For in-vitro diagnostic use Product Code: FK314.1, FK314.2 FS314._

Transcrição

5
CAUTION
All donors of human serum supplied (kits only) have been serum tested and found to be negative for
Hepatitis B surface antigen and antibodies to Hepatitis C virus and Human Immunodeficiency Virus
(HIV 1 & 2). However, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling
and disposal methods should be established as for all potentially infective material and only personnel
adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures.
MOUSE KIDNEY, STOMACH IFA
KIT/SLIDES
For in-vitro diagnostic use
Product Code: FK314.1, FK314.2
FS314._
Product manufactured by:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK
www.bindingsite.co.uk
Telephone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
INTENDED USE
This product is intended for use in the screening and titration of circulating autoantibodies in human
serum as an aid in the diagnosis and treatment of various autoimmune diseases. The four major
autoantibodies detected are antinuclear antibodies (ANA), antimitochondrial antibodies (AMA),
antismooth muscle antibodies (ASMA) and antigastric parietal cell antibodies (AGPCA).
2
SUMMARY AND EXPLANATION
Indirect immunofluorescence is the reference method for screening and titration of circulating
autoantibodies in serum. Animal tissue sections, e.g. from mouse, are generally preferred over other
commonly-used substrates including human tissue sections and cell preparations; this is primarily due
to the lack of interference from HLA and/or other blood group antibodies. Using two different tissues
(kidney and stomach) enables autoantibodies to be more easily identified by comparing the results
obtained with each tissue.
Particular autoantibodies are associated with a number of different diseases. ANA almost always occur
with systemic lupus erythematosus (SLE) but are also commonly found in patients with connective
tissue and rheumatoid diseases. AMA are frequently present in primary biliary cirrhosis but may also
be detected in patients with other liver diseases. ASMA are frequently associated with chronic active
hepatitis and primary biliary cirrhosis, but are also detectable in low concentrations in various other
conditions. AGPCA occur in the serum of most patients with pernicious anaemia. A more detailed
description of which autoantibodies are associated with which disease is given in section 9 (refs 1-8).
3
PRINCIPLE
The kit uses an indirect immunofluorescence technique (ref. 6) where patient samples and appropriate
controls are incubated with the sections. The unreacted antibodies are washed off and then
appropriate fluorescein-labelled conjugates are applied. Unbound conjugate is washed off as before.
Slides are viewed with a fluorescence microscope and positive samples produce apple-green
fluorescence which corresponds to areas of the section where autoantibody has bound.
4
4.1
This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated. Adherence to the
given procedure is recommended.
6
REAGENTS
Mouse kidney, stomach sections on 5- or 10-well slides.
7
ANA homogeneous positive control serum, containing 0.099% sodium azide.
Prediluted, ready for use.
4.3
Mitochondrial positive control serum, containing 0.099% sodium azide. Prediluted,
ready for use.
SPECIMEN COLLECTION
Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated
as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to
assay (ref. 9), or for prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or below. DO NOT freeze and
thaw sera more than once. Avoid using lipaemic, haemolysed or microbially contaminated sera as
decreased titres or unclear staining patterns may occur.
METHODOLOGY
8.1
Materials provided
8.1.1
50T Kit FK314.1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
10 x Mouse, kidney, stomach slides – 5-well
1 x 1mL ANA positive control (prediluted)
1 x 1mL Mitochondrial positive control (prediluted)
1 x 1mL Smooth Muscle positive control (prediluted)
1 x 1mL Negative Control (prediluted)
1 x 6.2mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain
2 x 60mL PBS concentrate (x20)
1 x 3mL Mounting Medium
20 x Blotters
10 x Coverslips (22 x 70mm)
1 x instruction leaflet
8.1.2
250T Kit FK314.2
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
1 x 1mL ANA positive control (prediluted)
1 x 1mL Mitochondrial positive control (prediluted)
1 x 1mL Smooth Muscle positive control (prediluted)
1 x 1mL Negative Control (prediluted)
1 x 15.5mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC
1 x 3mL 1% Evans Blue counterstain
2 x 60mL PBS concentrate (x20)
1 x 10mL Mounting Medium
50 x Blotters
25 x Coverslips (22 x 70mm)
1 x instruction leaflet
8.1.3
FS314.1, FS314.A, FS314.2, FS314.B
1.
2.
10 x 5-well slides, 1 x 5-well slide, 25 x 10-well slides, 1 x 10 well slide respectively.
1 x instruction leaflet.
8.2
Additional materials required
8.2.1
Distilled water to dilute the PBS concentrate.
8.2.2
Container for PBS buffer.
8.2.3
Micropipettes and disposable tips to apply patient samples.
8.2.4
Humid chamber for incubation steps (eg. Magnetic Staining Chamber Code: BD010).
8.2.5
Fluorescence microscope with 495nm exciter filter and 515nm barrier filter.
8.2.6
Plastic squeeze bottle for initial wash in PBS.
8.2.7
If slides only are being used, additional components may be obtained from the Binding
Site: PBS (CON 3.3), negative control (CON 92), ANA homogeneous control (FA105),
mitochondrial positive control (FA128), smooth muscle positive control (FA134), antiHuman IgG (H+L) AFF FITC (FA003), mounting medium (CON 195) and 1% Evans
Blue (CON 93).
Kits only.
4.2
STORAGE AND STABILITY
Unopened kits should be stored at 2-8°C and can be used until the given expiry date. DO NOT
FREEZE. Once slides are removed from a foil bag, they should be used immediately. Diluted PBS
buffer can be stored for up to one month at 2-8°C. All other reagents should be stored at 2-8°C.
8
FDA (USA) Information
Analyte ID codes
AMA: 0439
ANA: 0441
AGPCA: 0442
ASMA: 0451
Complexity Cat: High
1
The Evans Blue and the kit controls contain 0.099% sodium azide as a preservative and must be
handled with caution – do not ingest or allow contact with the skin or mucous membranes. If contact
does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive metal azides may
by formed with the lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of
water to prevent azide build up.
8.3
Test procedure
Quality control
Positive and negative controls should be used every time a batch of samples is tested.
4.4
Smooth muscle positive control serum, containing 0.099% azide. Prediluted, ready for
use.
8.3.1
4.5
Negative control serum, universally negative for all autoantibodies, containing 0.099%
sodium azide. Prediluted, ready for use.
Mounting medium: Remove the mounting medium from the fridge to allow it to reach
room temperature (18-28ºC) before it is needed.
8.3.2
4.6
Affinity purified sheep anti-human IgG (H+L), fluorescein isothiocyanate, containing
0.099% sodium azide. Prediluted, ready for use.
Dilute PBS concentrate. Dilute PBS concentrate with distilled water (1 part PBS
concentrate + 19 parts distilled water) and mix. The PBS is used for diluting patient
samples and as a wash buffer.
4.7
1% Evans Blue, as an optional counterstain.
8.3.3
Dilute patient samples
Screening: Dilute patient samples 1/20 by adding 50µL of serum to 950µL of PBS
buffer.
Titration: Make serial dilutions of positive screened samples with PBS buffer (eg. 1/20,
1/40, 1/80, 1/160 and 1/320, etc.).
For example: Take 100µL of the 1/20 dilution, mix with 100µL PBS to give a 1/40
dilution (repeat for further dilutions).
8.3.4
Substrate slides. Allow substrate slide(s) to reach room temperature (18°C-28°C) prior
to removal from pouch(es). Label slides appropriately, place in the humid chamber and
add one drop of each positive and negative control to appropriate wells. Add 50µL of
diluted patient samples to the remaining wells.
4.8
Phosphate buffered saline (PBS), provided as a 20-fold concentrate in liquid form.
4.9
Blotters, to blot the slides after washing.
4.10
Mounting medium, containing an anti-fading agent (DABCO 1, 4, diazabicyclo [2.2.2]
octane).
4.11
Coverslips.
Insert Code: CIN286, Version: 17th September 2007, Page 1 of 12
8.3.5
Slide incubation. Incubate slides for 20 minutes in a humid chamber at room
temperature (18-28°C).
8.3.6
PBS wash. Remove slides from humid chamber and rinse briefly with PBS squeeze
bottle. Do not squirt directly on to the wells. Place slides in a rack and immerse in PBS
and agitate or stir for 5-10 minutes.
8.3.7
Addition of fluorescent conjugate. Shake off excess PBS and blot around wells using
blotters provided. Return slides to humid chamber and immediately cover each well with
a drop of fluorescent conjugate. DO NOT LEAVE WELLS UNCOVERED FOR LONGER
THAN 15 SECONDS. Drying out of the substrate seriously affects the results.
8.3.8
This test alone should not be considered diagnostic. All other factors including the
clinical history of the patients and other serological or biopsy results must also be taken
into account.
10.6
Suitability for use with other manufacturers' IFA reagents has not been assessed but
use with such reagents should not necessarily be excluded.
FDA information – see front page.
Slides sold separately are classified as Analyte Specific Reagents. Except as a component of the kit,
analytical and performance characteristics are not established.
Slide incubation. Incubate slides for 20 minutes in humid chamber at room temperature
(18-28°C), in the dark.
8.3.9
PBS wash. Wash again as described in step 8.3.6. OPTIONAL COUNTERSTAIN. Add
2-3 drops of 1% Evans Blue per 100mL of PBS prior to slide immersion.
8.3.10
Mounting with coverslip. Remove one slide at a time from PBS wash. Quickly dry
around the wells and add a drop of mounting medium to each well. Carefully lower the
slide onto the coverslip, avoiding air bubbles, but if present do not attempt to remove.
Wipe excess medium from around edge of coverslip.
8.3.11
View slides under fluorescence microscope. Slides may be stored for up to 3 days at
2-8°C, in the dark, without significant loss of fluorescence.
9
10.5
11
11.1
Patient group
Normal donors
Chronic active
Hepatitis
Primary biliary
cirrhosis
SLE
Rheumatoid
arthritis
RESULTS
9.1
The ANA positive control should give a bright apple-green homogeneous pattern in cell nuclei. The
mitochondrial positive control should give bright apple-green staining of renal tubules and gastric
parietal cells. The smooth muscle positive control should give bright apple-green staining of the
muscularis layer of the stomach.
The negative control should show dull green staining in all tissues, with no discernible fluorescence.
If the controls do not appear as described, the test is invalid and should be repeated.
9.2
Interpretation of results
9.2.1
Negative results
11.2
Antinuclear Antibodies (ANA)
1.
Additional information can be obtained by interpreting the ANA nuclear patterns obtained (see below).
It is recommended that all positive ANA samples are titred to endpoint to ensure that possible mixed
reactions are detected that may otherwise have been missed. Further analysis of such samples for
autoantibodies to double stranded DNA and extractable nuclear antigens (ENA) is also advised.
Common antigens involved
ds DNA, histones
Native/ds DNA
Extractable nuclear antigens
Ribonucleoprotein,
Scl-70,
SSB
4-6S RNA
110
10
86
3
0
8
16
4
100
100
0
0
0
0
0
0
*
*
Disease association
SLE
Rheumatoid arthritis (RA)
Mixed connective tissue disease
Drug induced lupus
SLE
Scleroderma
Sjögren’s syndrome
Mixed connective tissue disease
SLE
Scleroderma
Sjögren’s syndrome
SLE, RA and progressive systemic
sclerosis
Tissue associated
REFERENCES
3.
4.
6.
7.
8.
9.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
SUMMARY OF PROCEDURE
Equilibrate mounting medium to room temperature.
Dilute PBS with distilled water.
Dilute patient sera 1/20 with PBS.
Equilbrate substrate slides to room temperature (18-28°C).
Apply 50µL positive and negative controls and diluted patient sera to appropriate wells.
Incubate in a humid chamber for 20 minutes.
Wash for 5-10 minutes in PBS.
Blot around each well and immediately cover each well with a drop of conjugate.
Incubate as in step 13.6.
Wash as in step 13.7.
Mount.
View slide under fluorescence microscope.
Main disease association
Antimitochondrial
Antibodies (AMA)
Kidney distal tubule cytoplasm
and the proximal tubules (to a
lesser extent).
Primary biliary cirrhosis
& other liver disease
Antiismooth muscle
Antibodies (ASMA)
Muscularis layers (stomach)
Arteriole muscle layers (other
tissues)
Parietal cells (stomach)
Chronic active hepatitis
Antigastric parietal cell
Antibodies (AGPCA)
Antireticulin antibodies
(ARA)
Peritubular fibres & Bowman’s
capsules (kidney)
Pernicious anaemia
Crohn’s disease
Coeliac disease
Dermatitis hepetiformis
NB: Each laboratory should establish at which point a positive result is considered clinically significant.
10
8
8
Comparison study
Tissue Specific autoantibody staining patterns include:
Antibody
AGPCA
0
0
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases
and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical
implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed.
Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases,
Immunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis
herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Weller, T.H; Coons, A.H: Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and
Herpes Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
R.M. Bernstein et al. Diversity of autoantibodies in Primary biliary cirrhosis and Chronic
active hepatitis. Clin. Exp. Imm. 55: 553-560, 1984.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward,
GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
2.
5.
ANA stain the nuclei of the following: distal and proximal kidney tubules, gastric parietal and chief cells.
Almost all SLE patients have ANA in the serum, but ANA can also be found in various connective
tissue diseases including rheumatoid arthritis. ANA can also occur with chronic active hepatitis and
primary biliary cirrhosis and in response to certain drug treatments.
Nucleolar
Reference
AMA
0
2
A comparison study was performed on 90 clinical samples using this kit and a commercially available
reference method. 87 out of the 90 samples tested gave identical results by the two methods. For the
patterns described in section 9.2, the relative sensitivity ranged from 86-100%, the relative specificity
was 100% in every case and the relative agreement ranged from 98-100%. For the samples that
differed, weak ANA or SMA positive staining was obtained by the reference method only, suggesting
that these samples were borderline for the particuar patterns, and/or there are slight differences in
sensitivity between the two methods.
Positive results
These are seen as significant fluorescence in specific tissue areas giving one or more of the following
patterns:
Peripheral
(Rim)
Speckled
% Positive
ASMA
0
58
ANA
0
66
N.B. It is possible for a sample to test positive for more than one pattern.
12
These are seen as dull green staining in all sections, with no discernible fluorescence. Suspected weak
reactions should be repeated but at a higher dilution (eg. 1/40). If the repeated result appears the same
as the original, the test is regarded as negative.
Pattern
Homogeneous
No.
60
50
* = Data obtained from in-house studies at The Binding Site Ltd.
Quality control
9.2.2
EXPECTED RESULTS
Expected results
LIMITATIONS OF PROCEDURE
10.1
The light source, filters and optics of different makes of fluorescence microscopes will
influence the sensitivity of the assay. The performance of the microscope is significantly
influenced by correct maintenance especially centring of the mercury vapour lamp and
changing of the lamp after the recommended period of time.
10.2
Staining patterns often change as a sample is titred out to end point. This is usually due
to the presence of more than one autoantibody, especially for ANAs.
10.3
Autoantibodies can be activated or induced by a wide range of drugs including oral
contraceptives and antibiotics.
10.4
Due to the short distance between wells on the 10-well slides it is possible for cross
contamination of samples and controls to occur. Care must be taken, especially at the
washing stages, to ensure that this does not happen.
befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von HIV,
Hepatitis B-Virus oder anderen Infektionsträgern.
Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und
Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen.
MAUS-NIERE, MAGEN-KITS/
OBJEKTTRÄGER FÜR DIE IFT
Das Evans Blue und die Kitkontrollen enthalten 0,099% Natriumazid als Konservierungsmittel. Deshalb
sollten die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Verschlucken sowie Kontakt mit
Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen
Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der
Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.
Dieses Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal für den angegebenen
Verwendungszweck verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen.
Zur in vitro Diagnostik
6
Bestell-Nr.: FK314.1, FK314.2
FS314._
7
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
8
Gelieferte Materialien
8.1.1
50 Test-Kit FK314.1
1.
(10 x 5 Auftragsstellen Maus-Nieren-Magen-Objektträger)
1 x 1mL ANA positive control
(vorverdünnte ANA-Positiv-Kontrolleserum)
1 x 1mL Mitochondrial positive control
(vorverdünnte Mitochondrial-Positiv-Kontrolleserum)
1 x 1mL Negative Control (vorverdünnte Negativ-Kontrollserum)
1 x 1mL Smooth Muscle positive control
(vorverdünnte Glatte-Muskulatur-Positiv-Kontrollserum)
1 x 6,2mL Anti human IgG (H&L) AFF FITC
(anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung)
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS-Konzentrat (20fach))
1 x 3mL Mounting Medium (Eindeckmedium)
20 x Blotters (Blotter)
10 x Coverslips (Deckgläschen) (22 x 70mm)
1 x Arbeitsanleitung
3.
VERWENDUNGSZWECK
Diese Kits/Objektträger dienen zum Nachweis und zur Titration von zirkulierenden Autoantikörpern im
Humanserum, zur Unterstützung der Diagnose und Therapie von verschiedenen AutoimmunErkrankungen. Die vier häufigsten Autoantikörper sind: antinukleäre Antikörper (ANA), antimitochondriale Antikörper (AMA), Antikörper gegen die glatte Muskulatur (ASMA /GMA) und Antikörper
gegen Magenparietalzellen (AGPCA).
EINFÜHRUNG
Die indirekte Immunfluoreszenz ist die Referenzmethode für den Nachweis und die Titration von
zirkulierenden Autoantikörpern im Humanserum. Tierische Gewebeschnitte, wie z. B. von der Maus,
werden allgemein gegenüber anderen Gewebeschnitten einschließlich menschlichem Gewebe oder
Zellkulturen bevorzugt, da bei ihnen keine Störungen durch HLA und/oder anderen Blutgruppen-Antikörpern auftreten. Die gleichzeitige Verwendung von zwei unterschiedlichen Geweben (Leber und
Magen) erleichtert die Interpretation, durch den Vergleich der Ergebnisse auf den verschiedenen
Geweben.
Einzelne Autoantikörper sind mit einer Anzahl von verschiedenen Erkrankungen assoziiert. ANAs
werden in der Regel bei systemischem Lupus erythematodes (SLE), aber auch bei Patienten mit
Bindegewebs- und rheumatischen Erkrankungen gefunden. AMAs werden häufig bei Patienten mit
primärer biliärer Zirrhose gefunden, sie können aber auch bei anderen Lebererkrankungen auftreten.
ASMA sind mit der chronischen aktiven Hepatitis und der primären biliären Zirrhose assoziiert, sind
aber auch in niedrigen Konzentrationen bei anderen Erkrankungen nachweisbar. AGPCA werden bei
Patienten mit perniziöser Anämie gefunden. Eine detaillierte Auflistung, welche Autoantikörper mit
welcher Krankheit assoziiert werden, wird in Abschnitt 9 gegeben (Ref. 1-8).
3
TESTPRINZIP
Der Test beruht auf der indirekten Immunfluoreszenz-Technik (IFT) (Ref. 6). Die Patientenseren und
entsprechenden Kontrollen werden auf den Gefrierschnitten inkubiert. In einem Waschschritt werden
die nicht reagierenden Antikörper entfernt und dann das Fluoreszein-Konjugat zugegeben.
Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Die Untersuchung der Objektträger erfolgt
unter dem Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen in den Bereichen der Gefrierschnitte, in
denen die Autoantikörper an entsprechende Strukturen gebunden haben, eine apfelgrüne Fluoreszenz.
4
4.1
REAGENZIEN
Objektträger mit Maus-Niere-Magen-Gefrierschnitten mit je 5- oder 10 Auftragsstellen.
Nur Kits:
TESTDURCHFÜHRUNG
8.1
2.
2
PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum so
schnell wie möglich vom Gerinnsel abtrennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei
2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden (Ref. 9). Für eine längere Lagerung die Seren
aliquotieren und bei mindestens -20°C einfrieren. Serum nur einmal einfrieren und auftauen. Keine
stark lipämische, hämolytische oder mikrobiell verunreinigte Seren verwenden, da dadurch erniedrigte
Titer oder unklare Muster auftreten können.
In England hergestellt von:
The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
1
LAGERUNG UND STABILITÄT
Ungeöffnete Kits bei 2-8°C lagern, sie sind so bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar.
NICHT EINFRIEREN! Ist der Folienbeutel eines Objektträgers einmal geöffnet, muss er sofort
verwendet werden. Der verdünnte PBS-Puffer ist bis zu einem Monat bei 2-8°C haltbar. Alle anderen
Reagenzien nach Anbruch bei 2-8°C aufbewahren.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.2
250 Test-Kit FK314.2
1.
25 x Mouse kidney, stomach slides – 10-well
(25 x 10 Auftragsstellen Maus-Nieren-Magen-Objektträger)
1 x 1mL ANA positive control
(vorverdünnte ANA-Positiv-Kontrolleserum)
1 x 1mL Mitochondrial positive control
(vorverdünnte Negativ-Kontrollserum)
1 x 1mL Smooth Muscle positive control
(vorverdünnte Glatte-Muskulatur-Positiv-Kontrollserum)
1 x 1mL Negative Control (vorverdünnte Negativ-Kontrollserum)
1 x 15,5mL Anti human IgG (H&L) AFF FITC
(anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung)
2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS-Konzentrat (20fach))
1 x 10mL Mounting Medium (Eindeckmedium)
50 x Blotters (Blotter)
25 x Coverslips (Deckgläschen) (22 x 70mm)
1 x Arbeitsanleitung
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.3
Objektträger:
FS314.1 (10 x 5 Auftragsstellen), FS314.A (1 x 5), FS314.2 (25 x 10), FS314.B (1 x 10)
8.2
Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien
8.2.1
Destilliertes Wsser zum Verdünnen des PBS-Pufferkonzentrats.
8.2.2
Gefäß für PBS-Puffer.
8.2.3
Mikropipetten und Einmal-Spitzen zum Pipettieren der Patientenseren.
Feuchte Kammer für die Inkubationen (z.B. Magnetische Färbekammer, Bestell-Nr.:
BD010).
4.2
ANA-Homogen-Positiv-Kontrollserum. Enthaltene
Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
Konservierungsmittel:
0,099%
8.2.4
4.3
Mitochondriale Positiv-Kontrollserum. Enthaltene
Konservierungsmittel:
0,099%
8.2.5
Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter.
8.2.6
Spritzflasche für 1. Waschschritt.
8.2.7
Bei Verwendung von Einzelobjektträgern können die zusätzlich benötigten
Komponenten bei The Binding Site bestellt werden: PBS-Puffer (Bestell-Nr.: CON3.3),
Negativ-Kontrollserum (Bestell-Nr.: CON92), ANA-homogen Positiv-Kontrollserum
(Bestell-Nr.: FA105), Mitochondriales Positiv-Kontrollserum (Bestell-Nr.: FA128), Glatte
Muskulatur Positiv-Kontrollserum (Bestell-Nr.: FA134), anti-Hu-IgG-(H+L)-FITCKonjugat (Bestell-Nr.: FA003), Eindeckmedium (Bestell-Nr.: CON 195) und 1%ige
Evans-Blue-Lösung (Bestell-Nr.: CON93).
4.4
Positiv-Kontrollserum für glatte Muskulatur. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099%
4.5
Das Negativ-Kontrollserum ist für alle Autoantikörper negativ. Enthaltene
Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.6
Das Anti-human-IgG-(H+L)FITC-Konjugat ist affinitätsgereinigt und optimal mit
hochaktivem Fluorescein-Isothiocyanat markiert. Enthaltene Konservierungsmittel:
0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.7
Evans Blue: zur optionalen Gegenfärbung.
4.8
Der PBS-Puffer liegt als 20-fach Konzentrat vor und muss vor Gebrauch entsprechend
verdünnt werden.
8.3.1
4.9
Blot-Papier: Saugfähige Papierblotter um nach den Waschschritten die Objektträger
optimal zu trocknen.
Eindeckmedium: Das Eindeckmedium aus dem Kühlschrank nehmen und vor Gebrauch
auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
8.3.2
4.10
Das Eindeckmedium ist speziell für die Immunfluoreszenz und enthält DABCO (1,4
diazobicyclo [2.2.2] Octan) als Ausbleich-Schutzfaktor.
PBS-Konzentrat verdünnen. PBS-Konzentrat mit destilliertem Wasser 1/20 (1 Teil PBSKonzentrat + 19 Teile destilliertes Wasser) verdünnen und mischen. Der PBS-Puffer in
Arbeitskonzentration wird zum verdünnen der Patientenseren und als Waschpuffer
verwendet.
4.11
Deckgläschen (22 x 70mm) zum Abdecken der Objektträger.
8.3.3
Patientenseren verdünnen
Screening: Patientenseren im Verhältnis 1/20 verdünnen (z.B. 50µL Serum + 950µL
PBS-Puffer).
Titration: Von im Screening positiven Proben eine serielle Verdünnungsreihe erstellen
(z.B. 1/20, 1/40; 1/80; 1/160; 1/320; 1/640 usw.) z.B. 100µL eines 1/20 verdünnten
Patientenserums mit 100µL PBS-Puffer versetzen - ergibt eine 1:40 Verdünnung.
5
WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kontrollen stammt aus menschlichem Blut. Jede Einzelspende wurde bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV) 1 und 2, Antikörpern
gegen Hepatitis C Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ
8.3
Testdurchführung
Qualitätskontrolle
Die Negativ- und Positivkontrollen sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden.
8.3.4
Objektträger vorbereiten. Die Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen
lassen. Folienbeutel erst direkt vor dem Gebrauch öffnen! Die Objekträger aus dem
Folienbeutel nehmen, entsprechend beschriften und in eine feuchte Kammer geben. Je
1 Tropfen der Kontrollen und 50µL der verdünnten Patientenseren auf die jeweiligen
Auftragsstellen auftragen.
