análise da concentração de óxido nítrico na saliva de indivíduos

Transcrição

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
Faculdade de Odontologia
ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE
ÓXIDO NÍTRICO NA SALIVA DE
INDIVÍDUOS PORTADORES DE
DOENÇA PERIODONTAL
Vanessa Goulart Sampaio Reher
Belo Horizonte
2005
ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE
ÓXIDO NÍTRICO NA SALIVA DE
INDIVÍDUOS PORTADORES DE
DOENÇA PERIODONTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
em
Odontologia,
Área
de
Concentração
em
Clínicas Odontológicas - Ênfase em Periodontia, da
Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais,
como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Clínicas Odontológicas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Villamarim Soares
Co–orientador: Prof. Dr. Elton Gonçalves Zenóbio
Belo Horizonte
2005
Análise da Concentração de Óxido Nítrico na Saliva de Indivíduos Portadores de Doença Periodontal
FOLHA DE APROVAÇÃO
3
4
DEDICATÓRIA
À minha mãe, Neyde, pela educação recebida, pelo
amor, incentivo e apoio constante.
Ao meu marido, amigo e companheiro, Peter, pelo amor
incondicional durante nossos quinze anos.
Aos meus Lucas e Mariana, alegrias da minha vida, por
todo o amor e pela compreensão pelas ausências
constantes durante esse período.
DEDICO A REALIZAÇÃO DESTE SONHO
5
AGRADECIMENTOS
Aos meus irmãos (Alessandra, Júnior e Roney) e à tia Neuza, por estarem sempre
perto, mesmo que a quilômetros de distância.
Ao meu imprescindível e indispensável braço direito (e esquerdo também) Célia, que
me ajudou a manter a vida organizada, o tempo livre, a casa em ordem e meus
filhos felizes.
Aos amigos queridos: Fernanda Vale, Júnia Neves, Maria Ilma Côrtes e Jorge
Espeschit pela amizade que nos une, pelo carinho no dia a dia e pelo apoio durante
todo esse período.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Villamarim Soares, com quem tanto aprendi, pela sua
orientação durante meu desenvolvimento acadêmico. Agradeço pela amizade e
confiança, por ter acreditado em meu trabalho principalmente nos momentos difíceis,
por sua valiosa colaboração e pronta atenção durante todo este período de
convivência.
Ao Prof. Dr. Elton Gonçalves Zenóbio, exemplo de competência e profissionalismo,
pela amizade, pelos conhecimentos transmitidos e por todo apoio e incentivo que
recebi durante este período.
Ao Prof. Dr. Fernando de Oliveira Costa, a quem tanto admiro pela dedicação à
ciência e ao ensino, pela amizade e pela valiosa oportunidade de poder discutir os
resultados dos experimentos de maneira clara e objetiva.
A todos os professores do domínio conexo, pela excelência das aulas, pela
dedicação e pelos conhecimentos transmitidos.
6
Às queridas Silvania e Angélica, secretárias da pós-graduação da Faculdade de
Odontologia da PUCMinas, pela amizade, competência, disponibilidade, alegria e
apoio constantes.
Aos colegas do mestrado, pela agradável convivência, pelo apoio mútuo e incentivo
constantes, em especial aos colegas Geraldo Lúcio Silva, Elias Abdallah e Fernando
Mauad, companheiros das horas difíceis e dos estudos intermináveis...
Aos professores de Periodontia da Faculdade de Odontologia da PUC-Minas pela
amizade, apoio e disponibilidade em ajudar, especialmente as professoras Patrícia
Soares Ribas e Elizete dos Reis Borges.
À Profª. Drª. Gerluza Aparecida Borges Silva, ao Prof. Dr. Alfredo Miranda de Góes e
à Profª.Drª. Valderez Ornelas Dutra, professores do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais, por me receberem em seus laboratórios.
À Aylla Martins de Araújo, por todo o auxílio, disponibilidade e energias positivas em
todo esse período.
Aos alunos da graduação e pós-graduação em Periodontia da PUC-Minas, pelo
auxílio fundamental para a realização deste trabalho.
Aos funcionários da Faculdade de Odontologia da PUC-Minas, pela disponibilidade,
atenção e agradável convivência.
Aos pacientes que se disponibilizaram para a realização deste trabalho.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento
deste trabalho.
7
“No meu ponto de vista, o mais urgente, não é educar para uma vida já
feita, mas sim para uma vida criadora.”
José Ortega y Gasset
8
RESUMO
A doença periodontal é uma reação inflamatória dos tecidos periodontais, em
decorrência de uma infecção provocada por um grupo específico de bactérias.
Novas técnicas de diagnóstico, incluindo a análise de constituintes salivares, vêm
sendo amplamente desenvolvidas e utilizadas no seu diagnóstico. O objetivo do
presente estudo foi mensurar a concentração de óxido nítrico (NO) na saliva de
indivíduos portadores de doença periodontal crônica generalizada (DPCG) e sem
periodontite, verificando se há alterações entre estes grupos. Procurou-se ainda
determinar se esta mensuração pode ser utilizada como parâmetro auxiliar no
diagnóstico diferencial entre as formas moderada e avançada da doença, bem como
observar se há correlação positiva entre os critérios de diagnóstico clínico e os
níveis de NO. Foram selecionados 30 indivíduos, e estes divididos em 3 grupos. O
grupo controle foi formado por indivíduos sem periodontite, o grupo moderada, por
portadores de DPCG moderada, e o grupo avançada por portadores de DPCG
avançada, segundo os critérios da AAP. Após exames clínico e periodontal,
amostras de saliva foram coletadas, centrifugadas e armazenadas a -20˚C. A
concentração de NO foi analisada indiretamente por meio da mensuração das
concentrações de nitrito pelo método colorimétrico de Griess. Os resultados
mostraram uma diferença significativa (p = 0,0024) entre as concentrações médias
de nitrito no grupo controle (5,86 µM) em relação ao conjunto dos grupos moderada
e avançada (11,79 µM). Analisando-se separadamente os grupos moderada e
avançada, os valores obtidos foram respectivamente de 7,78 µM e 15,79 µM, e estes
também apresentavam uma diferença estatisticamente significativa entre si (p <
0,01). Houve correlação positiva entre os níveis de nitrito na saliva em relação aos
níveis de profundidade de sondagem, sendo que o número de dentes com PS ≥ 7
mm obteve o maior valor (correlação = 0,69). Conclui-se que a concentração de
nitrito está aumentada na saliva de indivíduos com DPCG, sendo este aumento
maior nos casos de DPCG avançada. Os resultados do presente estudo sugerem
que a avaliação da concentração do NO na saliva pode ser utilizada como marcador
biológico da doença periodontal crônica generalizada.
Palavras Chave: saliva, doença periodontal, óxido nítrico, marcadores biológicos.
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ABSTRACT
Periodontal disease is an inflammatory reaction of the periodontal tissues in
response to infection caused by a specific group of bacteria. New diagnostic
techniques, including analysis of salivary constituents have been developed and
used in the diagnosis of this disease. The aim of the present study was to measure
the concentration of nitric oxide (NO) in the saliva of individuals with generalized
chronic periodontal disease (DPCG) and in individuals without periodontitis,
evaluating possible differences among groups. The ability of these measurements to
differentiate between moderate and advanced forms of this disease was also
analyzed, as well as the occurrence of positive correlations between clinical
parameters and nitrite levels. Thirty individuals were selected and divided into 3
groups. The control group, was formed by individuals without periodontitis, the
moderate group by individuals with moderate DPCG, and the advanced group by
individuals with advanced DPCG, according to AAP criteria. After clinical and
periodontal exam, saliva was collected, centrifuged, and stored at -20˚C. The NO
concentration was analyzed indirectly measuring the nitrite concentration by the
Griess colorimetric assay. Results showed a significant difference (p=0,0024)
between the mean nitrite concentration in the control group (5,86 µM) compared to
the moderate and advanced groups pooled together (11,79 µM). Comparison of
mean values obtained by the moderate (7,78 µM) and advanced (15,79 µM) groups
also revealed a significant difference (p<0,01). A positive correlation between salivary
nitrite levels and probing depth levels was also observed, and the higher correlation
(correlation = 0,69) occurred with the number of teeth with probing depth ≥ 7 mm We
conclude that the nitrite concentrations were elevated in saliva of individuals with
DPCG, and that the highest levels occurred in individuals with the advanced DPCG
These results suggest that it may be possible to use indirect measurements of NO
as a biological marker of generalized chronic periodontal disease.
Key Words: saliva, periodontal disease, nitric oxide, biological markers
10
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 A via bioquímica L-arginina-óxido nítrico.................................................28
FIGURA 2 Centrífuga refrigerada Centra CL3R, IEC................................................52
FIGURA 3 Placa de Elisa após a reação de Griess. Amostras utilizadas na
elaboração de uma curva padrão de NaNo2 nas duas últimas fileiras....54
FIGURA 4 Leituras das amostras teste e padrão.....................................................55
FIGURA 5 Curva padrão de amostras pré-determinadas de Nitrito de Sódio..........57
FIGURA 6 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal
(grupos
moderada
e
avançada)
e
de
indivíduos
do
grupo
controle...................................................................................................59
FIGURA 7 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos dos grupos: controle,
doença periodontal crônica generalizada moderada e doença periodontal
crônica generalizada avançada...............................................................61
FIGURA 8 Correlação entre a maior profundidade de sondagem e os valores da
concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal
crônica generalizada moderada e avançada. ........................................63
FIGURA 9 Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 7mm e os valores da
crônica generalizada moderada e avançada. ........................................64
FIGURA 10 Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 4mm e os valores da
crônica generalizada moderada e avançada. ..................................... 65
11
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal
(grupos moderada e avançada) e de indivíduos do grupo
controle....................................................................................................58
TABELA 2 Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal
crônica generalizada moderada, avançada e de indivíduos do grupo
controle. ..................................................................................................60
TABELA 3 Correlações entre parâmetros de profundidade de sondagem e os
valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença
periodontal crônica generalizada............................................................62
LISTA DE ABREVIATURAS
AAP
American Academy of Periodontology
BCG
Bacilo Calmette-Guérrin
BH4
Tetrahidrobiopterina
CNS
Conselho Nacional de Saúde
COX
Cicloxigenase
Des. Pad.
Desvio Padrão
DNA
Ácido desoxirribonucléico
DP
Doença periodontal
DPCG
Doença periodontal crônica generalizada
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay
FAD
Flavina adenina dinucleotideo
FMN
Flavina mononucleotídeo
HGF
Fator de crescimento de hepatócitos
I.C.
Intervalo de Confiança
iCa++
Cálcio intracelular
Ig
Imunoglobulina
IL
Interleucina
IFN-γ
Interferon gama
LPS
Lipopolissacarídeos
MEG
Mercaptoetilguanidina
MMPs
Metaloproteinases
NADP
Fosfato nicotinamida adenina dinucleotídeo
NO
Óxido nítrico
12
NO2
Nitrito
NO3
Nitrato
NOS
Óxido nítrico sintase
NOSc
Óxido nítrico sintase constitutiva
NOSe
Óxido nítrico sintase endotelial
NOSn
Óxido nítrico sintase neuronal
NOSi
Óxido nítrico sintase induzida
PAF
Fator de ativação de plaquetas
PDGF
Fator de crescimento derivado de plaquetas
PGE
Prostaglandina
PI
Perda de inserção
PMN
Polimorfonucleares
PS
Profundidade de sondagem
TIMP
Inibidor tecidual de matriz de metaloproteinase
TNF
Fator de necrose tumoral
VEGF
Fator de crescimento vascular endotelial
13
14
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 16
2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................................ 20
2.1. DOENÇA PERIODONTAL - MECANISMOS CELULARES E MOLECULARES............................................. 20
2.1.1 Marcadores Biológicos ........................................................................................................ 22
2.2. O ÓXIDO NÍTRICO ......................................................................................................................... 25
2.2.1 Enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS)................................................................................... 28
2.2.2 Propriedades Citotóxicas do Óxido Nítrico.......................................................................... 31
2.2.3 Propriedades Citoprotetoras do Óxido Nítrico..................................................................... 32
2.2.4 Propriedades Anti/Pró-inflamatórias e Antiinfecciosas do Óxido Nítrico............................. 34
2.2.5 Óxido Nítrico e a Destruição Tecidual ................................................................................. 35
2.2.6 Participação do Óxido Nítrico nas Doenças Periodontais................................................... 38
3. OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 44
3.1. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................... 44
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................................. 44
4. HIPÓTESES ...................................................................................................................................... 45
5. METODOLOGIA ............................................................................................................................... 46
5.1. SELEÇÃO DA AMOSTRA E DIVISÃO DOS GRUPOS ............................................................................ 46
5.1.1 Critérios de Exclusão........................................................................................................... 46
5.1.2 Critérios de Inclusão ............................................................................................................ 47
5.2 CONSENTIMENTO PARA A PESQUISA ............................................................................................... 48
5.3 EXAME PERIODONTAL .................................................................................................................... 49
5.3.1 Calibração............................................................................................................................ 49
5.3.2 Sangramento à sondagem .................................................................................................. 50
5.3.3 Supuração ........................................................................................................................... 50
5.3.4 Profundidade de sondagem ................................................................................................ 50
5.3.5 Perda de inserção................................................................................................................ 51
5.4. COLETA DAS AMOSTRAS DE SALIVA ............................................................................................... 51
5.5. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO ........................................................................... 53
5.5.1 Componentes do Reagente de Griess ................................................................................ 53
5.5.1 Montagem da Placa e Leitura Espectofotométrica.............................................................. 54
5.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................................... 55
6. RESULTADOS.................................................................................................................................. 57
15
6.1. CURVA PADRÃO DE NaNO2 .......................................................................................................... 57
6.2. GRUPO CONTROLE X GRUPOS COM DOENÇA PERIODONTAL .......................................................... 58
6.3. GRUPOS COM DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA MODERADA X AVANÇADA ...................................... 59
6.4. CORRELAÇÃO ENTRE OS PARÂMETROS CLÍNICOS E AS MEDIDAS DE NITRITO NAS AMOSTRAS DE
SALIVA ....................................................................................................................................... 61
7. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 66
8. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 72
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................ 73
ANEXOS ............................................................................................................................................... 88
16
1. INTRODUÇÃO
A doença periodontal é uma reação inflamatória dos tecidos periodontais de
suporte dos dentes (ligamento periodontal, cemento e osso alveolar) em decorrência
de uma infecção provocada por um grupo específico de bactérias (BECK e
OFFENBACHER, 1998). O grupo bacteriano que inicia e perpetua a doença
periodontal é formado por bactérias anaeróbicas gram-negativas que colonizam o
ambiente subgengival. No entanto, a intensidade e a gravidade da doença são
dependentes do equilíbrio dinâmico entre a agressão microbiana e a resposta
imuno-inflamatória do hospedeiro (PAGE e KORNMAN, 1997). A microbiota
subgengival se organiza em biofilmes, o que permite que as bactérias fiquem menos
susceptíveis às defesas do hospedeiro e desenvolvam resistência a agentes
quimioterápicos (SOCRANSKY e HAFFAJEE, 2002). É importante ressaltar que
embora as bactérias sejam essenciais para o estabelecimento da doença,
isoladamente são insuficientes para instituir a patologia (SOCRANSKY e
HAFFAJEE, 1992).
