Análise das regiões não traduzidas dos genes da família ADAM

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Análise das regiões não traduzidas dos genes da família ADAM para
identificação de microRNAs regulatórios do câncer
Walter L. T., Verbisck N.V.
Centro CCNH, Universidade Federal do ABC
Av. dos Estados, 5001, Santo André, SP
As ADAMs são proteínas que possuem alguns domínios característicos: domínio metaloproteinase, um domínio desintegrina,
um domínio rico em cisteína, um domínio semelhante ao fator de crescimento epidérmico (EGF), um pró-domínio, um domínio
transmembrana e uma cauda citoplasmática. As ADAMs podem ser reguladas em vários níveis, tais como transcricional, ´splicing´
alternativo, modificações pós-transcricionais, interações com outras proteínas, localização celular, localização dentro da membrana e
disponibilidade de substratos. Uma forma de regulação pós-transcricional é a ação de microRNAs nos mRNAs alvos através de suas
regiões não traduzidas (UTRs), que resulta na não tradução da proteína. Das 40 ADAMs identificadas até o momento, 33 estão
presentes nos mamíferos e 17 delas estão localizadas no sistema nervoso, sendo responsáveis por uma série de eventos como as
interações célula-célula e célula-matriz de diferentes tipos celulares, as sinalizações intracelulares e a clivagem de inúmeras moléculas
que desempenham um papel importante para o processo de invasão e metástase de células tumorais. Por conta disso, o estudo dessas
proteínas é importante para o desenvolvimento de tratamentos de eventos patológicos. Com pesquisas baseadas na literatura foi
possível selecionar 8 ADAMs superexpressas em gliomas (ADAM8, 9, 10, 12, 15, 17, 22, 23). Atualmente os microRNAs regulatórios de
expressão gênica têm sido muito estudados, mas até o momento pouco se sabe a respeito dos microRNAs reguladores da expressão das
proteínas da família ADAM. A identificação desses microRNAs a partir de bancos de dados pode trazer uma esperança como um
possível tratamento para essas alterações da expressão gênica. E o presente estudo fez uma análise (e uma seleção criteriosa) em cima
dos miRNAs reguladores dessas ADAMs. Em cima dessa análise foi possível selecionar dois miRNA para a ADAM9: hsa-miR-302b e
hsa-miR-302c; e três miRNAs para ADAM10: hsa-miR-32, hsa-miR-92a e o hsa-miR-92b.
Palavras chave: miRNA, ADAMs, SNC, câncer do SNC.
I. INTRODUÇÃO
As
proteínas
ADAM
(A
Disintegrin
And
Metalloproteinase Domain; ADAMs) constituem uma família
de proteínas integrais da membrana plasmática das células
(transmembrana do tipo I). As ADAMs são caracterizadas por
um domínio metaloproteinase (função de clivagem
proteolítica), um domínio desintegrina (age na adesão celular
através da interação com integrinas), um domínio rico em
cisteína (também promove a adesão celular), um domínio de
fator de crescimento epidérmico (EGF-like) (que é pouco
conhecido, mas é responsável por estimular a fusão das
membranas), um pró-domínio (bloqueia a atividade protease
da proteína), um domínio transmembrana (é responsável por
ancorar a proteína na membrana da célula) e uma cauda
citoplasmática (que pode ser fosforilada e atuar na regulação
de outras atividades de sinalização) (Yang et al, 2006).
Das 40 ADAMs identificadas até o momento, 33 estão
presentes nos mamíferos e 17 delas estão localizadas no
sistema nervoso. Diferentes mutações ou alterações póstranscricionais podem causar mudanças significativas na
expressão normal das ADAMs, o que pode estar relacionado
com a origem ou curso de diversas patologias, inclusive o
câncer. As ADAMs também aparecem como importantes
atores para o desenvolvimento do câncer do sistema nervoso.
A expressão de ADAM12, por exemplo, está diretamente
correlacionada com o índice de células de tumores malignos
de astrócitos.
