Reflexiones sobre la gestión de conocimiento y los sistemas de

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Veterinaria y Zootecnía ISSN 2011-5415
Vol 8 No.2, julio - diciembre de 2014
Reflexiones sobre la gestión de conocimiento y
los sistemas de producción ovina y caprina en
Colombia
ARTÍCULO DE
REFLEXIÓN
Oscar Ospina1, Alexandra Montoya2, Iván Montoya3, Henry Grajales4
1,
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá, Colombia.
2,
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
3,
Facultad de Minas, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
4,
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá, Colombia.
[email protected]
(Recibido: 3 de Octubre de 2014 Aprobado: 29 de Enero 2015 Actualizado: 25 de junio de
2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.1
RESUMEN: El crecimiento ondulante en el inventario y
sostenido en el consumo per cápita del ovino-caprino en Colombia, crea
la oportunidad y/o necesidad de aprovechar no solo las ventajas
comparativas, sino también el impulsar la generación de ventajas
competitivas que lleven a la ovinocultura y la caprinocultura dentro del
camino de la competitividad y la globalización, aprovechando las
oportunidades en el mercado nacional y de exportación. El eficaz
aprovechamiento de las ventajas comparativas y la generación de
ventajas competitivas implican la incorporación de los datos, la
información y el conocimiento como factores de producción dentro de
un proceso ordenado, bajo el marco de un sistema de “Gestión del
Conocimiento”. El presente trabajo aborda una reflexión acerca de los
aportes que se podrían dar desde la teoría general de sistemas, la matriz
de creación del conocimiento, la epistemología evolucionaria y la
cibernética del conocimiento a la conceptualización de un sistema de
Gestión del Conocimiento para ovinos y caprinos.
Palabras clave: epistemología, conocimiento, pequeños rumiantes
Reflections on knowledge management and sheep and goat
production systems in Colombia
ABSTRACT: The undulant growth in the inventory and the
sustained growth in the per capita sheep and goat consumption in
Colombia, creates the opportunity and/or the need to take the most not
only of the comparative advantages, but also take the chance to promote
©Universidad de Caldas
1
the generation of competitive advantages that take sheep and goat
breeding in the way of competitiveness and globalization, taking
advantage of the opportunities in the domestic and export markets. The
efficient use of comparative advantages and the generation of
competitive advantages involve incorporation of data, information and
knowledge as factors of production within an orderly process under the
framework of a “Knowledge Management” system. This work
addresses a reflection on the contributions that could emerge from the
general systems theory, the matrix of knowledge creation, evolutionary
epistemology and knowledge cybernetics for the conceptualization of a
Knowledge Management System for sheep and goats breeding.
Key words: epistemology, knowledge, small ruminants
Introducción
Los sistemas de producción de ovinos y caprinos en Colombia han
crecido de manera significativa en los últimos años produciendo
animales para consumo nacional y exportación (Castellanos et al., 2010;
Ospina et al., 2011; Vega et al., 2014). De manera general se produce
con poca intervención humana, las ovejas y las cabras son casi
silvestres, llevando a que sea la naturaleza y su capacidad la que en gran
medida sostenga la actividad, generando productos con poco control,
baja productividad y pobre calidad (Nonaka & Toyama, 2003;
Castellanos et al., 2010; Moreno & Grajales, 2014).
La cultura ganadera tradicional, aunada con el pobre nivel de
información y el escaso conocimiento explícito utilizado en los
procesos productivos, hace que la manera de trabajar de los
ovinocultores y caprinocultores se fundamente en la tradición oral,
mitos y leyendas, que llevan a tener ganaderías con bajos niveles de
organización, alto nivel de improvisación, inadecuado desarrollo y
apropiación de tecnologías, poca o nula planeación, bajos niveles de
desempeño y mínimas oportunidades de un crecimiento planificado y
consciente hacia el mercado, los gremios y el Estado, quedando
relegados a la fuerza de las modas, del capricho de los ciclos biológicos
y sin las bondades de las “ventajas competitivas”, desatendiendo las
oportunidades presentes en el mercado interno y externo (Morales &
Pech, 2000; Nonaka, 2000; Montuschi, 2001; Senge, 2005; Castellanos
et al., 2010; Ospina et al., 2011; Moreno & Grajales, 2014; Vega et al.,
2014).
La gestión del conocimiento es una disciplina de la gestión que busca
tener impacto en el procesamiento del conocimiento, tiene como
propósito incrementar la potencialidad de una organización para
ejecutarlo y de esta forma mejorar la calidad de sus conductas, del
procesamiento organizacional y la habilidad para adaptarse al ambiente
(Rodríguez & Dante, 2008).
Veterinaria y Zootecnía. 2014; 8(2): 01-14
El objetivo del presente trabajo es abordar las bases conceptuales que
tendría un sistema de gestión del conocimiento para granjas ovinas y
caprinas, como herramienta de generación de ventajas competitivas en
Colombia. Se avanza sobre elementos de la matriz de creación del
conocimiento, la teoría de los tres mundos de la epistemología
evolucionaria, el ciclo observación, orientación, decisión y acción –
OODA– de la cibernética del conocimiento y la teoría general de
sistemas.
Planteamiento del problema
En los trabajos hechos por el Instituto Colombiano Agropecuario –
ICA– y la Agencia Alemana de Cooperación Técnica Internacional –
GTZ–, se señala la escasa información existente y el insuficiente
conocimiento productivo y reproductivo que hay de la ovinocultura y la
caprinocultura (Gall & Reule, 1989). Siguen vigentes los
planteamientos que hacía la FAO para América Latina en 1989, en
donde se planteaba que esta zona se encuentra lejos de utilizar de
manera óptima los recursos naturales primarios y es por eso que aún
existe un gran margen para incrementar la productividad en la mayoría
de los sistemas de producción pecuarios, pero esto depende de factores
más relacionados con los humanos que con los animales, en donde
están el individualismo, el nivel de educación y cultura. Asimismo, se
encuentra una correlación positiva entre el nivel de manejo de
conocimientos del productor y la factibilidad de optimizar el
funcionamiento de un sistema pecuario (Castellanos & Arellano, 1989;
Moreno & Grajales, 2014).
Los sistemas de producción de ovinos y caprinos en Colombia,
producen animales para consumo nacional y para exportación (Antillas
Holandesas), con apenas ventajas comparativas, con una producción
que se realiza bajo un manejo tradicional, sin mucha inversión,
tecnología y desarrollo empresarial (Espinel & Martínez, 2006; Moreno
& Grajales, 2014; Vega et al., 2014). Los mismos están constituidos por
granjas con diferentes niveles tecnológicos, aunque predomina el nivel
bajo, que se caracteriza por su escaso nivel sanitario, bajos parámetros
reproductivos, falta de asistencia técnica y de gestión, todo esto
redundando en menores rendimientos del rebaño, detrimento en la
calidad de los animales y su productividad (Castellanos et al., 2010;
Moreno & Grajales, 2014).
La agenda de investigación y desarrollo tecnológico para la cadena
cárnica ovino caprina 2010 del Ministerio de Agricultura (Castellanos
et al., 2010;, , define para Colombia que los objetivos de crecimiento y
desarrollo del sector agrícola dependen de una mayor inserción en los
mercados internacionales y de la ampliación del mercado interno. Estos
objetivos están relacionados con el incremento de la competitividad de
la producción nacional, que es consecuencia no solo de las ventajas
comparativas que provee la naturaleza, sino también de la capacidad de
introducción constante de conocimiento y de nuevas tecnologías que
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lleven a la generación de ventajas competitivas (Ospina et al., 2011) y
su aseguramiento mediante la incorporación de Buenas Prácticas
Ganaderas –BPG– (Grajales & Afanador, 2014; Vega et al., 2014).
La pegunta de reflexión de este trabajo es: ¿Cómo se podría diseñar un
sistema de gestión del conocimiento para hacer más competitivo a los
sectores ovino y caprino colombianos?
Marco teórico
Teoría General de Sistemas –TGS–
La TGS plantea que los sistemas transforman las corrientes de entrada o
insumos, en corrientes de salida o productos, mediante el proceso de
conversión. El proceso genera desorden y pérdidas de energía o
entropía, la pérdida de energía en el sistema es contrarrestada mediante
la neguentropía, que es la fuerza contraria a la entropía. La
neguentropía es la cantidad de información necesaria para organizar un
sistema. En los sistemas, la información es generada por un
componente especializado que se denomina subsistemas de control o de
retroalimentación negativa, que son la base para el desarrollo de los
sistemas de información (Bertalanffy, 1950; Johansen, 2004).
Teoría de la información
En el universo suceden eventos en el espacio del tiempo que al ser
representados mediante signos o símbolos se convierten en datos, estos
datos al ser procesados por métodos estadísticos se convierten en
información. La información es la regularidad observada en un
fenómeno que se puede medir mediante bites; cuando un conjunto de
bites de información se interrelacionan en una estructura que tiene
lógica racional y se aplica en un contexto se produce conocimiento;
cuando este conocimiento se utiliza en una realidad que afecta la
producción de bienes o servicios dentro de una organización, se
convierte en tecnología (Bellinger, 1997; Martín, 2007; Frías, 2009).
Esta característica de la información cumple la ley de los incrementos
en la cual, en la medida en que la información se interrelaciona, se
amplifica y lleva a que mediante la transformación de datos a
conocimiento se genere aún más información (Johansen, 2004).
Sistemas de producción ovina y caprina
Desde la perspectiva de la teoría general de sistemas, se entiende a una
ganadería ovina o caprina como un proceso de transformación de
energía solar, desde pasto a carne, lana y/o leche para el consumo
humano, pasando sucesivamente por los subsistemas: nutrición,
alimentación, población, reproducción, producción, y economía (Figura
1) (Aguilera, 1989; Sánchez & Reinés, 2001; Machado & Campos,
2008).
Este proceso de transformación de la energía genera entropía o pérdida
de energía, que en los sistemas ovinos o caprinos, según la teoría del
diezmo, del 100% de la energía que se captura en forma de vegetales el
1% se convierte en energía en forma de carne, leche y/o lana disponible
para consumo humano (Aguilera, 1989; Sánchez & Reinés, 2001;
Machado & Campos, 2008). El sistema tiene una entropía o pérdidas de
energía del 99%; para controlar o disminuir esta entropía es necesario
que el sistema genere neguentropía, lo que se logra fundamentalmente a
través de la información (Johansen, 2004).
La información en un sistema de producción (ovina o caprina) está
presente en dos formas: la primera, producto de la evolución, se
encuentra almacenada en nucleótidos –ADN– (Parker & Walker, 2010);
la segunda, producto de la observación empírica o científica que se
encuentra almacenada en el sistema de gestión de conocimiento formal
o informal con el que el sistema trabaje (Marcos, 1991).
En este contexto, se podría abordar el conocimiento desde la
perspectiva de su origen, naturaleza y potencial uso en los sistemas de
producción, entrando en el terreno de la epistemología, la economía y la
administración.
Epistemología
La comprensión moderna del conocimiento propone la identificación de
dos dimensiones, la epistemológica y la ontológica. La epistemológica,
a su vez, indica que el conocimiento es de dos tipos: conocimiento
tácito y conocimiento explícito; el primero, producto de la experiencia
cotidiana, transmitido por tradición oral, mitos y leyendas, de
generación en generación, es un conocimiento que no tiene un origen
formal; el segundo, el explícito, es el que se ha documentado y puede
ser combinado, analizado, validado y socializado; este conocimiento
generalmente es de origen formal o generado mediante un método
sistemático o científico (Nonaka, 1994; Ospina et al., 2011).
5
Desde el punto de vista de la dimensión ontológico, se plantea que el
conocimiento se puede generar a nivel de individuo, grupo,
organización e ínter-organizaciones (Nonaka, 1994).
La creación de conocimiento se da cuando se combina el conocimiento
tácito con el explícito, siguiendo la matriz de creación de conocimiento
(Nonaka, 1994) (Figura 2). En la creación de conocimiento, según el
modelo de Nonaka. (1999), se “socializa” cuando se pasa el
conocimiento de tácito a tácito, esto sucede cuando el conocimiento
pasa de una persona a otra de manera verbal o espontanea; se
“externaliza” cuando el conocimiento pasa de tácito a explícito, es
decir, se documenta el conocimiento tácito dentro de un método o
modelo sistemático; se “combina” cuando el conocimiento explícito se
mezcla o sinergisa con otro conocimiento explícito y se obtiene como
resultado un nuevo producto más evolucionado; se “interioriza” cuando
el conocimiento explícito se lleva de nuevo a tácito y éste se incorpora
al proceso normal de análisis y toma de decisiones, dando origen a la
matriz de creación del conocimiento que al cerrar el ciclo y volver a
comenzar avanza sobre el siguiente ser ontológico dando origen a la
espiral de creación de conocimiento en las organizaciones (Figura 2).
Ventajas competitivas
Desde el punto de vista de la economía, el conocimiento y la capacidad
de crearlo y utilizarlo, son consideradas la más importantes fuentes de
firmes y sostenibles ventajas competitivas (Nonaka & Toyama, 2003).
En este sentido, Senge (2005) plantea que la única fuente de ventaja
competitiva sostenida está en la capacidad de la organización de
aprender más rápido que la competencia. En una organización, la
capacidad de construir conocimiento es el generador de ventajas
competitivas (Senge, 2005).
El paradigma de la gestión del conocimiento plantea a los activos
intangibles de las empresas como generadores de ventajas competitivas
y la planeación del conocimiento en función de ésta (Senge, 2005).
Gestión del conocimiento
La gestión del conocimiento es una disciplina de la gestión que busca
tener impacto en el procesamiento del conocimiento, tiene como
propósito incrementar la potencialidad de una organización para
ejecutarlo y de esta forma mejorar la calidad de sus conductas, del
procesamiento organizacional y la habilidad para adaptarse al ambiente
(Rodríguez & Ponjuán, 2008) y, por supuesto, con miras a mejorar la
competitividad de las organizaciones.
Se identifican dos grandes etapas en la gestión del conocimiento, la
primera se dio a principios de los años noventa, en ella se entendía el
conocimiento como un inventario estático que ofrecía fortalezas para
hacer competitiva a la organización. En esa etapa, se pensaba en un
inventario de conocimiento como activo estratégico, que se deja
disponible mediante un sistema de información o de gestión
documental, que conecta a la cadena de producción o ejecución de un
proyecto (Danskin et al., 2005; Morales & Varas, 2007). La segunda
etapa se da después de mediados de los noventa, en ésta se entiende a la
empresa o proyecto como una “organización que aprende”, que crea
conocimiento para generar ventajas competitivas que le permitan
adaptarse al entorno (Rodríguez & Ponjuán, 2008).
Gestión del conocimiento y las metáforas biológicas
Las metáforas biológicas aplican conceptos de la biología a la
administración y la economía (Martínez, 2004). En la gestión del
conocimiento, el punto de vista de la naturaleza biológica del
conocimiento al entenderlo como una “organización que aprende”,
provee las bases para tomar conceptos: autopoiésis, cibernética del
conocimiento y epistemología evolucionaria.
Autopoiésis: Para que un sistema complejo sea considerado
autopoiético (autosostenible en el tiempo) requiere cumplir 6
características clave (Hall, 2005):
• El sistema tiene componentes identificables
pertenecientes a él y diferenciables del entorno.
• Los componentes identificados realizan algún proceso
dentro del sistema.
• El sistema es dinámico, tiene interacciones y procesos.
• El proceso mantiene la integridad del sistema.
• El sistema de manera intrínseca produce sus propios
componentes.
• El sistema es autónomo.
La autopoiésis implica que el sistema es autosostenible, se adapta y
evoluciona según las condiciones del entorno. El conocimiento tácito
está inmerso en el sistema, en la granja, en las rutinas conectadas que
producen las salidas de productos (corderos, lana, leche, etc.), está
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inmerso en las palabras y modismos propios del sistema y su gente
(ovinovultura o caprinocultura), que le va sumando conocimiento en el
transcurrir del tiempo. El conocimiento explícito está codificado y
distribuido por los procesos en una variada documentación física
(registros), conformando la herencia o la memoria de la organización.
En una organización que aprende, el proceso cognitivo incrementa el
nivel o valor del conocimiento a través del tiempo. Una organización
que aprende necesita adaptarse a cambios impredecibles en un ambiente
competitivo (Hall, 2005).
Epistemología evolucionaria: En la epistemología evolucionaria
propuesta por Popper se tienen 4 elementos guía (Popper, 1978, 1999;
Hall, 2005):
• Todo organismo está constantemente envuelto en
problemas de existencia y resolviéndolos.
• Todo problema resuelto proviene de un proceso de
ensayo y error.
• Se eliminan formas no satisfactorias como en la
selección natural.
• Hay un P1 que es el problema inicial y un P2 que es la
solución propuesta.
Se plantea la existencia de tres mundos. El primer mundo corresponde a
aquel donde están los procesos de transformación de insumos a
productos, lo rige la bioquímica, la física y/o el metabolismo, busca
persistir en el tiempo. El segundo mundo corresponde al plano del
conocimiento tácito con el que la organización entiende el mundo que
la rodea. El tercer mundo corresponde al conocimiento explícito que se
da en dos formas: como herencia codificada en el ADN y como el
contenido lógico almacenado en los sistemas de información, los libros,
documentos, etc. En la medida en que el conocimiento explícito explica
al primer mundo y éste puede ser utilizado por el segundo mundo, el del
tácito, el conocimiento es válido y se incrementa o si no, muere y se
desecha. Solo aquel conocimiento que genera resultados positivos
sobrevive (Popper, 1978, 1999; Hall, 2005).
Cibernética de una organización que aprende Ciclo OODA: El
conocimiento puede entonces verse como crítico para que un individuo
u organización sea competitivo y sobreviva, para que esto se logre el
conocimiento cumple un ciclo cibernético de cuatro pasos OODA,
como se muestra en la Figura 3 (Boyd, 1996; Hall, 2005):
• Observación: Corresponde a la información que
recoge la organización del entorno, incluye fuentes
externas de información, paradigmas, resultados de
acciones
previas.
• Orientación: Determina la dirección para hacer
evolucionar la organización, incluye procesos cognitivos
complejos. En esta fase desde el entorno se afecta al
conocimiento tácito, la historia del conocimiento, las
rutinas, la cultura y tradición, se hace la selección de
entradas, incluye procesos de recolección, análisis,
síntesis de conocimiento. La memoria y la historia del
conocimiento pueden cambiar por acción del
conocimiento explícito, que también determina la
orientación
de
la
organización.
• Decisión: Corresponde a la hipótesis escogida o el plan
de
acción
a
ejecutar.
• Acción: Ejecución de las decisiones en respuesta a los
controles y limitaciones internas y externas. Los
elementos del Ciclo OODA identifican de manera
sistemática los elementos que conforman el proceso que
realiza el conocimiento dentro de una organización,
permitiendo identificar puntos sobre los cuales hacer
mediciones sobre el proceso del mismo.
Reflexión
Al Integrar en un solo modelo los conceptos de la teoría de sistemas, los
sistemas de producción ovinos o caprinos, la matriz de creación del
conocimiento, la teoría de los tres mundos y el Ciclo OODA, se tiene:
Según la teoría general de sistemas, se entiende a una ganadería ovina o
caprina como un proceso de transformación de energía solar desde
pasto a carne, lana y/o leche como productos para el consumo humano.
Este proceso de transformación de energía genera entropía o pérdida de
energía, que en un sistema de producción, según la teoría del diezmo,
del 100% de la energía que se atrapa en forma de vegetales el 1% se
convierte en energía en forma de carne, leche y/o lana disponible para
consumo humano. El proceso del sistema genera una entropía natural o
una pérdida de energía estimada en un 99%. Si se quisiera controlar o
disminuir esta entropía y aumentar la productividad del sistema, es
necesario que este genere neguentropía, lo que se logra a través de la
incorporación de información. La información en un sistema de
producción ovina o caprina está presente en dos formas; la primera,
producto de la evolución, se encuentra almacenada en el ADN; la
segunda, se encuentra en el sistema administrativo formal o informal
que direccione la granja. El sistema administrativo para su
funcionamiento utiliza conocimiento, que a su vez es de dos tipos:
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tácito y explícito; el tácito es el producto de la tradición oral, mitos y
leyendas y la experiencia personal; el explícito es el conocimiento
escrito, formal, producido por un método sistemático. La generación de
ventajas competitivas se da a partir de la incorporación de conocimiento
explícito a los procesos de producción de las granjas. De manera
natural, las granjas ovinas o caprinas, basan la toma de decisiones sobre
el conocimiento tácito, que corresponde a la tradición oral, mitos y
leyendas que llegan a través de miembros de la comunidad, colegas o
familiares cercanos, más la experiencia del productor, conformando la
cultura ovina o caprina que rige a la granja, con poca o nula
incorporación de conocimiento explícito. Esta situación hace que el
nivel de conocimiento formal sea limitado, dando paso a que las
ventajas comparativas sean las relevantes al momento de enfrentar el
mercado. Si se quiere generar ventajas competitivas, es necesario que el
sistema incorpore conocimiento explícito mediante la utilización de la
matriz de creación del conocimiento, que mediante sus cuatro pasos:
socialización, exteriorización, combinación e interiorización, permite la
incorporación del conocimiento explícito al tácito, subir el nivel de
conocimiento formal en la granja que lleve a una acertada y ordenada
toma de decisiones, que permitan aumentar la neguentropía, controlar el
sistema de producción, disminuir la entropía e incrementar el nivel de
productividad del sistema.
La fuente de las estadísticas, que dan soporte al conocimiento explícito,
se deben generar mediante un sistema de información que, midiendo los
subsistemas de la granja, provee elementos para incorporar a la matriz
de creación de conocimiento (Figura 4).
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Propuesta sistema de gestión del conocimiento
Se parte de identificar los tres mundos de la teoría evolucionaria del
conocimiento de la siguiente manera: el primer mundo es donde está la
granja, el segundo mundo es donde está el productor y su conocimiento
tácito, el tercer mundo es donde están los sistemas de información, la
asistencia técnica y los investigadores. Se incorpora conocimiento
explícito, al tácito, cuando se pone en marcha la matriz de creación del
conocimiento que incorpora conocimiento desde el tercer mundo, al
segundo mundo. El segundo mundo pone a prueba el nuevo
conocimiento cuando entra a modificar el primer mundo. El cambio
generado o el efecto del nuevo conocimiento, es evaluado por el tercer
mundo mediante el Ciclo OODA (observación, orientación, decisión y
acción), validando o desechando el conocimiento, generado en un
proceso cibernético del conocimiento, que puede construir
conocimiento útil en un proceso autónomo.
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Determinación de parámetros cinéticos de
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ARTÍCULO DE
INVESTIGACIÓN
Henry Jurado-Gámez2, 3, Fredy Calpa-Yamá3, Aura Chaspuengal-Tulcán3
1,
Financiado por la Vicerrectoría de Posgrados y Relaciones Internacionales
(VIPRI), Universidad de Nariño, Pasto, Colombia.
2,
Programa de Zootecnia, Departamento de Producción y Procesamiento
Animal, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño, Pasto,
Colombia.
3,
Grupo de investigación en Procesos Biotecnológicos Aplicados a la
Producción Animal - Fisiología y Etología Animal (PROBIOTEC-FISE),
Pasto, Colombia.
[email protected]
(Recibido: 2 de Mayo de 2014 Aprobado: 21 de Agosto de 2014 Actualizado: 25 de junio de
2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.2
RESUMEN: El objetivo de la presente investigación fue
evaluar las mejores condiciones de la cinética de fermentación de
Lactobacillus casei en dos medios probióticos (MRS y Pro). En cada
medio se evaluó el máximo crecimiento en relación con producción de
biomasa, conteo de microorganismos viables en placa (UFC/ml),
determinación de pH, consumo de azúcares totales (mg/L) y producción
de ácido láctico (%). Se usó un diseño de bloques al azar con dos
tratamientos (medios Pro y MRS), 11 bloques correspondientes a los
tiempos de evaluación y 2 réplicas por cada uno. La prueba se efectuó
cada 2:24 horas durante un día; se obtuvo la fase exponencial de
crecimiento (UFC/ml) al tiempo 7 (16:48 horas) y tiempo 6 (14:24
horas) de la cinética, alcanzando valores de 3,0 x 1011 y 7,3 x 108
UFC/ml respectivamente, y una concentración de proteínas de 46,95
g/L y 45,83 g/L para el tiempo 7 y 6 respectivamente. Los resultados
estadísticos no encontraron diferencias estadísticas significativas
(P>0,05). La prueba por HPLC indicó que las cepas de L. casei eran
homofermentivas, presentando una producción de ácido láctico superior
al 80%. En la muestra P (L. casei), el pico No. 9 (tr –tiempo de
retención– = 12,1 min), presenta un tiempo de retención similar al del
pico No. 2 del estándar de calibración, por lo que posiblemente el
péptido de esta muestra presente una cadena de aminoácidos compuesta
por VAL-TIR-VAL (PM = 379,5). El pico No. 3 del estándar, que
corresponde al péptido metionina enkefalina acetato, de composición
(TIR-GLI-GLI-FA-MET) M6638 (PM = 573,7 para la base libre),
presenta un tiempo de retención similar al del pico No. 12 de la muestra
15
P (L. casei). Los valores en los dos medios indican ser adecuados para
la preparación de inóculos probióticos.
Palabras clave: bacteria, biomasa, salud, fermentación
Determination of kinetic parameters of Lactobacilluscasei in two
probiotics media
ABSTRACT: The objective of this investigation was to
evaluate the best conditions of the kinetic fermentation of Lactobacillus
casei in two probiotic media (MRS and Pro). In each media maximal
growth related to biomass production, counting of viable
microorganisms in plaque (CFU/ml), determination of pH, total sugar
consumption (mg/L) and lactic acid production (%) was evaluated. A
randomized blocks design with two treatments (media Pro and MRS),
eleven blocks corresponding to the time of the evaluation and 2 replicas
for each one, was used. The test was carried out every 2:24 hours
during one day; the exponential phase of growth (CFU/ml) was
obtained at period 7 (16:48 hours) and period 6 (14:24 hours) of
kinetics, reaching values of 3.0 x 1011 and 7.3 x 108 CFU/ml
respectively, and a protein concentration of 46.95g/L and 45.83g/L for
the period 7 and 6 respectively. Statistical results did not show
significant differences (P>0.05). The HPL C test indicated that L. casei
strains were homofermentative presenting a lactic acid production
higher than 80%. In sample P (L.casei), peak No. 9 (rt– retention time–
= 12.1min), has a similar retention time to the peak No 2 from the
calibration standard, reason why possibly, the peptides of this sample
show an amino acids chain composed of VAL-TIR-VAL (MW =379.5).
The peak No. 3, of the standard which corresponds to the peptide
methionine enkephalin acetate, composition (TIR-GLY-GLY-FAMET) M6638 (MW = 573.7 for the free base) has a retention time
similar to that of peak No. 12 from sample P (L.casei). The values in
the two media indicate they are suitable for the preparation of inoculum
probiotic.
Key words: bacterium, biomass, health, fermentation
Introducción
Lactobacillus casei es una bacteria ácido-láctica que posee el estatus de
Generalmente Reconocida como Segura (GRAS), además, de
catalogarse como probiótico; este último corresponde al cultivo de
microorganismos vivos (bacterias, hongos y levaduras) que actúan
directa o indirectamente sobre bacterias patógenas Gram-negativas en el
tubo digestivo, actuando por competición física o de nutrientes, por
secreción de bacteriocinas, producción de ácidos o por inmunidad
cruzada (Susamo & Ocampo, 2006). La importancia de su uso en la
alimentación de animales de granja se basa en las propiedades que se
les atribuyen para mejorar la eficiencia de conversión alimenticia y
como promotores del crecimiento (Rosmini et al., 2004).