8.3.5
Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20min. bei Raumtemperatur (18-28°C) in
der feuchten Kammer inkubieren.
8.3.6
Waschen mit PBS-Puffer. Die Objektträger aus der feuchten Kammer nehmen und
rasch mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen, dabei nicht direkt in die Auftragsfelder
spritzen. Die Objektträger in eine Halterung geben und in ein PBS-Pufferbad
eintauchen. Die Objektträger 5-10 min im PBS-Puffer belassen, dabei rühren oder leicht
schütteln.
8.3.7
Zugabe von Fluoreszenz-Konjugat. Überschüssigen PBS-Puffer abschütteln und die
Objektträger mit dem mitgelieferten Blotpapier (nur Kits!) oder Filterpapier abtrocknen.
Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und sofort, d. h. innerhalb von
15 sec, auf jede Auftragsstelle einen Tropfen Fluoreszenz-Konjugat geben. Das
Austrocknen des Substrats kann das Ergebnis beträchtlich beeinrächtigen.
8.3.8
Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20 min. bei Raumtemperatur (18-28°C) in
der feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren.
8.3.9
Waschen mit PBS-Puffer. Erneut waschen wie unter Punkt 8.3.6 beschrieben. Wenn
eine Gegenfärbung gewünscht wird, können bei diesem Waschschritt bis zu 2-3 Tropfen
der 1 %igen Evans-Blue-Lösung pro 100mL PBS-Puffer zugegeben werden.
8.3.10
Deckgläschen aufsetzen. Jeweils nur einen Objektträger aus dem PBS-Pufferbad
nehmen. Um die Auftragsstellen herum rasch abtrocknen und jeweils 1 Tropfen
Eindeckmedium auf die Auftragsstelle geben. Das Deckgläschen sorgfältig auf den
Objektträger legen, wobei Luftbläschen zu vemeiden sind. Eventuell vorhandene
Luftblasen nicht versuchen zu entfernen. Überschüssiges Eindeckmedium mit
Filterpapier entfernen.
Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Sie können im Dunkeln bei
2-8°C bis zu drei Tage ohne signifikaten Fluoreszenzverlust aufbewahrt werden.
8.3.11
9
ERGEBNISSE
9.1
Qualitätskontrolle
10
GRENZEN DES TESTS
10.1
Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die
Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte
Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach
der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst.
10.2
Bei der Titration einer Probe bis zum Endpunkt kann sich das Fluoreszenzmuster
ändern. Diese Änderung wird durch das Vorkommen von mehreren Autoantikörpern
(speziell bei ANAs) verursacht.
10.3
Es ist zu beachten, dass Autoantikörper durch verschiedene Medikamente,
einschließlich Antibiotika und Orale Kontrazeptiva, aktiviert oder induziert werden
können.
10.4
Aufgrund der nur kleinen Abstände zwischen den Auftragsstellen bei den Objektträgern
mit 10 Auftragsstellen besteht eine gewisse Verschleppungsgefahr. Deshalb muss
besonders sorgfältig gearbeitet werden, speziell beim Waschen, um eine
Verschleppung zu vermeiden.
10.5
Der Test allein ist nicht als diagnostischer Beweis ausreichend. Alle Ergebnisse sollten
immer nur im Zusammenhang mit anderen Laborbefunden (Serologie, Biopsie) und
dem klinischen Bild des Patienten betrachtet werden.
10.6
Die Verwendung dieser Produkte mit IFT-Reagenzien anderer Hersteller wurde nicht
überprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen.
FDA (USA) Informationen: siehe englische Packungsbeilage.
11
ERWARTETE ERGEBNISSE UND LEISTUNGSDATEN
11.1 Erwartete Ergebnisse
Patientengruppe
Normale Bluspender
Chronisch-aktive
Hepatitis
Primäre biliäre
Zirrhose
SLE
Rheumatische Arthritis
Anzahl n
60
50
ANA
0
66
AMA
0
2
ASMA
0
58
(AG)PCA
0
0
Ref.
8
8
110
10
16
4
100
100
86
3
0
8
0
0
0
0
0
0
*
*
Die ANA-Positivkontrolle sollte eine kräftige, apfelgrüne, homogene Fluoreszenzfärbung in den
Zellkernen erzeugen. Die Mitochondrial-Positivkontrolle sollte eine kräftige, apfelgrüne Fluoreszenfärbung in den Nieren-Tubuli und den Magen-Parietalzellen erzeugen. Die ASMA-Positivkontrolle
sollte eine kräftige, apfelgrüne Fluoreszenzfärbung in der Magen-Muskelschicht erzeugen.
*Daten stammen aus einer bei The Binding Site Ltd. durchgeführten, internen Studie.
Die Negativkontrolle zeigt eine matt-grüne Anfärbung des Gewebes ohne erkennbare Fluoreszenz.
11.2 Vergleichsstudie
Erscheint eine der Kontrollen nicht wie beschrieben, sollte der Testansatz verworfen und ein neuer
Ansatz gemacht werden.
In einer Vergleichsstudie wurde dieser Kit mit einer kommerziell erhältlichen Referenzmethode
verglichen. Es wurden 90 Patientenseren getestet und folgende Ergebnisse erhalten:
87 der 90 getesteten Proben ergaben mit beiden Methoden ein identisches Ergebnis. Es wurde für die
in Abschnitt 9.2 beschriebenen Muster eine relative Sensitivität von 86-100%, und eine relative
Spezifität von 100 % gefunden. Die relative Übereinstimmung liegt zwischen 98-100%. Die Proben mit
abweichendem Ergebnis wurden nur mit der Referenzmethode als schwach ANA- oder ASMA-positiv
befunden. Dies bedeutet, dass die Proben grenzwertig sind und/oder die zwei Methoden geringfügige
Unterschiede in der Sensitivität aufweisen.
9.2
Interpretation der Ergebnisse
9.2.1
Negativ
Bei einem negativen Ergebnis zeigen alle Teile des Gewebes eine matt-grüne Färbung ohne
erkennbare Fluoreszenz.Seren, die lediglich eine sehr schwache Fluoreszenz zeigen, sollten erneut
mit einer Verdünnung von 1: 40 getestet werden. Ist das Ergebnis wie zuvor, so wird die Probe als
negativ angesehen.
9.2.2
Hinweis: Es ist möglich, dass eine Probe mehrere verschiedene Fluoreszenzmuster aufweisen kann.
12
1.
Positiv
Bei einer positiven Probe wird eine signifikante Fluoreszenz in spezifischen Gewebe-Strukturen
gefunden. Folgende Fluoreszenz-Muster können auftreten:
2.
Antinukleäre Antikörper (ANA)
3.
Durch ANA’s werden folgende Zellkerne angefärbt: distale und proximale Nieren-Tubuli, MagenParietal- und Hauptzellen. Bei fast allen SLE-Patienten werden ANA’s im Serum gefunden, aber sie
können ebenfalls bei verschiedenen Erkrankungen des Bindegewebes, inkl. Rheumatischer Arthritis
auftreten. ANA‘s können auch bei der chronischen aktiven Hepatitis und primären biliären Zirrhosen
und als Folge von verschiedenen Medikamenten auftreten.
4.
Zusätzliche Informationen können durch die Interpretation des ANA-Musters gewonnen werden (siehe
Tabelle unten). Es wird empfohlen, dass alle ANA- positiven Seren bis zum Endpunkt austitriert
werden, um sicherzustellen, dass keine gemischten Muster übersehen werden. Weiterhin sollten diese
Proben auch auf Autoantikörper gegen Doppelstrang-DNA (dsDNA) und extrahierbare nukleäre
Antigene (ENA) untersucht werden.
7.
Muster
Homogen
Peripher
(Rim)
Gesprenkelt
Nukleolär
Beteiligte Antigene
dsDNA, Histone
Native / dsDNA
Extrahierbare, nukleoläre Antigene
Ribonukleoproteine
Scl-70
SSB
4-6S RNA
Assoziierte Erkrankungen
SLE
Rheumatische Arthritis (RA)
Mischkollagenosen
Medikamenten-induzierter Lupus
SLE
Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
Mischkollagenosen
SLE
Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
SLE, RA und progressive systemische
Sklerodermie
REFERENZEN
Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and
probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H
C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Weller, T.H; Coons, A.H: Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes
Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis.
J. Clin. Path. 19, 527-538.
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD
Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
5.
6.
8.
9.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
KURZARBEITSANLEITUNG
Eindeckmedium auf Raumtemperatur erwärmen lassen.
PBS-Pufferkonzentrat 1:20 mit destilliertem Wasser verdünnen.
Patientenseren 1:20 mit PBS-Puffer verdünnen.
Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
Je 50 µl Kontrollen und verdünnte Patientenseren auftragen.
20 Minuten bei Raumtemperatur (18-28°C) in einer feuchten Kammer inkubieren.
Objektträger 5-10 min. mit PBS-Puffer waschen.
Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum gut abtrocknen,
wieder in die feuchte Kammer legen und sofort 1 Tropfen FITC-Konjugat auftragen.
20 Minuten bei Raumtemperatur (abdunkeln) inkubieren.
Wie unter Punkt 13.7 beschrieben waschen.
Objektträger Eindecken und Deckgläschen aufsetzen.
Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten.
Fluoreszenzmuster von gewebespezifischen Autoantikörpern:
Muster
Antimitochondriale
Antikörper (AMA)
Antikörper
gegen
Muskulatur (ASMA)
glatte
Antikörper
gegen
Magenparietalzellen (PCA)
Anti-Retikulin
Antikörper
(ARA)
Gewebe
Niere: distales, tubuläres Zytoplasma und proximale Tubuli
(seltener)
Magen: Zytoplasma der
Parietalzellen
Magen: Muskelschicht
Andere Gewebe: arterielle
Muskelschicht
Magen: Parietalzellen
Niere: Peritubuläre Fibern und
Bowman’sche Kapsel
Assoziierte Erkrankungen
Primäre biliäre Zirrhose
andere Lebererkrankungen
Chronisch aktive Hepatitis
Perniziöse Anämie
Morbus Crohn
Zöliakie
Dermatitis hepetiformis
Hinweis: Jedes Labor sollte eigene Richtlinien erstellen und festlegen wann ein positives Ergebnis
klinisch relevant ist.
6
LAMES/KITS D’IMMUNO-FLUORESCENCE
REIN/ESTOMAC DE SOURIS
Pour usage diagnostic in vitro
Code Produit : FK314.1, FK314.2
FS314._
7
Distribués en France par la société :
The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex.
Téléphone : 04.38.02.19.19
Fax : 04.38.02.19.20
e-mail : [email protected]
1
ECHANTILLONS
Prélever de façon stérile et par ponction veineuse et laisser le sang coaguler à température ambiante,
puis séparer le sérum du caillot dès que possible pour éviter l’hémolyse. Les sérums peuvent être
conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests (réf. 9) ou aliquotés et congelés à -20°C minimum
pour une conservation plus longue. Ne pas congéler et décongeler les sérums plus d’une fois. Il est
recommandé d’utiliser des sérums non lipidiques, non hémolysés et non contaminés par des bactéries
qui pourraient donner des titres faibles ou des marquages flous.
8
8.1
Produits fabriqués en Angleterre par la société :
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.
STOCKAGE ET STABILITE
Les coffrets non ouverts doivent être stockés à 2-8°C et peuvent être utilisés jusqu’à la date de
péremption. Ne pas congeler. Lorsque les lames sont sorties de leur étui, les utiliser immédiatement.
Le tampon PBS dilué peut être stocké un mois à 2-8°C. Tous les autres réactifs doivent être stockés à
2-8°C.
METHODOLOGIE
Matériel fourni
8.1.1
Coffret FK314.1 50 tests
1.
10 x Mouse kidney, stomach slides – 5-well
(10 lames de 5 puits de rein, estomac de souris)
1 x 1mL ANA positive control (contrôle positif ANA prédilué)
1 x 1mL
2.
3.
INDICATIONS
Ces coffrets sont destinés au dépistage et au titrage des autoanticorps circulants dans le sérum
humain. Ils apportent une aide au diagnostic et au traitement de plusieurs maladies autoimmunes. Les
quatre principaux autoanticorps détectés sont les anti-nucléaires (ANA), les anti-mitochondries (AMA),
les anti-muscle lisse (ASMA) et les anti-cellules pariétales gastriques (AGPCA).
2
RESUME ET EXPLICATION
L’immunofluorescence indirecte est la méthode de choix pour le dépistage et la tritration des
autoanticorps circulants dans le sérum. Les coupes de tissus d’animaux, par exemple de souris, sont
généralement préférées à des coupes de tissus humains ou des cellules. Ceci est lié à l’abscence
d’interférences du système HLA ou d’autres anticorps liés aux groupes sanguins. En utilisant deux
types de tissus (rein et estomac), il est plus facile d’identifier les autoanticorps en comparant les
résultats obtenus sur chacun des tissus.
