Luís Martins - IPO de Lisboa

Transcrição

Diagnóstico da Infecção Viral no doente
Hematológico
Citomegalovirus
Vírus Epstein-Barr
HHV-6
BKV
Mário Cunha, Luís Martins
IPOLFG EPE
IPOLFG,
Serviço de Patologia Clínica
Laboratório de Virologia
Laboratório Acreditado NP ISO 15189
Diagnóstico da Infecção Viral no
doente hematológico
y Resumo
y Vírus
y Outros vírus com impacto no doente hematológico
y Metodologia
g para
p detecção e quantificação
q
viral
y Tipos de Amostra
y Expressão
p essão dee Resultados
esu ta os
y Caso clínicos
y Conclusões
2
1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 26 e 27 Novembro 2012
Os vírus provocam diferentes tipos de infecções
- Infecções ocultas ou inaparentes
(90%)
- Infecções agudas
Lise celular
- Infecções latente
- Infecções persistente
- Infecções crónicas
- Lise
- Sintomas
-Virémia acentuada
- Infecções progressivamente lentas
Panencefalite Esclerosante Sub aguda:
patologia provocada não por défice
imunitário mas por replicação defeituosa no
CNS – produção anormal da proteína M
- Infecções Tumorogénicas
Transformação celular – EBV, HPV, HTLV I
3
Infecção Viral
y Vírus com impacto em doentes transplantados:
y Citomegalovirus (CMV)
y Vírus Epstein Barr (EBV)
y Herpes
p Humano Tipo
p 6 (HHV6)
(
)
y Vírus BK (BKV)
4
Família Herpesviridae
Sub-Família
Género
Tipo
Alphaherpesvirinae
Simplexvirus
HSV1
Variante
HSV2
Betaherpesvirinae
Varicellavirus
VZV
Cytomegalovirus
Herpesvirus Humano 5
(CMV)
Roseolavirus
Herpesvirus
p
Humano 6
(HHV6)
Variante A
Variante B
(HHV7)
Gammaherpesvirinae
5
Lymphocryptovirus
(EBV)
Rhadinovirus
(HHV8)
1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia
Latência
26 e 27 Novembro 2012
vs reactivação vs reinfecção
HCMV
y HCMV
y
y
y
y
y
y
y
O Homem é o único reservatório
Infecta células epiteliais
p
ductais das gglândulas salivares ou de rim
Excretado regularmente na saliva e urina
Infecções assintomáticas na infância
Cadeia dupla DNA com 240 Kb
In vitro: infecta fibroblastos humanos fetais (ciclo replicativo lento)
Em pacientes imunossuprimidos, tem efeitos deletérios graves:
y
y
y
y
y
y
IInfecções
f õ pulmonares
l
Hepatites
Pneumonias intersticiais
G
Gastrites
Encefalites
Etc.
y É uma das
d maiores causas de
d mortalidade
l d d e morbilidade
b l d d em
transplantados
6
HHV 6
HHV-6
y Isolado em 1986 (Human B Lymphotropic Vírus), em pacientes
y
y
y
y
com HIV/Doença linfoproliferativa (Science, 1986. Salahuddin )
Maior parte da população é seropositiva
Receptor
p celular: CD46
Reactivação nas primeiras 2 a 4 semanas
Apresenta duas variantes
y Variante A: Neurotróprica
y Variante B: Agente etiológico da Roseola infantum ou Exanthem subitum
y População normal:
y Encontra-se
Encontra se em saliva
saliva, sangue periférico,
periférico monócitos
7
HHV-6
HHV
6 (Cont.)
y Trans-activador de retrovirus endogenos
y Latência: Monócitos e Linfócitos
y DNA
y Forma epissomal
y Forma integrada
g
(CI-HHV-6):
(
): 0.2-0.8%
. .
y Poderá estar associado a:
y Sindrome Fadiga Crónica
y Alzheimer
y Esclerose Múltipla
y Miocardites
Mi
di
y Fibromialgias
y Autismo
8
Em pacientes imunossuprimidos,
imunossuprimidos tem efeitos deletérios graves:
•Infecções pulmonares
•Hepatites fulminantes
•P
•Pneumonias
i iintersticiais
t ti i i
•Encefalites
•Imunossupressor
•Etc.