Lactobacillus casei ha sido ampliamente estudiada y utilizada en la
industria en procesos de fermentación a partir de varios sustratos como
harinas, leche, carnes, conservas. Este microorganismo se encuentra de
forma natural en vegetales fermentados, leche, carne, intestino, boca y
ambiente (Collins et al., 1989). En estudios previos se ha reportado el
uso de L. casei para la fermentación de suero de leche y la optimización
en la producción de biomasa a partir de este sustrato (Ruales & Vallejo,
2007). Estudios in vivo e in vitro sobre sustratos como suero de leche
han demostrado su capacidad probiótica al aprovechar los nutrientes y
generar productos o metabolitos de interés (Escobar, 2008).
La investigación tuvo como objetivos: evaluar las mejores condiciones
de la cinética de fermentación de Lactobacillus casei en un medio
probiótico comparado con el comercial MRS; y determinar el máximo
crecimiento de microorganismos viables en placa (UFC/ml, expresado
como la fase logarítmica de crecimiento), determinar el consumo de
azúcares totales, pH y producción de ácido láctico en los periodos
evaluados.
Materiales y Métodos
El presente estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología y el
Laboratorio especializado de la sección de Biología Molecular y
Biotecnología de la Universidad de Nariño (Torobajo) ubicado en la
ciudad de Pasto, Nariño. En la investigación se utilizó Lactobacillus
casei, una cepa de referencia ATCC® 334™* de colección American
Type Culture Collection, obtenida de un laboratorio reconocido.
La reconstitución de la cepa se hizo en base a agar nutritivo (Nutrient
Agar) marca Oxoid CM0003 de 500 g, elaborado por Oxoid Ltd
(Basingstoke, Hampshire, England). A las 24 horas se realizó la
reconstitución de la cepa de acuerdo a las instrucciones para
microorganismos KWIK-STIK™. Inmediatamente después, se verificó
su crecimiento y se repicó en agar MRS comercial, incubándose por 24
horas a 35°C. Este procedimiento se realizó en cámara de flujo laminar
tipo II, para evitar contaminación del medio. Enseguida, se verificó el
crecimiento, morfología (macroscópica y microscópica) y la pureza
mediante tinción de Gram. Para la conservación de la cepa, se realizó
repique cada cinco días en medio sólido (agar MRS) y cada ocho días
en medio líquido (caldo MRS), estos preservados se incubaron por 2024 horas a 35-37°C y se almacenaron refrigerados en nevera a 4°C.
Asimismo, cada vez que se realizó un nuevo repique o siembra se
confirmó su pureza mediante tinción de Gram.
Posterior a este procedimiento, se inoculó una alícuota con la cepa en
un Erlenmeyer que contenía 40 ml de caldo MRS comercial estéril. La
incubación tuvo un tiempo de 24 horas a 37°C. Terminado este periodo
17
se realizó un repique de 4 ml y se colocó en otros 40 ml de caldo MRS
con las condiciones mencionadas anteriormente.
El porcentaje de inóculo fue ajustado a un 10% v/v al inicio de la
fermentación (Crueger & Crueger, 1993), esto se logró preparando 90
ml de caldo MRS, en el cual se adicionaron 10 ml del inóculo
probiótico con aplicación de la regla. Después se calculó el número de
bacterias por ml.
Se tomó 1 ml del caldo comercial MRS para realizar una lectura directa
en espectrofotómetro a 625 nm, se adicionó caldo estéril cuando la
población encontrada fue mayor a la establecida; esto se realizó a través
del cálculo matemático propuesto por Guerrero (apud Montes et al.,
2003).
Para ello se realizó el siguiente cálculo:
Se tomó como M1 a la población o densidad celular que se debe ajustar,
M2 como la densidad utilizada en la primera fermentación (0,125
densidad óptica equivalente a 1,50 x 108 bact/ml), V1 es 1 ml
proveniente del inóculo total (10/90), X1 fue la cantidad que contenía
M2, V2 es el valor que se agrega a 1 ml, para ajustar a 1,50 x 108
bact/ml, V3 equivale a 100 ml de inóculo total, X2 cantidad de caldo
MRS comercial estéril que se agrega a V3 para ajustar la población al
valor de M2.
Se utilizaron dos medios de cultivo, medio MRS comercial y medio Pro
(Tabla 1).
La cinética de fermentación se efectuó en un Erlenmeyer con 600 ml
del medio y la bacteria probiótica ajustada (540 ml del medio y 60 ml
del inóculo) a 32°C, en agitación constante en incubadora shaker a 100
rpm a 32°C.
La técnica de conteo en placa propicia la información del número de
células viables durante el proceso en términos de UFC/ml, permitiendo
determinar la evolución de la producción de biomasa. Las medidas por
peso seco y turbidimetría no se efectuaron debido una elevada cantidad
de sólidos en suspensión del medio de cultivo. Se diluyó 1 ml de
muestra en 9 ml de agua peptonada al 0,1%, para realizar los conteos.
Luego se hicieron diluciones decimales en las cuales se sembraron 100
µl en cajas de Petri con MRS más azul de anilina. Estas cajas fueron
incubadas a 32°C y se observaron entre las 24 y las 48 horas.
Únicamente fueron consideradas las cajas que presentaron conteos de
30 a 300 UFC/ml observadas durante el periodo de 24 a 48 horas; el
número de colonias encontradas se multiplicó por el inverso de la
disolución y por 10 con el fin de obtener su valor en UFC/ml formadas
(LANARA, 1981), finalmente fueron trabajadas en transformación a
logaritmo natural para los análisis estadísticos.
La evolución del pH se valoró mediante la medición con un pHmetro
digital Jenco® Vision Plus (San Diego, California, Norte América).
La determinación de azúcares se realizó por el método de Dubois
(Antrona), para ello se preparó previamente una curva patrón con
diversas concentraciones de la solución usada como patrón (Figura 1).
Los resultados de la lectura de densidad óptica fueron graficados contra
la concentración en mg/L, para obtener la ecuación de la recta.
Obtenidas las muestras de los diferentes tiempos de la cinética se
procedió a realizar las lecturas de absorbancia a las muestras en
espectrofotómetro a 625 nm, y se procedió a aplicar la fórmula
despejando los valores de X para cada tiempo, teniendo en cuenta que
se trabajó en base a una dilución de 1/100 y 1/1000 para MRS y Pro,
respectivamente.
19
La determinación de proteínas se realizó por el método de Lowry
modificado. Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu
para dar un complejo color azul. La intensidad del color depende del
número de aminoácidos presentes y enlaces peptídicos y cambiará
según la clase de proteína; la solución azul muestra una absorbancia
máxima a 750 nm. Rango de linealidad entre 0-300 mg/L.
Procedimiento: Se ajustó 1 ml de patrones de la curva estándar y
muestras por duplicado, enseguida se adicionó 0,5 ml de NaOH 2 N a
todos los tubos, se colocó en baño María a temperatura de ebullición
durante 10 minutos. Se dejó reposar en baño de agua fría, para
adicionar 0,5 ml de H2SO4 2,6 N. A continuación se adicionó 0,9 ml de
solución A y se llevó por 10 minutos a baño María a 50°C, luego se
dejó reposar en baño de agua fría; después se adicionó 0,1 ml de
solución B y se colocó por 10 minutos en la oscuridad, para finalmente
adicionar 3 ml de la solución C.
Reactivos:
Solución A: Diluir 0,5 g de tartrato de sodio y potasio, 25 g de
carbonato de sodio, 125 ml de hidróxido de sodio 1 N en 125 ml de
agua destilada.
Solución B: Diluir 2 g de tartrato de sodio y potasio, 1 g de sulfato de
cobre en 10 ml de hidróxido de sodio 1 N.
Solución C: Preparar una solución de agua destilada y reactivo de
Folin-Ciocalteu en proporción 14:1 (preparar al momento de usar).
Solución estándar de seroalbúmina bovina: Disolver 15 mg en 50 ml de
agua destilada, el resto se almacena en congelador (concentración final
300 mg/L).
La determinación de producción de ácido láctico se realizó aplicando el
método de titulación con hidróxido de sodio 0,1 N.
Los resultados obtenidos permitieron determinar si la cepa resulta ser la
más adecuada en términos tiempo-tasa de crecimiento durante el
proceso de fermentación para establecer el tiempo de duración en la
producción de biomasa.
Los cálculos de fermentación para las cinéticas se definieron de acuerdo
con Crueger & Crueger (1993) y Rodríguez et al. (2003). Siendo la
velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación:
El tiempo de duplicación celular:
El análisis de producción de ácidos orgánicos se realizó por
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), permitiendo
caracterizar las bacterias en homo o heterofermentativas, estableciendo
un perfil característico para cada especie (Brizuela, 2003), descartando
fácilmente cepas con perfiles idénticos. El caldo de crecimiento se
centrifugó a 8500 rpm, filtrando el sobrenadante por membrana de 0,45
micras. Los ácidos orgánicos fueron determinados por HPLC así:
solvente de fase móvil, ácido sulfúrico a pH 1,5; presión 800-900 PSI;
volumen inyectado: 20 L; temperatura del horno: 65ºC; columna
BIORAD Aminex HPX87 H con soporte de resina trasplantada H+
(copolímero de estireno y bisulfato de divinilbenzeno).
Para la identificación de los péptidos posibles presentes en el
sobrenadante de L. casei, la muestra para análisis de cromatografía
líquida de alta eficiencia (HPLC) se preparó de la siguiente forma:
• La cepa se cultivó en caldo MRS por 24 horas a 32°C, posteriormente
se ajustó por espectrofotometría a una densidad óptica 0,125 en escala
McFarland patrón 0,5 equivalente a una concentración de 1,5 x 108
bacterias/ml.
• Se trasfirieron muestras en tubos Eppendorf y se centrifugaron a
18000
rpm,
durante
30
minutos
a
4°C.
• El sobrenadante se filtró utilizando membranas PVDF de 0,2 micras y
se llevó a lectura.
21
Las condiciones del análisis fueron las siguientes:
Equipo: Cromatógrafo Líquido HPLC Waters – Bomba Binaria 1525.
Columna: C18 300A (Jupiter, Phenomenex 150 mm x 4,6 mm).
Detector: PDA 2998 a 214 y 280 nm Scan (200-350 nm).
Inyector:
Rheodyne
Loop
de
20
μL.
Fase
móvil:
Modo
de
separación
gradiente.
Composición: A (Agua: TFA 0,1%) B (Agua: Acetonitrilo: TFA,
0,1%).
Para el conteo de microorganismos viables en placa UFC/ml obtenidos
durante la cinética de fermentación se adoptó un diseño en bloques al
azar (DBA) dado el número de datos utilizados, los medios se
consideraron como los dos tratamientos y las horas de evaluación
correspondieron a los bloques (11 tiempos), se evaluó el
comportamiento desde el tiempo 0 (cero horas), hasta el tiempo 11 (24
horas); se consideraron dos réplicas para cada medio y tiempo.
Para analizar pH, consumo de azúcar total (mg/L) y % de ácido láctico
resultado de la cinética, se aplicó un análisis de regresión tomando
como variable dependiente las UFC/ml formadas; el modelo usado fue
el siguiente:
Los datos obtenidos se analizaron en SAS 9.1.3 versión 2007 y fueron
sometidos a un análisis de varianza ANDEVA y prueba de significancia
de Tukey para comparar variaciones que resulten estadísticamente
significativas (P<0,05) (Solarte et al., 2009).
Resultados y Discusión
En la Figura 2 se observa el crecimiento de la cepa probiótica cada 2:24
horas durante 24 horas en 11 tiempos de evaluación. El medio Pro
alcanza su fase exponencial más rápido que el medio MRS, con una
caída después de las 14:24 horas de iniciado el proceso.
El máximo crecimiento (UFC/ml) para L. casei en los medios MRS y
Pro, se obtuvo al tiempo 7 (16:48 horas) y tiempo 6 (14:24 horas) de la
cinética, es decir, al alcanzar la fase exponencial de crecimiento, con
valores de 7,3 x 108 UFC/ml y de 3,0 x 1011 UFC/ml respectivamente,
mostrándose así una mayor ventaja con 2:24 horas anticipadas para el
medio Pro, respuesta positiva ya que se facilita la generación de
inóculos probióticos con menor tiempo y menores costos de producción
(Tabla 2). La concentración de proteínas fue de 46,95 g/L y 45,83 g/L
para el tiempo 7 y 6 respectivamente. Posteriormente se presenta una
disminución de estos parámetros.
Estos resultados son importantes por cuanto indican que la formación
de la biomasa por parte de L. casei en los dos medios (MRS y Pro) en
los dos tiempos de mayor crecimiento hacen que presenten un adecuado
consumo de proteínas, y así el medio Pro puede ser adecuado para el
desarrollo de este microorganismo en la fase exponencial. De igual
manera, al comparar estos resultados se puede observar que no se
evidenciaron diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) entre
los efectos de los medios Pro y MRS.
De igual manera, se permite observar que no se presentaron diferencias
estadísticamente significativas (P>0,05) entre los medios de cultivo, no
obstante, al considerar los periodos de evaluación tomando diferentes
tiempos, estadísticamente sí existe diferencia entre las horas de
evaluación (P<0,05), de esta manera el efecto producido por el tiempo
fue bloqueado y permitió un mejor análisis de los tratamientos. El error
estándar no fue considerado dentro del análisis estadístico ya que el R
cuadrado alcanzó un valor considerablemente alto (73%).
23
Finalmente, el análisis de ANOVA revela que los dos tipos de medios
no presentan diferencias estadísticas significativas (P>0,05), por
consiguiente, ambos pueden ser usados como medio de cultivo en
laboratorio, aunque a favor del medio Pro se debe considerar su mayor
producción de biomasa y menor costo de producción para la
elaboración de inóculos probióticos en futuros estudios para el
suministro a animales in vivo.
De esta manera, los valores obtenidos en la prueba expresan ser
adecuados para ser utilizados en la preparación de inóculos con
propiedades probióticas, ya que al alcanzar poblaciones elevadas
permitirá hacer una competencia frente al microorganismo patógeno,
facilitando la colonización del tracto gastrointestinal (Zamudio &
Zabaleta, 2003).
Con la cinética efectuada se determinó tiempo requerido para obtener el
máximo crecimiento microbiano en los medios MRS y Pro, siendo de
16:48 horas (tiempo 7) y 14:24 horas (tiempo 6) respectivamente. Estos
resultados tienen relación con los encontrados por Ramírez (2005), en
un medio similar a base de azúcar blanco, leche de soya, suero de leche
y salvado de trigo con un cultivo de una cepa probiótica asilada de un
probiótico comercial, la cual alcanzó el máximo crecimiento a las 15
horas (tiempo 5) del proceso con 6,2 x 1011 UFC/ml. Asimismo,
Montes et al. (2003) indicaron que en la fermentación por 12 horas en
medio elaborado a base de melaza y leche en polvo con cultivo de
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus se presentó el pico máximo de
crecimiento de la bacteria en el tiempo 10 (11 horas), determinándose
así el tiempo de cosecha con una biomasa de 9,3 x 1011 UFC/ml.
Finalmente, se debe tener en cuenta que la curva de cinética de
fermentación dependerá de los siguientes factores: tipo de cepa
probiótica, tiempo y periodos de evaluación, medio y condiciones de
cultivo.
Para que se presenten efectos beneficiosos, los Lactobacillus deben
sobrevivir y adherirse a la pared del tubo digestivo en número
suficiente, como indican los resultados de la viabilidad (UFC/ml) para
L. casei, y que al mismo tiempo le permitirán una eficiente colonización
en la mucosa intestinal. Uno de los criterios de selección más
importantes para determinar qué microorganismos serán utilizados
como potenciales probióticos, es la habilidad de adherirse a la mucosa
intestinal debido a que es un prerrequisito para poder colonizar el
intestino (León, 2012).
Los estudios de medios y condiciones de cultivo que permitan la
obtención de altas concentraciones de microorganismos (>107 UFC/ml),
han sido el objetivo fundamental cuando se trabaja con bacterias ácidolácticas, como microorganismos iniciadores y como aditivos
probióticos para aumentar el valor nutritivo de los productos. De esta
forma, la biomasa de estos microorganismos ha adquirido un mayor
valor y una mayor demanda. Infortunadamente, los métodos de cultivo
industrial de probióticos se caracterizan por sufrir de la inhibición del
crecimiento celular debido a la producción de ácido láctico, un producto
primario de su metabolismo (Mack et al., 2003).
En este sentido es difícil proponer una cantidad precisada, ya que
depende de la normatividad y legislación de cada país, pero se ha
propuesto que deben contar con una población mínima de 106 UFC/ml,
mientras que Ouwehand et al. (2002) y otros autores denotan que debe
tener la cantidad necesaria para que se ingiera 109 UFC/ml.
En la Figura 3 se observa cómo en la fase exponencial hay mayor
producción de biomasa a pH de 5,94 y 6,01 en el medio MRS y Pro
respectivamente, y finaliza con valores de 5,74 y 5,57 a las 24 horas de
la cinética.
Los Lactobacillus como microorganismos acidúricos, pueden crecer a
pH inferiores a 5 (Kandler & Weiss, 1986). Estudios revelan cómo
diferentes pH influyen sobre el crecimiento de L. casei, encontrando
que la bacteria probiótica no crece adecuadamente cuando es inoculada
en un medio de cultivo a pH de 5, comparada con otros pH de 6 y 7 en
donde hubo un mayor crecimiento (García & Jerez, 2004).
25
Los valores de pH encontrados en los tiempos de cinética favorecen los
procesos de fermentación, en la producción de inóculos; entre las cepas
que soportan pH de 2,5 se encuentran Lactobacillus casei (ATCC
27139, FAGRO 98, FAGRO 98LP) y Lactobacillus rhamnosus
(FAGRO 36,5 y FAGRO 53,1), indicando que son capaces de
sobrevivir al ambiente del tracto gastrointestinal, no son afectadas por
pH ácidos y a concentraciones altas de sales biliares (León, 2012). Por
lo anterior, estas cepas serían capaces de soportar la acidez que se
presenta en el estómago de especies como el cuy y el cerdo (alrededor
de 4,0), siendo uno de los principales obstáculos para el paso a través
del tracto gastrointestinal.
La evolución del pH fue relacionado con el incremento en cada unidad
Ln UFC/ml mediante análisis de regresión, siendo el pH la variable
independiente que presenta un valor de B1, -0,32244 en el medio MRS
y de -0,15537 en el medio Pro, lo que significa que por cada unidad
logarítmica del crecimiento de colonia el pH disminuye en -0,32244 y 0,15537 unidades de pH para cada medio, notándose una mayor caída
del pH en el medio Pro.
El consumo de azúcares totales presentó valores de 4,36 mg/L y 33,48
mg/L para los medios MRS y Pro respectivamente, a las 16:48 horas y
14:24 horas de efectuada la cinética, respectivamente (Figura 4).
Mediante el análisis de regresión se relacionó el consumo de azúcares
totales y la formación de UFC/ml hasta la fase logarítmica de
crecimiento a través del tiempo durante el proceso fermentativo. La
pendiente de la recta (B1, -0,4355) en el medio MRS indica que, en
promedio a cada incremento de una unidad logarítmica de UFC/ml, se
consume el azúcar total en 0,4355 mg/L; igualmente sucede en el medio
Pro que presenta un valor de B1, -1,228, significa que 1,228 mg/L de
azúcar son consumidos por cada unidad Ln UFC/ml.
Comparando los dos valores de las variables independientes, se
considera que el consumo de azúcar es menor en MRS, que en el medio
probiótico, donde la concentración de azúcares es más significativa
dadas las condiciones de las materias primas utilizadas, permitiéndole a
los microorganismos contar con una mayor cantidad de nutrientes, sin
que estos lleguen a ser un factor limitante para su crecimiento.
27
Según Jurado (2009) y Ramírez et al. (2011), las BAL (bacterias ácido
lácticas) requieren para su multiplicación de azúcares como lactosa y
glucosa, además de aminoácidos, vitaminas y otros factores de
crecimiento; no obstante, la leche constituye un medio especial y
satisfactorio para la proliferación de este tipo de bacterias, mientras la
mayoría de las especies necesitan además varios aminoácidos (Parra,
2010) y vitaminas del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, ácido
nicotínico, ácido pantotéico, ácido fólico).
En general, para que L. casei se implante y colonice dentro del tracto
del animal, es indispensable que disponga de una dieta rica en sustratos
prebióticos, algunos de estos son de naturaleza lignocelulósica
(oligosacáridos, fructooligosacáridos, fibra, cereales), derivados de la
lactosa (galactooligosacáridos, lactulosa, lactitol), inulina entre otros;
para este caso, la función como prebiótico la cumple el salvado de trigo
(fibra insoluble) (Jurado, 2009).
La leche de soya es una buena fuente de hidratos de carbono,
principalmente sacarosa, rafinosa y estaquiosa, así como proteínas y
magnesio; durante la fermentación, más del 60% del contenido inicial
de estaquiosa, rafinosa y sacarosa en la leche de soya se metaboliza por
las bacterias. El azúcar es otra fuente importante de carbono, que
favorece la producción de energía y la producción del ácido láctico.
Los medios MRS y Pro presentaron 0,36% y 0,71% de ácido láctico al
tiempo 7 y 6, respectivamente. Los resultados valorados mediante el
método de titulación se muestran en la Figura 5.
La producción de ácido láctico se ve reflejada como producto de la
fermentación de azúcares por BAL, y es considerado un metabolito
generado por ciertos microorganismos y es clasificado como GRAS
(generalmente reconocido como seguro) para su empleo como aditivo
alimenticio por la FDA (Administración de Drogas y Alimentos) (Parra,
2010). La producción de ácido láctico se da a partir de la fermentación
de las hexosas a ácido láctico por la vía Embden-Meyerhof (Samaniego
& Sosa, 2012). Además, el potencial de la producción de ácido láctico
así como peróxido de hidrógeno y bacteriocinas principalmente de las
cepas probióticas se ve reflejado por su papel bactericida, su acción se
da por atacar el metabolismo de las bacterias patógenas o atacar sus
estructuras como, por ejemplo, la membrana citoplasmática (González
et al., 2003).
La producción de ácido láctico fue valorada mediante análisis de
regresión, determinando el efecto del ácido láctico sobre el número de
colonias, la variación positiva de 0,03846 % de ácido láctico
incrementa en una unidad Ln UFC/ml para MRS. En el medio Pro los
resultados fueron similares, por cada incremento en una unidad de Ln
UFC/ml la acidez se incrementa en 0,01929%, un estado muy favorable
debido al hecho de que durante la cinética tal evento marca cierta
29
diferencia para establecer el punto exacto para la cosecha del cultivo
probiótico.
La prueba por HPLC indicó que las cepas de L. casei eran
homofermentivas, presentando una producción de ácido láctico superior
al 80% (Tabla 4), el cual podría contribuir a disminuir el pH del medio y
actuar como inhibidor de microorganismos patógenos (Ramírez, 2005).
El 20% restante se evidenció que correspondía a ácido cítrico, ácido
succínico, ácido acético y etanol (Tabla 3).
La identificación tentativa de los péptidos se realizó por análisis de los
picos de los espectros UV integrados por el sistema de detección de
PDA. Se utiliza como una mezcla de referencia estándar de péptido
(Sigma H2016) utilizado en las mismas condiciones (Tabla 4 y Figura 6a).
Los resultados reportados para el análisis de las muestras, con el uso de
HPLC (espectro UV 214 nm), se observan en la Tabla 5.
En la muestra P (L. casei), el pico No. 9 (tr = 12,1 min) presenta un
tiempo de retención similar al del pico No. 2 del estándar de
calibración, por lo que posiblemente el péptido de esta muestra presente
una cadena de aminoácidos compuesta por VAL-TIR-VAL (PM =
379,5). Los espectros UV presentan longitudes similares de máxima
absorción.
El pico No. 3 del estándar, que corresponde al péptido metionina
enkefalina acetato, de composición (TIR-GLI-GLI-FA-MET)M6638
(PM =573,7 para la base libre), presenta un tiempo de retención similar
al del pico No. 12 de la muestra P (L. casei). Los máximos de
absorbancia de los espectros presentan longitudes de máxima absorción
muy cercanas, sin que se evidencie una diferencia marcada.
31
Los resultados de la producción de biomasa relacionada con distintos
factores aparecen en la Tabla 6.
De acuerdo a los resultados obtenidos en la cinética, el medio Pro
resultó ser el más adecuado, alcanzó el valor mayor de μh-1, y por lo
tanto el tiempo de duplicación celular es menor, lo que se ve reflejado
al haber alcanzado una mayor concentración celular en la fase
logarítmica a las 14:24 horas. Como se puede observar en los resultados
encontrados, el medio MRS presenta desventajas debido a que
presentaría un tiempo de duplicación celular muy elevado y esto
implica que al llegar a la fase logarítmica la concentración celular será
mucho menor, con respecto al medio Pro.
Por otro lado, se deben tener en cuenta los costos de producción, ya que
estos son de gran interés en el proceso de producción a nivel industrial
en la elaboración de inóculos. De acuerdo con Jurado (2009), el costo
de 500 g del medio MRS es aproximadamente $210.000 (USD 108,46),
y el costo de elaboración de un litro de este medio comercial es
$27.142,86 (USD 14,02); comparado con el medio Pro elaborado con
azúcar blanco, leche de soya, salvado de trigo y leche en polvo el costo
por litro del medio probiótico asciende a únicamente a $2.775 (USD
1,42).
El tiempo requerido para alcanzar la fase logarítmica en los medios
MRS y Pro, fue a las 16:48 horas (tiempo 7) y 14:24 horas (tiempo 6)
respectivamente. El crecimiento bacteriano expresado como UFC/ml
demostró valores de 7,3 x 108 UFC/ml para MRS y 3,0 x 1011 UFC/ml
para Pro. Los valores obtenidos en los dos medios indican ser
adecuados para ser utilizados en la preparación de inóculos con
propiedades probióticas, que posteriormente podrían ser utilizados en
ensayos in vivo en especies de gran importancia zootécnica como los
son cuyes, cerdos y aves, que ayudarían a obtener una mejoría en la
producción y salud animal.
Agradecimientos
Al personal de los Laboratorios Especializados y Laboratorio de
Microbiología de Ciencias Pecuarias de la Universidad de Nariño, y a
todas las personas que de una u otra manera colaboraron en el
desarrollo del proyecto.
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Disponible en:
35
Clasificación fenomenológica de las crisis epilépticas en caninos
SHORT
ARTICLE
Lina Maria Delgado-Garcia1, 2, Sergio Eduardo Linares-Villalba2
1,
Departamento de Clínica Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinária y
Zootecnia. UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil.
2,
Grupo de Investigación CIENVET, Facultad de CienciasAgropecuarias,
Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia.
[email protected]
(Recibido: 07 de Septiembre de 2014 Aprobado: 06 de Abril de 2015 Actualizado: 07 de julio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.3
RESUMEN: El estudio de las crisis epilépticas en caninos es relevante en
investigación, ya que son un modelo natural de epilepsia, como en clínica de pequeños
animales, debido a su alta frecuencia en el atendimiento neurológico. Este trabajo
adaptó el apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva”
en la clínica de pacientes caninos con crisis epiléptica para clasificar su fenomenología
y reconocer una zona sintomatogénica. El análisis de la fenomenología y la zona
sintomatogénica sugieren que caninos con crisis epiléptica presentan áreas cerebrales
sensibles de generar actividad neuronal anormal, específicamente; la alta frecuencia
del grupo fenomenológico Motor definió una localización en el lóbulo parietal-frontal.