A doença periodontal crônica é a forma mais comum das doenças
periodontais em adultos e pode ser definida como um processo infeccioso que
resulta na inflamação dos tecidos de suporte dos dentes com progressiva perda de
inserção e óssea (FLEMMIG, 1999; AAP, 2000a), podendo ser classificada pela
gravidade e extensão (PAGE et al., 1983; ZAMBON, CHRISTERSSON e GENCO,
1986; ARMITAGE 1999; LINDHE, KARRING e LANG, 1999; AAP, 2000b).
Até o presente momento o diagnóstico e a classificação das diversas doenças
periodontais são ainda baseados essencialmente em parâmetros clínicos. O avanço
no campo molecular e genético tem permitido uma maior compreensão das vias e
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mecanismos pelos quais tais bactérias iniciam e perpetuam a reposta imunoinflamatória (SOCRANSKY e HAFFAJEE, 1992). Novas técnicas suplementares de
diagnóstico, que utilizam componentes de fluidos, a microflora subgengival e a
susceptibilidade genética estão sendo amplamente desenvolvidas (ARMITAGE et al,
2003). Elas podem ser usadas na detecção de substâncias associadas a
determinados patógenos, enzimas derivadas do hospedeiro, assim como na
mensuração de produtos da lise celular e de mediadores inflamatórios. Estas novas
técnicas ainda não são utilizadas rotineiramente na clínica já que seu valor
diagnóstico – sensitividade e especificidade - ainda está sendo avaliado, entretanto,
a continuidade do seu estudo é fundamental para o desenvolvimento de novos
instrumentos de diagnóstico da doença periodontal (ARMITAGE et al., 2003).
Diversas fontes de amostras como saliva, fluido e células do sulco gengival,
soro e células sanguíneas, podem ser utilizadas na detecção de marcadores
biológicos da doença periodontal (PAGE, 1992). A saliva é um fluido facilmente
coletado que pode conter marcadores biológicos locais e sistêmicos da doença
periodontal. Os marcadores biológicos encontrados na saliva incluem proteínas e
enzimas do hospedeiro, marcadores fenotípicos, células do hospedeiro, hormônios,
bactérias, produtos bacterianos, compostos voláteis e íons (KAUFMAN e LAMSTER,
2000).
O óxido nítrico (NO) também tem sido proposto como um potencial marcador
biológico da doença periodontal (BATISTA et al, 2002). Ele é um gás com um elétron
não pareado, sendo, portanto, um radical livre que é capaz de reagir com diversas
moléculas biológicas. Na década de 80 o NO ficou conhecido como potente “fator de
relaxamento endotelial”, e inúmeras funções biológicas já foram atribuídas a este
composto na literatura (MONCADA, PALMAR e HIGGS, 1991).
18
O NO é sintetizado a partir da L-arginina por uma família de coenzimas
chamadas NO-sintases (JENKINS et al, 1995). Duas das três sintases são
expressadas constitutivamente, e a expressão da terceira é induzida através de
estímulos imunológicos. Como a meia vida do NO é da ordem de segundos,
medições diretas do mesmo são difíceis, mas podem ser feitas com técnicas de
quimioiluminescência. Entretanto, o mais comum é avaliá-lo indiretamente, através
das medidas da conversão da L-arginina radiomarcada em L-citrulina (BREDT e
SNYDER, 1990), ou medindo o acúmulo de nitrato (NO3) e nitrito (NO2) (GREEN et
al, 1982).
Os estímulos inflamatórios existentes na doença periodontal também são
capazes de induzir a formação do NO e há relatos na literatura de que o mesmo
possa atuar interferindo na progressão da periodontite (MATEJKA, et al., 1998;
RAUSCH-FAN e MATEJKA, 2001; KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001). No
osso, assim como em outros tecidos, a produção de NO pode ser estimulada pelos
lipopolisacarídeos (LPS) bacterianos (VAN’T HOF e RALSTON, 2001; KIM et al
2004).
Matejka et al. (1998) estudaram diferentes mediadores pró-inflamatórios,
entre eles as prostaglandinas e o óxido nítrico, em tecido gengival de pacientes
portadores de doença periodontal crônica moderada e observaram que a
concentração de prostaglandina, L-arginina e L-citrulina estava significativamente
elevada nestes indivíduos. Daghigh et al. (2002) e Hirose at al. (2001) demonstraram
que fibroblastos gengivais coletados de portadores de periodontite crônica
apresentam uma expressão significativamente maior de NOs do que aqueles obtidos
de tecidos gengivais sadios. No entanto, mais estudos são necessários para
19
aumentar a compreensão do efeito do NO na etiologia e na progressão da doença
periodontal, bem como seu uso como um potencial marcador biológico.
Assim, o objetivo do presente estudo é mensurar a concentração de NO na
saliva de indivíduos portadores de doença periodontal crônica generalizada e em
indivíduos sem periodontite. Pretende-se verificar se esta mensuração pode ser
utilizada como parâmetro auxiliar no diagnóstico diferencial entre as formas
moderada e avançada da doença e avaliar a existência de uma possível correlação
entre parâmetros clínicos periodontais e os níveis de NO na saliva dos indivíduos
avaliados. Desta maneira espera-se determinar se a avaliação do NO na saliva
apresenta potencial para ser utilizada como um marcador biológico da doença
periodontal contribuindo assim para a obtenção de um diagnóstico preciso da
doença na elaboração de programas preventivos e terapêuticos.
20
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Doença Periodontal - Mecanismos Celulares e Moleculares
O periodonto abrange os tecidos que recobrem e suportam os dentes: a
gengiva, livre e inserida; o cemento, que cobre a superfície radicular de cada dente;
o ligamento periodontal, que liga a superfície radicular do dente ao processo ósseo
alveolar adjacente (COHEN e SLAVKIN, 2002). As principais funções do periodonto
são a inserção do dente no tecido ósseo dos maxilares e a manutenção da
integridade da superfície da mucosa mastigatória da cavidade bucal (LINDHE,
KARRING, LANG, 1999).
O início e a evolução da doença periodontal (DP) depende de inúmeros
fatores que modificam e interferem na expressão da mesma. Para KORNMAN
(1996),
a
patogênese
da
DP
envolve
os
seguintes
fatores:
bactérias
periodontopatogênicas, quantidade de placa bacteriana e tipos de bactérias
encontradas na placa; fatores genéticos e ambientais e a reposta imune do
hospedeiro.
A DP se apresenta inicialmente como uma gengivite induzida pela presença
da placa bacteriana, caracterizada pela inflamação da porção marginal da gengiva.
Esta gengivite apresenta caráter reversível e pode ou não progredir para uma
periodontite, que é uma alteração inflamatória destrutiva que afeta os tecidos de
sustentação dos dentes, levando à formação de bolsa periodontal pela perda de
inserção (McCLANAHAN et al., 2001).
21
Neste contexto, Page e Schroeder (1976) consideram que a degradação das
fibras conjuntivas, seguida por uma migração apical do epitélio juncional e por
reabsorção óssea, a fronteira entre a gengivite e a periodontite.
A forma mais prevalente de periodontite é a periodontite crônica. Essa doença
está diretamente associada ao acúmulo de placa e cálculo e apesar de ser mais
prevalente em adultos, também pode ocorrer em crianças. A periodontite crônica é
uma doença infecciosa associada a uma microbiota predominantemente gramnegativa, mas apenas a presença desses patógenos não é suficiente para causar a
mesma. A expressão clínica da doença – extensão e gravidade – depende da
resposta do hospedeiro à virulência dos microorganismos (NEWMAN; TAKEI;
CARRANZA, 2004). A extensão da periodontite crônica é avaliada pela distribuição
da doença nos sítios examinados podendo ser localizada ou generalizada. A
gravidade da periodontite crônica está relacionada com o grau de destruição
tecidual causado pela doença e pode ser descrita como leve, moderada e avançada
(ARMITAGE,1999). Segundo Socransky et al. (1984), a periodontite crônica não é
contínua, podendo progredir em sítios específicos durante surtos de destruição ativa
seguida de períodos de aquiescência e possivelmente reparo. A velocidade da
progressão da doença vai depender da interação de fatores locais, sistêmicos e
ambientais que influenciam o equilíbrio hospedeiro-bactéria.
Estudos prévios relataram que a susceptibilidade do indivíduo para
desenvolver formas avançadas de periodontite não é causada pela ação das
bactérias (FIGUEIREDO e RIBEIRO, 2001) e que a ação desta é necessária, mas
não suficiente para causar a doença em indivíduos susceptíveis (OFFENBACHER,
1996).
22
A literatura tem demonstrado que há uma grande variação na resposta imune
e nas reações inflamatórias de um indivíduo (MOLVIG et al., 1988; POCIOT et al.,
1992; SHAPIRA et al., 1994). Os neutrófilos, seguidos dos monócitos/macrófagos
são as células mais estudadas no processo de destruição tecidual na DP e um
número elevado de neutrófilos tem sido observado em estudos relacionados à
inflamação do tecido periodontal (ATTSTROM e EGELBERG, 1970, KOWASHI et
al., 1979).
Neutrófilos
periféricos
de
pacientes
com
periodontite
crônica
têm
demonstrado hiperatividade destas células usando a produção de radicais livres de
oxigênio como marcadores da atividade celular (GUSTAFSSON e ASMAN (1996);
FREDRIKSSON et al. 1998). Sua hiperatividade é uma das principais teorias para
explicar a destruição tecidual na inflamação crônica. Essas células podem ser
encontradas em três estágios distintos: quiescência – célula em repouso, pode
receber ativação ou pré-ativação; pré-ativação – célula pronta para agir, esperando
mais estímulo antes de ativar resposta oxidativa; e ativação – aumento de cálcio
intracelular (iCa ++) no citosol ativando o sistema oxidativo (FIGUEIREDO e
RIBEIRO 2001). Entre as substâncias capazes de pré-ativar os neutrófilos estão as
citocinas pró-inflamatórias interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8
(IL-8) e o fator de necrose tumoral (TNF). A liberação dessas substâncias ocorre em
resposta a imunoestimuladores como LPS e produtos da degradação tecidual
(HANAZAWA et al., 1985).
2.1.1 Marcadores Biológicos
23
Com o desenvolvimento da biologia celular e molecular, muitas substâncias
existentes no corpo humano vem sendo analisadas. Tem sido demonstrado que
substâncias imunoreativas possuem a habilidade de modular a permeabilidade
microvascular e também estão associados intimamente com a defesa do organismo
contra a doença periodontal. Com o atual conhecimento da resposta do hospedeiro
e da patogênese da doença periodontal, é intuitivo que a inibição farmacológica da
resposta do hospedeiro seja um adjunto ou uma alternativa no tratamento da mesma
(PAQUETTE e WILLIAMS, 2000). Entretanto, apesar desse avanço apresentado nas
últimas décadas na área da periodontia, principalmente com relação à etiopatogenia
das doenças periodontais, o diagnóstico e a classificação destas doenças ainda é
baseado quase inteiramente em métodos clínicos tradicionais (ARMITAGE, 2003).
Baseando-se no indicador de doença periodontal, Jeffcoat (1994) propôs uma
classificação dos métodos de diagnóstico periodontal em quatro grupos: testes
microbiológicos; testes metabólicos; testes de susceptibilidade e medições físicas –
medidas anatômicas de suporte (sondagem e radiografia). Seu estudo relata que as
medições físicas são as mais utilizadas e enfatiza que estas são únicas em sua
capacidade de caracterizar indivíduos pela extensão e gravidade da doença e por
poder medir também progressão.
Segundo Lang e Bragger (1991), a medida do nível de inserção clínica é
considerada um padrão que pode ser utilizado para avaliação da progressão da
doença periodontal uma vez que se aproxima das medidas histológicas do
periodonto. Armitage (1999, 2003) confirma que as medidas de perda de inserção
clínica e profundidade de sondagem feitas com o auxílio de sonda periodontal
calibrada ainda são os métodos de diagnóstico mais empregado. Ressalta, porém, a
grande expectativa com relação à pesquisa de mediadores bioquímicos como
24
marcadores de progressão da DP, incluindo mediadores ou produtos inflamatórios,
enzimas derivadas do hospedeiro ou produtos de destruição tecidual.