EBV
y Agente etiológico da mononucleose infecciosa
(doença do beijo)
y Genoma sob a forma linear, epissomal e
integrado
y Ciclo Replicativo:
y Lítico:
Lítico genoma linear
y Latência: Forma Epissomal/ Integrada
y Tem vários tipos
p de latência
y Capacidade de imortalização de células in vitro
y Vírus Oncogénico:
y Carcinoma Nasofaringe
y Linfoma de Burkit
EBNA1: proteína de regulação, responsável
pela manutenção da forma epissomal
y Outros Linfomas
y Doenças Linfoproliferativas Pós
Transplante
9
BKV
y Pertence a família Polyomaviridae
y Cadeia dupla
p DNA com 5000 ppb
y Infecções assintomáticas na infância
y Latência - uroepitélio
y A seropositiva aumenta com a idade
y Está
E á associado
i d a:
y Cistites hemorrágicas
y Nefropatia
N f
pos transplante
l
renall
y Encefalites
y Pneumonias
y Retinites
10
Detecção Viral vs Amostra
y Detecção Directa:
y Detecção Indirecta:
y Antigenémia (CMV)
y Anticorpos da classe IgM , IgG e IgA
y PCR em Tempo Real
y Pouca utilidade em contexto
y Mais rápido
y Permite monitorização (quantificação)
y Amostra:
Cópias/mL
hematológico
y Só utilizada no estudo do perfil
serológico
y Plasma
y Lavado Bronco Alveolar
y Liquido Céfalo Raquidiano
y Urina
y Soro
11
Antigenémia CMV (pp65)
Monitorização Viral (cont.):
(cont ):
y Detecção Directa por PCR em Tempo Real:
y Permite monitorização continua da carga viral do
paciente:
y Expressão
E
ã dde R
Resultados:
l d cópias/mL
ó i / L ou UI/mL
UI/ L
y Detectado (Valor superior ao Limite Quantificação,
expresso em
y Cópias/ml: Carga Viral CMV, EBV, HHV6, HHV8
y Detectado inferior ao Limite de Quantificação (LQ)
y Não detectado
12
Monitorização Viral (cont.):
y PCR em Tempo Real:
y Curva
C
dde calibração:
lib ã
y Periodicidade diária
y Realização de quatro diluições seriadas, em
triplicado
y Avaliação dos resultados por Regressão Linear:
y Avaliação de Outliers: Teste Grubbs
y Linearidade: Análise de Resíduos, p-value
p value
13
PCR em Tempo Real
14
Monitorização Viral:
T
Transplante
l t de
d Medula
M d l Óssea
Ó
– Tratamento pré-emptivo (aciclovir)
– Monitorização, em média, até ao dia +100
• HCMV: bissemanalmente
• HHV-6 e EBV: semanalmente
– Técnicas
Té i usadas:
d
• Antigenémia:
– HCMV (proteína não estrutural
estrutural, pp65)
• PCR em Tempo Real (qPCR) – Carga Viral (Cópias/mL)
– HCMV
– EBV
– HHV-6
– Serologia:
l
Estudo
d ddo perfil
f l serológico
ló
ddo receptor/dador,
d d antes ddo
transplante
15
Alo-Transplante UTM
70
y Nº d
de PPacientes: 87
y Idades: 27 anos [1; 63]
y Sexo Masculino:
y Idade Média: 24,3[1; 63]
y Sexo Feminino:
y Idade Média: 29,8[1; 57]
63
63
57
60
50
40
30
27
24,3
20
10
0
1
1
1
Idade (Total)
Masc.
Feminino
Média
16
29,8
Min.
Máx.