No SNC, as células de sustentação são conhecidas
como neuroglia. Suas funções incluem promover a migração
de certos tipos de neurônios, controlar a extensão,
direcionamento, fasciculação e embainhamento de axônios e
promover a sinaptogêneses. São capazes de secretar fatores
tróficos que modulam a proliferação dos neurônios e da
própria glia. Algumas células da glia fagocitam neurônios e/ou
prolongamentos neuronais. Participam diretamente da
manutenção do micro ambiente extracelular adequado e,
indiretamente, mediante ação sobre o endotélio vascular do
sistema nervoso central. Têm papel importante no
metabolismo de neurotransmissores, pois contribuem para
uma maior eficiência da condução e transmissão do impulso
nervoso e participam do sistema imune do organismo. Os
principais tipos de glia são: microglia, Ependimárias, Glias
radiais, Astrócitos e Oligodentrócitos.
Existem quatro classes principais de tumores cerebrais:
gliomas,
tumores
neurais,
neoplasias
pobremente
diferenciadas e meningiomas (Kummar et al., 2005). Os
tumores cerebrais primários, malignos ou benignos, são
aqueles que são originariamente provenientes do cérebro.
Aproximadamente metade de todos os tumores cerebrais
primários provêm de células gliais, que são coletivamente
denominados como gliomas (Mathupala et al.,2007) Os
gliomas ainda podem ser subdivididos de acordo com a célula
glial do qual derivam, podendo ser astrocitomas,
oligodendrogliomas e ependimomas (Kummar et al., 2005).
Esta classe de tumores representa quase metade dos tumores
cerebrais, sendo os mais comuns de todos os tumores sólidos e
a segunda mais freqüente neoplasia em crianças (Mathupala et
al.,2007). Os astrocitomas podem, ainda, ser subdivididos em
astrocitoma fibrilar, glioblastoma multiforme, astrocitoma
pilocítico e xantoastrocitoma pleomórfico. Protocolos e
ensaios clínicos são baseados no esquema de graduação da
Organização mundial da Saúde (OMS), que considera os
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tumores baseado em seus comportamentos biológicos,
variando de grau I até grau IV.
O emprego de técnicas atuais, como por exemplo, o uso de
RNA de interferência (siRNAs) pode auxiliar na identificação
e caracterização dos mecanismos moleculares importantes
para o surgimento das doenças relacionadas com as ADAMs.
Os miRNAs são moléculas de RNA fita simples de
19 a 25 nucleotídeos capazes de regular a transcrição de uma
proteína. A regulação pós-transcricional exercida pelos
miRNAs na região 3`UTR dos mRNAs-alvo depende do grau
de complementaridade com o RNA mensageiro (mRNA) ou
alvo, podendo ocorrer inibição traducional ou degradação do
mRNA (Júlio et al., 2006). Assim como os mRNAs das
proteínas são expressos em diferentes tipos celulares e em
diferentes concentrações, os miRNAs também são encontrados
em diferentes circunstâncias no corpo, permitindo o
funcionamento normal das células (Dalmay et al., 2006). A
alteração na expressão de miRNAs tem sido associada a
diversos tipos de tumores, podendo funcionar como oncogenes
ou genes supressores de tumor (Dalmay et al., 2006). Embora
as pesquisas estejam em estado inicial, tudo indica que o
estudo dessas moléculas poderá fornecer métodos mais
eficientes de diagnósticos, além de auxiliar na busca de novos
alvos terapêuticos (Mathupala et al., 2007).
II. MATERIAIS E MÉTODOS
1) Estudo na literatura
Para o aprendizado dos conceitos básicos que se
relacionam ao tema deste projeto, tais como expressão gênica,
epigenética, mecanismos de silenciamento gênico póstranscricional, microRNAs, proteínas ADAM, adesão e
migração celular, câncer, etc, foi feito o levantamento
bibliográfico, em livros e periódicos especializados, com os
quais foram realizados estudos dos artigos científicos e a
produção de resenhas e resumos em cima destes. Para a
pesquisa de artigos científicos foi utilizado o PubMed,
disponível online (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). E as buscas
foram realizadas com as seguintes palavras chaves: “ADAM”,
“ADAM e miRNA”, “miRNA”, “ADAM e câncer”, “miRNA
e câncer”, “sistema nervoso e ADAM” e “sistema nervoso e
miRNA”.