Chapple (1997) revela a deficiência dos métodos tradicionais para diagnóstico
periodontal com relação a acurácia, na habilidade em diagnosticar sítios em
atividade, ou que vão entrar em atividade de doença, e sua eficiência em determinar
a condição de sítios que tem história prévia de perda de tecidos de suporte. Enfatiza
a importância de técnicas específicas de diagnóstico, que levariam a uma terapia
voltada para áreas realmente acometidas, evitando sobretratamento.
Para Litsgarten (1986), a evolução do conhecimento em relação às causas da
doença, e dos mecanismos envolvidos no seu desenvolvimento podem ser utilizados
para refinar os métodos de diagnóstico vigentes. As deficiências nas defesas do
hospedeiro, a presença e o aumento de bactérias periodontopatogênicas e a
detecção de determinantes bioquímicos em fluidos do corpo humano podem ser
indicativos de desequilíbrio entre bactéria e hospedeiro.
Williams et al. (1996) revelaram a importância da pesquisa no descobrimento
de novos caminhos para o diagnóstico das doenças periodontais, na determinação
da susceptibilidade do indivíduo para a progressão da DP, assim como da atividade
da doença, da probabilidade de sucesso do tratamento proposto e da recorrência da
doença. Relataram ainda a importância dos estudos na área de mediadores
biológicos relacionados à destruição tecidual que poderiam ser modulados com o
intuito de controlar ou prevenir a progressão da doença periodontal.
Os métodos clínicos comumente utilizados no diagnóstico da DP têm
demonstrado serem mais úteis na indicação da história prévia da doença do que na
atividade da mesma (OZMERIC, 2004). Estudos têm demonstrado que a
determinação dos mediadores inflamatórios em fluidos biológicos são um bom
25
indicador da atividade inflamatória. Os marcadores bioquímicos e imunobiológicos
encontrados na saliva e/ou fluido do sulco gengival podem refletir a extensão da
destruição periodontal e predizer a progressão da mesma (OZMERIC, 2004;
PAQUETT e WILLIAMS, 2000).
Análises de amostras de saliva têm sido sugeridas como de grande potencial
para avaliação de marcadores biológicos devido à facilidade de obtenção das
mesmas, ao baixo custo envolvido, por ser um método não invasivo, que apresenta
potencial
para
diagnóstico
e
monitoramento
da
resposta
a
tratamentos
implementados. Dentre os potenciais marcadores biológicos salivares destacam-se
as enzimas (elastase, amilase, arginase, lisozimas, etc), as proteínas (lactoferrina,
TIMP, VEGF, HGF, fibronectina, etc), as imunoglobulinas (IgA, IgG, IgM) e outras
substâncias (nitrito, PAF, urato, cortisol, etc), revistas por Ozmeric (2004)
recentemente.
2.2. O Óxido Nítrico
Durante muitas décadas o óxido nítrico (NO), ou monóxido de nitrogênio, foi
conhecido apenas por ser um gás poluente e nocivo, produzido pela combustão
interna dos motores, causador das chuvas ácidas e poluição atmosférica, sendo alvo
principalmente do estudo de ambientalistas e químicos (FUKUTO, 1995; BRENNAN,
THOMAS e LANGDON, 2003). O cientista belga Jan Baptista van Helmont (15771644) foi o primeiro a sintetizar o NO laboratorialmente. Em 1772, Joseph Priestley
observou que a putrefação da carne era reduzida quando exposta ao NO. Os efeitos
do NO como agente bactericida foram revistos novamente no princípio da década de
26
1980, entretanto somente em 1987 é que Palmer et al., (1987) e Ignarro et al. (1987)
propuseram que o fator relaxante derivado do endotélio (EDRF) era o radical livre
óxido nítrico, e que o mesmo também desempenhava importante papel no
funcionamento de muitos tecidos e órgãos (BRENNAN, THOMAS, LANGDON,
2003). Ainda hoje, essa é considerada uma das mais importantes descobertas no
campo da fisiologia médica e uma das maiores descobertas do século XX
(MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991).
Apesar dos estudos iniciais se concentrarem no papel do NO na regulação do
tônus vascular, logo foi percebido que essa molécula tinha uma vasta importância
nas ações patológicas e fisiológicas no ser humano, assim sendo o mecanismo de
ação e a bioquímica desse importante modulador biológico foi discutido em mais de
50.000 artigos, desde 1990 (SCHECHTER, 1997; BRENANN, THOMAS e
LANGDON, 2003).
O NO é um gás formado pela combinação de dois dos gases mais freqüentes
na atmosfera: oxigênio e nitrogênio. É uma das menores moléculas mensageiras
biologicamente ativas biossintetizadas por células de mamíferos, com peso
molecular de 30 Da (NATHAN, 1992). Possui um número ímpar de elétrons e é por
definição considerado um radical livre com propriedades paramagnéticas, reagindo
com átomos e outros radicais livres (SZABÓ e THIERMERMANN, 1995). É incolor,
com densidade de 1,04 Kg/m³ relativa à do ar, pouco solúvel em água ou em
substâncias alcalinas, sendo lipofílico e praticamente apolar, o que lhe confere
especial capacidade de difusão pelas membranas (MILLER e GRISHAM, 1995,
PENHA-OLIVEIRA, 1998; KRÖNCKE et al., 1997).
O NO é produzido através das ações sintetizadoras de uma família de
coenzimas chamadas óxido nítrico sintases (NOS) (JENKINS et al., 1995). Essas
27
enzimas deaminam a L-arginina liberando NO, havendo co-produção de L-citrulina
(MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991; NATHAN, 1992) (Fig. 1). Sua produção é
realizada por diversas células (MONCADA e HIGGS, 1993) como macrófagos
derivados de monócitos, macrófagos alveolares e monócitos de sangue periférico
(HUNT e GOLDIN, 1992), neutrófilos (MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991),
linfócitos, hepatócitos, fibroblastos (GRABOWSKI, MACPHERSON e RALSTON,
1996), células da medula óssea e osteoblastos (RIANCHO et al., 1995). Estas
células geralmente são estimuladas quando expostas à endotoxinas bacterianas ou
citocinas inflamatórias como a interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral (TNF) e
interferon gama (IFNγ) (GRABOWSKI, MACPHERSON e RALSTON, 1996; VAN’T
HOFF e RALSTON, 1997).
Sendo uma molécula altamente instável (vida média de 5 a 10 segundos), o
NO reage rapidamente com o oxigênio formando dióxido de nitrogênio e logo em
seguida, nitrato (NO3-) e nitrito (NO2-). Além disso, combina-se com a hemoglobina
para formar metahemoglobina (KRÖNCKE et al, 1997).
Devido à sua rápida meia vida, a mensuração direta do NO é difícil, mas pode
ser realizada por técnicas de quimioluminescência. Entretanto o mais comum é a
mensuração indireta do NO, medindo a conversão da L-arginina radiomarcada em Lcitrulina (BREDT e SNYDER, 1990) ou o acúmulo de NO3 e NO2 em fluidos
biológicos como o plasma, urina e cultura de células (GREEN et al., 1982).
28
L-Arginina + O2
Análogos
da Arginina
(L-NAME
L-NMMA
etc.)
NADPH
FAD
FMN
BH4
NOS
NADP+
NOSi
+
Citocinas
LPS
+
iCa++
NOSe
NOSn
L-Citrulina + NO.
NO3-
NO2-
FIGURA 1 – A via bioquímica L-arginina-óxido nítrico.
Legenda - FAD, flavina adenina dinucleotídeo; FMN, flavina mononucleotídeo; BH4,
tetrahidrobiopterina; NADP, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato; NOSe, NOS
++
endotelial; NOSn, NOS neuronal; NOSi, NOS induzida; iCa , cálcio intracelular; LPS,
lipopolisacarídeo.
FONTE: Ralston, 1997 (adaptação)
2.2.1 Enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS)
Apesar do NO ser uma molécula pequena (30 Da), para sua síntese são
necessárias 17 reações de ligação em uma cadeia de eventos que utiliza a
maquinaria de cerca de 300 kDa das enzimas NOS. Já foram identificadas três
diferentes isoformas da NOS, que são hemeproteínas e possuem significativa
homologia com a enzima citocromo P-450 redudase na seqüência C-terminal
(BREDT et al., 1991; LOWENSTEIN e SNYDER, 1992; MARLETTA, 1994;
KNOWLES e MONCADA, 1994).
As NOS podem ser divididas em dois grandes grupos. O primeiro grupo de
enzimas é formado pelas isoformas constitutivas (NOSc), que produzem
29
continuamente quantidades nanomolares de NO e compreende a enzima endotelial
(NOSe) (LAMAS et al., 1992) e a enzima neuronal (NOSn). A ativação dessas
enzimas depende de cálcio/calmodulina e requer fosfato de nicotinamida adenina
dinucleotídeo (NADPH), tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina mononucleotídeo
(FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD) como cofatores. A ativação ocorre
principalmente por intermédio de mediadores, como acetilcolina e bradicinina, que
mobilizam cálcio para o citosol das células. As NOSc existem na membrana das
células endoteliais e no citosol dos neurônios, tanto central quanto perifericamente.
(BRET e SNYDER, 1994). Quando ativadas essas células produzem, por curtos
períodos de tempo, o NO que de maneira geral mediará processos fisiológicos vitais,
como a vasodilatação e a neurotransmissão (MONCADA, PALMER e HIGGS, 1991).
O segundo grupo de enzimas compreende a isoforma induzida (NOSi), que
libera quantidades micromolares de NO e é expressa transitoriamente após ativação
imune/inflamatória ou por citocinas. As NOSi não são encontradas em células não
estimuladas (NATHAN e XIE, 1994) já que sua síntese requer indução. A indução da
expressão de NOSi pode se dar por meio de estímulos antigênicos e inflamatórios,
de endotoxinas (como LPS) e certas citocinas (IL-1, TNF e IFN-γ), que podem agir
individualmente ou em conjunto. A enzima NOSi é citosólica e cálcio-independente,
porém requer NADPH, BH4, FAD e FMN como cofatores de ativação, como as
outras isoformas (MORRIS e BILLIAR, 1994).
A enzima NOSi é induzida como uma primeira linha de defesa, mediando a
citotoxicidade não-específica de macrófagos contra patógenos e células tumorais,
também regulando respostas específicas mediadas por células, suprimindo a
proliferação alogênica e mitogênica de linfócitos T (HOEY et al., 1997). Ela é
responsável direta pela atividade anti-microbiana e anti-parasitária dos macrófagos
30
já que a produção de NO, que se segue à indução de NOSi em macrófagos
ativados, é responsável pelos efeitos citotóxicos e/ou citostáticos desses fagócitos
(SZABÓ e THIEMERMANN, 1995). Estas células também usam o NO para ações
anti-virais (CROEN, 1993; KARUPIAH et al., 1993). Entretanto, uma grande
quantidade de NO pode lesar os tecidos circunjacentes, direta ou indiretamente,
através da geração de produtos de oxidação como o peroxinitrito ou o íon hidroxila
(HOEY et al., 1997).
Além do macrófago, diversos outros tipos celulares também expressam NOSi
quando estimulados. (LOWENSTEIN et al., 1992). Dentre eles pode-se citar os
leucócitos mono- e polimorfonucleares (KIRK et al., 1990; CARRERAS et al., 1994;
DEL POZO et al., 1997), fibroblastos (WERNER_FELMAYER et al., 1990),
hepatócitos (FREESWICK et al.,1994), células de músculo liso vascular (BUSSE e
MULSCH, 1990), condrócitos (CHARLES et al., 1993), miócitos cardíacos, células
das ilhotas pancreáticas (LAYCHOCK el al., 1991), pneumócitos (ROBBINS et al.,
1994), plaquetas, células mesangiais (KUNZ et al., 1994), micróglia e neurônios
(KOPROWSKI et al., 1993), megacariócitos, células de Kupfer, celulas endo- e
epiteliais (SZABÓ e THIEMERMANN, 1995).
Por outro lado, citocinas como interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10),
interleucina-13 (IL-13) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) inibem
a indução de NOSi em certos tipos de células (NUSSLER e BILLIAR, 1993;
KNOWLES e MONCADA, 1994). Glicocorticóides também inibem a indução da
NOSi, mas não a ação da mesma na maioria dos tipos celulares (MONCADA, 1992;
KNOWLES e MONCADA, 1994). Além dessas substâncias, as enzimas NOS
também são inibidas por análogos da L-arginina, derivados do imidazol e indazol
31
heme-ligantes, antagonistas da calmodulina e inibidores de flavoproteínas (JUN e
WENNMALM, 1994; FUKUTO e CHAUDURI, 1995).
Em relação à auto-regulação da síntese de NO, estudos confirmam que
elementos que dão origem ao NO promovem inibição de funções dos neutrófilos
humanos, sugerindo que o NO produzido por eles agiria como um mecanismo de
“feedback” negativo frente aos próprios neutrófilos, tentando limitar o processo
inflamatório (MOILANEN et al.,1993). Segundo Assreuy et al., (1993), a desativação
da NOSi nos macrófagos não se deve à falta de substrato ou de cofatores para a
enzima, ou mesmo a alguma substância inibitória presente nos sobrenadantes, mas
ao fato de que o próprio NO liberado pela NOSi tem capacidade de inibir a enzima,
ou seja, uma inibição pelo produto.
