Exercício 1 As enzimas de restrição

Exercício 1
As enzimas de restrição
A Engenharia Genética é possível graças a um grupo especial de enzimas que cortam
o DNA. Estas enzimas são chamadas de enzimas de restrição ou endonucleases de
restrição.
As enzimas de restrição são proteínas produzidas por bactérias para
prevenir ou restringir a introdução de DNA exógeno. Elas atuam como “tesouras” de
DNA cortando-o e inativando-o.
As enzimas de restrição reconhecem e cortam sítios específicos ao longo da molécula
de DNA, chamados sítios de restrição. Cada enzima de restrição (e existem centenas,
produzidas por muitas bactérias diferentes) tem o seu próprio sítio de ação. Em geral,
um sítio de restrição é uma seqüência palindrômica de 4 ou 6 pares de base. Um
DNA palindrômico é uma seqüência na qual a fita lida no sentido 5’ a 3’ é a mesma da
fita lida no sentido 5’ a 3’. Por exemplo:
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
é uma seqüência de DNA palindrômica. Para verificar isto, leia as seqüências das
fitas superior e inferior do final 5’ para o final 3’. Esta seqüência é também um sítio de
restrição para a enzima chamada EcoRI. O nome EcoRI vem de uma bactéria na qual
ela foi descoberta, Escherichia coli RY 13 (EcoR), e I porque esta foi a primeira enzima
de restrição encontrada neste organismo.
A EcoRI corta entre a G e a A em cada fita de DNA (veja abaixo). Assim que os cortes
são feitos, o DNA é mantido unido pelas pontes de hidrogênio entre as quatro bases
do meio. As pontes de hidrogênio são frágeis, e então o DNA se separa.
Sítios de restrição:

5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’

DNA cortado:
5’ G
3’ CTTAA
AATTC 3’
G 5’
A EcoRI não corta diretamente a molécula de DNA. Quando a EcoRI corta uma
molécula de DNA, há a formação de fitas simples como “caudas” nos finais novos.
Este tipo de final é chamado de “finais coesivos” (sticky end) porque podem se unir
facilmente a outras fitas com finais complementares.
Nem todas as enzimas de
restrição formam finais coesivos; algumas cortam as duas fitas de DNA diretamente,
produzindo um “final abrupto” (blunt end).
Quando os cientistas estudam uma molécula de DNA, uma das primeiras coisas a
fazer é solucionar onde estão os sítios de restrição. Então, eles criam um mapa de
restrição, mostrando a localização dos sítios de clivagem para muitas enzimas
diferentes. Estes mapas são utilizados como mapas rodoviários para a molécula de
DNA. A figura 1 mostra um mapa de restrição de um plasmídio.
EcoRI (1/5541)
PvuI (4916)
PvuII (3247)
HindIII (32)
EagI (942)
ApaI (2035)
SmaI (2540)
Figura 1. Mapa de restrição do plasmídio YIP5 (5541 pares
de base). O número após cada nome de enzima de restrição
indica em qual par de base o DNA é cortado pela enzima.
Abaixo estão demonstrados alguns sítios de restrição de diferentes enzimas de
restrição.
EcoRI:

5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’


5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG 5’

BamHI:
SmaI:

5’ AAGCTT 3’
3’ TTCGAA 5’

HindIII:
AluI:

5’ CCCGGG 3’
3’ GGGCCC 5’


5’ AGCT 3’
3’ TCGA 5’


HbaI: 5’ GCGC 3’
3’ CGCG 5’