Palabras clave: epilepsia, ictus, semiología, sintomatología, zona sintomatogénica
Phenomenological classification of epileptic seizures in dogs
ABSTRACT: The study of canine seizure is relevant in research as a
natural model of epilepsy in small animal clinic, because of its high frequency in the
neurology service. This work adapted the “Ictal Phenomenology. Glossary of
Descriptive Ictal Terminology” appendix in the clinic of canine patients with epileptic
crisis to classify its phenomenology and recognize a symptomatology zone. The
Phenomenology and the symptomatology zone analysis suggest that canines in
epileptic crisis present brain areas sensible of generating abnormal neuronal activity,
specifically; the high frequency of the phenomenological motor group defined a
parietal-frontal lobe localization.
Key words: epilepsy, ictus, semiology, symptomatology zone, symptomatology
Introducción
Las crisis epilépticas son comunes en humanos, caninos y felinos (Berendt,1999;
Berendt et al.,2004; Chandler, 2006; Pákozdy et al., 2010; Thomas, 2010; Lorenz et
al., 2011).El estudio de las crisis epilépticas en caninos es relevante en investigación,
ya que son un modelo natural de epilepsia (Potschka et al., 2013), como en clínica de
pequeños animales, debido a su alta frecuencia en el atendimiento neurológico (Moore,
2013).Según la Liga Internacional contra la Epilepsia (ILAE) las crisis epilépticas o
ictus son una manifestación transitoria de signos y/o síntomas debido a una actividad
neuronal anormal excesiva o sincrónica en el cerebro (Blume-Chair et al., 2001; Berg
et al., 2010; Fisher et al., 2010); siendo una convulsión un término legal, no especifico
y de uso inapropiado, para describir una crisis epiléptica (Blume-Chair et al., 2001).
Históricamente, el primer documento conocido sobre epilepsia y crisis epiléptica es la
Clasificación Internacional de la ILAE, de Merlis (1970), el cual tuvo en cuenta
aspectos clínicos básicos; posteriormente, fue divulgada la clasificación World Health
Organization (WHO, 1987; 1994) basada en la descripción de la sintomatología ictal y
paralelamente la Clasificación de las Crisis Epilépticas(Commission on Classification
and Terminology of the International League Against Epilepsy, 1981) y la
Clasificación de las Epilepsias y Síndromes Epilépticos(Commision on Classification
and Terminology of the International League Against Epilepsy,1989) concerniente,
primariamente, a síndromes. En 1997, tras una amplia revisión de los documentos
anteriores, la comisión de la ILAE creó un esquema diagnóstico constituido por
apéndices que incluyó terminología y conceptos estandarizados para describir
pacientes con epilepsia y crisis epilépticas (Engel, 2001), facilitando el abordaje
clínico para determinar los estudios diagnósticos y las estrategias terapéuticas a ser
tomadas (Engel, 2001,2006).
El apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” es
usado actualmente para describir crisis epilépticas (Blume-Chair et al., 2001; Engel,
2001; Berg et al., 2010). En medicina veterinaria es apenas reportado en estudios de
carácter descriptivo (Berendt,1999; Berendt et al., 2004), siendo aún desconocido para
la mayoría de los clínicos veterinarios de pequeños animales.
La zona sintomatogénica es el área de la corteza cerebral que una vez activada por una
descarga epileptiforme produce síntomas ictales o crisis epilépticas siendo detectada a
través del análisis de la sintomatología o fenomenología ictal, el histórico de las crisis
o el análisis de registros de video (Rosenow & Luders, 2001).Los trabajos de Acharya
et al. (1997) y Hammer et al. (1999) en niños con epilepsia fueron pioneros en detectar
la zona sintomagénica a través de la sintomatología ictal, así sugirieron relaciones
entre síntomas y zona sintomagénica que actualmente son aplicadas, la figura 1 muestra
un esquema de sus principales hallazgos. Con el objetivo de difundir esta terminología
y demostrar una aplicación práctica en la clínica de pequeños animales, este trabajo
adaptó el apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva”
en la clínica de pacientes caninos con crisis epiléptica para clasificar su fenomenología
y reconocer una zona sintomatogénica.
37
Fueron seleccionados los registros clínicos de 31 pacientes caninos sin distinción de
raza, sexo o edad con anamnesis de crisis epiléptica atendidos en el Hospital
Veterinario Diego Villegas Toro, de la Universidad de Caldas, durante el periodo
2009-2011.Para cada registro se adoptó el documento “Fenomenología ictal. Glosario
de Terminología Descriptiva”(tabla 1), considerando aquellos comportamientos que
pueden ser observados en pacientes veterinarios se relacionó la sintomatología descrita
en la anamnesis con los conceptos para fenomenología Motor, No motor y
Autonómica, así como su zona sintomatogénica(tabla 2).
39
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Análisis estadístico
Se realizó análisis de frecuencia y probabilidad para la fenomenología de las crisis
epilépticas y la zona sintomatogénica.
43
La figura 2 muestra el análisis de la fenomenología de las crisis epilépticas, el grupo
Motor está presente en todas las crisis, con alta frecuencia y probabilidad para todos
los grupos fenomenológicos y de la asociación Motor, No Motor y Autonómico. La
figura 3 muestra el análisis de la zona sintomatogénica, se destacó que el lóbulo parietal
estuvo presente en todas las crisis con alta frecuencia y probabilidad del lóbulo frontal
contralateral.
Fueron estudiados los registros de 31 pacientes caninos con anamnesis de crisis
epiléptica (tabla 2), para cada registro se adoptaron los parámetros del apéndice
“Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva” siendo la
sintomatología distribuida en los grupos fenomenológicos Motor, No motor y
Autonómico y sugiriendo una zona sintomatogénica. El apéndice contiene
terminología estandarizada en el área de la salud, destinada a comunicar lo que se
observay/o lo que el paciente reporta durante una crisis epiléptica (Blume-Chair et al.,
2001); en medicina, la descripción semiológica es a menudo obtenida de la familia y
cuidadores de pacientes derivando en términos comunes para los síntomas ictales
(Berg et al., 2010).
En el caso del clínico veterinario, la descripción de la fenomenología se basa
enteramente en las observaciones del propietario y clínicos siendo el apéndice y los
conceptos de la ILAE herramientas previamente usadas en estudios descriptivos en
epilepsia canina y felina (Berendt et al., 2004; Chandler, 2006; Pákozdy et al., 2010;
Ekenstedt,2013; Mariani, 2013),sin embargo, un estudio demostró que existe niveles
relativamente bajos de acuerdo entre la presencia de una crisis epiléptica, el tipo de
crisis y la semiología reportada por clínicos veterinarios especialistas y no especialistas
(Packer et al., 2015).
De este modo, la correcta descripción de la fenomenología en una crisis epiléptica
provee un vocabulario que facilita la comunicación entre clínicos (Rosenow & Luders,
2001) y permite realizar diagnósticos confiables (Packer et al.,2015).
El ictus o crisis epiléptica es reconocido por la disfunción de una o más de las
funciones motoras (alteraciones musculares o movimientos involuntarios) y
autonómicas, con pérdida de la conciencia y automatismos (movimientos repetitivos) o
comportamientos paroxísticos (disturbios psíquicos) (Licht et al., 2002; Graeff Viana
& Vahia, 2007; Lorenz et al., 2011; Morita et al., 2011; Mariani, 2013). El análisis de
la fenomenología de cada crisis epiléptica fue eficaz en reconocer estas disfunciones,
45
específicamente en el caso del grupo fenomenológico Motor; presente en todas las
crisis (figura 1)comprometiendo el componente óseo-muscular del paciente; permitió
distinguir entre signos motores elementares (signos tónicos, mioclónicos, tónicoclónicos y atónicos) y automatismos o signos que acometen actividades musculares
coordinadas o movimientos voluntarios (tabla 2).
Otro hallazgo relevante en el análisis fue la alta frecuencia y probabilidad de los
grupos fenomenológicos No motor y Autonómico, así como su asociación con el grupo
Motor (figura 1). Al respecto, se considera que signos somatosensoriales o síntomas
sensoriales especiales y psíquicos involucran disturbios de funciones y áreas cerebrales
superiores o especializadas (Berendt et al., 2004). Estas funciones son poco
familiarizadas con crisis epilépticas en pacientes veterinarios y a menudo pasan
desapercibidas en la anamnesis; siendo los signos autonómicos y comportamentales
poco reportados entre los clínicos (Packer et al., 2015).
El análisis de la fenomenología de las crisis epilépticas, además de que suministró
información descriptiva detallada, es también una herramienta útil para la detección de
la zona sintomatogénica. En medicina, la fenomenología de pacientes con epilepsia y
crisis epilépticas es usada para distinguir los patrones de crisis epilépticas de cada
lóbulo cerebral y determinar su plan terapéutico(Yacubian, 1998). Este trabajo usó los
hallazgos de Acharya et al. (1997) y Hammer et al. (1999) (figura 1) para la localización
y análisis de la zona sintomatogénica en todas las crisis epilépticas de caninos,
deduciendo quela participación en todas las crisis del grupo fenomenológico Motor
derivó en una localización en el lóbulo parietal y frontal contralateral. La asociación
crisis motora y localización parietal-frontal ha sido igualmente encontrada en estudios
fenomenológicos (Mariani et al., 2013) y estudios clínico–patológicos (Morita et al.,
2011).
Conclusiones
El apéndice “Fenomenología ictal. Glosario de Terminología Ictal Descriptiva”
permitió describir la fenomenología de las crisis epilépticas en caninos, con lo cual se
comprobó que la adopción de la péndice en la evaluación clínica de pacientes con
crisis epiléptica contribuye en la universalización de los conceptos y la comunicación
entre clínicos, además de ser eficaz en detectar la zona sintomatogénica de cada
paciente.
El análisis de la fenomenología y la zona sintomatogénica sugiere que caninos con
crisis epiléptica presentan áreas cerebrales sensibles de generar actividad neuronal
anormal, específicamente; la alta frecuencia del grupo fenomenológico motor definió
una localización en el lóbulo parietal-frontal. Múltiples estudios son necesarios para
entender los mecanismos fisiológicos implicados en la susceptibilidad de esta área
cerebral y mejorar el conocimiento sobre las crisis epilépticas en caninos.
Agradecimientos
Programa “Joven Investigador” de COLCIENCIAS, Vicerrectoría de Investigaciones y
Posgrados (H022) y Hospital Veterinario Diego Villegas Toro, Universidad de Caldas.
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Disponible en:
Osteoartrose: aspectos clínicos e novas perspectivas terapêuticas
baseadas na terapia regenerativa
REVIEW
ARTICLE
Esteban Osorio-Carmona1, Cleuza Maria de Faria Rezende2
1,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil.
Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias, Escola de Veterinária,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil.
2,
[email protected]
(Recibido: 22 de Enero de 2015 Aprobado: 23 de Abril de 2015Actualizado: 25 de junio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.4
RESUMO: As doenças articulares em animais de pequeno porte
representam uma alta porcentagem na rotina hospitalar. A alta freqüência de lesões
articulares decorrentes de diferentes fatores (fraturas intra-articulares, ruptura de
ligamentos, doenças predisponentes, dentre outras) exige terapias mais efetivas. O
objetivo do tratamento das doenças articulares após a correção das causas primárias é
diminuir a dor e retardar o avanço da osteoartrose. O equilíbrio no metabolismo da
cartilagem é de vital importância para a manutenção da integridade da matriz
extracelular e das outras estruturas que formam a cartilagem. O desequilíbrio entre as
citocinas e fatores de crescimento pode levar a alterações irreversíveis e incapacitantes
na superfície articular das principais articulações. A osteoartrose caracteriza-se pela
alteração da estrutura da cartilagem articular, diminuição dos movimentos articulares
acompanhada de crepitação, formação de osteófitos, claudicação, dor e perda da
função. Os tratamentos disponíveis na atualidade incluem os conservativos e cirúrgicos
que visam estabilizar as articulações e aliviar a dor embora não previnam a progressão
da doença articular degenerativa. O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma substância
autóloga obtida a partir de sangue total submetido a processos de centrifugação e
ativação que tem mostrado potencial terapêutico no tratamento de algumas doenças e
em diversas áreas da medicina humana e veterinária. O objetivo deste levantamento
bibliográfico é revisar os principais aspectos da osteoartrose, o papel das citocinas no
desenvolvimento da mesma, as características do plasma rico em plaquetas, sua
obtenção e seu emprego como nova alternativa terapêutica nas principais lesões
articulares que acometem os animais domésticos.
Palavras chave: cães, fatores de crescimento, doença articular degenerativa, plasma
rico em plaquetas
49
Osteoartritis: aspectos clínicos y nuevas perspectivas terapéuticas basadas en la
terapia regenerativa
RESUMEN: Las enfermedades articulares en animales de pequeño porte
representan un alto porcentaje en la rutina de los hospitales veterinarios. La alta
frecuencia de lesiones articulares derivadas de diferentes factores (fracturas intraarticulares, ruptura de ligamentos, enfermedades predisponentes, entre otras) exige
terapias más efectivas. El objetivo del tratamiento de las enfermedades articulares
después de la corrección de las causas primarias es disminuir el dolor y retardar el
avance de la osteoartritis. El equilibrio en el metabolismo del cartílago es de vital
importancia para el mantenimiento de la integridad de la matriz extracelular y de las
otras estructuras que forman el cartílago. El desequilibrio entre las citocinas y los
factores de crecimiento puede llevar a alteraciones irreversibles e incapacitantes en la
superficie articular de las principales articulaciones. La osteoartritis se caracteriza por
la alteración de la estructura del cartílago articular, disminución de los movimientos
articulares acompañado de crepitación, formación de osteófitos, claudicación, dolor y
pérdida de la función. Los tratamientos disponibles en la actualidad incluyen los
conservativos y quirúrgicos que tratan de estabilizar las articulaciones y aliviar el
dolor, pero no prevenir la progresión de la enfermedad articular degenerativa. El
plasma rico en plaquetas (PRP) es una sustancia autóloga obtenida a partir de la sangre
total sometida a procesos de centrifugación y activación que han mostrado potencial
terapéutico en el tratamiento de algunas enfermedades y en diversas áreas de la
medicina humana y veterinaria. El objetivo de esta presentación bibliográfica es
revisar los principales aspectos de la osteoartritis, el papel de las citocinas en el
desarrollo de esta, las características del plasma rico en plaquetas, procesos de
obtención y su uso como nueva alternativa terapéutica en las principales lesiones
articulares que afectan a los animales domésticos.
Palabras clave: canino, factores de crecimiento, enfermedad articular degenerativa,
plasma rico en plaquetas.
Osteoarthritis: clinical aspects and new therapeutic perspectives based on
regenerative therapy
ABSTRACT: Joint diseases in small animals represent a high percentage
in the routine of veterinary hospitals. The high frequency of joint injuries resulting
from various factors (intra-articular fractures, ruptured ligaments, predisposing
diseases, etc.) requires more effective therapies. The goal of treatment of joint diseases
after correction of the primary causes is to decrease pain and delay the progression of
osteoartritis. Equilibrium in the cartilage metabolism is critical for maintaining the
integrity of the extracellular matrix and the other structures that form the cartilage. The
imbalance between cytokines and growth factors can lead to irreversible and disabling
alterations in the joint surface of the major joints. Osteoarthritis is characterized by
alteration of the structure of articular cartilage, decrease in joint movement
accompanied by crackling, osteophyte formation, lameness, pain and loss of function.
The currently available treatments include conservative and surgical ones trying to
stabilize joints and relieve pain, but not to prevent the progression of the degenerative
joint disease. Platelet rich plasma (PRP) is an autologous substance obtained from
whole blood subjected to centrifugation and activation processes that have shown
therapeutic potential in the treatment of certain diseases and in various areas of human
and veterinary medicine. The objective of this bibliographical presentation is to review
the main aspects of osteoarthritis, the role of cytokines in its development, the
characteristics of platelet-rich plasma, processes for its obtation and use as a new
therapeutic alternative in the main joint injuries affecting domestic animals.
Key words: canine, growth factors, degenerative joint disease, platelet rich plasma
Introdução
As doenças ortopédicas, especialmente as articulares, representam uma grande
porcentagem de casos na rotina dos hospitais veterinários e podem acometer animais
de qualquer idade ou sexo (Tatarunas, 2004). Essas afecções, decorrentes
principalmente de lesões traumáticas significativas, podem afetar os ossos e
ligamentos, comprometendo assim a estabilidade articular e a integridade da
articulação.
Dentre as lesões articulares destacam-se as displasias, osteocondroses, luxações e
lesões ligamentares associadas a rupturas completas ou não que acometem as
articulações femoro-tibio-patelar (FTP), coxofemoral (CF), escápulo-umeral (EU) e
úmero-rádio-ulnar (URU), principalmente. Alterações nestas articulações são as que
causam maior comprometimento na deambulação do animal.
A estrutura mais freqüentemente acometida na articulação FTP é o ligamento cruzado
cranial (LCCr), cuja ruptura, seja parcial ou completa, produz instabilidade articular
que ocasiona o desenvolvimento da osteoartrose (OA) (Arnold et al., 1979; Innes et al.,
2000; Johnson et al., 1994; Maletius & Messner, 1999; Wainer et al., 1998).
São relatadas na literatura diferentes modalidades terapêuticas para o tratamento da
ruptura total ou parcial do LCCr, como protocolos conservativos e tratamentos
cirúrgicos que incluem técnicas extra e intra-capsulares. As técnicas cirúrgicas têm
como objetivos o restabelecimento da estabilidade articular e o retardamento do
progresso da OA (Chang et al., 2003; Codesido et al., 2009; Dürselen et al., 1996;
Huang et al., 2008; Meisterling et al., 2009; Muzzi et al., 2009).
Novas alternativas terapêuticas que se baseiam na aplicação intra-articular de
diferentes tipos de células autógenas, obtidas de diferentes fontes, são propostas para
favorecer a recuperação dos tecidos lesionados. Essas células possuem características
intrínsecas tais como fatores de crescimento e pluri-potencialidade para proliferar e se
diferenciar em diferentes tipos celulares que podem modular a regeneração tecidual.
Estas novas terapias são conhecidas como terapia regenerativa e engenharia tecidual
(Huang
et
al.,
2008;
Petrigliano
et
al.,
2006;
Silva,
2012).
A terapia celular regenerativa inclui principalmente células tronco, células tronco
mesenquimais, e concentrados autólogos de plaquetas, cuja literatura relata o efeito
benéfico de seu uso na reparação e cicatrização de tecidos doentes ou lesionados. Os
resultados mostram grande potencial terapêutico do plasma rico em plaquetas (PRP)
quando empregado em humanos na reparação dental e maxilar (Oates et al., 1993;
Rodriguez-Florez et al., 2012), em cavalos para o tratamento de lesões
51
musculoesqueléticas (Carmona, 2006) e em cães como terapia coadjuvante no
tratamento da osteoartrose adquirida (Silva, 2012).
Estudos experimentais têm mostrado o efeito favorável do emprego de PRP no retorno
das funções após lesões ligamentares, lesões traumáticas na cartilagem articular e em
fraturas, mas ainda há controvérsia sobre sua ação nos tecidos articulares (Milano et
al., 2010; Patel et al., 2013; Torres, 2006; Weibrich et al., 2004). Assim, o objetivo
desta revisão é analisar aspectos como a homeostase da cartilagem, os fatores
bioquímicos envolvidos no equilíbrio articular, a osteoartrose e seus fatores
desencadeantes e o PRP, incluindo a função das plaquetas, princípios biológicos do
PRP, seus componentes estruturais, substâncias empregadas para sua ativação, sua
obtenção e seu uso na medicina humana e veterinária.
Homeostase da cartilagem, citocinas e seu papel nas doenças articulares
Nas articulações sinoviais, a cartilagem articular proporciona proteção ao osso
subcondral contra as cargas mecânicas e as forças de corte. Esse tecido conjuntivo
altamente especializado é composto principalmente por água, colágeno e
proteoglicanos que formam uma fibra rígida reforçada com alta resistência e
capacidade para absorver impactos (Stockwell, 1991).
A cartilagem articular é um tecido conectivo avascular, aneural e alinfatico desenhado
para distribuir as cargas mecânicas e proporcionar uma superfície de resistência ao
desgaste para as estruturas articulares (Buckwalter & Mankin, 1998; Mobasheri
&Henrotin, 2010).
O tecido cartilaginoso é feito de matriz extracelular (MEC). Os condrócitos são as
principais células na cartilagem articular normal e são muito ativos, eles são os
principais responsáveis pela manutenção da MEC. Acredita-se que a integridade da
matriz é mantida pelo equilíbrio entre as citocinas anabólicas (fatores de crescimento)
tais como o Insulinic Growth Factor (IGF) e o Transforming Growth Factor β (TGF-β)
que induzem a produção das macromoléculas que formam a cartilagem articular e os
efeitos catabólicos das citocinas interleucina 1α (IL-1α), interleucina 1β (IL-1β) e o
fator de necrose tumoral α (FNT-α), as quais induzem a produção de metaloproteinases
específicas degradadoras da matriz (Shinmei et al., 1990; Westacott & Sharif, 1996).
O papel e o mecanismo de ação das citocinas na progressão da OA têm recebido
especial atenção nas pesquisas recentes devido à particular interação entre a cartilagem
articular e a sinovia na fisiopatologia da doença (Pelletier et al., 1991; Westacott &
Sharif, 1996).
A manutenção da homeostase da matriz da cartilagem articular requer renovação dos
componentes da matriz, principalmente do colágeno e dos proteoglicanos. Acredita-se
que os condrócitos e os sinoviócitos são estimulados, através de receptores de
membrana específicos, pelas citocinas, tais como a IL-1 e o FNT-α para produzir
proteases da matriz cartilaginosa e para suprimir a síntese de colágeno e proteoglicanos
(Pelletier et al., 1991). Assim as citocinas não só favorecem a destruição do tecido,
mas também inibem a reparação do mesmo (Pelletier et al., 1991).
Muitos fatores de crescimento tais como o TGF-β, podem neutralizar o efeito das
citocinas pela estimulação da síntese dos componentes da matriz ou atuando como
inibidores naturais das enzimas degradadoras da cartilagem (Pelletier et al., 1991).
As citocinas são liberadas por algumas células em resposta a um sinal específico e
influenciam a função das células, exercendo um efeito positivo ou negativo na
expressão genética (Arend & Dayer, 1993). Estas moléculas têm uma vida média
relativamente curta, fazendo com que usualmente exerçam sua função nas células do
local onde são liberadas (Arend & Dayer, 1993).
As citocinas são sintetizadas por células como monócitos, macrófagos, sinoviócitos e
fibroblastos, os quais se encontram aumentados na sinovia inflamada, podendo assim
modular o metabolismo dos tecidos conjuntivos (Larrick & Kunkel, 1988).
Os tecidos conjuntivos são caracterizados pela abundância da sua MEC. Para o
funcionamento dos tecidos, requer-se uma arquitetura normal dessa matriz cuja
homeostase é controlada principalmente pelas células do tecido conectivo através da
regulação dos eventos de síntese e degradação estimuladas pelas citocinas que atuam
como mensageiros intracelulares (Pelletier et al., 1991; Westacott & Sharif, 1996). As
células da MEC além de sintetizar os componentes estruturais essenciais da matriz
como o colágeno e os proteoglicanos, produzem as proteases responsáveis pela
renovação desses componentes (Pelletier et al., 1991; Westacott & Sharif, 1996).
Acredita-se que a super-regulação ou um excesso das citocinas tem um papel
determinante na fisiopatologia de muitas doenças articulares, principalmente na OA,
embora esse papel ainda não seja bem estabelecido (Westacott & Sharif, 1996).
Em tecidos normais, a homeostase da matriz pode ser considerada balanceada quando
a taxa da nova síntese de matriz é igual à taxa de degradação da mesma, sendo que não
há nem perda nem ganho neto de tecido. Um desequilíbrio na síntese e degradação é
comumente associado com estados patológicos (Pelletier et al., 1991).
Os processos degradativos e de síntese são controlados por proteínas extracelulares
denominadas fatores de crescimento ou citocinas. Os fatores de crescimento tais como
o IGF e o TGF- β são associados principalmente com a estimulação da formação de
tecido conectivo, enquanto as citocinas, tais como a IL-1 e o FNT-α são
principalmente associados com a estimulação da degradação da MEC (Gupta, 1988;
Pelletier
et
al.,
1991).
É sabido que algumas citocinas antagonizam os efeitos de outras como, por exemplo, a
atividade da IL-1 é diminuída na presença do TGF- β e do IGF, possivelmente devido
à sub-regulação do receptor da IL-1 (Harvey et al., 1991; Tyler, 1989; Westacott &
Sharif, 1996). Esses mecanismos de controle são essenciais para manter a integridade
dos tecidos. Alterações no equilíbrio dos mecanismos de ação das citocinas podem
contribuir ou desencadear processos destrutivos e degradativos das articulações
(Westacott & Sharif, 1996).
Osteoartrose
A OA é uma doença multifatorial e com diferentes fatores predisponentes (Stockwell,
1991) que pode acometer qualquer articulação, incluindo a articulação coxo-femoral
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(CF), a úmero-rádio-ulnar (URU) e a fêmoro-tíbio-patelar (FTP) (Franklin et al., 2009;
Rychel, 2010). Esta doença é a mais comum das afecções articulares nos animais
domésticos, afetando a integridade da cartilagem articular e causando dor e disfunção.
As alterações no osso subcondral e a perda da cartilagem resultam em inflamação,
claudicação, diminuição na amplitude dos movimentos, dor e incapacidade física
(Johnston et al., 2007; Liu et al., 2003; Westacott & Sharif, 1996).
O diagnóstico da OA está baseado principalmente nos exames clínicos e
imagenológicos. Na maioria dos casos, entretanto, há discrepância entre os sinais
clínicos e o surgimento das alterações articulares (Henrotin et al., 2012).
Animais de médio e grande porte são os mais acometidos, desenvolvendo sinais
clínicos mais graves ou iniciando o processo degenerativo precocemente, embora
animais de todos os tamanhos, sexos e raças de cães e gatos possam ser acometidos
pela doença (Rychel, 2010).
Instabilidade, incongruência e injúria articular são fatores que predispõem à OA
devido ao estresse anormal na cartilagem articular e à inflamação crônica (Ray & Ray,
2008). Dentre os principais fatores predisponentes pode se citar a displasia URU e CF,
cirurgias ortopédicas, ruptura do ligamento cruzado cranial (RLCCr), fraturas
articulares e incongruências resultantes de traumas ou de deformidades angulares dos
membros (Rychel, 2010).
Independente da causa que originou o processo degenerativo, a cartilagem acometida é
usualmente mais fina e mais hidratada que a cartilagem das articulações normais (Liu
et al., 2003; McDevitt & Muir, 1976). Os níveis das macromoléculas que compõem a
MEC encontram-se aumentados nas cartilagens afetadas pela OA, indicando que os
condrócitos dessas cartilagens sintetizam agrecanos imaturos e maiores, confirmando a
formação de cartilagem imatura (Adams & Grant, 1987; Liu et al., 2003).
Quando ocorre a RLCCr com o subseqüente desenvolvimento da OA, pode-se
observar o rompimento e remodelamento da rede de colágeno na zona superficial da
cartilagem articular (Guilak et al., 1994) com aumento nos níveis de mRNA de
colágeno tipo II e sua expressão na cartilagem (Matyas et al., 2002; Matyas et al.,
1997a; Matyas et al., 1997b).
