estudo fitoquímico e biológico in vitro de espécies do gênero

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
GEÓRGIA SUELEY BEZERRA
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO IN VITRO DE ESPÉCIES DO
GÊNERO Euphorbia: E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia L.
(EUPHORBIACEAE)
PETROLINA
2015
GÊNERO Euphorbia: E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia. L.
(EUPHORBIACEAE)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como
parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Recursos Naturais
do Semiárido, para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais.
Área de concentração:
atividade biológica.
Orientadora:
Prof.
Dra.
Cavalcante da Cruz Araújo
PETROLINA
2015
Química
e
Edigênia
Bezerra, Géorgia Sueley
B574e Estudo fitoquímico e biológico in vitro de espécies do gênero
Euphorbia: E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia. L.
(Euphorbiaceae)/ Géorgia Sueley Bezerra – Petrolina, 2015.
xviii, 135p.
Ficha
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus
Petrolina, Petrolina- PE, 2015.
Orientadora: Profa. Dra. Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo.
1. Estudo fitoquímico 2. Atividade biológica in vitro 3.
Euphorbia hirta, E. hyssopifolia e E. timmyfolia. I. Título. II.
Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 581.634
Catalogação pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF.
Bibliotecária: Maria Betânia de Santana da Silva CRB4/1747
GÊNERO Euphorbia: E. Hirta, E. Hyssopifolia e E. Thymifolia. L.
(EUPHORBIACEAE)
APROVADA em ........ de ........ de 2015.
_________________________________________________
Profa. Dra. Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo - UNIVASF
(Orientadora)
_________________________________________________
Profa. Dra. Gabriela Lemos de Azevedo Maia - UNIVASF
(1° Examinador)
_________________________________________________
Profa. Dra. Xirley Pereira Nunes – UNIVASF
(2° Examinador)
“Diante da sabedoria infinita, mais vale um
breve desejo de humildade com algum ato do
mesmo, do que toda ciência do mundo”.
(Santa Tereza D’Ávila)
iv
Agradecimentos
Louvo e agradeço a Deus por ter me dado o dom da vida, mas principalmente
por ter me concedido saúde e perseverança diante de todas as dificuldades e
tribulações enfrentadas durante a realização deste trabalho.
À minha mãe do céu, Maria santíssima por sempre me proteger e por sua
poderosa intercessão.
À minha mãe, de saudosa memória que infelizmente não se faz mais presente
entre nós, mas se estivesse hoje aqui estaria muito feliz com a realização do
meu sonho, a ela minha eterna gratidão.
Ao meu pai, que sempre se fez presente na minha vida e nunca permitiu que
me faltasse nada. Agradeço por todo amor dedicado a mim em todos os
momentos, que me ajudou a superar cada obstáculo.
Ao meu irmão Rodolfo, meu amigo, razão da minha alegria, agradeço por
todo amor, carinho, cumplicidade e companheirismo.
Ao meu irmão Tiago que mesmo não estando tão presente sempre se alegrou
com cada conquista minha, agradeço por todo amor, carinho e compreensão.
Às minhas tias, em especial Tia Dade e Tia Teca as quais sempre me
acolheram com todo amor e carinho, se colocando sempre à disposição para
me ajudar.
Às minhas amigas Keyte Nayara, Adriana Andrade, Elisângela Cordeiro,
Deize Raquel, Louise Marjoriê, Raphaelle simões, Fernanda Kelly, Manoela
Rocha, Ilze Braga, Poliana Ferrais, Luana Rosa e Eduarda por toda força e
incentivo durante esse trajeto e principalmente por estarem sempre ao meu
lado.
v
As minhas amigas e companheiras de trabalho Elizabeth, Amanda e Inaiara,
que com sua disposição, amizade e companheirismo sempre me deram muita
força, agradeço também por toda ajuda e suporte na realização de alguns
experimentos desse projeto; e que nos momentos mais difíceis me
proporcionaram incontáveis sorrisos.
À minha pastora, amiga e irmã, Estéfany pelo incentivo, encorajamento
constante por meio de suas sábias palavras, orações e inúmeras conversas
durante a madrugada.
Ao meu grande amigo Walisson que sempre se colocou à disposição para me
ouvir e aconselhar, mas agradeço principalmente pelo suporte nas traduções
dos meus textos e resumos.
As minhas colegas, Sandra, Naiane, Paloma, Fernanda e em especial Ana
Paula e Eliatania, que sempre se colocaram disponíveis para auxiliar na
realização da execução desse projeto, pois aprendi muito com elas.
À minha família shalom, em especial, aos meus irmãos do Davi, que me
acolheram com tanto amor. Agradeço por todo cuido, zelo e sorrisos.
Aos professores do IF- Sertão, pelos ensinamentos e pelo apoio constante e
amizade.
Às professoras Maria Leopoldina Veras e Débora dos Anjos, que de maneira
tão simples e desinteressada, contribuíram enormemente para o meu
crescimento profissional e pessoal, bem como por toda ajuda e apoio desde a
época da seleção.
À minha orientadora, por partilhar seu enorme conhecimento científico,
sempre me permitindo qual caminho traçar, mas principalmente por ter
acreditado em mim, mesmo quando eu mesma não acreditei, por toda sua
disposição, paciência e compreensão, a quem eu vou agradecer eternamente.
vi
Ao
Professor
Jackson
Roberto
pelos
ensinamentos
e
por
sempre
disponibilizar materiais e equipamentos para execução dos experimentos
deste trabalho.
Aos professores do colegiado de Pós-graduação em Recursos Naturais do
Semiárido, por terem proporcionado momentos gloriosos na aprendizagem.
À Duílio Paulino por ter me acompanhado durante a realização das coletas
no CRAD e também na identificação das plantas.
À UNIVASF, por ter disponibilizado o curso e me proporcionado esse titulo de
Mestre.
À CAPES pelo apoio financeiro para a realização da pesquisa.
Obrigada a todos que de certa forma vieram a contribuir na realização desse
sonho.
vii
Resumo
Euphorbia hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia são espécies pertencentes a
família Euphorbiaceae , sendo comumente utilizadas na medicina popular no
combate a vários tipos de infecções. Do material vegetal (partes aéreas)
obteve-se os extratos etanólicos bruto (Eh-EEB), (Ehy-EEB) e (Et-EEB) que
foram particionados, obtendo-se as frações hexânicas, clorofórmicas, acetato
de etila e metanólicas. Para os extratos e frações foram realizadas triagens
fitoquímicas que revelaram uma forte presença de terpenos, esteroides e
flavonoides em todas as espécies. O extrato diclorometânico das flores da
espécie Euphorbia hirta foi submetido a procedimentos cromatográficos e
foram isoladas duas substâncias que foram identificadas como sendo o
benzoato de lupeolila e Heptacosan-1-ol. O extrato etanólico das flores de E.
hirta foi também submetido a procedimentos cromatográficos do qual foi
isolada a substância que foi identificada como sendo Quercetina-3-β-Oramnosídeo. As estruturas dessas três substâncias foram definidas a partir
das análises dos espectros de RMN de 1H e
13
C e por comparação com
dados da literatura. Na determinação de fenóis totais, a fração que
apresentou o maior teor de fenóis totais foi a Eh-MeOH (102 ± 1,3 mg
EqAG/g), enquanto que na determinação de flavonoides totais, Ehy-AcOet
apresentou o maior teor (221,3 ± 6,25 mg EqC/g). Na avaliação da atividade
antioxidante, in vitro, Et-EEB mostrou maior poder antioxidante no método do
DPPH e Eh-EEB no método do β-caroteno. Para a atividade antibacteriana,
as três espécies em estudo apresentaram boa atividade, destacando-se na
eficiência de inibição do crescimento de bactérias Gram-negativas. Desta
forma, este estudo contribuiu para o estudo fitoquímico e biológico de três
espécies pertencentes ao gênero Euphorbia, E. hirta, E. hyssopifolia e E.
thymifolia tendo em vista que das três espécies estudas, duas delas, E.
hyssopifolia e E. thymifolia apresentam poucos relatos na literatura. Além
disso, foram isoladas três substâncias químicas as quais foram relatados pela
primeira vez na espécie, sendo uma delas relatada pela primeira vez no
gênero.
Palavras-chave: Euphorbia, estudo fitoquímico, atividade biológica.
viii
Abstract
Euphorbia Hirta, E. Hyssopifolia and E. Thymifolia are species belonging to
the Euphorbiaceae family. They have been used in traditional medicine (folk
medicine) for treating various diseases. There was obtained, of their vegetal
material, the crude ethanolic extracts (Eh-EEB), (Ehy-EEB) and (Et-EEB) that
have been partitioned to give the hexane fractions (Eh-Hex, Ehy-Hex, Et-Hex),
chloroform (Eh- CHCl3, Ehy- CHCl3, Et-CHCl3), ethyl acetate (Eh- AcOet, EhyAcOet, Et-AcOet) and methanolic (Eh- MeOH, Ehy- MeOH, Et-MeOH). For the
extracts and fractions were carried out phytochemical screening that revealed
a strong presence of terpenes, steroids and flavonoids in all species. The
dichloromethane extract of flowers of the Euphorbia hirta species was
subjected to chromatographic procedures, and were isolated two substances
identified as being benzoate of lupeolila and Heptacosan-1-ol. The ethanolic
extract of E. hirta flowers was also subjected to chromatographic procedures
which was isolated the substance identified as Quercetin-3-O-β-rhamnoside.
The structures of the three substances have been defined from the analysis of
the NMR spectra of 1H and
13
C, and from comparison with literature data. For
the determination of total phenols, the phase that presented the highest total
phenols content was the Eh-MeOH (102 ± 1,3 mg EqAG/g), while for the
determination of total flavonoids, Ehy-AcOet presented the highest content
(221,3 ± 6,25 Eq/C/g). In the evaluation of antioxidant activity, in vitro, Et-EEB
evinced greater antioxidant power in the method of DPPH and Eh-EEB in the
β-Carotene method. For the antibacterial activity, the three species presented
good activity, standing out effectiveness in inhibiting the growth of Gramnegative bacteria. Therefore, this study contributes to the phytochemical and
biological study of three species of the genus Euphorbia, E. hirta, E.
hyssopifolia e E. thymifolia, considering that of the three studied species, two
of them, E. hyssopifolia e E. thymifolia, have few reports in the literature.
Keywords: Euphorbia, phytochemical study, biological activity.
ix
Lista de figuras
Figura 1- Região do nordeste onde predomina o bioma caatinga....................
21
Figura 2 - Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários em plantas.....................................................................................
23
Figura 3 - Euphorbia hirta.................................................................................
39
Figura 4 - Euphorbia thymifolia.........................................................................
42
Figura 5 - Euphorbia hyssopifolia.....................................................................
43
Figura 6 - Estrutura básica dos flavonoides.....................................................
44
Figura 7 - Esquema simplificado da origem biossintética dos flavonoides .....
48
Figura 8 - Biossíntese dos terpenos e esteroides.............................................
50
Figura 9 - Exsicata n° # 0786 de Euphorbia hirta.............................................
55
Figura 10 - Exsicata n° #1052 de Euphorbia hyssopifolia................................
56
Figura 11 - Exsicata n° #11838 de Euphorbia thymifolia..................................
57
Figura 12 - Flor de Euphorbia hirta...................................................................
60
Figura 13 - Triagem fitoquímica........................................................................
63
Figura 14 – Coluna cromatográfica da fase diclorometano das flores de E.
hirta....................................................................................................................
65
Figura 15 – Placas CCDA sílica de frações E. hirta.........................................
66
Figura 16 – Experimento atividade antibacteriana............................................
75
Figura 17 – Benzoato de lupeol........................................................................
85
Figura 18 – Espectro RMN 13C de Eh-01 (CDCl3 , 125 MHz)...........................
87
Figura 19 - Espectro RMN 13C/ DEPT Q de Eh-01 (CDCl3 , 125 MHZ)...........
87
Figura 20 – Expansão do espectro RMN 1H de Eh-01 (CDCl3 , 500 MHZ)......
88
1
Figura 21 – Expansão do espectro RMN H de Eh-01 (CDCl3 , 500 MHz).......
88
Figura 22 – Expansão do espectro RMN 1H de Eh-01 (CDCl3 , 500 MHz).......
89
Figura 23 – Expansão do espectro RMN 1H de Eh-01 (CDCl3 , 500 MHz).......
89
Figura 24 – Expansão do espectro RMN 1H de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz)........
90
Figura 25 – Espectro RMN de correlação 1H x 1H- COSY de Eh-01 (CDCl3,
500 MHz)...........................................................................................................
1
Figura 26 – Espectro de correlação H x
95
13
C- HSQC de Eh-01 (CDCl3, 500
MHZ e 125MHZ)................................................................................................
96
Figura 27 – Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de Eh-01 (CDCL3, 500
97
x
MHz e 125 MHZ)...............................................................................................
Figura 28 – Heptacosan-1-ol............................................................................
98
Figura 29 – Espectro RMN 1H de Eh-02 (CDCl3, 300 MHz).............................
101
Figura 30 – Espectro RMN 13C de Eh-02 (CDCl3, 75 MHz )...........................
101
Figura 31 – Quercetina-3-β-O -ramnosideo......................................................
102
Figura 32 - Espectro RMN de 1H de Eh-03 (MeOD, 500 MHz)........................
104
Figura 33 - Espectro RMN de 1H de Eh-03 (MeOD, 500 MHz)........................
104
1
Figura 34 - Espectro RMN de H de Eh-03 (MeOD, 500 MHz).......................
105
Figura 35 - Espectro RMN de 13C/ DEPT Q de Eh-03 ( MeOD, 125 MHz).......
Figura 36 - Espectro de correlação 1H x 1H- COSY de Eh-03 (CDCl3, 500
105
MHz)..................................................................................................................
109
Figura 37 – Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de Eh-03 (CDCl3, 500
MHz e 125 MHz)................................................................................................
1
Figura 38- Espectro de correlação H x
110
13
C- HMBC de Eh-03 (CDCl3, 500
MHz e 125 MHz)...............................................................................................
111
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sistema de eluição e reveladores para a caracterização de
metabólitos secundários de extratos do material vegetal de Euphorbia hirta, E.
timmyfolia e E. hyssopifolia por cromatografia em camada delgada...................
62
Tabela 2 - Fracionamento cromatográfico da fração diclorometânica da flor de
Euphorbia hirta, frações coletadas e reunião das frações obtidas após análise
em CCDA..............................................................................................................
67
Tabela 3 - Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto da flor de
Euphorbia hirta, frações coletadas e reunião das frações após análise em
CCDA....................................................................................................................
69
Tabela 4 - Identificação das principais classes de constituintes do extrato EEB
e fases (Eh-hex, Eh-CHCl3, Eh- AcOET e Eh- MeOH) da espécie Euphorbia
hirta)....................................................................................................
82
Tabela 5 Identificação das principais classes do EEB e extrato diclorometânico
da flor da espécie Euphorbia hirta..............................................
83
Tabela 6 - Identificação das principais classes de constituintes do extrato
etanólico e fases (Ehy-Hex, Ehy- CHCL3, Ehy- AcOET e Ehy- MeOH) da
espécie Euphorbia hyssopifolia............................................................................
83
Tabela 7- Identificação das principais classes de constituintes do extrato
etanólico e fases (Et- Hex, Et- CHCL3, Et- AcOET e Et- MeOH) da espécie
Euphorbia thymifolia.............................................................................................
Tabela 8 - Comparação dos dados de RMN de 1H (500 MHz) e
13
C (125 MHz)
referentes à substância Eh-01 com dados da literatura.......................................
1
Tabela 9 - Dados de RMN de H (500 MHz) e
1
H x
13
C (500 MHz e
C (125 MHz), HMQC e HMBC
13
C 125 MHz), referentes à substância Eh-
à
91
13
01..........................................................................................................................
referentes
84
substância
Eh-02
com
93
13
C (75 MHz)
dados
da
literatura................................................................................................................. 100
MHz),
referente
à
substância
Eh-03
com
13
dados
C (125
da
literatura................................................................................................................. 106
xii
Tabela 12 – Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz), HSQC e HMBC
1
H
X
13
C
(500
MHz,
125
MHz),
referente
à
substância
Eh-
03........................................................................................................................... 107
Tabela 13 - Atividade antioxidante, fenóis e flavonoides totais in vitro do extrato
etanólico (EEB) e fases (AcOet e MeOH) de Euphorbia hirta, E.hyssopifolia e
E. thymifolia...........................................................................................................
114
Tabela 14. Atividade antibacteriana de Eh- EEB, Eh- AcOEt e Eh-MeOH das 116
partes ( folhas, caules e flor) de E. hirta................................................................
Tabela 15 - Atividade antibacteriana de Ehy-EEB, Ehy-AcOet e Ehy-MeOH das
partes (Folhas, caule e flor) de E. hyssopifolia.....................................................
117
Tabela 16 - Atividade antibacteriana de Et- EEB, Et-AcOET e Et- MEOH das
partes ( folhas, caule e flor) de E. timmyfolia.......................................................
118
xiii
Lista de quadros
Quadro 1 - Tipos de esqueletos de diterpenos encontrados no gênero
Euphorbia..........................................................................................................
32
Quadro 2- Exemplos de alguns metabólitos secundários encontrados no
gênero Euphorbia..............................................................................................
34
Quadro 3 – Triterpenos isolados de Euphorbia hirta........................................
40
Quadro 4 - Classes de flavonoides e algumas características conhecidas......
46
xiv
Fluxogramas
Fluxograma 1- Resumo geral da metodologia da pesquisa.............................
58
Fluxograma 2 - Fracionamento cromatográfico da fração DCM da flor de
Euphorbia hirta..................................................................................................
68
Fluxograma 3- Fracionamento cromatográfico do EEB da flor de Euphorbia
hirta....................................................................................................................
70
Fluxograma 4- obtenção e fracionamento do EEB de euphorbia hirta ...........
78
Fluxograma 5– Obtenção e fracionamento do EEB da flor da espécie
Euphorbia hirta..................................................................................................
79
Fluxograma 6 – Obtenção e fracionamento do EEB das partes da planta
(folhas, caule e flor) de Euphorbia hyssopifolia.................................................
80
Fluxograma 7 – Obtenção e fracionamento do EEB das partes da planta
(folhas e caule) de Euphorbia timmyfolia...........................................................