2.2.2 Propriedades Citotóxicas do Óxido Nítrico
O NO é citostático ou citotóxico tanto para células eucariotas quanto para
células procariotas (FREEMAN, 1994). Apesar do NO existir na forma de um gás,
suas reações, sob condições biológicas, ocorrem em solução.
O NO pode ser produzido por uma célula e agir localmente em outras células
(SOUTHAM e GARTHWAITE, 1991). A interação mais significativa do NO envolve
oxigênio molecular, radical superóxido (O2-) e metais como o cobre, o ferro e
manganês, que são geralmente ligados a uma proteína. O NO atua sobre essas
metalo-proteínas ativando-as ou interferindo em suas ações, seqüestrando o metal
nos sítios de ativação.
Danos graves mediados pela ação do NO sobre o ácido desoxirribonucléico
(DNA) também podem desencadear a morte celular através de necrose ou
32
apoptose. A necrose vai resultar em lise da célula, extravasamento dos
componentes celulares e inflamação. A apoptose vai resultar em fragmentação do
DNA e condensação dos componentes celulares, que serão fagocitados e não
extravasados (KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001).
Segundo Patel et al. (1999), o NO também pode reagir com outras
biomoléculas intra e extracelulares, formando componentes citotóxicos. As reações
do NO levam à oxidação, nitração (adição de NO2), nitrosação (adição de NO+) e
nitrosilação (NO) da maioria das biomoléculas.
O peroxinitrito resultante da reação equimolar de NO e O2- é capaz de levar à
oxidação ou nitração de diversas biomoléculas resultando os produtos finais, nitrito e
nitrato, que são excretados na urina. Diversos pesquisadores têm sugerido que o
peroxinitrito, devido à sua capacidade de oxidar diretamente grupos sulfidril e bases
de DNA, catalisar a peroxidação de membranas lipídicas sem ferro e reagir com
metaloporeínas ou metais para formar o íon tóxico nitronio (NO2-), deve ser mais
importante em mediar a citotoxicidade do que o NO (MILLER e BRITIGAN, 1997;
SZABÓ e OHSHIMA, 1997; PATEL et al., 1999). Contudo, para que o efeito final
destas interações seja de toxicidade, depende ainda das condições do meio interno
da célula e do nível da concentração de NO gerada (KENDALL, MARSHALL e
BARTOLD, 2001).
2.2.3 Propriedades Citoprotetoras do Óxido Nítrico
Apesar da capacidade citotóxica do NO de agir, ele também pode exercer um
efeito protetor antioxidante devido à sua habilidade de seqüestrar o radical
superóxido (MILES et al., 1996). O papel citoprotetor do NO ainda não está
33
totalmente claro. Grisham et al. (1999) categorizaram as interações do NO como
diretas e indiretas. As interações diretas com moléculas biológicas ocorrem sob
condições fisiológicas normais e baixa produção de NO, enquanto as interações
indiretas são aquelas mediadas pelos intermediários derivados pelo NO, que
predominam durante o processo inflamatório.
Wallace e Tigley (1995) citam diversas evidências implicando o NO como um
mediador de defesa das mucosas por um variado mecanismo incluindo manutenção
do fluxo sanguíneo e interações com a expressão das prostaglandinas. As
prostaglandinas são mediadores críticos da inflamação, e como o NO, apresentam
ações citoprotetoras. A literatura relata haver uma possível regulação recíproca
entre a expressão da cicloxigenase (COX) e a do NO (SALVEMINI et al., 1993), e
que na periodontite a COX deve ser induzida pelas endotoxinas bacterianas, pelas
citocinas proinflamatórias e provavelmente pelo óxido nítrico e/ou pelo peroxinitrito
(LOHINAI; STACHLEWITZ; SZÉKELY et al., 2001).
Estudos indicam que a baixa produção de NO direta ou transitória, exerce
função
homeostática/regulatória
e
anti-inflamatória.
No
entanto,
condições
fisiológicas alteradas, como as que ocorrem durante a inflamação, podem resultar no
aumento da NOSi e da produção de NO, e em reações pró-inflamatórias indiretas. É
evidente que as ações do NO também são comandadas pelo ambiente intra e
extracelular das células alvo e geradoras (KENDALL, MARSHALL e BARTOLD,
2001).
34
2.2.4 Propriedades Anti/Pró-inflamatórias e Antiinfecciosas do Óxido Nítrico
Devido à duplicidade das suas propriedades, ora benéficas ora deletérias
(GRANGER et al., 1990; GREEN et al., 1990; LIEW et al., 1991), o NO tem sido,
geral e figurativamente, descrito como uma “faca de dois gumes” (MONCADA et al.,
1991; CHENSUE et al., 1994; SCHIMIDT e WALTER, 1994), principalmente em
processos infecciosos ou inflamatórios. Inúmeros trabalhos têm demonstrado que o
NO é uma molécula versátil e fundamental nos processos inflamatórios agudos e
crônicos e nos mecanismos de defesa do hospedeiro. A ampla expressão de NOSi
que ocorre em inflamações e infecções tem sido bem caracterizada e aceita como
um componente vital da resposta adaptativa do hospedeiro aos estímulos nocivos e
patógenos (LIEW e COX, 1991). Contudo existem evidências de que a indução de
NOSi, em algumas condições fisiopatológicas, seja parte de uma ativação imune
descontrolada e deletéria, já que a inibição de NOS pode exercer efeitos protetores
nessas condições.
O papel da formação aumentada de NO tem sido investigado e discutido na
insuficiência
circulatória
associada
com
o
choque
endotóxico
e
séptico
(THIEMERMANN, 1994; SZABÓ e THIEMERMANN, 1994), na artrite reumatóide e
osteoartrite (FARRELL et al, 1992; IALENTI et al., 1992) e na doença intestinal
crônica (MILLER et al., 1993)
Diversos estudos também abordam o envolvimento de TNF-α, IFN-γ e IL-2 na
indução de NOSi em vários modelos animais de infecção. Assim, em um modelo
murino de choque causado por Pseudomonas aeruginosa, um anticorpo monoclonal
anti-TNF inibiu acentuadamente o aumento de níveis plasmáticos de nitrito/nitrato
(SHI et al., 1993). Em macrófagos peritoneais obtidos de camundongos tratados
35
com o bacilo Calmette-Guérin (BCG) de Mycobacterium bovis, TNF-α também
suprimiu a produção de nitrito (GREEN et al., 1993). Em vários órgãos de
camundongos submetidos a endotoxinas, TNF-α e um anticorpo policlonal contra IL1 inibiram a indução de NOSi (CUNHA et al., 1994). A neutralização de INF-γ com
anticorpos monoclonais bloqueia a indução de NOSi no fígado de camundongos
com infecção por Gram-negativos (EVANS et al., 1992) e em macrófagos peritoneais
de camundongos tratados com BCG (GREEN et al., 1993). Além disso, macrófagos
peritoneais obtidos de camundongos ou deficientes para o receptor de IFN-γ ou com
genes defeituosos para o INF-γ não produzem NO sob estímulo com endotoxina
(HUANG et al., 1993; DALTON et al., 1993).
Sob o ponto de vista celular, o NO exerce efeitos variados sobre a função
leucocitária, incluindo, mas não se limitando, a indução de apoptose (ALBINA et al.,
1993), o estímulo da motilidade citoplasmática em macrófagos (FUKUSHIMA et al.,
1995), a modulação da adesão neutrofílica (KUBES et al., 1991) e a regulação
diferencial da síntese de citocinas pelos leucócitos (LIEW, 1995). Como a atividade
da NOS é vital para a produção de NO, a análise dessa atividade se faz
extremamente importante e o uso de inibidores da NOS é um recurso bastante
utilizado.
2.2.5 Óxido Nítrico e a Destruição Tecidual
Os mais citados mediadores da destruição tecidual na periodontite são a IL1ß, o TNF-α, a prostaglandina-2 (PGE2) (PAGE, 1991) e a cicloxigenase-2 (COX-2)
(LOHINAI et al. 2001). A IL-1 induz a co-expressão tanto da NOSi quanto a isoforma
36
da cicloxigenase induzida, a COX-2 (CORBETT et al., 1993). Entretanto a autoregulação da COX-2 pelo NO deve ser dependente da expressão da NOSi, já que o
NO endógeno parece inibir a produção da COX-2 (STADLER et al.,1993). A
prolongada produção de mediadores pró-inflamatórios resultam no aumento da
produção do NO e na estimulação da COX-2 resultando na síntese da PGE2. A
resposta inflamatória é autolimitante, entretanto, quando a inflamação está
desregulada ou quando os fatores causais persistem, como no caso da doença
periodontal, ela pode levar a uma perda tecidual excessiva.
A destruição dos tecidos moles é causada principalmente por enzimas do
hospedeiro como a plasmina e as metaloproteinases (MMPs) (BIRKEDAL-HANSEN
et al., 1993). Os radicais livres são ativos na despolimerização de componentes da
matriz extracelular, na peroxidação de lipídios, na oxidação de enzimas como as
antiproteases, na alteração do DNA e na indução de citocinas pró-inflamatórias
(CHAPPLE, 1997). A ativação de neutrófilos pró-colagenase (MMP-8) pelos
derivados intermediários do NO, peroxinitito e dióxido de nitrogênio, deve ser o
mecanismo pelo qual a produção de radicais livres deve contribuir para o início
precoce da perda de colágeno nas lesões gengivais (OKAMOTO et al., 1997). Em
estudos com animais o NO tem potencializado a degradação da matriz, a supressão
da síntese de proteoglicanas e colágeno, assim como a super-regulação da
atividade das metaloproteinases (TASKIRAN et al., 1994; MURRELL et al., 1995).
Assim como em modelos animais, a produção de NO nos fibroblastos do
tecido gengival de seres humanos vai ser exacerbada nos processos inflamatórios
(DAGHIGH et al. 2002). A elevada indução de NOSi pelos fibroblastos gengivais vai
resultar no comprometimento do processo de cicatrização e contribuir para o
desequilíbrio entre destruição tecidual sobre o reparo tecidual, que é característico
37
na periodontite (KENDALL et al. 2000; KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001;
GUTIERREZ-VENEGAS et al., 2005).
As interações entre célula-célula, célula-matriz e moléculas bioativas são
complexas. A homeostase é mantida pelo equilíbrio entre a morte celular e o
crescimento celular e o NO pode induzir a paralisação desse crescimento ou mesmo
a apoptose, logo, é provável que alterações no ambiente intracelular como os que
ocorrem durante os processos de inflamação devem resultar em alterações na
concentração do NO e na indução da expressão do NOSi pelos fibroblastos
(KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001).
Também há evidências de que o NO é uma molécula reguladora importante
do tecido ósseo e com múltiplas funções metabólicas, como a fisiologia, a resposta
ao estrógeno, a dinâmica mecânica e com as citocinas. (RALSTON, 1997). A
remodelação óssea é um processo de equilíbrio, caracterizado por episódios de
formação óssea, mediado pelos osteoblastos, e episódios de reabsorção óssea,
mediado pelos osteoclastos. Tanto osteoclastos quanto osteoblastos produzem e
respondem ao NO (RALSTON et al., 1994; BRANDI et al., 1995).
O NO é um regulador parócrino e autócrino do metabolismo ósseo e o NO
gerado pelos osteoblastos agem tanto sobre os osteoblastos quanto sobre os
osteoclastos durante a remodelação (BRANDI et al, 1995; CHAE et al.,1997;
DAMOULIS e HAUSCHKA, 1997). O NO em altas concentrações suprime a
formação de osteoclastos e a atividade de osteoclastos maduros, inibindo a
reabsorção óssea, enquanto baixa concentração de NO é necessária para a
regulação da atividade dos osteoclastos. (MacINTYRE et al., 1991; BRANDI et al.,
1995; RALSTON et al., 1995). As interações do NO com os radicais livres, gerados
pelas citocinas e ou macrófagos ativados pelo LPS também são significantes para a
38
função dos osteoclastos, como o superóxido e o peróxido de hidrogênio estimulando
a reabsorção óssea (GARRETT et al, 1990).
A produção de NOSi gerada pelas citocinas e pelo LPS tem sido determinante
na inibição do crescimento e na diferenciação dos osteoblastos (RALSTON, 1994),
sendo que altas concentrações induzem apoptose. (DAUMOULIS e HAUSCHKA,
1997). A periodontite e a artrite reumática são doenças inflamatórias crônicas que
resultam em perda óssea localizada e destruição tecidual ocasionadas pela ativação
das citocinas inflamatórias e de mediadores como o TNF-α, a IL-1 e as
prostaglandinas. A indução do NOSi no tecido ósseo ocorre durante a inflamação
(FOX e CHOW, 1998), e é provável que o NO e as prostaglandinas atuem juntas
inibindo a expressão do fenótipo osteoblástico, estimulando a reabsorção óssea
(HUGHES et al., 1999; RALSTON, 1997). Segundo Kendall et al., 2001, um
processo inflamatório persistente e a produção de NOSi induzida pelas citocinas
resultam no desequilíbrio entre formação e reabsorção do tecido ósseo.
2.2.6 Participação do Óxido Nítrico nas Doenças Periodontais
Considerando a enorme quantidade de artigos publicados sobre o NO, há
relativamente poucos estudos que abordam o papel desta molécula nas doenças
bucais, sendo que a sua maioria contempla a patogênese e a biologia tumoral do
câncer bucal. Os trabalhos que abordam a participação do NO na doença
periodontal em sua maioria citam o aumento da síntese do NO como resultado da
infiltração dos macrófagos nos tecidos periodontais (PAQUETTE e WILLIAMS, 2000;
BRENANN, THOMAS E LANGDON, 2003).