Les anticorps antinucléaires (ANA) correspondent à une variété d’anticorps contre les constituants du
noyau de la cellule comprenant l’ADN, l’ARN, et les différentes protéines nucléaires (réf. 1). Ces ANA
sont rencontrés fréquemment chez des patients atteints le lupus érythémateux disséminé (LED) mais
aussi de connectivites ou de pathologies rhumatoïdes. Les AMA sont fréquemment présents dans les
cirrhoses biliaires primitives, mais peuvent être également rencontrés dans d’autres pathologies du
foie. Les ASMA sont trouvés chez des patients atteints d’hépatite chronique active ou de cirrhoses
biliaires primitives, mais aussi en faible concentration dans d’autres maladies. Les AGPCA sont
présents chez la plupart des patients atteints d’anémie pernicieuse. Une description plus précise des
ces anticorps est donnée au pargraphe 9 (réf. 1-8).
3
PRINCIPE
Ce coffret fait appel à une technique d’immunofluorescence indirecte (réf. 6). Les sérums de patients
et les contrôles appropriés sont incubés sur les coupes de tissus. Les anticorps non spécifiques sont
éliminés par lavage. Un conjugué approprié marqué à la fluorescéine est appliqué. Le conjugué non lié
est éliminé par lavage et la lecture des lames s’effectue à l’aide d’un microscope à fluorescence. La
positivité des échantillons se traduit par un marquage fluorescent de certaines régions de la coupe de
tissus sur lesquelles sont accrochés les autoanticorps.
4
4.1
REACTIFS
Lames de rein, estomac de souris en 5 ou 10 puits.
Coffrets seulement
4.2
Sérum de contrôle positif ANA homogène, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et
prêt à l’emploi.
4.3
Sérum de contrôle positif anti-mitochondrie, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et
4.4
Sérum de contrôle positif anti-muscle lisse, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et
4.5
Sérum de contrôle négatif, universellement négatif pour tous les autoanticorps, contenant
0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi.
4.6
Antisérum de mouton anti-IgG(H+L) humaines, purifié par affinité et couplé à l’isothiocyanate
de fluorescéine, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi.
4.7
Bleu d’Evans à 1%, comme contre-colorant optionnel.
4.8
Tampon PBS, fourni sous forme liquide concentré 20 fois.
4.9
Buvards pour sécher le pourtour des puits après lavage.
4.10
Milieu de montage contenant un agent anti-fading (DABCO 1, 4, diazabicyclo [2.2.2] octane).
4.11
Lamelles.
5
PRECAUTIONS
Tous les sérums des donneurs humains ont été soumis aux tests des hépatites B et C, de l’HIV1 et
HIV2 et se sont avérés négatifs. Toutefois ces tests ne peuvent garantir l’absence totale d’agents
infectieux. Tous les échantillons doivent donc être considérés comme potentiellement infectieux. Seul
un personnel formé peut utiliser ce matériel.
Le bleu d’Evans et les contrôles du coffret contiennent 0,099% d’azide de sodium, il est recommandé
de les manipuler avec précaution – Ne pas ingérer ni mettre en contact avec la peau ou les
muqueuses. En cas de contact, rincer à grande eau et consulter un médecin. L’azide peut réagir avec
du plomb ou du cuivre pour former de l’azide de métal très explosif. Dans ce cas, laver à grande eau
pour empêcher la formation des azides de métaux.
Ce réactif doit être utilisé par du personnel formé. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le
protocole.
Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre humide à
température ambiante (18-28°C). Recouvrir la chambre humide de papier pour éviter
l’exposition à la lumière.
8.3.8
8.3.9
Lavage. Procéder comme à la section 8.3.6. Il est possible de faire une contre
coloration en ajoutant 2 à 3 gouttes de bleu d’Evans à 1% à 100mL de PBS avant
d’immerger les lames.
8.3.10
Montage des lames. Sortir les lames une à une du PBS. Sécher rapidement le pourtour
des puits puis déposer une goutte de milieu de montage dans chaque puits. Déposer la
lamelle en évitant la formation de bulles d’air. Ne pas essayer d’éliminer les bulles d’air
éventuellement apparues. Essuyer l’excès de milieu de montage.
8.3.11
Lecture des lames. La lecture se fait à l’aide d’un microscope fluorescent. Les lames
peuvent être stockées 3 jours à 2-8°C sans diminution de l’intensité de fluorescence.
9
RESULTATS
9.1
Le contrôle positif ANA doit donner une fluorescence verte homogène du noyau. Le contrôle positif
anti-mitochondrie doit donner une fluorescence verte des tubulles rénaux et des cellules pariétales
gastriques. Le contrôle positif anti-muscle lisse doit donner une fluorescence verte de la couche
musculaire de l’estomac.
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissu,
mais en aucun cas une fluorescence franche.
Si les puits de contrôle ne correspondent pas à la description ci-dessus, le test doit être considéré
comme invalide et il est conseillé de le répéter.
9.2
Interprétation des résultats
9.2.1
Négatif
Résultats attendus
Patient
Donneurs
normaux
Hépative
chronique
active
Cirrhose biliaire
primitive
LED
Arthrite
rhumatoïde
11.2
ANA
0
2.
3.
5.
Anticorps anti-nucléaires (ANA)
6.
Marquage spécifique des noyaux des tubules distaux et proximaux du rein, les cellules principales et
pariétales gastriques. La plupart des patients atteints de LED ont des ANA dans leur sérum, mais les
ANA peuvent aussi être retrouvés dans des connectivites et notamment dans l’arthrite rhumatoïde. Les
ANA sont également présents lors d’hépatites chroniques actives et de cirrhoses biliaires primitives ou
en réponse à certains medicaments.
7.
Des informations complémentaires peuvent être obtenues en interprétant le type de marquage observé
(voir ci-dessous) Il est recommandé que tous les sérums positifs pour les ANA soient titrés jusqu’au
point final afin de s’assurer que l’on ne rate pas une combinaison d’anticorps. Il est recommandé de
procéder à des analyses complémentaires pour les anti-ADN db et les antigènes nucléaires solubles
(ENA).
Aspect
Homogéne
Antigène impliqué
ADN double brin, histones
Périphérique
(Rim)
Moucheté
ADN double brin, natif
50
66
2
58
0
8
110
10
86
3
0
8
16
4
100
10
0
0
0
0
0
0
*
*
Autoanticorps
anticellules
gastriques
pariétales (AGPCA)
Autoanticorps antiréticuline
(ARA)
Extractable nuclear antigens
Ribonucléoproteine,
Scl-70,
SSB,
RNA 4-6S
Maladie associée
LED
L’arthrite rhumatoïde (RA)
Connectivites mixtes
Lupus médicalement induit
LED
Sclerodermie
Syndrome de Sjögren
Connectivites mixtes
LED
Sclerodermie
Syndrome de Sjögren
LED, AR et
Sclérose systémique progressive
REFERENCES
8.
9.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
RESUME DE LA PROCEDURE
Placer le milieu de montage à température ambiante.
Diluer le PBS dans de l’eau distillée.
Diluer les sérums au 1/20 dans du PBS.
Ramener les lames à température ambiante (18-28°C).
Déposer 50µL de contrôles positifs et négatifs et les sérums de patients dilués dans les
puits.
Incuber 20 minutes en chambre humide.
Laver 5 à 10 minutes en tampon PBS.
Sécher autour des puits et couvrer immédiatement chaque puits avec une goutte de
conjugué.
Incuber come à l’étape 13.6.
Laver comme à l’étape 13.7.
Monter les lames.
Visualiser sous un microscope à fluorescence.
Tissus associés
Tubules distaux des reins et
tubules proximaux (moins)
Cytoplasme
Couche musculaire (estomac)
Couche musculaire des
artérioles (autres tissus)
Cellules pariétales (estomac)
Fibres péritubulaires
Capsules de Bowman (rein)
Principales maladies
associées
Cirrhose biliaire primitives
et autres pathologies du foie
Hépatites chroniques actives
Anémie pernicieuse
Maladie de Crohn
Maladie coeliaque
Dermatoses herpétiques
Note : Chaque laboratoire doit déterminer le seuil à partir duquel il y aura signification clinique.
10
8
Etude de comparaison
Aspect du marquage pour les autoanticorps spécifiques des tissus :
Autoanticorps antimuscle lisse (ASMA)
Réf
Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954
J. Clin. Path. 19, 527-538.
4.
Un échantillon est considéré positif lorsqu’une fluorescence significative apparaît dans les organelles
des tissus spécifiques donnant un des aspects suivants :
Autoanticorps
AGPCA
0
Une étude de comparaison a été réalisée sur 90 échantillons cliniques en utilisant ce coffret et un autre
coffret commercial de référence. 87 des 90 échantillons testés ont donné des résultats identiques avec
les 2 coffrets. Pour les aspects décrits dans le paragraphe 9.2, la sensibilité relative atteint 86 à 100%,
la spécificité relative était de 100% dans tous les cas et la corrélation relative allait de 98 à 100%. Pour
les échantillons qui différaient, le marquage positif ANA faible ou SMA a été obtenu dans chaque cas
avec la méthode de référence seulement, suggérant que ces échantillons étaient douteux pour l’aspect
en question et/ou qu’il existe une légère différence de sensibilité entre les 2 méthodes.
12
Positif
Autoanticorps antimitochondries (AMA)
AMA
0
% Positif
ASMA
0
No.
60
NB : Il est possible qu’un échantillon soit positif pour plusieurs aspects.
1.
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissus,
mais en aucun cas une fluorescence franche. Les réactions faibles doivent être répétées mais à une
concentration plus élevée (ex: 1/40). Si le nouveau test paraît identique au précédent, il est considéré
comme négatif.
Nucléolaire
VALEURS ATTENDUES ET PERFORMANCES SPECIFIQUES
* Résultats obtenus au cours d’études internes dans les laboratoires The Binding Site.
Contrôle qualité
9.2.2
11
11.1
LIMITES DE LA PROCEDURE
10.1
La qualité des filtres, des optiques et de la source lumineuse peut influencer la
sensibilité du test. La performance du microscope est liée à la maintenance et plus
particulièrement sur le centrage et le changement de la lampe.
10.2
Les aspects de marquage changent souvent lorsqu’ un échantillon est titré jusqu’à son
point final. Ceci est dû à la présence de plusieurs autoanticorps, spécialement pour les
ANA.
10.3
Les autoanticorps peuvent être activés ou induits par divers médicaments tels que les
contraceptifs oraux ou les anticorps.
10.4
Compte tenu du faible espacement entre les puits sur les lames de 10 puits, il est
possible qu’il y ait des contaminations. La plus grande attention est recommandée lors
des étapes de lavage.
10.5
Ce test seul ne doit pas être utilisé pour donner un diagnostic. D’autres résultats doivent
être pris en compte tels que les signes cliniques, les biopsies ou les tests sérologiques.
10.6
Aucun test n’a été fait avec les réactifs provenant d’autres fournisseurs, mais leur
utilisation n’est pas exclue.
Information FDA (USA) – cf 1ere page
adecuados para todos los materiales potencialmente infecciosos y los procedimientos deben
permitirse sólo a personal experto y autorizado.
KIT/PORTAOBJETOS PARA
INMUNOFLUORESCENCIA - SECCIONES
DE RIÑÓN, ESTÓMAGO DE RATÓN
Spanish
Para uso diagnóstico in vitro
Código Producto: FK314.1, FK314.2
FS314._
El Azul de Evans y los controles del kit contienen el 0,099% de azida sódica como conservante y
deben manipularse con precaución – no trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas. En
caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden
formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los
recipientes para evitar la acumulación de azida.
El presente producto debe ser utilizado por personal especializado. Se recomienda observar
estrictamente el procedimiento indicado.
6
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Los kits o los portaobjetos no abiertos deben conservarse a 2-8°C y se pueden usar hasta la fecha de
Producido por:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB,
U.K.www.bindingsite.co.uk
The Binding Site sucursal en España,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
web: www.bindingsite.es
1
PROPÓSITO
Este producto se utiliza para el screening y la titulación de los autoanticuerpos circulantes en el suero
humano como auxiliar en el diagnóstico y en el tratamiento de varias enfermedades autoinmunes. Los
cuatros principales autoanticuerpos determinados son los antinucleares (ANA), los antimitocondriales
(AMA), los antimúsculo liso (ASMA) y los anticélulas parietales gástricas (AGPCA).
2
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para el screening y la titulación de los
autoanticuerpos circulantes en el suero. En general se prefieren las secciones de tejido animal, por
ejemplo de ratón, a otros substratos utilizados habitualmente, tal como los preparados de células y las
secciones de tejido humano; esto se debe principalmente a la ausencia de interferencias con los
anticuerpos ante HLA y/o con otros anticuerpos dirigidos contra los grupos sanguíneos. El uso de dos
diferentes tejidos (riñón y estómago) permite determinar más facilmente los autoanticuerops
comparando los resultados obtenidos con cada tejido.