81
xv
Lista de abreviações
% AA: Percentual de atividade antioxidante
AA: Atividade antioxidante
BHA: Butil-hidroxi-anisol
BHT: Butil-hidroxi-tolueno
CBM: Concentração bacteriostática mínima
CC: Cromatografia em coluna
CCD: Cromatografia em camada delgada
CCDA: Cromatografia em camada delgada analítica
CE50: Concentração eficiente 50%
CHCl3: Clorofórmio
CIM: Concentração Inibitória Mínima
COSY: Espectroscopia de correlação homonuclear de hidrogênio (correlated
specroscopy)
d: dupleto
dd: duplo dupleto
EROs: Espécies reativas de oxigênio
DEPTQ: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Including the
Detection of Quaternary Nuclei
DMSO: Dimetilsulfóxido
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
δ: Deslocamento químico
EEB: Extrato Etanólico Bruto
Eh-1: Substância 1 isolada de E. hirta
Eh-2: Substância 2 isolada de E. hirta
Eh-3 : Substância 3 isolada de E. hirta
Eh-AcOEt: Fração acetato de etila de E. hirta
Eh-CHCl3: Fração clorofórmica de E. hirta
Eh-EEB: Fração etanólico bruto de E. hirta
Eh-Hex: Fração hexânica de E. hirta
Ehy-AcOEt: Fração acetato de etila de E. hyssopifolia
Ehy-CHCl3: Fração clorofórmica de E. hyssopifolia
xvi
Ehy-EEB: Extrato etanólico bruto de E. hyssopifolia
Ehy-Hex: Fração hexânanica de E. hyssopifolia
Et-AcOEt: Fração acetato de etila de E. timmyfolia
Et-CHCl3: Fração clorofórmica de E. timmyfolia
Et-EEB: Extrato etanólico bruto de E. timmyfolia
Et-Hex: Fração hexânanica de E. timmyfolia
EO: Estresse oxidativo
HMBC: Correlação heteronuclear de múltiplas ligações (multiple bond
correlation)
Hz: Hertz
HO : Radical hidroxila
HSQC: Correlação heteronuclear quântica simples (heteronuclear single
quantum correlation)
HMQC: Correlação heteronuclear de múltiplas ligações (heteronuclear
Multiple Quantum Coherence)
HVASF: Herbário Vale do São Francisco
J: Constante de acoplamento
m: multipleto
mg EqAG/g: miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama de amostra
mg EqC/g: miligrama de equivalentes de catequina por grama de amostra
NCCLS: National Commitee of clinical Laboratory Standards
ppm: partes por milhão
Ri: Índice de retenção
RMN 1H: Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN 13C: Ressonância magnética nuclear de carbono
s: simpleto
t: tripleto
OBS: as abreviaturas e os símbolos utilizados neste trabalho e que não
constam nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções
adotadas universalmente.
xvii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................
20
2. OBJETIVOS....................................................................................................
25
2.1. Objetivo geral................................................................................................
26
2.2. Objetivos específicos....................................................................................
26
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.......................................................................
27
3.1. Considerações sobre família Euphorbiaceae..............................................
28
3.2. Considerações sobre o gênero Euphorbia...................................................
30
3.3. Considerações sobre a espécie Euphorbia hirta..........................................
38
3.4. Considerações sobre a espécie Euphorbia thymifolia..................................
41
3.5. Considerações sobre a espécie Euphorbia hyssopifolia.............................
43
3.6. Considerações gerais sobre os flavonoides.................................................
44
3.7. Considerações sobre os terpenoides...........................................................
48
3.8. Considerações sobre a atividade antioxidante.............................................
51
3.9. Considerações sobre a atividade antibacteriana..........................................
52
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................
55
4.1. Coleta e identificação do material botânico..................................................
55
4.2. Fases do desenvolvimento da pesquisa.......................................................
58
4.3. Processamento do material vegetal..............................................................
59
4.3.1. Obtenção dos extratos de Euphorbia hirta (Eh-EEB), Euphorbia
59
timmyfolia (Et-EEB) e Euphorbia hyssopifolia (Ehy-EEB)....................................
4.3.2. Preparação do extrato da flor da espécie Euphorbia hirta........................
59
4.3.3. Partição dos extratos de E. hirta, E. timmyfolia e E. hyssopifolia..............
60
4.4. Prospecção fitoquímica prfeliminar.............................................................
61
4.5. Isolamento e purificação dos constituintes químicos de E. hirta.
64
4.5.1. Fracionamento cromatográfico da fase diclorometano do extrato da flor
de E. hirta.............................................................................................................
66
4.5.2. Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto da flor da
espécie E. hirta....................................................................................................
68
4.6. Métodos de análise.......................................................................................
70
4.6.1. Métodos cromatográficos...........................................................................
70
4.6.2. Métodos espectrofotométricos...................................................................
71
4.6.3.. Métodos espectrométricos........................................................................
71
xviii
4.7. Estudos fitoquímicos.....................................................................................
72
4.7.1. Determinação do teor de fenóis totais ......................................................
72
4.7.2. Determinação do teor de flavonoides totais...............................................
72
4.8. Avaliação da atividade antioxidante.............................................................
73
4.8.1. Método do sequestro do radical DPPH (2,2- Difenil- 1picrilhidrazil)..........
73
4.8.2. Método da inibição da autooxidação do β- caroteno.................................
74
4.9. Avaliação da atividade antibacteriana..........................................................
74
4.10. Análise estatística.......................................................................................
76
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................
77
5.1. Fracionamento do extrato etanólico das espécies E. hirta, e. timmyfolia e
E. hyssopifolia .....................................................................................................
78
5.2. Perfil fitoquímico preliminar dos extrato e fases...........................................
81
5.3. Caracterização estrutural das substâncias Eh-1, Eh-2 e Eh-3.....................
85
5.3.1. Caracterização estrutural da substância Eh-1..........................................
85
98
102
5.4. Fenóis totais, flavonoides totais e atividade antioxidante in vitro.................
112
5.5. Avaliação da atividade antibacteriana..........................................................
114
6. CONCLUSÃO.................................................................................................
122
7. REFERÊNCIAS...............................................................................................
124
APÊNDICES.......................................................................................................
136
1. INTRODUÇÃO
20
BEZERRA, G. S. Estudo Fitoquímico e Biológico “in vitro” de Espécies do Gênero Euphorbia:
E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia L. (EUPHORBIACEAE).
1. INTRODUÇÃO
As plantas são utilizadas desde os primórdios da civilização para tratamento e
cura de enfermidades, o que propiciou uma das bases mais importantes para o
nascimento da medicina (NOLDIN et al., 2006).
Durante séculos, a única fonte de agentes terapêuticos para o homem eram
as plantas. No início do século XIX, com o desenvolvimento da química, as plantas
passaram a representar a primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de
medicamentos (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006; ZARONI et al., 2004;
HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003).
Nos últimos anos tem-se verificado um grande avanço científico envolvendo
os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos
compostos com propriedades terapêuticas (FILHO e YUNES, 1998).
A utilização de plantas na terapêutica, enquanto elemento cultural de um povo
é importante fonte preliminar de informação na pesquisa com vistas ao
desenvolvimento e promoção do uso racional de fitoterápicos (MARIZ et al., 2010).
Muitas das propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela
população, as quais são confirmadas em sua maioria, nos estudos científicos,
comprovando a importância da pesquisa etnofarmacológica. Tais propriedades
propiciaram o desenvolvimento de vários medicamentos, sejam estes obtidos por
síntese a partir de molécula protótipo ou através de isolamento, algumas vezes,
biomonitorado (NOLDIN et al., 2006).
Empresas estão conscientes das tendências de consumo, e buscam novos
ingredientes para incorporar aos produtos já existentes e aos que poderão ser
desenvolvidos no futuro. Uma tendência que está se destacando é o aumento na
procura por parte da população, de produtos funcionais baseados em ativos ou
ﬁtoterápicos (ROCHA FILHO, 1995; OLIVEIRA; BLOISE,1995).
Devido a todos estes aspectos, vê-se um interesse crescente na utilização e
pesquisa de plantas medicinais, objetivando fins terapêuticos, aliadas à boa
aceitabilidade destes produtos no mercado farmacêutico e as altas cifras que
circundam a comercialização de fitomedicamentos, observada na última década
(NOLDIN et al., 2006).
O Brasil é o país com maior potencial para pesquisa com espécies vegetais,
21
pois detém a maior e mais rica biodiversidade do planeta, distribuída em seis biomas
distintos (NOLDIN et al., 2006). Com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo
o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar
de sua vocação para os produtos naturais (PINTO et al, 2002). Possui a maior e
mais rica biodiversidade do planeta (NOLDIN, 2006).
A Caatinga, um bioma característico por apresentar vegetação arbustiva do
nordeste do Brasil, suporta uma alta, ainda pouco estudada, diversidade de recursos
vegetais (TRETIN et al., 2011). Considerado como o principal ecossistema do
Nordeste do Brasil, o bioma caatinga, uma palavra indiana que significa Floresta
aberta, assim chamada por causa de sua aparência durante a estação seca. Ele
consiste de extensas planícies semiáridas encontradas principalmente na Região
Nordeste, do Piauí ao Norte de Minas Gerais, com exceção do estado do Maranhão
(Figura 1, p.21), sendo rica em espécies medicinais e aromáticas (SILVA;
ALBUQUERQUE, 2005).
Figura 1 - Região do Nordeste onde predomina o bioma caatinga.
Fonte: http://siscom.ibama.gov.br/monitorabiomas/ acesso em 13/01/2015
22
O uso elevado de plantas medicinais pela população brasileira ocorre devido
à imensa variedade de espécies vegetais com potencial terapêutico existentes em
nosso território, além do custo dessa prática ser relativamente baixo e, até mesmo,
por questões culturais (MARIZ et al., 2010).
As plantas medicinais endêmicas ainda são pouco conhecidas e se
constituem num fascinante assunto de pesquisa acadêmica em desenvolvimento.
Neste contexto, o químico de produtos naturais não só pode estar envolvido no
isolamento e identificação dos constituintes ativos, como também desenvolvendo
pesquisas na tentativa de validação de métodos analíticos modernos visando o
controle de qualidade destas plantas. A Química de Produtos Naturais (QPN) é,
dentro da Química brasileira, a área mais antiga e a que, talvez ainda hoje, congrega
o maior número de pesquisadores (PINTO et al, 2002).
Muitas são as propriedades terapêuticas conferidas às plantas em
decorrência dos princípios ativos desenvolvidos pelo seu metabolismo secundário.
Nesses organismos, os compostos são biossintetizados como um mecanismo
próprio de defesa para atuarem em alvos moleculares específicos de seus
predadores (FERREIRA; PINTO, 2010) e variam dependendo de uma interface
química entre as plantas e o ambiente circundante (Figura 2, p.23). Fato este que
interfere na quantidade e qualidade de produtos secundários resultantes de uma
planta em um determinado momento (GOBBO-NETO, 2007).
23
Figura 2 - Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos
secundários em planta.
Fonte: GOBBO-NETO, 2007
O gênero Euphorbia é considerado o maior da família Euphorbiaceae. Alguns
relatos mostram que espécies pertencentes a este gênero têm sido usadas como
medicamentos tradicionais chineses para tratar várias doenças há mais de mil anos,
uma vez que mostraram boa atividade antiinflamatória, antimalárica e antitumoral
(WU et al., 2012).
Euphorbia hirta, por exemplo, é utilizada na medicina popular chinesa no
combate
a
várias
doenças,
tais
como
disenteria,
eczema,
hematúria,
hipersensibilidade e problemas gastrointestinais. Alguns estudos mostram que essas
atividades estão relacionadas à presença de substâncias químicas isoladas nesta
planta, tais como diterpenos, triterpenóides, flavonóides, compostos fenólicos,
taninos, hidratos de carbono, hidrocarbonetos (WU et al., 2012).
Desta maneira para contribuir com o estudo de espécies do gênero Euphorbia
diante da imensa riqueza vegetal presente nos solos brasileiros, principalmente na
24
caatinga, e dos poucos estudos químicos e biológicos das espécies endêmicas
deste bioma exclusivamente brasileiro, este trabalho relata o estudo fitoquímico com
determinação estrutural de substâncias isoladas e avaliação de atividades
antioxidantes e antibacteriana in vitro de três espécies pertencentes a este gênero:
Euphorbia hirta, Euphorbia hyssopifolia e Euphorbia thymifolia.
2. OBJETIVOS
26
E. hirta, E. Hyssopifolia e E. thymifolia L. (EUPHORBIACEAE).
2.Objetivos
2.1. Geral
Contribuir para o estudo fitoquímico e biológico das espécies Euphorbia hirta, E.
hyssopifolia e E. thymyfolia (Euphorbiaceae).
2.2. Específicos
2.2.1 Identificar classes de metabolitos secundários presentes nas partes aéreas das
espécies Euphorbia hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia;
2.2.2 Elucidar a estrutura de constituintes químicos isolados das flores da espécie E.
hirta através das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 1H e
13
C (uni e
bidimensionais);
2.2.3. Avaliar o conteúdo fenólico e flavonoídico dos extratos e fases das três
espécies em estudo;
2.2.4 Avaliar as atividades antioxidante dos extratos e fases das partes aéreas das
espécies em estudo;
2.2.5 Avaliar a atividade biológica dos extratos e fases das partes aéreas das três
espécies através da atividade antibacteriana;
2.2.6 Contribuir para o estudo quimiotaxonômico e biológico de espécies do gênero
Euphorbia.
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
28
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Considerações sobre a família Euphorbiaceae
A família Euphorbiaceae conta com cerca de 317 gêneros e 8.000 espécies,
separadas em cinco subfamílias: Phyllanthoideae, Oldifieldioideae, Acalyphoideae,
Crotonoideae e Euphorbioideae, e distribuídas principalmente em regiões tropicais
(CARNEIRO-TORRES, SANTOS, GIULIETTI, 2002). Além de apresentar a maior
riqueza de espécies, provavelmente, em muitos habitats (VASAS; HOHMANN,
2010), é reconhecida como uma das mais extensas e complexas famílias das
Angiospermas (OLIVEIRA, 2013).
Os maiores centros de dispersão encontram-se nas Américas e na África. São
plantas de hábito variado, existindo na forma de ervas, subarbustos, árvores e
trepadeiras. Os gêneros mais expressivos da família são Euphorbia, com 1500
espécies, Croton (700), Phyllanthus (400), Acalypha (400), Macaranga (250),
Antidesma (150), Drypetes (150), Tragia (150), Jatropha (150) e Manihot (150). A
esta família pertence a mandioca, também conhecida como aipim e macaxeira,
possuidora de raízes tuberosas as quais são fonte de amido e farinha.
Umas das principais características das euforbiáceas é a presença de um
látex com aspecto incolor ou leitoso (HIROTA et al., 2010). Além disso, muitas
espécies desta família são tóxicas tendo sido a causa de intoxicação em humanos
em várias partes do mundo (OLIVERIA; GIMENEZ; GODOY, 2007).
Levantamentos florísticos no Brasil revelam que a família é uma das mais
ricas em número de espécies, cerca de 1.000, distribuídas em 80 gêneros com
representantes em todos os diferentes tipos de vegetação do país. Apresenta grande
número de espécies endêmicas da caatinga, cerca de 17, que apesar de ser um
dos biomas mais ameaçados do planeta, tem sido enfocado em poucos trabalhos,
principalmente no que diz respeito às caatingas arenosas (SÁTIRO; ROQUE, 2008).
As Euforbiáceas das caatingas arenosas do médio Rio São Francisco estão
representadas, segundo o sistema de classificação de Webster, por três subfamílias,
totalizando nove gêneros e 20 espécies: subfamília Acalyphoideae (Alchornea,
Dalechampia e Tragia); subfamília Crotonoideae (Croton, Jatropha, Cnidoscolus e
Manihot); e subfamília Euphorbioideae (Chamaesyce e Sapium) (SATIRO; ROQUE,
29
2008).
É a segunda família mais representativa da Caatinga em número de espécies,
superada apenas pela família Leguminosae (SANTOS; SCHRIPSEMA; KUSTER,
2005) e está entre as famílias de maior importância econômica entre as
Eudicotiledôneas, especialmente no setor farmacológico-medicinal, industrial,
madeireiro, ornamental e na produção de alimentos (OLIVEIRA, 2013).
Estudos fitoquímicos de espécies da família Euphorbiaceae demonstram a
presença de diversas classes de substâncias químicas, tais como tanino e lignana
(CUI; TAN, 2004), flavonoide (SANTOS; SCHRIPSEMA; KUSTER, 2005), alcalóide
(LEITE et al., 2005) e cumarina (LIMA et al., 2009) entre outros. Por exemplo, da
espécie Croton sellowii foram isolados terpenóides, flavonoides e fenilpropanóide
(JUNIOR et al., 2006).
São diversas as atividades biológicas apresentadas para esta família, como
por exemplo, para o gênero Croton têm sido relatados efeitos que incluem antihipertensivos, anti-inflamatórios, antimaláricos, antimicrobianos, antiespasmódicos,
antiulcerogênicos, antivirais e miorrelaxantes. Algumas espécies apresentaram
atividade antioxidante através do método do sequestro de radical livre DPPH·.
Análises fitoquímicas de extratos de plantas dessa família revela a presença de
triterpenos, esteroides, lactonas, taninos, fenóis, indicando que a atividade
antioxidante está correlacionada com a presença destes compostos (SALATINO;
SALATINO; NEGRI, 2007).
Foram realizados testes de atividade antibacteriana do látex e extratos de
Croton urucurana Baillon e verificou-se que o látex apresentou potente ação contra
todas as bactérias, com exceção da E. coli. Extratos em hexano, diclorometano e
etanol das folhas mostraram atividade contra S. pyogenes, K. pneumoniae, P.
aeruginosa, S. typhimurium, S. aureus e S. epidermidis
nas maiores doses
(MOSQUERA et al., 2007).
Oliveira e colaboradores (2008) realizaram testes de atividade antibacteriana
do látex e extratos de Croton urucurana Baillon e verificaram que os látex mostraram
potente ação contra todas as bactérias, com exceção da E. coli. Extratos em
hexano, diclorometano e etanol das folhas mostraram atividade contra S. pyogenes,
K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. typhimurium, S. aureus
maiores doses.
e S. epidermidis nas
30
3.2 Considerações sobre o gênero Euphorbia
O nome do gênero Euphorbia foi originado do nome do rei grego Euphorbos,
um incentivador do estudo das plantas medicinais para o tratamento dos males do
povo em seu reino, a partir da cicatrização das chagas de seu corpo pelo uso do
látex de uma espécie laticífera não especificada (VARRICCHIO et al., 2008). Este
gênero caracteriza-se pela presença de um látex branco leitoso que é considerado
tóxico e utilizado como ingrediente em venenos de flecha (KUMAR; MALHOTRA;
KUMAR, 2010).
O gênero Euphorbia pertence à família Euphorbiaceae e inclui mais de 2.000
espécies amplamente distribuídas ao redor do mundo (CHEN, 2014), sendo mais
comuns em regiões temperadas (VASAS; HOHMANN 2013), particularmente na
África e na América. Na China, existem cerca de 80 espécies distribuídas no
sudoeste e noroeste (CHEN, 2014). Este gênero é considerado maior da família
Euphorbiaceae. Algumas espécies têm sido utilizadas como medicamentos
tradicionais chineses no combate a doenças há mais de mil anos, por apresentarem
uma infinidade de atividades, tais como anti-inflamatória, antimalárica e antitumoral
(WU et al., 2012).
