KÁTIA APARECIDA KERN GERMINAÇÃO, CRESCIMENTO E

KÁTIA APARECIDA KERN
GERMINAÇÃO, CRESCIMENTO E
METABOLISMO ENERGÉTICO DE Euphorbia
heterophylla L.: EFEITOS DO ETANOL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Biológicas
(Área de concentração – Biologia Celular
e Molecular) da Universidade Estadual de
Maringá, para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Biológicas.
Orientadora: Dra. Emy Luiza Ishii-Iwamoto
Maringá
2007
KÁTIA APARECIDA KERN
GERMINAÇÃO, CRESCIMENTO E
METABOLISMO ENERGÉTICO DE Euphorbia
heterophylla L.: EFEITOS DO ETANOL
Profa. Dra. Emy Luiza Ishii-Iwamoto
Orientadora
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BIOGRAFIA
KÁTIA APARECIDA KERN CARDOSO, nasceu em São Paulo, SP, em 05 de
janeiro de 1978. Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual
de Maringá (2004). Em março de 2005 iniciou o Curso de Mestrado em Biologia
Celular na Universidade Estadual de Maringá, em Maringá, PR. Atualmente é
professora de Biologia do ensino médio do Colégio Evangélico de Maringá.
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APRESENTAÇÃO
Em concordância com as normas fixadas pelo Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas, a dissertação foi redigida na forma de um artigo a ser submetido ao
periódico Weed Research:
Kátia Aparecida Kern, Érica Marusa Pergo, Luiz Saraiva Arraes, Maria Aparecida Sert,
Fernanda Kagami Lima e Emy Luiza Ishii-Iwamoto. Efeitos do etanol sobre a
germinação, crescimento e metabolismo energético da planta daninha Euphorbia
heterophylla L. (Amendoim bravo).
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RESUMO
INTRODUÇÃO E
OBJETIVOS

A
Euphorbia
heterophylla
L.
(Euphorbiaceae) é uma planta anual nativa da América tropical e subtropical e está,
atualmente, amplamente difundida nas regiões temperadas do mundo. No Brasil, a
espécie considerada daninha é responsável por perdas na produtividade de diversas
culturas, particularmente o da soja. Essa planta já foi identificada em quase 70% dos
cultivos de soja nos estados do sul, sendo que a ocorrência de biótipos resistente a
herbicidas que inibem a acetolactase sintase tem sido relatada nestas áreas. A planta é
de difícil controle porque apresenta grande capacidade de produção de sementes (até
3.000 sementes por planta). As sementes permanecem no solo, infestando o próximo
cultivo. Assim, a utilização de substâncias de ocorrência natural capaz de suprimir a
germinação dessas sementes deve ser considerada no desenvolvimento de métodos
alternativos para limitar a distribuição da espécie. Embora muito seja conhecido sobre a
Euphorbia heterophylla L. com relação às suas exigências para a germinação e o
crescimento, pouco é conhecido sobre as características bioquímicas e fisiológicas da
espécie durante a germinação e os primeiros estágios de crescimento. Em estudos
preliminares, foi observado que a esterilização superficial das sementes de Euphorbia
heterophylla L. com etanol 95% causa uma supressão completa da germinação. Com
base nestas observações, o objetivo do presente trabalho foi o de avaliar alguns aspectos
de metabolismo energético de Euphorbia heterophylla L. durante germinação da
semente e o crescimento inicial das plântulas e a influência do etanol. Foram medidas a
atividade respiratória e a atividade da álcool desidrogenase em embriões e em raízes
primárias das plântulas. A atividade respiratória de mitocôndrias isoladas de raízes
primárias foi também avaliada. Para verificar se o etanol afeta outras espécies de plantas
daninhas, a germinação e o crescimento de Senna obtusifolia L. e de Ipomoea
grandifolia L. foram, também, examinadas.
