monofluotm kit - Bio-Rad
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MONOFLUOTM KIT MONOFLUO TM KIT INFLUENZA 2 X 45 TESTES 52209 MONOFLUO TM KIT ADENOVIRUS 45 TESTES 52210 MONOFLUO TM KIT PARA-INFLUENZA 1+2 45 TESTES 52211 MONOFLUO TM KIT PARA-INFLUENZA 3 45 TESTES 52212 DETECÇÃO DE INFLUENZA A E B, PARAINFLUENZA 1 E 2, PARAINFLUENZA 3 OU ADENOVIRUS POR IMUNOFLUORESCENCIA IVD ÍNDICE 1- INTERESSE CLINICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 2- PRINCIPIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74 3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74 4- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77 5- AMOSTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 5.1 – TÉCNICA PARA RECOLHA DE AMOSTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 5.2 – TRATAMENTO DAS AMOSTRAS ANTES DO TESTE I.F. . . . . . . . . . . .79 5.3 - ISOLAMENTO DO VÍRUS EM CULTURA CELULAR . . . . . . . . . . . . . . . .79 6- MODO DE FUNCIONAMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80 6.1 – MATERIAL NECESSARIO MAS NÃO FORNECIDO . . . . . . . . . . . . . . . .80 6.2 – RECONSTITUIÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES . . . . . . . . . . .81 6.3 - PROCEDIMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81 7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 7.1 – CONTROLO DE QUALIDADE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 7.2 – LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . .82 72 8- LIMITES DO TESTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 9- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 10- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 11- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 1- INTERESSE CLINICO Os vírus Respiratório Sincicial, Influenza A e B, para-Influenza 1, 2 e 3 e Adenovírus são responsáveis por graves infecções respiratórias em crianças e pessoas fragilizadas. O diagnóstico da origem viral ou bacteriana destas infecções é essencial para a implementação das medidas terapêuticas apropriadas. O diagnóstico destas doenças virais baseia-se no isolamento do vírus. Na verdade, o diagnóstico serológico não produz resultados satisfatórios; os títulos de anticorpos aumentam significativamente apenas 10 a 15 dias após o início dos sinais clínicos, não sendo normalmente possível detectá-los na criança. O método de referência continua ainda a ser o isolamento do vírus de cultura de células (células Hela, KB, Hep2 ou linhas celulares de fibroblastos de origem embrionária) e a sua identificação a partir de uma amostra nasofaríngea ou de líquido de lavagem broncoalveolar. A amostra é obtida durante a fase de replicação máxima do vírus, 1 a 6 dias após o início da doença. A associação dos anticorpos monoclonais específicos destes vírus com tropismo respiratório e a técnica de imunofluorescência permitiram o diagnóstico rápido destas doenças (por análise directa da amostra), sem recorrer ao método de cultura celular, o qual é difícil de realizar. Para cada um destes vírus foram seleccionados anticorpos monoclonais dirigidos contra as proteínas virais, em primeiro lugar devido à sua especificidade e, segundo, devido à qualidade da imagem que se observa durante a aplicação de imunofluorescência; a aparência habitual é uma fluorescência granular ou de partículas, claramente visível, no citoplasma das células infectadas. Estes anticorpos monoclonais também podem ser utilizados para identificar cada um destes vírus, após respectivo isolamento em cultura celular. A prevalência destas infecções virais levou a Bio-Rad a propor a elaboração do diagnóstico rápido das doenças de etiologia viral, da seguinte forma: • O vírus Respiratório Sincicial (RSV) é responsável por mais de 60% destas infecções; MONOFLUOTM SCREEN R.S.V. é