Espécies deste gênero consistem de grande importância econômica, tais
como: Euphorbia tetragonal e Euphorbia triangularis das quais se extrai a borracha,
Euphorbia antisyphylitica a cera de candelila (VASAS; HOHMANN 2013).
Os diterpenos são considerados marcadores taxonômicos para as famílias
Euphorbiaceae, mais de 650 diterpenóides, incorporando mais de 20 tipos de
estruturas foram isoladas de plantas do gênero Euphorbia (Quadro 1, p. 32) (VASAS;
HOHMANN 2013), logo são considerados marcadores taxonômicos deste gênero
(CHEN, 2014), diterpenos presentes em plantas deste gênero são objeto de estudo
na química de produtos naturais, no intuito da descoberta de princípios ativos
possíveis de serem utilizados como medicamentos em razão da variedade de suas
atividades
biológicas
terapeuticamente
relevantes
(anti-tumoral,
citotóxica,
propriedades antivirais). Estas atividades estão relacionadas a diversidade
estrutural, resultante de diferentes esqueletos macrocíclicos e policíclicos ( jatrofano,
ingenano, dafnano, tigliano, latirano, etc.), contendo
incluindo
esqueletos
diferentes funcionalidades,
alifáticos (acetil, n-butanoil, isobutanoil, metilbutanoil, tiglil,
31
angeloyl, isovaleroyl, etc.) e ácidos aromáticos (de benzoil e nicotinoil) (VASAS;
HOHMANN, 2013 ).
Espécies de Euphorbia são famosas pela diversidade química dos seus
constituintes isoprenóides, especialmente diterpenos bioativos (YANG et al., 2014).
Investigações fitoquímicas sobre o gênero Euphorbia revelaram a presença de
diterpenos,
triterpenos,
sesquiterpenóides,
floracetophenones,
cerebrosídeos,
glicerois, flavonoides e esteroides (CHEN et al., 2014).
Apesar do grande número de estudos enfocando espécies do gênero
Euphorbia, muitas espécies brasileiras são desconhecidas (TORRES, 2002). Desta
forma,
tornam-se
importantes
os
estudos
com
espécies
deste
gênero,
principalmente em áreas de caatinga, no intuito de propiciar informações que
possam ser utilizadas em programas de conservação (SATIRO; ROQUE, 2008).
32
Quadro 1: Tipos de esqueletos de diterpenos encontrados no gênero Euphorbia
Rosano
Abietano
Atisano
Kaurano
Casbano
Jatrifano
Latirano
33
Mirsiano
Premirsiano
Ciclomirsiano
Pepluano
Dafnano
Ligliano
Ingenano
(VASAS; HOHMANN, 2013)
Foram também encontrados em espécies deste gênero flavonoides,
principalmente do tipo flavonol, como campferol e quercetina, glicosilados, como 3glícosides, 3-rhamnosideos, 3-arabinósideos, 3-glícuronideos e 3-rutinosideos. A
34
apigenina-7-glícósideo foi isolado apenas de E. granulata e E. prostrata
(KAWASHTY et al, 1990). No Quadro 2 p.34, estão descritos alguns metabólitos
secundários isolados do gênero Euphorbia.
Quadro 2. Exemplos de alguns metabólitos secundários encontrados no gênero
Euphorbia.
Estrutura química
Referência
(MARTÍNEZ-FLÓREZ
al., 2002)
Eter- 3β- hidrixicicloart-23-ene-25-metil
TANAKA et al., 1999)
3β-hidroxi-4α,14α-dimetil-5α-ergosta8,24(28)-dien-7-ono
et
35
(YIN, HU, LOU, 2004)
Quercetina-3-O-β-D-galactosídeo
(SOHRETOGLU, SAKAR,
STERNER, 2009)
Quercetina-3-O-(3″-Ogaloigalactopiranosídeo
36
(OLIVEIRA, et al., 2000)
Ácido 9β-hidroxicostus
(KLOCHKOV;
AFANASEVA;
PUSHIN,
2006)
Isoalantolactono
(SHIBASAKI, 2000)
12,13 dideoxi-16-hidroxiforbol
37
(VASAS; HOHMANN,
2013)
Ácido Bisinshanico A
(VASAS; HOHMANN,
2013)
Pekineral
(VASAS; HOHMANN,
2013)
Euphoirbina L
38
(VASAS; HOHMANN,
2013)
Euphornina N
(VASAS; HOHMANN,
2013)
Euphorbialoide L
3.3 Considerações sobre a espécie Euphorbia hirta
Euphorbia hirta L. (Figura 3, p.39), conhecida popularmente como ervaandorinha, erva-de- santa luzia, folha-de-leite ou eufórbia (PINTO et al., 2002) é uma
planta herbácea selvagem muito comum em todos os países tropicais, incluindo a
Índia. As hastes com muitas ramificações a partir da base para o topo, são delgadas
e muitas vezes de cor avermelhada, coberta com amarelado eriçado e pêlos
especialmente nas partes mais jovens. As folhas são opostamente dispostas,
lanceoladas e são normalmente esverdeada ou avermelhada por baixo, medindo
cerca de 5 cm de comprimento. O caule e folhas produzem suco leitoso quando
cortado (BHRASKARA RAO et al., 2010).
39
Figura 3- Euphorbia hirta.
Fonte: Autora
.
Muitos estudos têm sido feitos sobre E. Hirta (Figura 3) a maioria envolve
toda a planta ou apenas folhas (RAJEH et al., 2010).
E. hirta tem sido utilizada em caso de distúrbios respiratórios, tais como
asma, bronquite, espasmo laríngeo (CORRÊA, 1984), e no tratamento de amebíase
intestinal (NEWALL et al., 2002). Possui atividades antibacteriana (VIJAYA et al.,
1995; SUDHAKAR et al., 2006), antifúngica (POLACHINI, 2004), antiretroviral
(GYURIS et al, 2009) antiespasmódica, antianafilática (PINTO, 2014), antialérgica
(SINGH et al., 2006), ansiolítica (ANURADHA et al., 2008), antimalárica (LIU et al.,
2007), anti-leucêmica (JAIN et al., 2009) e anti-inflamatória contra asma (EKPO;
PRETORIUS, 2007).
Estudos também demonstraram que esta planta diminui a motilidade
gastrintestinal (HORE et al., 2006), reduz a degeneração da cartilagem em casos de
artrite (LEE et al., 2008), é antidepressiva (LANHERS et al., 1996), sedativa e
40
ansiolítica (LANHERS et al,1990), e pode apresentar diarreia severa como principal
efeito colateral, se utilizada em altas doses (AL-QURA'N, 2005).
Liu e colaboradores (2007) relatam a presença de alcanos, triterpenos,
fitosterois, taninos, polifenois e flavonoides (LIU et. al., 2007; KUMAR, 2010). O
quadro abaixo mostra alguns triterpenos isolados da espécie E. hirta.
Quadro 3- Triterpenos isolados de Euphorbia hirta
Estrutura química
Nome
Taraxerona
25-hidroperoxicicloart-23-en-3 β -ol
24-hidroperoxicicloart-25-en-3 β –ol
(R= OH)- Cicloartenol
(R=Ácidos graxos de cadeia longa)Àcido graxo do cicloartenol
41
(R= OH) – Lupeol
(R=Ácidos graxos de cadeia longa)Acido graxo do lupeol
(R= OH) – α- Amirina
(R=Ácidos graxos de cadeia longa)Ácido graxo da α-amirina
(R= OH)- β- Amirina
(R=Ácidos graxos de cadeia longa)Àcido graxo da β- amirina
(RAGASA; CORNELIO, 2013)
3.4 Considerações sobre a espécie Euphorbia thymifolia L.
Euphorbia thymifolia (Figura 4, p.42) é uma erva medicinal pantropical usado
como diurético e laxante em Taiwan e no tratamento de problemas abdominais e de
pele, no sudeste da Ásia (LEE et al., 1990). Pode ser encontrada em toda a Índia em
planícies baixas. Suas folhas secas e sementes são usadas como estimulante,
adstringente, anti-helmíntico, emoliente e laxante (GANPATI et al., 2011). A raiz é
utilizada no tratamento de amenorréia e gonorréia. O suco da planta é empregado
no sul da Índia como vermífugo. O pó da planta é utilizado como remédio para
picadas de répteis venenosos, já com a adição de cloreto de amônio é empregado
no tratamento contra caspa. Além disso, a planta possui atividade antioxidante,
antiviral, antimicrobiana e anti peroxidação lipídica (MALI; PANCHAL, 2013).
42
Figura 4- Euphorbia thymifolia.
FONTE: Autora.
Constituintes químicos como taninos hidrolisáveis, ácido isomalotíneo,
alcalóides, quercetrina, hexacosenol, euforbol, epitaraxerol foram isolados desta
espécie (GANPATI et al., 2011). Foram encontrados poucos relatos na literatura
sobre a espécie Euphorbia thymifolia.
43
3.5 Considerações sobre a espécie Euphorbia hyssopifolia L.
Euphorbia
brasiliensis
hyssopifolia
var.hyssopifolia
(L.)
L.,Chamaesyce
são
hyssopifolia
sinonímias
desta
(L.),
espécie
Euphorbia
da
família
Euphorbiaceae (LUCENA, 2009).
Figura 5- Euphorbia hyssopifolia.
Fonte: Autora.
Segundo Agra e colaboradores (2007), a euphorbia hyssopifolia L. (Figura 5,
p.43), conhecida popularmente por “erva-de-leite” ou “burra leiteira”, é utilizada na
medicina tradicional para o tratamento da conjuntivite e úlceras externas.
Foram encontrados poucos relatos sobre a espécie E. hyssopifolia L.,
entretanto como mostram estudos científicos com espécies congêneres estas
plantas provavelmente possuem compostos farmacologicamente ativos (AGRA;
44
FREITAS; FILHO, 2007)
3.6 Considerações gerais sobre flavonoides
Flavonoides são metabólitos secundários (polifenois) de plantas que estão
subdivididas nas classes: flavonas, flavanonas, isoflavonas, flavonóis, flavanóis e
antocianinas (SIMÕES, 2010).
A maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbono em
seu núcleo fundamental, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três
carbonos entre elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são chamadas núcleo A,
B e C e os átomos de carbono recebem a numeração com números ordinários para
os núcleos A e C e os mesmos números seguidos de uma linha („) para o núcleo B.
Alguns autores substituem a numeração 9 e 10 no flavonoides por 8a e 4a,
respectivamente. As chalconas, excepcionalmente, possuem uma numeração
diferente (SIMÕES, 2012).
O que diferencia os flavonóis dos demais flavonóides é a presença do grupo
hidroxílico (na posição 3) e do grupo carbonílico (na posição 4) no anel C (Figura 6,
p. 44). Os flavonóis ocorrem em alimentos geralmente como O-glicosídeos, com
mono, di ou trissacarídeos ligados em sua maioria, na posição 3, e em alguns casos,
na posição 7. Os glicosídeos mais encontrados são glicose, galactose, ramnose e
frutose (MATSUBARA; MAIA 2006).
Figura 6 - Estrutura básica dos flavonoides
Fonte: MARTINEZ- FLORES et al., 2002
45
São conhecidos, mais de 4200 flavonoides diferentes, sendo que o número de
flavonoides aumentou nos últimos 20 anos. Os flavonóides de origem natural
apresentam-se, frequentemente, oxigenados e um grande número ocorre conjugado
com açucares (SIMÓES et al., 2010). O quadro 4, p. 46 mostra classes de
flavonoides e algumas características conhecidas.
46
Quadro 4- Classes de flavonoides e algumas características conhecidas.
Número aproximado
Classes
de estruturas
Características
conhecidas
Flavonas, flavonóis e seus Oheterosídeos
Co-pigmentação em flores,
1660
protetores contra raios UV
nas folhas
Pigmentação do vermelho
C-heterosídeos
303
Antocianinos
256
Pigmentação amarela
Chalconas
197
Pigmentação amarela
até o azul
Estão presentes
Auronas
29
frequentemente em tecidos
de madeira
Di-hidro-flavonóis
110
Flavonas
319
Di-hidro-chalconas
71
Flavanas, leucoantocianidinas e
proantocianidinas
309
Podem apresentar sabor
amargo
Podem apresentar sabor
amargo
Substâncias adstrigentes
com propriedades tanantes
Propriedades estrogênicas e/
ou antifúngicas
Isoflavonoides
630
_
Neoflavonoides
70
_
Biflavonoides
134
Propriedades antifúngicas
Outras estruturas
100
_
(SIMÓES et. al. 2010)
Os flavonoides são sintetizados em plantas e participam da fase luzdependência durante a fotossíntese, no qual catalisam o transporte de elétrons. São
47
sintetizados a partir de aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, em conjunto
com unidades de acetato. A fenilalanina e a tirosina dão origem ao ácido cinâmico e
ao ácido para-hidroxicinâmico, respectivamente, que mediante condensação com
unidades de acetato, originam a estrutura cinamoil dos flavonoides (MIDDLETON;
KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000). Subsequentemente derivados glicosilados
ou sulfatados são formados (MARTINEZ- FLÓREZ et al., 2002).
Os flavonoides são biossintetizados por meio de uma combinação do ácido
chiquímico e vias acilpolimalonato. Um derivado de ácido cinâmico (fenilpropano),
sintetizado a partir do ácido chiquímico, atua como composto de partida na síntese
de um policetideo, em que um de três resíduos de acetato adicionais são
incorporadas na estrutura (Figura 7, p. 48). Isto é seguido pelo fechamento do anel.
Através de hidroxilações e reduções subsequentes, as plantas são então capazes
de formar diferentes classes de flavonoides (SIMÕES et. al., 2010).
.
48
Figura 7- Esquema simplificado da origem biossintética dos flavonoides
(adaptado de SIMÕES et. al., 2010).
Os flavonoides têm recebido muita atenção nos últimos anos devido aos
vários efeitos benéficos observados. Por causa do efeito antioxidante, eles tornaramse importantes compostos dietéticos com promissor potencial terapêutico. Relatos e
evidências epidemiológicas sugerem que dietas ricas em flavonóides, como a
quercetina, têm efeitos na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares,
câncer e insuficiência renal e hepática. Entretanto, pouco se conhece sobre a
biodisponibilidade, absorção e metabolismo dos polifenóis em humanos, pois seu
estudo é complexo e os dados são escassos (BIANCHI et al., 2004)
3.7 Considerações sobre terpenoides
Os terpenoides constituem uma grande variedade de substâncias vegetais,
sendo que este termo é empregado para designar todas as substâncias cuja origem
biossintética deriva de unidades de isopreno. A unidade isoprênica, por sua vez,
origina-se a partir de via de biossíntese: também conhecida como via do acetatomevalonato, responsável pela formação dos sesquiterpenos (C15) e triterpenos
49
(C30), que ocorre no citosol e cujos precursores são piruvato e acetil-coA; e a via
alternativa, conhecida como via do metileritritol fosfato (MEP), que origina os
monoterpenos (C10), diterpenos (C20) e tetraterpenos (C40), ocorre nos plastídeos
e cujos precursores são piruvato e gliceraldeído-3-fosfato (SIMÕES et al., 2010;
OOTANI et al., 2013).
As agliconas dos esteroides e triterpenos têm a mesma origem até a
formação do óxido de esqualeno. Para os esteroides, o óxido de esqualeno cicliza
numa conformação cadeira-barco-cadeira-barco formando o cicloartenol (em algas e
plantas verdes) ou o lanosterol (em fungos e organismos não fotossintéticos) após
vários rearranjos. Após clivagem oxidativa de três metilas, o cicloartenol, entre outros
compostos forma os esteroides (Figura 8, p. 50). Os diversos terpenos apresentam
funções variadas nos vegetais. Os monoterpenos e sesquiterpenos são constituintes
dos óleos voláteis, sendo que os primeiros atuam na atração de polinizadores. Os
sesquiterpenos, em geral, apresentam funções protetoras contra fungos e bactérias,
enquanto muitos diterpenoides dão origem aos hormônios de crescimento vegetal.
Os triterpenoides e seus derivados, os esteroides, apresentam função protetora
contra herbívoros; alguns são antimitóticos e outros atuam na germinação das
sementes e na inibição do crescimento da raiz. Atualmente, estima-se que de 3.000
óleos voláteis conhecidos, 300 são comercialmente importantes na indústria
farmacêutica, agronômica, alimentícia, sanitária, cosmética e de perfumaria e
aromaterapia (OOTANI et al., 2013).
50
Figura 8 – Esquema da biossíntese de terpenos e esteroides
Fonte- SIMÕES et al., 2010
51
3.8 Considerações sobre a atividade antioxidante
Os radicais livres, vem sendo considerados nos últimos anos como grandes
causadores de várias doenças como câncer, doenças cardiovasculares, catarata,
declínio do sistema imune, disfunções cerebrais e diabetes mellitus tipo I.
No
entanto, quando em excesso, podem gerar o estresse oxidativo (EO), que pode ser
definido como as circunstâncias nas quais os radicais livres causam danos teciduais
(SOUSA et al., 2007).
Os mecanismos pelos quais essas patologias se desenvolvem, geralmente
envolvem alterações oxidativas de moléculas consideradas críticas, o que inclui
proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos além das substâncias envolvidas na
modulação da expressão gênica e em respostas inflamatórias (KAWANISHI et al.,
2002; LAGUERRE; LECOMTE; VILLENEUVE, 2007).
A produção de radicais livres ocorre naturalmente durante ações catalíticas
de enzimas, no metabolismo celular ou pela exposição à fatores exógenos
(BARREIROS et al., 2006; BIANCHI e ANTUNES., 1999).
Essa produção é controlada nos seres vivos por diversos compostos
antioxidantes, os quais podem ter origem endógena (por ex., superóxido dismutase),
ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Destas últimas destacamse tocoferóis (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), polifenóis, selênio e
carotenóides. Quando há limitação na disponibilidade de antioxidantes podem
ocorrer lesões oxidativas de caráter cumulativo. Os antioxidantes são capazes de
estabilizar ou desativar os radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas
células (COSTA et al., 2007).
Um organismo encontra-se sob EO quando ocorre um desequilíbrio entre
sistemas prooxidantes e antioxidantes, de maneira que os primeiros sejam
predominantes (BIANCHI; ANTUNES, 1999; SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004). O
excesso desses radicais pode ser combatido por antioxidantes produzidos pelo
corpo ou adquiridos de forma exógena. De acordo com Sousa e colaboradores
(2007),
denominam-se
concentrações
baixas,
antioxidantes,
comparadas
as
ao
substâncias
substrato
que
presentes
oxidável,
em
retardam
significativamente ou inibem a oxidação do substrato (BARREIROS et al., 2006).