A OA resulta de uma complexa interação entre fatores bioquímicos ou inflamatórios e
biomecânicos (De Rezende et al., 2013). As alterações associadas com o processo
degenerativo envolvem todos os tecidos articulares, incluindo a cápsula articular, osso
subcondral, ligamentos e músculos, resultando em dano e destruição da cartilagem
articular (Innes et al., 2000; Johnston, 1997; Pond & Nuki, 1973; Rayward et al.,
2004).
Fatores bioquímicos
Alguns estudos recentes postulam a OA como uma doença inflamatória que se
perpetua, causada por respostas mediadas por condrócitos e sinoviócitos (Bonnet &
Walsh, 2005; Konttinen et al., 2012; Pincus, 2001; De Rezende et al., 2013), na qual
os níveis séricos e sinoviais de citocinas inflamatórias são maiores em pacientes com
OA (Pearle et al., 2007; De Rezende et al., 2013; Sohn et al., 2012).
As mudanças bioquímicas na cartilagem acometida por OA afetam os dois principais
componentes da MEC: o colágeno e os proteoglicanos, sendo que os últimos são as
primeiras macromoléculas da matriz a ser acometidas. Durante o processo patológico
há uma diminuição dos proteoglicanos da cartilagem articular, que indica a gravidade
da doença (Liu et al., 2003; Mankin, et al., 1974; Pelletier et al., 1991). Em estádios
avançados os condrócitos são incapazes de compensar a diminuição dos
proteoglicanos, resultando assim em perda da MEC (Pelletier et al., 1991).
As citocinas pró-inflamatórias, tais como a IL-1, a IL-6 e o FNT-α e as quimiocinas
têm sido encontradas em quantidades elevadas em articulações de humanos com artrite
reumatóide, assim como citocinas antiinflamatórias tais como a IL-10. A IL-1 e o
FNT-α estão entre as primeiras citocinas liberadas pelos monócitos ativados e pelos
macrófagos na resposta imune. Uma vez liberadas elas agem nas células do sistema
não imune como as células endoteliais, condrócitos e osteoblastos para produzir mais
IL-1 e FNT- α aumentando a concentração de citocinas que resulta em inflamação
acentuada (Cartier et al., 1999).
Blom et al. (2007) realizaram um estudo no qual foram empregados dois grupos, no
primeiro grupo, foi realizada a depleção dos macrófagos e no segundo grupo não foi
feita a depleção dos macrófagos e induziram a OA através da colagenase. O grupo no
qual houve a depleção dos macrófagos sinoviais antes da indução da OA não
apresentou degradação da cartilagem, o que significa que os macrófagos têm papel
fundamental na patogênese da OA e não é apenas conseqüência dela.
A IL-1 e o FNT- α induzem outras interleucinas como a IL-6, as quais promovem a
infiltração celular, a hematopoiese e a angiogênese através da proliferação das células
endoteliais. Por meio destes mecanismos, as citocinas pró-inflamatórias liberadas pelos
macrófagos poderiam ser responsáveis por algumas das mudanças inflamatórias em
determinadas doenças articulares e podem estimular os sinoviócitos e os condrócitos
para produzir e ativar as metaloproteinases, que tem um papel fundamental no
processo destrutivo da cartilagem articular (Carter et al., 1999; Coughlan et al., 1998a;
Coughlan et al., 1998b). A IL-1 e o FNT- α atuam sinergicamente para induzir e
manter a inflamação e a erosão articular nas artrites (Brennan et al., 1998).
Um dos sinais clínicos observados em pacientes com OA é o aumento de volume
articular, causado pelo derrame articular ou espessamento articular, demonstrando
assim a presença de sinovite (De Rezende et al., 2013). A sinovite e o derrame
articular são considerados fatores que induzem a perda da cartilagem na articulação
inicialmente sem OA (Roemer et al., 2011). Tem-se encontrado uma associação direta
entre o grau de sinovite e o deterioramento da articulação (Ayral et al., 2005).
Aproximadamente 50% dos casos de OA em caninos apresentam sinovite de
moderada, a acentuada em biopsias sinoviais (Baines, 1994). Esta sinovite é
caracterizada por hipertrofia e hiperplasia das células da intima sinovial, proliferação
das vilosidades e infiltração moderada de linfócitos, células plasmáticas e monócitos
(Cartier et al., 1999; May et al., 1992).
Num estudo em ratos, pesquisou-se o efeito da IL-1 e do FNT- α no desenvolvimento
da artrite aguda injetando estas substâncias na articulação FTP na dose de 3, 10 ou
30µg. Observou-se dois dias após que a IL-1 induziu significativamente e dosedependente, um aumento na inflamação (de moderada a acentuada), na reabsorção
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óssea (de mínima a moderada) e na formação de osteoclastos (de mínima a moderada).
Em contraste, o FNT- α induziu mínima a moderada inflamação, mas teve pouco efeito
na reabsorção óssea e na proliferação de osteoclastos. Tanto a IL-1 quanto o FNT- α
induziram discreta degeneração na cartilagem articular (Bolon et al., 2004). Os autores
concluíram que ambas as citocinas estimulam o processo inflamatório, mas que a IL-1
é a citocina que leva à destruição do osso subcondral (Bolon et al., 2004).
É Indiscutível o papel fundamental que desempenham as citocinas no processo
fisiopatológico da OA ao promover degradação da cartilagem articular e dos
componentes da MEC através de enzimas liberadas por condrócitos e sinoviócitos
estimulados por estas moléculas, ao mesmo tempo em que aumentam a resposta
inflamatória do tecido local, favorecendo e perpetuando o processo inflamatório.
Fatores biomecânicos
Os fatores biomecânicos na OA estão relacionados com alterações no movimento e as
forças físicas que agem sobre pontos localizados da articulação (De Rezende et al.,
2013). A OA é uma resposta patofisiológica de uma articulação a um insulto mecânico
e representa a tentativa da articulação de corrigir um estresse mecânico anormal e de
reparar a lesão resultante (Brandt et al., 2009; De Rezende et al., 2013).
O estresse mecânico ao qual são submetidos às articulações com OA, atua também
como desencadeador da resposta inflamatória (Kawakita et al., 2012). O estresse é
captado e interpretado pelos mecanorreceptores, que ativam as cascatas inflamatórias
exatamente como ocorre na ativação pelas citocinas (Piscoya et al., 2005).
Existem diferentes fatores que podem levar a um aumento anormal das forças que
agem em áreas localizadas da articulação, dentre os quais se destacam os defeitos
anatômicos congênitos, lesões adquiridas que promovem instabilidade articular,
sobrepeso e combinação destes fatores (De Rezende et al., 2013). Embora os fatores
biomecânicos não sejam a causa da OA, eles têm um papel fundamental no
desenvolvimento dessa lesão devido à concentração do estresse intra-articular que
estimula a resposta inflamatória (De Rezende et al., 2013).
Outros estudos em humanos tem encontrado também que as lesões em estruturas como
os meniscos aumentam o risco do desenvolvimento de OA (Englund et al., 2009), pois
estas lesões precedem a perda da cartilagem articular. Cirurgias para remoção de
lesões nos meniscos, mesmo remoções parciais, aumentam o estresse focal na
cartilagem e causam altas taxas de OA (Papalia et al., 2011).
As displasias congênitas aumentam o risco de desenvolvimento da OA (Lane et al.,
2000). Joelhos em varus ou valgus sofrem lesões no compartimento articular medial e
lateral, respectivamente, causada pelo aumento das cargas fisiológicas que atuam sobre
a articulação FTP (Felson et al., 2003).
Injúria repetitiva parece ser um fator importante para a síntese de citocinas e qualquer
alteração no equilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórias que pode
contribuir para o desenvolvimento do processo degenerativo. A produção insuficiente
de fatores de crescimento e o desequilíbrio entre a inibição e a produção de
metaloproteinases podem contribuir para o catabolismo da cartilagem (Johnston,
1997). Os fatores biomecânicos agem então, como predisponentes para o surgimento
dos fatores bioquímicos, ao produzir uma resposta inflamatória localizada causada pela
distribuição inadequada das cargas e forças que agem sobre os componentes
articulares.
Após o desencadeamento do processo degenerativo, seu desenvolvimento e progressão
são inevitáveis mesmo que a causa primaria biomecânica ou bioquímica tenham
recebido
o
tratamento
adequado.
A OA é um processo doloroso e incapacitante e o objetivo primário do tratamento é o
alivio da dor. Geralmente empregam-se agentes modificadores da osteoartrose, para
diminuir a dor e manter ou melhorar a função articular. É necessário, entretanto, tratar
a causa primária do problema (Rezende & Gobi, 2009).
Os principais agentes empregados são os glicosaminoglicanos polissulfatados, o
sulfato de condroitin e o acido hialurônico intra-articular, que podem diminuir a dor, a
inflamação e restabelecer o ambiente articular. Eles possuem substâncias como
glicolipídeos, glicoproteínas, glicosaminoglicanos, proteoglicanos dentre outros, que
desenvolvem um papel fundamental na formação das superfícies articulares, tendões,
tecido sinovial, ossos e têm participação no metabolismo da cartilagem articular
(Anvisa, 2012; Canapp, 2013). Embora estas substâncias sejam empregadas com
freqüência na rotina, elas nem sempre têm os efeitos desejados e não oferecem um
controle satisfatório no desenvolvimento da OA.
Tem sido relatado também, o uso de antiinflamatórios não esteroidais na tentativa de
diminuir a inflamação e a dor causadas pelo processo degenerativo. Em muitos casos,
estes medicamentos oferecem poucos benefícios sobre o controle da doença e muitas
vezes podem ter efeitos deletérios sobre a articulação e sobre outros sistemas corporais
(Clark, 2006; Filho & Rahal, 2008; Lees et al., 2004).
Devido à ausência de um tratamento satisfatório para prevenir o desenvolvimento da
OA e suas conseqüências, tem se realizado pesquisas empregando a terapia celular.
Neste contexto surgem os estudos de avaliação do efeito do PRP em diferentes tecidos
orgânicos (Carmona et al., 2011; Choi et al., 2005; Froum et al., 2002; Gobbi & Vitale,
2012; Hakimi et al., 2010; Silva, 2012; Silva et al., 2012a). Os resultados mostram a
eficiência desta substância para acelerar o processo de cicatrização, na redução da
inflamação e da dor, além de disponibilizar os fatores de crescimento essenciais para
direcionar a reparação do tecido lesado.
Plasma rico em plaquetas: obtenção e emprego
Fisiologia das plaquetas
As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos derivados dos megacariócitos da medula
óssea, cujo diâmetro varia de um a três µm nos cães e de dois a seis µm nos gatos, com
uma vida média entre seis a dez dias. Estas células são multifuncionais e atuam em
vários processos fisiológicos como a homeostase, manutenção e regulação do tônus
vascular, formação e retração do coágulo (Boudreaux et al., 2010; Harrison, 2005;
Wilkerson et al., 2001).
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Essas células também atuam na reparação de feridas e no início da cicatrização
tecidual, uma vez que elas contem fatores de crescimento, citocinas e mediadores
inflamatórios que agem produzindo quimiotaxia, proliferação e diferenciação celular,
neovascularização, angiogênese e deposição de MEC, além de atuar na resposta imune
(Carmona, 2006; Carrasco et al., 2009; Sanchez et al., 2003; Silva et al., 2013; Silva et
al., 2012b).
Após a injúria tecidual as plaquetas chegam ao local e entram em contato com o
colágeno e o fator de Von Willebrand expostos dentro da MEC, produzindo-se assim a
ativação das mesmas com conseqüente liberação de citocinas, fatores de crescimento e
diferentes mediadores pro-inflamatórios que aumentam a agregação plaquetária e a
ativação das vias da coagulação para a formação do coágulo de fibrina, exercendo
assim, suas funções na coagulação, inflamação, formação de tecido de granulação,
epitelialização e remodelação do tecido de cicatrização (Blair & Flaumenhaft, 2009;
Boswell et al., 2012; Iacopetti et al., 2012; Mishra et al., 2009; Silva, 2012; Verhamme
& Hoylaerts, 2009).
As plaquetas contêm no seu interior uma variedade de grânulos encarregados de
secretardiferentes substâncias depois de ativadas. Os principais grânulos são os
grânulos α, os grânulos densos e os grânulos lisosomais, os quais exercem uma função
diferente durante o período de reparação das feridas. As principais substâncias
secretadas pelos grânulos após a ativação são os fatores de crescimento (PDGF, TGFβ, IGF, FGF, EGF, VEGF), citocinas, fator de Von Willebrand, serotonina, fator V, XI
e XIII, fibrinogênio, ATP, fibronectina, dentre outros que exercem diferentes funções
no processo de cicatrização (Gobbi & Vitale, 2012; Intini, 2009).
Após a injúria do tecido, a membrana celular libera tromboxanos e prostaglandinas2α,
levando a uma vasoconstrição inicial (Broughton et al., 2006a). Posteriormente, as
plaquetas são ativadas pela exposição às proteínas da MEC como colágeno, o fator de
Von Willebrand e fibronectinas dentre outras (Smith & Roukis, 2009), fazendo com
que inicie a agregação plaquetária e a formação inicial de um trombo (Broughton et al.,
2006b; Witte & Barbul, 1997). Esse processo chamado ativação inclui mudanças na
morfologia da plaqueta e a liberação do conteúdo dos grânulos (Behnke & Forer,
1998; Diegelmann & Evans, 2004). As substâncias liberadas pelos grânulos densos
potencializam a ativação plaquetária.
Durante a fase de ativação, os grânulos α unem-se à membrana da plaqueta para liberar
os fatores de crescimento, as citocinas e quimiocinas que auxiliam na migração e
crescimento celular. Este processo se inicia nos primeiros dez minutos após a ativação
e termina aproximadamente uma hora depois (Behnke & Forer, 1998; Diegelmann &
Evans, 2004; Marx, 2004).
A liberação das substâncias contidas nos grânulos das plaquetas ocorre durante a vida
útil das mesmas (Froum et al., 2002; Marx, 2004).
Plasma Rico em Plaquetas
O PRP, também conhecido como concentrado autólogo de plaquetas, é utilizado para
favorecer o processo de reparação de feridas e lesões em diferentes tecidos como o
cutâneo, musculoesquelético, intestinal, dentre outros (Boswell et al., 2012;
Yamaguchi et al., 2012) e para proporcionar uma MEC com capacidade para permitir
o desempenho mecânico e funcional dos tecidos sadios (Wasterlain et al., 2012).
O PRP é uma fração de plasma obtida de sangue autólogo que possui uma
concentração de plaquetas três a cinco vezes superiores aos níveis basais do sangue
total e é considerada uma fonte natural de fatores de crescimento (Carrasco et al.,
2009; Gonzalez, 2006; Jo et al., 2012; Kon et al., 2012; Marx et al., 1998; RodriguezFlorez et al., 2012).
O mecanismo de ação do PRP está fundamentado na quantidade de plaquetas
concentradas que são aplicadas diretamente sobre os tecidos lesados (Choi et al., 2005;
Silva, 2012; Wasterlain et al., 2012; Yamaguchi et al., 2012), e na modulação dos
processos cicatriciais através dos fatores de crescimento e de outras substâncias,
presentes nos grânulos α das plaquetas, que após sua liberação, iniciam e mantêm o
processo de regeneração tecidual (Beca et al., 2007; Mishra et al., 2009; Textor, 2011).
Os fatores de crescimento, mediadores pro-inflamatórios, fibrina e outras sustâncias
são capazes de influenciar o meio onde são aplicadas para produzirem mitose celular,
recrutamento de outras células, proliferação e diferenciação celular, síntese de
proteínas da MEC como colágeno e substâncias que promovem a angiogênese e
neovascularização (Anitua et al., 2012; Freymiller & Aghaloo, 2004; Iacopetti et al.,
2012; Lee et al., 2012; Mishra et al., 2009; Silva et al., 2012a).
Dentre os principais fatores de crescimento liberados dos grânulos encontram-se o
TGF-β, o Platelet Derived Growth Factor (PDGF), o Vascular Endotelial Growth
Factor (VEGF), o Fibroblast Growth Factor (FGF), o Insulinic Growth Factor (IFG), o
Epidermic Growth Factor (EGF) dentre outros (Beca et al., 2007; Gonzalez, 2006;
Iacopetti et al., 2012; Lee et al., 2012; Rodriguez-Florez et al., 2012; Silva, 2012a;
Silva et al., 2011a). Esses fatores de crescimento têm várias funções e atuam em
conjunto com as citocinas e as outras sustâncias pro-inflamatórias para regenerar os
tecidos. Dentre as principais funções dos diferentes fatores de crescimento pode-se
citar:
• PDGF: é o primeiro fator de crescimento presente na ferida, inicia a reparação do
tecido conectivo e suas principais funções incluem a mitogênese de células como os
neutrófilos, monócitos e fibroblastos que agem na reparação tecidual, angiogênese das
células endoteliais dos capilares e ativação dos macrófagos (Bennett & Schultz, 1993;
Hakimi et al., 2010; Marx et al., 1998; Smith & Roukis, 2009);
• TGF-β: promove a proliferação, migração celular e síntese de proteínas da MEC
como o colágeno (Anitua et al., 2005; Bennett & Schultz, 1993; Hakimi et al., 2010;
Sanchez et al., 2003), além de produzir mitogênese e quimiotaxia de osteoblastos e
inibe a atividade dos osteoclastos (Bennett & Schultz, 1993). Induz a osteogênese e a
condrogênese (Joyce et al., 1990);
• IGF: produz proliferação celular que estimula a síntese de proteínas da MEC, tem
efeitos quimiotáticos e mitôgenicos (Bennett & Schultz, 1993; Goh et al., 2003),
aumenta a síntese de colágeno tipo I e III;
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• VEGF, FGF: produzem quimiotaxia e estimulam a mitogênese de células endoteliais
e vasculares, promovendo a angiogênese e a vascularização (Anitua et al., 2005;
Bennett & Schultz, 1993; Intini, 2009; Smith & Roukis, 2009). O VEGF estimula a
angiogênese (Intini, 2009);
• EGF: estimula a migração quimiotática de células epiteliais ao tempo que estimula a
mitose dessas células (Bennett & Schultz, 1993), estimula a proliferação celular (Goh
et al., 2003) e a síntese da MEC (Kang & Kang, 1999).
Para que essas sustâncias possam ter efeito terapêutico devem ser concentradas em
níveis adequados para proporcionar os fatores de crescimento e outras moléculas numa
quantidade suficiente para estimular a neovascularização, o incremento no aporte
sanguíneo e de nutrientes necessários para a regeneração do tecido lesado (Boswell et
al., 2012; Gobbi & Vitale, 2012; Tiwari & Bhargava, 2013; Xie et al., 2013b). A
concentração celular pode aumentar ou diminuir segundo o método empregado na
obtenção do PRP.
Ativação do PRP
Além da concentração das plaquetas é necessária a ativação das mesmas para que seja
liberado o conteúdo dos grânulos e, dependendo da sustância empregada pode-se obter
um gel ou um liquido de consistência viscosa que permite a ativação das plaquetas
mediante diferentes vias.
Batroxobina: induz a ativação das plaquetas pela formação e polimerização da fibrina
a partir do fibrinogênio e interação da fibrina com sais de cálcio. A ativação e
liberação dos grânulos são lentas (Mazzuco et al., 2008; Silva, 2012b; Wang et al.,
2001).
Trombina: media a agregação das plaquetas, a liberação do ADP, tromboxano A2,
serotonina, e epinefrina, além da produção de fibrina a partir do fibrinogênio (Jennings
et al., 2009; Silva et al., 2012a).
Gluconato de cálcio: o cálcio é um importante segundo mensageiro na cascata de
ativação das plaquetas, pois, media as respostas características da ativação plaquetária
tais como mudanças na forma da plaqueta, secreção dos grânulos e agregação. Ativar
as plaquetas com gluconato de cálcio leva a um aumento deste no citosol e
conseqüentemente a um aumento da resposta das funções das plaquetas que são
diretamente dependentes do cálcio. Essas respostas são ativação da integrina, liberação
de uma segunda onda de mediadores, ADP e tromboxano A2 e a expressão da
atividade procoagulante das plaquetas, principalmente pela geração de trombina
(Bergmeier & Stefanini, 2009; Roberts et al., 2004).
Após a adição dos diferentes produtos para a ativação das plaquetas, o PRP ativado e
pronto para ser empregado, deve ser imediatamente aplicado no local lesado para
evitar que a de granulação e os fatores de crescimento liberados sejam depositados fora
do local de interesse (Mazzuco et al., 2008).
É importante considerar que diferentes fatores extrínsecos podem influenciar na
qualidade do PRP e na quantidade de plaquetas concentradas mediante os diferentes
métodos. Dentre esses fatores tem-se: a fração colhida após a centrifugação, a força de
centrifugação, o tempo de centrifugação, a substância empregada para ativar as
plaquetas e o conteúdo de leucócitos (Ehrenfest et al., 2008; Silva et al., 2013; Tiwari
& Bhargava, 2013).
Giraldo et al. (2013) demonstraram na sua pesquisa que há outros fatores adicionais
que também influenciam a qualidade e o conteúdo celular do PRP. Fatores intrínsecos
como a raça, a idade e o sexo afetam diretamente os resultados hematológicos, a
quantidade de plaquetas, a concentração dos fatores de crescimento e das proteínas
entre outros aspectos. Esses fatores intrínsecos interagem com os fatores extrínsecos
influenciando a presentação celular e molecular do PRP.
Obtenção do PRP
OPRP, fonte natural de fatores de crescimento e substâncias pró-inflamatória pode ser
obtido mediante diferentes métodos (Argüelles et al., 2006). Na medicina veterinária
são descritos três métodos empregados com sucesso para este fim, que são o método
manual ou método do tubo com única centrifugação (Silva et al., 2011b; Silva, 2012),
o método manual com dupla centrifugação (Virchenko & Aspenberg, 2006; Xie et al.,
2013a) e o método semi-automatizado (Ehrenfest et al., 2008; Textor, 2011). A
concentração de plaquetas depende do tempo e da força da centrifugação empregada e
da quantidade de sangue total para a produção do PRP (Anitua et al., 2009; Baksh et
al., 2013; Jo et al., 2012).
Método do tubo com centrifugação única
Neste método é coletada uma quantidade determinada de sangue total, que varia de
acordo com a espécie, em tubos com solução ACD-A. Esta solução contém citrato de
trisódio (22 g/L), ácido cítrico (8 g/L) e dextrose (24,5 g/L) (Argüelles et al., 2006;
Silva, 2012) e age como anticoagulante. Posteriormente, as amostras são centrifugadas
a velocidades que variam de 85 a 1220 g (Argüelles et al., 2006; Silva et al., 2011a;
Silva et al., 2011b; Virchenko & Aspenberg, 2006) durante 5 a 20 minutos. Com este
método, são obtidas duas frações diferentes de concentrados de plaquetas, sendo que a
primeira corresponde aos 50% imediatamente acima da capa leucocitária (PRP) e a
segunda aos 50% localizados acima da primeira fração que é denominada plasma
pobre em plaquetas (PPP).
Posteriormente, com auxilio de uma micropipeta de volume fixo, ambas as frações são
separadas e depositadas em tubos de polipropileno para a avaliação, mediante
impedância volumétrica do hematócrito, plaquetas, leucócitos,valores relativos e
absolutos de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos (Argüelles et al.,
2006; Silva et al., 2011a).
Esta mesma avaliação é feita também em amostras de sangue total para se obter os
valores de referência para posterior comparação com os valores do PRP (Jo et al.,
2012; Virchenko & Aspenberg, 2006).
61
Método do tubo com centrifugação dupla
Este método segue os princípios básicos do método do tubo com centrifugação única,
mas após a primeira centrifugação, a fração correspondente aos primeiros 50%
imediatamente acima da capa leucocitária é coletada em tubos de polipropileno e é
novamente centrifugada a velocidades que variam de 240 a 3600 g durante períodos de
tempo que variam de 5 a 20 minutos (Argüelles et al., 2006; Choi et al., 2005; Lee et
al., 2012; Virchenko & Aspenberg, 2006; Xie et al., 2013a). Após a centrifugação o
produto obtido pode ser dividido em duas frações (A e B), onde a primeira
corresponde a 25% da fração mais baixa no tubo (PRP) e a segunda aos 75% da fração
restante (PPP). Posteriormente, as plaquetas obtidas após a segunda centrifugação são
suspendidas em plasma, ficando o produto disponível para seu uso (Argüelles et al.,
2006).
Método semi-automatizado
Este método é caracterizado pelo emprego de aparelhos de alta tecnologia para
concentrar as plaquetas mediante o processo de centrifugação. Durante este
procedimento pretende-se separar o plasma pobre em plaquetas e a fração sanguínea
do PRP (Froum et al., 2002; Hakimi et al., 2010).
Para obter o PRP com este método é colhida uma determinada quantidade de sangue
total que varia de acordo com a espécie (entre cinco até 50 ml), que posteriormente é
depositada em tubos de PRP para ser centrifugada a uma velocidade que varia de 3200
a 5600g durante 15 a 20 minutos. Após este procedimento o sangue é separado em
PPP e PRP, descartando o PPP. O PRP é submetido à análise celular para avaliar seu
conteúdo e realiza-se a contagem celular no sangue total para comparar com o PRP e
avaliar sua qualidade e, portanto, a eficiência do método (Tiwari & Bhargava, 2013).
Independente do método empregado para se obter o PRP, é importante avaliar se foi
eficiente para concentrar as plaquetas. Devem ser consideradas também a força
empregada na centrifugação e a duração do processo, pois a quantidade de plaquetas
concentradas e a viabilidade das mesmas são altamente dependentes desses pontos
críticos (Choi et al., 2005; Ehrenfest et al., 2008; Weibrich et al., 2004).
Usos do PRP
Muitas pesquisas têm sido realizadas para avaliar os efeitos terapêuticos dos
concentrados de plaquetas, em medicina humana e em veterinária envolvendo cirurgias
maxilo-faciais, ortopedia e tratamentos periodontais (Marx et al., 1998; RodriguezFlorez et al., 2012; Torres, 2006), recuperação de lesões musculoesqueléticas em
cavalos (Carmona et al., 2011; Carmona, 2006; Iacopetti et al., 2012), como terapia
para a osteoartrose adquirida em cães (Silva, 2012) e após tratamento da ruptura do
ligamento cruzado cranial (Xie et al., 2013b).
Os resultados obtidos mostraram grande potencial de regeneração, fato que tem
estimulado ainda mais as pesquisas para o melhor entendimento da ação do PRP.
Em estudos realizados em pacientes humanos o PRP foi empregado para estimular a
proliferação celular de tenócitos e melhorar a expressão gênica de MEC em tendões.
Os resultados mostraram um aumento significativo da proliferação e densidade celular
aos sete e 14 dias dependendo da dose aplicada, e estímulo significativo da expressão
gênica de colágeno tipo I e tipo III durante os mesmos períodos de tempo (Jo et al.,
2012; Tohidnezhad et al., 2011). Outros estudos avaliaram o efeito do PRP sobre a
osteoartrose em humanos com significativa redução da dor, redução da rigidez
articular, da função física e do score total da doença quando foi comparado com um
tratamento
placebo
(Patel
et
al.,
2013).
Na medicina veterinária, o PRP tem sido avaliado em cavalos para determinar seu
efeito na recuperação de feridas cutâneas e musculares de difícil cicatrização,
mostrando uma melhora clinica significativa com estímulo da formação de tecido de
granulação e diminuição da produção de fibrina e de secreções serosas nas primeiras
três semanas após o tratamento, diminuição da inflamação e melhora da cicatrização
da ferida e da aparência cosmética da mesma (Iacopetti et al., 2012).