Determinados autoanticuerpos se asocian a varias patologías distintas. Los ANA casi siempre están
presentes en el lupus eritematoso sistémico (LES), pero también se observan habitualmente en
pacientes con enfermedades reumatoides y del tejido conectivo. Los AMA se observan con frecuencia
en la cirrosis biliar primitiva, pero también pueden detectarse en pacientes con otras enfermedades
hepáticas. Los ASMA se asocian con frecuencia a la hepatitis crónica activa y la cirrosis biliar
primitiva, pero se determinan también a concentraciones bajas en muchas otras condiciones. Los
AGPCA están presentes en el suero de la mayoría de los pacientes con anemia perniciosa. En la
sección 9, se proporciona una descripción más detallada sobre las enfermedades a las que se asocian
los autoanticuerpos (ref. 1-8).
3
PRINCIPIO
Se utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta (ref. 6), en la que las muestras de los
pacientes y los controles adecuados se incuban con las secciones. Los anticuerpos no específicos se
eliminan mediante lavado y, a continuación, se aplica un conjugado adecuado marcado con
fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediante lavado, tal como se ha hecho anteriormente.
Los portaobjetos se examinan en un microscopio de fluorescencia. Las muestras positivas producen
una fluorescencia de color verde brillante que corresponde a las áreas de la sección en las que se ha
unido el autoanticuerpo.
4
REACTIVOS
4.1
Secciones di riñón, estómago de ratón en portaobjetos de 5 o 10 pocillos.
4.2
Suero de control positivo ANA homogéneo con el 0,099% de azida sódica. Prediluido,
listo para usar.
4.3
Suero de control positivo mitocondrial, con el 0,099% de azida sódica. Prediluido, listo
para usar.
4.4
Suero de control positivo al músculo liso, con el 0,099% de azida sódica. Prediluido,
listo para usar.
4.5
Suero de control negativo universalmente negativo para todos los autoanticuerpos, con
el 0,099% de azida sódica. Prediluido, listo para usar.
4.6
Antisuero de oveja anti-IgG humanas purificado por afinidad (H+L) conjugado con FITC
(isotiocianato de fluoresceína) con el 0,099% de azida sódica. Prediluido, listo para
usar.
Los kits contienen:
4.7
Azul de Evans al 1% (coloración de contraste opcional).
4.8
Tampón PBS, solución líquida concentrada (x20).
4.9
Papeles absorbentes, para secar los portaobjetos tras el lavado.
4.10
Solución de montaje, contenente un agente anti-decoloración (DABCO, 1, 4 diazabiciclo
[2.2.2] octano).
4.11
5
Cubreobjetos (22 x 70mm).
PRECAUCIONES
Todos los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes,
resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los
anticuerpos ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la
ausencia de agentes infecciosos. Deben establecerse métodos de manipulación y eliminación
Por ejemplo: tome 100µL de la dilución 1/20 y diluya con 100µL de PBS para obtener
una dilución 1/40. Repita el procedimiento para otras diluciones.
10
8.3.4
Portaobjetos con substrato. Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura
ambiente (18-28°C) antes de sacarlos del envase. Etiquete los portaobjetos
correctamente, colóqueles en la cámara húmeda y añada el control positivo y negativo
en los respectivos pocillos. Añada 50µL de las muestras diluidas en los pocillos
restantes.
10.1
8.3.5
Incubación de portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 20 minutos en una cámara
húmeda a temperatura ambiente (18-28°C).
8.3.6
Lavado con PBS. Saque los portaobjetos de la cámara húmeda y aclárelos brevemente
con el PBS en una botella de plástico a presión. No rociar directamente en los pocillos.
Coloque los portaobjetos en un rack y sumérjalos en el PBS, luego agite durante 5-10
minutos.
8.3.7
Adición de conjugado fluorescente. Elimine el exceso de PBS y seque el contorno de
los pocillos con papeles absorbentes suministrados. Vuelva a colocar los portaobjetos
en la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado
fluorescente. NO DEJAR LOS POCILLOS DESCUBIERTOS DURANTE MÁS DE 15
SEGUNDOS. El secado del substrato afecta negativamente los resultados.
8.3.8
Incubación de portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 20 minutos en una cámara
húmeda a temperatura ambiente (18-28°C) a oscuras.
8.3.9
Lavado con PBS. Vuelva a lavar y secar, tal como se describe en el paso 8.3.6.
COLORACIÓN DE CONTRASTE OPCIONAL. Añada 2-3 gotas de Azul de Evans al 1%
por cada 100mL de PBS antes de proceder a la inmersión de los portaobjetos.
8.3.10
Montaje con cubreobjetos. Quite uno a uno los portaobjetos de la solución de lavado
PBS. Seque rápidamente el contorno de los pocillos y añada una gota de solución de
montaje en cada pocillo. Coloque con cuidado el portaobjeto en el cubreobjeto,
evitando que se formen burbujas de aire, pero sin intentar eliminar las que se hayan
formado. Elimine el exceso de solución de montaje del contorno del cubreobjeto.
8.3.11
Examen de portaobjetos con el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos pueden
conservarse a 2-8°C a oscuras durante un máximo de 3 días, sin una pérdida
significativa de fluorescencia.
9
10.3
10.4
10.5
10.6
Control de calidad
El control positivo ANA homogéneo debe mostrar una fluorescencia color verde brillante en los
núcleos de las células. El control positivo mitocondrial debe mostrar una fluorescencia verde brillante
de los túbulos renales y de las células parietales gástricas. El control positivo al músculo liso debe
mostrar una fluorescencia verde brillante en la capa muscular del estómago.
El control negativo debe mostrar una coloración verde oscura en todos los tejidos, sin fluorescencia
visible.
FDA (USA) Advertencia: ver la primera página de la metódica en inglés.
11
11.1
9.2
Interpretación de los resultados
9.2.1
11.2
Estudio comparativo
Se llevó a cabo un estudio comparativo en 90 muestras clínicas con el uso de este kit y un método de
referencia comercialmente disponible. 87 de las 90 muestras analizadas obtuvieron resultados
idénticos con los dos métodos. Para los patrones descritos en la sección 9.2, la sensibilidad relativa
osciló entre el 86 y el 100%, y la especificidad relativa era del 100% en cada caso y la concordancia
relativa osciló entre el 98 y el 100%. Para las muestras discordantes, se obtuvo una coloración
positiva débil ANA o SMA sólo con el método de referencia, lo que sugiere que estas muestras
estuvieron en el límite en el patrón específico y/o que existen ligeras diferencias de sensibilidad entre
los dos métodos.
Resultado negativo
12
1.
2.
Se observa una coloración verde oscura en todas las secciones, sin fluorescencia visible. Reacciones
débiles sospechas deben repetirse pero aumentando el factor de dilución (por ejemplo 1/40). Si, tras la
repetición del ensayo, el resultado es igual al inicial, el ensayo se considera negativo.
3.
4.
Resultado positivo
Se observa una fluorescencia significativa en las áreas tisutales específicas que presentan uno o más
de los siguientes patrones:
Anticuerpos Antinucleares (ANA)
Pueden obtenerse informaciones adicionales mediante la interpretación de los patrones nucleares de
los ANA observados en los ensayos (véase a continuación). Se recomienda titular todas las muestras
ANA positivas hasta el punto final para garantizar la detección de eventuales reacciones mixtas que, si
no, podrían no relevarse. También se recomienda efectuar otro análisis de dichas muestras para
determinar los autoanticuerpos ante el DNA bicatenario y los antígenos nucleares extraíbles (ENA).
PATRÓN
Periférico
(Borde)
Granular
Nucleolar
5.
6.
7.
Los ANA coloran los núcleos de las siguientes células: células hepáticas, células de los túbulos
renales distales y proximales, células principales y parietales gástricas. Casi todos los pacientes con
LES presentan ANA en el suero, pero los ANA pueden también estar presentes en varias patologías
del tejido conectivo incluida la artritis reumatoide. Además los ANA se pueden observar en la hepatitis
crónica activa, cirrosis biliar primitiva, así como en respuesta a determinados tratamientos
farmacológicos.
Homogéneo
VALORES PREVISTOS
Resultados previstos
% Positivos
Referencia
Tipología
Núm.
ANA
AMA
ASMA
AGPCA
Donantes sanos
60
0
0
0
0
8
Hepatitis crónica
50
66
2
58
0
8
activa
Cirrosis biliar
110
10
86
3
0
8
primitiva
LES
16
100
0
0
0
*
Artritis reumatoide
4
100
0
0
0
*
* = Datos obtenidos de estudios llevados a cabo en los laboratorios “The Binding Site Ltd.”
Si los controles no resultan tal como se describe arriba, el ensayo debe considerarse no válido y debe
repetirse.
9.2.2
La fuente luminosa, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia de diferentes
marcas influirán en la sensibilidad del kit. Las prestaciones del microscopio dependen
considerablemente de un mantenimiento correcto y, en particular, del centrado y de la
sustitución de la lámpara de vapores de mercurio tras el periodo de tiempo aconsejado.
A menudo, los patrones de coloración cambian cuando la muestra se titula hasta el punto
final. Esto normalmente se debe a la presencia de más de un autoanticuerpo, sobre todo
en el caso de los ANA.
Los autoanticuerpos pueden ser activados o inducidos por un gran número de fármacos,
incluidos los anticonceptivos y antibióticos orales.
Debido a la distancia reducida entre pocillos de los portaobjetos de 10 pocillos, puede que
se produzca contaminación cruzada de muestras y controles. Deben tomarse
precauciones especiales, sobre todo en las fases de lavado, para evitar que esto ocurra.
Este ensayo por sí solo no es válido para el diagnóstico. También deben tenerse en
cuenta los demás factores, incluidos la historia clínica de los pacientes y otros resultados
serológicos o biópsicos.
La idoneidad para el uso del kit con reactivos IFA de otros fabricantes no se ha evaluado,
pero el uso con estos reactivos no debe excluirse necesariamente.
N.B.: Una muestra puede resultar positiva en más de un patrón.
RESULTADOS
9.1
10.2
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
ANTÍGENOS COMUNES
IMPLICADOS
dsDNA, histonas
dsDNA/Nativo
Antígenos nucleares
extraíbles
Ribonucleoproteína,
Scl-70,
SSB
4-6S RNA
PATOLOGÍAS ASOCIADAS
LES
Artritis reumatoide (AR)
Enfermedad mixta del tejido
conectivo
Lupus inducido por fármacos
LES
Esclerodermia
Síndrome de Sjögren
Enfermedad mixta del tejido
conectivo
LES
Esclerodermia
Síndrome de Sjögren
LES, AR y esclerosis sistémica
progresiva
8.
9.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
BIBLIOGRAFÍA
Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 - 794, 1954.
J. Clin. Path. 19, 527-538.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
Deje que la solución de montaje alcance la temperatura ambiente.
Diluya el PBS con agua destilada.
Diluya los sueros de los pacientes 1/20 con PBS.
Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente (18-28°C).
Dispense 50µL de los controles positivos y negativos y sueros de pacientes diluidos en los
respectivos pocillos.
Incube en una cámara húmeda durante 20 minutos.
Lave durante 5-10 minutos en PBS.
Seque el contorno de cada pocillo y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de
conjugado.
Incube como en la fase 13.6 en lugar oscuro.
Lave como en la fase 13.7.
Monte.
Examine el portaobjetos con el microscopio de fluorescencia.
Los patrones de coloración de los autoanticuerpos específicos de los tejidos incluyen:
ANTICUERPO
Anticuerpos
antimitocondriales
(AMA)
Anticuerpos
antimúsculo liso
(ASMA)
Anticuerpos
anticélulas parietales
gástricas (AGPCA)
Anticuerpos
antirreticulina (ARA)
TEJIDO ASOCIADO
Citoplasma de los túbulos
renales distales y túbulos
proximales (en medida
menor)
Capas musculares
(estómago)
Capas musculares arteriolas
(otros tejidos)
Células parietales (estómago)
Fibras peritubulares y
cápsulas de Bowman (riñón)
PRINCIPALES PATOLOGÍAS
ASOCIADAS
Cirrosis biliar primitiva y otras
patologías hepáticas
Hepatitis crónica activa
Anemia perniciosa
Enfermedad de Crohn
Enfermedad celíaca
Dermatitis herpetiforme
N.B.: Cada laboratorio debe establecer cuándo un resultado positivo se considera clínicamente
significativo.
Este produto deve ser utilizado por pessoal treinado e deve ser utilizado apenas para os fins a que se
propõe. Recomenda-se que seja seguido o procedimento descrito.
KIT/LÂMINAS PARA IFA COM RIM E
ESTÔMAGO DE RATO
Portuguese
6
Para diagnóstico in-vitro
Código do Produto: FK314.1, FK314.2
FS314._
7
Telefone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
Material fornecido
8.1.1
50T Kit FK314.1
1.