Hoje em dia, há um interesse perceptível em antioxidantes, especialmente
52
naqueles que pode impedir os efeitos deletérios presumidos de radicais no
organismo humano, e para evitar a deterioração de gorduras e outros componentes
de alimentos. Em ambos os casos, há uma preferência para os antioxidantes
naturais, em vez de sintéticos. Atualmente, a maioria dos antioxidantes são
fabricados sinteticamente. A principal desvantagem dos antioxidantes sintéticos são
os efeitos colaterais. Estudos anteriores relataram que o butilhidroxianisol (BHA) e
butilhidroxitolueno (BHT) acumulam-se no corpo e pode resultar em danos no fígado
e carcinogénese (BASMA et al., 2011).
Assim, pesquisas têm se voltado para
descoberta de produtos naturais com atividade antioxidante.
3.9 Considerações sobre a atividade antibacteriana
A busca de substâncias com atividades antimicrobianas tem direcionado a
atenção sobre os produtos naturais e, entre estes, os derivados das plantas
superiores têm, nos últimos anos, despertado a investigação para o potencial da
flora brasileira (ALMEIDA et al., 1998; ALVES et al., 2000; RATES, 2001;
SUFFREDINI et al., 2004; MICHELIN et al., 2005; LIMA et al., 2006).
Com relação às bactérias patogênicas, um problema crescente e preocupante
é o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos (NOSTRO et al. 2004,
GEORGOPAPADAKOU, 2005). Para pacientes, a resistência antimicrobiana
aumenta a morbidade e mortalidade, enquanto que para as instituições de saúde
significa aumento de custos (DANCER, 2001; COUTINHO et al., 2009). No que diz
respeito à crescente importância dada as infecções bacterianas em comunidades
hospitalares e o desenvolvimento progressivo da resistência antimicrobiana, um
grande número de pesquisas vem sendo realizadas enfatizando as propriedades
antibacterianas de produtos vegetais (HERNÁNDEZ et al. 2003).
Produtos naturais de origem vegetal podem alterar o efeito de antibióticos,
seja aumentando ou reduzindo a atividade antibiótica (COUTINHO et al. 2009). Nos
últimos anos, muitas plantas têm sido avaliadas não só pela atividade antibacteriana,
mas também como um agente modificador da atividade antibiótica (GURIB-FAKIM
2006).
Atualmente, o método de diluição é usado para determinar a concentração
mínima de um agente necessário para inibir ou matar um microrganismo. Os
53
procedimentos para determinar a atividade inibitória podem ser realizados tanto
pelas técnicas de diluição em caldo ou em ágar. Os agentes antimicrobianos são
geralmente testados em diluições consecutivas, e a menor concentração capaz de
inibir o crescimento de um organismo é considerada como a Concentração Inibitória
Mínima (CIM). As CIM‟s são consideradas excelentes ferramentas para determinar a
susceptibilidade dos organismos aos antimicrobianos e, portanto, usadas para julgar
a performance de todos os outros métodos de susceptibilidade. Nos laboratórios de
diagnóstico, as CIM‟s são também usadas como uma ferramenta de pesquisa para
determinar a atividade in vitro de novos antimicrobianos (ALVES et al., 2008).
4. Material e métodos
55
E. hirta, E. Hyssopifolia e E. thymifolia L. (EUPHORBIACEAE)
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Coleta e identificação do material botânico
O material botânico das partes aéreas das espécies em estudo Euphorbia
hirta L., E. hyssopifolia L. e E. thymifolia L. foram coletados em março de 2013, na
cidade de Petrolina-PE. O material foi comparado às exsicatas de números #0786
(figura 9, p. 55), #1052 (figura 10, p.56), #11838 (figura 11, p.67), respectivamente
do Herbário da Univasf (HVASF).
Figura 9- Exsicata nº # 0786 de Euphorbia hirta L. do HVASF
Fonte: HVASF.
56
Figura 10- Exsicata nº # 1052 de Euphorbia hyssopifolia L. do HVASF
Foto: HVASF
57
Figura 11- Exsicata nº # 11838 de Euphorbia thymifolia L. do HVASF
Foto: HVASF
58
4.2 Fases no desenvolvimento da pesquisa
Fluxograma 1- Resumo geral da metodologia da pesquisa
Material vegetal
(partes aéreas)
Secagem do material
botânico e pulverização
Maceração com
etanol
Extrato etanólico bruto
(EEB)
Cromatografia à vácuo
Triagem fitoquímica preliminar
Frações: Hexânica, clorofórmica,
acetato de etila e metanólica
Avaliação das atividades
antioxidante e antibacteriana
Separação por
técnicas
cromatográficas
Identificação por
técnicas
espectrométricas
Compostos
isolados
59
4.3 Processamento do Material Vegetal
4.3.1 Obtenção dos extratos de E. hirta (Eh-EEB), E. thymifolia (Et-EEB) e E.
hyssopifolia (Ehy-EEB)
As partes aéreas de cada espécie permaneceram em estufa separadamente,
a aproximadamente 50ºC por 72 horas para retirada de umidade. Após secagem o
material foi pulverizado em moinho de facas. O material botânico seco foi pesado e
devidamente acondicionado em um sistema de extração do tipo percolador. Em
seguida foi adicionado o solvente de extração etanol, o material permaneceu em
repouso por 72 horas. Em seguida a solução extrativa alcoólica foi retirada do
equipamento e submetida à destilação do solvente em evaporador rotativo para
obtenção do extrato etanólico bruto de E. hirta (Eh-EEB), que pesou 15 g, E.
thymifolia (Et-EEB), que pesou 5 g e E. hyssopifolia (Ehy-EEB) que pesou 6 g. Com
os extratos etanólicos brutos obtidos foram realizados ensaios para quantificação de
fenóis totais, flavonoides totais, atividade antioxidante, atividade antibacteriana e
para avaliação fitoquímica preliminar. Uma quantidade de extrato foi reservada e em
seguida particionada para o isolamento dos constituintes químicos, sendo que a
espécie escolhida para realização do isolamento e purificação dos constituintes
químicos foi a espécie E. hirta, pelo fato de ter apresentado um maior rendimento do
extrato etanólico bruto.
4.3.2 Preparação do extrato das flores da espécie Euphorbia hirta
Após ter sido separada da planta, a flor (Figura 12, p.63) permaneceu em
estufa a aproximadamente 50ºC por 72 horas para retirada de umidade. Após
secagem o material foi pulverizado com o auxílio de um grau e pistilo. O material
botânico seco foi pesado e devidamente acondicionado para realização de uma
extração com diclorometano. Em seguida foi adicionado o solvente de extração
diclorometano, o material permaneceu em repouso substituindo o solvente a cada 72
horas até completo esgotamento da droga. Em seguida a solução extrativa foi
retirada do equipamento e submetida à destilação do solvente em evaporador
60
rotativo para obtenção do extrato bruto diclorometânico das flores de E. hirta.
Após esta extração uma segunda extração foi realizada com o solvente
etanol, o material permaneceu em repouso por mais 72 horas. Em seguida a solução
extrativa alcoólica foi retirada do equipamento e submetida à destilação do solvente
em evaporador rotativo para obtenção do extrato etanólico bruto das flores de E.
hirta ( Figura 12, p.60).
Figura 12- Flor de Euphorbia hirta
Fonte: Autora
4.3.3 Partição dos Extratos de E. hirta , E. thymifolia e E. hyssopifolia
Com o extrato etanólico bruto das espécies Euphorbia hirta, E.hyssopifolia e
E. thymifolia foram realizadas partições através de um sistema de cromatografia à
vácuo com os solventes de polaridade crescente hexano, clorofórmio, acetato de
etila e metanol para obtenção das frações. As frações também foram submetidas à
determinação de fenóis totais e à avaliação antioxidante.
61
4.4 Prospecção fitoquímica preliminar
A pesquisa fitoquímica preliminar (Figura 13, p.63) busca destacar a presença
de constituintes químicos presentes no material vegetal. Foram realizados testes
para a identificação de fenóis e taninos (cloreto férrico 2%), flavonoides (Shinoda),
alcaloides
(Dragendorff,
Mayer
e
Bouchardat),
esteroides
e
terpenoides
(Liebermann-Burchard), segundo metodologia descrita por Matos (1997). Foi
realizada uma triagem fitoquímica utilizando placas de camada fina de gel de sílica
60 F254 com suporte de alumínio. O extrato etanólico e as frações obtidas na
partição foram aplicados com o auxilio de um tubo capilar.
Assim, tocou-se a
extremidade na superfície da fase estacionária e o líquido foi transferido por
capilaridade para a superfície da placa. Posteriormente, tais placas foram eluídas
em diferentes sistemas de solventes, tal como descrito por Sobrinho e
colaboradores, 2012, buscando identificar qualitativamente a presença dos principais
grupos de metabolitos secundários, conforme expresso na Tabela 1.
62
Tabela 1.
Sistemas de eluição e reveladores utilizados na triagem fitoquímica
preliminar das espécies Euphorbia hirta Euphorbia thymifolia e Euphorbia
hyssopifolia.
Fitoquímica
Sistema de eluição
Alcaloides
Tolueno:
Revelador
acetato
de Reagente de
etila: dietilamina
Dragendorff
(70:20:10, v/v)
Derivados antracenicos
acetato
de
etila: Reagente KOH
metanol:
água etanólico 10%
(100:13,5:10,
v/v)
Cumarinas
Tolueno: éter etílico (1:1 Reagente KOH
saturado com ácido
etanólico 10%
acético 10%, v/v)
Flavonoides e taninos
acetato de etila: ácido Reagente de NEU
fórmico: ácido acético
glacial:
água
(100:11:11:26, v/v)
Lignanas
Clorofórmio:
metanol: Reagente de vanilina
água (70:30:4, v/v)
Mono e diterpeno
Tolueno: acetato de etila Reagente de vanilina
(93:7, v/v)
Naftoquínonas
Sulfúrica
Tolueno: ácido fórmico Reagente KOH
(99:1, v/v)
Terpenos e esteroides
Fosfórica
Tolueno:
etanólico 10%
clorofórmio: Reagente de
etanol (40:40:10, v/v)
Lieberman-Burchard
63
Figura 13 – Triagem fitoquímica
Fonte: Autora
64
4.5. Isolamento e purificação dos constituintes químicos de E. hirta.
O isolamento, a purificação e a análise dos constituintes químicos de
Euphorbia hirta foram realizados utilizando os seguintes métodos cromatográficos:
cromatografia em coluna (CC) e cromatografia em camada delgada analítica
(CCDA). Na cromatografia de adsorção em coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60
(MACHEREY-NAGE), de partículas com dimensões entre 0,063-0,200 mm e
sephadex LH-20 (SIGMA) tendo como suporte colunas de vidro cilíndricas cujos
comprimentos e diâmetros variaram de acordo com a quantidade de amostra a ser
cromatografada (Figura 14, p. 65). As amostras foram aplicadas sobre o topo da
coluna, procedendo-se então a eluição com os solventes comerciais hexano,
Clorofórmio, Acetato de etila e Metanol, puros ou em misturas binárias, em ordem
crescente de polaridade.
A cromatografia em camada delgada (CCD) foi empregada para análise e
purificação das frações obtidas por CC. Na CCDA foi utilizada cromatofolhas de
alumínio de Sílica Gel 60 (MACHEREY-NAGE) (Figura 15, p.66).
65
Figura 14 – Coluna cromatográfica da fase diclorometano das flores de E. hirta
Foto: Autora
A revelação das substâncias em CCDA foi executada pela exposição das
cromatoplacas à radiação eletromagnética de comprimento de onda na região de
ultravioleta (UV) – 254 nm e 366 nm – em aparelho da marca BOITTON, bem como
por vanilina sulfúrica e impregnação das placas em cubas de vidro saturadas com
vapores de iodo. Por CCDA, as frações semelhantes foram reunidas de acordo com
os fatores de retenção. O grau de pureza foi determinado quando observada uma
única mancha após revelação da cromatoplaca nos reveladores já descritos.
66
4.5.1. Fracionamento cromatográfico da fase diclorometano das flores de
Euphorbia hirta.
A fase diclorometano (alíquota de 340,8 mg) foi cromatografada em coluna
utilizando Sílica como fase estacionária e fase móvel solventes em ordem crescente
de polaridade. Processo este que resultou em 152 frações (Tabela 2, p. 67). Após
análise em CCDA (Figura 15), estas foram reunidas em dez grupos de acordo com
seus Rf (Fluxograma 2, p.71). A fração 18-21 resultou no composto codificado como
Eh-1, solúvel em clorofórmio. A fração 26-28 resultou no composto codificado como
Eh-2, também solúvel em clorofórmio.
Figura 15 - Placas CCDA sílica de frações de E. hirta.
Foto: Autora
67
Tabela 2 – Fracionamento cromatográfico da fração diclorometânica de Euphorbia
hirta, frações coletadas e reunião das frações obtidas após análise em CCDA.
Hex (100%)
CHCl3:hex( 30:70)
CHCl3:hex (50:50)
ChCl3 (100%)
CHCl3:AcOet (30:70)
CHCl3:AcOet (50:50)
AcOet (100%)
MeOH:AcOet (30:70)
MeOH:AcOet (50:50)
Frações
coletadas
1 a 11
12 a 25
26 a 43
44 a 61
62 a 107
108 a 111
112 a 131
132 a 141
Reunião após
CCDA
1-11
12-17; 18-21; 2225
26-28; 29-43
44-61
62-73; 74-107
108-111
112-131
132-141
142 a 152
142-152
Obs.: As frações em negrito resultaram no isolamento das substâncias Eh-1 e Eh-2.
.
68
Fluxograma 2 – Fracionamento cromatográfico da fase diclorometânica das flores
de Euphorbia hirta.
Fração
diclorometânica
(340,8 mg)
10 grupos
18-21
26-28
Eh-1
(11mg)
Eh-2
(22mg)
4.5.2 Fracionamento do extrato etanólico das flores da espécie Euphorbia hirta.
O extrato etanólico bruto (alíquota de 2,2 g) foi cromatografado em coluna
utilizando sílica como fase estacionária e como fase móvel solventes em ordem
crescente de polaridade, processo este que resultou em 112 frações (Tabela 3,
p.69). Após análise em CCDA, estas foram reunidas em doze grupos de acordo com
seus Rf’s (Fluxograma 3, p.70). A fração 66-89 resultou no composto codificado
como Eh-3, solúvel em metanol.
As frações coletadas foram monitoradas por CCDA, e quando necessário, as
placas foram reveladas com vanilina sulfúrica 1% sob aquecimento. Baseado na
semelhança entre os fatores de retenção (Rf), as frações foram reunidas em grupos.
69
Tabela 3 – Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto das flores de
Euphorbia hirta, frações coletadas e reunião das frações obtidas após análise em
CCDA.
CHCl3 (100%)
AcOEt:CHCl3 (5:90)
AcOEt:CHCl3 (10:90)
AcOEt:CHCl3 (15:85)
AcOEt:CHCl3 (30:70)
AcOEt:CHCl3 (50:50)
AcOEt (100%)
MeOH:AcOEt ( 5:95)
Frações
coletadas
Reunião após
CCDA
1a6
1-6
7 a 20
7-20
21 a 23
24 a 27
28 a 29
30 a 32
33 a 36
37 a 38
MeOH:AcOEt (10:90)
39
AcOEt (20:80)
40 a 61
21-23
24-27
28-29
30-32
33-36
37-38
39
40-61
62-65; 66-89; 90MeOH:AcOEt (50:50)
62 a 101
101
Obs.: A fração em negrito resultou no isolamento da substância Eh-3
70
Fluxograma 3 – Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico bruto das flores
Euphorbia hirta.
Extrato etanólico
bruto (EEB) (2,2 g)
12 grupos
66-68
Eh-3 (12 mg)
4.6. Métodos de análise
4.6.1 Métodos cromatográficos
Para cromatografia de adsorção em coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60 (70230 mesh, ASTM) de partículas com dimensões entre 0,063-0,200 mm (MERCK),
tendo como suporte colunas de vidro cilíndricas cujas dimensões variaram de acordo
com a quantidade de amostra a ser cromatografada. Para cromatografia em camada
delgada (CCD), foi usada sílica gel 60 PF254 (MERCK). As frações foram
monitoradas por cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) da Silicycle
TLC – Aluminum F254, sugerindo que a amostra está pura quando observada uma
única mancha, sendo que a revelação das substâncias foi executada pela exposição
das placas em câmara de irradiação ultravioleta (254 e 366 nm). As placas foram
71
eluídas em sistemas de solventes distintos. Como eluentes foram utilizados os
solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, isoladamente ou em
misturas binárias, em gradiente crescente de polaridade.
4.6.2 Métodos espectrofotométricos
Para
execução
dos
métodos
espectrofotométricos
foi
utilizado
o
espectrofotômetro Quimis (Q798U2M) de monofeixe, operando em uma faixa de
trabalho de 190 a 1000 nm. Este método é utilizado para determinar a concentração
de uma amostra utilizando a técnica da espectrofotometria ou colorimetria, a qual
consiste na determinação da concentração de uma solução a partir da coloração
apresentada por ela, já que a intensidade da cor é proporcional à quantidade da
substância sobre a qual agiu o reativo. O espectrofotômetro mede a quantidade de
luz absorvida pela amostra comparando a intensidade de luz emitida pela fonte com
a intensidade de luz que emerge da amostra.
A lei de Beer diz que para as
radiações monocromáticas, a absorbância A é diretamente proporcional ao
comprimento do caminho b através do meio e à concentração c das espécies
absorventes. Esta relação é dada por: A = abc Em que a é uma constante de
proporcionalidade (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).
4.6.3 Métodos espectrométricos
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN de 1H) e
Ressonância Magnética Nuclear de
13
C (RMN de
13
C), uni e bidimensionais foram
obtidos em espectrômetros Bruker NMR (DPX 300), operando na frequência do
hidrogênio a 300 MHz e do carbono a 75 MHz e VARIAN operando a uma frequência
de 500 MHz e 125 MHz para hidrogênio-1 e carbono-13, respectivamente. As
amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se pequena quantidade das
mesmas nos solventes deuterados CDCl3 e MeOD. Os deslocamentos químicos (δ)
foram referenciados para RMN de 1H pelos picos característicos dos hidrogênios
pertencentes às frações não deuteradas destes solventes em relação ao TMS:
CDCl3 (δH = 7,23) e MeOD: (δH = 3,3). As multiplicidades das bandas de RMN 1H
72
foram indicadas segundo as convenções: s (singleto), d (dubleto), dd (duplo
dubleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).
4.7 Estudos fitoquímicos
4.7.1 Determinação do teor de fenóis totais
A determinação do teor de fenóis totais presentes nos extratos e fases foi
realizada utilizando reagente de Folin–Ciocalteu (SIGMA), conforme o método de
Slinkard e Singleton (1977) com adaptações dos volumes (ALMEIDA et al., 2011).