2) Análise in silico
Foram realizados estudos nas regiões não codificadoras dos
genes ADAM para os quais já foi relatado papel no câncer, de
modo a identificar possíveis microRNAs regulatórios. Essa
análise levou em consideração os métodos de predição de
alvos para microRNAs descritos até o momento, e os níveis de
expressão relacionadas ao câncer levantados na literatura para
os microRNAs já descritos. Para a obtenção das sequências
correspondentes às regiões não traduzidas foi utilizado o
GenBank, um dos mais utilizados bancos de dados genômicos.
Foi usado o banco de dados de microRNAs denominado
miRBase
(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)
e
diferentes ferramentas de bioinformática disponíveis na
Internet para predição de alvos de microRNAs nas regiões não
traduzidas dos genes ADAM, como por exemplo TargetScan
(http://www.targetscan.org/vert_50/),
Diana
microT
(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/),
GeneMir
(http://www.macinolab.org/GeneMir.htm),
PicTar
(http://pictar.mdc-berlin.de/)
e
Ensembl
(http://www.ensembl.org/index.html), além da ferramenta
BLAT para alinhamentos genômicos adicionais e outras
correlações
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com base na literatura vista até o momento foi possível
destacar
oito
principais
ADAMs
envolvidas
no
desenvolvimento de tumores cerebrais: ADAMs 8, 9 10, 12,
15, 17, 22 e 23 (Kodama et al., 2004; Wildeboer et al., 2006).
Com isso, foi possível analisar as os miRNAs que se ligam nas
regiões UTRs de seus respectivos mRNAs.
A ADAM8 (A disintegrin and metalloproteinase domain 8)
(Cell surface antigen MS2) (CD156a antigen): a ADAM8 está
presente nos neurônios, nos astrócitos e nos oligodendrócitos.
Possui o domínio metaloprotease ativo, enquanto que nada se
sabe sobre o domínio desintegrina (Yang et al., 2006). O RNA
da ADAM8 foi encontrado nos astrocitomas de grau I, II e III,
e nos oligodendrogliomas de grau II e III (Wildeboer et al.,
2006). De acordo com os bancos de dados, apenas o Gene Mir
encontrou miRNAs, um total de 28. Mas por critérios internos,
nenhum deles foram selecionados.
ADAM9 (A disintegrin and metalloproteinase domain 9)
(Metalloprotease/ disintegrin/ cysteine-rich protein 9)
(Myeloma cell metalloproteinase) (Meltrin-gamma) (Cellular
disintegrin-related protein): essa ADAM está presente no
hipocampo, hipotálamo e no cerebelo (Yang et al., 2006). O
mRNA da ADAM9 foi expresso em todos os tecidos
neoplásicos e tumores cerebrais, principalmente em tumores
astrocíticos (Wildeboer et al., 2006). Essa ADAM apresenta
dois transcritos, NM_003816 e NM_001005845. Porém,
apenas dois miRNAs foram selecionados: hsa-miR-302b, hsamiR-302c.
ADAM10 (A disintegrin and metalloproteinase domain 10)
(Mammalian disintegrin-metalloprotease) (Kuzbanian protein
homolog) (CDw156) (CD156c antigen): a ADAM10 está
presente nos neurônios do córtex cerebral, no hipocampo, no
hipotálamo e no córtex cerebelar (Yang et al., 2006). A
exressão do mRNA da ADAM10 aparece em astrocitoma de
baixo grau, astrocitoma anaplásico, glioblastoma, neurinomas
intracranianos e carcinomas metastásico (Kodama et al.,
2004). De acordo com os critérios escolhidos quatro miRNAs
se destacaram: hsa-miR-32, hsa-miR-92ª, hsa-miR-92b, hsamiR –363.