10 x Mouse, kidney, stomach slides – 5-well (Lâminas com rim e estômago de rato, 5
poços)
1 x 1mL ANA postive control (Controlo positivo de ANA)
1 x 1mL Negative Control (Controlo negativo)
1 x 1mL Mitochondrial postive control (Controlo positivo mitocondrial, pré diluído)
1 x 1mL Smooth Muscle postive control (Controlo positivo para músculo liso, pré
diluído)
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC (IgG (H+L) anti-humana de afinidade
purificada conjugada com FITC)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Contrastante Evans Blue)
1 x 60mL PBS concentrate (x20) (Tampão PBS, x20 conc.)
1 x 3mL Mounting Medium (Meio de montagem)
20 x Blotters (Discos absorventes)
10 x Coverslips (Lamelas, 22 x 70mm)
1 x folheto de instruções
2.
3.
4.
5.
UTILIZAÇÃO
Este produto destina-se à pesquisa e quantificação de autoanticorpos circulantes existentes no soro
humano, como complemento ao diagnóstico e tratamento de várias doenças autoimunes. Os quatro
principais grupos de autoanticorpos detectados são: anticorpos anti nucleares (ANA), anticorpos
antimitocondriais (AMA), anticorpos anti-músculo liso (ASMA) e anticorpos anti-células gástricas
parietais (AGPCA).
2
RESUMO E EXPLICAÇÃO
A imunofluorescência indirecta é o método de referência para o despiste e quantificação de
autoanticorpos no soro. As secções de tecido animal, e.g. de ratazana, são geralmente preferidos em
relação aos substratos usuais incluindo secções de tecido humano e preparações celulares devido à
falta de interferência entre HLA e/ou outros anticorpos do sangue. A utilização de dois tecidos
diferentes (fígado e estômago) torna mais fácil a identificação dos autoanticorpos comparando os
resultados obtidos em cada tecido.
Os autoanticorpos estão associados a um grande número de doenças. Os ANA encontram-se
presentes no soro de doentes com Lúpus eritematoso sistémico (SLE) mas são também comuns nos
casos de doenças reumatóide e do tecido conjuntivo. Os AMA estão frequentemente relacionados a
casos de cirroses biliares primárias e outras doenças hepáticas. Os ASMA estão associados a
hepatites crónicas e cirroses biliares primárias, no entanto encontramo-los em baixas concentrações
noutras situações. Os AGPCA aparecem maioritariamente em doentes com anemia perniciosa. Na
secção 9 será dada uma descrição mais detalhada de quais os autoanticorpos associados a cada
doença (ref. 1-8).
3
PRINCIPIO
A imunofluorescência indirecta (ref. 6) é utilizada quando as amostras dos doentes e os controlos
apropriados são incubados com o substrato das lâminas. Os anticorpos que não reagem são
eliminados por lavagem e é aplicado um conjugado marcado com fluoresceina. O conjugado que não
se liga ao substrato é também eliminado por lavagem, e procede-se à visualização da lâmina num
microscópio de fluorescência. As amostras positivas apresentarão uma fluorescência “verde-maçã”
que corresponde a áreas da secção onde o anticorpo se ligou.
4
4.1
REAGENTES
Secções de rim e estômago de rato em lâminas de 5 ou 10.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.2
250T Kit FK314.2
1.
25 x Mouse, kidney, stomach slides – 10-well (Lâminas com rim e estômago de rato, 10
poços)
1 x 1mL ANA postive control (Controlo positivo de ANA)
1 x 1mL Negative Control (Controlo negativo)
1 x 1mL Mitochondrial postive control (Controlo positivo mitocondrial, pré diluído)
1 x 1mL Smooth Muscle postive control (Controlo positivo para músculo liso, pré diluído)
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC (IgG (H+L) anti-humana de afinidade
purificada conjugada com FITC)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Contrastante Evans Blue
1 x 60mL PBS concentrate (x20) (Tampão PBS, x20 conc.)
1 x 10mL Mounting Medium (Meio de montagem)
50 x Blotters (Discos absorventes)
25 x Coverslips (Lamelas, 22 x 70mm)
1 x folheto de instruções
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.3
FS314.1, FS314.A, FS314.2, FS314.B
3.
10 x lâminas com 5 poços, 1 x lâminas com 5 poços, 25 x lâminas com 10 poços, 1 x
lâminas com 10 poços respectivamente.
1 x folheto de instruções.
4.
8.2
Material adicional necessário
8.2.1
Água destilada para diluir o PBS concentrado.
8.2.2
Recipiente para o tampão PBS.
8.2.3
Micropipetas e pontas descartáveis para aplicar as amostras dos doentes.
8.2.4
Câmara húmida para os passos de incubação (ex. Câmara de Coloração Magnética,
BD010).
8.2.5
Microscópio de fluorescência com filtro excitador de 495nm e filtro barreira de 515nm.
Só em kits.
4.2
Soro controlo positivo homogéneo para ANA, contendo 0,099% de azida de sódio. Pré
diluído, pronto a usar.
4.3
Soro controlo positivo mitocondrial, contendo 0,099% de azida de sódio. Pré diluído,
pronto a usar.
4.4
Soro controlo positivo músculo liso, contendo 0,099% de azida de sódio. Pré diluído,
pronto a usar.
4.5
Soro controlo negativo, universal a todos os anticorpos, contendo 0,099% de azida de
sódio. Pré diluído, pronto a usar.
4.6
1% de Evans Blue (contrastante opcional).
4.8
Tampão fosfato (PBS), concentrado 20x na forma líquida.
4.9
Papel absorvente, para absorver o excesso da lâmina após a lavagem.
4.10
Meio de montagem, com agente que evita a perda de fluorescência (DABCO) 1,4
octanato dazabiciclo [2.2.2].
4.11
Lamelas.
5
8.2.6
Esguicho de plástico para as lavagens iniciais com o PBS.
8.2.7
Se estão a utilizar apenas as lâminas pode obter os componentes adicionais à The
Binding Site: PBS (CON 3.3), controlo negativo (CON 92), controlo homogéneo de ANA
(FA105), controlo positivo mitocondrial (FA128), controlo positivo músculo liso (FA134),
IgG (H+L) anti-humana conjugada com FITC (FA003), meio de montagem (CON 195),
1% Evans Blue (CON 93).
8.3
8.3.1
Meio de montagem. Retirar o meio de montagem do frigorífico para que este fique à
temperatura ambiente (18-28ºC) antes de ser utilizado.
8.3.2
Diluir o PBS concentrado. Diluir o PBS concentrado com água destilada (1 parte de
PBS concentrado + 19 partes de água destilada) e misturar bem. O PBS irá servir para
diluir as amostras dos pacientes e como tampão de lavagem.
8.3.3
Diluir as amostras do paciente.
Despiste: Diluir as amostras do paciente 1/20 adicionando 50µL do soro a 950µL de
PBS.
Quantificação: Efectuar diluições sucessivas das amostras positivas com tampão PBS
(ex. 1/20 1/40, 1/80, 1/160 e 1/320 etc.). Por exemplo: Retirar 100µL da diluição 1/20,
misturar com 100µL de PBS para dar uma diluição de 1/40. Repetir para outras
diluições.
8.3.4
Lâminas substrato. Deixar as lâminas atingirem a temperatura ambiente (18-28ºC)
antes de retirá-las dos invólucros. Rotular as lâminas adequadamente, colocá-las na
câmara húmida e adicionar uma gota de cada um dos controlos positivo e negativo nos
poços adequados. Adicionar 50µL das amostras diluídas nos restantes poços.
8.3.5
Incubação das lâminas. Incubar as lâminas durante 20 minutos na câmara húmida à
temperatura ambiente (18-28ºC) e no escuro.
PRECAUÇÕES
Todos os dadores de soro fornecido nos kits foram analisados e considerados negativos para o
antigénio da Hepatite B, anticorpos contra o vírus da Hepatite C e para o Vírus de Imunodeficiência
Humano (HIV 1 & 2). No entanto estes testes não garantem a ausência de agentes infecciosos.
Deverão ser tomadas medidas adequadas quando se procede ao manuseamento e eliminação de
todo o material potencialmente infectado; os métodos deverão ser executados por pessoal
especializado e treinado.
O Evans Blue e os controlos contêm 0,099% de azida de sódio como conservante e devem ser
manuseados com cuidado – não ingerir nem permitir o contacto com a pele ou membranas mucosas.
No caso de contacto lavar abundantemente com água e procurar um médico. Podem formar-se azidas
metálicas explosivas nas canalizações de cobre e alumínio, quando eliminar o reagente lavar
abundantemente com água de modo a impedir a formação das azidas.
Execução do teste
Controlo de qualidade
Os controlos positivos e negativos deverão ser utilizados sempre que é testado um lote
de amostras.
IgG (H+L) de ovelha anti-humana, purificada e conjugada com isocianato de
fluoresceína (FITC) contendo 0,099% de azida de sódio. Pré diluído, pronto a usar.
4.7
METODOLOGIA
8.1
6.
1
COLHEITA DAS AMOSTRAS
As amostras de sangue devem ser colhidas por venepunctura, deixar coagular naturalmente e separar
o soro o mais rapidamente possível para evitar a hemólise. O soro pode ser conservado de 2-8°C até
7 dias antes do teste, ou em aliquotas a -20°C ou menos, para períodos mais prolongados (ref. 9).
NÃO congelar e descongelar o soro mais do que uma vez. Evitar a utilização de soro contaminado
com lípidos, hemolisado ou micróbios dado que pode ocorrer uma coloração fraca e diminuição dos
títulos.
8
Produto fabricado por:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK
ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Os kits e as lâminas fechados devem ser armazenados a 2-8ºC e podem ser utilizados até à data de
validade inscrita na embalagem. NÃO CONGELAR. Desde que as lâminas sejam retiradas do
invólucro de alumínio em que se encontram, devem ser utilizadas imediatamente. O PBS diluído pode
ser armazenado durante um mês a 2-8ºC. Todos os reagentes devem ser armazenados a 2-8ºC.
8.3.6
Lavagem com PBS. Retirar as lâminas da câmara húmida e lavar ligeiramente com o
esguicho de PBS. Não deitar o tampão directamente nos poços. Colocar as lâminas
num suporte, e emergi-las em PBS, agitar durante 5-10 minutos.
10.5
Este teste só por si não pode ser considerado diagnóstico. Todos os outros factores
incluindo história clínica dos doentes e outros resultados serológicos ou biopsias
também devem ser considerados.
8.3.7
Adição do conjugado fluorescente. Sacudir o excesso de PBS e em volta dos poços
absorver com os discos fornecidos. Colocar as lâminas novamente na câmara húmida
e cobrir imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. NÃO
DEIXAR OS POÇOS DESCOBERTOS DURANTE MAIS DE 15 SEGUNDOS. Se o
substrato secar os resultados serão seriamente afectados.
10.6
Não foi testado a utilização de reagentes de IFA comercializados por outras casas pelo
que não se sabe se são adequados, no entanto a sua utilização não deverá ser
necessariamente excluída.
8.3.8
Incubação da lâmina. Incubar as lâminas durante 20 minutos na câmara húmida à
temperatura ambiente (18-28ºC) no escuro.
8.3.9
Lavagem com PBS. Lavar novamente as lâminas como descrito no passo 8.3.6.
Contraste opcional. Adicionar 2-3 gotas de 1% de Azul de Evans por 100mL de PBS
antes de emergir as lâminas.
11
11.1
8.3.11
Visualização das lâminas no microscópio de fluorescência. As lâminas podem ser
armazenadas até 3 dias a 2-8ºC, na escuridão, sem perder significativamente a
fluorescência.
RESULTADOS
9.1
O controlo positivo para ANA deve apresentar um padrão homogéneo verde-maçã brilhante nos
núcleos das células. O controlo positivo mitocondrial deverá apresentar uma coloração verde-maçã
brilhante nos tubulos renais e células gástricas parietais. O controlo positivo músculo liso deverá
apresentar coloração verde brilhante na camada muscular do estômago.
O controlo negativo deve apresentar uma coloração verde baço em todos os tecidos, sem
fluorescência.
Se os controlos não se apresentarem como descrito, o teste está inválido e deverá ser repetido.
Interpretação dos resultados
9.2.1
Resultados negativos
11.2
Resultados positivos
1.
3.
4.
5.
Os ANA marcam os núcleos das estruturas seguintes: células hepáticas, túbulos renais distais e
proximais, células gástricas parietais e principais. Quase todos os doentes com SLE possuem ANA no
seu soro, mas estes podem também ser encontrados em várias doenças do tecido conjuntivo
incluindo artrite reumatóide. Os ANA podem também ser encontrados nos casos de hepatite crónica
activa e cirrose biliar primária e em resposta a tratamentos com determinadas drogas.
6.