Inicialmente foram preparadas soluções do extrato, das fases e do padrão nas
concentrações de 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L e 1000 mg/L,
utilizando o etanol como solvente. Alíquotas de 40 μl de cada amostra (extrato, fases
e padrão) foram adicionadas a 3,16 ml de água destilada e 200 μl de reagente de
Folin-Ciocalteu. A mistura foi agitada e deixada em repouso durante 6 minutos, antes
da adição de 600 μl de solução de carbonato de sódio. O branco foi preparado
utilizando o procedimento descrito anteriormente, mas ao invés de utilizar 3,16 ml de
água usou-se 3,2 ml. As soluções foram deixadas a 20 °C durante 2 horas e a
absorbância de cada solução foi determinada em espectrofotometro UV-VIS
(Quimis) a 765 nm contra o branco. A absorção versus a concentração de cada
amostra foi plotada em gráfico e o teor de fenóis totais foi expresso como miligramas
de equivalentes de ácido gálico por grama de amostra (mg EqAG/g) através da
curva de calibração com ácido gálico. A faixa da curva de calibração foi 50-1000
mg/L. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
4.7.2 Determinação do teor de flavonoides totais
A determinação do teor de flavonoides totais foi realizada conforme método
descrito por Dewanto e colaboradores (2002), com adaptações. A técnica baseia-se
na medida da absorbância, em 510 nm, do complexo formado entre o flavonoide e o
alumínio do reagente de cor, formando compostos de coloração amarelada.
Foram preparadas soluções de cada extrato e fases nas concentrações de
73
50, 100, 150, 250, 500 e 1000 mg/L, diluídos em metanol. Posteriormente, uma
alíquota de 300 µL de cada solução foi misturada a 1,50 mL de água destilada em
um tubo de ensaio seguido da adição de 90 µL da solução de NaNO 2 5% (m/v) em
metanol. Após 6 minutos um volume de 180 µL de AlCl3 . 6 H2O a 10% (m/v) foi
adicionado e deixado repousar por mais 5 minutos antes de adicionar 600 µL de
NaOH 1 mol/L. Passado esse período a solução foi completada com 330 µL de água
destilada, agitada e imediatamente mensurada a absorbância contra o branco em
510 nm usando espectrofotômetro. Para a construção da curva de calibração foram
usadas soluções de catequina nas concentrações definidas de 50, 100, 150, 250,
500 e 1000 mg/L, em metanol e submetidas às mesmas condições dos extratos e
fases descritos anteriormente.
Os resultados foram expressos como equivalentes de catequina (ECAT) por
grama de amostra. As análises foram efetuadas em espectrofotômetro UV-VIS
Quimis.
4.8 Avaliação da atividade antioxidante
Os ensaios de atividade antioxidantes dos extratos e fases das espécies E.
hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia foram avaliados usando duas metodologias do
sequestro do radical DPPH e inibição da auto-oxidação do sistema β-caroteno/ ácido
linoleico.
4.8.1 Método do seqüestro do radical DPPH (2,2-difenil-1picrilhidrazil)
Este teste foi realizado utilizando a metodologia de seqüestro do radical livre
DPPH. A solução de DPPH possui uma coloração roxa intensa e a ação antioxidante
de um extrato, fase ou substância isolada pode ser visualizada pelo progressivo
descoloramento da solução, ao final do qual a mesma torna-se amarelada.
As soluções de amostras e padrões foram preparadas utilizando como
solvente etanol e quinze minutos após a adição de DPPH às amostras, a leitura foi
realizada em um espectrofotômetro de Ultravioleta UV-Vis a um comprimento de
onda de 517 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata. A inibição da coloração
foi expressa em % Atividade Seqüestradora de Radicais Livres (AS), através da
74
fórmula: % AS= 100 x Δhx / hc Onde: hc= absorbância do controle (DPPH + MeOH)
hx= absorbância teste (DPPH + substância teste) Δhx= hc – hx.
4.8.2 Método da inibição da autooxidação do β-caroteno
Outro método utilizado foi o de avaliação da atividade antioxidante baseado
na inibição da reação de autooxidação do β-caroteno. A reação foi acompanhada por
espectrofotometria no visível em comprimento de onda de 470 nm, utilizando-se
soluções em EtOH tanto dos padrões como dos extratos, fases e substancias
isoladas.
Preparou-se o meio oxidante do β-caroteno e transfere-se 0,1 mL de
padrões/extratos/fases/substâncias para uma cubeta; adicionou-se 2,5 mL do meio
oxidante. Os tubos foram fechados e uma primeira leitura foi efetuada, em seguida
as amostras foram colocadas em banho de água a 50 oC e novas leituras foram
realizadas no tempo zero e em intervalos de 15 minutos até completar 1 hora. Todas
as amostras foram avaliadas em triplicata. O Cálculo da Atividade Antioxidante (AA)
foi realizado através da fórmula: seguindo a fórmula abaixo:
AA= 100 x [1-(A0 –
At) / (A00 – At 0)] AA foi avaliada pelo efeito do aditivo em relação ao branco, Onde:
A0= absorbância inicial da amostra At= absorbância final da amostra A00=
absorbância inicial do branco At 0= absorbância final do branco
4.9. Avaliação da atividade antibacteriana
Os extratos e frações foram submetidos à atividade antibacteriana. A atividade
antibacteriana (Figura 16, p.75) foi avaliada para as seguintes amostras: extrato
etanólico (EtOH) e as frações acetato (AcOEt) e metanólica (MeOH) das partes
aéreas de E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia (folhas, caule e flor).
Para
avaliação da atividade antimicrobiana, utilizaram-se cepas bacterianas de referência
obtidas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS/FIOCRUZ
– Brasil). Os microrganismos utilizados foram: Bacillus cereus (ATCC 11778),
Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883),
Salmonella enterica (ATCC 10708), Serratia marcescens (ATCC 13880), Shigella
flexneri (ATCC 12022) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia Coli
75
(25922). A avaliação da atividade antibacteriana foi determinada através de dois
métodos o de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida
Mínima (CBM).
Figura 16 - Atividade antibacteriana
Fonte: Autora
O efeito antibacteriano foi avaliado pelo método de microdiluição (SANTOS et
al., 2012), como recomendado pelo The National Committee for Clinical Laboratory
Standards (CLSI, 2003). Primeiramente uma solução mãe de 25 mg/mL dos extratos
e frações foi preparada utilizando uma solução aquosa de DMSO a 20% (v/v). Em
seguida transferiu-se 200 μL desta diluição para a microplaca contendo 200 μL de
Muller-Hinton. Em seguida, diluições seriadas foram realizadas, resultando em
concentrações de 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39 e 0,195 e 0,0975 mg/mL. O
inoculo contendo 5 x 105 UFC/mL (0,5 na escala de McFarland) foi adicionado a
cada poço. Foram reservados poços nas microplacas para controle de esterilidade
do caldo, de crescimento bacteriano e da ação do antimicrobiano de referência
76
(Gentamicina). Para a gentamicina foi usada uma concentração inicial de 1,6 mg/mL,
a qual foi diluída para concentrações de 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125
mg/mL. As microplacas foram incubadas sob condições de aerobiose durante 18-24
horas a 37 °C, quando 10 μL de cloreto de 2,3,5trifenil-tetrazólio (CTT) a 2% foram
adicionados a cada poço para a detecção da mudança de cor do CTT (incolor) para
vermelho, que reflete o metabolismo bacteriano ativo. A CIM foi definida com a
concentração mais baixa do extrato que visivelmente inibiu o crescimento
bacteriano. Para determinar a CBM, alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada um
dos poços do ensaio anterior contendo os extratos e transferidas para placas de
Petri contendo ágar Muller-Hinton. As placas foram incubadas durante 24 horas a 37
°C. O surgimento de colônia de bactéria para uma dada concentração indica que
essa não foi capaz de matar 99,9% ou mais do inoculo bacteriano utilizado. Os
ensaios foram realizados em triplicata.
4.10. Análise estatística.
Os dados obtidos nos ensaios das atividades foram expressos como média
de três repetições (n = 3) e estimativa do desvio padrão da média (x = ± s).
Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05, utilizando o teste t de
Student. Todas as determinações foram efetuadas em triplicata.
/
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
78
5. Resultados e discussão
5.1. Fracionamento do extrato etanólico das espécies E. hirta, E. hyssopifolia e
E. thymifolia.
As quantidades de cada fração obtida no fracionamento do extrato etanólico
das partes aéreas de cada espécie estudada e do extrato da flor de E. hirta estão
descritas nos fluxogramas 4, 5 , 6 e 7 p. 78, 79, 80 e 81.
Fluxograma 4- Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das partes
aéreas de Euphorbia hirta.
Material vegetal
seco e pulverizado
122,6 g
Maceração exaustiva com etanol
Solução extrativa
Concentração em rotavapor
EtOH (Eh- EtOH)
21 g
Partição através de cromatografia à vácuo
Hexano (Eh-Hex)
0,085 g
Clorofórmio (Eh- CHCl3)
0,683 g
Acetato de etila
(Eh-AcOet) 10,686 g
Metanol (EMeOH)
2,165 g
79
Fluxograma 5- Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das flores da
espécie Euphorbia hirta.
Material vegetal
seco e pulverizado
30g
Maceração exaustiva com diclorometano
Solução
extrativa
Diclorometano
(Eh flores-DCM)
0,186g
Etanol
(Eh flores-EtOH)
0,340 g
80
Fluxograma 6- Obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto das partes
aéreas de Euphorbia hyssopifolia.
Material vegetal
seco e pulverizado
69g
Solução extrativa
EtOH (Ehy- EtOH)
10g
Hexano (Ehy-Hex)
0,04g
Clorofórmio
(Ehy- CHCl3)
0,29g
Acetato de etila
(Ehy-AcOet) 4,9g
Metanol
(Ehy-MeOH)
1,06 g
81
Fluxograma 7- Fluxograma da obtenção e fracionamento do extrato etanólico bruto
das partes aéreas de Euphorbia thymifolia.
Material vegetal
seco e pulverizado
45 g
Solução extrativa
Etanol (Et- EtOH)
5g
Hexano
(Et-Hex)
0,025 g
Clorofórmio
(Et- CHCl3)
0,1 g
Acetato de etila
(Et-AcOEt)
2,1 g
Metanol
(Et-MeOH)
500 mg
Foram feitos testes de fenóis, flavonoides totais, atividade antioxidante,
antibacteriana e triagem fitoquímica com as fases cujo rendimento permitiu a
análise. O isolamento e purificação dos constituintes químicos foi realizado apenas
com a espécie E. hirta, devido ao baixo rendimento dos outros extratos.
5.2. Perfil fitoquímico preliminar dos extratos e fases
A triagem fitoquímica preliminar teve como objetivo identificar ausência ou a
presença das principais classes de metabólitos secundários nos extratos ou fases
analisadas, a análise dos dados nos permitiu também fazer um estudo comparativo
entre as espécies E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia. Em todas as amostras
analisadas, exceto nas amostras da espécie E. thymifolia observou-se a ausência de
saponinas, entretanto os flavonoides apareceram na maioria das amostras
82
analisadas, este resultado obtido na triagem confirma o alto teor de fenóis e
flavonoides totais, de alguns extratos e fases testados, principalmente, no extrato
etanólico e nas fases acetato de etila e metanólica das espécies em estudo e pode
ser justificado pelo fato de as plantas terem sido coletadas em Petrolina, cidade
localizada em região semiárida, onde as chuvas são pouco frequentes. Além dos
flavonoides, outra classe também presente em todas as espécies foram os terpenos
e esteroides o que confirma dados da literatura que relatam que esta classe de
metabólitos são considerados marcadores taxonômicos do gênero Euphorbia (CHEN
at al., 2014). Um resumo dos resultados obtidos na análise fitoquímica dos extratos
das partes aéreas das espécies E. hirta, E. hyssopifolia, E. timmyfolia é mostrado
nas tabelas 4, p.82; 5, p.83; 6, p.83 e 7, p.84.
Tabela 4 - Identificação das principais classes de constituintes do extrato etanólico e
fases (Eh-CHCl3, Eh-AcOEt e Eh-MeOH) da espécie Euphorbia hirta.
Classe química
Alcaloides
Cumarinas
Derivados
antracênicos
Flavonoides e
taninos
Mono e diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
EtOH
-
Eh-Hex
+
+++
-
++
Saponinas
Eh-CHCl3
+
Eh-AcOEt
+
Eh-MeOH
-
-
+++
+
-
-
+++
++
++
+
+
+++
+++
++
++
-
++
-
-
++
+
-
-
-
-
-
(-): ausência do constituinte, (+) presença do constituinte, (++): presença moderada do constituinte,
(+++):presença elevada do constituinte.
83
Tabela 5- Identificação das principais classes de constituintes do extrato etanólico e
extrato diclorometânico das flores da espécie Euphorbia hirta.
Classe química
Alcaloides
Cumarinas
Derivados
antracênicos
Flavonoides e
taninos
Mono e
diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
EtOH
++
+
Eh-DCM
+++
+++
+
++
+
++
++
+++
-
++
++
++
Saponinas
-
-
(+++): presença elevada do constituinte.
Tabela 6- Identificação das principais classes de constituintes do extrato etanólico e
fases (Ehy-Hex, Ehy-CHCl3, Ehy-AcOEt e Ehy-MeOH) da espécie Euphorbia
hyssopifolia.
Classe química
Alcaloides
Cumarinas
EtOH
+
-
Ehy-Hex
-
Ehy-CHCl3
+
+
Ehy-AcOEt
+
+
Ehy-MeOH
+
Derivados
antracênicos
++
-
+
++
-
++
-
+
++
++
+
-
++
++
-
+
+
++
++
-
+
++
+
+
-
-
-
-
-
-
Flavonoides e
taninos
Mono e
diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
Saponinas
84
Tabela 7. Identificação das principais classes de constituintes do extrato etanólico e
fases (Et-Hex, Et-CHCl3, Et-AcOEt e Et-MeOH) da espécie Euphorbia thymifolia.
Classe química
Alcaloides
Cumarinas
EtOH
+
+
Et-Hex
+
Et-CHCl3
+
+
Et-AcOEt
+
+
Et-MeOH
+
Derivados
antracênicos
-
+
++
+
-
++
-
+
++
++
++
+
+
++
++
+
+
+
++
++
-
++
+
-
-
-
-
+
+
-
Flavonoides e
taninos
Mono e
diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
Saponinas
85
5.3. Caracterização estrutural das substâncias Eh-01, Eh-02 e Eh-03
5.3.1.Caracterização estrutural da substância Eh - 01
A substância Eh- 01 (11 mg) apresentou-se como um precipitado amorfo com
coloração branca e solúvel em clorofórmio (CHCl3). A partir dos dados obtidos de
RMN 13C e 1H (Tabela 8, p. 91).
Figura 17 – Benzoato de lupeolila
O espectro de RMN
13
C (Figura 18, p. 87), (125 MHz, CDCl3) revelou a
presença de 49 sinais, sendo que 32 desses foram considerados da substância
(Tabela 8, p. 91), e os outros sinais visualizados foram identificados como
impurezas.
O sinal em 172,74 que corresponde a um carbono carbonílico e os sinais em
150, 98 e 109,83 que são característicos para uma dupla ligação entre um carbono
não hidrogenado e outro di-hidrogenado, correspondente a carbonos olefínícos,
atribuídos respectivamente a C-20 e C-29, o que levou a caracterizar Eh-1 como um
triterpeno pentacíclico do tipo lupano.
Dos sinais identificados como da substância (Figura 19, p. 87), sete são de
86
carbonos não hidrogenados (δC 36,25; 37,85; 40,86; 42,84; 43,01;140,60; 150,98
ppm), outros seis foram atribuídos a carbonos metínicos (δC 81,06, 55,44, 50,34,
38,05, 48,3, 48,02 ppm), dez foram referentes a carbonos metilênicos (δC 38,38,
23,69, 18,02, 34,21, 20,95, 25,11, 27,44, 35,58, 29,84, 40,01 ppm) e sete de
carbonos metílicos (δC 27,98; 15,98; 16,54; 16,17; 14,14; 18,08; 19,30 ppm),
mostrando a presença da maioria dos sinais na região de alta blindagem,
característica para compostos terpênicos.
O espectro de RMN de 1H (Figura 20 p. 88) apresentou sinais na faixa de δH
0,60 e 2,0 ppm, singletos e multipletos referentes a hidrogênios metílicos ligados
anéis cicloexânicos e hidrogênios de carbonos metínicos e metilênicos em posições
axiais e equatoriais.
Um singleto largo em δH 1,7 compatível com os hidrogênios metílicos H-30
que acoplam a longa distância (4J) com o hidrogênio δH 4,4 H-29. (Figura 21, p. 88).
Um dubleto em δH 4,6 ppm e um duplo dubleto em δH 4,4 compatíveis com
os hidrogênios olefínicos de H-29, que confirmou a presença da dupla ligação
terminal característica de triterpenos de esqueleto Lupano (Figura 22, p. 89).
Foram observados também multipletos em uma região mais desprotegida na
faixa de δH 7,1 a 7,3 ppm que foram atribuídos a hidrogênios aromáticos. (Figura 23,
p.89).
Após análise dos espectros de RMN de 1H e 13C unidimensionais e comparação
com dados da literatura (SANTOS et al., 1998), foi possível identificar a substância
como sendo o benzoato de lupeolila (Figura 17, p.85).
87
Figura 18. Espectro RMN 13C de Eh-01 (CDCl3, 125 MHz)
Figura 19. Espectro RMN 13C/DEPT Q de Eh-01 (CDCl3, 125 MHz)
88
Figura 20- Expansão do espectro RMN de 1H de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz)
Figura 21- Expansão do especro RMN de 1H de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz)
89
90
Figura 24-Expansão do espectro RMN de 1H de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz)
91
Tabela 8- Comparação dos dados de RMN
13
C (CDCl3, 125 MHz) referentes à
substância Eh-01 com dados da literatura (SANTOS, 2012).
Benzoato de
Posição
Substância Eh-01
Lupeolila
(SANTOS, 2012)
C
C
C
1
38,38
38,40
2
25,11
25,10
3
81,06
81,82
4
37,85
38,20
5
55,44
55,45
6
18,20
18,24
7
34,21
34,22
8
40,86
40,87
9
50,34
50,35
10
36,25
37,13
11
20,95
20,97
12
23,69
23,77
13
38,05
38,05
14
42,84
42,85
15
27,44
27,45
16
35,58
35,58
17
43,01
43,00
18
48,30
48,29
19
48,02
48,01
20
150,98
150,95
21
29,84
29,84
22
40,00
40,00
23
27,98
28,12
24
15,98
16,00
25
16,54
16,80
92
26
16,17
16,20
27
14,14
14,55
28
18,08
18,01
29
109,37
109,38
30
19,30
19,30
1’
172,74
166,28
2’
140,60
132,68
3’
128,27
129,52
4’
126, 19
128,30
5’
128,45
131,01
6’
126,19
128,30
7’
128,27
129,52
93
Tabela 9- Dados de RMN de 1H (500 MHz) e
13
C (125 MHz), HMQC e HMBC 1H x
13
C (500 MHz, 125 MHz), referentes à substância Eh-01.