39
No ligamento periodontal de incisivos de ratos, a distribuição positiva de
NADPH-diaforase pelas células coincide com a expressão de NOSi (ICHIKAWA e
SUGIMOTO, 1998). No sistema nervoso periférico, particularmente nos vasos
sanguíneos, no sistema nervoso entérico e nas vias aéreas, é provável que o NO
atue como um co-transmissor assim como um neuromodulador inibindo outros
processos de transmissão (LINCOLN et al., 1997). Isto indica que as formas
constitutivas do NOS são necessárias para o desenvolvimento das funções normais
e que estão envolvidas na percepção da dor, na inervação do periodonto, na
manutenção do fluxo sanguíneo e na modulação da resposta inflamatória.
Nas lesões periodontais sabe-se que quantidades consideráveis de NO
devem ser geradas principalmente por macrófagos, PMNs, linfócitos e fibroblastos
induzidos pelas citocinas e pelos LPS (BRENANN, THOMAS E LANGDON, 2003).
Bactérias periodontopatogênicas são capazes de provocar a produção de NO em
macrófagos de cobaias (BLIX e HELGELAND, 1998; FROLOV et al., 1998; ROSEN
ET AL., 1999). O LPS de Prevotella intermedia, uma importante bactéria
periodontopatogênica, induziu a produção de NO através da indução de NOSi em
cultura de macrófagos RAW264.7 (KIM et al. 2004).
Apesar da produção de NO ter um papel primário bactericida, é provável que
essa produção em altas concentrações resultem em danos aos tecidos periodontais
do hospedeiro (BRENANN, THOMAS E LANGDON, 2003). Ratos que não possuem
a NOSi quando expostos à bactéria Porphyromonas gingivalis apresentaram
infecções mais significativas do que ratos normais, sugerindo que o NO é um
elemento importante na defesa do hospedeiro contra este microorganismo
(GYURKO et al. 2003). O mesmo grupo demonstrou ainda que a NOSi promove
reabsorção óssea durante o desenvolvimento ósseo assim como após infecção
40
bacteriana por Porphyromonas gingivalis, e que o NOSi é uma importante molécula
sinalizadora na diferenciação osteoclástica normal (GYURKO et al. 2005).
Matejka et al. (1998) descreveram um aumento significativo nos níveis de Larginina e L-citrulina em amostras de tecidos gengivais inflamados humanos quando
comparados a um controle. Citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, IL-1β, estão
aptas a super-regular a produção de PGE2 e das metaloproteínas pela ativação de
macrófagos e fibroblastos e são citados como mediadores críticos da destruição
tecidual na periodontite (BIRKEDAL-HANSEN et al, 1993; LAPPIN et al., 2000). Já
que os LPS e as citocinas produzidas pelas células inflamatórias, como o TNF-α, IL1β e INF-γ, promovem a produção de NOSi em quantidades significativas, a
produção subseqüente de NO deve contribuir para o desequilíbrio da resposta
inflamatória na periodontite e na destruição tecidual associada (SALVI e LANG,
2005).
Lohinai et al. (1998, 2001) levantam a hipótese de que é provável que as
bactérias patogênicas da placa bacteriana sejam responsáveis pela ativação da
NOSi, já que nenhuma atividade de NOSi é encontrada no tecido gengival de
animais estéreis. Diversos estudos têm demonstrado que fibroblastos gengivais em
periodontite crônica, quando comparados com tecido gengival saudável, tem um
aumento significativo na expressão de NOSi (KENDALL et al. 2000; HIROSE et al.
2001; DAGHIGH et al. 2002). O NO deve influenciar tanto na patogênese da
periodontite quanto na perda óssea, seja direta ou indiretamente, através da
modulação da produção de outras citocinas pró-inflamatórias (LOHINAI et al. 2001).
Um estudo in vitro mostrou que inibidores da NOSi reduziram a produção de
fibroblastos gengivais, e foi postulado que a inibição farmacológica do NO poderia
ser de grande valor no tratamento da doença periodontal (DAGHIGHI et al. 2002). A
41
inibição da NOSi com isosorbida previne a reabsorção óssea alveolar na periodontite
induzida em ratos (LEITÃO et al. 2004, 2005).
Lohinai et al. (1997, 1998) avaliando a periodontite induzida em ratos,
detectaram a expressão de NOSi nas células inflamatórias e na camada basal do
epitélio gengival. O tratamento de ratos com periodontite induzida, pela
administração de mercaptoetilguanidina (MEG) (30mg/Kg, intraperitoneal, quatro
vezes ao dia, por 8 dias), um inibidor seletivo de NOSi, resultou em uma significativa
diminuição na reabsorção óssea quando comparado ao grupo controle (LOHINAI,
1998). Para Szabó et al. (1997) estes efeitos protetores podem ser atribuídos à
habilidade do MEG de agir como um radical livre de oxigênio, como um seqüestrador
de peroxinitrito bem como um inibidor da atividade da cicloxigenase. O uso de
inibidores seletivos de NOSi tem mostrado efeitos benéficos no caso de artrites,
choques e inflamação (KENDALL, MARSHALL e BARTOLD, 2001).
Outros autores sugerem o uso de outro inibidor da NOS, a aminoguanidina,
usando o mesmo modelo de periodontite induzida por ligadura em ratos. Observouse também uma redução nos parâmetros inflamatórios, sugerindo que este inibidor
da NOS reduz a produção de NO e o stress oxidativo (DI PAOLA et al. 2004). O
mesmo grupo testou ainda outra substância, semelhante à dismutase superóxida, o
M40403, que remove anions superóxidos sem interferir em outras repostas
inflamatórias, observando uma redução dos níveis da inflamação (DI PAOLA et al.
2005).
As propriedades da tetraciclina relacionadas à sua habilidade de inibir as
MMPs e seu potencial terapêutico são de considerável interesse no tratamento das
doenças inflamatórias crônicas (GOLUB et al.,1984;1991). A ação da tetraciclina
sobre as MMPs se deve tanto à inibição direta da atividade enzimática quanto à
42
inibição da produção da NOSi que é conhecida por potencializar a atividade da MMP
(MURRELL et al.,1995). A modulação racional da atividade da MMP nas desordens
crônicas inflamatórias tem sido desenvolvida no tratamento da doença periodontal
associando baixas doses de tetraciclina ao tratamento mecânico (GOLUB et al.,
1997).
A análise imunohistoquímica de pacientes com gengivite e periodontite
crônica revelou um aumento das células coradas para iNOS quando comparadas
aos indivíduos do grupo controle. As células mais imunoreativas foram as células
polimorfonucleares (PMN), que, além de atuarem no mecanismo de defesa através
do sistema imune, com a produção de enzimas, citocinas e fatores de crescimento,
estão provavelmente envolvidas na patogênese da doença periodontal via produção
de óxido nítrico (BATISTA et al., 2002). Resultados semelhantes foram observados
por CHEN et al. (2000), que obervaram aumento de NOS e de endotelina em tecido
gengival de 20 pacientes com periodontite crônica, comparados a um grupo controle.
O trabalho de Carossa et al. (2001), demonstrou um aumento na produção de
óxido nítrico bucal durante o início da deposição da placa dental. Este aumento
ocorre provavelmente devido à super-regulação da expressão da NOSi pelas células
gengivais, induzidas não só pela proliferação bacteriana, mas também através da
produção de citocinas estimulada pela placa bacteriana (RAUSCH-FAN e MATEJKA,
2001).
A arginase é uma enzima que parece estar envolvida no metabolismo do NO,
já que compete pelo mesmo substrato deste, a L-Arginina. Sabendo-se que a Larginina é determinante na síntese do NOS, a arginase atuaria diminuindo a
produção do NO através da competição pelo mesmo substrato (ÖZMERIÇ, ELGÜN
e URAZ, 2000). Um artigo recente comparou os níveis de NOSi e de arginase em
43
biópsias de pacientes submetidos à tratamento periodontal por curetagem ou
cirurgia com retalho de Widman modificado (GULLU et al., 2005). Os autores
observaram que após 2 meses de tratamento houve uma diminuição dos níveis de
expressão da NOS, e um aumento dos níveis da enzima arginase.
Até a presente data, foram encontrados poucos artigos avaliando o NO ou
componentes de sua via bioquímica na saliva. Özmeriç, Elgün e Uraz (2000)
avaliaram a presença de arginase na saliva. A arginase é uma enzima depletora de
arginina, pertencente ao complexo L-arginina/óxido nítrico, responsável pela síntese
das poliaminas que são encontradas na saliva e que são fundamentais para a
nutrição de diversas bactérias bucais. Os autores observaram um aumento da
atividade da arginase em pacientes com periodontite comparados com indivíduos
saudáveis. Contudo a atividade da arginase não parece ser um bom marcador
biológico, pois não pôde ser correlacionada com os parâmetros clínicos de
periodontite (ÖZMERIÇ, ELGÜN E URAZ, 2000; ÖZMERIÇ, 2004).
Encontramos apenas dois artigos que utilizaram o método de Griess para
análises da concentração de nitrito na saliva, e com resultados conflitantes. Um dos
artigos descreve um aumento significativo da concentração do nitrito na saliva de
indivíduos portadores de doença periodontal quando comparado ao grupo controle
(CHEN e SUN, 1999). A outra análise salivar foi realizada por Aurer et al. (2001), e
seus resultados mostraram grande variabilidade, mas com tendência de uma
diminuição nos níveis de nitrito nos pacientes com doença periodontal crônica e
agressiva, quando comparados ao grupo controle.
44
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
•
Determinar se a mensuração da concentração de óxido nítrico na
saliva pode ser utilizada como método auxiliar de diagnóstico da
doença periodontal crônica generalizada.
3.2. Objetivos Específicos
•
Medir indiretamente os níveis de óxido nítrico por meio da mensuração
da concentração de nitrito na saliva de indivíduos sem periodontite e de
indivíduos portadores de doença periodontal crônica generalizada.
•
Determinar se a mensuração da concentração de óxido nítrico na
saliva pode ser utilizada como parâmetro auxiliar no diagnóstico
diferencial entre as formas moderada e avançada da doença
periodontal crônica generalizada.
•
Determinar se existe correlação entre os parâmetros clínicos de
diagnóstico da doença periodontal e os níveis de óxido nítrico
mensurados na saliva.
45
4. HIPÓTESES
•
A mensuração indireta da concentração de óxido nítrico na saliva é
utilizada como método auxiliar no diagnóstico da doença periodontal
crônica generalizada.
•
Diferenças entre os níveis de óxido nítrico na saliva de indivíduos
portadores de doença periodontal crônica generalizada são utilizados
como parâmetro auxiliar no diagnóstico diferencial entre as formas
moderada e avançada da mesma.
•
Existe correlação entre os parâmetros clínicos de diagnóstico da
doença periodontal e os níveis de óxido nítrico na saliva.
46
5. METODOLOGIA
5.1. Seleção da Amostra e Divisão dos Grupos
Para seleção da amostra foram examinados aproximadamente 200 indivíduos
que se apresentaram nas clÍnicas de periodontia da Faculdade de Odontologia da
PUC-Minas. Deste total foram selecionados 30 indivíduos, e estes divididos em 3
grupos. O grupo controle, constituído por 10 indivíduos sem doença periodontal; o
grupo moderada, constituído por 10 indivíduos portadores de doença periodontal
crônica generalizada moderada e o grupo avançada, constituído por 10 indivíduos
portadores de doença periodontal crônica generalizada avançada.
5.1.1 Critérios de Exclusão
Foram excluídos deste estudo os indivíduos que apresentassem pelo menos
uma das seguintes situações:
•
Doenças sistêmicas e outros problemas médicos relevantes, para não
contaminar o método
•
Pacientes imunodeprimidos
•
Tabagismo recente (1 ano)
•
Gravidez
•
Medicamentos de uso contínuo
•
Antibioticoterapia recente (< 3 meses)
•
Traumatismo bucal recente
•
Doenças bucais (além da doença periodontal)
47
5.1.2 Critérios de Inclusão
Indivíduos de ambos os sexos, faixa etária de 20 a 55 anos e grupo racial
heterogêneo participaram do estudo. Os indivíduos sem periodontite foram
selecionados entre os alunos do 4˚ período do curso de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica de Minas Gerais (FO/PUC-Minas) e os pacientes portadores
de doença periodontal que procuraram as clínicas de periodontia da Faculdade de
Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais (FO/PUC-Minas).
Os critérios de inclusão específicos para cada grupo foram:
Grupo Controle
•
Assinatura do termo de consentimento
•
Indivíduos com profundidade de sondagem ≤ 3 mm
•
Presença mínima de 16 dentes na boca
Grupo Moderada (Doença periodontal crônica generalizada moderada)
•
•
•
Ausência de tratamento periodontal por pelo menos 1 ano
•
Pacientes com diagnóstico clínico de doença periodontal crônica generalizada
moderada, baseado nos critérios da American Academy of Periodontology
(AAP) (AAP 2000 a e b):
48
o Pelo menos quatro dentes examinados (30%) com profundidade de
sondagem de 4 a 6 mm e perda de inserção até 4 mm.
Grupo Avançada (Doença periodontal crônica generalizada avançada)
•
•
•
Ausência de tratamento periodontal por pelo menos 1 ano
•
Pacientes com diagnóstico clínico de doença periodontal crônica generalizada
avançada, baseado nos critérios da AAP (AAP 2000 a e b):
o Pelo menos quatro dentes examinados (30%) com profundidade de
sondagem ≥ 7 mm e perda de inserção maior que 4 mm.
5.2 Consentimento para a Pesquisa
Os procedimentos realizados nesta pesquisa obedeceram à resolução do
Conselho Nacional de Saúde (CNS) e foram aprovados, pelo Comitê de Ética e
Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas
Gerais (anexo 1).