Pode obter-se informação adicional interpretando os padrões nucleares obtidos para os ANA (ver
abaixo). É recomendável que todas as amostras positivas para ANA sejam tituladas até ao fim para
assegurar que possíveis reacções misturadas sejam detectadas, dado que de outra forma podiam ser
perdidas. É aconselhável efectuar outros testes a estas amostras para os autoanticorpos anti-dsDNA
e antigénios nucleares extraíveis (ENA).
9.
Periferial (Rim)
Mosqueado
Primitivo/ds DNA
Antigénios nucleares extraíveis
Ribonucleoproteinas,
Scl-70,
SSB
4-6S sRNA
Nucleolar
Anticorpos anti-células
gástricas parietais
(AGPCA)
Anticorpos anti-reticulina
(ARA)
REFERÊNCIA
AGPCA
0
0
0
0
8
50
66
2
58
0
8
110
10
86
3
0
8
16
4
100
100
0
0
0
0
0
0
*
*
Associação a doenças
SLE
Artrite reumatóide (AR)
Doença do tecido conjuntivo
Drogas indutoras de lúpus
SLE
Escleroderma
Sindroma de Sjögren
Doença do tecido conjuntivo
SLE
Escleroderma
Sindroma de Sjögren
SLE, AR e esclerose sistémica
progressiva
Estudo comparativo
REFERÊNCIAS
7.
8.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
RESUMO DA TÉCNICA
Equilibrar o meio de montagem para a temperatura ambiente.
Diluir o tampão PBS em água destilada.
Diluir o soro do doente 1/20 em PBS.
Equilibrar as lâminas com substrato para a temperatura ambiente (18-28ºC).
Aplicar 50µL dos controlos positivo e negativo e do soro diluido nos poços apropriados.
Incubar na câmara húmida durante 20 minutos.
Lavar durante 5-10 minutos em PBS.
Absorver o excesso em volta de cada poço e cobrir imediatamente com uma gota de
conjugado.
Incubar como no passo 13.6.
Lavar como no passo 13.7.
Montar.
Visualizar as lâminas no microscópio de fluorescência.
Tecido associado
Citoplasma do túbulos distal e
proximal (numa extensão
inferior)
Camadas musculares
(estômago). Camada muscular
das arteriolas (outros tecidos)
Células parietais (estômago)
Fibras peritubulares e cápsulas
de Bowman (rim)
Principais doenças
Cirrose biliar primária e outras
doenças do fígado
Hepatite crónica activa
Anemia perniciosa
Doença de Crohn
Doença celíaca
Dermatite hepetiforme
N.B. Cada laboratório deve estabelecer qual o ponto para o qual um resultado positivo é considerado
clinicamente significante.
10
% Positiva
ASMA
60
Padrões de marcação de autoanticorpos específicos do tecido incluem:
Anticorpo
Anticorpos
anti-mitocondriacais
(AMA)
Anticorpos anti-músculo
liso (ASMA)
AMA
Herpes Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954.
2.
Anticorpos anti-nucleares (ANA)
Antigénios comuns envolvidos
ds DNA, histonas
ANA
Foi feito um estudo comparativo em 90 amostras clínicas utilizando este kit um método de referência
comercial. 87 amostras das 90 testadas obtiveram resultados idênticos pelos dois métodos. Para os
padrões descritos na secção 9.2, a sensibilidade relativa variou entre os 86-100%, a especificidade
relativa foi de 100% em todos os casos e a concordância relativa variou dos 98-100%. Para as
amostras que diferiam, obteve-se uma marcação fracamente positiva para os ANA ou SMA em cada
caso, com apenas o método de referência, sugerindo que estas amostras estavam na zona limite para
aquele padrão e/ou que existe ligeiras diferenças na sensibilidade dos dois métodos.
Estes são vistos com fluorescência bem marcada em áreas específicas do tecido dando um ou mais
dos seguintes padrões:
Padrão
Homogéneo
No.
N.B. É possível que uma amostra obtenha um resultado positivo para mais do que um padrão.
12
São visualizados com coloração verde baço em todas secções, sem fluorescência. As reacções que
se suspeita serem fracas devem ser repetidas com uma diluição mais elevada (ex. 1/40). Se os
resultados repetidos forem iguais aos originais, o teste é dado como negativo.
9.2.2
Valores de referência
* = Dados obtidos através de testes feito na The Binding Site Ltd.
Controlo de qualidade
9.2
VALORES DE REFERÊNCIA
Grupo de
doentes
Dadores
normais
Hepatite
crónica
Cirrose biliar
primária
SLE
Artrite
reumatóide
Montagem das lâminas. Remover uma lâmina de cada vez do PBS. Secar rapidamente
os poços e adicionar a cada um uma gota do meio de montagem. Cuidadosamente
colocar a lamela, evitando a formação de bolhas de ar, mas se existirem não tente
removê-las. Limpar o excesso de meio de montagem em volta da lamela.
8.3.10
9
Informação da FDA (EUA) - ver folha de rosto do Folheto de Instruções em Inglês.
LIMITAÇÕES DA TÉCNICA
10.1
A sensibilidade da técnica pode ser influenciada pela fonte de luz, filtros e ópticas de
microscópios de fluorescência diferentes. A qualidade do microscópio é
significativamente influenciada pela correcta manutenção, especialmente centrando a
lâmpada de mercúrio a vapor e mudando-a no período recomendado.
10.2
Os padrões mudam frequentemente à medida que a amostra é quantificada até ao fim.
Este fenómeno deve-se à presença de mais do que um anticorpo, especialmente para
os ANA.
10.3
Os autoanticorpos podem ser activados ou induzidos por várias drogas incluindo
contraceptivos orais e antibióticos.
10.4
Dada a curta distância entre os poços nas lâminas com 10 poços, é possível
contaminação cruzada de amostras e controlos. Deve ser tomado especial cuidado
nomeadamente nos passos de lavagem, para assegurar que tal não aconteça.
KIT/VETRINI PER IMMUNOFLUORESCENZA
- SEZIONI DI RENE, STOMACO DI TOPO
Il Blu di Evans e i controlli del kit contengono lo 0,099% di sodio azide come conservante e devono
essere trattati con cautela – non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le mucose. In caso di
contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici esplosivi si possono
formare con il rame e il piombo. Quando si procede all’eliminazione del reagente, lavare con molta
acqua i recipienti allo scopo di evitare l’accumulo di azide.
Il prodotto deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente formato. Si
raccomanda di attenersi rigorosamente alla procedura indicata.
Italian
Per uso diagnostico in vitro
Codice Prodotto: FK314.1
FK314.2
FS314._
Prodotto da:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
Telefono: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
6
7
8
8.1
Kit per 50 test FK314.1
10 x Mouse kidney, stomach slide (5-well) (Vetrini da 5 pozzetti con rene, stomaco di
topo)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA, omogeneo. Prediluito, pronto
all’uso)
1x1mL Mitochondrial Positive Control (Controllo positivo anti mitocondrio. Prediluito,
pronto all’uso)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controllo positivo anti muscolatura liscia.
Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Negative Control (Controllo negativo. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Coniugato anti-IgG (H+L) umane FITC
purificato per affinità)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans all’1%)
2 x 60mL PBS Buffer (PBS concentrato x20)
1 x 3mL Mounting Medium (Soluzione di montaggio)
20 x Blotters (Carte assorbenti)
10 x Coverslips (22 x 70mm) (Vetrini coprioggetti, 22 x 70mm)
1 scheda tecnica
4.
2
RIASSUNTO E DESCRIZIONE
L’immunofluorescenza indiretta è il metodo di riferimento per lo screening e la titolazione degli
autoanticorpi circolanti nel siero. Le sezioni di tessuto di origine animale, come il topo, generalmente
sono preferibili ad altri substrati comunemente usati come le sezioni di tessuto umano e i preparati
cellulari; ciò è dovuto principalmente all’assenza d’interferenza con il sistema HLA e/o con gli altri
anticorpi diretti contro i gruppi sanguigni. L’utilizzo di due diversi tessuti (rene e stomaco) permette
d’identificare più facilmente gli autoanticorpi confrontando i risultati ottenuti con ciascun tessuto.
Determinati autoanticorpi sono associati a diverse patologie. Gli ANA sono quasi sempre presenti nel
lupus eritematoso sistemico (LES), ma si osservano anche comunemente nei pazienti affetti da
malattie reumatoidi e del tessuto connettivo. Gli AMA si osservano con frequenza nelle cirrosi biliari
primitive ma si possono anche individuare nei pazienti con altre malattie epatiche. Gli ASMA sono
frequentemente associati all’epatite cronica attiva e alla cirrosi biliare primitiva, ma sono anche
identificabili a basse concentrazioni in diverse altre condizioni. Gli AGPCA sono presenti nel siero della
maggior parte dei pazienti affetti da anemia perniciosa. Una descrizione più particolareggiata
dell’associazione degli autoanticorpi con certe patologie è riportata al punto 9 (rif. 1-8).
3
PRINCIPIO
Il kit usa una tecnica di immunofluorescenza indiretta (rif. 6) in cui i campioni dei pazienti e i relativi
controlli sono incubati sui vetrini con le sezioni. Gli anticorpi non specifici sono eliminati con il lavaggio,
quindi viene applicato un coniugato fluorescente specifico. Il coniugato non legato viene eliminato
come prima con il lavaggio. Per la lettura dei vetrini si usa un microscopio a fluorescenza. I campioni
positivi presentano una fluorescenza di colore verde che corrisponde alle aree della sezione dove
l’autoanticorpo si è legato.
4
4.1
REAGENTI
Sezioni di rene, stomaco di topo su vetrini da 5 o 10 pozzetti.
Materiali forniti
1.
5.
6.
INDICAZIONI
METODOLOGIA
8.1.1
3.
1
PRELIEVO CAMPIONI
I prelievi di sangue devono essere effettuati per via venosa. Lasciare che il sangue si coaguli in modo
naturale. Separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l’emolisi. Il siero può essere
conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio (rif. 9), oppure per periodi più
lunghi, aliquotare e conservare a -20°C o temperature inferiori. NON congelare e scongelare più di una
volta. Evitare l’uso di sieri lipemici, emolizzati o contaminati da batteri in quanto si potrebbero avere
titoli più bassi o pattern di colorazione non chiari.
2.
Questo prodotto è utilizzato per lo screening e la titolazione degli autoanticorpi circolanti nel siero
umano come supporto nella diagnosi e nel trattamento di varie malattie autoimmuni. I quattro
autoanticorpi principali individuati sono gli antinucleari (ANA), gli antimitocondrio (AMA), gli antimuscolatura liscia (ASMA) e gli anti-cellule parietali gastriche (AGPCA).
CONSERVAZIONE E STABILITA’
I kit o i vetrini non aperti devono essere conservati a 2-8°C e possono essere usati fino alla data di
scadenza indicata. NON CONGELARE. Una volta estratti dal loro involucro, i vetrini devono essere
usati immediatamente. Il tampone PBS diluito può essere conservato fino ad un mese a 2-8°C. Tutti i
reagenti devono essere conservati a 2-8°C.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.2
Kit per 250 test FK314.2
1.
25 x Mouse kidney, stomach slide (10-well) (Vetrini da 10 pozzetti con rene, stomaco di
topo)
1 x 1mL ANA Positive Control (Controllo positivo ANA omogeneo. Prediluito, pronto
all’uso)
1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Controllo positivo anti mitocondrio. Prediluito,
pronto all’uso)
1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Controllo positivo anti muscolatura liscia.
Prediluito, pronto all’uso)
1 x 1mL Negative Control (Controllo negativo. Prediluito, pronto all’uso)
1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Coniugato anti-IgG (H+L) umane FITC
purificato per affinità)
1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans all’1%)
2 x 60mL PBS Buffer (PBS concentrato x20)
1 x 10mL Mounting Medium (Soluzione di montaggio)
50 x Blotters (Carte assorbenti)
25 x Coverslips (Vetrini coprioggetti, 22 x 70mm)
1 scheda tecnica
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
8.1.3
FS314.1, FS314.A, FS314.2, FS314.B
1.
10 vetrini da 5 pozzetti, 1 vetrino da 5 pozzetti, 25 vetrini da 10 pozzetti, 1 vetrino da 10
pozzetti, rispettivamente.
1 scheda tecnica
2.
8.2
Materiale necessario ma non fornito
8.2.1
Acqua distillata per diluire il PBS.
8.2.2
Recipiente per contenere il PBS.
I kit contengono:
8.2.3
Micropipette e puntali monouso per dispensare i campioni dei pazienti.
4.2
Siero di controllo positivo ANA omogeneo, contenente lo 0,099% di sodio azide.
Prediluito, pronto all’uso.
8.2.4
Camera umida per le fasi d’incubazione (p.e. Camera di Colorazione Magnetica, Codice
BD010).
4.3
Siero di controllo positivo anti mitocondrio, contenente lo 0,099% di sodio azide.
8.2.5
Microscopio a fluorescenza con filtro a 495nm (filtro di eccitazione) e filtro a 515nm
(filtro di barriera).