1
1
Posição
Tipo
C
C
C
H
1
CH2
38,38
2,6 e 1,2* (m)
2
CH2
25,11
1,6* e 1,3* (m)
3
CH
Hx
81,06
C– HMQC
4,45 (dd, J=5,2;
10,5 Hz)
4
C
37,85
-
5
CH
55,44
0,75* (m)
6
CH2
18,20
1,5* e 0,8* (m)
7
CH2
34,21
1,9* e 1,3* (m)
8
C
40,86
-
9
CH
50,34
1,3* (m)
10
C
36,25
-
11
CH2
20,95
1,2* e 0,9* (m)
12
CH2
23,69
1,6* e 0,8* (m)
13
CH
38,05
1,6 (m)
14
C
42,84
-
15
CH2
27,44
1,6* e 1,0* (m)
16
CH2
35,58
1,5* e 1,3* (m)
17
C
43,01
-
18
CH
48,02
1,4* (m)
19
CH
48,30
H x 13C – HMBC
13
2
JCH
1
H x 1H – COSY
3
JCH
H-3
C-1’
2,35 (td, J=5,3;
11,1; 16,3Hz)
20
C
150,98
-
21
CH2
29,84
1,9* e 1,3* (m)
22
CH2
40,00
1,3* e 1,1* (m)
23
CH3
27,98
0,8 (s)
C-3
24
CH3
15,98
0,9 (s)
C-3
H-2
94
25
CH3
16,54
0,75 (s)
26
CH3
16,17
0,85 (s)
27
CH3
14,14
0,95 (s)
28
CH3
18,08
0,7 (s)
4,7 (d, J=2,4 Hz)
CH2
29
109,37
e 4,6 (dd, J=1,3 e
C-30, C-19
H-30
C-19, C-29
H-29
2,4 Hz)
30
CH3
19,30
1,65 (sl)
1’
C=O
172,74
-
2’
C
140,60
-
3’
CH
128,27
7,25 (m)
4’
CH
126,19
7,17 (m)
5’
CH
128,45
7,25 (m)
6’
CH
126,19
7,17 (m)
7’
CH
128,27
7,25 (m)
C-20
C-2’
C-2’
* Devido a sobreposição de sinais no espectro de RMN de 1H na região de 0,6 a 2,0
ppm estas atribuições podem estar equivocadas.
A correlação entre os hidrogênios observada no espectro COSY (Figura 25, p.
95) confirmaram o acoplamento entre os sinais em δ H 4,45 (H-3) com δH 1,6 (H-2),
bem como o acoplamento dos hidrogênios olefínicos 4,7 e 4,6 ppm (H-29) com a
metila em 1,65 ppm (H-30), conforme mostra a Tabela 9, p. 94.
No espectro de HSQC (Figura 26, p. 96) observou-se as correlações a uma
ligação entre os hidrogênios δH 4,7 e 4,6 e o carbono δC 109,37 da estrutura, no
entanto, existem ainda dúvidas sobre as correlações nas regiões de sobreposição
de sinais entre 0,6 e 2,0 ppm característico de cadeia terpênica e entre 7,1 e 7,3
ppm característico de anéis aromáticos na projeção do RMN 1H e as regiões 13 a 43
ppm e em torno de 128 ppm na projeção do RMN 13C (Tabela 9, p. 93).
Através do experimento de HMBC (Figura 27, p. 97) foi possível fazer as
seguintes correlações entre o δH 1,65 (H-30) com o δC 150,98 (C-20) a duas ligações
(2J) e a três ligações (3J) de H-3 com C-1’, H-29 com C-19/C-30 e H-30 com C-19/C-
95
29. As correlações observadas estão também descritas na tabela 9 (p. 94).
Figura 25. Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz)
96
Figura 26. Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz e
125 MHz).
97
Figura 27- Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de Eh-01 (CDCl3, 500 MHz e
125 MHz).
O triterpeno lupeol, núcleo terpênico do benzoato de lupeolila, apresenta
várias atividades farmacológicas. Entre essas atividades destaca-se seu efeito sobre
a proliferação de queratinócitos na pele, atividades nefroprotetoras, tanto na
exposição crônica ao cádmio, quanto na redução da excreção de oxalato em
determinadas patologias que causaria danos no tubo renal (NAGARAJ et al., 2000).
Atividades antitumorais (MORIARITY et al., 1998), antioxidantes (MOREIRA;
CARLOS; VILEGA, 2001) e liberadores de mediadores da resposta imunológica
98
(RAJIC et al., 2000) também são efeitos farmacológicos deste composto.
Um levantamento bibliográfico nos bancos de dados web of Science, Pubmed
e periódico CAPES revelou que a substância isolada das flores de Euphorbia hirta e
identificada como benzoato de lupeolila está sendo relatada pela primeira vez como
produto natural, pois os dados espectrométricos encontrados, que permitiram a
comparação, foram do derivado semissintético, obtido a partir da reação de
esterificação do Lupeol na hidroxila presente em C-3 com ácido benzoico (SANTOS,
2012). Esta é a primeira vez que esta substância é relatada para a espécie
Euphorbia hirta.
5.3.2. Caracterização estrutural da substância Eh-02
A substância codificada como Eh-02, foi isolada na forma de pó branco,
solúvel em Clorofórmio (Figura 28, p. 98).
Figura 28- Heptacosan-1-ol
No espectro de RMN de 1H (500 MHz, CDCl3), (Figura 29, p. 101) foram
observados os seguintes sinais de hidrogênios, um multipleto em H 0,88 ppm
correspondendo aos hidrogênios metílicos da cadeia terminal ligados ao carbono.
Diversos sinais multipletos entre H 1,52 e H 1,68 atribuídos aos hidrogênios ligados
aos carbonos alifáticos C-2 a C-26; um tripleto em H 3,64 ppm, J=6,6 Hz, atribuídos
aos hidrogênios do carbono oxigenado C-1 (SILVERSTEIN et al., 2007). Além disso,
99
verificou-se na região de hidrogênio alifáticos um singleto largo em H 1,26,
integrado para 45 hidrogênios, característico de cadeia hidrocarbônica longa
(ROCHA; SILVA et al., 2007) o que é condizente com a intensidade do sinal em 29
no RMN de 13C.
O espectro de RMN de
13
C (125 MHz, CDCl3), ( Figura 30, p. 103) mostra dez
sinais, com destaque para os sinais em C 63,33 ppm correspondente a carbono
oxigenado
C 14,32 ppm atribuído ao carbono metílico. De acordo com os
deslocamentos químicos, dos dez sinais do espectro de RMN
13
C , 7 são referentes
a carbonos metilênicos (C 33,04; 32,15; 29,92; 29,84; 25,97; 25,09 e 22,91 ppm), 1
metínico (C 63,33 ppm) e 1 metílico (C 14,32 ppm).
Esses dados associados à comparação com dados descritos na literatura
permitiram identificar a substância Eh-02 como sendo heptacosan-1-ol (KOAY et. al.,
2013).
100
Tabela 10- Comparação dos dados de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) e 13C (75 MHz)
referentes à substância Eh-02 com dados da literatura (KOAY et al, 20013).
Posição
Substância Eh-2 (CDCl3)
C
C
1
63,33
2
33,04
3
32,15
4 a 23
29,92
Dados da literatura
Posição
H; mult.; J (Hz)
C
3,64 ( t, J=6,6 Hz,
1
2H)
1,64 (m, 2H)
1,26 (sl, 45H)
(CDCl3)
C
63,1
2
32,9
3
31,9
4 a 24
29,7
24
25,97
25
25,09
25
25,8
26
22,91
26
22,7
27
14,32
0,88 (m, 3H)
27
14,1
H; mult.; J (Hz)
3,64 (t, J=6,3 Hz,
2H)
1,57 (m, 2H)
1,25 (sl, 45H)
0,88 ( t, J=6,6 Hz,
3H)
101
Figura 29- Espectro RMN de 1H de Eh-02 (CDCl3, 300 MHz);
Figura 30- Espectro RMN de 13C/BB Q de Eh-02 (CDCl3, 75 MHz)
BEZERRA, G. S. Estudo Fitoquímico e Biológico “in vitro” de Espécies do Gênero
Euphorbia: E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia L. (EUPHORBIACEAE).
5.3.3. Caracterização estrutural da substância Eh-03
A substância codificada como Eh-03 (12 mg), foi isolada na forma de um
cristal marrom, solúvel em metanol e apresentou fluorescência sob luz ultravioleta,
sugerindo a presença de grupos cromóforos na sua estrutura.
Figura 31- Quercetina-3-β-O-ramnosídeo
No espectro de RMN de 1H (125 MHz, MeOD), (Figura 32, p.104) foram
observados sinais de hidrogênios aromáticos característicos de um flavonol. Os
espectros mostraram a presença de dois dubletos integrando para um hidrogênio
cada, acoplando meta entre si, em 6,19 (J =2,1 Hz) δH 6,36 (J =2,1 Hz),
característicos de flavonoides que possuem anel A 5-7- dissubstituido, sendo estes
sinais atribuídos aos hidrogênios H-6 e H-8, respectivamente (PIZZOLATTI at al,
2013).
Para o anel B foram apresentados três sinais (Tabela 12, p.107)
correspondentes aos três hidrogênios localizados em ambientes químicos diferentes
103
( H’-2: δH 7,29; H-5’: δH 6,91; H-6’: δH 7,31). O sinal em δH 7,31 (H-6’), com
multiplicidade de duplo dubleto e constante de acoplamento (J) igual a 2,0 e 8,5 Hz,
mostrou acoplamento meta com o sinal em δH 7,29 (H-2’, d, J=2,0) e orto com δH
6,91 (H-5’, d, J= 8,5), respectivamente. Os valores dos deslocamentos químicos
edas constantes de acoplamento observadas nos espectros de RMN 1H de Eh-03
permitiram propor a localização das funções oxigenadas nas posições 3’ e 4’ do anel
B.
Foi observada ainda a presença de sinais que sugeriram a presença de uma
unidade de açúcar, pois apresentaram sinais múltiplos na faixa entre δH 3,28 a 3,34
combinados ao hidrogênio anomérico em δH 5,36 a qual foi identificada como
ramnose devido a presença do sinal para hidrogênio metílico ( d, J= 6,0) em δH 0,94.
A figura 35, p.105 correspondente ao espectro RMN
13
C/DEPTQ (125 MHz,
MeOD), o mesmo dispõe de 21 linhas espectrais, sendo que o multipleto de sete
picos, tendo o pico central o deslocamento químico de aproximadamente δC 49,0,
trata-se do solvente metanol deuterado. Foram observados sinais em δC 93,40 (C8), δC 98,50 (C-6), δC 104,46 (C-10), δC 157,13 (C-9), δC 161,75 (C-5) e δC 164,61
(C-7) ppm correspondentes aos sinais de carbono do anel A dos flavonoides. Os
sinais com deslocamentos químicos abaixo de 100 ppm, atribuídos a C-6 e C-8, são
característicos de carbonos aromáticos blindados por oxigenação nas posições orto
carbonos 5 e 7 do anel A.
O sinal em 178,24 ppm, equivalente a sinal de grupo cetônico, junto com os
sinais de carbonos olefínicos em 157,13 e 134,81 ppm, caracterizam o anel C típico
de flavonóis (CARDOSO et al., 2005).
104
Figura 32- Espectro RMN de 1H de Eh-03 (CDCl3, 500 MHz)
105
Figura 35- Espectro RMN de 13C/DEPT Q de Eh-03 (MeOD, 125 MHz)
106
Tabela 11 - Comparação dos dados de RMN de 1H (MeOD, 500 MHz) e 13C (125
MHz) referentes à substância Eh-03 com dados da literatura.
1
1
Hx
Posição
H x 13C – HMQC
13
C– HMQC
Substância Eh-03
Quercetina-3-β -O ramnosídeo*
(CARDOSO et al., 2005).
C
C
H
C
H
2
157,94
-
159,0
-
3
134,81
-
136,5
-
4
178,24
-
179,8
-
5
161,75
-
163,4
-
7
164,61
-
166,0
-
9
157,13
-
158,7
10
104,46
-
106,0
-
1’
121,49
-
122,2
-
3’
145,01
-
147,0
-
4’
148,41
-
149,8
-
6
98,50
6,19 (d, J = 2,1)
100,0
6,20 (d, J=2,2 Hz)
8
93,40
6,36 (d, J = 2,1)
94,9
6,37 (d, J=2,2 Hz)
2’
115,02
7,29 (d, J = 2,05)
116,5
7,30 (d, J=2,2 Hz)
5’
115,57
6,91 (d, J = 5)
116,6
6,91 (d, J=8,4 Hz)
6’
121,56
7,31 (dd, J = 8,2; 2,1)
123,0
7,31 (dd, J=8,4 e 2,0 Hz)
1’’
102,13
5,34 (d, J = 1,6)
102,13
5,35 (d, J=1,7 Hz)
2’’
71,06
4,24 (dd, J= 3,3 e J=1,7)
71,6
4,21(dd, J=3,3 e 1,7)
3’’
72,2
3,78( dd, J=9,4 e J=3,4)
72,2
3,74 (dd, J=9,3 e 3,3)
4’’
72,4
72,3
3,30 (dd, J=9,5 e 6,1)
5’’
71,8
72,0
3,40 (dd, J=9,5 e 9,3)
17,8
0,94 (3H, d, J = 6,1 Hz)
-
CH
CH3
6’’
16,26
0,94 (3H, d, J = 6,1)
107
Tabela 12- Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz), HSQC e HMBC 1H x
13
C (500 MHz, 125 MHz), referentes à substância Eh-03.
1
H x 13C– HMQC
Posição
1
H x 13C –
Substância Eh-03
C
C
H
2
157,94
-
3
134,81
-
4
178,24
-
5
161,75
-
7
164,61
-
9
157,13
-
10
104,46
-
1’
121,49
-
3’
145,01
-
4’
148,41
-
6
98,50
6,19 (d, J = 2,1)
8
93,40
6,36 (d, J = 2,1)
2’
115,02
7,29 (d, J = 2,1)
5’
115,57
6,91 (d, J =8,3)
6’
121,56
7,31 (dd, J = 8,3; 2,1)
1’’
102,13
5,34 (d, J = 7,41)
2’’
71,06
4,24 (dd, J= 3,3 e J=1,7)
3’’
72,2
3,78( dd, J=9,4 e J=3,4)
4’’
72,4
5’’
71,8
HMBC
2
JCH
1
H x 1H – COSY
3
JCH
CH
CH3
6’’
16,26
0,94 (3H, d, J = 5)
C-5
C-5
C-1’
H-6’
C-1’
C-2’’
H-5’
H-2’’
H-1’’
C-2’’
108
Os espectros de RMN 2D COSY (Figura 36, p.109) , HSQC (Figura 37, p.110)
e HMBC (Figura 38, p.111) confirmaram as correlações entre os hidrigênios H-6’ e
H-5’ referentes aos sinais em δH 7,31 e 6,91, respectivamente, comfirmou também
as posições oxigenadas identificadas após análise dos espectros unidimensionais de
Eh-3.
O espectro de correlação 1H x
13
C- HSQC confirmou as correlações entre
os carbonos δC 16,26; δC 102,13; δC 121,56 com os hidrogênios δH 0,94; δH 5,34; δH
7,31, respectivamente.
O espectro de correlação 1H x
13
C- HMBC confirmou as correlações entre o
carbono δC 71,8 com os hidrogênios δH 5,34 e δH 0,94 , entre o carbono δC 134,81 e
o hidrogênio δH 5,34.
. Após análise dos dados de RMN 1H e
13
C uni e bidimensionais foi possível
propor a estrutura do flavonoide Quercetina-3-β-O-ramnosídeo (Fig 31, p.102).
109
Figura 36. Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de Eh-03 (MeOD, 500 MH
110
Figura 37- Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de Eh-03 (MeOD, 500 MHz e
125 MHz).
111
Figura 38- Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de Eh-03 (MeOD, 500 MHz e
125 MHz).
Já foram isolados e identificados diversos flavonoides na espécie Euphorbia
hirta. Wu e colaboradores (2012) relataram recentemente o isolamento e
identificação de nove compostos fenólicos entre eles a quercetina que é a aglicona
112
da substância identificada com Eh-3 (Wu et al., 2012).
5.4. Fenóis totais, flavonoides totais e atividade antioxidante in vitro
Diante das diversas formas de radicais livres e de suas diferentes formas de
atuação nos organismos vivos se fez necessário a realização de mais de uma
técnica para a determinação da atividade antioxidante. Um dos métodos mais
utilizados para determinação dos fenóis totais utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu
que consiste de mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico, no qual o
molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+ porém, em
presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se o
molibdênio azul e o tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação dos
metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a determinação da concentração
das substâncias redutoras, que incluem outras além das fenólicas (NACZK;
SHAHIDIB, 2004; IKAWA et al., 2003). Usualmente, na elucidação estrutural por UVVIS dos flavonoides, os grupos oxigenados podem ser detectados pela observação
dos deslocamentos bactocrômicos neste espectro, obtido pela adição de agentes,
tais como: AlCl3, H3BO3, AcONa e NaOMe (CORNARD; MERLIN, 2001). A
complexação dos flavonoides com metais, principalmente com o íon Al 3+, é uma
técnica comumente empregada no estudo de flavonoides, pela análise da absorção
no UV-VIS dos flavonoides, os deslocamentos são devidos à formação do complexo
Al3+- flavonoide (POZZI, 2007). Nessas condições, o complexo Al3+- flavonoide
absorve em comprimento de onda bem maior do que o flavonoide sem a presença
do agente complexante. Os ácidos fenólicos, mesmo os que formam complexos com
AlCl3, absorvem em comprimentos de onda muito inferiores, evitando-se desta
maneira interferências nas medidas de absorvância (LIANDA; VIANNA; CASTRO,
2009).
Tendo em vista, a importância dos compostos fenólicos e dos flavonoides em
relação aos seus potenciais antioxidantes dentre outras atividades biológicas
descritas na literatura para os mesmos, assim como a disponibilidade de
metodologias simples usualmente utilizadas em laboratórios, conforme descrito
acima, procedeu-se à quantificação dos mesmos nos extratos de E. hirta, E.
hyssopifolia e E. thymifolia. Assim, Eh-MeOH foi a fase que apresentou o maior teor
113
de fenóis totais (102±1,3 mg EqAG/g) enquanto que na quantificação de flavonoides
totais, a fase Ehy-AcOet apresentou um alto teor (221,3 ± 6,25) quando comparado
aos resultados das outras fases das espécies estudadas.