utilizado para identificar este vírus por técnica de imunofluorescência directa em uma fase, da amostra recolhida. • Os vírus Influenza A e B, para-Influenza 1, 2 e 3 e Adenovírus são responsáveis, a vários níveis consoante as regiões e a época do ano, 73 por cerca de 30% destas infecções. MONOFLUO TM SCREEN INFLUENZA, PARA-INFLUENZA, ADENOVIRUS é utilizado para confirmar ou invalidar a presença de um destes vírus, por técnica de imunofluorescência directa em uma fase, na amostra; em caso de resposta positiva, o vírus incriminado pode ser identificado utilizando: - MONOFLUOTM KIT INFLUENZA (referência 52209) - MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 1 + 2 (referência 52211) - MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 3 (referência 52212) - MONOFLUOTM KIT KIT ADENOVIRUS (referência 52210)i 2- PRINCIPIO O dispositivo de teste MONOFLUOTM KIT Influenza destina-se à detecção dos vírus Influenza A e B em células infectadas, por técnica de imunofluorescência indirecta utilizando anticorpos monoclonais específicos de cada um destes vírus. O dispositivo de teste MONOFLUO TM KIT Adenovirus destina-se à detecção das diferentes estirpes de Adenovírus. O dispositivo de teste MONOFLUOTM KIT para-Influenza 1+2 destina-se à detecção dos vírus para-Influenza tipos 1 ou 2 e o dispositivo de teste MONOFLUOTM KIT para-Influenza 3 à detecção do vírus para-Influenza tipo 3. Estes anticorpos monoclonais ligam-se ao antigénio expresso no citoplasma de células infectadas, obtidas de amostras contendo secreções ou exsudados de células do tracto respiratório, ou após isolamento do vírus em cultura celular. A adição de conjugado anti-IgG de ratinho, marcado com fluoresceína, torna fluorescentes as células que se fixaram ao anticorpo monoclonal. As células que se ligam aos anticorpos monoclonais específicos, dirigidos contra as proteínas virais, exibem fluorescência, essencialmente citoplásmica, de aparência granular ou em partículas, no exame ao microscópio de fluorescência. 3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO Para informações sobre as condições de armazenamento e o prazo de validade é favor reportar-se à etiqueta da embalagem. Os reagentes guardados à temperatura de +2-8°C, na ausência de contaminação microbiana, mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na etiqueta (mesmo depois de abertos). 74 MONOFLUOTM KIT INFLUENZA (referência 52209) ETIQUETA R1a Monoclonal Antibody anti-Influenza A R1b Monoclonal Antibody anti-Influenza B R2 Negative control REAGENTES Anticorpos monoclonais (ratinho) Anti-Influenza A (clone IA52/9) Conservante: < 0,1% azida sódica Anticorpos monoclonais (ratinho) Anti-Influenza B (clone IB82/2) Conservante: < 0,1% azida sódica Controlo negativo (sobrenadante de cultura) Conservante: < 0,1% azida sódica APRESENTAÇÃO 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) R3 R4 Concentrated Conjugate (10X) Conjugado Concentrado (10X): Anticorpos (ovelha), tampão anti-IgG de fluoresceína, contendo azul de Evans Conservante: < 0,1% azida sódica Mounting medium Meio de fixação (pronto a utilizar): Glicerol tamponado para imunofluorescência Conservante: < 0,1% azida sódica 1 x 1 ml (frasco conta-gotas) 1 x 3 ml (frasco conta-gotas) MONOFLUOTM KIT ADENOVIRUS (referência 52210) ETIQUETA R1 Monoclonal Antibody Adenovirus R2 Negative control REAGENTES Anticorpos monoclonais (ratinho) anti-Adenovirus (clone H60 e H72) Conservante: < 0,1% azida sódica Controlo negativo (sobrenadante de cultura) Conservante: < 0,1% azida sódica APRESENTAÇÃO 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) R3 R4 Concentrated Conjugate (10X) Mounting medium Conjugado Concentrado (10X) : Anticorpos (ovelha), tampão anti-IgG de ratinho marcado com isotiocianato de fluoresceína, contendo azul