4.4
Siero di controllo positivo anti muscolatura liscia, contenente lo 0,099% di sodio azide .
8.2.6
Bottiglia di plastica a pressione per lavaggio iniziale in PBS.
8.2.7
Se si usano solo i vetrini, è possibile ottenere da The Binding Site alcuni componenti
aggiuntivi: il PBS (CON 3.3), il controllo negativo (CON 92), il controllo positivo
omogeneo ANA (FA105), il controllo positivo anti mitocondrio (FA128), il controllo
positivo anti muscolatura liscia (FA134), il coniugato FITC (FA003), la soluzione di
montaggio (CON 195), la soluzione Blu di Evans all’1% (CON 93).
4.5
Siero di controllo negativo universalmente negativo per tutti gli autoanticorpi, contenente
lo 0,099% di sodio azide. Prediluito, pronto all’uso.
4.6
Antisiero di pecora anti-IgG umane purificato per affinità (H+L) coniugato con FITC
(isotiocianato di fluoresceina) contenente lo 0,099% di sodio azide. Prediluito, pronto
all’uso.
4.7
Blu di Evans all’1% come colorazione di contrasto opzionale.
4.8
Tampone PBS, soluzione liquida concentrata (x20).
4.9
Carte assorbenti, per asciugare il vetrino dopo il lavaggio.
4.10
Soluzione di montaggio, contenente un agente ‘anti-affievolimento’ (DABCO) 1, 4
diazodiciclo [2.2.2] ottano.
4.11
5
Vetrini coprioggetti (22 x 70mm).
8.3
8.3.1
Soluzione di montaggio: Togliere la soluzione di montaggio dal frigorifero per portarla a
temperatura ambiente (18-28ºC) prima dell’uso.
8.3.2
Diluire il PBS concentrato. Diluire il PBS con acqua distillata (1 parte di PBS + 19 parti
di acqua distillata) e miscelare. Il PBS viene usato per diluire i campioni dei pazienti e
come tampone di lavaggio.
8.3.3
Diluire i campioni dei pazienti.
Screening: Diluire i campioni 1/20 aggiungendo 50µL di siero in 950µL di PBS.
Titolazione: Effettuare diluizioni seriali dei campioni positivi con PBS (p.e. 1/20, 1/40,
1/80, 1/160 e 1/320 ecc.).
Per esempio: Prendere 100µL della diluizione 1/20 e diluire con 100µL di PBS per
ottenere una diluizione 1/40. Ripetere questa procedura per ulteriori diluizioni.
8.3.4
Vetrini con substrato. I vetrini devono raggiungere la temperatura ambiente (18-28°C)
prima di essere tolti dalla confezione. Etichettare correttamente i vetrini, metterli nella
camera umida e aggiungere una goccia di ciascun controllo positivo e negativo nei
rispettivi pozzetti. Aggiungere 50µL dei campioni diluiti nei pozzetti rimanenti.
PRECAUZIONI
Tutti i sieri umani forniti nel kit sono stati sottoposti a screening per donatori, risultando negativi per
l’antigene di superficie dell’epatite B e per gli anticorpi verso i virus HIV1, HIV2 e HCV. Ciò nonostante,
questi test non possono garantire l’assenza di agenti infettivi. Devono essere stabiliti metodi di
trattamento e di eliminazione adeguati come per tutti i materiali potenzialmente infettivi e le procedure
devono essere eseguite soltanto da personale esperto ed autorizzato.
Procedura
Controllo qualità
I controlli negativi e positivi devono essere usati ogni volta che sono dosati i campioni.
8.3.5
Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 20 minuti in una camera umida a temperatura
ambiente (18-28°C).
8.3.6
Lavaggio PBS. Togliere i vetrini dalla camera umida e risciacquarli brevemente con il
PBS in una bottiglia di plastica a pressione. Non spruzzare direttamente nei pozzetti.
Posizionare i vetrini in un rack e immergerli nel PBS, poi agitare per 5-10 minuti.
8.3.7
Aggiunta del coniugato fluorescente. Eliminare l’eccesso di PBS e asciugare intorno ai
pozzetti con le carte assorbenti fornite. Riportare i vetrini nella camera umida e coprire
immediatamente ogni pozzetto con una goccia di coniugato fluorescente. NON
LASCIARE I POZZETTI SCOPERTI PER OLTRE 15 SECONDI. L’essiccamento del
substrato compromette seriamente i risultati.
10.2
I pattern di colorazione spesso variano quando un campione è titolato fino al suo endpoint. Ciò è dovuto di solito alla presenza di più di un autoanticorpo, soprattutto per gli
ANA.
10.3
Gli autoanticorpi possono essere attivati o indotti da un’ampia varietà di farmaci
compresi contraccettivi orali e antibiotici.
10.4
Poiché sui vetrini con 10 pozzetti, questi ultimi sono a breve distanza l’uno dall’altro, è
possibile una contaminazione incrociata dei campioni e dei controlli. Occorre fare
attenzione affinché ciò non si verifichi soprattutto nelle fasi di lavaggio.
10.5
Questo test da solo non permette la formulazione di una diagnosi. E’ necessario
prendere in considerazione tutti gli altri fattori compresa l’anamnesi clinica dei pazienti e
altri risultati sierologici o della biopsia.
L’idoneità all’uso del kit con reagenti IFA di altri fabbricanti non è stata valutata ma l’uso
con tali reagenti non deve essere necessariamente escluso.
8.3.8
Incubazione dei vetrini. Incubare i vetrini per 20 minuti in una camera umida a
temperatura ambiente (18-28°C) al buio.
10.6
8.3.9
Lavaggio con PBS. Lavare nuovamente come descritto nella fase 8.3.6. Colorazione di
contrasto opzionale. Aggiungere fino a 2-3 gocce di Blu di Evans all’1% per 100mL di
PBS prima di immergere i vetrini.
FDA (USA) Avvertenze: vedere la pagina iniziale dell'inserto in Inglese.
8.3.10
Montaggio con il vetrino coprioggetti. Rimuovere un vetrino alla volta dal lavaggio PBS.
Asciugare rapidamente intorno ai pozzetti e aggiungere una goccia di soluzione di
montaggio in ciascun pozzetto. Mettere con cura il vetrino sul vetrino coprioggetti,
evitando le bolle d’aria, ma se ci sono non tentare di rimuoverle. Rimuovere la soluzione
di montaggio in eccesso intorno al bordo del vetrino coprioggetti.
8.3.11
9
11
11.1
Risultati attesi
Tipologia
Donatori sani
Epatite cronica
attiva
Cirrosi biliare
primitiva
LES
Artrite
reumatoide
Lettura dei vetrini con il microscopio a fluorescenza. I vetrini possono essere conservati
a 2-8°C al buio fino a 3 giorni, senza una significativa perdita di fluorescenza.
RISULTATI
9.1
VALORI ATTESI
Controllo qualità
No.
60
50
ANA
0
66
% Positivi
AMA
ASMA
0
0
2
58
RIFERIMENTO
AGPCA
0
0
8
8
110
10
86
3
0
8
16
4
100
100
0
0
0
0
0
0
*
*
Il controllo positivo ANA omogeneo deve presentare una fluorescenza color verde brillante nei nuclei
delle cellule. Il controllo positivo anti mitocondrio deve presentare una fluorescenza verde brillante dei
tubuli renali e delle cellule parietali gastriche. Il controllo positivo anti muscolatura liscia deve
presentare una fluorescenza verde brillante nello strato muscolare dello stomaco.
* = Dati ottenuti da studi condotti internamente ai laboratori “The Binding Site Ltd.”
Il controllo negativo deve presentare una colorazione verde scura in tutti i tessuti, senza fluorescenza
visibile.
11.2
Se i controlli non risultano come sopra descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto.
9.2
Interpretazione dei risultati
9.2.1
Risultato negativo
Si osserva una colorazione verde scuro in tutte le sezioni, senza fluorescenza visibile. Reazioni deboli
sospette devono essere ripetute ma aumentando il fattore di diluizione (p.e. 1/40). Se dopo avere
ripetuto il test, il risultato sembra uguale a quello iniziale, il test viene considerato negativo.
9.2.2
NOTA - Un campione può risultare positivo per più di un pattern.
12
1.
Risultato positivo
Si osserva una fluorescenza significativa nelle zone tissutali specifiche che presentano uno o più dei
seguenti pattern:
2.
Anticorpi Antinucleari (ANA)
3.
Gli ANA colorano i nuclei delle seguenti cellule: cellule dei tubuli renali distali e prossimali, cellule
principali e parietali gastriche. Quasi tutti i pazienti affetti da LES hanno degli ANA nel loro siero, ma gli
ANA possono anche essere presenti in varie patologie del tessuto connettivo compresa l’artrite
reumatoide. Inoltre gli ANA si possono osservare nei casi di epatite cronica attiva, di cirrosi biliare
primitiva e in risposta a determinate terapie farmacologiche.
4.
E’ possibile ottenere ulteriori informazioni interpretando i pattern dei nuclei degli ANA osservati nei test
(vedere qui di seguito). Si raccomanda di titolare tutti i campioni ANA positivi fino all’end-point per
garantire l’individuazione di eventuali reazioni miste che altrimenti potrebbero andare perse. Si
consiglia inoltre un’analisi supplementare di questi campioni per ricercare gli autoanticorpi diretti contro
il DNA a doppio filamento e gli antigeni nucleari estraibili (ENA).
7.
Pattern
Omogeneo
Antigeni comuni coinvolti
dsDNA, istoni
Patologia associata
LES
Artrite reumatoide (AR)
Connettiviti miste
Lupus farmaco-indotto
Periferico (Bordo)
dsDNA/Nativo
LES
Granulare
Antigeni nucleari estraibili
Ribonucleoproteina,
Scl-70,
SSB
Sclerodermia
Sindrome di Sjögren
Connettiviti miste
LES
4-6S RNA
Sclerodermia, Sindrome di
Sjögren
LES, AR e sclerosi sistemica
progressiva
Nucleolare
Studio comparativo
E’ stato eseguito uno studio comparativo su 90 campioni clinici utilizzando questo kit e un metodo di
riferimento disponibile sul mercato. 87 dei 90 campioni dosati hanno fornito risultati identici con i due
metodi. Per i pattern descritti al punto 9.2, la sensibilità relativa variava dall’ 86 al 100%, la specificità
relativa era del 100% in ogni caso e la concordanza relativa variava dal 98 al 100%. Per i campioni che
hanno dato risultati diversi, è stata ottenuta una debole colorazione ANA o SMA positiva soltanto con il
metodo di riferimento, suggerendo così che tali campioni erano borderline per il determinato pattern
e/o che esistevano delle leggere differenze di sensibilità tra i due metodi.
5.
6.
8.
9.
13
13.1
13.2
13.3
13.4
13.5
13.6
13.7
13.8
13.9
13.10
13.11
13.12
BIBLIOGRAFIA
Herpes Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954
SINTESI DELLA PROCEDURA
Portare la soluzione di montaggio a temperatura ambiente.
Diluire il PBS con acqua distillata.
Diluire i sieri dei pazienti 1/20 con PBS.
Portare i vetrini a temperatura ambiente (18-28°C).
Dispensare 50µL dei controlli positivi e negativi e dei sieri dei pazienti diluiti nei rispettivi
pozzetti.
Incubare in camera umida per 20 minuti.
Lavare per 5-10 minuti in PBS.
Asciugare bene intorno ad ogni pozzetto e coprire immediatamente ogni pozzetto con
una goccia di coniugato.
Incubare come nella fase 13.6 al buio.
Lavare come nella fase 13.7.
Montare.
Leggere il vetrino con il microscopio a fluorescenza.
I pattern di colorazione degli autoanticorpi specifici dei tessuti comprendono:
Anticorpo
Tessuto associato
Principali patologie associate
Anticorpi anti
mitocondrio (AMA)
Citoplasma dei tubuli distali
renali e dei tubuli prossimali
(in minor misura).
Cirrosi biliare primitiva
e altre patologie epatiche
Anticorpi anti
muscolatura liscia
(ASMA)
Anticorpi anti cellule
parietali gastriche
(AGPCA)
Anticorpi anti reticolina
(ARA)
Strati muscolari (stomaco)
Strati muscolari arteriole (altri
tessuti)
Cellule parietali (stomaco)
Epatite cronica attiva
Fibre peritubulari e capsule di
Bowman (rene)
Morbo di Crohn
Morbo celiaco
Dermatite erpetiforme
Anemia perniciosa
NB: Ogni laboratorio deve stabilire a che punto un risultato positivo è considerato clinicamente
significativo.
10
10.1
LIMITI DELLA PROCEDURA
La fonte luminosa, i filtri e l’ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche
influiranno sulla sensibilità del test. La performance del microscopio è influenzata
notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla
sostituzione della lampada a vapori di mercurio dopo il periodo di tempo consigliato.

For in-vitro diagnostic use Product Code: FK314.1, FK314.2 FS314._

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