Em relação às atividades antioxidantes dos extratos e frações das espécies
Euphorbia hirta, E. thymifolia e E. hyssopifolia verificou-se que no método do
seqüestro do radical DPPH todas as amostras testadas foram efetivas, porém o
extrato etanólico bruto das espécies E. hirta (h-EEB) e E. hyssopifolia (hy-EEB)
apresentaram maior poder antioxidante com IC50 de 14,92 ± 0,55, 11,7 ± 0,47 µg/mL,
respectivamente. Na espécie E. thymifolia a fração metanólica foi a que mais se
destacou com IC50 de 15,48±0,49.
No modelo da inibição da co-oxidação do β-caroteno a amostra Eh-EEB se
mostrou com melhor atividade com um valor de 78,9 ± 3,18 na espécie E. hirta, já
nas espécies E. hyssopifolia e E. thymifolia a fração que apresentou melhor
resultado foi a acetato de etila com valores de 33,8 ± 2,7 (Ehy-AcOEt) e 75,63±3,27
(Et-AcOEt), respectivamente. Através destes resultados identificamos que a espécie
E. hyssopifolia não possui atividade antioxidante expressiva no método de inibição
da co-oxidação do β-caroteno. Este método nos permite avaliar a capacidade de
uma determinada substância prevenir a oxidação do β-caroteno protegendo-o dos
radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico. (ALVES et al.,
2010). Os dados encontram-se dispostos na Tabela 13, p.109.
114
Tabela 13- Atividade antioxidante, fenóis e flavonóides totais in vitro do extrato
etanólico (EtOH) e frações (AcOet e MeOH) de Euphorbia hirta, E.hyssopifolia e
E.thymifolia.
Amostra
DPPH
(IC50
µg/mL)
β–
CAROTENO
(%AA)
Fenóis totais
(mg
EqAG/g)
Flavonoides
totais
(mg EqC/g)
EEB-h
14,9 ± 0,55
78,9 ± 3,18
68,02±6,06
54,1±2,9
Eh-AcOEt
38,8 ± 1,9
18,4 ± 3,09
51,0±7,07
19,07±046
Eh-MeOH
24,1 ± 1,48
33,2 ± 3,55
102,9±1,3
16,09±0,46
Ehy-EEB
11,7 ± 0,47
26,4 ± 4,15
68,33±2,6
128,8±0,75
Ehy-AcOET
9,4 ± 0,63
33,8 ± 2,7
72,83±3,9
221,3±6,25
Ehy-MeOH
23,2 ± 1,4
26,5 ± 21,2
15,33±0,7
4,250±0,25
Et-EEB
29,87±1,08
71,73±3,36
37,50±1,607
124,3±3,03
Et-AcOEt
33,90±0,24
75,63±3,27
19,36±9,65
176,0±2,75
Et-MeOH
15,48±0,49
-
48,17±3,44
72,33±5,86
2,72 ± 0,05
-
BHA
3,61 ± 0,20
92,3 ± 3,20
BHT
8,72 ± 1,21
95,3 ± 0,36
Ácido
Ascorbico
Ácido gálico
2,121±0,05
5.5. Avaliação da atividade antibacteriana
A avaliação da atividade antibacteriana foi determinada através de dois
métodos: o de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Bactericida
Mínima (CBM), os dois ensaios foram baseados na metodologia utilizada por Santos
e colaboradores (2012).
As cepas de bactérias utilizadas nestes ensaios foram obtidas do Instituto
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS/FIOCRUZ – Brasil). Os
microrganismos utilizados foram: Bacillus cereus (ATCC 11778), Enterococcus
faecalis (ATCC 19433), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Salmonella enterica
(ATCC 10708), Serratia marcescens (ATCC 13880), Shigella flexneri (ATCC 12022)
115
e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia Coli (25922).
O efeito antibacteriano foi avaliado pelo método de microdiluição (SANTOS et
al., 2012), como recomendado pelo The NationalCommittee for ClinicalLaboratory
Standards (CLSI, 2003). Primeiramente uma solução mãe de 25 mg/mL dos extratos
foi preparada utilizando uma solução aquosa de DMSO a 20% (v/v). Em seguida
transferiu-se 200 μL desta diluição para a microplaca contendo 200 μL de MullerHinton.
Em
seguida,
diluições
seriadas
foram
realizadas,
resultando
em
concentrações de 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39 e 0,195 e 0,0975 mg/mL. O
inoculo contendo 5 x 105 UFC/mL (0,5 na escala de McFarland) foi adicionado a
cada poço. Foram reservados poços nas microplacas para controle de esterilidade
do caldo, de crescimento bacteriano e da ação do antimicrobiano de referência
(Gentamicina). Para a gentamicina foi usada uma concentração inicial de 1,6 mg/mL,
a qual foi diluída para concentrações de 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125
mg/mL. As microplacas foram incubadas sob condições de aerobiose durante 18-24
horas a 37 °C, quando 10 μL de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (CTT) a 2% foram
adicionados a cada poço para a detecção da mudança de cor do CTT (incolor) para
vermelho, que reflete o metabolismo bacteriano ativo. A CIM foi definida com a
concentração mais baixa do extrato que visivelmente inibiu o crescimento
bacteriano.
Para a determinação da CBM, alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada um
dos poços do ensaio anterior contendo os extratos e transferidas para placas de
Petri contendo ágar Muller-Hinton. As placas foram incubadas durante 24 horas a 37
°C. O surgimento de colônia de bactéria para uma dada concentração indica que
essa não foi capaz de matar 99,9% ou mais do inoculo bacteriano utilizado. Os
ensaios foram realizados em triplicata. Nas tabelas 14, 15 e 16, págs 118, 119 e 120
estão descritos os dados obtidos para amostras analisadas.
116
Tabela 14- Atividade antibacteriana de Eh-EEB, Eh-AcOEt e Eh-MeOH das partes
aéreas de E.hirta.
EtOH
Eh-AcOEt
Eh-MeOH
Bactéria
Gentamicina
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
Bacillus cereus
0,39
12,5
0,78
0,78
1,56
1,56
0,40
0,40
Enterococcus
0,09
0,39
0,09
12,5
0,09
*
0,40
0,40
Escherichia coli
0,09
3,12
0,09
*
3,12
*
0,025
0,025
Klebsiella
3,12
6,25
6,25
6,25
6,25
*
6,25
6,25
1,56
3,12
3,12
3,12
*
0,40
3,12
*
6,25
*
0,09
1,56
0,05
0,05
Shigella flexneri
1,56
*
6,25
12,5
3,12
12,5
0,05
0,05
Staphylococcus
0,09
0,09
0,78
0,78
6,25
0,19
*
0,025
faecalis
pneumonia
Salmonela
choleraesuis
Serratia
marcescens
aureus
CIM: concentração inibitória mínima. CBM: concentração bactericida mínima. Os
valores estão expressos em mg/mL e indicam até qual concentração a amostra foi
efetiva. (*): crescimento bacteriano em todas as concentrações testadas.
117
Tabela 15- Atividade antibacteriana de Ehy-EEB, Ehy-AcOEt e Ehy-MeOH das
partes (folhas, caule e flor) de E. hyssopifolia.
EtOH
Eh-AcOEt
Eh-MeOH
Bactéria
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
Bacillus cereus
0,39
6,25
0,09
0,19
1,78
1,78
Enterococcus faecalis
0,09
0,39
0,09
0,09
1,56
*
Escherichia coli
0,09
0,19
0,09
3,12
1,56
12,5
Klebsiella pneumonia
3,12
3,12
3,12
3,12
6,25
12,5
Salmonela choleraesuis
0,39
3,12
0,78
0,78
0,19
12,5
Serratia marcescens
0,78
*
3,12
*
0,09
3,12
Shigella flexneri
1,56
*
1,56
*
6,25
6,25
Staphylococcus aureus
0,09
0,09
0,78
1,56
0,30
1,56
118
Tabela 16- Atividade antibacteriana de Et-EEB, Et-AcOEt e Et-MeOH das partes
(folhas, caule e flor) de E. thymifolia.
EtOH
Eh-AcOEt
Eh-MeOH
Bactéria
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
Bacillus cereus
0,39
0,39
0,78
0,78
12,5
12,5
Enterococcus faecalis
0,09
12,5
0,09
12,5
0,09
*
Escherichia coli
0,09
3,12
0,09
*
0,09
0,09
Klebsiella pneumonia
6,25
12,5
1,56
6,25
3,12
6,25
Salmonela choleraesuis
12,5
12,5
0,09
6,25
6,25
6,25
Serratia marcescens
6,25
*
6,25
6,25
6,25
6,25
Shigella flexneri
6,25
*
3,12
3,12
6,25
*
Staphylococcus aureus
0,09
0,09
0,78
1,78
6,25
6,25
Das oito cepas bacterianas que foram submetidas ao teste de sensibilidade
ao extrato e fases das espécies Euphorbia hirta, Euphorbia hyssopifolia e Euphorbia
thymifolia todas se mostraram sensíveis aos extratos e frações testadas, sendo que
para algumas cepas de bactérias os extratos etanólicos brutos mostraram-se
eficiente até a última concentração testada (0,098 mg/mL), que foi o caso para os
microorganismos E. fecalis, E.coli e Staphylococus aureus.
Notadamente, microrganismos Gram-negativos mostram-se mais resistentes
à ação de antimicrobianos, uma vez que sua parede celular encontra-se protegida
por uma camada de lipopolissacarídeos (GOULD, 2009). Das oito cepas testadas,
três são classificadas como microrganismos Gram-positivas (Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus) e outras cinco como Gram-negativas
(Escherichia
Coli,
Klebsiella
pneumonia,
Salmonela
choleraesuis,
Serratia
marcescens e Shigella flexneri). Observou-se que das três cepas que mostraram-se
119
sensíveis em todas as concentrações do extrato, duas pertencem ao grupo das
Gram-positivas e apenas a E..coli foi a Gram-negativa sensível. Desta forma,
percebe-se a eficiência do extrato etanólico em inibir o crescimento dos
microorganismos Gram-negativos. Esse efeito pode ser explicado pela presença de
uma maior variedade de substâncias presentes no extrato. Acredita-se que muito do
efeito antimicrobiano dos extratos vegetais se deve, principalmente, à presença de
flavonoides em sua composição (AHMAD; BEG, 2001).
6. CONCLUSÕES
121
E. hirta, E. Hyssopifolia e E. thymifolia. (EUPHORBIACEAE) L.
6. Conclusões
A análise fitoquímica preliminar para o extrato e fases das espécies estudadas
revelou a presença de terpenos e flavonoides. Estes dados foram confirmados com
isolamento e identificação do flavonoide glicosilado Quecetina-3-β-O-ramnosídeo do
extrato etanólico bruto das flores da espécie Euphorbia hirta e dos terpenoides
benzoato de lupeolila e Heptacosan-1-ol do extrato diclorometânico também das
flores de E. hirta.
Na determinação de fenóis totais, a fase que apresentou o maior teor de
fenóis totais foi a Eh-MeOH (102 ± 1,3 mg EqAG/g), enquanto que na determinação
de flavonoides totais, Ehy-AcOet apresentou o maior teor (221,3 ± 6,25 equivalente
de catequina). Na avaliação da atividade antioxidante, in vitro, Et-EEB mostrou maior
poder antioxidante no método do DPPH e Eh-EEB no método do β-caroteno. Para a
atividade antibacteriana, as três espécies em estudo apresentaram boa atividade,
destacando-se na eficiência de inibição do crescimento de bactérias Gramnegativas.
Diante do que foi exposto, observa-se que as espécies Euphorbia hirta, E.
thymifolia e E. Hyssopifolia apresentaram potencial nas atividades antioxidante e
antibacteriana, podendo estas serem justificadas pela presença de compostos
fenólicos e flavonoides, conforme foi identificado na triagem fitoquímica, além dos
constituintes químicos que foram identificados pela primeira vez na espécie. Assim,
pode-se contribuir tanto para o estudo fitoquímico quanto biológico, tendo em vista
que das três espécies estudadas, duas delas, E. hyssopifolia e E. thymifolia
apresentam poucos relatos na literatura.
REFERÊNCIAS
123
E. hirta, E. hyssopifolia e E. thymifolia. L. (EUPHORBIACEAE).
5. Referências
AGRA, M. F.; FREITAS, P. F.; FILHO, J. M. B. Synopsis of the plants known as
medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Revista Brasileira de
Farmacognosia. v. 17, n.1, p. 114-140, 2007.
AHMAD, I.; BEG, A. Z. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian
medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. Journal of
Ethnopharmacology, v. 74, p. 113-123, 2001.
ALBUQUERQUE, U. P.; HANAZAKI, N. As pesquisas etnodirigidas na descoberta
de novos fármacos de interesse médico e farmacêutico: fragilidades e
pespectivas. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16, p. 678-689, 2006.
ALMEIDA S. P.; PROENÇA, C. E. B.; SANO, S. M.; RIBEIRO, J. F. Cerrado
espécies vegetais úteis. Planatina: EMBRAPA, 1998.
ALMEIDA, J. R. G. et. al. Phenolic quantification and antioxidant activity of
Anaxagorea
dolichocarpa
and
Duguetia
chrysocarpa
(Annonaceae).
International Journal of Pharma and Bio Science, Andhra Pradesh, v. 2, n. 4, p.
367374, 2011.
AL-QURA'N, S. Ethnobotanical survey of folk toxic plants in southern part of
Jordan. Toxicon, v. 46, p.119-129, 2005.
ALVES, C. Q. et al. Métodos para determinação de atividade antioxidante in
vitro em substratos orgânicos. Química Nova, v. 33, n. 10, p. 2202-2210, 2010.
ALVES, E. G.; VINHOLIS, A. H. C.; CASEMIRO, L. A.; FURTADO, N. A. J. C.; SILVA,
M. L. A.; CUNHA, W. R.; MARTINS, C. H. G. Estudo comparativo de técnicas de
screening para avaliação da atividade antibacteriana de extratos brutos de
espécies vegetais e de substâncias puras. Química Nova, v. 31, n. 5, p.1224-
124
1229, 2008.
ALVES, T. M. A.; SILVA, A. F.; BRANDÃO, M.; GRANDI, T. S. M.; SMÂNIA, E. F. A.;
SMÂNIA, J. A.; ZANI, C. L. Biological screening of Brazilian medicinal plants. v.
95, p. 367-373, 2000.
ANURADHA, H. et al. Euphorbia hirta reverses chronic stress-induced anxiety
and mediates its action through the GABAA receptor benzodiazepine receptorCl-channel complex. Journal of Neural Transmission, v. 115, p.35-42, 2008.
BARREIROS, A. L. B. S.; DAVID, J. M.; DAVID, J. P. Estresse oxidativo: relação
entre geração de espécies reativas e defesa dos organismos. Química nova, v.
29, p. 113-123, 2006.
BHASKARA RAO K. V., KARTHIK L., ELUMALAI E K, SRINIVASAN, GAURAV
KUMAR K.. Antibacterial and antifungal activity of Euphorbia hirta l. Leaves: A
comparative study. Journal of Pharmacy Research, 2010, 3(3),548-549.
BASMA, A. A.; ZAZARIA, Z.; LATHA, L. Y.; SASIDHARAN, S. Antioxidant activity
and phytochemical screening of the methanol extracts of Euphorbia hirta L.
Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, p. 386-390, 2011.
BIANCHI, E. B. et. al. Flavonoide quercetina: Aspectos gerais e ações
biológicas. Alim. Nutr. Araraquara, v. 15, n. 3, p. 285- 292, 2004.
BIANCHI, M. L. P.; ANTUNES, L. M. G. Radicais Livres e os principais
antioxidantes da dieta. Rev. Nutr, v. 12, p.123-130, 1999.
CARDOSO, C. L. et al. New biflavonoid and other flavonoids from the leaves of
Chimarrhis turbinata and their antioxidant activities. Journal of the Brazilian
Chemical Society. vol.16, p. 1353-1359, 2005.
CHEN, R. et. al. Chemical constituents from the roots of Euphorbia
nematocypha Hand.-Mazz. Biochemical Systematics and Ecology 57, p. 1-5, 2014.
125
CLINICAL LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (CLSI). Metodologia dos testes
de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição para bactérias de
crescimento aeróbico: norma aprovada. 6ª ed., M7-A6, v. 23, n. 2, 2003.
CORNARD, J. P.; MERLIN, J. C. Structural and spectroscopic investigation of
5hydroxyflavone and its complex with aluminium. Journal of Molecular Structure,
v. 569, p.129-138, 2001.
CORRÊA, M. P. Dicionário das Plantas Úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Instituto
Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, 707p. 1984.
COSTA, L. S.; ARAUJO, D. S.; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S. ARAÚJO,
P. B. M.; BRANDÃO, M. S.; CHAVES, M.H. Fenóis totais e atividade antioxidante
de cinco plantas medicinais. Quimica Nova, v. 30, n. 2, p.351-355, 2007.
COUTINHO, H. D. M.; COSTA, J. G. M.; SIQUEIRA-JR, J. P. & LIMA, E.O. Effect of
Momordica charantia L. in the resistance to aminoglycosidesin ethicilinresistant Staphylococcus aureus. Comparative immunology, microbiology and
infectious diseases, v. 1010-1016, 2009.
CUI,
G.Y.;
TAN,
(Euphorbiaceae)
R.X.
and
Lignans
their
and
tannins
chemotaxonomic
from
Alchornea
significance.
davidii
Biochemical
Systematics and Ecology, v. 32 p. 99–102, 2004.
DANCER, S.J. The problem with cephalosporins. Antimicrob Che mother, v. 48, p.
463-478, 2011.
DEWANTO, V et. al. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes
by increasing total antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v.
50, n. 10, p. 3010-4, 2002.
EKPO, O. E.; PRETORIUS, E. Euphorbia hirta and its anti-inflammatory
properties. South African Journal of Science, v. 103, p. 201-203, 2007.
126
SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da planta ao medicamento. Editora
UFSC, Florianópolis, p 1104. 2010.
FERREIRA. F. V.; PINTO. C. A. A fitoterapia no mundo atual. Química Nova, vol.
33, n. 9, 1829, 2010.
FILHO, V. C.; YUNES, R. A. Etratégias para a obtenção de compostos
farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre
modificação estrutural para otimização da atividade. Química nova, 21 (1), 1998.
GANPATI, K. S. et. al. Antimicrobial activity and phytochemical screening of
fresh látex of Euphoebia thymifolia LINN. IJRAP. v. 2(5), p.1153-1555, 2011.
GEORGOPAPADAKOU, N.H. Infectious disease 2001: drug resistance,new
drugs. Drug resistance updates: reviews and commentaries in antimicrobial
and anticancer chemotherapy, v. 5, p. 181-191, 2005.