de Evans Conservante: < 0,1% azida sódica Meio de fixação (pronto a utilizar): Glicerol tamponado para imunofluorescência Conservante: < 0,1% azida sódica 1 x 1 ml (frasco conta-gotas) 1 x 3 ml (frasco conta-gotas) 75 MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 1+2 (referência 52211) ETIQUETA R1 Monoclonal Antibody paraInfluenza 1 + 2 R2 Negative control REAGENTES Anticorpos monoclonais (ratinho) anti-paraInfluenza 1 e 2 (clone P2 128/14) Conservante: < 0,1% azida sódica Controlo negativo (sobrenadante de cultura) Conservante: < 0,1% azida sódica APRESENTAÇÃO 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) R3 R4 Concentrated Conjugate (10X) Mounting medium Conjugado Concentrado (10X) : Anticorpos (ovelha), tampão anti-IgG de ratinho marcado com isotiocianato de fluoresceína, contendo azul de Evans Conservante: < 0,1% azida sódica Meio de fixação (pronto a utilizar): Glicerol tamponado para imunofluorescência Conservante: < 0,1% azida sódica 1 x 1 ml (frasco conta-gotas) 1 x 3 ml (frasco conta-gotas) MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 3 (referência 52212) ETIQUETA R1 Monoclonal Antibody paraInfluenza 3 R2 Negative control REAGENTES Anticorpos monoclonais (ratinho) anti-parainfluenza 3 (clone Pi3 5/12 Conservante: < 0,1% azida sódica Controlo negativo (sobrenadante de cultura) Conservante: < 0,1% azida sódica APRESENTAÇÃO 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) 1 x 2,5 ml (frasco conta-gotas) R3 R4 76 Concentrated Conjugate (10X) Mounting medium Conjugado Concentrado (10X) : Anticorpos (ovelha), tampão anti-IgG de ratinho marcado com isotiocianato de fluoresceína, contendo azul de Evans Conservante: < 0,1% azida sódica Meio de fixação (pronto a utilizar): Glicerol tamponado para imunofluorescência Conservante: < 0,1% azida sódica 1 x 1 ml (frasco conta-gotas) 1 x 3 ml (frasco conta-gotas) 4- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO A qualidade dos resultados está dependente do cumprimento das seguintes boas práticas de laboratório: • Não utilizar reagentes cujo prazo de validade tenha expirado. • Não misturar nem combinar reagentes de dispositivos que tenham números de lote diferentes, durante um mesmo procedimento. • Antes de usar, deixar os reagentes estabilizar à temperatura ambiente (+18-30°C). • Utilizar recipientes em vidro perfeitamente lavados e enxaguados com água desionizada ou, de preferência, usar material descartável. • Utilizar uma nova ponta de pipeta para cada amostra. • Verificar a qualidade da água desionizada. Se se observarem organismos fluorescentes num controlo negativo, será necessário esterilizar a água utilizada por filtração. • Não deixar que o conjugado seque sobre a lâmina, durante o processo de coloração. INSTRUÇÕES DE SAUDE E SEGURANÇA • Usar luvas descartáveis. • Não “pipetar com a boca". • Qualquer material que entre em contacto directo com as amostras deverá ser considerado como contaminado e, como tal, material infeccioso. • Evitar o derramamento das amostras. • Respeitar sempre as técnicas e precauções em vigor quanto à protecção contra riscos microbiológicos, no tratamento e eliminação dos materiais e produtos biológicos utilizados para a reacção. ATENÇÃO: O reagente R3 (conjugado concentrado) contém azida sódica a uma concentração de <0,2%. Xn - Nocivo R22-32: Nocivo por ingestão. Em contacto com ácidos liberta gases muito tóxicos. S28-60: Após contacto com a pele, lavar imediata e abundantemente com água. Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos. Dados de segurança dos produtos estão disponíveis a pedido. 