MÉTODOS
 As sementes de Euphorbia heterophylla L. foram colocadas em
caixas gerbox com folhas duplas de papel de germinação umedecidas com água
destilada (controle) ou com soluções de etanol (0,5, 1,0 ou 1,5%, v/v). As caixas foram
colocadas em uma câmara de crescimento programada para o fotoperíodo de 12 hr (230
mol m-2 s-1 fluxo de fótons) a 25° C. O mesmo fotoperíodo foi utilizado para a Senna
obtusifolia L. e Ipomoea grandifolia L., porém a temperatura foi de 30° C. As sementes
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que germinaram nos tempos de 24, 48, 72 ou 96 horas de incubação foram selecionadas
para os testes de crescimento. As plântulas foram removidas, o excesso de água foi
retirado com papel de filtro, e as suas raízes e caules primários foram seccionados para
as determinações dos comprimentos e das massas frescas e secas. O consumo de
oxigênio dos embriões ou das raízes primárias foi medido polarograficamente, a 25° C,
através de um elétrodo do tipo Clark posicionado em uma câmara de acrílico. Para
calcular a contribuição da citocromo oxidase mitocondrial no consumo global de
oxigênio (respiração total), o cianeto de potássio (KCN) foi acrescentado ao meio de
incubação. A atividade da álcool desidrogenase foi analisada espectrofotometricamente
monitorando a velocidade inicial de redução do NAD+, a 340 nm, na presença de npropanol. Para o isolamento das mitocôndrias as raízes primárias de plântulas incubadas
por 48 horas, foram cortadas em pequenos segmentos em meio de manitol-Tris-HCl
gelado e foram homogeneizadas em um homogeneizador de van Potter-Elvehjem. O
homogeneizado foi filtrado e centrifugado a 1000 × g. Em seguida, o sobrenadante foi
centrifugado a 15000 × g e o sedimento de mitocôndrias resultante, contendo
aproximadamente 1,5 mg proteína mitocondrial foi ressuspenso em um volume final de
2,0 ml de um meio manitol-Hepes. Todas as operações foram executadas a 0-4° C. O
consumo de oxigênio das mitocôndrias isoladas foi avaliado polarograficamente, a 25°
C, em um meio manitol-Tris-HCl contendo 5,0 mM de KH2PO4. A respiração foi
iniciada pela adição de NADH, succinato ou L-malato. O ADP (160 µM) foi adicionado
ao meio de reação depois de aproximadamente 5 min da adição do substrato.
RESULTADOS E DISCUSSÃO  A atividade respiratória de embriões isolados
de sementes de Euphorbia heterophylla L. incubadas por 12 ou 24 horas foi maior do
que a de raízes primárias das plântulas crescidas após 36 ou 48 horas da incubação. A
contribuição relativa da respiração KCN-insensível para respiração total foi menor do
que 10% em todas estas condições. A oxidase alternativa mitocondrial não parece ter
contribuído para a respiração KCN-insensível dos embriões e das raízes primárias
porque o consumo de oxigênio das mitocôndrias isoladas foi totalmente bloqueado pela
adição de KCN. A atividade da álcool desidrogenase dos embriões foi também mais
elevada durante o período de embebição, mas logo após a emergência, houve um
acentuado declínio da atividade desta enzima. Quando as sementes de Euphorbia
heterophylla L. foram submetidas a etanol nas concentrações de 0,5%, 1,0% e 1,5%,
tanto a percentagem de germinação quanto o crescimento das plântulas foram inibidas.
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No tempo de 24 horas de incubação, houve supressão completa da germinação com
etanol 0,5%. Nos períodos experimentais subseqüentes, a germinação e o crescimento
das plântulas foram também reduzidos, porém em percentuais menores. A respiração
total bem como a atividade da álcool desidrogenase de embriões de sementes incubadas
na presença de etanol por 12 ou 24 horas não foi modificada, mas foram encontradas
diferenças nos períodos experimentais subseqüentes (36 e 48 horas). A atividade
respiratória e a atividade da álcool desidrogenase foram substancialmente mais altas
quando comparadas com os respectivos controles. Nestes períodos, porém, a maioria
das sementes não havia germinado, ou seja, as atividades foram essencialmente aquelas
dos embriões. O exame dos efeitos diretos de etanol em mitocôndrias isoladas revelou
que etanol não afeta a respiração basal e nem a respiração do estado IV. Porém, a
respiração do estado III foi reduzida pelo etanol na concentração de 1,5%. É pouco
provável, portanto, que a maior atividade respiratória dos embriões, encontrada nos
tempos de 36 e 48 horas, tenha sido conseqüência de uma ação desacopladora do etanol
sobre mitocôndrias. A maior atividade da álcool desidrogenase, por sua vez, poderia ser
interpretada como um estímulo da expressão da ADH mediada pelo etanol no meio, ou
ainda uma resposta à condição de anaerobiose induzida pela inibição da germinação.