ADAM12 (A disintegrin and metalloproteinase domain 12)
(Meltrin-alpha) A ADAM12 está presente na pirâmide
neuronal e nos oligodendrócitos (Yang et al., 2006). Além
disso, possui uma expressão seletiva em casos de glioblastoma
(Kodama et al., 2004). Nenhum miRNA foi selecionado.
ADAM 15 (A disintegrin and metalloproteinase domain
15) (Metalloproteinase-like, disintegrin-like, and cysteine-rich
protein 15)(MDC-15) (Metalloprotease RGD disintegrin
protein) (Metargidin): a ADAM15 está presente na espinha,
nos neurônios e nas células de Schwann (Yang et al., 2006).
Está expresso em glioblastoma anaplásico, oligodendroglioma
e ependimoma anaplásico (Wildeboer et al.,2006). Para esta
ADAM, também, nenhum miRNA foi selecionado.
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ADAM17 (A disintegrin and metalloproteinase domain 17)
(TNF-alphaconverting enzyme) (TNF-alpha convertase)
(Snake venom-like protease) (CD156b antigen): a ADAM17
está expressa em astrócitos, nas células endoteliais e nos
neurônios (Yang et al., 2006). O mRNA desta ADAM foi
observado em astrocitoma de graus II e III, em glioblastoma,
em astrocitoma anaplásico, em ependimoma anaplásico e em
oligodendroglioma anaplásico de grau II (Kodama et al., 2004;
Wildeboer et al., 2006). Nenhum miRna foi selecionado.
ADAM22 (A disintegrin and metalloproteinase domain 22)
(Metalloproteinase-like, disintegrin-like, and cysteine-rich
protein 2) (Metalloproteinase-disintegrin ADAM22-3). Assim
como a ADAM 17, esta também não apresenta nenhum
miRNA de interesse.
ADAM23 (A disintegrin and metalloproteinase domain 23)
(Metalloproteinase-like, disintegrin-like, and cysteine-rich
protein 3) (MDC-3): essa ADAM está presente nos neurônios,
no hipocampo, no gânglio basal e nas células granulares do
cerebelo. A ADAM23 tem sido relatada a promover a adesão
de neuroblastoma e astrocitoma de células HeLa (Yang et al.,
2006). Também não foram encontrados nenhum miRNA de
interesse.
Os miRNAs selecionados foram aqueles que passaram
pelos critérios individuais de cada banco de dados. Para o
Gene Mir o critério foi aparecer um pelo menos 3 bancos de
dados apresentado por ele. Para o PicTar, para o Diana microT
e miRanda, foram escolhido os miRNAs que possuíam pelo
menos 2 sítios de ligação com o mRNA alvo. Para o Target
Scan o critério adotado para selecionar os miRNAs de maior
interesse foi se o respectivo miRNA regula a ADAM em pelo
menos duas espécies distintas evolutivamente. Com isso, os
miRNAs passaram em todos esses critérios de seleção foram
selecionados.
IV. CONCLUSÃO
A pesquisa bibliográfica permitiu compreender melhor o
funcionamento das ADAMs e agregar suas possíveis
desregulações com o câncer do sistema nervoso central. Assim
como as ADAMs a expressão alterada dos miRNAs dessas
respectivas ADAMs também foi associado.
Foi possível selecionar oito principais ADAMs que
tiveram sua expressão alterada em gliomas: ADAM8, 9, 10,
12, 15, 17, 22 e 23. Aprofundando a pesquisa, foi selecionado
apenas as ADAM 9 e 10, por apresentarem miRNAs que se
ligassem em pelo menos dois sítios da seqüências 3’UTR das
suas respectivas ADAMs e que tivessem sido encontradas em
pelos menos três bancos de dados consultados. Com isso
foram escolhidos os hsa-miR- 302b e hsa-miR-302c, para
ADAM9; hsa-miR-32, hsa-miR-92a e o hsa-miR-92b miRNAs
para ADAM10. É possível que esses miRNAs sejam futuros
alvos para terapia diagnósticade tumores cerebrais.
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