Quais destas enzimas formariam finais abruptos?
Quais delas formariam finais
coesivos?
Exercício 1
Corte a faixa de papel com a seqüência de DNA ao longo de suas bordas. Esta faixa
representa uma molécula de DNA de fita dupla. Cada seqüência de letras representa a
cadeia fosfodiéster, e as linhas verticais entre os pares de base representam as
pontes de hidrogênio entre as bases.
1. Você vai simular a atividade da EcoRI. Verifique ao longo da seqüência do DNA 1
até você encontrar o sítio da EcoRI (utilize a lista de enzimas dada como
referência). Faça cortes através da cadeia fosfo-diéster justamente entre a G e a
A do sítio de restrição em ambas as fitas. Não corte através de toda a faixa.
Lembre-se que a EcoRI corta a cadeia de cada fita de DNA separadamente.
2. Agora separe as pontes de hidrogênio entre os sítios de corte, cortando através
das linhas verticais.
Separe os dois pedaços de DNA.
Analise os finais
produzidos pela EcoRI. Eles são abruptos ou coesivos? Escreva EcoRI nos finais
cortados. Mantenha os fragmentos cortados em sua mesa.
3. Repita o procedimento com a faixa 2, desta vez simulando a atividade da SmaI.
Encontre o sítio da SmaI e corte através do esqueleto fosfodiéster nos sítios
indicados acima. Há alguma ponte de hidrogênio entre os sítios de restrição? Os
finais novos são coesivos ou abruptos?
Marque os novos finais com SmaI e
mantenha os fragmentos de DNA em sua mesa.
4. Simule a atividade da HindIII com a faixa 3.
Estes finais são coesivos ou
abruptos? Marque os novos finais com HindIII e mantenha os fragmentos.
5. Repita o procedimento com a faixa 4, simulando a EcoRI novamente.
6. Pegue o “fragmento de DNA inicial” da faixa 4 (um fragmento) EcoRI e o
“fragmento final” da HindIII da faixa 3. Ambos os fragmentos têm “caudas” em fita
simples de 4 bases.
Escreva as seqüências de bases das duas “caudas” e
identifique-as EcoRI e HindIII. Marque os finais 5’ e 3’. As seqüências de bases
dos finais produzidos pela EcoRI e HindIII são complementares?
7. Tire o fragmento da HindIII e pegue o fragmento final da faixa 1 (cortado com
EcoRI). Compare os finais de fita simples do fragmento produzido pela EcoRI na
faixa 1 com o fragmento produzido pela EcoRI na faixa 4. Escreva as seqüências
de bases das “caudas” de fita simples e marque os finais 5’ e 3’.
Eles são
complementares?
8. Imagine que você cortou um fragmento de DNA completamente desconhecido
com EcoRI. Você acha que os finais de fita simples destes fragmentos serão
complementares àqueles produzidos nas faixas 1 e 4?
9. Uma enzima chamada DNA ligase refaz as pontes fosfodiéster entre nucleotídeos.
Para a DNA ligase trabalhar, dois nucleotídeos devem se aproximar com a
orientação apropriada para a ponte (o final 5’ de um deve estar próximo ao final 3’
do outro). Você acha que seria mais fácil para a DNA ligase reconectar dois
fragmentos cortados pela EcoRI ou um fragmento cortado pela EcoRI com outro
cortado pela HindIII? Qual é a sua explicação?
Exercício 2
A figura 1 é um mapa de restrição do plasmídio circular YIP5. Este plasmídio contém
5541 pares de bases. Há um sítio de restrição da EcoRI no par de base 1. As
posições dos outros sítios de restrição estão demonstradas no mapa. Os números
após o nome das enzimas mostram em qual par de base a enzima cliva o DNA. Se
você digerir o YIP5 com EcoRI, você vai obter um pedaço de DNA com 5541 pares de
bases.
10. Quais seriam os produtos de digestão com as enzimas EcoRI e EagI?
11. Quais seriam of produtos de digestão com as enzimas HindIII e ApaI?
12. Quais seriam of produtos de digestão com as enzimas HindIII, ApaI e PvuI?
13. Se você pegar os produtos de digestão da questão 10 e digeri-los com PvuI, quais
seriam os produtos?
1
5’ - TAGACTGAATTCAAGTCA - 3’

3’ - ATCTGACTTAAGTTCAGT - 5’
2
5’ - ATACGCCCGGGTTCTAAA - 3’
   
3’ - TATGCGGGCCCAAGATTT - 5’
3
5’ - CAGGATCGAAGCTTATGC - 3’
   
3’ - GTCCTAGCTTCGAATACG - 5’
4
5’ - AATAGAATTCCGATCCGA - 3’

3’ - TTATCTTAAGGCTAGGCT - 5’