Para que a pesquisa pudesse ser conduzida dentro dos padrões éticos que
regem estudos em humanos, todas as facilidades e meios (gratuidade e acesso
direto às instituições, esclarecimentos sobre a importância e necessidade do
tratamento, possibilidade de abandonar a pesquisa, dentre outros) foram oferecidos
aos indivíduos afetados.
49
O formulário de consentimento foi assinado por todos os participantes do
estudo que, também, receberam por escrito todos os esclarecimentos necessários
para a realização da pesquisa (anexo 2).
5.3 Exame Periodontal
Foram avaliados o sangramento à sondagem, a supuração, a profundidade de
sondagem e a perda de inserção em todos os dentes presentes na cavidade bucal,
com exceção dos 3º molares. Os dados coletados foram registrados em uma ficha
clínica periodontal própria, baseada no modelo padronizado do curso de
especialização em periodontia da Faculdade de Odontologia da Pontifícia
Universidade Católica de Minas Gerais (anexo 3).
O conjunto de instrumental padronizado para o exame incluiu: espelho bucal,
pinça de algodão e sonda periodontal milimetrada modelo Williams (Hu Friedy®).
Todos os procedimentos foram realizados seguindo normas de biosegurança (uso
de paramentação adequada: avental, gorro, óculos de proteção, máscaras e luvas
descartáveis). Os instrumentos clínicos foram esterilizados e acondicionados em
pacotes individuais (COTTONE; THERAZALMY; MOLLINARI, 1991).
5.3.1 Calibração
O exame clínico foi realizado por um único examinador. A calibração prévia foi
realizada e o mesmo submetido ao exame de concordância intra-examinador (Teste
Kappa). O resultado do teste Kappa (concordância entre valores menores e maiores
que 4 mm) foi K=0,86. Em escala ordinal, pelo teste t-Student pareado, a
50
concordância intra-examinador não apresentou diferenças significativas entre os
dois exames utilizados no teste (p<0,001).
5.3.2 Sangramento à sondagem
O sangramento à sondagem é um sinal clínico da presença de um processo
inflamatório no tecido gengival, e este processo pode provocar a atrofia ou a
ulceração do epitélio do sulco gengival ou da bolsa periodontal (NEWMAN; TAKEI;
CARRANZA, 2004).
A leitura clínica dos pontos sangrantes foi realizada no momento da medida
da profundidade de sondagem até 60 segundos após a mesma. A ocorrência de
sangramento foi registrada na ficha clínica, nos campos específicos por superfície
dental (mesial, distal, vestibular e lingual/palatina), de forma dicotômica, para sua
presença (+) ou ausência (-).
5.3.3 Supuração
A leitura clínica das áreas com supuração foi realizada no momento da
medida da profundidade de sondagem e/ou por compressão digital na gengiva. A
ocorrência de supuração foi registrada na ficha clínica, nos campos específicos por
superfície dental (mesial, distal, vestibular e lingual/palatina), de forma dicotômica,
para sua presença (+) ou ausência (-).
5.3.4 Profundidade de sondagem
51
A profundidade clínica do sulco gengival ou da bolsa periodontal é definida
como a distância da margem gengival ao fundo do sulco e/ou bolsa periodontal e é
obtida por meio de uma sonda periodontal (NEWMAN; TAKEI; CARRANZA, 2004).
A mensuração da profundidade de sondagem foi realizada em todos os dentes
presentes com uma sonda periodontal modelo Williams (Hu-Friedy®). As sondagens
na face vestibular dos dentes foram realizadas em três sítios (mesio-vestibular,
vestibular e disto-vestibular), sendo anotado o valor de cada sítio. Uma sondagem
circunferencial foi
realizada
nas
demais
faces
dentais
(mesial,
distal,
e
lingual/palatino) sendo anotado o maior valor como representante de cada
superfície.
5.3.5 Perda de inserção
A perda de inserção é a distância, em milímetros, do limite amelo-cementário
até o fundo do sulco e/ou bolsa gengival, e pode ser um indicativo de história de
doença e do grau de destruição dos tecidos periodontais (LINDHE; KARRING;
LANG, 1999). Foram registrados os valores de perda de inserção em todos os
dentes, através da leitura com sonda milimetrada modelo Williams (Hu-Friedy®),
tendo como base os sítios mesial, distal, vestibular e lingual/palatino.
5.4. Coleta das Amostras de Saliva
Foi solicitado aos participantes do estudo que se abstivessem de ingerir
alimentos e bebidas nas duas horas que precederam à coleta. Os indivíduos
enxaguaram a cavidade bucal com água e em seguida a produção de saliva foi
52
estimulada pela mastigação de 20cm² de filme plástico, aproximadamente 1g,
(Rolopack®) durante 5 minutos. A saliva foi coletada em tubos Falcon de 50 ml,
mantidos em gelo durante e após a coleta. As amostras foram centrifugadas a uma
temperatura de 4ºC, 4.000 rpm, durante 10 minutos (Centra CL3R, IEC) (Fig. 2), e o
sobrenadante foi aliquotado em tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml e congelado a –20oC
até a sua utilização nos experimentos subseqüentes.
FIGURA 2 – Centrífuga refrigerada Centra CL3R, IEC.
53
5.5. Determinação da Concentração de Nitrito
A concentração de nitrito na saliva foi mensurada pelo método colorimétrico
de Griess (GREEN et al, 1982). O reagente de Griess é uma mistura 1:1 de 1% de
sulfanilamida (Reagen) e 0.1% de naftiletilenodiamino-bicloridrato (Vetec) em ácido
ortofosfórico (H3PO4) a 5% (Vetec).
5.5.1 Componentes do Reagente de Griess
Ácido Fosfórico 5%
H3PO4.85% P.A. (Vetec).........................................................................................20ml
Água deionizada Milli-Q.......................................................................................320 ml
Solução l – Sulfanilamida 1% p/v
Sulfanilamida (Reagen)...........................................................................................0,5g
H3PO4.5%...............................................................................................................50ml
Solução II - Naftiletilenodiamino – bicloridrato 0,1% p/v
Naftiletilenodiamino - bicloridrato (Vetec)..............................................................0,05g
H3PO4.5%...............................................................................................................50ml
Deixar as soluções estoque I e II a 4ºC. No momento do ensaio, misturar uma
parte da solução I e uma parte da solução II, formando o reagente de Griess.
54
5.5.1 Montagem da Placa e Leitura Espectofotométrica
As amostras (50µl de saliva) foram transferidas em triplicatas, para uma placa
tipo ELISA de 96 poços. O mesmo volume (50µl) do reagente de Griess foi
adicionado em cada poço (Fig. 3).
FIGURA 3 – Placa de Elisa após a reação de Griess. Amostras utilizadas na
elaboração de uma curva padrão de NaNo2 se encontram nas duas
últimas fileiras.
Após 10 minutos, a densidade óptica (absorbância) foi medida por
espectofotometria em leitor de ELISA (SpectraMax 340, Molecular Devices),
55
utilizando um filtro de 570 nm (Fig. 4). As concentrações de nitrito foram calculadas
a partir de uma curva padrão realizada com uma solução de nitrito de sódio (NaNO2)
em PBS (pH 7,2), expressos em µM. Os valores utilizados para o cálculo da curva
padrão de NaNO2 foram de 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56 e 0,78 µM.
FIGURA 4 – Leitura das amostras teste e padrão.
(Espectofotômetro SpectraMax 340, Molecular Devices)
5.6. Análise Estatística
Os resultados individuais foram analisados em triplicatas, e portanto utilizouse a média destas observações para calcular um valor único para cada indivíduo ou
56
amostra padrão. Para a análise dos grupos estudados, os valores individuais foram
então agrupados, calculando-se a média, o desvio padrão e o intervalo de confiança
(95%). Para comparações entre doença e grupo controle foi utilizado o teste t de
Student, considerando-se significativos os valores de p<0,05. Nas análises descritas
utilizou-se o programa Excel ®.
Para as comparações entre os 3 grupos utilizou-se análise de variância
(ANOVA) usando o teste de correção de Tukey. Valores de p<0,05 foram
considerados significativos, portanto as conclusões apresentam pelo menos 95% de
confiança. O teste de ANOVA foi rodado no programa BioEstat® 3.0.
Foram realizadas correlações (Pearson) entre os diversos parâmetros clínicos
de diagnóstico avaliados, comparado-os com os níveis de nitrito mensurados. Esta
análise foi realizada em todos os indivíduos com doença periodontal, unindo os
grupos moderada e avançada, na tentativa de correlacionar a gravidade da doença
com os níveis de nitrito. Os cálculos de correlação foram realizados usando os
programas Excel ® e BioEstat® 3.0.
57
6. RESULTADOS
6.1. Curva Padrão de NaNO2
Após a plotagem da curva padrão da concentração de NaNO2 (µM) versus
sua densidade óptica (570 nm), calculou-se a linha de tendência para a mesma (Fig.
5). Quanto mais esta linha coincide com os valores obtidos, mais fiéis serão os
resultados das leituras ópticas. Obteve-se uma ótima linha de tendência (R2=0,99),
já que quando a linha tem o valor de 1, a linha coincide exatamente com os valores
plotados. A equação obtida foi:
y = 28,33x – 2,22
Concentração de Nitrito de Sódio
(microMolar)
Curva Padrão Nitrito de Sódio X Densidade Óptica
120
y = 28,334x - 2,228
2
R = 0,9952
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
Densidade óptica (570 nm)
FIGURA 5 – Curva padrão de amostras pré-determinadas de Nitrito de Sódio.
58
6.2. Grupo Controle X Grupos com Doença Periodontal
As médias, desvio padrão e intervalo de confiança (95%) da concentração de
nitrito na saliva dos indivíduos portadores de doença periodontal e do grupo controle
estão listadas na tabela 1. Para a comparação entre os indivíduos sem periodontite
(grupo controle) e os indivíduos com doença periodontal, os grupos moderada e
avançada foram agrupados. Os valores médios obtidos estão representados em
forma gráfica na figura 6, e foram de 5,86 µM e de 11,79 µM para controle e doença
respectivamente (Figura 6). A análise estatística mostra que existe diferença
altamente significativa entre os grupos (p=0,0024).
TABELA 1
Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal (grupos
moderada e avançada) e de indivíduos do grupo controle (detalhes no anexo 4).
Controle
Doença Periodontal Crônica
n
10
n
20
Média
5,86
Média
11,79
Des. Pad.
±1,58
Des. Pad.
±5,99
I. C. 95%
4,88 – 6,84
I. C. 95%
9,16 – 14,42
Teste ‘t’ de Student (Controle X Doença) - p = 0,0024
Valores de média, desvio padrão (Des. Pad.) e intervalo de confiança (I.C.) expressos em µM.
Concentração
de NO2
59
Concentração de Nitrito na Saliva na
Doença Peridontal Crônica
16,00
*
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
-
Controle
Doença
Periodontal
FIGURA 6 – Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal
(grupos moderada e avançada) e de indivíduos do grupo controle
(Valores expressos em µM, barras de erro ± intervalo de confiança de 95%)
Legenda: * p = 0,0024
6.3. Grupos com Doença Periodontal Crônica Moderada X Avançada
Quando os grupos controle, moderada e avançada são analisados
separadamente, pode-se avaliar melhor se a mensuração de nitrito na saliva é capaz
de diferenciar as formas moderada e avançada da doença periodontal crônica
generalizada (Tabela 2, Figura 7). Ao observarmos a tabela 2, verifica-se que não
houve diferença significativa entre os grupos controle e moderada pela análise de
ANOVA (p > 0,05). Contudo, comparando-se os grupos controle e o grupo
avançada, as diferenças foram altamente significativas (p < 0,01).
60
TABELA 2
Comparação entre os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com
doença periodontal crônica generalizada moderada, avançada e de indivíduos do
grupo controle (detalhes no anexo 5).
Controle
Moderada
Avançada
n
10
n
10
n
10
Média
5,86
Média
7,78
Média
15,79
Des.
Pad.
I. C. 95%
Des.
±1,58
4,88-6,84
Pad.
I. C. 95%
Des.
±3,02
5,91-9,65
Pad.
I. C. 95%
Análise de ANOVA (Tukey): Controle X Moderada
p > 0,05
Controle X Avançada
p < 0,01
Moderada X Avançada
p < 0,01
±5,59
12,33-19,25
Valores de média, desvio padrão (Des. Pad.) e intervalo de confiança (I.C.) expressos em µM.
Ao analisarmos as diferenças entre as duas formas de doença periodontal
crônica, podemos observar que a medida de nitrito na saliva foi capaz de diferenciar
estes grupos (Figura 7). Os valores médios calculados foram de 7,78 µM para o
grupo moderada e 15,79 µM para o grupo avançada, sendo que esta diferença foi
significativa (ANOVA p<0,01).
Concentração
de NO2
61
Concentração de Nitrito na Saliva na
Doença Periodontal Crônica Moderada e Avançada
20,00
18,00
16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
-
Controle
Moderada
Avançada
FIGURA 7 – Concentração de NO2 na saliva de indivíduos dos grupos: controle,
moderada e avançada.
(Valores expressos em µM, barras de erro ± intervalo de confiança de 95%)
Legenda:
Controle X Moderada
p > 0,05
p < 0,01
Moderada X Avançada p < 0,01
6.4. Correlação entre os Parâmetros Clínicos e as Medidas de Nitrito nas
Amostras de Saliva
Os valores da concentração de nitrito na saliva foram comparados com todos
os parâmetros clínicos avaliados. A presença de sangramento à sondagem e
supuração foi freqüentemente observada nos pacientes avaliados, e não possibilitou
a distinção entre a gravidade dos grupos moderada e avançada. Portanto estes
parâmetros não obtiveram correlação com as medidas de nitrito na saliva.