Outro estudo num eqüino com lesão traumática da articulação escápulo-umeral
mostrou efeito favorável do tratamento com PRP, logo após o terceiro dia da
aplicação, com redução do aumento do volume articular e inicio de apoio no membro.
Melhora gradativa foi verificada ao longo do tratamento (Carmona & López, 2011).
Em pequenos animais, também tem sido avaliados os efeitos do PRP, principalmente
em cães. Num dos estudos avaliou-se seu efeito na expressão gênica em modelo canino
de tratamento do ligamento cruzado cranial, encontrando-se um aumento nos níveis de
mRNA de substâncias como colágeno tipo I e III, metaloproteinases da matriz 1 e 13 e
TGF-β às duas, seis e 12 semanas após a cirurgia de substituição do ligamento. O PRP
pode alterar a expressão de alguns genes específicos, especialmente durante os estágios
precoces da remodelação do enxerto, fato que pode explicar seu efeito benéfico no
processo de maturação dos enxertos empregados na reparação do ligamento cruzado
cranial
(Xie
et
al.,
2013a).
Outro estudo em cães avaliou o efeito do PRP na revascularização e reinervação de
autoenxertos empregados na reparação do ligamento cruzado cranial, onde foi
observado um incremento na expressão do mRNA de moléculas como o VEGF,
trombospondina 1, neurotropina 3 e fator de crescimento neural (Xie et al., 2013b).
O PRP foi utilizado na cicatrização de anastomose intestinal em ratos, cujo resultado
mostrou que os grupos de animais tratados com PRP tiveram um aumento significativo
nos valores da pressão de ruptura anastomótica e na concentração de hidroxiprolina,
enquanto as concentrações altas de PRP ocasionaram diminuição significativa nesses
mesmos valores e concentrações baixas não tiveram nenhum efeito nos parâmetros
avaliados. As concentrações do PRP interferem na eficácia dessa terapia. (Yamaguchi
et al., 2010).
Outro estudo no qual foram utilizados cães que sofreram ruptura do ligamento cruzado
cranial espontânea e que foram submetidos a tratamento cirúrgico acompanhado de
terapia com PRP ou com agentes modificadores da OA e que foram submetidos a
avaliações radiográficas e em plataforma de força, encontrou que no grupo tratado com
PRP os valores de apoio na plataforma de força do membro acometido e tratado com
PRP foram aumentando até igualar os valores do membro contralateral ao longo do
estudo, fato que não ocorreu no grupo que não recebeu esse tratamento. Isso sugere
que a injeção intra-articular dessa substância foi favorável nas alterações degenerativas
articulares pelo menos durante o tempo do estudo (Silva, 2012).
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Considerações finais
A área da terapia regenerativa constitui-se numa nova modalidade terapêutica que vem
ganhando espaço no tratamento de diferentes doenças tanto na medicina humana
quanto na medicina veterinária. O emprego de substâncias autólogas e principalmente
de células obtidas a partir de diferentes fontes biológicas representa uma excelente
alternativa terapêutica para abordar o tratamento de algumas afecções que até agora
não tem nenhum tratamento satisfatório.
Como foi descrito acima, o PRP é relativamente fácil de coletar, seguro para seu uso
em diversos pacientes, é um importante modulador das respostas inflamatórias
desatadas após que acontece alguma injúria tecidual, sendo fundamental no controle e
resolução da fase inflamatória, regulando a migração de diferentes tipos de células
como os neutrófilos e os macrófagos responsáveis pela fagocitose e limpeza do local
afetado.
Adicionalmente, o alto conteúdo de fatores de crescimento liberado através das
plaquetas e de outras fontes estimula a fase de proliferação, durante a qual tem lugar a
síntese da matriz extracelular e a vascularização do local, fatores que propiciam um
melhor ambiente para a chegada dos fatores de crescimento e das células que influem
na regeneração do tecido lesado e aperfeiçoam a formação de um tecido novo com
propriedades mecânicas e biológicas similares aos tecidos sadios.
Para obter um efeito positivo empregando o PRP é necessária a associação de diversos
fatores durante sua obtenção. Os pontos críticos a considerar e que podem interferir
nos resultados obtidos são o método de coleta do sangue, o tempo e a força de
centrifugação, a fração de plasma colida após a centrifugação, a substância empregada
para ativar o PRP e a aplicação no local afetado. Falhas em algum desses pontos
podem conduzir a erros terapêuticos que podem não ter nenhum efeito benéfico e até
causar efeitos deletérios como retraso e alteração no processo de cicatrização.
O PRP tem mostrado resultados importantes e promissores em diversas áreas da
medicina e cirurgia veterinárias, demonstrando seu potencial quando foi empregado
em diferentes pesquisas e como tratamento em alguns casos clínicos. Seus resultados
benéficos foram demonstrados em diferentes tecidos tratados, principalmente no
musculoesquelético, onde foram obtidos resultados significativamente melhores
quando se emprego o PRP e se comparou com os tratamentos convencionais. Os
concentrados autólogos de plaquetas também foram empregados em cirurgias
abdominais, como coadjuvante na reparação de feridas cutâneas infectadas e de difícil
cicatrização, em fraturas, no tratamento de doenças articulares como a osteoartrose,
lesões da cartilagem, tendões e ligamentos e em todos os casos comprovou-se a sua
contribuição positiva no processo de reparação tecidual.
Referências
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71
Calidad de leches crudas en empresas ganaderas doble propósito en el
departamento de Córdoba (Colombia) en condiciones de máxima
precipitación1
RESEARCH
ARTICLE
Virginia Rodríguez Rodríguez2, Alfonso Calderón Rangel3, Arles Acosta Ruiz4
1,
Financiado por la División de Investigaciones y Extensión de la Universidad
de Córdoba, Montería, Colombia.
2,
Grupo de Investigaciones Microbiológicas y Biomédicas de Córdoba
(GIMBIC), Programa de Bacteriología, Universidad de Córdoba, Montería,
Colombia.
3,
Estudiante del Doctorado en Medicina Tropical, SUE-Caribe, Universidad
de Córdoba. Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico (IIBT),
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Córdoba,
Montería, Colombia.
4,
Laboratorio de Lactología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.
[email protected]
(Recibido: 23 de Marzo de 2014 Aprobado: 10 de Septiembre de 2014 Actualizado: 01 de julio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.5
RESUMEN: El propósito en la producción agropecuaria es la obtención de
alimentos de excelente calidad composicional y microbiológica para disminuir los
riesgos en salud pública. En la leche, los altos conteos de mesófilos indican una
deficiente manipulación y la presencia de coliformes es evidencia de contaminación.
El objetivo del presente estudio fue conocer la calidad fisicoquímica, microbiológica y
sanidad de la ubre en leches crudas provenientes de empresas ganaderas doble
propósito en Córdoba (Colombia), durante máxima precipitación. Mediante un
muestreo no probabilístico y un estudio transversal, se recolectaron muestras de leche
cruda en 149 empresas ganaderas. Los datos obtenidos se analizaron por estadística
descriptiva. Los parámetros fisicoquímicos se encontraron dentro de los valores
normales de la legislación colombiana; los promedios del recuento de mesófilos, de
coliformes totales, de fecales y el recuento de células somáticas fueron altos. Las
variables analizadas permiten establecer que la calidad fisicoquímica es buena, pero
hay deficiencias en la calidad microbiológica y la sanidad de las ubres.
Palabras clave: antibióticos, calidad, coliformes, composición leche cruda, mesófilos,
recuento de células somáticas
Quality of raw milk in dual purpose cattle farms in the Department of Córdoba
(Colombia), under maximum precipitation conditions
ABSTRACT: The purpose in agricultural production is to obtain food of
excellent compositional and microbiological quality to reduce public health risks. In
milk, high numbers of mesophilic counts indicate poor handling and the presence of
coliforms are evidence of contamination. The objective of this study was to
determine,the physicochemical, microbiological quality and the udder health in raw
milk in a period of maximum precipitation, from dual purpose farms in the Department
of Córdoba (Colombia). Using a non-probabilistic sampling and a cross-sectional
study, 149 samples of raw milk were collected in dual purpose cattle farms. The
obtained data was analyzed using descriptive statistics..The physicochemical
parameters were found within the normal range according to Colombian legislation.
The averages of mesophilic, total coliform, fecal counts and the count of somatic cells
were high. The variables analyzed establish that the physicochemical quality is good
but there are shortcomings in the microbiological quality and udder health.
Key words: antibiotics, composition, coliform, mesophilic, raw milk, quality, somatic
cell counter
Introducción
La tendencia mundial en la producción agropecuaria es la obtención de alimentos de
excelente calidad e inocuos para el consumo humano y son las empresas ganaderas
productoras de leche, el eslabón primario, desde donde se debe empezar a garantizar
las condiciones para la obtención de un producto de óptima calidad dentro de la cadena
láctea (Calderón et al., 2006).
Un estudio previo en Colombia ha propuesto que una leche de excelente calidad debe
presentar los porcentajes de proteína mayores a 3,2%, grasa mayor a 3,5%, sólidos
totales mayores a 12,2%, recuentos de mesófilos inferiores a 50000 UFC/ml, células
somáticas menores a 100000 CS/ml (Calderón et al., 2006); y la legislación
colombiana establece que la leche para consumo humano debe ser libres de inhibidores
o de sustancias extrañas y se debe asegurar su inocuidad (MinProtección, 2006).
En Colombia la normatividad oficial establece como parámetro de calidad
microbiológica el recuento de mesófilos (MinProtección, 2006) y se define a los
mesófilos como bacterias que crecen en un rango de temperatura entre 20 y 40oC; este
parámetro es un indicador de la calidad microbiológica de la leche cruda (Chacón,
2004). Un bajo recuento de mesófilos no asegura la ausencia de patógenos o sus
toxinas; igualmente, un elevado recuento de mesófilos no significa presencia de flora
patógena, sino excesiva contaminación de la materia prima y deficiente manipulación
durante el proceso de manufactura (Ortiz & Ríos, 2006). Dentro del grupo de los
coliformes totales están los coliformes fecales, evidencia de que un alimento ha sido
contaminado con materia fecal (Salomón et al., 2006).
Las células somáticas son indicativas del grado de inflamación de las glándulas
mamarias (mastitis) como consecuencia de la agresión de patógenos u otros factores de
73
índole traumática. Así, el recuento de células somáticas (RCS) aumenta en la leche en
proporción directa con la severidad del cuadro infeccioso; su cuantificación constituye
uno de los parámetros de mayor interés para determinar el estado sanitario de la ubre y
la calidad de la leche que se produce (Cerón et al., 2007; Calderón et al., 2012).
Altos recuentos de mesófilos y células somáticas en el momento de la pasteurización,
liberan enzimas proteolíticas que disminuyen la vida útil del producto (Calderón et al.,
2006) y además reducen los porcentajes de las características fisicoquímicas y
rendimientos de la leche cuando se somete a procesos de coagulación (Calderón et al.,
2012). Además de establecer la calidad fisicoquímica, el objetivo general fue conocer
la calidad microbiológica, incluyendo la determinación de coliformes totales y fecales
en leches crudas para proponer estrategias de manejo que permitan aumentar la
competitividad de la leche del sistema doble propósito en el departamento de Córdoba.
Tipo de estudio
Descriptivo de corte transversal.
Lugar de estudio
Se realizó en ocho municipios del departamento de Córdoba (Colombia).
Tamaño de muestra
Se estimó que en el departamento de Córdoba hay 19.097 empresas ganaderas tipo
doble propósito; tomando una prevalencia del 10%, una confiablidad del 95% y una
amplitud de intervalo del 0,1; como resultado se obtuvo 134 empresas ganaderas, pero
se aumentó el número a 149 empresas a evaluar, pertenecientes a 3 empresas
acopiadoras y procesadoras de leche. Estas muestras fueron tomadas en época de
máxima precipitación.
Criterios de selección
Las empresas ganaderas se seleccionaron teniendo en cuenta su ubicación dentro de
Córdoba, que sean manejadas bajo el sistema doble propósito, y consentimiento y
participación activa de los propietarios o administradores, quienes respondieron una
encuesta de manejo general sobre aspectos administrativos de las empresas.
Toma de muestra
Para la determinación de los diferentes parámetros fisicoquímicos y microbiológicos
en cada una de las empresas se tomó una muestra de leche cruda de 200 ml de la
siguiente forma. Cuando la leche fue almacenada en un sólo recipiente por medio de
un agitador manual de acero inoxidable estéril, se homogenizo durante 3 o 4 minutos y
con un cucharón de acero inoxidable estéril se obtuvo la muestra de 200 ml; cuando la
leche se almacenó en diferentes cantinas o recipientes de plástico, en cada uno de estos
recipientes se obtuvo una muestra siguiendo la metodología anteriormente descrita y
de la sumatoria de las muestras se extrajo la muestra; donde hubo tanque refrigerado,
previa agitación por 10 minutos se tomó la muestra de 200 ml de leche por medio de
un cucharón de acero inoxidable estéril. Todas las muestras se recolectaron en frascos
estériles tapa rosca azul, previamente rotulados, y se conservaron en refrigeración
(4°C) hasta su procesamiento en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias de la Salud, Programa de Bacteriología, donde se realizaron los análisis
microbiológicos y residuos de antibióticos, y una alícuota al Laboratorio de Lactología
de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia donde se implementó el análisis
fisicoquímico y el RCS; las muestras se procesaron antes de 6 horas después de su
recolección.
Determinación de parámetros fisicoquímicos
Para la determinación de los parámetros fisicoquímicos se hizo por duplicado, la
densidad se implementó por el método de termolactodensímetro de Quevenne y su
lectura se reportó a 15oC (Icontec, 1993), la acidez se evaluó por la titulación con una
solución de hidróxido de sodio 0,1 N (Icontec, 1993) y el resultado se informó como
porcentaje de ácido láctico (% de a. láctico); el porcentaje de grasa (% de grasa) por el
método de Gerber (Gerber, 1994), el porcentaje de proteína (% de proteína) y de
lactosa (% de lactosa) por un analizador ultrasónico de leche (Biolac 60), sólidos no
grasos (% de SNG) por el refractómetro de Bertuczi, los sólidos totales (% de ST) por
el método de la estufa y el porcentaje de minerales y adición de agua por el analizador
ultrasónico de leche (Biolac 60). Para la discusión de la calidad físicoquímica de la
leche cruda se tomó como referencia lo estipulado en el Decreto 616 de 2006
(MinProtección, 2006).
Determinación de parámetros microbiológicos
El recuento de mesófilos aerobios se determinó por medio del recuento estándar en
placa (SPC), la determinación de coliformes totales por el número más probable
(NMP), los coliformes fecales por la prueba de MacKenzie; estas determinaciones se
efectuaron de acuerdo con los protocolos descritos por el Invima (1998) y se
reportaron como NMP. El análisis de residuos de antibióticos (inhibidores) mediante la
prueba colorimétrica (Delvotest), que se implementó de acuerdo con las
especificaciones de la casa comercial.
Determinación de la sanidad de la ubre
El recuento de las células somáticas (RCS) se realizó mediante determinación
fluorescente por medio del contador óptico de células, que emplea yoduro de propidio
(DeLaval, 2005).
Análisis de resultados
Se realizó un análisis descriptivo de las variables fisicoquímicas, microbiológicas y
sanidad de la ubre. El software implementado para el análisis estadístico fue SAS
(2001).
75
Se tomaron 149 muestras de leche cruda que proveen a tres empresas procesadoras en
Córdoba; la empresa uno aportó el 51% (76/149), la dos el 22% (33/149) y la tres el
27% (40/14) de las muestras; la distribucion y porcentaje de las empresas ganaderas
por municipio se muestra en la Tabla 1. El total de vacas en ordeño fue de 4675 con un
mínimo de 3 y un máxino de 220 vacas por empresa, el volumen de producción por
finca fluctuó entre 10 y 1010 L y la producción promedio fue de 3,7 L con un mínimo
de 2 y un máximo de 9 L.
En la mayoría de las fincas evaluadas (99,93%) el ordeño fue realizado en forma
manual; el 96,64% (144/149) cuentan con un establo destinado para el ordeño, de estos
el 59,06% (88/149) estaban cubiertos y en el 40,94% (61/149) parcialmente cubiertos.
Los pisos del lugar destinado para el ordeño en el 58,38% (87/149) fue tierra y en el
41,62% (62/149) cemento. Solamente el 2,01% (3/149) de las empresas cuentan con
tanque de refrigeración para la conservación de la leche. El 99,33% (148/149) filtran la
leche y los sistemas utilizados para filtrar son: colador plástico 56,08% (83/148), filtro
desechable 36,49% (54/148), tela 4,05% (6/148), colador metálico 2,03% (3/148),
solamente en el 1,35% (2/149) el filtro fue en línea que correspondió a 2 fincas con
ordeño mecánico.
De las 149 empresas ganaderas involucradas, sólo el 52,34% (78/149) realizan la
prueba del CMT. El 58,38% (87/149) no están certificadas como fincas libres de
brucelosis y en el 80,53% (1207/149) no declaradas libres de tuberculosis bovina;
planes preventivos que deben que deben instaurar las empresas para certificarse en
buenas prácticas ganaderas (MinProtección, 2006; ICA, 2008).
Al evaluar el manejo que le dan a la leche procedente de vacas que reciben
tratamientos con antibióticos, el 78,52% (117/149) de las empresas no ordeñan y dejan
que las crías se la mamen, el 8,05% (12/149) ordeñan y sumnistran esta leche a los
animales de compañía (caninos y felinos), el 5,36% (8/149) descartan la leche, el
8,05% (8/149) se entrega para consumo humano y en el 0,67% (1/149) fue
autoconsumo humano. Es ideal que leche proveniente de vacas tratadas con
antibióticos no sea destinada para consumo humano y se descarte su uso, ya que su
ingestión puede provocar alergias, disbacteriosis, sobrecrecimientos y resistencia
bacteriana (Máttar et al., 2009). Se hace necesario implementar controles en plantas
para detectar su presencia; debido a que en muchas ocasiones es comercializada con
empresas que no realizan los respectivos análisis (Calderón et al., 2008).
La distribución de la densidad de acuerdo a los parámetros de la legislación
colombiana (Figura 1). El promedio de la densidad en este estudio (Tabla 2) está dentro
del rango normal establecido por la legislación colombiana. Valores de 1,032±0,001 y
de 1,032±0,007 g/ml, han sido reportados en leches sin mastitis subclínica en la región
(Calderón et al., 2011; Calderón et al., 2012). En México, mayores valores de
densidades se asociaron con altos porcentajes de proteína y sólidos totales (Bernal et
al., 2007).
77
La clasificación de la acidez con relación a la legislación colombiana (Figura 2). El
promedio de la acidez en este estudio (Tabla 2) está dentro del rango señalado como
normal dentro de la legislación colombiana. Valores más altos (0,19±0,18% y
0,17±0,01%) han sido reportados en Córdoba (Calderón et al., 2007; Calderón et al.,
2012), donde el incremento se asoció con la falta de refrigeración de la leche,
almacenamiento en materiales no apropiados y la alta temperatura ambiental en la
zona. Una alta acidez es un indicador del detrimento bacteriológico de la leche y de un
mal manejo antes de su recepción en las plantas procesadoras de leche (Chacón, 2004).
En México, hallaron diferencias significativas entre muestras de máxima y mínima
precipitación, donde la mayor acidez se presentó en la época seca por las altas
temperaturas ambientales y la falta de enfriamiento de la leche (Álvarez et al., 2012).
Igualmente, en Barinas (Venezuela) encontraron diferencias significativas en la época
de mínima precipitación y entre la finca y la planta por la manipulación no adecuada
(García et al., 2013).
La distribución de la grasa de acuerdo a los parámetros de la legislación colombiana
(Figura 3). El promedio del porcentaje de la grasa obtenido en este estudio (Tabla 2); este
valor puede deberse al tipo racial adaptado en la zona donde hay cruces Bos taurus x
Bos indicus (Briñez et al., 2008) y al sistema de pastoreo evidenciado en el 100% de
las empresas evaluadas. Se determinó que la época del año desempeña un papel
importante en la variación de los componentes de la leche para los porcentajes de grasa
y proteína, siendo estos más altos durante la época poco lluviosa (White et al., 2002).
En leches de ganado Gyr en Brasil, se observaron que altos RCS no se asociaron con la
reducción del porcentaje de grasa (Barbosa et al., 2013).
El promedio del porcentaje de la lactosa fue de 4,59%±0,25 (Tabla 2). Valores más altos
(4,79±0,187% y 4,90±0,23%) han sido determinados en la región (Calderón et al.,
2011; Calderón et al., 2012) en leche sin mastitis subclínica. El porcentaje de lactosa
no presentó cambios significativos entre las épocas seca, de lluvias e invierno (Álvarez
et al., 2012) y leches con altos RCS disminuyen el porcentaje de lactosa (Barbosa et
al., 2013).
La distribución del porcentaje de la proteína (Figura 4). El promedio del porcentaje de
proteína fue 2,98±0,17 (Tabla 2). Valores de 3,6±0,42 y de 3,22±0,09 han sido
reportados en leches sin mastitis subclínica en empresas ganaderas del sistema doble
propósito en Montería (Calderón et al., 2007; Calderón et al., 2011) y de 3,28±0,23%
(Calderón et al., 2012). Este bajo promedio obtenido en el presente estudio puede
deberse a la falta de una selección genética, a la poca suplementación y altos RCS que
afectan la calidad fisicoquímica de la leche (Calderón et al., 2012). Mayores
porcentajes de proteína han sido reportados en México en condiciones similares de
manejo (Álvarez et al., 2012) de 3,29% (García et al., 2013), de 3,49% en Venezuela.
En Paraguay hallaron que altos RCS disminuyeron el porcentaje de proteína (Sandoval
et al., 2011). Se ha observado que el porcentaje de proteína varió por la época del año
(Álvarez et al., 2012) y altos RCS están afectando el porcentaje de proteína en leches
de vacas en tres ganaderías Gyr del Brasil (Barbosa et al., 2013).
79
La distribución del porcentaje de los sólidos totales (Figura 5) y el promedio de la
densidad en este estudio (Tabla 2). Mayores porcentajes de sólidos totales han sido
reportados en otras latitudes como: 12,37% en Brasil (Newton et al., 2004), 12,97% en
Canadá y 13,95% en Nueva Zelanda por Machado et al. (2000) y 12,18%±0,42 en
Argentina (Revelli et al., 2011); valores que se pueden deber a la selección y
mejoramiento animal. Se determinó que el porcentaje de sólidos totales no presentó
cambios significativos por época del año (Álvarez et al., 2012) y que altos RCS
redujeron el porcentaje de sólidos totales (Sandoval et al., 2011).
El promedio de los mesófilos fue de 1039216,78±1351600,52 UFC/ml, con un valor
mínimo de 1000 y máximo de 9400000 UFC/ml (Tabla 2); este alto recuento de
mesófilos puede deberse a que solo el 2,01% (3/149) de las empresas cuentan con
tanque de refrigeración para la conservación de la leche; igualmente, factores como las
malas condiciones higiénicas de los establos, la falta de implementación de prácticas
de higienización de pezones, la inadecuada rutina de limpieza, la inapropiada
desinfección de los pezones, la deficiente desinfección de los recipientes usados en el
ordeño, pueden aumentar el recuento de mesófilos; pero, estos factores de manejo no
fueron evaluados dentro de este estudio. En el Oriente antioqueño proponen que al
mejorar las variables de manejo se mejora la calidad bacteriológica de la leche (Ruiz et
al., 2012). En Hidalgo (México), que para mejorar la calidad bacteriológica de la leche
se debe reducir el tiempo de exposición a factores ambientales como: temperatura,
humedad, polvo (Cervantes et al., 2013). En diferentes regiones de Colombia
establecieron que el 93,9% de las leches presentaron recuentos de mesófilos hasta de
200000 y de estas el 84,49% hasta 100000 UFC/ml parámetro exigido por la
Comunidad Europea y Estados Unidos, y el 47,53%de las muestras presentaron
mesófilos por debajo de los 25000 UFC/ml (Vásquez et al., 2012).
Solamente el 27,51% (41/149) de las empresas ganaderas, de acuerdo a la Resolución
000017 de 2012 (MinProtección, 2012), deben recibir bonificación ya que los
mesófilos fueron menores a 200000 UFC/ml (Tabla 3). Un promedio de
160,346±213,354 UFC/ml fue reportado para la misma región y se encontraron
diferencias entre leche no refrigerada (235,450±252,559 UFC/ml) y leche refrigerada
(74,514±125,222 UFC/ml) (Calderón et al., 2012), donde estas diferencias se debieron
al sistema de enfriamiento de la leche cuyo objetivo es inhibir el crecimiento
bacteriano, ampliar el tiempo de almacenamiento en finca para disminuir los costos de
transporte de la leche (DeLaval, 2006). Valores 4500 UFC/ml han sido reportados en
San Pedro de los Milagros en el norte de Antioquía, con ordeños manuales y
mecánicos en sistemas especializados de producción de leche (Ruiz et al., 2012).
La distribución de los coliformes totales (NMP/ml) en el 12,08% (18/149) fueron
menores a 50 NMP/ml; en el 2,01% (3/149) de las muestras de leche los coliformes
totales oscilaron entre 51 a 100 NMP/ml; en el 14,09% (21/149) los coliformes totales
fluctuaron entre 101 a 750 NMP/ml y en el 71,82% (107/149) los coliformes fueron
mayores a 750 NMP/ml. La normatividad colombiana no establece el recuento de
coliformes totales y fecales como criterio para evaluar la calidad microbiológica de la
leche cruda; la alta carga de bacterias contaminantes en la leche disminuye la vida útil
81
de los productos elaborados, reduce la calidad organoléptica y nutricional e interfiere
en los procesos de fermentación ácido láctica y en la coagulación enzimática
promoviendo el deterioro o proteólisis de las caseínas (Signorini et al., 2008).
Recuentos elevados de bacterias mesófilas aerobias (BMA), bacterias coliformes
totales (BCT) y bacterias psicrófilas pueden ser una fuente de transmisión de
intoxicaciones alimentarias (Silanikove et al., 2010). Mediante programas de
prevención en el ordeño se puede disminuir el riesgo de transmisión de enfermedades,
pero en los procesos de manufactura como producción de quesos se ha aislado E. coli,
indicador de contaminación fecal o deficiente higienización durante la fabricación de
los quesos (Durán et al., 2010); lo cual constituye un riesgo para la salud pública, de
origen manufacturero.
El 71,81% de las empresas ganaderas vinculadas al estudio presentaron BCT
superiores a 750 NMP/ml. En Paipa (Boyacá) determinaron coliformes totales y
fecales en leches crudas y concluyeron que su presencia fue por la no implementación
de las buenas prácticas en el ordeño, almacenamiento y transporte de la leche (Neira &
De Silvestri, 2006). La presencia de un número elevado de BCT constituye una
evidencia del inadecuado manejo higiénico-sanitario de la leche cruda; además de ser
indicativo de la probable presencia de cepas patógenas (Higgins et al., 2007).