Alo-Transplante UTM
y Diagnóstico:
y Leucémias: 48
y Mieloide Crónica - 8
y Tipo de Transplante
y Relacionados: 44
y Mieloide Aguda - 26
y Linfoide
Li f id Aguda
A d -9
y Linfoide Crónica - 3
y Outras - 2
y Linfomas: 12
y Hodgkin - 4
y Não Hodgkin - 8
y Aplasias/Anemias: 13
y Outras: Mieloma Multiplo,
Mielofibrose, Sind. Mielo Displásico
17
y 1 Singénico (gémeos idênticos)
y Não Relacionados: 43
Diagnóstico
Diagnóstico
18
Nº
Sexo
TipoTransplante
Leucémia
LMA
26
M: 12; F: 14
NR: 11; Rel.: 15
N=48
LMC
8
M:2; F: 6
NR: 4; Rel.: 4
LLA
9
M: 2; F7
NR: 6; Rel.: 2
LLC
3
M:1; F: 2
NR: 1; Rel.: 2
Outros
2
M:1; F: 1
NR: 1; Rel.: 1
Linfoma
LNH
8
M: 4; F: 4
NR: 4; Rel.: 4
N=12
LH
4
M: 1; F: 3
NR: 4
Aplasias/Anemias
B talassémia
4
M:3; F: 1
NR: 1; Rel.: 3
N=13
Anemia aplastica
4
M:2; F: 2
NR: 2; Rel.: 2
Outros
5
M: 1; F: 4
NR: 3; Rel.: 2
Outros
Sind. Mielodisplásico
7
M: 4; F: 3
NR: 4; Rel.: 3
N=12
Sind. Wisckott-Aldrich
2
M: 4
NR: 1; Rel.: 1
Alo-Transplante UTM
y Desfecho:
y 14/87 (16%) p
pacientes faleceram:
y Em média, faleceram ao dia +187 pós transplante
y Tipo de Transplante:
y 9 Alo-Transplante Não Relacionados
y 5 Alo-Transplantes Relacionados, dos quais um é Singénico
y Diagnóstico:
y Leucémias: 7 (LLA:3; LMA: 4)
y Linfomas:
L f
5 (LH:
(LH 1;
1 LNH:
LNH 4)
y Mielofibrose: 1
y Sind.
Sind Mielodisplásico
Mielodisplásico: 1
19
Serologia Pré Transplante
20
Serologia
CMV
HHV-6
EBV
Positivo
81 6%
81,6%
82 8%
82,8%
83 9%
83,9%
Negativo
8,4%
7,2%
6,1%
Antigenémia CMV pp65
Alo-Transplante Relacionado vs Não Relacionado
21
HCVM
g
Antigenémia
Alo-Transplante
Não Relacionado
Alo-Transplante
Relacionado
Alo-Transplante
Relacionado e
Nã Relacionado
Não
R l i
d
Nº Pacientes
Positivos
29/87 (33%)
23/87 (26%)
52/87 (59%)
Número Médio
Amostras
52,8
18
46
1ª Amostra
Positiva
Dia +29
Dia +84
Dia +40
% Amostras
Positivas
22,8%
13%
18%
Média Células/
50.000
4 Células/50.000
2,4 Células/50.000
3 Células/ 50.000
Carga Viral CMV
HCMV
Carga Viral
22
Alo-Transplante Alo-Transplante
Não Relacionado
Relacionado
Total
Nº Pacientes
Positivos
35/87 (40%)
37/87 (43%)
72/87 (83%)
Número Médio
Amostras
65
47
50
1ª A
Amostra
Positiva
Dia +16
Dia +45
Dia +31
% Amostras
Positivas
45%
25%
32%
Média Cópias/ml
p
1046 cópias/ml
p
584 cópias/ml
p
829 cópias/ml
p
EBV
23
EBV
Carga Viral
Alo-Transplante Não
Relacionado
Alo-Transplante
Relacionado
Alo-Transplante
Relacionado e Não
Relacionado
Nº Pacientes
Positivos
21/77 (27%)
11/77 (14%)
32/77 (41%)
Número Médio
Amostras
37
30
33
1ª A
Amostra
Positiva
Dia +79
Dia +114
Dia +91
% Amostras
Positivas
13%
18%
14%
Média
Cópias/ml
5831 cópias/ml
1211 cópias/ml
4511 cópias/ml
HHV-6
Alo Transplante Relacionado vs Não Relacionado
Alo-Transplante
Alo-Transplante
o a sp a te
Relacionado
Com
Integ.
Sem
Integ.
Com
Integ.
Sem
Integ.
Com
Integ.
Sem
Integ.
