em biomphalaria glabrata

CARACTERIZAÇÃO DAS ISOFORMAS DA
ADENOSINA DESAMINASE (ADA) EM
BIOMPHALARIA GLABRATA
Sandra Fernanda L. C. Nunes1; Rafael V. Pereira2; Yacy M. Almeida3; Marcus R. Vale*
* [email protected] Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Rua Cel Nunes de
Melo 1127, CEP 60430-270 – Rodolfo Teófilo - Fortaleza-Ceará
1 - [email protected] 2 - [email protected] 3 – [email protected]
Characterization of adenosine deaminase isoforms in Biomphalaria glabrata
Adenosine (Ad), inhibts the inflammatory process and is controlled by adenosine deaminase (ADA). In
human, ADA is expressed by isoenzymes ADA1 and ADA2. We detected high activity of ADA in
hemolymph of Biomphalaria glabrata (50 times higher than in human serum) and decided to characterize it
also in hepatopancreas. A molecular filtration showed one peak in hemolymph with higher activity for Ad
than for 2’-deoxy-adenosine (dAd) and one peak in hepatopancreas with higher activity for dAd. Both peaks
presented an apparent molecular weight of 120kD. Ion exchange chromatography confirmed one form of
ADA in hemolymph but revealed 3 peaks of activity in hepatopancreas, with higher activity for dAd. These
results indicate the existence of at least 4 isoforms of ADA in B. glabrata with similar molecular weights: one
in hemolymph and three in hepatopancreas. It should be of interest to study ADA in the infection of B.
glabrata by Schistosoma mansoni to find if the enzyme also plays any role in the defense system of that
animal.
Introdução
A adenosina (Ad) é um nucleosídeo
purínico que age como sinal extracelular
mediando uma grande número de respostas via
interação com seus receptores de membrana
(Rodwell, 1998). Sua ação antiinflamatória já
está bem estabelecida. Bloqueia a adesão de
neutrófilos (Cronstein et al, 1986), maturação e
quimiotaxia de monócitos (Fischer et al, 1985),
produção de íons superóxido pelos neutrófilos
(Cronstein et al, 1985), citotoxicidade das células
“killers” e “natural killers” (Grever et al, 1982),
liberação de citocinas (Bouma et al, 1996),
inibição da síntese de LTB4 (Krump et al, 1996)
e a liberação de histamina pelos basófilos
(Marone et al, 1979).
Seus níveis são modulados por
intermédio de enzimas especializadas, dentre as
quais a mais importante é a adenosina
desaminase (ADA),que em humanos é expressa
por 2 isoenzimas: ADA1 e ADA2 (Vander
Wayden & Kelley, 1976).
A
ADA1
(36.000
daltons)
é
amplamente distribuída nos tecidos e desamina
eficientemente a adenosina (Ad) e a 2’deoxiadenosina (dAd), funcionando como agente
modulador dos níveis, intra e extracelulares de
Ad e dAd. A ADA1 está diretamente envolvida
na ativação dos linfócitos T, tendo sido
demonstrada sua associação direta com CD26
(Dong et al, 1996), uma molécula extracelular
acessória para a ação dessas células (peso
molecular
final
do
complexo
ADA/CD26=280.000 daltons).
A ADA2 (peso molecular = 100.000
daltons) é normalmente encontrada no soro e
produzida somente pelo sistema monocítico
macrofágico (Ungerer et al, 1992). É importante
ferramenta para o diagnóstico de doenças
inflamatórias e infecciosas como tuberculose,
febre tifóide, hepatite viral e AIDS (Gakis et al,
1989).
Em Biomphalaria glabrata, principal
hospedeiro intermediário de Schistosoma
mansoni, detectamos em estudos preliminares,
altos níveis de atividade da ADA (Almeida,
1999). Este achado despertou o interesse em
conhecer a implicação dessa enzima no sistema
de defesa do animal.
Experimental
1. Obtenção da hemolinfa e do homogenato de
hepatopâncreas de B. glabrata
Foram utilizados animais com o diâmetro
de concha entre 15 e 18mm. A hemolinfa
coletada (100uL), foi centrifugada a 10.000xg
por 15 minutos a -4ºC e o sobrenadante diluído
50 vezes em tampão fosfato 50mM, pH 6,8.
Após a coleta da hemolinfa, o
hepatopâncreas
foi
isolado,
pesado
e
homogenizado em 10 volumes de tampão fosfato
(50mM, pH 6,8). O homogenato foi centrifugado
a 10.000xg por 20 minutos a 10ºC e o
sobrenadante utilizado para o ensaio da ADA.