En el 12,08% (18/14) de las muestras de leche el BCT fue menor a 50 NMP/ml, que es
ideal en cualquier sistema de producción de leche. Para disminuir los coliformes en
leche cruda se deben implementar buenas prácticas de manejo como: implementación
del presellado con productos recomendados para este fin, tiempo adecuado del
presellado, secado de los pezones con papel desechable, uso de guantes de látex
recomendados para el ordeño y almacenamiento de la leche a 4oC en recipientes
adecuados y recomendados por la normatividad e industria de alimentos; prácticas que
garantizan pezones limpios, secos y sanos, primera norma para obtener leche de
excelente calidad bacteriológica. En Venezuela, en leches crudas se encontraron
valores de 1,2 x 103 UFC/ml de BCT, señalando que esta carga microbiana se debió a
que no existieron las condiciones higiénicas necesarias en la recolección de las
muestras (Monsalve & González, 2005).
La distribución del recuento de coliformes fecales (NMP/ml) en leches crudas en el
40,26% (60/149) fueron menores a 100 NMP/ml, en el 18,12% (27/149) se presentaron
entre 101 y 1000´y en el 41,62% (62/149) fueron mayores a 1001 NMP/ml.
Solo el 0,68% (1/149) de las muestras analizadas se detectó la presencia de inhibidores
o antibióticos. Un estudio previo en la misma región, determinó que en el 25% de las
muestras de leches crudas se detectó la presencia de inhibidores, lo que constituye un
riesgo para la salud pública (Máttar et al., 2009). En Santa Rosa de Osos (norte de
Antioquia) detectaron la presencia de residuos de medicamentos entre el 4,6 al 19,6%
y no observaron asociación estadística entre RCS y la presencia de residuos, y sugieren
la existencia de problemas de mastitis subclínica como también la violación a la
normatividad que establece, para la leche de consumo humano, que debe ser libre de
residuos de antimicrobianos y demás inhibidores (Reyes et al., 2010).
El promedio del RCS en el actual estudio fue de 385181±254015 CS/ml con un valor
mínimo de 15000 y máximo de 1231500 CS/ml (Tabla 2). En leches sin mastitis
subclínica en empresas ganaderas del sistema doble propósito en Monería, el RCS fue
de 230000±5650 CS/ml que fue considerado como bajo (Calderón et al., 2011), y
cuando se compararon leches con bajos y altos (230000±5650 y 1253000±424500)
RCS se afectó significativamente la calidad fisicoquímica y se disminuyó en un 5,58%
el rendimiento en la producción de queso costeño (Calderón et al., 2011). Un promedio
de 345133±302241 CS/ml fue reportado para la misma región (Calderón et al., 2012).
En otras regiones de Colombia como el norte de Antioquia se han reportado RCS
menores o iguales a 400000 CS/ml (Posada et al., 2010); parámetro aceptado por la
industria y algunos países como USA (Ruegg & Pantoja, 2013). Recuentos ≥500000
CS/ml podría haber hasta el 16% de los cuartos infectados, una reducción del 6% en la
producción de leche (NMC, 1996; Sharif & Muhammad, 2008) y pérdidas en la
calidad (Calderón et al., 2012). Igualmente en diferentes regiones de Colombia, se ha
obtenido un promedio de 642000 CS/ml y en el 39,54% de la leche no superó los
estándares internacionales para RCS; para ser competitivos en mercados
internacionales se debe disminuir este recuento (Vásquez et al., 2012) ya que altos
RCS están afectando el porcentaje de proteína (Barbosa et al., 2013).
En el 6,71% (10/149) de las empresas ganaderas el RCS fue menor o igual a 100000
CS/ml (Tabla 4), siendo este recuento excelente para la sanidad de la ubre; en el
17,44% (26/149) el RCS fue menor o igual a 200000 (Tabla 4) considerado como
bueno, y en el 75,85% (Tabla 4) los RCS fueron mayores a 400000 CS/ml donde se
están presentando casos subclínicos y clínicos, y donde es necesario implementar de
forma inmediata medidas de prevención y control de la mastitis bovina.
Conclusiones
Las variables fisicoquímicas analizadas en las leches crudas presentaron una buena
calidad composicional y se encontraron dentro de los límites establecidos en la
normatividad colombiana; pero, su calidad microbiológica y sanidad de la ubres son
deficientes y se hace necesario implementar programas de aseguramiento de la calidad
de la leche, para obtener una materia prima de óptima calidad para la industria.
83
Agradecimientos
Los autores agradecen a las estudiantes Rosa Ana Gutiérrez Tordecilla y Luz Esthela
Parodi Urango, a los empresarios y administradores de las empresas ganaderas, sin
cuya colaboración no hubiese sido posible haber adelantado este estudio, y a la
División de Investigaciones y Extensión de la Universidad de Córdoba por la
financiación del proyecto.
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n.2, p.72-86, 2014. Disponible en:
Caracterización parasitaria de la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
y su efecto en la producción de la estación piscícola flotante Intiyaco, en
el lago Guamuez (Nariño)1
ARTÍCULO DE
INVESTIGACIÓN
Julbrinner Salas-Benavides2, Jorge Nelson López-Macías3, Alba Lucy OrtegaSalas4, Vilma Yolanda Gómez-Nieves5
1,2,3,4,5,
Departamento de Recursos Hidrobiológicos, Programa de Ingeniería en
Producción Acuícola, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia
[email protected]
(Recibido: 20 de Noviembre de 2014 Aprobado: 06 de Mayo de 2015 Actualizado: 03 de julio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.6
RESUMEN: La investigación se desarrolló durante 12 meses en la
Estación Piscícola de jaulas flotantes Intiyaco de la Universidad de Nariño, localizada
en el lago Guamuez, departamento de Nariño. Se analizaron 194 ejemplares de trucha
arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con rango de peso entre 8,74 y 168,85 g, talla de
100,12 mm a 220,66 mm. El estudio se propuso identificar las principales entidades
parasitarias que afectan la especie íctica O. mykiss, evaluar el índice de prevalencia, el
efecto de la asociación entre las patologías parasitarias y su impacto en las distintas
etapas del cultivo en la producción.
Los datos fueron sometidos a análisis monofactorial multivariante Chi cuadrado de
Pearson y análisis de regresión logística, utilizando el programa estadístico IBM SPSS
20 – Statistical Package (2013). Los resultados demuestran que las patologías
parasitarias se encuentran principalmente en la cámara branquial, con prevalencias
significativas (P<0,05), de las especies: Gyrodactylus sp (34,76 %); Dactylogyrus sp
(27,59 %); Trichodina sp (21,67 %); e Ichthyophthirius sp (15,98 %). La investigación
demostró que el 35 % de las larvas y el 23 % de los juveniles de trucha arcoíris
presentaron infestaciones por exoparasitosis. El análisis diferencial del número de
parásitos, valor promedio de peso y talla de los animales de O. mykiss, por etapa de
cultivo en jaulas flotantes, determinó mayor prevalencia de parásitos unicelulares
durante la fase larvaria de trucha arcoíris, afectando el peso y la talla de los animales
enfermos (9,28 g y 10,98 mm) en comparación con los animales sanos (12,75 g y
180,37 mm). Igualmente, el número de animales enfermos durante la etapa de
larvicultura fue superior en 65,5 %, con respecto a los ejemplares infestados de la fase
de levante.
Palabras clave: edema, congestión, necrosis, parásitos , prevalencia, tremátodos
87
Parasitical characterization of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) and its
effect on fish production in the ‘Intiyaco’ floating fish station in the Guamez
Lake, Nariño (Colombia)
ABSTRACT: The study was performed during 12 months in floating cages
at the ‘Intiyaco’ fish station, which belongs to Universidad de Nariño, located in the
Guamez lake, in the Department of Nariño (Colombia). A total of 194 specimens of
rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) with a weight range from 8.74 to 168.85 grams,
and total length from 100.12 mm to 220.66 mm were analyzed. The study aimed to
identify the main parasitic entities that affect the O.myk iss species and to evaluate the
prevalence rate, the effect of the association between parasitical pathologies and their
impact in the different stages of cultivation and production. Data were subjected to
Multivariate Analysis, Chi square test and logistic regression analysis using the SPSS
20 - Statistical Package (2013). Results demonstrate that parasitic patologies are
mainly found in the gill chamber, with significant prevalence (P<0.05) of the
following
species:
Gyrodactylus
(34.76%);Dactylogyrussp
(27.59%);
Trichodinasp(21.67%); and Ichthyophthiriussp (15.98%). The research demonstrated
that 35% larvae and 23% juvenile rainbow trout showed exoparasitosis infestations.
The differential analysis of the number of parasites, average value of total length and
weight of O. mykiss fish per cultured stage in floating cages determined higher
prevalence of unicellular parasites during the larval stage of rainbow trout, affecting
the weight and length of diseased fish (9.28 g and 10.98 mm) compared to healthy
animals (12.75 g and 180.37 mm). Also the number of animals getting sick during the
larviculture phase was higher than 65.5% in relation to species infested during the
growing phase.
Key words: edema, congestion, trematodes, necrosis, prevalence, parasites
Introducción
Las aguas continentales son altamente susceptibles de contaminación, razón por la cual
su importancia como fuente de pesquerías naturales tiende a disminuir. Por otro lado,
la población mundial, aún en países en desarrollo, está sufriendo un rápido cambio
hacia la urbanización, haciendo que el hombre sea más dependiente de un suministro
comercial de alimento a través de mercados organizados que intervengan en la cadena
de seguridad alimentaria. Lo anterior incrementa la presión sobre los recursos naturales
entre los cuales se encuentran los hidrobiológicos, con su gran potencial inexplotado,
desempeñando un papel importante en la generación no solo de alimentos, sino
también de divisas (López-Macías, 2014).
En opinión de López-Macías (2014) los peces deben ser cultivados a altas densidades
de siembra, en volúmenes pequeños, para optimizar el aprovechamiento del agua en la
producción intensiva de proteína animal. Por tanto, es inevitable el desarrollo de
condiciones que favorecen la propagación de enfermedades por la acumulación de
metabolitos y deterioro de las condiciones fisicoquímicas y bacteriológicas del medio
acuático. La mortalidad de organismos ícticos en áreas pequeñas (estanques, cajas,
jaulas, entre otros) puede constituir un problema económico grave, por lo que justifica
tomar medidas para prevenir dichas pérdidas.
La aparición de una enfermedad acuícola requiere que un agente patógeno exista, un
huésped apropiado esté presente y condiciones ambientales de estrés tales como: la
superpoblación; desnutrición; contenido bajo de oxígeno; solubilización y/o
precipitación de materia orgánica; cambios en pH; temperatura y deficiencias
vitamínicas. Así mismo, el piscicultor utiliza gran cantidad de medicamentos y
químicos para una diversidad de enfermedades y parásitos generando no solo
problemas de resistencia de los microorganismos, sino también la destrucción del
fitoplancton y, por ende, la alteración total de la productividad primaria del medio
acuático. Además, los fármacos usados en acuicultura representan hasta el 10 % de los
costos directos en la truchicultura del suroccidente colombiano (Vuong et al., 1999;
Keiser & Utzinger, 2005; Torres et al., 2007; López-Macías, 2014). Por esta razón,
debe implementarse una producción limpia que disminuya la incidencia de patógenos.
El departamento de Nariño es líder en Colombia en la producción de trucha de altura,
principalmente en el lago Guamuez; infortunadamente, este cuerpo de agua de
altiplano, enfrenta desde hace varios años un gran deterioro medioambiental debido a
las descargas de basuras, aguas residuales domésticas, deforestación intensa de los
bosques naturales de la cuenca, actividades agrícolas y ganaderas que erosionan los
suelos e incrementan la cantidad de sólidos disueltos, afectando negativamente el
hábitat de los peces, toda vez que aumenta la turbidez por la disminución del oxígeno
disuelto, con alteración de los procesos de respiración, visión y olfato y con ello la
respuesta inmunológica de los peces, causando así enfermedades y subsecuentemente
el metabolismo oxidativo de los nutrientes, lo que incide en las variables de
incremento de peso, talla y conversión alimenticia, impactando la rentabilidad de la
truchicultura (López & Rubio, 2003).
El cultivo de trucha en el lago Guamuez es una alternativa novedosa, frente a otras
formas de producción, debido a que incentiva el mantenimiento de las fuentes de agua,
la conservación de los boques primarios, el manejo adecuado de la microcuenca
hidrográfica, facilita el uso integral y el manejo racional de las materias primas y
recursos locales, incrementa la eficiencia tecnológica en las diferentes etapas del ciclo
productivo, reduce los costos unitarios e incorpora valor agregado. Así mismo, la
truchicultura puede alcanzar gran importancia dentro del sistema alimentario por la
producción de bienes de gran relevancia desde el punto de vista nutricional por
ubicarse en áreas deprimidas o de mediano desarrollo del departamento de Nariño,
donde puede originar una serie de actividades conexas como la pesca deportiva y el
turismo ecológico que estimulan el crecimiento económico.
El cultivo de trucha arcoíris está limitado por la alta mortalidad de alevinos durante la
larvicultura y levante debido a la infestación de parásitos, siendo dominantes las
especies pertenecientes a trematodos monogenésicos y parásitos unicelulares, los
cuales, además de ocasionar considerables daños con altas mortalidades en los
diferentes sistemas de producción, son también indicadores biológicos y determinan la
distribución de los hospedadores, teniendo en cuenta el hábitat, sitio de infección y alta
especificidad, señalando ásí el grado de polución de los ambientes al estar las
poblaciones parasitarias favorecidas por las bajas concentraciones de oxígeno y alta
turbidez que aumentan el número de parásitos por hospedador, predisponiendo la
presencia de la enfermedad con su impacto sobre la rentabilidad del cultivo (López &
Rubio, 2001).
89
Se analizaron 194 ejemplares de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con un rango
de peso entre 8,74 y 168,85 g, talla de 100,12 mm a 220,66 mm, recolectados
aleatoriamente durante 12 meses en el periodo comprendido entre marzo de 2013 y
abril de 2014; los animales muestreados fueron 76 (39,0 %) y 32 (16,6 %) larvas en
época de lluvias y de menor precipitación respectivamente, así mismo, 54 (27,8 %)
juveniles en época de máxima precipitación y 32 (16,6 %) juveniles en época de menor
precipitación, provenientes de la Estación Piscícola Intiyaco de la Universidad de
Nariño ubicada en lago Guamuez, vereda El Puerto, corregimiento de El Encano,
municipio de Pasto, Colombia, en los 2840 msnm, 13 ºC de temperatura
y, coordenadas geográficas de 01º 06’3.80” N y 77º 07’2.26” W.
Los ejemplares se distribuyeron aleatoriamente en 16 jaulas flotantes de 10 m3,
localizadas en la Estación Piscícola Intiyaco, cada jaula consistía en una bolsa de malla
multifilamento con un ojo de ¼ a ½ pulgada, según la fase de desarrollo de los
ejemplares cultivados, con dimensiones 2 m de largo, 2 m de ancho y 2,5 m de
profundidad, recubierta con una malla polisombra. Las truchas fueron trasladadas
vivas, moribundas o recién muertas en recipientes plásticos (50 L) al Laboratorio de
Fisiopatología Acuática del Departamento de Recursos Hidrobiológicos de la
Universidad de Nariño para su posterior proceso.
Se analizaron las siguientes variables:





Peso. Ejemplares analizados de trucha arcoíris de Intiyaco. Talla. Longitud total y estándar de los ejemplares de trucha arcoíris. Morbilidad. Número de los ejemplares enfermos por parasitosis causadas por trematodos monogénicos y parásitos monocelulares en la Estación Piscícola de Intiyaco. Etapa de Cultivo. Número de los ejemplares infestados en diferentes fases de producción en la Estación Piscícola Intiyaco. Parasitosis. Presencia de parásitos en los peces observados. Pruebas estadísticas
Las pruebas estadísticas aplicadas en el ensayo se realizaron mediante el programa
estadístico IBM SPSS 20 – Statistical Package (2013).
Análisis monofactorial multivariante
Este análisis respondió a la pregunta: ¿hay diferencia entre las enfermedades
producidas por trematodos monogénicos y parásitos monocelulares con respecto a la
talla, peso y variabilidad temporal en la producción de trucha arcoíris en la Estación
Piscícola Intiyaco?
Chi cuadrado de Pearson
El procedimiento estableció la posible asociación entre la presencia de las
enfermedades parasitarias y la valoración de peso y talla de las truchas estudiadas,
teniendo en cuenta que todos los ejemplares recibieron el mismo tipo de alimento
balanceado, suministrado en igual porcentaje por unidad de peso vivo diariamente.
Análisis de regresión logística
¿Cuáles son los factores de producción piscícola (etapa de cultivo, peso y talla,
asociados con las enfermedades parasitarias en la Estación Piscícola Intiyaco?
Los análisis de las 194 unidades muestrales demostraron la incidencia de parásitos
externos sobre piel y cámara branquial, pero ausencia de patógenos internos en los
ejemplares estudiados. Lo anterior indica que la ausencia de endoparásitos de tipo
gastrointestinal y muscular corrobora la efectiva y adecuada práctica sanitaria de
cultivar peces en recintos flotantes, impidiendo de esta forma la propagación de estos
patógenos por la imposibilidad física de acceder a un huésped intermediario.
Las variables de estudio de la población de trucha arcoíris en la Estación Piscícola
Intiyaco, y su interacción con la comunidad parasitaria, establecen que la abundancia
parasitaria promedio, por etapa (larvas y juveniles) y época (máxima y mínima
precipitación), así como talla y peso de los ejemplares de trucha arcoíris, no se ajustan
a la distribución normal (DN), por tanto, la frecuencia de los géneros parasitarios,
(Gyrodactylus sp, Dactylogyrus sp, Trichodina sp e Ichthyophthirius sp) talla y peso
de O. mykiss, son estadísticamente significativos (Tabla 1).
La concentración parasitaria (# de parásitos) fue estadísticamente significativa
(P<0,05) en el tejido branquial de los peces analizados, sus valores fueron 59,46 y
66,86 individuos por 4 arcos branquiales (simetría bilateral), respectivamente, para las
épocas de menor y mayor precipitación. Según López-Macías (2014) todo pez debe
poseer parásitos que le permita al sistema inmunológico estimularse en situaciones de
infestaciones masivas. En el caso de los tremátodos parasitarios, el mismo autor
recomienda, que en condiciones de homeóstasis, el número por arco branquial debe ser
inferior a siete. La prueba T, determina que la concentración de los parásitos en el
tejido branquial de los ejemplares analizados es significativamente mayor al valor
máximo permitido (P<0,001) (Tabla1).
Las patologías parasitarias se registraron exclusivamente en tejido branquial, con
prevalencias significativas (P<0,05) del orden de Gyrodactylus sp (34,76 %),
91
Dactylogyrus sp (27,59 %), Trichodina sp (21,67 %) e Ichthyophthirius sp (15,98 %)
(Figura 1).
Según Salgado-Maldonado & Rubio-Godoy (2014), el conocimiento actual de los
parásitos de agua dulce en el neotrópico se ha limitado a la evolución e historia
biogeográfica de los peces hospederos y la clasificación taxonómica de las entidades
parasitarias; en contraste, los estudios de comunidades de parásitos en peces es
limitado (Vidal-Martínez, 2003); sin embargo, se ha mostrado alta variación en
composición de especies, riqueza y diversidad. La diferencia más importante entre la
infracomunidad parasitaria proveniente de zonas templadas y tropicales se debe a la
presencia, en estas últimas, de un componente predecible formado por parásitos
especialistas (Holmes, 1990; Kennedy & Hartvigsen, 2000; (Vidal-Martínez et al.,
2002).
Violante-González (2006), Violante-González, Aguirre-Macedo & Mendoza-Franco
(2007), al estudiar las poblaciones de parásitos metazoarios de peces, caracterizaron la
parasitofauna, la temporalidad y los patrones que estructuran las comunidades de
varias especies de peces, definiendo así, que las comunidades de los hospederos son
pobres en número de especies parasitarias, pero alto en número de individuos
parasitantes; lo anterior está de acuerdo con lo observado en el presente estudio.
El mayor daño inducido al tejido branquial de O. mykiss está caracterizado por edema,
necrosis y telagentiasis; síntomas causados por Gyrodactylus sp que difiere
significativamente de los demás géneros parasitarios (Figura 2).
La estimación de los parámetros, peso y talla de los ejemplares de O. mykiss, de esta
investigación, fueron significativos (P<0,05), de 9,90±1,28 a 10,21±1,28 g y de
142,20±20,1 a 140,70±20,1 mm, respectivamente.
El análisis multivariante determinó diferencias estadísticas (P<0,005) entre los cuatro
géneros de parásitos, respecto de su abundancia del hospedero, pero no detecto
diferencias con proporción a las épocas y la variable talla de O. mykiss. También
estableció diferencias entre el número de parásitos y las épocas de mayor y menor
precipitación y crecimiento en talla de los ejemplares (Tabla 2).
Las infracomunidades parasitarias en peces marinos pueden ser más diversas que las
poblaciones de peces de agua dulce (Kennedy & Bush, 1986; Kennedy & Williams,
1989; Kennedy & Bakke, 1989; Kennedy & Hartvigsen, 2000). Según Holmes (1990),
los helmintos gastrointestinales de peces marinos varían en el número de especies e
individuos, por lo tanto sus poblaciones son más complejas que dichas comunidades en
los peces dulceacuícolas. El mismo autor observó que la mayoría de los parásitos se
93
comportan como especies generalistas, sin embargo, algunas son especialistas a nivel
del género del hospedero, las cuales se presentan como especies dominantes.
Los estudios de dinámica de poblaciones de los parásitos en peces involucran
determinar la extensión en el tiempo y en el espacio de los parámetros bioecológicos
del pez hospedero siendo relevantes para examinar los engranajes biológicos de
abundancia, composición, transmisión y distribución de los ensamblajes parasitarios
(Rohde, 1993; Rohde, Hayward & Heap, 1995; Chisholm & I., 2003; Benz & Bullard,
2004; Poulin, 2007).
Argáez-García (2010) analizan el efecto de la temporalidad en las comunidades de
helmintos, observando mayor riqueza y abundancia de especies durante la temporada
de lluvias, aunque la diversidad no presentó diferencias significativas entre
temporadas. A nivel de infracomunidad, el estudio citado demostró que todas las
especies de parásitos son generalistas, que indica entonces, baja predictibilidad y una
estructuración basada principalmente en el azar y la distribución de los hospederos
intermediarios. Sin embargo, a nivel de comunidad componente, los valores de
prevalencia y abundancia de las especies dominantes muestran un patrón de
estructuración basado en el dominio de las especies más abundantes; de la misma
manera, como se presenta en el presente estudio, existen diferencias significativas en el
número de individuos (abundancia) parasitarios; así, en el periodo de mínima
precipitación, el porcentaje de huéspedes es de 31,3 % y 68,7 %, en máximo régimen
de lluvias (Figura 3).
Según Weins (2000) y Putman (1994), existen pocos estudios del efecto de la
temporalidad tropical (secas y lluvias) en la composición y estructura de la
parasitofauna; sin embargo, los mismos autores comprobaron que la respuesta de las
comunidades de parásitos a la temporalidad se puede reflejar en la presencia y
ausencia de especies parasitarias o en la abundancia de las mismas.
En la definición, si existe asociación o dependencia entre el número de parásitos, el
peso y talla de los ejemplares infectados de O. mykiss; mediante análisis de correlación
de Pearson, se identifica asociación lineal positiva significativa estadísticamente entre
el peso de trucha arcoíris y la talla de los mismos (R= 0,96; P<0,001). El coeficiente de
determinación (R2 = 0,92) permite inferir que la variabilidad del peso se explica en un
92 %, por la variabilidad en la talla de trucha arcoíris. Igualmente, este análisis define
dependencia lineal negativa significativa entre el peso del hospedante y el número de
parásitos (R= -0,22; P<0,001). El coeficiente de determinación (R2 = 0,048) permite
inferir que la variabilidad del peso se explica en un 4,8 %, por la variabilidad en el
número de parásitos (Tabla 3).
No existe relación de dependencia significativa (Chi-cuadrado de Pearson P>0,001)
entre los géneros parasitarios y la época de prevalencia de mayor o menor
precipitación (Tabla 4).
El análisis diferencial del número de parásitos, valor promedio de peso y talla de los
animales de O. mykiss, por etapa de cultivo en jaulas flotantes, determinó mayor
prevalencia de parásitos unicelulares durante la fase larvaria de trucha arcoíris,
afectando el peso y la talla de los animales enfermos (9,28 g y 10,98 mm) en
comparación con los animales sanos (12,75 g y 180,37 mm). Igualmente, el número de
animales enfermos durante la etapa de larvicultura (38) fue superior en 65,5 % con
respecto a los ejemplares infestados de la fase de levante (20) (Figura 4).
95
El porcentaje de relación del número de parásitos en larvas y juveniles de O. mykiss,
según la época de mayor precipitación, estimó 24,25 % mayor invasión en esta primera
fase; el valor promedio de peso y talla de sus animales señaló respectivamente 37,4 %
y 67,3 %, con un mejor indicador en juveniles que en larvas. Durante el periodo de
menor precipitación, el número de parásitos en larvas ocurrió en 58,12 % (Figuras 3 y
4).
El peso y talla de los ejemplares afectados con parásitos unicelulares durante la etapa
de larvicultura en la estación piscícola Intiyaco fue inferior en 16,16 % a los datos
reportados por Salas (2012) en condiciones similares de cultivo (Incremento de Peso
Diario 1,5 g día-1 e Incremento de longitud Diaria de 0,462 mm día-1). Igual situación
se presenta durante la fase de levante (Tabla 5).
El análisis monofactorial aplicado para establecer si existe diferencias en el peso y
talla de los ejemplares infestados por arriba del límite permisible (López-Macías,
2014) y los “no infectados” señala alta significancia (P<0,05); así, se deduce que en
presencia de parásitos, el peso tiene menor promedio (10,82±1,81 g) que en ausencia
de patógenos (114,44±32,24 g); sin embargo, la variable talla no presentó diferencias
estadísticas en presencia o ausencia de estas entidades parasitarias, 120,76 ± 30,81mm
y 150,15±20,52 mm, respectivamente (Figura 5).
La caracterización cualitativa del opérculo como zona de exposición al ataque de
parásitos, se definió con atrofia bilateral y congestión interna; condición prevalente en
el margen izquierdo de este hueso. Los ejemplares presentaron esta parasitosis en el 23
% de los animales juveniles y en el 35 % de las larvas (Figura 6). Con relación al
estudio de la piel, se estableció 30 % de lesiones de despigmentación y 40 % de
hiperpigmentación, en los ejemplares infestados con parásitos monogenésicos.
El análisis somático, por definición anatómica externa de los hospederos, determinó
que el compromiso en las aletas medias, específicamente las aletas dorsal y anal,
exhiben necrosis en 10 % de su superficie tisular y la aleta caudal presentó necrosis del
80 % de su estructura histológica.
97
La calidad de agua en la producción, según los registros fisicoquímicos de pH,
temperatura y oxígeno disuelto (O2 mg.L-1), saturación O2, dióxido de carbono (CO2
mg.L-1) y capa fótica (zona trofogénica-fotosíntesis), durante el periodo de estudio,
estimados en dos sitios (A: al interior de los módulos de cultivo y B: al exterior de las
jaulas a dos metros de distancia de ellas), demuestran que los rangos de estos
parámetros se mantuvieron en los límites aceptables de disponibilidad de oxígeno para
una especie sensible a este parámetro; condición aerobia satisfactoria al límite de la
subsaturación (OD 50 %) y predominio de bicarbonatos (HCO3-1), en condición de pH
neutro y niveles bajos de CO2 ideales fisiológicamente en el metabolismo energético
rentable en la producción de trucha arcoíris en el lago Guamuez (Roldán & Ramírez,
2008; Vásquez, 2005; Boyd, 2000; López-Macías, 2014) (Figura 7).