77 5- AMOSTRA Estes vírus estão confinados a secreções e exsudados celulares das vias respiratórias superiores. Para efectuar um diagnóstico directo por meio de fluorescência, é necessário recolher células descamadas das secreções nasais ou traqueo-brônquicas. Se se pretender isolar o vírus em cultura celular, a técnica de imunofluorescência pode igualmente ser aplicada às células que tenham sido infectadas in vitro, logo que o efeito citopático possa ser detectado. 5.1. TÉCNICA PARA RECOLHA DE AMOSTRAS Os vírus Influenza A e B, para-Influenza 1, 2 e 3 e Adenovírus são investigados em amostras contendo secreções nasais ou traqueobrônquicas obtidas por técnica de esfregaço em algodão Q-tip® ou por aspiração ou lavagem nasal com solução tampão PBS. Para análise directa das amostras em imunofluorescência, as secreções respiratórias podem ser transferidas para o laboratório. Em caso de isolamento viral, as secreções são recolhidas em meio de transporte apropriado para manter o vírus: de preferência, solução salina – ou meio MEM tamponado (já que uma parte dos vírus com tropismo respiratório perde a sua natureza infecciosa em meio ácido) e enriquecida com determinadas substâncias destinadas a proteger os vírus: albumina bovina, gelatina, soro de galinha, sacarose e antibiótico. A fórmula seguinte é um exemplo: • MEM, 5 mg/ml albumina bovina, 4.76 mg/ml HEPES, 0.22 mg/ml bicarbonato de sódio, 1500 U/ml penicilina, 1000 mcg/ml estreptomicina. Para isolamento, a amostra deve ser transportada em estado de congelação profunda ou a frio. Um elemento fundamental é obter uma quantidade suficiente de secreções. Normalmente torna-se mais eficaz e conveniente recolher secreções respiratórias, muitas vezes secreções de muco, por aspiração, utilizando um pequeno tubo acoplado a um recipiente de recolha de amostras, sendo o tubo inserido no nariz da criança. Este sistema encontra-se disponível no mercado sob a designação de “ bomba de sucção de mucosidades”. Caso não seja possível proceder à aspiração na criança acamada, poder-se-á utilizar uma seringa de elevada capacidade (50 ml), uma bomba de aspiração manual ou, se possível, um sistema de aspiração eléctrico. Por vezes, como por exemplo em casos de bronquiolite, o nariz da 78 criança está seco, não sendo, por isso, possível obter secreções em quantidade suficiente. Neste caso, pode-se utilizar a lavagem com um enema nasal: instilar alguns mililitros de solução numa passagem nasal e, em seguida, este líquido é imediatamente aspirado. Na maioria dos casos, a aspiração nasal permite recolher, pelo menos, 0,2 a 0,5 ml de secreções. Este material é então transferido para o laboratório ou colocado no meio de transporte apropriado para isolamento do vírus em cultura celular. À temperatura ambiente (18-30°C) , o armazenamento por menos de 3 horas não altera a qualidade dos antigénios virais na amostra. Recomenda-se o armazenamento a frio (+2 - 8°C) para isolamento viral, mas a inoculação das culturas celulares não deve ser protelada por muito tempo, uma vez que o seu poder infeccioso diminui, mesmo após congelação profunda a -70°C. 5.2. TRATAMENTO DAS AMOSTRAS ANTES DO TESTE I.F. No laboratório é necessário proceder a várias lavagens sucessivas do material aspirado para obter uma suspensão de células nasais isentas de muco. • Preparar o volume necessário de tampão PBS para tratamentos e lavagens, diluindo solução concentrada 10 vezes em água destilada esterilizada. • Adicionar 5 ml de PBS a aproximadamente 0,5 - 1 ml de secreções. Agitar lentamente. • Centrifugar durante 10 minutos a 500 g a +2 - 8°C. Decantar o fluido sobrenadante • Adicionar 5 ml de PBS ao precipitado e centrifugar. Repetir o procedimento de lavagem 2 ou 3 vezes para eliminar completamente qualquer muco. • Após a centrifugação final, adicionar 1 ml de PBS a precipitado celular. Homogeneizar a suspensão por pipetagem. • Aplicar as células nas lâminas. • Proceder à fixação e coloração das células (ver a técnica de coloração). 