2. Ensaio padrão da ADA
O ensaio da enzima é baseado na
quantificação da amônia originada da
desaminação da Ad ou dAd pela enzima (Giusti,
1974) .Os resultados são expressos em umoles de
amônia formada por minuto ou em nmoles de
NH3 / min
3. Filtração Molecular em Sephadex G200
A filtração molecular foi realizada em
coluna de 36 cm x 2,5cm, equilibrada e
inicialmente eluída com tampão fosfato pH 6,8
com fluxo de 0,4 mL por minuto. Frações de
2mL foram coletadas e 100ul de cada fração
utilizada para análise de ADA. A presença de
proteína foi medida em absorbância 280nm.
4. Cromatografia de troca iônica em Deaecelulose
A cromatografia foi realizada em coluna
de 36cm x 2,5cm, equilibrada com tampão
fosfato pH 6,8, inicialmente eluida com o mesmo
tampão e em seguida alteradas as concentrações
de cloreto de sódio (0,1; 0,3; 0,5; 0,8 e 1,0M).
Foram coletadas frações de 4,5mL e destas
foram retirados 100uL para realização do ensaio.
Resultados e Discussão
A atividade da ADA da hemolinfa
(2677 + 47,2 umoles de NH3/min/L - n=12 para
Ad; 1011,75 + 52,27umoles de NH3/ min/ L n=12 para dAd) e do hepatopâncreas (1,478 +
0,12 nmoles de NH3/ mg de prot./min - n=12
para Ad; 2,365 + 0,146 nmoles de NH3/ mg de
prot/ min - n=12 para dAd) de B. glabrata foi
detectada, pela primeira vez, no Laboratório de
Farmacologia Bioquímica e chamou a atenção
por seus altos níveis, se comparados aos da ADA
em soro humano normal (10 a 20 U/L).
A filtração molecular da hemolinfa em
Sephadex G200 revelou um único pico de
atividade usando Ad ou dAd como substrato. As
frações do pico apresentaram atividades em
torno de 35% maiores com Ad do que com a
dAd (Figura 1).
O mesmo perfil foi observado na
filtração molecular do homogenato de
hepatopâncreas, sendo que a atividade da enzima
com dAd foi em torno de 30% maior do que com
a Ad. (Figura 2)
Os altos níveis de atividade da ADA na
hemolinfa de B. glabrata podem indicar a
necessidade do animal manter em seu meio
baixas concentrações de Ad e dAd. Portanto,
pode-se também inferir um papel importante
para esses substratos já que aparentemente seus
níveis são fortemente controlados.
O uso dos dois substratos mostrou
comportamentos diversos da atividade da enzima
da hemolinfa e do hepatopâncreas em coluna de
Sephadex G200, indicando uma possível
existência de pelo menos 2 isoformas com
idênticos pesos moleculares. Uma isoforma que
apresentava maior atividade com Ad (hemolinfa)
e outra com maior atividade com dAd
(hepatopâncreas).
Utilizando-se proteínas de peso
moleculares conhecidos (ADA1, ADA1+CD26 e
hemoglobina humanas), foi possível calcular o
peso molecular da ADA da hemolinfa e
hepatopâncreas. Os picos da ADA de ambos
mostraram um padrão de eluição compatível com
o peso molecular de 120.000 daltons.
Foi
necessário
utilizar
outra
metodologia de separação para confirmar a
hipótese da existência de 2 isoformas: a
cromatografia de troca iônica por Deae-celulose.
A cromatografia de troca iônica da hemolinfa em
Deae-celulose revelou a presença de um único
pico de atividade para ADA usando Ad ou dAd
como substrato. As frações do pico apresentaram
atividades em torno de 2,5 vezes maior com Ad
do que com a dAd. (Figura 3). Já no homogenato
de hepatopâncreas em Deae-celulose, foram
discriminadas pelo menos mais 3 isoformas
diferentes que apresentaram atividade maior para
dAd. (Figura 4).
3
1
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
0
90
80
Frações
Figura 3: Cromatografia de troca iônica da
hemolinfa em DEAE-celulose (As setas indicam
a troca das soluções de NaCl : ( 0,5; 0,8 e 1M,
respectivamente).
Ad
nmoles de NH3/minuto
dAd
Proteínas
1
0.15
0.10
0.05
0
0
25
50
1.0
3
4
0.1
1
0.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0.0
100
Figura 4: Cromatografia de troca iônica do
hepatopâncreas em DEAE-celulose (As setas
indicam a troca das soluções de NaCl : (0,1; 0,3;
0,5; 0,8 e 1M) respectivamente)
Conclusões:
Na hemolinfa de B. glabrata, foi
detectado, com os métodos utilizados, somente
uma isoforma da ADA, com atividade maior
para Ad. No hepatopâncreas existem pelo menos
três isoformas de ADA com atividade maior para
dAd.