Conclusiones
Las patologías parasitarias se registraron principalmente en la cámara branquial, con
prevalencias significativas (P<0,05) de las siguientes especies: Gyrodactylus sp (34,76
%); Dactylogyrus sp (27,59 %); Trichodina sp (21,67 %); e Ichthyophthirius sp (15,98
%). Los ejemplares presentaron exoparasitosis en el 35 % de las larvas y el 23 % de
los juveniles. El análisis diferencial del número de parásitos, valor promedio de peso y
talla de los animales de O. mykiss por etapa de cultivo en jaulas flotantes, determinó
mayor prevalencia de parásitos unicelulares durante la fase larvaria de trucha arcoíris,
afectando el peso y la talla de los animales enfermos (9,28 g y 120,75 mm) en
comparación con los animales sanos (10,98 g y 180,37 mm). Igualmente, el número de
animales enfermos durante la etapa de larvicultura fue superior en 65,55 %, con
respecto a los ejemplares infestados de la fase de levante.
Porcentualmente, la relación del número de parásitos en larvas y juveniles de O.
mykiss en época de mayor precipitación presenta 24,25 % de mayor invasión en esta
primera fase; el valor promedio en peso y talla señaló respectivamente 37,4 % y 67,3
% con un mejor indicador en juveniles que en larvas; así mismo, durante el periodo de
menor precipitación, el número de parásitos en larvas prevaleció en 58,12 %.
La infestación ectoparasitaria compromete el 10 % de las aletas dorsal y anal, así como
en el 80 % la superficie tisular de la aleta caudal con necrosis histológica.
Agradecimientos
Vicerrectoría de Investigaciones, Posgrados y Relaciones Internacionales de la
Universidad de Nariño – VIPRI.
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Evaluación clínica de la otitis parasitaria bovina (Rhabditis bovis) en la
raza Gyr1
ARTÍCULO DE
INVESTIGACIÓN
José Alberto Cardona-Álvarez2, 5, Mastoby Miguel Martínez-Martínez3, Jair
Pérez-Osorio4
1,
Financiado por la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.
2,
Grupo de investigación en Medicina de Grandes Animales (MEGA),
Departamento de Ciencias Pecuarias, Universidad de Córdoba, Montería,
Colombia.
3
Departamento de Ciencias Pecuarias, Universidad de Córdoba, Montería,
Colombia.
4
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Salle, Bogotá,
Colombia.
5
Bolsista do Programa Estudantes-Convênio de Pós-Graduação – PEC-PG,
da CAPES/CNPq – Brasil.
[email protected]
(Recibido: 3 de Octubre de 2014 Aprobado: 2 de Diciembre de 2014 Actualizado: 03 de julio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.7
RESUMEN: El objetivo del presente artículo fue realizar un informe
detallado sobre la otitis parasitaria bovina (Rhabditis bovis) en la raza Gyr. En la cual
se incluyen aspectos epidemiológicos de orden nacional e internacional, geográficos,
manifestaciones clínicas, métodos diagnósticos y tratamiento. La otitis parasitaria
clínica es causada por nematodos rhabditiformes, que causa malestar en los animales
de la raza Gyr puros, generando pérdidas económicas en la industria ganadera. Se
pretende actualizar y generar conciencia en los médicos veterinarios sobre el
diagnóstico, el seguimiento epidemiológico y las estrategias de control de la
enfermedad.
Palabras clave: nematodo, rhabditiformes, parásitos (Fuente: MeSH)
Clinical evaluation of bovine parasitic otitis (Rhabditis bovis) in the race Gyr
ABSTRACT: The objective of this article was to conduct a detailed report
on bovine parasitic otitis (Rhabditis bovis) on the Gyr breed. Epidemiological aspects,
of the national and international order including geographical, clinical, diagnostic
methods and treatment are included. The clinical parasitic otitis is caused by
rhabditiform nematodes that cause discomfort in pure breed Gyr animals, generating
economic losses in the cattle industry. It is intended to update and generate awareness
among veterinarians about diagnosis, epidemiological monitoring of the disease and
the strategies for disease control.
Key words: nematode, rhabditiform, parasites (Source: MeSH)
Introducción
La otitis parasitaria bovina es causada por nematodos del género Rhabditis, se presenta
principalmente en bovinos de la raza Gyr e Indubrasil. La raza Gyr parece estar
predispuesta a la enfermedad en comparación con otras razas, debido a la
conformación anatómica del pabellón auricular, el cual es alargado, pendulante, en
forma tubular, con su porción superior enrollada sobre sí misma, abriéndose
gradualmente hacia fuera, curvándose hacia adentro, lo que favorece la retención de
cerumen, proporcionando así un ambiente propicio para la reproducción y
permanencia del parásito (Leite et al., 1993; Vieira et al., 1998; Vieira et al., 2001)
(Figura 1).
Epidemiología
Condiciones agroecológicas
Se ha reportado en algunos países con explotaciones en clima caliente y húmedo, como
Tanzania (Msolla et al., 1993), Kenia (Round, 1962; Matandala et al., 2002) y
Zimbabwe (Ushewokunze-Obatolu et al., 1999). Aunque la mayoría de reportes son de
Brasil, principalmente en Minas Gerais, Goiás, Pernambuco, São Paulo, Rio de Janeiro
y Espírito Santo (Leite et al., 1993; Verocai et al., 2007; Beltrame et al., 2011). En
Colombia, solo se ha reportado la enfermedad en bovinos puros de la raza Gyr en el
departamento de Córdoba (Cardona et al., 2010).
Vieira et al. (2001) y Duarte & Hamdan (2004) expresan que el género Rhabditis es un
parásito saprófito que habita en zonas de bosque húmedo tropical, que vive
103
comúnmente en materias fecales, tierras húmedas y materia orgánica en
descomposición. Por otra parte, Abdalla et al. (2008), Souza et al. (2008) y Santos et
al. (2009) afirman que esta condición parasitaria es común en rebaños que se
encuentran en países de bosque húmedo tropical, sumada a las características propicias
que favorecen las orejas de los bovinos de la raza Gyr (Leite et al., 1993; Vieira et al.,
2001).
Parece ser que el hospedero adquiere el parásito en las primeras etapas de su vida
cuando está descansando o acostado en el suelo, debido a que todo el ciclo del parásito
sucede en el hospedero reiniciando el ciclo con la muerte del mismo; las larvas
adquieren su estado adulto antes de la 48 horas, en este punto pueden copular; el
macho deposita su esperma en la Receptacula seminis de la hembra, la cual copula una
sola vez en su vida, ya que los huevos eclosionan en su interior matándola y sirviendo
como recipiente para su descendencia, mientras que el macho continúa activamente
moviéndose en busca de hembras aún no fertilizadas (Vieira et al., 2001; Duarte &
Hamdan, 2004).
Fuentes de contagio/Factores de riesgo
Los principales factores de riesgo para el contagio son las actividades grupales como
baños ectoparasiticidas, vacunación, vermifugación y otras prácticas zootécnicas,
asimismo el contacto de animales enfermos con animales sanos en los sitios de libre
desplazamiento (Msolla et al., 1986; Msolla et al., 1987). Sin embargo, se reporta que
un factor de riesgo importante lo constituye la presencia exagerada de moscas,
adicionalmente la época lluviosa favorece la presentación de la enfermedad
(Ushewokunze-Obatolu et al., 1999).
Frecuencia/Prevalencia
Existen diversos reportes de frecuencia de presentación de otitis parasitaria en países
tropicales con características agroecológicas similares, como los reportados por Leite
et al. (1993) con 93% en el estado de Minas Gerais; Vieira et al. (1998) con 78,43% en
el estado de Goiás; Duarte et al. (2001) con 60,1% en el estado de Minas Gerais y
Verocai et al. (2007) con 90,9% en Rio de Janeiro. En Colombia solo se ha
determinado la frecuencia de presentación en bovinos Gyr puros de seis ganaderías del
departamento de Córdoba con 63,2% (Cardona et al., 2012) y en tres explotaciones
ganaderas del departamento de Sucre con una frecuencia de presentación del 85,6%
(Cardona et al., 2014). No existen datos en la literatura consultada sobre la influencia
de la edad y el sexo en la presentación de otitis parasitaria por Rhabditis bovis.
Manifestaciones clínicas
Es preciso tener en cuenta la anamnesis, el tiempo de padecimiento de la enfermedad y
la evolución del cuadro, así como la observación directa de la motilidad del parásito en
el cerumen como datos importantes para el diagnóstico clínico de otitis parasitaria
bovina por Rhabditis spp. (Vieira et al., 2001; Santos et al., 2009).
Las manifestaciones clínicas incluyen: a la inspección se puede observar que algunos
animales presentan movimientos laterales súbitos de la cabeza, más en detalle se
observa otitis clínica, otorrea que puede ser purulenta (Figura 2), olor fétido, cierto
grado de estenosis del conducto auditivo y prurito intenso expresado con movimientos
constantes y rascado excesivo de las orejas (Duarte & Hamdan, 2004; Verocai et al.,
2009). Por otra parte, algunas otitis pueden llegar a producir síndrome vestibular, y
concomitantemente se puede producir lesión del nervio facial (Abdalla et al., 2008;
Souza et al., 2008).
Vieira et al. (1998) y Vieira et al. (2001) describen que los animales con otitis
parasitaria en la mayoría de los casos presentan la afección en ambas orejas,
acompañados principalmente de otorrea con secreción algunas veces purulenta y
fétida, dolor a la palpación en las bases de los orejas y linfadenitis de los nódulos
linfáticos mandibulares.
Diagnóstico
A la inspección del conducto auditivo externo, se puede observar cierto grado de
estenosis así como la otorrea algunas veces purulenta, y en forma directa el
movimiento de los parásitos, de igual forma se puede percibir el olor fétido de las
secreciones (Duarte & Hamdan, 2004; Cardona et al., 2010; Cardona et al., 2012;
Cardona et al., 2014).
Al examinar clínicamente ambos conductos auditivos, de acuerdo con el protocolo
propuesto por Leite et al. (1994), se puede establecer la presencia de otitis clínica con
105
presencia de olor fétido, otorrea, eritema y estenosis. Las muestras de cerumen se
obtienen por hisopado del conducto auditivo externo, pudiéndose observar en forma
directa el movimiento del parásito en el cerumen. Posteriormente, el material se
deposita en tubos de ensayo con alcohol al 70% y transportados a temperatura
ambiente para su evaluación microscópica en el Laboratorio de Parasitología, donde se
determinará la presencia de nematodos en diferentes estadios evolutivos (larvas y
adultos) según Duarte et al. (2001), y clasificados como pertenecientes al género
Rhabditis spp. de acuerdo con Leite et al. (1994), Sudhaus & Kiontke (1996) y Santos
et al. (2009).
Igualmente, después de la colecta del cerumen por hisopado, se puede observar en
forma directa en el estereoscopio, el movimiento del parásito (Figura 3).
En el laboratorio se puede corroborar la presencia de larvas y adultos del parásito por
observación microscópica y caracterizarlo dentro del género Rhabditis de acuerdo con
Leite et al. (1994), Sudhaus & Kiontke (1996) y Santos et al. (2009) (Figura 4).
Tratamiento
Se han instaurado una gran cantidad de tratamientos con el fin de controlar la
enfermedad, sin embargo todas las estrategias utilizadas han demostrado ser
ineficientes, dada la constante reinfestación. Es así como Viera et al. (2001) probaron
dos tratamientos, uno a base de una aplicación tópica de triclorfon al 3%, con
dimetilsulfóxido (DMSO) al 1% y utilizando como vehículo la nitrofurazona en pasta;
el otro tratamiento fue una solución de alcohol/éter en relación 1:1 con 2% de sulfato
de cobre; ambos tratamientos fueron aplicados una sola vez, no encontrando resultados
satisfactorios. Por otra parte, Radostits et al. (2002) manifestaron que eliminaron el
parásito y la secreción purulenta en el interior del conducto auditivo externo,
utilizando moxidectina y un antibiótico de amplio espectro, sin embargo Santos et al.
(2009), basándose en esa apreciación, realizaron tratamientos con moxidectina en
bovinos positivos a otitis parasitaria, pero con resultados insatisfactorios.
Verocai et al. (2009) realizaron un experimento con el fin de evaluar la eficacia del
sulfóxido de albendazol administrado oralmente y de la ivermectina en forma de
“pour-on” en el tratamiento de la otitis parasitária bovina, en el cual se demostró que la
ivermectina es ineficaz en el control de parásito, mientras que el sulfóxido de
albendazol demostró ser efectivo solo en un 25% al día 21 postratamiento.
Debido a la ineficacia de los tratamientos hasta ahora evaluados, es necesaria la
instauración de nuevos estudios con el fin de establecer una estrategia terapéutica
adecuada y eficaz, evaluando vías alternativas de administración, así como el
conocimiento de los factores predisponentes como son el control de moscas en el
verano, los descornes de los terneros, así como la adquisición de animales de la raza
Gyr o Indubrasil sin evidencia clínica de la enfermedad.
107
Conclusiones
Las características epidemiológicas (temperatura y humedad relativa), las
manifestaciones clínicas (antecedentes, rascado, inquietud, otorrea), las características
del cerumen del conducto auditivo externo (color, olor y movimiento del parásito), así
como la observación del parásito en el laboratorio (estereoscopio y microscopio),
permiten diagnosticar otitis parasitaria clínica por nematodos rhabditiformes
(Rhabditis bovis) en bovinos de la raza Gyr. De igual forma, se plantea la necesidad de
realizar más investigaciones sobre el estado epidemiológico de la enfermedad en las
explotaciones de bovinos Gyr puros en los diferentes departamentos de Colombia, y
sobre las posibles estrategias de manejo y control de la enfermedad.
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Zootecnia, v.8, n.2, p.102-109, 2014.. Disponible en:
109
Evaluación del conocimiento sobre enfermedades zoonóticas en
estudiantes de bachillerato de instituciones educativas del sector rural
del municipio de Pasto, Nariño1
ARTÍCULO DE
INVESTIGACIÓN
Juan Manuel Astaiza-Martínez2, Carmenza Janneth Benavides-Melo2, Darío
Antonio Vallejo-Timarán3
1,
Financiado por la Vicerrectoría de Investigaciones y relaciones
Internacionales (VIPRI) de la Universidad de Nariño, Pasto, Colombia.
2,
Grupo de Investigación en Salud Pública y Epidemiología (SAPUEP),
Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño, Pasto, Colombia.
3,
Grupo de Investigación en Medicina Interna y Farmacología Veterinaria
(MIFARVET), Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño, Pasto,
Colombia.
[email protected]
(Recibido: 7 de Julio de 2014 Aprobado: 10 de Septiembre de 2014 Actualizado: 03 de julio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.8
RESUMEN: Las zoonosis son enfermedades poco conocidas en términos
generales por la población, siendo en los países en vías de desarrollo una importante
causa de morbimortalidad y pérdidas económicas. El objetivo del presente trabajo fue
evaluar el conocimiento de estudiantes de bachillerato de instituciones educativas del
sector rural del municipio de Pasto sobre algunas enfermedades zoonóticas, a través de
capacitaciones dirigidas por profesionales y estudiantes del programa de Medicina
Veterinaria de la Universidad de Nariño. En el proceso participaron 16 instituciones
rurales con estudiantes de diferentes grados de bachillerato, a los cuales se les aplicó
un cuestionario antes y después de la capacitación sobre conceptos generales,
toxocariosis, toxoplasmosis, rabia, brucelosis, tuberculosis, cisticercosis y
leptospirosis. El cambio cognoscitivo pasó de tener el mayor porcentaje de estudiantes
dentro de un nivel de conocimientos “insuficiente” en la fase de diagnóstico a un nivel
cognitivo “excelente” en la fase de evaluación. Se concluye que existe
desconocimiento sobre las enfermedades zoonóticas en la población rural evaluada y la
educación sanitaria es una herramienta eficaz y necesaria para contribuir de esta
manera al control y prevención de este tipo de enfermedades.
Palabras clave: colegios rurales, educación sanitaria, salud, zoonosis
Assessment of the knowledge about zoonotic diseases in high school students of
educational institutions from the rural area of the municipality of Pasto, Nariño
ABSTRACT: Zoonotic diseases are little known in general terms by the
population, being a major cause of morbidity, mortality and economic losses in
developing countries. The aim of this study was to assess the knowledge of high
school students from educational institutions in the rural area of the municipality of
Pasto about some zoonotic diseases through training conducted by professionals and
students from the Veterinary Medicine program at Universidad de Nariño. The process
involved 16 rural institutions with students from different high school grade levels
who were applied a questionnaire before and after training about general concepts,
toxocariasis, toxoplasmosis, rabies, brucellosis, tuberculosis, cysticercosis and
leptospirosis. Cognitive change went from having the highest percentage of students
within an "insufficient” level of knowledge in the diagnostic stage to an "excellent"
cognitive level in the evaluation stage. It is concluded that there is lack of awareness
about zoonotic diseases within the rural population assessed and sanitary education is a
useful and necessary tool for contributing to the control and prevention of these
diseases.
Key words: health, rural schools, sanitary education, zoonoses
Introducción
La convivencia entre el hombre y los animales no siempre tiene lugar en condiciones
óptimas de higiene y seguridad. Por otra parte, las normas correctas para establecer
una adecuada relación entre ellos no siempre son conocidas o aplicadas, los riesgos
más notorios que surgen de estas situaciones son la transmisión de enfermedades entre
los animales y el hombre, la ocurrencia de lesiones y la contaminación del ambiente
(Marcos et al., 1996).
En el año 1959 la OMS definió las zoonosis como “las enfermedades e infecciones que
se transmiten de los animales al hombre y viceversa”. Esta definición básica se
conserva, a pesar de múltiples propuestas que apuntan a detallarla o adicionarle
conceptos. Para clasificar las zoonosis se han utilizado como criterios centrales, mas
no únicos, el agente infeccioso que la produce y el modo de transmisión. Aunque en
muchos países se han logrado controlar algunas de las zoonosis, en el panorama
mundial de salud pública la importancia de las zoonosis se debe a su persistencia,
carácter emergente y reemergente (Agudelo Suárez, 2012).
En los países en vías de desarrollo con un contexto socio económico y social
desfavorable (por ejemplo, en las zonas suburbanas y rurales), son una importante
causa de morbimortalidad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia
con animales, la ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural
continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades, así como la ausencia
de políticas públicas eficaces y continuas de promoción y educación de la salud
(Dabanch, 2003; Ballesteros et al., 2013).
El riesgo de contraer una enfermedad zoonótica es, en principio, común a toda la
población, pero tiene una especial trascendencia en niños, personas inmunodeprimidas
y en personas cuya actividad laboral se desarrolla con animales y/o productos
derivados de los mismos (Dabanch, 2003).
Las zoonosis son enfermedades poco conocidas, en términos generales, por la
población. Hay desconocimiento y confusión acerca de lo que son en realidad estas
enfermedades, sus mecanismos de transmisión, los efectos en el ser humano y las
111
medidas de prevención. Tanto en el ámbito de lo privado (familiar) como de lo público
(vecinos, clientes, trabajadores) la tendencia es a ignorar la posibilidad de un riesgo
importante para la salud propia y de los demás, todo ello para relacionarse en unos
casos con menor angustia con el animal, si éste comparte el hogar, o bien para evitar el
cambio de costumbres o prácticas profesionales, siempre incómodos y a veces
costosos económicamente (Del Pozo, 2001).
Especialmente en el medio rural, todo ello choca con hábitos y actitudes culturales
fuertemente arraigados. La evidencia de que existen grandes resistencias (en gran parte
inconscientes) en la población a valorar y asumir el riesgo de contraer una enfermedad
zoonótica, indica la relativa ineficacia de cualquier campaña de comunicación
concebida en la dirección exclusiva de la información. Informar de las zoonosis, del
proceso de contagio, de los riesgos que se corren y de las medidas oportunas para
prevenirlas, apenas puede decirse que sea una medida que permita por sí misma
modificar los comportamientos, dado que el problema se sitúa menos en el “saber” que
en el “querer saber” (Del Pozo, 2001).
Los problemas relacionadas con la sanidad animal y, en consecuencia, la salud pública
pueden ser minimizados cuando se aplica una educación en salud, por lo que es
necesario educar a la gente, no solo con anuncios y revelaciones en medios de
comunicación masivos, sino también con programas sistemáticos de educación para la
salud, contribuyendo al proceso en el que la comunidad aumenta su capacidad para
resolver sus problemas de salud e intensificar su propia participación (Moreira et al.,
2013).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el conocimiento de estudiantes de
bachillerato de instituciones educativas del sector rural del municipio de Pasto sobre
algunas enfermedades zoonóticas.
El estudio consistió básicamente en una intervención educativa sobre enfermedades
zoonóticas, la cual incluyó zoonosis como: Toxocariosis, Toxoplasmosis, Rabia,
Brucelosis, Cisticercosis, Tuberculosis y Leptospirosis.
La intervención educativa abarcó el concepto de zoonosis además de las formas de
transmisión, agentes causales, reservorios, tipos de alimentos involucrados,
sintomatología y las medidas preventivas de estas zoonosis.
Este programa de Educación Sanitaria se realizó en 16 instituciones rurales de
bachillerato registradas en la Secretaria Municipal de Pasto: Institución Nuestra Señora
de Guadalupe, Instituciones Municipales de Cristo Rey, Marco Fidel Suárez,
Mocondino, Cabrera, Agualongo, Francisco de la Villota, José Antonio Galán,
Eduardo Romo Rosero, Santa Teresita, Encano, Francisco José de Caldas, Obonuco,
María Nazareth, Morasurco y la Institución Educativa Municipal INEM Luis Delfín
Insuasty Rodríguez de la modalidad agropecuaria (Alcaldía de Pasto, 2013).
Inicialmente se realizó un test evaluativo dirigido a los estudiantes cuyo propósito fue
determinar el conocimiento previo acerca de las enfermedades zoonóticas, el cual fue
diseñado en lenguaje sencillo y mediante preguntas de selección múltiple con única
respuesta.
En la segunda visita se llevó a cabo la intervención educativa (capacitación sanitaria)
realizada por dos docentes médicos veterinarios y dos estudiantes de último año del
programa de Medicina Veterinaria de la Universidad de Nariño, durante el primer
semestre de 2013. La capacitación se hizo mediante la ayuda de diapositivas donde se
explicó mediante lenguaje sencillo, imágenes y esquemas los conceptos básicos sobre
enfermedad, agentes infecciosos, grupos de riesgo, agentes etiológicos, mecanismos de
transmisión, síntomas y medidas de prevención y control. En promedio cada tema se
abordó en un tiempo de 20 minutos, con la participación de grupos de 20 estudiantes.
Al finalizar la capacitación se realizó de nuevo el test evaluativo para evaluar el nivel
de captación de la información suministrada acerca de las enfermedades zoonóticas y
por ende la calidad de la capacitación.
Finalmente se realizó la entrega de material didáctico (manuales sobre enfermedades
zoonóticas) elaborado para este proyecto, a los estudiantes y a la biblioteca de cada
institución.
El análisis de los datos obtenidos se realizó de manera descriptiva y se presentan de
manera porcentual, para su análisis se utilizó el paquete estadístico SPSS bajo licencia
Shareware.
En el estudio participaron 584 estudiantes de diferentes grados (6º a 11º).
En la fase de diagnóstico se encontró un nivel de conocimiento acerca de las
enfermedades zoonóticas de 27,71%, siendo evidente un menor grado cognitivo en las
enfermedades causadas por parásitos como la cisticercosis (11,59%) y la toxocariosis
(10,64%) y en las enfermedades bacterianas como brucelosis (11,25%). El mayor
grado de conocimiento fue en rabia (48,83%) (Figura 1).
Situación preocupante si se tiene en cuenta que las zoonosis son una realidad en la
población y la falta de conocimientos básicos sobre estas enfermedades es debido a la
escasa entrega de información a comunidades rurales y urbanas (Marcos, 2004;
Logroño, 2011).
113
Posterior a la capacitación (Figura 2) el nivel global de conocimiento aumentó hasta un
72,4% siendo el mayor en rabia (90,30%), y el menor en leptospirosis (52,19%).
La toxoplasmosis fue la enfermedad en la cual se logró el mayor incremento en el
nivel de conocimiento el cual fue de un 67,32% ya que pasó de 16,11% a 83,43%;
seguido de la cisticercosis y la brucelosis donde se incrementó el nivel de
conocimiento en un 58,84% y 52,48% respectivamente.
Datos relevantes, si se tiene en cuenta que la educación en salud e instrucción sobre
higiene, en especial cuidados con los niños a menudo se subestima, aunque en muchos
casos es casi suficiente para evitar zoonosis como la equinococosis, toxocariosis,
tuberculosis bovina y otras (Vega, 2009).
Además, refuerza el hecho de que la educación sanitaria es un proceso que influye en
la transmisión de todo lo que se conoce sobre la salud dentro de los patrones deseables
de la conducta individual y colectiva (Bartolo, et al., 2008).
Comparación fase de diagnóstico – fase de evaluación
En la fase de diagnóstico se encontró un promedio de 27,95% de preguntas aprobadas,
en comparación con un promedio de 72,78% de preguntas aprobadas en la evaluación
realizada después de la capacitación (Figura 3).
Haga click sobre la imagen para ampliarla
Debido a que no hubo una distribución normal en los datos, para estimar diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos se realizó una prueba de comparación
de medias de t-Student (Tabla 1).
Según lo anterior, el porcentaje promedio de preguntas aprobadas en la fase de
diagnóstico fue de 27,9% y en la fase de evaluación fue de 72,7%, por lo tanto hubo un
incremento de 44,8% en el número de preguntas aprobadas después de la capacitación.
Mediante el estadístico t-Student se establece que existen diferencias estadísticamente
significativas entre las medias del porcentaje de preguntas aprobadas antes y después
de la capacitación (valor de P 0,001). Con un 95% de confianza, se afirma que la
capacitación sobre enfermedades zoonóticas tiene un efecto positivo en los estudiantes
de colegios rurales, incrementando sus conocimientos en un 44,8%.
Adopción de conocimientos y cambio cognoscitivo.
La adopción de conocimientos en el estudio fue de 44,8% (Figura 4). Por lo tanto, la
probabilidad de incrementar los conocimientos sobre enfermedades zoonóticas es dos
veces mayor si el estudiante recibe capacitación.
115
Para determinar el cambio cognoscitivo de los estudiantes durante el proceso de
capacitación se asignaron categorías de acuerdo al porcentaje de aciertos por parte de
los estudiantes según la Tabla 2.
Con base en lo anterior se determinó el cambio cognoscitivo de los estudiantes antes y
después de la capacitación. El nivel de conocimiento inicial de los estudiantes se
estableció en la fase de diagnóstico (Figura 5).
Se evidencia que el cambio cognoscitivo antes y después de la capacitación pasó de
tener el mayor porcentaje de estudiantes dentro de un nivel de conocimientos
“insuficiente” en la fase de diagnóstico a un nivel cognitivo “excelente” en la fase de
evaluación (Figura 6).
Con un 95% de confianza se afirma que existe un crecimiento exponencial en el nivel
de conocimientos y la adopción de conocimientos de estudiantes que reciben
capacitación en enfermedades zoonóticas. De igual manera, la capacitación permite un
cambio cognitivo de insuficiente a excelente en la comprensión de enfermedades
zoonóticas. Por lo tanto, la intervención sanitaria tuvo un impacto positivo en la
población objeto de estudio.
Dato alentador si se tiene en cuenta que el alumno de enseñanza básica rural además
de motivar a sus padres o apoderados, es capaz de transmitir una buena calidad de
información en el 65,9% de los casos, convirtiéndose en maestro al participar en la
entrega de información a sus familiares y amigos (Bartolo et al., 2008).