62
O parâmetro clínico de perda de inserção também não se mostrou eficaz na
determinação da gravidade da doença e não obteve correlação com as medidas de
nitrito na saliva.
O parâmetro clínico que obteve correlações positivas com a medida de nitrito
na saliva foi a profundidade de sondagem (Tabela 3). Subdividimos as medidas de
profundidade de sondagem (PS) nos seguintes subgrupos:
1) Maior PS medida no indivíduo (Figura. 8).
2) Número de dentes com PS ≥ 7 mm (Figura. 9).
3) Número de dentes com PS ≥ 4 mm (Figura. 10).
TABELA 3
Correlações observadas entre diversos parâmetros de profundidade de sondagem
com os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença
periodontal crônica generalizada (detalhes no anexo 6).
Número de
Número de
[NO2] na
Maior PS
dentes com
dentes com
saliva (µM)
(mm)
PS ≥ 7mm
PS ≥4mm
20
20
20
20
Média
11,79
7,90
3,90
13,75
Des. Pad.
±5,99
±1,91
±3,24
±5,68
I.C. 95%
9,17 – 14,41
7,06 – 8,74
2,48 - 5,32
11,26 – 16,24
0,14
0,68
0,54
n
Correlação com a [NO2]
Cada um dos critérios acima foi comparado com a concentração de nitrito na
saliva dos indivíduos nos grupos moderada e avançada. Pode-se observar na tabela
3 que todos os quesitos avaliados apresentaram correlação positiva, ou seja, quanto
maior o valor do parâmetro clínico avaliado, maior a medida de nitrito (anexo 6).
63
As correlações com valores mais elevados foram obtidas para os parâmetros
do número de dentes com PS ≥ 7mm (0,68) e número de dentes com PS ≥ 4mm
(0,54). As figuras 9 e 10 ilustram as curvas de correlação destes subgrupos.
Correlação [NO2] X Maior Profundidade de
Sondagem
Profundidade de Sondagem (mm)
12
10
R2 = 0,0239
8
6
4
2
0
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
[NO2]
FIGURA 8 – Correlação entre a maior profundidade de sondagem e os valores da
crônica generalizada moderada e avançada
Correlação (Pearson) = 0,14
64
Correlação [NO2] X Número de dentes
com P.S. ≥ 7 mm
12
R2 = 0,4831
Número de dentes
10
8
6
.
4
2
0
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
[NO2]
FIGURA 9 – Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 7mm e os valores da
crônica generalizada moderada e avançada
As linhas de tendência (R2) da figura 8, bem como dos outros critérios
avaliados obtiveram valores baixos. As linhas das figuras 9 e 10 obtiveram valores
mais altos, mas ainda mostram dispersão dos dados.
65
Correlação [NO2] X Número de dentes
com P.S. ≥ 4 mm
30
Número de Dentes
25
R2 = 0,2853
20
15
10
5
0
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
[NO2]
FIGURA 10 – Correlação entre o número de dentes com PS ≥ 4mm e os valores
da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença
periodontal crônica generalizada moderada e avançada
66
7. DISCUSSÃO
Os marcadores bioquímicos e imunobiológicos encontrados na saliva e/ou
fluido do sulco gengival podem, em parte, refletir tanto a extensão da destruição
periodontal quanto predizer a progressão da mesma (OZMERIC, 2004; PAQUETT e
WILLIAMS, 2000). Dentro deste contexto, a utilização da análise dos constituintes
salivares têm sido sugerida devido à facilidade de obtenção das amostras, inclusive
repetidamente se necessário, e em especial ao fato de se tratar de um procedimento
não invasivo. Além disto, as amostras podem ser coletadas por indivíduos sem
treinamento
especial,
apresentando
assim
baixo
custo
de
coleta
e
conseqüentemente, considerável potencial para uso em estudos epidemiológicos.
Contudo, ainda são necessários estudos prospectivos controlados em grandes
populações para determinar a importância da utilização de marcadores específicos.
Atualmente, a maioria dos marcadores salivares estudados avalia a presença
ou ausência da DP, e não são capazes de distinguir a gravidade ou extensão da
doença. Exceções relatadas na literatura são o NO, que pôde ser correlacionado
com PS (CHEN e SUN, 1999), o fator de crescimento de hepatócito (OHSHIMA et al,
2002), que também conseguiu correlacionar seus valores com a PS (PS ≥ 4 mm e
PS ≥ 6 mm), e o fator de atividade plaquetária (GARITO, PRIHODA e McMANUS,
1995), que pôde ser correlacionado com a extensão da DP.
Estudos prévios sugerem que o uso de medicamentos e substâncias com
potencial de inibir a NOSi ou os seus produtos finais como o NO e outros radicais
livres, podem ser de grande valor no tratamento da doença periodontal (DAGHIGH
et al. 2002). A inibição da NOSi com isosorbida previne a reabsorção óssea alveolar
67
na periodontite induzida em ratos (LEITÃO et al. 2004, 2005). O tratamento de ratos
com periodontite induzida, pela administração de mercaptoetilguanidina (MEG), um
inibidor seletivo de NOSi, resultou em uma significativa diminuição na reabsorção
óssea quando comparado ao grupo controle (LOHINAI, 1998). Para Szabó et al.
(1997) estes efeitos protetores podem ser atribuídos à habilidade do MEG de agir
como um radical livre de oxigênio, como um seqüestrador de peroxinitrito e como um
inibidor da atividade da cicloxigenase. O uso de inibidores seletivos de NOSi tem
mostrado efeitos benéficos no caso de artrites, choques e inflamação (KENDALL,
MARSHALL e BARTOLD, 2001). A aminoguanidina também tem sido usada para
este propósito, e foi relatada a ocorrência de uma redução nos parâmetros
inflamatórios que sugere que este inibidor da NOS reduz a produção de NO e o
stress oxidativo (DI PAOLA et al. 2004). O mesmo grupo testou ainda outra
substância, semelhante à dismutase superóxida, o M40403, e relatou que este
remove anions superóxidos sem interferir em outras repostas inflamatórias causando
uma redução dos níveis inflamatórios (DI PAOLA et al. 2005).
Neste contexto, outras substâncias parecem agir inibindo indiretamente a
produção de NOSi, como por exemplo a tetraciclina. Este antibiótico age tanto pela
inibição direta da atividade enzimática quanto pela inibição da produção da NOSi
que é conhecida por potencializar a atividade das MMPs (MURRELL et al.,1995). A
modulação racional da atividade das MMPs nas desordens crônicas inflamatórias
tem sido utilizada no tratamento da doença periodontal associando baixas doses de
tetraciclina ao tratamento mecânico (GOLUB et al., 1997).
Outra frente de tratamento pode ser através de um aumento da enzima
arginase, já que ela compete pelo mesmo substrato do NO, a L-Arginina. Sabendose que a L-arginina é determinante na síntese do NOS, a arginase atuaria
68
diminuindo a produção do NO (ÖZMERIÇ, ELGÜN e URAZ, 2000). Um artigo
recente comparou os níveis de NOSi e de arginase em biópsias de pacientes
submetidos à tratamento periodontal por curetagem ou cirurgia com retalho de
Widman modificado (GULLU et al., 2005). Os autores observaram que após 2 meses
de tratamento houve uma diminuição dos níveis de expressão da NOS, e um
aumento dos níveis da enzima arginase.
Os diversos estudos mencionados acima indicam que a utilização de
amostras de saliva pode ser de grande valor na condução de estudos científicos
sobre a avaliação e o diagnóstico da DP. Também revelam que o NO e as enzimas
que participam de sua biossíntese participam da modulação da DP e, portanto
fundamentam e corroboram a execução do presente. Pôde-se observar no nosso
estudo que houve um aumento significativo do óxido nítrico na saliva dos indivíduos
com DPCG. Estes resultados estão em acordo com autores que observaram
aumentos de aminoácidos relacionados com o NO na doença periodontal
(MATEJKA et al 1998), aumentos da expressão de iNOS em biópsias teciduais
(LOHINAI et al 1998; LAPPIN et al, 2000; GULLU et al, 2005) assim como em cultura
de fibroblastos gengivais (KENDALL et al, 2000; DAGHIGH et al 2002).
O aumento de NO na saliva também pode ser justificado em parte pelo
aumento do NO decorrente do acúmulo de placa dental. O estudo conduzido por
Carossa et al. (2001), demonstrou um aumento na produção de óxido nítrico bucal
durante o início da deposição da placa dental. Um estudo similar postulou que este
aumento seria provavelmente um resultado da super-regulação da expressão da
NOSi pelas células gengivais, induzida não só pela proliferação bacteriana, mas
também através da produção de citocinas estimuladas pela presença da placa
bacteriana (RAUSCH-FAN e MATEJKA, 2001).
69
Nossos resultados estão de acordo com os de Chen e Sun (1999), que
também utilizaram o método de Griess, descrevendo um aumento do nitrito na saliva
na doença periodontal, relatando concentrações de 28,80 microns/L no grupo
controle e 55,36 microns/L na DP (p<0,01). Os valores absolutos são maiores do
que os nossos, o que pode ser justificado por variações na curva padrão, mas não
alteram a análise mais importante, que é a comparativa.
Uma redução nos níveis de óxido nítrico na saliva de indivíduos portadores de
doença periodontal, sobretudo portadores de periodontite agressiva foi descrito
previamente (AURER et al, 2001). Estes resultados são contrários aos obtidos no
presente estudo e podem ser em parte explicados pela grande variabilidade da
amostra utilizada pelos autores, fato este que foi explicitado no referido artigo.
Adicionalmente, os resultados dos referidos autores estão em desacordo com a
vasta maioria da literatura que relata que um aumento na concentração de NO na
saliva de pacientes com DPCG é esperado tendo em vista que a expressão de NO é
aumentada após estímulos com LPS e outras toxinas bacterianas presentes nesta
patologia (BLIX e HELGELAND, 1998; KENDALL et al 2000; CARROSSA et al,
2001; RAUSCH-FAN e MATEJKA, 2001).
É importante salientar que no presente estudo a mensuração de NO na saliva
de indivíduos com DPCG foi capaz de distinguir com clareza as formas moderada e
avançada da mesma. Até a presente data, este é o primeiro estudo que utilizando a
quantificação do NO em amostras salivares pôde demonstrar esta diferença. O
aumento dos níveis de nitrito no grupo de indivíduos com DPCG avançada revela
uma maior atividade de doença no mesmo e, portanto indica que apresenta um
potencial adicional no seu diagnóstico.
70
Outro ponto de discussão que merece ser destacado refere-se à correlação
entre parâmetros clínicos de doença periodontal e os níveis de NO. Dentre os
critérios clínicos de classificação indicados pela AAP, correlações positivas entre os
níveis de NO e os níveis de profundidade de sondagem foram observadas. As
correlações mais representativas foram observadas em relação ao número de
dentes com PS ≥ 7 mm, e número de dentes com PS ≥ 4 mm respectivamente. Uma
correlação positiva entre os níveis de PS e o critério de sítio com a maior PS
também foi observada. Como o valor obtido nesta última foi inferior aos dois
anteriores, estes resultados indicam que os níveis de NO na saliva avaliam melhor a
extensão do que a gravidade da DPCG. Contudo, esta observação ainda deve ser
avaliada com cautela, pois houve dispersão razoável dos dados. É possível que com
uma amostra maior esta dispersão possa vir a ser reduzida, melhorando as linhas de
tendência e confirmando ou não esta hipótese.
Correlações com os outros parâmetros clínicos, como perda de inserção,
sangramento à sondagem e supuração não foram significativas em relação aos
níveis de NO nas amostras de saliva. Sangramento à sondagem e supuração foram
tão freqüentes na amostra que não tiveram valor diagnóstico para distinguir os
grupos avançada e moderada, e, portanto também não puderam ser correlacionados
com os níveis de NO. Quanto à perda de inserção, a falta de correlação observada
era esperada, já que este critério avalia muito mais o histórico da doença do que sua
atividade atual.
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que, a mensuração do óxido
nítrico na saliva pelo método de Griess apresenta grande potencial de utilização
como método auxiliar no diagnóstico da doença periodontal. Além das facilidades de
coleta descritas previamente, o método de Griess é de fácil execução, já que o
71
reagente é composto apenas de duas substâncias. Uma possível dificuldade, a
necessidade de se fazer a leitura em espectrofotômetros não representa uma
grande limitação tendo em vista que os laboratórios de análises clínicas dispõem e
estão familiarizados com a utilização desta tecnologia. Assim, a avaliação do NO
como meio de diagnóstico necessitaria apenas da coleta salivar em campo ou em
consultório, seguida do congelamento das amostras e de uma fase laboratorial
simples.
Tendo em vista os resultados e as considerações mencionadas, podemos
concluir que estudos futuros utilizando o NO como marcador biológico apresentam
um grande potencial e valor clínico para testar diferentes terapias coadjuvantes no
tratamento da DPCG e como meio auxiliar de diagnóstico na DPCG. Além de sua
utilização como marcador, a avaliação de novas terapias envolvendo a modulação
do NO tem potencial no tratamento da DPCG. Finalmente, torna-se necessário
validar este método através de estudos clínicos prospectivos controlados. Após este
tipo de validação, a mensuração do NO na saliva pode vir a ser utilizada em estudos
epidemiológicos e como meio auxiliar de diagnóstico e controle da DPCG.
72
8. CONCLUSÕES
•
Os níveis de nitrito na saliva de indivíduos portadores de doença periodontal
crônica generalizada foram significativamente maiores do que os observados
no grupo controle.
•
Observou-se diferenças significativas nos níveis de nitrito na saliva entre as
formas moderada e avançada da doença periodontal crônica generalizada.