0.00
100
75
Proteínas 2
Frações
Absorbância em 280nm
0.20
0.2
5
dAd
0.0
Figura 1: Cromatografia em coluna de Sephadex
G200 em hemolinfa de B.glabrata.
2
Ad
1.5
nmoles de NH3/minuto
4
2
Frações
Figura 2: Cromatografia em Coluna Sephadex
G200 do hepatopâncreas de B. glabrata
Agradecimentos:
FUNCAP
nmoles de NH3/minuto
Referencias Bibliográficas
3
Ad
dAd
0.4
Proteínas
3
0.3
2
1
0
0.2
2
1
0.1
0
10
20
30
40
50
Frações
60
70
0.0
80
Absorbância em 280nm
4
ALMEIDA, S. M. Caracterização da adenosina
desaminase presente na hemolinfa de
Biomphalaria
glabrata
(Say,
1818).
Monografia de Graduação, Universidade
Federal do Ceará, 1999.
BOUMA, M. G.; VAN DEN WILDENBERG; F.
A. J. M.; BUURMAN, W. A. - Adenosine
inhibits cytokine release and expression of
adhesion molecules by activated human
endothelial cells. J. Physiol., 270: C522C529, 1996.
CRONSTEIN, N. B., LEVIN, R. I.,
BELANOFF, J., WEISSMANN, G.;
HIRSCHHORN, R. - Adenosine: an
endogenous inhibitor of neutrophil-
Absorbância em 280nm
nmoles de NH3/ minuto
Ad
dAd
Proteína
Absorbância em 280nm
5
mediated injury to endothelial cells. J.
Clin. Invest., 78: 760-770, 1986.
CRONSTEIN, N. B., ROSENSTEIN, E. D.,
KRAMER,
B.,
WEISSMAN,
G.;
HIRSCHHORN,
R.
Adenosine
physiological modulator of superoxide
anion generation by human neutrophils.
Adenosine acts via an A2 receptor on
human neutrophils. J. Immunol., 135:
1366-1371, 1985.
DONG, R. P., KAMEOKA, J., HEGEN, M.,
TANAKA, T., XU, Y., SCHLOSSMAN, S.
F.;MORIMOTO, C. - Characterization of
adenosine deaminase binding to human
CD26 on T cells and its biologic role in
immune response. J. Immunol., 156:13491355, 1996.
FISCHER, D., VAN DER WEYDEN, M.
SNYDERMAN, R. & KELLEY, W. N. - A
role for adenosine deaminase in human
monocyte maturation. J. Clin. Invest.,
58:399-407, 1976.
GAKIS, C., CALIA, G., NAITANA, A.,
PIRINO, D &SERRU, G. - Serum adenosine
deaminase activity in HIV positive subjectsA hypothesis on the significance of ADA2.
Panminerva Medica, 31:107-113, 1989.
GIUSTI, G. - Adenosine deaminase. in:
Methods of Enzymatic Analysis, New
York, Academic Press, 1974.
GREVER, M. R., SIAW, M. F. E., COLEMAN,
M. S., WHISLER, R. L.; BARCERZAC, S.
P. - Inhibition of K and NK limphocyte
cytotoxicity by an inhibitor of adenosine
deaminase and deoxi-adenosine. J.
Immunol., 129:365-369, 1982.
KRUMP, E., LEMAY, G.; BORGEAT, P. Adenosine A2 receptor-induced inhibition of
leukotriene B4 synthesis in whole blood exvivo. J. Pharmacol., 117:1639-1644, 1996.
MARONE,
G.,
LICHTENSTEIN,
receptor of human
histamine release.
1979.
FINDLEY,
S.
R.;
L. M. - Adenosine
basophils: modulation of
J. Immunol., 123:1473,
RODWELL, V. W. Estrutura, função e
replicação
das
macromoléculas
informacinais. In: MURRAY, R. K.;
GRANNER, D.K.; MAYES, P. A.;
RODWELL, V. W. – Harper: bioquímica.
8a ed. Atheneu, ., São Paulo, 1998.
UNGERER, J. P. J., BURGER, H. M.,
BISSBORT, S. H.; VERMAAK, W. J. Adenosine deaminase isoenzymes in typhoid
fever. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.,
15:510-512, 1996.
VAN DER WEYDEN, M. B.; KELLEY, W. N. Human adenosine deaminase. Distribution
and properties. J. Biol. Chem., 251:54485456, 1976.