Finalmente, es importante considerar que el número de charlas dictadas puede influir,
ya que hay autores que aseguran la importancia de mantener la continuidad a través del
tiempo en este tipo de intervenciones educativas para lograr un buen resultado (Bartolo
et al., 2008). Ya que estas medidas de intervención en Promoción de la Salud de
ámbito comunitario si se diseñan con carácter continuado, con una determinación de
objetivos concretos y sobre una población definida por los datos epidemiológicos
disponibles, eliminan progresivamente las situaciones de riesgo y operan en el sentido
de la responsabilización de la población propietaria de animales y de los sectores
profesionales directamente relacionados con el riesgo de zoonosis (Del Pozo, 2001).
El trabajo desarrollado se limitó a un tiempo determinado, pero se requiere dar
continuidad por parte de las instituciones a este tipo de capacitaciones para realmente
lograr un impacto en la comunidad a través de los estudiantes capacitados que más
adelante podría ser evaluado.
117
Conclusiones
En la población objeto de estudio se observó un bajo nivel de conocimiento sobre
enfermedades zoonóticas, principalmente en toxocariosis lo cual refleja la necesidad
de intensificar campañas respecto a este tema, más aún cuando en nuestro medio es tan
frecuente la tenencia de mascotas y su estrecha relación con los niños que son la
población más vulnerable. Los conocimientos más amplios tanto en la fase de
diagnóstico como posterior a la capacitación se observaron en rabia, lo cual podría
asociarse a las campañas oficiales que sobre esta enfermedad se hacen, con un impacto
positivo en la población.
En general, el nivel de conocimientos mejoró a partir de las capacitaciones ofrecidas,
lo cual permite deducir que la educación sanitaria es una herramienta eficaz para
incrementar el nivel de conocimiento en la población y de esta manera contribuir al
control y prevención de este tipo de enfermedades, además sirve de base para que las
instituciones participantes ejecuten trabajos continuos de concientización sobre las
zoonosis en sus alumnos, proyectada a la población rural en general.
Agradecimientos
Los autores expresan sus agradecimientos a los médicos veterinarios Mario Fernando
Jojoa Puerres y José Luis Bolaños Domínguez, quienes participaron en el proceso de
capacitación.
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Agudelo‐Suárez, A. Aproximación a la complejidad de las zoonosis en Colombia. Revista de Salud Pública, v.14, n.2, p.325‐339, 2012. Alcaldía de Pasto, Nariño‐Colombia. Listado Instituciones Educativas Oficiales, 2013. Disponible en: http://www.pasto.gov.co/index.php/directorio/instituciones-educativas. Accesado en: 23/11/2012. Ballesteros, M.; Navarro, M.; Passucci, J. et al. Educación para la prevención de zoonosis en el ámbito rural. Proyecto de Extensión de la Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Argentina, 2013. Disponible en: http://extension.unicen.edu.ar/?action=proyecto&id=1064 Accesado en: 12/02/2014. Bartolo, F.; Rojas, P.; Gadickë, P. Evaluación del impacto de un programa de educación sanitaria para prevenir enfermedades zoonóticas. Theoria, v.17, n.1, p.61‐69, 2008. Dabanch, P.J. Zoonosis. Revista Chilena de Infectología, v.20, p.47‐51, 2003 (suppl.1). Del Pozo Sardinero, J. Guía de Actuación frente a las Zoonosis en la Comunidad de Madrid. (Documentos técnicos de salud pública No. 68). Madrid: Dirección General de Salud Pública, 2001. Logroño, K. Programa educativo para prevenir la zoonosis en las familias de la comunidad de San Roque del Cantón Sucre, Parroquia Charapotó, Provincia de Manabí. Chimborazo, Ecuador: Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, 2011. 344p. Tesis (Licenciatura en Promoción y Cuidados de la Salud). Disponible en: http://dspace.espoch.edu.ec/bitstream/123456789/2044/1/104T0007.pdf Accesado en: 12/02/2014. ©Universidad de Caldas
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119
Diarrea neonatal bovina en un hato del altiplano norte de Antioquia
(Colombia), un estudio descriptivo1
ARTÍCULO DE
INVESTIGACIÓN
David Andrey Cadavid-Betancur2, Carlos Andrés Giraldo-Echeverri2, Santiago
Sierra-Bedoya2, Mateo Montoya-Pino2, Jenny Jovana Chaparro-Gutiérrez3,
Juan Esteban Restrepo-Botero2, 4, Martha Olivera-Ángel2.
1,
Financiado por la Universidad de Antioquia (Convocatoria de
Regionalización 2012 y Estrategia de Sostenibilidad Grupo de Investigación
Biogénesis) y Colciencias (Programa Jóvenes Investigadores e Innovadores –
Convocatoria 2012).
2,
Grupo de Investigación Biogénesis, Facultad de Ciencias Agrarias,
Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
3,
Grupo de Investigación Vericel, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad
de Antioquia, Medellín, Colombia.
4,
Cooperativa Colanta Ltda, Medellín, Colombia.
[email protected]
(Recibido: 26 de Noviembre de 2014 Aprobado: 22 de Abril de 2015 Actualizado: 03 de julio de 2015)
DOI: 10.17151/vetzo.2014.8.2.9
RESUMEN: La diarrea neonatal bovina es una enfermedad cuya etiología
puede ser infecciosa o no infecciosa, afecta los neonatos bovinos especialmente
durante las tres primeras semanas de vida y causa serias pérdidas económicas en el
sector lechero a nivel mundial. En este estudio se describió la enfermedad en un hato
de producción lechera en el altiplano norte de Antioquia. Se evaluó una cohorte de 60
terneros durante su primer mes de vida mediante examen clínico, análisis
hematológicos, de serología, y ELISA en materia fecal para Cryptosporidium parvum,
rotavirus bovino tipo A, coronavirus bovino y E. coli K99. Adicionalmente, se estimó
la concentración de inmunoglobulinas en el calostro suministrado y la transferencia
pasiva de inmunoglobulinas. Se encontraron proporciones de morbilidad por diarrea de
94,92%, mortalidad general de 17,58% y letalidad del 15,79%. Entre los animales
enfermos se encontró un porcentaje de 89,47%, 47,37%, 7,02% y 0% para cada agente
patógeno respectivamente. Se evidenció un alto porcentaje de animales con linfocitos
reactivos, lo que indica la infección con agentes parasitarios o virales. Los resultados
obtenidos en este estudio sugieren que puede existir circulación de agentes
involucrados en la diarrea neonatal bovina en la zona, lo que genera preocupación por
el desconocimiento del estatus sanitario del altiplano norte de Antioquia en general.
Palabras clave: Cryptosporidium parvum, ELISA, inmunidad pasiva, rotavirus bovino
Bovine neonatal diarrhea in a herd in the Northern Antioquia (Colombia)
Highlands, a descriptive study
ABSTRACT: Bovine neonatal diarrhea is a disease, with etiology that can
be infectious or non-infectious, which affects calves during the first three and causes
serious economic losses in the dairy industry worldwide. This study describes the
disease in a dairy herd in the Northern Antioquia Highlands. A cohort of 60 calves was
evaluated during the first month of life through clinical examinations, haematological
and serology analysis, and ELISA in fecal samples to detect Cryptosporidium parvum,
bovine rotavirus type A, bovine coronavirus and E. coli K99. Additionally, the
concentration of immunoglobulin in the colostrum administered and the passive
transfer of immunoglobulin were estimated. Proportions of morbidity because of
diarrhea were 94.92%, general mortality 17.58%, and lethality 15.79%. Among the
group of sick animals 89.47%, 47.37%, 7.02% and 0% were found for each pathogenic
agent respectively. A high percentage of animals with reactive lymphocytes were
observed which indicates parasitic or viral infection. The results obtained from this
study suggest that circulation of agents involved in bovine neonatal diarrhea can exist
in the area, which generates concern because of the unknown sanitary status in the
Northern Antioquia Highlands.
Key words: bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, ELISA, passive immunity
Introducción
La diarrea neonatal bovina (DNB) genera pérdidas económicas en la industria láctea
debido a la alta morbilidad, retraso en el crecimiento y los altos costos en el
tratamiento (Lundborg et al., 2005; Afshari et al., 2012; Aguirre, 2012). Es un cuadro
clínico gastrointestinal común y complejo que afecta a los animales recién nacidos,
especialmente durante la segunda y tercera semana de vida, donde se presentan
alrededor del 70% de los casos (Baquero-Parrado, 2008; Hernández, 2010). Este
complejo es causado por una gran variedad de condiciones (ambientales, nutricionales,
genéticas); y, por lo general, no es exclusivo de un solo agente; de esta manera, su
presentación está influenciada por las características intrínsecas del animal, su estatus
nutricional e inmunológico, el manejo del hato, el medio ambiente y la variedad de
agentes infecciosos involucrados (Hernández, 2010; Pardo, 2012).
Históricamente, la DNB ha sido atribuida principalmente a los agentes infecciosos:
rotavirus bovino tipo A (RVB-A), coronavirus bovino (CVB), virus de la diarrea viral
bovina (VDVB), Salmonella spp., Escherichia coli (K99), Clostridium perfringens tipo
C, Cryptosporidium parvum y otras especies de Coccidia sp. (Cho et al., 2013). La
transmisión de estos agentes ocurre por vía oral-oral en los primeros días de vida
cuando el neonato consume calostro directamente de la madre infectada o permanece
en lugares donde la vaca ha defecado. El principal síntoma de los individuos afectados
es diarrea de consistencia blanda o líquida, en algunos casos es de tipo hemorrágico
(Ganaba et al., 1995; Trotz-Williams et al., 2007; Boileau & Kapil, 2010). En general,
la diarrea ocurre por mala absorción debido al daño completo de la célula epitelial
infectada, a la alteración de los mecanismos de absorción o al aumento de las
secreciones celulares, siendo en este último caso una diarrea por hipersecreción. Otros
121
síntomas clínicos incluyen depresión, debilidad, anorexia y deshidratación que puede
variar entre 8 y 10%, además de alteraciones de los parámetros sanguíneos, como
aumento del volumen del paquete celular y el conteo de leucocitos totales, lo cual
sugiere deshidratación. Además, hay reportes de neutrofilia y leucocitosis en estadios
tempranos de la diarrea (Malik et al., 2013). En 6 a 12 horas se pueden producir
desequilibrios electrolíticos donde predominan la hiperkalemia e hiponatremia,
acidosis metabólica, insuficiencia circulatoria, shock y muerte (Ganaba et al., 1995;
Boileau & Kapil, 2010).
El diagnóstico de los agentes infecciosos se ha realizado a través de diferentes técnicas
de laboratorio como aislamiento viral, microscopía electrónica, ELISA, cultivo de
bacterias, microscopía directa sobre extendidos de materia fecal con tinción para
agentes ácido-alcohol resistentes (Ziehl Neelsen) y técnicas de flotación (Pardo, 2012;
Cho et al., 2013). Otras técnicas diagnósticas basadas en la detección de ácidos
nucleicos como PCR, RT-PCR e inmunofluorescencia han tenido gran acogida, dado
que incrementan la sensibilidad y la rapidez en el diagnóstico (Cho et al., 2013).
El objetivo de este estudio fue caracterizar la enfermedad diarreica neonatal en
términos de agentes infecciosos involucrados, parámetros sanguíneos alterados y
transferencia de inmunidad pasiva; en bovinos de un hato en una zona de alta
producción lechera del departamento de Antioquia (Colombia).
El estudio fue realizado en un hato especializado de producción de leche ubicado en el
municipio de Belmira, en el Norte del departamento de Antioquia (Colombia) en una
zona de vida de Bosque húmedo Montano Bajo (Bh-MB), a una altura de 2550 msnm
y con temperatura promedio de 14°C (Holdridge, 1967). La pastura predominante es
Pennisetum clandestinum.
Los neonatos son separados de las vacas durante el primer día posparto después de
consumir calostro y llevados a terneriles, donde conviven con animales de hasta una
semana de edad; luego, salen a potrero donde son manejados con animales de hasta un
mes de edad. La alimentación consiste en calostro durante los tres primeros días y,
posteriormente, cuatro litros diarios de leche hasta los tres meses de edad.
Un grupo de animales (n = 60) (40 hembras y 20 machos), nacidos en el periodo mayo
a julio de 2013, fueron observados durante su primer mes de vida. Los animales fueron
en un 50% de raza Jersey, 10% Holstein y el restante 40% cruces de las razas Jersey,
Holstein y Pardo Suizo.
En la primera hora posparto se colectó de cada madre una muestra de calostro de 450
ml en promedio para el análisis inmediato de inmunoglobulinas. Entre las primeras 56
horas posteriores al nacimiento (Pardo, 2012), a cada neonato se le extrajo una muestra
de suero sin anticoagulante, que fue congelada (-20ºC) hasta el análisis de la
transferencia pasiva de inmunoglobulinas (TPI).
La definición de caso clínico fue: aquellos terneros con cuadros caracterizados por la
excreción de heces fluidas, frecuentes, abundantes; y con anorexia (Pardo, 2012). Se
midió el tiempo en días desde el nacimiento hasta el inicio de la diarrea. Una vez
detectado el caso y antes del inicio de cualquier tratamiento, se colectaron muestras de
materia fecal directamente del recto, las cuales fueron colocadas en frascos de
coprológico estériles. Todos los animales fueron muestreados de igual forma al mes de
vida para análisis por ELISA. Las muestrasse conservaron en tubos de microcentrífuga
a -20°C, para el análisis. Fueron incluidos aquellos animales que presentaron el cuadro
clínico, hijos de vacas de dos partos o más. Se excluyeron animales que presentaran
cualquier tipo de manifestación clínica de enfermedad diferente a diarrea.
A los animales les fueron tomadas muestras de sangre por punción de la vena yugular
y colocadas en tubos con y sin anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
para las pruebas hematológicas y químicas respectivamente, se remitieron a la Unidad
de Diagnóstico Veterinario de la Universidad de Antioquia para su análisis.
Para el trabajo con los animales se obtuvo aval del Comité de Ética para la
Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia, mediante Acta N° 78
del 09 de agosto de 2012.
Para la aproximación a la concentración de inmunoglobulinas en calostro se empleó un
calostrómetro (Biogenics, Mapleton, EUA). Se colocaron 500 ml de calostro a 20°C en
el recipiente y se siguieron las instrucciones de medición establecidas por el fabricante
y reportadas en la literatura, que indica que los resultados pueden ser registrados en mg
Ig/ml y con valores cualitativos (excelente, aceptable o pobre calidad) (Harp et al.,
1995; Aguirre, 2012).
Para la aproximación a la concentración de inmunoglobulinas séricas se empleó la
prueba de precipitación de sulfito de sodio. Se prepararon tres soluciones de sulfito de
sodio al 14, 16 y 18% en agua destilada. Posteriormente, se colocaron 1,9 ml de cada
solución en tres tubos de ensayo y se adicionó 0,1 ml de suero sanguíneo a cada uno,
mezclando muy bien. La interpretación del nivel de inmunoglobulinas séricas se
realizó de la siguiente manera: precipitación en los tres tubos (adecuado, ≥1500 mg
Ig/dl de suero), en los tubos con 16 y 18% (aceptable, 500-1500 mg Ig/dl de suero),
solo en el tubo 18% o ninguna precipitación (pobre o nula, ≤500 mg Ig/dl de suero)
(Weaver et al., 2000a; García et al., 2006). Se utilizaron sueros de animales recién
nacidos como controles negativos de la prueba, colectados previo al consumo de
calostro, mientras que como controles positivos de la prueba fueron utilizados sueros
de animales sanos de un mes de edad.
Todas las muestras de materia fecal fueron examinadas mediante ELISA, para el
antígeno de cuatro agentes patógenos que han sido reportados como involucrados en la
DNB: RVB-A, CVB, E. coli (K99) y C. parvum; usando un kit comercial (Bio-X
Diagnostics, Jemelle, Bélgica). El procedimiento se realizó siguiendo las instrucciones
del fabricante. La lectura se realizó con el Espectrofotómetro para Microplacas Epoch
(BioTek Instruments, Winooski, EUA). La sensibilidad del test para C. parvum, CVB,
RVB-A y E. coli (K99) es de 100, 93, 97 y 100% respectivamente, la especificidad es
de 88, 96, 100 y 100% en el mismo orden, de acuerdo con el fabricante.
Se analizaron 22 parámetros en el hemograma de las muestras de sangre con
anticoagulante (descritos más adelante) y hallazgos celulares anormales como
siderocitos, macroplaquetas, cuerpos de Howell-Jolly, linfocitos reactivos, entre otros.
El hemograma fue realizado por el método de Impedancia Eléctrica en el equipo
123
Abacus junior VET 5 (Diatron, Budapest, Hungría), adicionalmente se hizo recuento
visual por microscopía óptica a un aumento de 1000X sobre el extendido de sangre
(Olympus, Tokio, Japón). Los valores de creatinina sérica, urea y aspartato
aminotransferasa (AST) fueron medidos por turbidimetría usando el equipo Analyzer
A15 (Biosystems, Barcelona, España).
Se realizaron análisis descriptivos de todas las variables en estudio. Se realizó la
prueba de Shapiro-Wilk para evaluar distribución normal de los datos y de acuerdo a
ello se calcularon medias o medianas, desviaciones estándar e intervalos de confianza
del 95%, para las variables: concentración de inmunoglobulinas en calostro, tiempo al
inicio de la diarrea, recuento de leucocitos, recuento de linfocitos, recuento de células
intermedias, recuento de granulocitos, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos,
basófilos, bandas, recuento de eritrocitos, hemoglobina, hematocrito, volumen
corpuscular media, hemoglobina corpuscular media, concentración de hemoglobina
corpuscular media, amplitud de distribución eritrocitaria, recuento de plaquetas,
plaquetocrito, volumen plaquetario medio, amplitud de distribución plaquetaria,
proteínas plasmáticas, creatinina sérica, nitrógeno ureico en sangre, úrea y aspartato
aminotransferasa. Se establecieron proporciones para las variables: presencia de
macroplaquetas, hipocromía, poiquilositosis, crenocitos, acantocistos, eritroblastos,
policromatofilia, cuerpos de Howell-Jolly, siderocitos, agregados plaquetarios,
linfocitos reactivos, calidad del calostro y la TPI (excelente, aceptable y pobre o nula),
presencia de diarrea, mortalidad, letalidad (cociente entre el número de animales que
murieron a causa de la enfermedad y el número de animales enfermos), presencia de
cada agente infeccioso, coinfección y diferencia entre lecturas. Todos los análisis
fueron realizados en el programa estadístico STATA SE 13.0 (StataCorp, Texas,
EUA).
Al evaluar el calostro de las madres, 57 (95%) tenían calostro de calidad aceptable a
excelente y solo tres (5%) presentaron calostro de mala calidad. La prueba de sulfito
de sodio arrojó que 54 (89,47%) animales presentaron una absorción de
inmunoglobulinas adecuada (concentración aproximada >1500 mg Ig/dl) y solo tres
(5,26%) presentaron absorción pobre o nula (concentración aproximada <500 mg
Ig/dl).
Se encontró que 57 terneros presentaron diarrea, lo que corresponde a una prevalencia
de 94,9%. Todos los casos iniciaron antes de finalizar la segunda semana de vida, el
inicio se dio en promedio a los 7,4 días (IC95% 6,87-8,01). Se registró una mortalidad
de 10 animales (17,58%). En la Tabla 1 se muestran los resultados del diagnóstico de
agentes infecciosos, así como las coinfecciones encontradas. Tres animales (5%) que
no presentaron diarrea, fueron negativos a todos los patógenos.
En los análisis de hematología y química sanguínea de los animales que presentaron
DNB no se encontraron parámetros alterados cuando se compararon con los valores de
referencia del laboratorio. Cuando se compararon con los valores de referencia
utilizados por la Unidad de Diagnóstico. Se encontraron agregación plaquetaria
(5,88%) y linfocitos reactivos (52,94%).
Como se reporta en la literatura, la DNB en este caso es la principal enfermedad que
afecta los terneros durante las primeras semanas de vida. Sin embargo, contrario a
otros estudios donde se reporta que el cuadro clínico inicia entre la segunda y tercera
semana de vida, la diarrea inició desde la primera semana de vida y todos los casos se
presentaron antes de finalizar la segunda semana, con un promedio de inicio de 7,4
días (Trotz-Williams et al., 2008; Baumgartner, 2012).
Según los reportes de la literatura la morbilidad y la mortalidad pueden variar entre
estudios, en este caso la morbilidad del 94,92% se encontró por encima de los valores
más altos reportados con un 80% en otros países y muy por encima de los valores
reportados en estudios realizados en el país donde se reporta como máximo una
morbilidad del 37,5% en Antioquia, un 26,10% y 10,3% en la Sabana de Bogotá
(Escobar & Oliver, 1997; Pardo, 2012). La mortalidad de igual forma es variable y
aunque no es tan alta como lo reportado en otros países donde se habla hasta de un
75% (Von Buenau et al., 2005), sí se encontró con valores más altos comparados con
reportes de mortalidad general en terneros durante los primeros meses de vida con un
máximo de 11,5% en la Sabana de Bogotá (Pardo, 2012). Esto sugiere que las
condiciones de manejo de la granja podrían ser las responsables del incremento de los
casos como se ha reportado en la literatura para otros lugares (Trotz-Williams et al.,
2007; Pardo, 2012).
Por otro lado, la calidad del calostro no sería una de las causas de estas altas
proporciones de morbilidad y mortalidad pues los resultados muestran una adecuada
TPI, acorde con lo reportado por varios autores (Weaver et al, 2000b; Wallace et al.,
2006; Trotz-Williams et al., 2007). En los casos donde la TPI fue pobre, dos de los
terneros murieron. La morbilidad tan alta podría indicar que la diarrea y la respuesta
inmunológica por parte del neonato, dependerían de otros factores como las
particularidades de los agentes etiológicos involucrados.
En un estudio de la Sabana de Bogotá, al realizar el diagnóstico tanto en animales
sanos como enfermos se encontró una proporción de positividad de 38,3%, 19,7%,
7,5% y 0,75% a Cryptosporidium sp., RVB-A, E. coli (K99) y CVB respectivamente,
diagnosticados por la técnica de ELISA (Pardo, 2012). En el presente estudio, de igual
manera el Cryptosporidium parvum fue el agente de mayor importancia seguido por el
RVB. Sin embargo, en este caso no se presentaron animales positivos a E. coli (K99) y
la proporción de positividad a los otros tres agentes fue superior. Esto podría deberse a
que para este trabajo únicamente se diagnosticó una granja, lo que implica una posible
mayor carga de patógenos inherente a las condiciones de manejo, producción y medio
ambiente del hato. Al igual que en el estudio de la Sabana de Bogotá y en otros
reportes de la literatura, la coinfección entre dos o más agentes patógenos es común
encontrarla en el cuadro diarreico, siendo una de las de mayor proporción la
combinación Cryptosporidium parvum y RVB-A (Cho et al., 2013).
El 90% de los animales fueron positivos a Cryptosporidium parvum, el cual se
considera uno de los parásitos más comúnmente hallados en casos de DNB (Cho et al.,
2013; Cho & Yoon, 2014). Sin embargo, no es el calostro el que puede ofrecer alguna
protección (Weaver et al., 2000b; Cho & Yoon, 2014), ya que los animales expuestos
al parásito durante la primera semana de vida desarrollan diarrea y eliminan ooquistes;
como el sistema inmunológico en la mucosa del íleon en neonatos bovinos es
inmaduro e incapaz de responder a la infección, así el calostro contenga una buena
125
concentración de inmunoglobulinas tipo IgG, IgA e IgM y la TPI ocurra
adecuadamente, este parásito es capaz de inducir la diarrea (Wyatt, 2000). Según
Wyatt, la diarrea inducida por Cryptosporidium puede deberse a que la colonización de
las células intestinales ocurre predominantemente por linfocitos T γδ y hay
relativamente pocos linfocitos TCD4+ y CD8+. Adicionalmente, esta población de
linfocitos tiene un fenotipo sIgM+, que inmunológicamente no responde de forma
efectiva contra C. parvum (Wyatt, 2000). Durante la fase aguda de la criptosporidiosis
se da el reclutamiento de los linfocitos CD4+ y CD8+ en la mucosa del íleon y el
cambio de isotipo de las células B para producir IgA, IgG1 e IgG2 se da hacia la
segunda semana de vida, cuando la mucosa ya está infectada. Estas células son
necesarias para poner fin a la infección con eficacia (Wyatt, 2000).
En este estudio la lectura de las pruebas de ELISA se realizó al momento del inicio del
cuadro clínico, reportando una alta proporción de exposición de Cryptosporidium
parvum y RVB-A, que puede sugerir una coinfección, como ha sido reportado en otros
estudios (Pardo, 2012; Cho et al., 2013).
Por el tiempo promedio para el inicio de la diarrea que en este caso fue de 7,4 días, se
podría hipotetizar que el agente causante inicial fue el RVB-A (52%), ya que se ha
reportado como el agente que afecta a los animales principalmente durante la primera
semana de vida, facilitando la colonización de otros agentes patógenos en la segunda y
tercera semana de edad (Bicknell & Noon, 1993; Pardo, 2012; Cho & Yoon, 2014),
tiempo para el cual la presencia de Cryptosporidium parvum en mucho más común
como agente involucrado si se compara con otros periodos (Avendaño et al., 2014).
La infección por Cryptosporidium parvum se debe a factores de riesgo reportados por
Trotz-Williams et al. (2007) y Pardo (2012). En este caso, la infección se podría
asociar con el consumo de calostro directamente desde la ubre la cual se puede
contaminar con materia fecal, además la permanencia del neonato con la madre por
más de una hora después del nacimiento aumenta la posibilidad de infección. En las
observaciones realizadas en este estudio, los neonatos permanecieron con la madre
durante el primer consumo de calostro, esto explicaría la exposición temprana al
parásito y el desarrollo de signos clínicos después de los 6 días siguientes a la
exposición, como lo reporta la literatura (Wyatt et al., 2010).
Los análisis hematológicos presentaron alteraciones en cuanto se presentó una alta
proporción de animales enfermos con linfocitos reactivos, mas no otros parámetros,
contrario a lo que reporta la literatura durante los cuadros de diarrea debido a la
infección y a la deshidratación que ocurre (Baquero-Parrado, 2008; Malik et al., 2013;
Cho & Yoon, 2014). La explicación a esta situación podría estar apoyada en que las
muestras de sangre fueron colectadas al inicio del cuadro clínico, y para ese momento
es posible que las alteraciones en los perfiles hematológicos aún no se hayan
presentado. Según la literatura, cuando se presentan abundantes linfocitos reactivos es
porque el animal está siendo estimulado antigénicamente, son indicadores del inicio de
una infección causada principalmente por virus y parásitos y son característicos en la
respuesta frente a la infección por Cryptosporidium parvum y RVB-A (Harp et al.,
1995).
Conclusiones
Se evidencia la presencia de varios agentes causales de DNB. Ante el desconocimiento
de la situación de la enfermedad en la región, se pone de manifiesto la necesidad de
realizar un estudio epidemiológico amplio que permita comprender la ocurrencia, la
etiología infecciosa y los factores asociados no infecciosos en el altiplano norte.
Agradecimientos
A los recursos del Fondo de Sostenibilidad CODI - U. de A. 2014-1015; a la
administración y empleados de la Finca El Pantano por el apoyo en el trabajo de
campo; y al estudiante de Medicina Veterinaria, Juan Diego Vásquez Serna.
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