Independente dos mecanismos exatos pelos quais etanol causou inibição na germinação
e crescimento de Euphorbia heterophylla L. deve ser enfatizado que este efeito é o
oposto da ação mais conhecida do etanol sobre as plantas, pois o composto atua como
estimulador da germinação de várias espécies cultivadas como o pepino, aveia, arroz,
alface e cevada. O efeito do etanol parece ser espécie-específico entre plantas daninhas,
como foi sugerido pelo menor efeito fitotóxico observado em Senna obtusifolia L. e
Ipomoeae grandifolia L.
CONCLUSÕES
 A ação fitotóxica do etanol em Euphorbia heterophylla L.
apresenta várias implicações fisiológicas, ecológicas e práticas. No meio ambiente, as
plantas poderiam sofrer influência do etanol exógeno liberado por outras plantas ou
microorganismos, particularmente em solos menos arejados, podendo influenciar o
metabolismo energético das sementes durante a germinação e o crescimento inicial das
plântulas, uma hipótese que merece investigações futuras. Por causa da sua potente e
específica ação sobre a Euphorbia heterophylla L., o etanol poderia ser considerado
uma substância alternativa no controle desta planta daninha. De fato, o etanol pode ser
um dos componentes ativos de resíduos gerados em destilarias, como o vinhoto, o óleo
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de fúsel e a flegmassa, que têm sido utilizados na agricultura e que têm apresentado a
propriedade de inibir a germinação de algumas espécies de plantas daninhas.
ABSTRACT
INTRODUCTION AND AIMS  Euphorbia heterophylla L. (Euphorbiaceae)
is an annual native of tropical and sub-tropical America, but it is now widely distributed
throughout the warm regions of the world. In Brazil the species is responsible for yield
losses of several crops, particularly soyabean. This weed has been identified in nearly
70% of cultivated soybean in the southern states and the occurrence of biotypes resistant
to herbicides that inhibit the acetolactase synthase has been reported in these producing
areas. The weed is difficult to control because presents greater capacity of seeds
production (up to 3000 seeds per plant). The seeds remain in the soil, causing the
infestation of the next cultivation. Thus, the utilization of naturally occurring
compounds able to suppress seed germination should be considered in the development
of alternative methods to limit this weed distribution. Although much is known about
Euphorbia heterophylla L. in relation to its germination and growth requirements, little
is known about its biochemical and physiological characteristics during seed imbibition
and in the early stage of growth. In preliminary experiments we have found that the
superficial disinfection of seeds with 95% ethanol causes a complete suppression of
Euphorbia heterophylla L. germination. In view of this, the aim of the present work was
to evaluate some aspects of energy metabolism of Euphorbia heterophylla L. during
seed germination and the influence of ethanol. We measured the respiratory activity and
the activity of alcohol dehydrogenase in seed embryos and in primary roots of
seedlings. The respiratory activity of mitochondria isolated from primary roots was also
measured. In order to verify if ethanol affects other weed species, the germination and
growth of Senna obtusifolia L. and Ipomoea grandifolia L. were also examined.
METHODS  Seeds of Euphorbia heterophylla L. were placed on a double sheet
of germination paper in plastic gerbox plates moistened with distilled water (control) or
ethanol solutions (0.5%, 1.0% or 1.5%, v/v). Gerbox plates were placed in a growth
chamber programmed for the photoperiod of 12 hr (230 µmol m-2 s-1 photon flux), at
25°C. The same photoperiod was used for Senna obtusifolia L. and Ipomoea grandifolia
L. at 30°C. The seeds that had germinated at 24, 48, 72 or 96 hours were selected for
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growth tests. The seedlings were removed, dried on filter paper, and the primary roots
and shoots were excised for measurement of their lengths and fresh and dry weights.