Nº Amostras
Positivas
34/84
(40%)
32/84
(38%)
22/84
(26%)
20/84
(24%)
56/84
(67%)
52/84
(62%)
Número
Médio
Amostras
37
34
26
25
33
30
1ª Amostra
Positiva
Dia +43
Dia + 45
Dia +66
Dia + 69
Dia +52
Dia +55
% Amostras
Positivas
15%
11%
13%
9%
15%
10%
Média
Có i / l
Cópias/ml
10090
p
cópias/m
l n=28
7622
cópias/
p
ml n=14
9448
cópias/ml
p
n= 43
9094
cópias/
p
ml
n=38
HHV-6
24
Total
( i
(Pacientes
com HHV-66
CI= 4)
Alo-Transplante
o a sp a te
Não Relacionado
9887
7631
cópias/
p
ml cópias/ml
p
n= 24
n= 15
1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
Vírus BK
BK Virus
25
Alo-Transplante
Alo
Transplante
Não Relacionado
Alo-Transplante
Alo
Transplante
Relacionado
Total
Plasma
Urina
Plasma
Urina
Plasma
Urina
Nº Amostras
Positivas
10/11
(91%)
6/8 (75%)
8/13
(62%)
11/12
(92%)
18/24
(75%)
17/20
(85%)
Número
Amostras
23
26
24
20
23
23
1ª Amostra
Positiva
Dia + 67
Dia +22
Dia + 36
Dia + 25
Dia +53
Dia +14
% Amostras
Positivas
32%
78%
18%
40%
26%
54%
Média
Cópias/ml
1525
cópias/ml
n=5
44,2x10
2x108
cópias/ ml
n= 24
1809
cópias/ml
n= 4
22,6x10
6x107
1651
cópias/ ml cópias/ml
n=10
n= 9
11,7x10
7x108
cópias/ ml
n=17
Antigenémia
g
pp
pp65 vs. Carga
g Viral CMV
y Nº médio amostras com resultado emparelhado: 51
y 72/87 (88%)pacientes com resultado concordante
y 23 (26%) paciente com CV CMV Não Detectado e Negativo para antigenémia pp65
y 8 pacientes com CV CMV inferior ao LQ
y 2 NR - pp65: 0.5 células/50.000
y 6 Rel - pp65: 0.8 células/50.000
y 41 p
pacientes com CV CMV superior
p
ao LQ:
Q
y Média de CV CMV: 965 cópias/ml
y Média de Células Positivos de pp65: 3.9 células/50.000
CV CMV vs pp65
y 23 NR – CV CMV: 1168 cópias/ml; pp65: 4,4 Cel. +/50k
y 16 Rel – CV CMV: 648 cópias/ml; pp65: 3 Cél. +/50k
y 1ª Amostra Positiva:
pp65: 28 dias (valor médio)
y CV CMV:12
CMV 12 dias
di (valor
( l médio)
édi )
y
CV
CMV
y 15 pacientes com resultado discordante:
y 7 apresentam CV CMV > ao LQ - Média CV CMV: 268 cópias/ml
y 3 com pp65 Positiva e CV CMV Não Detectado
26
Antigenémia
pp65
P ii
Positivo
N i
Negativo
Positivo
49
12
N ti
Negativo
3
23
CV HCMV vs CV HHV-6
y 40/87 apresentam DNAemia de HCMV e HHV-6
y 1ª Amostra com resultado “Detectado”:
y HCMV: +26 dias
y HHV
HHV-6:
6: +55 dias
y Carga Viral Média:
y HCMV:
HCMV 905 cópias/ml
ó / l (S
(Sem HHV6
HHV6-CI:
CI 876 cópias/
ó / mll
y HHV-6: 9928 cópias/ml (Sem HHV6-CI: 10237 cópias/ ml)
y Não Relacionado: 29
y Relacionado: 19
27
CV HCMV vs CV HHV-6 vs
CV
EBV
y 21/87 apresentam DNAemia de HCMV, HHV-6
HHV 6 e EBV
y 1ª Amostra com resultado “Detectado”:
y HCMV:
HCMV +27 di
dias
y HHV-6: +57 dias
y EBV: +81 dias
y Carga
g Viral Média:
y HCMV: 978 cópias/ml
y HHV-6:: 2793 cópias/ml
p
y EBV: 6007 cópias/ ml
y Tipo de Transplante
Transplante: NR – 29;
29 R – 19
y 1 paciente faleceu: NR
28
Vírus BK
y Monitorização de plasma e urina:
y Poucos p
pacientes em estudo
y Aparece mais cedo na urina: +14 dias
y Diferenças
Dif
entre Alo-Tx
Al T Relacionados
R l i d e Nã
Não
Relacionados:
y 1ª Amostra Positiva: +25 vs +22 (semelhante)
y CV BKV ((Urina):
) mais elevada 1 logg em Não Relacionados
(107 vs 108)
y Maior % Amostras Positivas em Não Relacionado: 40% vs
78%
29
Pacientes sem CV CMV
y 4 Pacientes com DNAémia EBV:
y 1 Amostra Positiva: +43 dias
y 490 cópias/ ml (n=2)
y 3 NR;; 1 Rel.