GYURIS, A. et al. Antiviral activities of extracts of Euphorbia hirta L. against
HIV-1, HIV-2 and SIVmac251. In Vivo, v. 23, n. 3, p. 429-432, 2009.
GOBBO NETO. Emprego de técnicas hifenadas na identificação de metabólitos
secundários de Lychophora ericoides Mart. (Asteraceae) e determinação de
suas variações populacionais e temporais. Tese de Doutorado. Universidade de
São Paulo, 2007.
GOULD, D. Effective strategies for prevention and control of Gram-negative
infections. Nursing Standard, Londres, v. 23, n. 48, p. 42-46, 2009.
GURIB-FAKIM, A. Medicinal plants: traditions of yesterday and drugs of
tomorrow. Molecular Aspects Medicine, v. 27, p. 1-93, 2006.
HERNÁNDEZ, T.; CANALES, M.; AVILA, J.G.; DURAN, A.; CABALLERO,J.; ROMO
127
DE VIVAR, A. & LIRA R. Ethnobotany and anti- Ethnobotany and antibacterial
activity of some plants used in traditional medicine Zapolitán de las Salinas,
Puebla (México). Journal of Ethnopharmacology, v. 88, p. 181-188, 2003.
HIROTA, B. C. K. et. al. Fitoquímica e atividades biológicas do gênero Jatropha:
Mini-revisão. Visão Acadêmica, Curitiba, v. 11, n. 2, 2010.
HORE, S. K. et al. Effect of aqueous Euphorbia hirta leaf extract on
gastrointestinal motility. Fitoterapia, v. 77, p. 35-38, 2006.
HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA P. C. Princípios ativos de plantas
superiores. São Carlos: EdUFSCar, p. 09, 60-61, 2003.
IKAWA, M. et.al. Utilization of Folin-Ciocalteu phenol reagent for the detection
of certain nitrogen compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51,
p. 1811-1815, 2003.
JAIN, S. et al. Ayurvedic medicines in treatment of cancer. Journal of Chinese
Integrative Medicine, v. 7,n. 11, p. 1096-1099, 2009.
JUNIOR, S. F. P. Constituintes químicos das folhas e caule de Croton sellowii
(Euphorbiaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16, n. 3, p. 397-402,
2006.
KAWANISHI, S.; MURATA, M.; TAKAHASHI, A.; SAITO, I. The role of metals in
site-specific DNA damage with reference to carcinogenesis. Free Radic Biol
Med, v. 32, p. 822-32, 2002.
KAWASHTY. S. A. et al. The Chemosystematics of Egyptian Euphorbia Species.
Biochemica/Systematics and Ecology, v. 18, n. 7/8, p. 487-490, 1990.
KLOCHKOV, S. G.; AFANASEVA, S. V.; PUSHIN, A. N. Acidic isomerization of
alantolactone derivatives. Chem Nat Compd, v. 42, p. 400–406, 2006.
128
KOAY, Y. C. et al. Chemical Constituents and Biological Activities of
Strobilanthes crispus L. Records of Natural Products, v. 7, n. 1, p. 59-64, 2013.
KUMAR, S.; MALHOTRA, R.; KUMAR, D. Euphorbia hirta: Its chemistry ,
traditional and medicinal uses, and pharmacological activities. Pharmacognosy
review, v. 4(7), p. 58–61, 2010.
LAGUERRE, M.; LECOMTE, J.; VILLENEUVE, P. Evaluation of the ability of
antioxidants to counteract lipid oxidation: Existing methods, new trends and
challenges. Review. Progress in Lipid Research, v. 46, p. 244-282, 2007.
LANHERS, M-C. et al. Behavioral effects of Euphorbia hirta: sedative and
anxiolytic properties. Journal of Ethnopharmacology, v. 29, n. 2, p. 189-198, 1990.
LANHERS, M-C et al. Neurophysiological effects of Euphorbia hirta L.
(Euphorbiaceae). Phytotherapy Research, v. 10, n. 8, p. 670 - 676, 1996.
LEE, S. et al. Hydrolysable tannins from euphorbia thymifolia. Phytochemistry, v.
29, n. 11, p. 3621-3625, 1990.
LEE, K. H. et al. The effect of water extracts of Euphorbia hirta on cartilage
degeneration in arthritic rats. Malaysian Journal of Pathology, v. 30, n. 2, p. 95102, 2008.
LEITE, A. C. et.al. Isolamento do alcaloide ricinina das folhas de Ricinus
communis (Euphorbiaceae) através de cromatografia em contracorrente.
Quimica Nova, v. 28, n. 6, p. 983-985, 2005.
LIANDA, R. L. P; VIANNA, C. A. F. J; CASTRO, N.R. Teor de Fenóis e Flavonoides
Totais em Mel de Eucalipto. 32a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2009.
LIMA, M. A. A. et al. Constituintes químicos de Sebastiania macrocarpa Muell.
Arg. (Euphorbiaceae). Química Nova, v. 32, n. 2, p. 348-353, 2009.
129
LIMA, M. R. F.; XIMENES, C. P. A.; LUNA, J. S.; SANT’ANA, A. E. G. The antibiotic
activity of some Brazilian medicinal plants. Revista Brasileira Farmacognosia, v.
16, p. 300-306, 2006.
LIU, Y. et al.
Antimalarial flavonol glycosides
from Euphorbia hirta.
Pharmaceutical Biology, v. 45, n. 4, p. 278-281, 2007.
LUCENA, M.F.A.; AMORIM, B. S.; ALVES, M. Sinopse das espécies de
Euphorbiaceae s.I. do Parque nacional Serra de Itabaiana, Sergipe, Brasil.
Revista Caatinga. v.22, n.4, p. 214-224, 2009.
MARIZ, S.R. et.al. Possibilidades terapêuticas e risco toxicológico de Jatropha
gossypiifolia L.: uma revisão narrativa. Revista Brasileira Plantas Medicinais,
v.12, n.3, p.346-357, 2010.
MARTÍNEZ-FLÓREZ, S. et al. Los flavonoides: propiedades y acciones
antioxidantes. Nutrición Hospitalaria, v. 6, p. 271-278, 2002.
MATOS, F.J.A. Introdução à fitoquímica experimental. 2. ed., Fortaleza: Edições
UFC; 1997.
MATSUBARA, S.; AMAYA, D. B. R. Conteudo de miricitina, quercetina e
kaempferol em chás comercializados no Brasil. Ciênc. Tecnol. Aliment.
Campinas, 26(2), p. 380-385, abr.-jun, 2006.
MICHELIN, D. C.; MORESCHI, P. E.; LIMA, A. C.; NASCIMENTO, G. G. F.;
PAGANELLI, M. O.; CHAUD, M. V. Avaliação da atividade antimicrobiana de
extratos vegetais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 15, p. 316-320, 2005.
MIDDLETON, E.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T.C. The Effects of Plant
Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease,
130
and Cancer. Pharmacological Reviews, v. 52, p. 673–751, 2000.
MOREIRA, R. R.; CARLOS, I. Z.; VILEGA, W. Release of intermediate reactive
hydrogen peroxide by macrophage cells activated by natural products.
Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 24. p. 201, 2001.
MORIARITY, D. M.; HUANG, J.; YANCEY, C.; ZHANG, P.; SETZER, W.; LAWTON,
R. O.; BATES, R. B.; CALDERA, S. Lupeol is the cytotoxic principle in the leaf
extract of Dendropanax querceti. Planta Medica, v. 64, p. 370-372, 1998.
MOSQUERA, O. M. et al. Antioxidant activity of twenty five plants from
Colombian biodiversity. Memorial Instituto Oswaldo Cruz, v. 102, n. 5, p. 631-634,
2007.
NACZK, M.; SHAHIDIB. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of
Chromatography, v. 1054, p. 95–111, 2004.
NAGARA, J. M.; SUNITHA, S.; VARALAKSHMI, P. Effect of lupeol, a pentacyclic
triterpene, on the lipid peroxidation and antioxidant status in rat kidney after
chronic cadmium exposure. Journal of Applied Toxicology, v. 20, p. 413, 2000.
NOLDIN, V. F.; ISAIAS, D. B.; FILHO, V. C. Gênero Calophyllum: Importância
química e farmacológica. Química Nova, v. 29, n. 3, p. 549-554, 2006.
NOSTRO, A.; BLANCO, A.R.; CANNATELLI, M.A.; ENEA, V.; FLAMINI, G. &
MORELLI, I. Susceptibility of methicillin-resistant staphy Susceptibility of
methicillin-resistant staphylococci to oregano essential oil, carvacrol and
thymol. FEMS Microbiology Letters, v. 230, p. 191-195, 2004.
OLIVEIRA, D. G. A família Euphorbiaceae Juss. em um fragmento de Caatinga
em Sergipe. Scientia Plena. v. 9, 2013.
OLIVEIRA, F. C.; FERREIRA, M. J. P.; NÚÑEZ, C. V.; RODRIGUEZ, G.V.;
EMERENCIANO, V. P. 13C NMR spectroscopy of eudesmane sesquiterpenes.
131
Prog Nucl Magn Reson Spec, v. 37, p. 1-45, 2000.
OLIVERIA, R. B.; GIMENEZ, V. M. M.; GODOY, S. A. P. Intoxicações com
Espécies da Família Euphorbiaceae. Revista Brasileira de Biociências, v. 5, p. 6971, 2007.
OLIVEIRA, I.S et.al. Triagem da atividade antibacteriana in vitro do látex e extratos
de Croton urucurana Baillon. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n 4, p. 587593, 2008.
OLIVEIRA, L. C.; BLOISE, MI. Extratos e óleos naturais vegetais funcionais.
Cosmetics & Toiletries 7: 30-37, 1995.
OOTANI, M. A. et. al. Use of Essential Oils in Agriculture. Jornal de
Biotecnologia e Biodiversidade, v. 4, n. 2, p. 162-174, 2013.
PAVIA, D. L., LAMPMAN, G. M., KRIZ, G. S., VYVYAN, J. R. Introdução à
espectroscopia. São Paulo: Cengage Learning, 2010.
PINTO, A. C.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R. A.
Produtos naturais: Atualidade, desafios e perspectivas. Quimica Nova, v. 25,
Supl. 1, p. 45-61, 2002
POLACHINI, C.O. Avaliação in vitro de extratos de plantas e produtos diversos,
frente a amostras de Candida albicans. Dissertação (Mestrado - Área de
Concentração em Ciências) - Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria
Estadual de São Paulo. São Paulo, p.89, 2004.
POZZI, A. C. S. Desenvolvimento de métodos de análise espectrofotométrica de
flavonoides do ‟maracujá”. Dissertação de Mestrado. Universidade de São Paulo,
2007.
RAGASA, C. Y.; CORNELIO, K. B. Triterpenes from Euphorbia hirta and their
cytotoxicity. Chinese Journal of Natural Medicines, v. 11(5), p. 0528−0533, 2013.
132
RAJEH. et. al. Assessment of Euphorbia hirta L. Leaf, Flower, Stem and Root
Extracts for Their Antibacterial and Antifungal Activity and Brine Shrimp
Lethality. Molecules, v. 15, p. 6008-6018, 2010.
RATES, S. M. K. Plants as source of drugs. Toxicon, v. 39, p. 603-613, 2011.
ROCHA FILHO, P. A. Fitocosméticos. Cosmetic & Toiletries, v. 7, p. 18-20, 1995.
ROCHA; SILVA, H. et al. Constituintes químicos das cascas do caule de
Cenostigma macrophyllum: ocorrência de colesterol. Química Nova, v. 30, n. 8,
p. 1877-1881, 2007.
SALATINO, A.; SALATINO, M. L. F.; NEGRI, G. Traditional uses, Chemistry and
Pharmacology of Croton species (Euphorbiaceae). Sociedade Brasileira de
Química, v. 18, n. 1, p. 11-33, 2007.
SANTOS, P. M. L; SCHRIPSEMA, J.; KUSTER, R. M. Flavonoides O-glicosilados
de
Croton
campestris
St.
Hill.
(Euphorbiaceae).
Revista
Brasileira
de
Farmacognosia. v. 15, n. 4, p. 321-325, 2005
SANTOS, R.A.S. Avaliação das propriedades biológicas dos derivados
sintéticos do β-sistosterol e triterpenos. Dissertação de mestrado. Universidade
Federal da Bahia, 2012.
SANTOS, T. G.; REBELO, R. A.; DALMARCO, E. M.; GUEDES, A.; GASPER, A. L.;
CRUZ, A. B.; SCHIMIT, A. P.; CRUZ, R. C. B.; STEINDEL, M.; NUNES, R. K.
Chemical composition and antimicrobial activity of leaf essential oil from Piper
malacophyllum (C. Presl.) C. DC. Química Nova, v. 35, p. 477-481, 2012.
SÁTIRO, L. N.; ROQUE, N. A família Euphorbiaceae nas caatingas arenosas do
médio rio São Francisco, BA, Brasil . Acta Botânica. Brasileira, v. 22, n. 1, p. 99118, 2008.
133
SCHNEIDER, C. D.; OLIVEIRA, A. R. Radicais Livres de Oxigênio e exercício:
Mecanismos de Formação e Adaptação ao Treinamento Físico. Revista
Brasileira de Medicina e Esporte, v. 10, p. 308-313, 2004.
SHIBASAKI, M. Phorbols: chemical synthesis and chemical biology. Yakugaku
Zasshi, v.120, p. 76–90, 2000.
SLINKARD, K.; SINGLETON, V. L. Total phenol analyses automation and
comparison with manual methods. American Journal of Enology and
Viticulture, Washington, v. 28, p. 49-55, 1977.
SILVA, A. C. O.; ALBUQUERQUE, U.P. Woody medicinal plants of the caatinga in
the state of Pernambuco (Northeast Brazil). Acta Botânica Brasileira, v.19, n. 1,
p. 17-26, 2005.
SILVERSTEIN,
R.
M.;
WEBSTER,
F.
X.;
KIEMLE,
D.
J.
Identificação
espectrométrica de compostos orgânicos. 7° ed. Rio de Janeiro:,LTC, 2007.
SINGH, G. D. et al. Inhibition of early and late phase allergic reactions by
Euphorbia hirta L. Phytotherapy Research, v. 20, p. 316-321, 2006.
SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da planta ao medicamento. Editora
UFSC, Florianópolis, 1104 p, 2010.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental.
5° ed. Porto Alegre: Bookman, 836 p., 2002.
ŞÖHRETOĞ LU, D.; SAKAR, M. K.; STERNER, O. New galloylated flavonoid
glycosides from Geranium stepporumdavis DAVIS. Helv Chim Acta, v. 92, p. 520524, 2009.
SOBRINHO, T.J.S.P.; CASTRO, V.T.N.A.; SARAIVA, A.M.; ALMEIDA, .M.; TAVARES,
E.A.; PISCIOTTANO, M.N.C.; AMORIM, L.C. Phytochemical screening and
134
antibacterial activity of four Cnidoscolus species (Euphorbiaceae) against
standard strains and clinical isolates. Journal of Medicinal Plants Research Vol. 6
(21), p. 3742-3748, 2012.
SOUSA, C. M. M.; SILVA, H. R.; VIEIRA, G. M.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. S.;
ARAÚJO, D. S. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas
medicinais. Química Nova, v. 30, p. 351-355, 2007.
SUDHAKAR, M. et al. Antimicrobial activity of Caesalpinia pulcherrima,
Euphorbia hirta and Asystasia gangeticum. Fitoterapia, v. 77, p. 378-380, 2006.
SUFFREDINI, I. B.; SADER, H. S.; GONÇALVES, A. G.; REIS, A. O.; GALES, A. C.;
VARELLA, A. D.; YOUNES, R. N. Screening of antibacterial extracts from plants
native to the Brazilian Amazon Rain Forest and Atlantic Forest. Braz J Med Biol
Res, v. 37, p. 379-384, 2004.
TANAKA, R.; KASUBUCHI, K.; KITA , S.; MATSUNAGA, S. Obtusifoliol and related
steroids from the whole herb of Euphorbia chamaesyce. Phytochemistry, v. 51,
p. 457-463, 1999.
TORRES, D. S. C.; GIULIETTI, F. A. R. S.; GIULIETTI, A. M. A tribo Euphorbiae
dumort (EUPHORBIACEAE) na Chapada Diamantina, Bahia, Brasil: Palinologia
e implicações taxonômicas. Polibotanica, v. 13, p. 83-96, 2002.
TRETIN, D.S. et. al. Potential of medicinal plants from the Brazilian semi-arid
region (Caatinga) against Staphylococcus epidermidis planktonic and biofilm
lifestyles. Journal of Ethnopharmacology, v. 137, p.327– 335, 2011.
VARRICCHIO, M. C. B. N.; SILVA, C. D.; GOMES, N. B. N.; KUSTER, R. M. LAGE,
C. L. S. O uso de Euphorbia tirucalli (Aveloz) em medicina tradicional e as
evidências científicas. Revista de Biologia e Farmácia, v. 3, n. 1, p. 84-92, 2008.
VASAS, A.; HOHMANN, J. Euphorbia Diterpenes: Isolation, Structure, Biological
135
Activity, and Synthesis (2008−2012). Department of Pharmacognosy, University of
Szeged, Eötvös u. 6, H-6720 Szeged, Hungary.
VIJAYA, K. et al. Antibacterial effect of theaflavin, polyphenon 60 (Camellia
sinensis) and Euphorbia hirta on Shigella spp - a cell culture study. Journal of
Ethnopharmacology, v. 49, p. 115-118, 1995.
WU Y. et al. Phenols and flavonoids from the aerial part of Euphorbia hirta.
Chinese Journal of Natural medicines, v.10(1), p. 40-42, 2012.
YANG, D. et. al. Chemical constituents from Euphorbia stracheyi and their
biological activities. Fitoterapia, p. 211–218, 2014.
YIN, F.; HU, L. H.; LOU, F. Chemical studies on the herb of Ocimum basilicum L.
Chin J Nat Med. v. 2, p. 20-24, 2004.
ZARONI, M.; PONTAROLO, R.; ABRAHÃO, W. S. M.; FÁVERO, M. L. D.; CORREA
JUNIOR, C.; STREMEL, D. P. Qualidade microbiológica das plantas medicinais
produzidas no Estado do Paraná. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 14, p.
29-39, 2004.
APÊNDICES
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161

estudo fitoquímico e biológico in vitro de espécies do gênero

Transcrição

Documentos relacionados

Baixar este arquivo PDF

O presente documento certifica que TONY BARBOSA BEZERRA

KÁTIA APARECIDA KERN GERMINAÇÃO, CRESCIMENTO E

Conteúdo para prova de Filosofia

Internet e Inseminação artificial

-Folha de São Paulo - Folha e Equilíbrio 07 de Março de 2002

barbara osorio fabrics

Resumo

Pompeu Vasconcelos

Analise da proporcao sexual de embrioes bovinos