The oxygen consumption of embryo and primary roots from Euphorbia heterophylla L.
was measured polarographically, at 25°C, in a nutrient solution using a Clark-type
electrode positioned in a closed plexi-glass chamber. For estimating the contribution of
the mitochondrial cytochrome oxidase to the overall O2 uptake (Total respiration),
potassium cyanide (KCN) was added to reaction medium. Alcohol dehydrogenase
activity was assayed spectrophotometrically by evaluating the initial rate of NAD+
reduction at 340 nm in the presence of n-propanol. For mitochondria isolation primary
roots of seedlings grown for 48 hours were cut into short segments in cold mannitolTris-HCl medium and subsequently homogenized with a van Potter-Elvehjem
homogenizer. The homogenate was filtered and centrifuged at 1000 x g. The supernatant
was centrifuged at 15000 x g and the resulting mitochondrial pellet, containing
approximately 1.5 mg mitochondrial protein was suspended in a final volume of 2.0 ml
of a mannitol-Hepes medium. All operations were performed at 0-4 °C. Oxygen uptake
of isolated mitochondria was measured polarographically at 25 °C in a mannitol-TrisHCl medium containing 5.0 mM KH2PO4. Respiration was initiated by addition of
NADH, succinate or L-malate. ADP (160 µM) was added after nearly 5 min of substrate
addition.
RESULTS AND DISCUSSION  The respiratory activity of embryo isolated from
Euphorbia heterophylla L. seeds incubated for 12 or 24 hours was higher than that of
root apices from seedlings grown for 36 or 48 hours. The relative contribution of KCNinsensitive respiration to overall respiration was less than 10% in all these conditions.
The mitochondrial alternative oxidase seems not to contribute to KCN-insensitive
respiration of root apices because the oxygen consumption of isolated mitochondria was
totally blocked by KCN addition. The alcohol dehydrogenase activity in embryo was
also higher during imbibition period, but shortly after the seedlings emergence, an
accentuated decline of the enzyme activity was found. When Euphorbia heterophylla L
seeds were grown in the presence of ethanol in the concentrations of 0.5%, 1.0% and
1.5% both seed germination percentage and seedling roots growth were significantly
inhibited. At 24 hours of incubation, complete suppression of seed germination was
observed with ethanol 0.5% or higher. At the subsequent experimental periods,
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germination and seedling growth were also reduced though to lesser degrees. The
overall respiration rates as well as the alcohol dehydrogenase activity of embryos
isolated from seeds grown in the presence of ethanol for 12 or 24 hours were not
modify, but differences were found at the subsequent experimental periods (36 and 48
hours). The respiratory activity and the alcohol dehydrogenase activity were
substantially higher when compared with their respective controls. At these time
periods, however, most of the seeds had not germinated, i.e, the activities were
measured essentially in embryos. The examination of the direct effects of ethanol in
isolated mitochondria revealed that ethanol did not alter basal and state IV respiration.
The state III respiration was, however, reduced by ethanol 1.5%. It is unlikely, thus, that
the higher respiratory activity found at 36 and 48 hours of seeds incubation was a
consequence of an uncoupler action of ethanol. The higher activity of alcohol
dehydrogenase, on the other hand, could be interpreted as an ethanol-induced
stimulation of ADH expression or a response to anaerobic condition caused by seed
germination inhibition. Irrespective of the exact mechanisms by which ethanol inhibited
the germination and growth of Euphorbia heterophylla L. it should be emphasized that
this effect is the opposite of ethanol action reported in most of plants, i.e., it acts
stimulating seed germination of many cultured plants such as cucumber, oat, rice,
lettuce and barley. The effect of ethanol seems to be species-specific among weed
plants, as suggested by the lower phytotoxic effect on Senna obtusifolia L. and
Ipomoeae grandifolia L.
CONCLUSION  This work revealing the phytotoxic action of ethanol on
Euphorbia heterophylla L. may be several physiological, ecological and practical
implications. The plants could suffer influence of exogenous ethanol released from
others plants or microbes, particularly in less aerated soil. In this condition, ethanol
might influence the energy metabolism of seed during germination and seedling growth,
a hypothesis which deserves future investigations. Because of its high and specific
phytotoxicity to Euphorbia heterophylla L, ethanol could be considered as an
alternative substance in the control of this weed. Actually, ethanol can be one of the
active components of residues generated in distilleries, such as vinasse, fusel oil and
flegmass that have been used in agriculture and that have been reported to inhibit the
germination of some weed species.
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