y 1 dos pacientes com HHV6-CI
y 2 faleceram
y 7 Pacientes com DNAéma HHV6
y 1 Amostra Positiva: +26 dias
d
y 4942 cópias/ ml (n=6)
y 5 NR; 2 Rel.
y 3 faleceram
30
Pacientes que faleceram
y 14/87 (16%) pacientes faleceram:
y Em média, faleceram ao dia +187 p
pós transplante
p
y 9 Não Relacionados
y 5 Relacionados
y Idade: 36 [[3, 59]]
31
1º Am. POS
Quant.
n
pp65
+30 dias
5,5 cel./50k
6
CV CMV
+ 22 dias
712 cop/ ml
9
CV EBV
-9 dias
< LQ
3
CV HHV6
+ 61 dias
590 cop/ ml
11
Análise de casos: nº1
Carga Viral CMV vs Antigenémia
30
25
15000
20
15
10000
10
5000
5
0
0
‐20
20 ‐10
10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
Dias Pós Transplante
Nº Cópias
p CMV
32
Antigenémia
g
pp65
pp
An
ntigeném
mia CMV
Carg
ga Viral
20000
Análise de casos: nº 1
Paciente 1
Carga Viral CMV - EBV - HHV6
600
30000
500
25000
400
20000
300
15000
200
10000
100
5000
0
‐10
0
40
Nº Cópias CMV
33
90
140
Nº Cópias HHV6
190
Nº Cópias EBV
LNH – AT-NR
Carga Virral EBV
C
Carrga Viral CMV e H
HHV6
35000
Análise de casos: nº32
Antigenémia pp65 e CV CMV
2500
12
10
Cargaa Viral CM
MV
8
1500
6
1000
4
500
2
0
-400
400
-300
300
-200
200
-100
100
0
0
Nº Cópias CMV
34
100
200
Antigenémia pp65
LMA – AT-NR
300
400
Antigenémiia pp65
2000
400
4000
350
3500
300
3000
250
2500
200
2000
150
1500
100
1000
50
500
0
-300
-200
-100
0
0
100
200
300
Nº Cópias HHV6
35
Nº Cópias CMV
Nº Cópias EBV
LMA – AT-NR
400
Carga Virral CMV e HHV66
C
Carg
ga Viral EBV
Carga Viral e Antigenémia pp65
6000
8
7
6
4000
5
3000
4
3
2000
2
1000
1
0
-20
0
0
20
40
60
80
Nº Cópias CMV
36
1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia
- 26 e 27 Novembro 2012
100
120
140
Antigenémia pp65
LLC – AT-NR
160
180
Antigenémiaa pp65
Cargaa Viral CM
MV
5000
400000
16000
350000
14000
300000
12000
250000
10000
200000
8000
150000
6000
100000
4000
50000
2000
0
-20
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Nº Cópias CMV
37
Nº Cópias EBV
Nº Cópias HHV6
LLC – AT-NR
Carga Viral HH
HV6
Carga V
Viral CM
MV e EBV
V
Análise de Casos: nº 46
-50
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
764
299
0
50
100
150
200
250
300
350
Antigenémia
A
i é i pp65
65
Nº Cópias CMV
38
Nº Có
Cópias
i HHV6
Nº Cópias EBV
Anemia aplastica – Tx NR
Carg
ga Viral E
EBV
Caarga Virall / Antig
genémia
Carga Viral HCMV, EBV e HHV-6
Antigenémia CMV pp65
Análise de Casos: nº
n 64
Carga Viral
CMV + EBV + HHV6
25000
1400
1265
26994
1200
1000
20000
800
15000
600
10000
6502
400
5000
200
0
-15,0
15 0
0
35 0
35,0
Nº Copias CV EBV
39
85 0
85,0
135 0
135,0
Nº Copias CV HHV6
185 0
185,0
235 0
235,0
Nº Copias CV CMV
LLC AT-NR
Carga Viiral CMV
V
Carg
ga Viral E
EBV e HHV6
30000
Lesões a HHV6
40
Conclusões:
y Citomegalovirus:
l
Carga Virall ddo HCMV vs Antigenémia
é
pp65
y Mais pacientes com resultado “Detectado” (40% vs 33%)