5.3. ISOLAMENTO DO VÍRUS EM CULTURA CELULAR Uma vez que alguns destes vírus com tropismo respiratório são termolábeis, é importante inocular as culturas celulares o mais rapidamente possível após a recolha da amostra. No laboratório, as amostras devem ser congeladas e descongeladas, por 79 forma a que as células realizem a citólise e libertem as partículas de vírus. Centrifugar durante 10 minutos a 500 g, à temperatura de +2 - 8°C, para eliminar os detritos celulares (2000 rpm). Inocular, com a amostra obtida, a cultura celular destinada a este fim. As células utilizadas são Hep2, Hela ou KB, bem como linhas celulares diplóides de fibroblastos embrionários humanos num meio MEM contendo 5 a 8% de soro fetal de vitela. Os volumes de inoculado e de meio de cultura podem diferir consoante o recipiente utilizado para cultura celular. • Se forem utilizados tubos de Leighton, inocular a cultura com 0,3 ml de amostra. Manter em contacto durante 2h30 a 37°C e, em seguida, diluir a 1,2 ml com o meio de cultura. • Se for utilizado um frasco de 25 cm3, inocular com 1 ml de amostra. Incubar a +37°C durante 2h30 e, em seguida, diluir a 12 ml com o meio de cultura. Incubar as células a +37°C até se observar o efeito citopático do vírus (cerca de 4 a 6 dias). Observação do efeito citopático Observar a célula inoculada ao microscópio óptico de contraste de fase e seguir o desenvolvimento do efeito citopático: separação progressiva de pequenas células mais ou menos redondas e refractivas com algumas inclusões nucleares de vírus Influenza e para-Influenza, e grandes células redondas formando agregados de Adenovirus. Se, ao fim de 6 a 8 dias, o efeito citopático não for ainda observável, após inoculação de uma amostra, prosseguir, de qualquer forma, com a coloração. A replicação viral pode ser suficiente para ser detectada nesta fase por imunofluorescência. De considerar uma segunda passagem nas células. 6- MODO DE FUNCIONAMENTO 6.1 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO • • • • • 80 Água destilada ou totalmente desionizada Lixívia Papel absorvente Luvas descartáveis Tampão de fosfato (PBS) pH 7.2 para IF (concentrado 10X) - 50 ml – referência 74901 • Acetona • Pipetas Pasteur esterilizadas • Pipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou fixas, de 10 a 200µl e 1ml de capacidade de distribuição. • Tubos de ensaio graduados de 10 ml ou 25 ml de capacidade • Tubos descartáveis • Tubos para centrifugação • Lâminas de imunofluorescência – referência 50569 (2 poços) ou 50566 (6 poços) • Lamelas de cobertura • Microscópio de fluorescência • Recipiente para resíduos biológicos perigosos 6.2 – RECONSTITUIÇÃO E ARMAZENAMENTO DOS REAGENTES R3: Diluir o conteúdo do frasco com 9 ml de tampão fosfato para obter a diluição da solução pronta a utilizar. Após diluição, o conjugado antiIgG de ratinho, conservado à temperatura de +2-8°C e na ausência de contaminação microbiana, mantém-se estável por 3 meses. 6.3 - PROCEDIMENTO 6.3.1. APLICAÇÃO E FIXAÇÃO DAS CÉLULAS • Análise directa na amostra - Distribuir 20 µl da amostra tratada (resíduo de centrifugação celular) num poço da lâmina. - Secar as lâminas ao ar utilizando um secador ou deixando secar à temperatura ambiente. - Fixar em banho de acetona a -20°C durante 5 minutos. - Deixar as lâminas secar ao ar. • Cultura celular na lâmina Lavar a lâmina duas vezes durante 1 minuto em banho PBS. Deixar a lâmina secar ao ar. Fixar em banho de acetona a -20°C durante 5 minutos. • Cultura celular em frasco - Retirar o meio. Recolher as células, raspando em 1 ml de PBS. - Resuspender as células, aspirando e rejeitando várias vezes, por meio de uma pipeta cónica. 81 - Em seguida, proceder à aplicação e fixação das células, tal como descrito na análise directa da amostra. 