•
Os maiores níveis de nitrito na saliva foram observados no grupo da doença
periodontal crônica avançada.
•
Uma correlação positiva entre a gravidade da doença e a mensuração dos
níveis de nitrito na saliva foi observada.
•
O parâmetro clínico de melhor correlação com o nível de nitrito na saliva foi o
de profundidade de sondagem.
•
Os resultados do presente estudo indicam que a mensuração da concentração
de óxido nítrico na saliva parece ter potencial de utilização como marcador
biológico da doença periodontal crônica generalizada.
73
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
ANEXO 1 – Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa
88
89
ANEXO 2 – Termo de consentimento
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Título do projeto:
Análise da Concentração de Óxido Nítrico na Saliva de Indivíduos Portadores de Doença
Periodontal
Este termo de consentimento pode conter palavras que você não entenda. Peça ao pesquisador que
explique as palavras ou informações não compreendidas completamente.
1) Introdução:
Você esta sendo convidado(a) a participar da pesquisa sobre a diferença da saliva nas pessoas com
e sem problemas na gengiva. Vamos selecionar pessoas com e sem problemas na gengiva. Se
decidir participar dela, é importante que leia estas informações sobre o estudo e seu papel nesta
pesquisa.
Você foi selecionado porque é de um dos dois grupos (com problemas na gengiva e sem problemas
na gengiva) e portanto queremos examinar a sua saliva. Sua participação não é obrigatória. A
qualquer momento você pode desistir de participar e retirar seu consentimento. Sua recua não trará
nenhum prejuízo em sua relação como o pesquisador ou com a instituição, PUCMinas.
É preciso entender a natureza e os riscos da sua participação e dar o seu consentimento livre e
esclarecido por escrito.
2) Objetivo:
O objetivo deste estudo é avaliar se a saliva de pessoa que têm a gengiva inflamada é diferente da
saliva de pessoas que não têm a gengiva inflamada.
3) Procedimento do Estudo:
Se concordar em participar deste estudo você será solicitado doar uma pequena quantidade de saliva
(5ml). Será necessário que você não coma ou beba (refrigerantes, sucos ou qualquer outro tipo de
bebida) nada, nas duas horas antes da coleta. Você vai enxaguar a boca com água, vai mastigar um
pequeno pedaço de plástico (macio) e vamos coletar a sua saliva. Vamos guardar a sua saliva em
tubos e vamos congelar a saliva para depois fazermos alguns exames dela. Depois de examinarmos
a sua saliva e a de outras pessoas, vamos poder entender se a saliva de pessoas com problemas na
gengiva é diferente a saliva de pessoas sem problemas na gengiva.
4) Riscos e Desconfortos:
Nesta pesquisa não existem riscos adicionais ao exame feito pelo dentista e por ele coletar um
pequeno volume da sua saliva.
5) Benefícios:
- A participação na pesquisa não acarretará gasto para você, sendo totalmente gratuita. O
conhecimento que você adquirir a partir da sua participação na pesquisa poderá beneficiá-lo
com informações e orientações futuras em relação ao seu problema/tratamento/situação de
vida, especialmente em relação à modificação de hábitos de vida, alimentação, trabalho e u
melhor conhecimento dos fatores de risco sobre o tema, beneficiando-o de forma direta ou
indireta.
- O tratamento poderá ou não trazer benefícios a você, mas as informações obtidas por meio
do
estudo
poderão
ser
importantes
para
a
descoberta
de
novos
90
tratamentos/técnicas/tecnologia, capazes de diminuir os problemas existentes em relação
ao objeto pesquisado.
- As consultas, os procedimentos relacionados ao estudo e a terapêutica utilizada serão
inteiramente gratuitos.
- Se diagnosticado algum problema, este será tratado e/ou encaminhado para tratamento
apropriado.
6) Tratamento Alternativo
Se você decidir não participar deste estudo, receberá o tratamento padrão para o seu
problema/doença de acordo com as normas desta instituição.
7) Custos/Reembolso
Você não terá nenhum gasto com a sua participa’~ao no estudo. A medicação, as consultas, os
exames e todo o tratamento serão gratuitos e também não receberá pagamento pela sua
participação. Você não receberá cobrança por nenhum tratamento e exame adicional ou qualquer
outro procedimento feito durante o estudo.
8) Caráter Confidencial dos Registros
Algumas informações obtidas a partir de sua participação neste estudo não poderão ser mantidas
estritamente confidenciais. Além dos profissionais de saúde que estarão cuidando de você, agências
governamentais locais, o Comitê de Ética em Pesquisa da instituição onde o estudo está sendo
realizado, o patrocinador do estudo e seus representantes podem precisar consultar seus registros.
Você não será identificado quando o material de seu registro for utilizado, seja para propósitos de
publicação científica ou educativa. Ao assinar este consentimento informado, você autoriza as
inspeções em seus registros, que será realizada na presença do pesquisador responsável e somente
a pedido dos órgãos citados acima.
9) Participação
Sua participação nesta pesquisa consistirá em ser examinado por um dentista e doar uma pequena
quantidade de saliva. É importante que você esteja consciente de que a participação neste estudo de
pesquisa é completamente voluntária e de que você pode recusar-se a participar ou sair do estudo a
qualquer momento sem penalidades ou perda de benefícios aos quais você tenha direito de outra
forma. Em caso de você decidir retirar-se do estudo, deverá notificar ao profissional e/ou pesquisador
que esteja atendendo-o. A recusa em participar ou a saída do estudo não influenciarão seus cuidados
nessa instituição.
10) Para obter informações adicionais
Você receberá uma cópia deste termo onde consta o telefone e o endereço do pesquisador principal,
podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação, agora ou a qualquer momento.
Caso você tenha mais dúvidas sobre o estudo, por favor, ligue para a PUCMinas, Faculdade de
Odontologia, Programa de Mestrado em Clínicas Odontológicas.
Avenida Dom Gaspar, 500 – Prédio 46, Coração Eucarístico
Belo horizonte, MG – Brasil CEP 30535-610
Telefone (31) 3319-4414; Fax (31) 3319-4415
E-mail: [email protected]
Pesquisadora: Vanessa Goulart S. Reher
91
Se você tiver perguntas com relação a seus direitos como participante do estudo clínico, você
também poderá contatar o Coordenador do Comitê de Ética em Pesquisa desta instituição, no
telefone (31) 3319-4298, Fax (31) 3319-4229 ou E-mail: [email protected]
11) Declaração de Consentimento
Li ou alguém leu para mim as informações contidas neste documento antes de assinar este termo e
consentimento.Declaro que fui informado sobre os métodos do estudo a ser utilizado, das
inconveniências, dos riscos, dos benefícios e dos eventos adversos que podem vir a ocorrer em
conseqüência dos procedimentos.
Declaro que tive tempo suficiente para ler e entender as informações acima. Declaro também que
toda a linguagem técnica utilizada na descrição deste estudo de pesquisa foi satisfatoriamente
explicada e que recebi respostas para todas as minhas dúvidas. Confirmo também que recebi uma
cópia deste formulário de consentimento. Compreendo que sou livre para me retirar do estudo em
qualquer momento, sem perda de benefícios ou qualquer outra penalidade.
Dou meu consentimento de livre e espontânea vontade e sem reservas para participar como paciente
deste estudo.
_____________________________________________
Nome do participante ( em letra de forma)
_______________________________________________
Assinatura do participante ou representante legal
_________________
Data
Atesto que expliquei cuidadosamente a natureza e o objetivo deste estudo, os possíveis riscos e
benefícios da participação do mesmo, junto ao participante e/ou seu representante autorizado.
Acredito que o participante e/ou seu representante recebeu todas as informações necessárias, que
foram fornecidas em uma linguagem adequada e compreensível e que ele/ela compreendeu essa
explicação.
_______________________________________________________
Assinatura do pesquisador
________________
Data
92
ANEXO 3 – Ficha Clínica
FICHA CLÍNICA
Identificação
Nome ________________________________________________ Prontuário nº: _______________
Data: ___/___/___ Nascimento: ___/___/____ Naturalidade ________________________________
Gênero: ________ Raça (cor): ____________ Estado civil: ___________ Profissão: _____________
Endereço:
Rua (Av.) __________________________________________ N° _____ Apt° _____
Bairro _______________ CEP ___________ Cidade _________________________
Telefones: Res.:(
) ____________ Trab.:(
) _____________ Cel: (
) __________________
Anamnese
História Médica:
1) Você tem algum problema de saúde?
( ) Sim
( ) Não
2) Em caso afirmativo, qual problema se aplica ao seu caso?
( ) Problemas cardíacos
( ) Pressão alta
( ) Infarto ou Angina
( ) Cirurgia cardíaca
( ) Marca passo
( ) Febre Reumática
( ) Anemia
( ) Doenças respiratórias
( ) Asma
( ) Hemofilia
( ) Leucemia
( ) Câncer
( ) Diabetes
( ) Problemas renais
( ) Reumatismo
( ) Doenças sexuais
( ) Epilepsia, convulsões
( ) Outros
Descreva o problema ___________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________
3) Já esteve internado ou submeteu-se a alguma cirurgia recentemente?
( ) Sim
( ) Não
Descreva: ____________________________________________________________________________________
4) Sofreu algum traumatismo na boca no último mês?
( ) Sim
( ) Não
5) Fez tratamento com antibióticos nos últimos 3 meses?
( ) Sim
( ) Não
6) Está usando algum medicamento no momento?
( ) Sim
( ) Não
Qual(is) ______________________________________________________________________________________
7) Tem alergia a algum medicamento?
( ) Sim
( ) Não
Qual(is) ______________________________________________________________________________________
Caso possua algum outro problema médico que ache importante, favor descrever: ___________________________________
_____________________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________________
Belo Horizonte, ____/___ /_____
Assinatura do paciente: _________________________________________________
93
Volume de Saliva: _____________
Exame Periodontal
Sangramento
D
17
16
15
14
13
12
11
21
22
23
24
25
26
27
37
36
35
34
33
32
31
41
42
43
44
45
46
47
V
M
Perda Inserção
L
D
V
M
Supuração
L
D
V
M
Profundidade de Sondagem
L
D
VD
V
VM
M
L
ANEXO 4 – Detalhamento da Tabela 1
Concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença periodontal crônica
generalizada e de indivíduos do grupo controle.
Controle
Doença Periodontal Crônica
n
Valor
n
Valor
1
4,48
11
7,22
2
8,26
12
10,33
3
8,16
13
12,13
4
6,65
14
8,07
5
3,06
15
12,13
6
5,52
16
4,01
7
5,52
17
7,59
8
6,27
18
7,31
9
5,04
19
5,42
10
5,61
20
3,63
21
12,79
22
20,34
23
9,67
24
11,66
25
16,76
26
16,38
27
11,94
28
15,81
29
29,03
30
13,54
Média
Média
5,86
11,79
Des. Pad.
Des. Pad.
±1,58
±5,99
I. C. 95%
I. C. 95%
4,88 – 6,84
9,16 – 14,42
Teste ‘t’ de Student (Controle X Doença) - p = 0,0024
Valores de média, desvio padrão e intervalo de confiança expressos em µM.
94
95
ANEXO 5 - Detalhamento da Tabela 2
Comparação entre os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com
doença periodontal crônica generalizada moderada, avançada e de indivíduos do
grupo controle.
Controle
Moderada
Avançada
n
Valor
n
Valor
n
Valor
1
4,48
1
7,22
11
12,79
2
8,26
2
10,33
12
20,34
3
8,16
3
12,13
13
9,67
4
6,65
4
8,07
14
11,66
5
3,06
5
12,13
15
16,76
6
5,52
6
4,01
16
16,38
7
5,52
7
7,59
17
11,94
8
6,27
8
7,31
18
15,81
9
5,04
9
5,42
19
29,03
10
5,61
10
3,63
20
13,54
Média
Média
Média
5,86
7,78
15,79
Des. Pad.
Des. Pad.
Des. Pad.
±1,58
±3,02
±5,59
I. C. 95% 4,88-6,84
I. C. 95% 5,91-9,65
I. C. 95% 12,33-19,25
Análise de ANOVA (Tukey): Controle X Moderada
p > 0,05
p<
0,01
Moderada X Avançada
p < 0,01
Valores de média, desvio padrão e intervalo de confiança expressos em µM.
96
ANEXO 6 – Detalhamento da Tabela 3
Correlações observadas entre diversos parâmetros de profundidade de sondagem
com os valores da concentração de NO2 na saliva de indivíduos com doença
periodontal crônica generalizada.
[NO2] na
n
saliva (µM)
11
7,22
12
10,33
13
12,13
14
8,07
15
12,13
16
4,01
17
7,59
18
7,31
19
5,42
20
3,63
21
12,79
22
20,34
23
9,67
24
11,66
25
16,76
26
16,38
27
11,94
28
15,81
29
29,03
30
13,54
Média
11,79
Des. Pad.
±5,99
I.C. 95%
9,17 – 14,41
Correlação com a [NO2]
Maior PS
(mm)
8
7
5
10
7
5
5
6
10
6
10
9
10
10
7
10
9
7
7
10
7,90
±1,91
7,06 – 8,74
0,14
Número de
dentes com
PS ≥ 7mm
3
1
0
3
3
0
0
0
3
1
11
7
4
5
4
9
4
5
9
6
3,90
±3,24
2,48 - 5,32
0,68
Número de
dentes com
PS ≥ 4mm
24
10
11
11
14
17
4
7
6
12
19
19
14
10
21
18
12
12
24
10
13,75
±5,68
11,26 – 16,24
0,54

análise da concentração de óxido nítrico na saliva de indivíduos

Transcrição

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