y Maior
M i percentagem de
d Amostras
A
por paciente
i
com resultado
l d
“Detectado” (32% vs 18%)
y Detecção precoce (+31 dias vs +40 dias)
y Antigenémia requer
y N
Nº mínimo de células (1000 leucócitos/ul)
y Amostra recente (máximo 4 horas após colheita) enquanto que na
CV HCMV só necessitamos de plasma
y A observação microscópica da antigenémia pp65 tem uma
observação subjectiva
y A CV permite
it a monitorização
it i ã a partir
ti ddo di
dia zero
41
Conclusões:
y Vírus Epstein-Barr
y Dinâmica viral diferente do CMV:: + 91 dias
y CV EBV: 4511 cópias/ml, com valores mais elevados
nos Alo-Tx
Al T Nã
Não R
Relacionados
l i d
y Importância no risco de desenvolvimento de Doença
Linfoproliferativa Pós Transplante
42
Conclusões:
y Herpes Humano Tipo 6;
y Possível p
papel
p como:
y Agente? – 11/14 (79%) pacientes com HHV6, + 61 dias
y Cofactor?
y Bystander?
y Possível trans-activador de outros vírus, nomeadamente HCMV
y Pacientes com DNAemia elevada de HHV-6: necessário avaliar a
possibilidade de este se encontrar integrado no genoma da
célula
43
Importância da Monitorização
Pós Transplante
y Alo-Transplante Relacionado (R) vs Não Relacionado (NR)
y DNAemia e Antigenémia
g
é mais elevada em NR do que
q R:
y pp65: 4 vs 2 Células/ 50.000
y HCMV: 1046 vs 584 Cópias/ml
y EBV: 5831 vs 1211 Cópias/ml
y HHV-6: 10090 vs 7631 Cópias/ml (inclui pacientes com HHV-6 CI)
y DNAemia/ Antigenémia CMV aparecem mais cedo em Alo-
Transplantes Não relacionados
y Pode comprometer sucesso de transplante
44
Importância da Monitorização
Pós Transplante
y Alo-Transplante Relacionado (R) vs Não Relacionado (NR)
y DNAemia e Antigenémia
g
é mais elevada em NR do que
q R:
y pp65: 4 vs 2 Células/ 50.000
y HCMV: 1046 vs 584 Cópias/ml
y EBV: 5831 vs 1211 Cópias/ml
y HHV-6: 10090 vs 7631 Cópias/ml (inclui pacientes com HHV-6 CI)
y DNAemia/ Antigenémia CMV aparecem mais cedo em
Alo-Transplantes Não relacionados
y Pode comprometer sucesso de transplante
45
Conclusões:
y As cargas virais permitem
y Detecção
ç precoce
p
y Permite a monitorização a partir do dia zero (ao contrário da
aantigenémia)
t ge é a)
y Estudo da Dinâmica viral - >Resultados quantificados(Cópias/mL)
46
Conclusões:
y Herpes Humano Tipo 6;
y Possível p
papel
p como:
y Agente?
y Cofactor?
y Bystander?
y Possível trans-activador de outros vírus, nomeadamente HCMV
y Pacientes com DNAemia elevada de HHV-6: necessário avaliar a
possibilidade de este se encontrar integrado no genoma da
célula (ver paciente 46) – Terapêutica antiviral
47
Agradecimentos
48
It is the laboratoryy that has helped
p turn
medicine from Art into Science
Stanley Zinberg

Luís Martins - IPO de Lisboa

Transcrição

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