6.3.2. APLICAÇÃO DE ANTICORPOS 1. Preparar o volume necessário de tampão fosfato (PBS) para lavagem, diluindo a solução concentrada 10 vezes em água destilada esterilizada. 2. Preparar o Conjugado R3 (ver o capítulo 6.2) 3. Distribuir uma gota de anticorpos monoclonais específicos (R1a e R1b para Influenza A e B) nos primeiros poços, (primeiro e segundo poços para Influenza A e B), tendo o cuidado de cobrir toda a superfície circular. 4. Distribuir uma gota de controlo negativo (R2) no poço seguinte. 5. Incubar a lâmina durante 30 minutos a +37°C numa incubadora húmida. 6. Uma vez terminado o tempo de incubação, lavar cuidadosamente a lâmina com PBS, utilizando um frasco de lavagem. 7. Lavar duas vezes durante 2 a 5 minutos com PBS. Agitar levemente. 8. Deixar a lâmina secar ao ar. 9. Agitar levemente o conjugado diluído (R3); distribuir uma gota de conjugado diluído (R3) em cada poço. 10.Incubar durante 30 minutos a 37°C em câmara húmida. 11.Após incubação, lavar cuidadosamente a lâmina com PBS, utilizando um frasco de lavagem. 12.Lavar duas vezes durante 2 a 5 minutos com PBS. Agitar levemente. 13.Mergulhar a lâmina (por alguns segundos) em água destilada. 14.Deixar a lâmina secar ao ar. 15.Montar com a lamela de cobertura, utilizando o glicerol tamponado (R4). Verificar se a lâmina se encontra isenta de bolhas de ar. Cobrir a lâmina com o verniz. 7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 7.1 – CONTROLO DE QUALIDADE Aplicar simultaneamente a coloração numa lâmina de referência, utilizando células positivas e negativas. 7.2 – LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Examinar as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência, com uma ampliação de X100 e X400: 82 • Leitura do poço de controlo negativo: não se observa qualquer célula fluorescente após análise de todo o poço. • Reacção positiva: fluorescência granular intra-citoplásmica entre outras células avermelhadas; observa-se, pelo menos, uma célula fluorescente característica. • Reacção negativa: não se observa qualquer célula fluorescente após análise de todos os poços. Nota: as lâminas devem ser lidas imediatamente para se obterem os melhores resultados. No entanto, elas podem ser conservadas à temperatura de +2 - 8°C, em local escuro, durante 24 horas. 8- LIMITES DO TESTE O diagnóstico de uma infecção recente só pode ser estabelecido com base numa combinação de observações clínicas e dados serológicos. O resultado de um único teste não constitui prova suficiente para o diagnóstico de uma infecção recente. 9- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE Os desempenhos dos dispositivos MONOFLUOTM KITS são controlados utilizando lâminas revestidas com controlos positivos e negativos. Estas são testadas com anticorpos monoclonais específicos de cada vírus e com sobrenadante negativo. Os resultados são os seguintes: - com anticorpos monoclonais: presença de células fluorescentes, intensidade ≥ ++ - com sobrenadante de cultura: ausência de células fluorescentes. 10- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO Todos os reagentes são fabricados e preparados de acordo com o nosso Sistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização do produto final. Cada lote é submetido a um controlo de qualidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos relacionados com a produção e controlo de cada lote são arquivados pela Bio-Rad. 11- REFERENCES 1. AYMARD M. Les orthomyxoviridés : les virus grippaux. Virologie médicale par J. MAURIN, 1985, 448-473 (Edit. Flammarion, Médecine - Sciences). 2. BREESE-HALL C., GLIMAN J.M., BREESE B.B., DOUGLAS R.O. Jr. Parainfluenza viral infections in children. Correlation of shedding with clinical manifestation. J. Pediatr. 1977, 91, 191-198. 3. 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