universidade federal da paraíba centro de ciências da

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO
TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS (UFC/UFRN/UFRPE/UFPB)
NÍVEL DOUTORADO
PAULA REGINA RODRIGUES SALGADO
ESTEREOISÔMEROS DA EPÓXI-CARVONA COM ATIVIDADE
ANTICONVULSIVANTE: UM ESTUDO COMPARATIVO
JOÃO PESSOA
2016
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Desenvolvimento
e
Inovação
Tecnológica
em
Medicamentos do Centro de Ciências
da Saúde da Universidade Federal da
Paraíba para obtenção do grau de
DOUTOR
EM
INOVAÇÃO
TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida
JOÃO PESSOA
2016
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida
Orientador – UFPB
__________________________________________
Profª. Drª. Margareth de Fátima Formiga de Melo Diniz
Examinadora Interna – UFPB
__________________________________________
Profª. Drª. Hilzeth de Luna Freire Pessôa
Examinadora Interna – UFPB
__________________________________________
Profª. Drª. Camila Carolina de Menezes Santos Bertozzo
Examinadora Externa – UFCG
__________________________________________
Profª. Drª. Kelly Samara de Lira Mota
Examinadora Externa – UFRN
__________________________________________
Prof. Dr. Luis Cézar Rodrigues
Examinador Interno – UFPB (SUPLENTE)
__________________________________________
Profª. Drª. Flávia Negromonte Souto Maior
Examinadora Externa – UFCG (SUPLENTE)
Aos meus pais, Jurandir Brasileiro Salgado e Amair Cristina
Rodrigues e a minha irmã, Camila Cristina Rodrigues Salgado, família
abençoada que Deus me concedeu, sem os quais nenhum percalço seria
superado nessa árdua caminhada, dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus, meu guia, meu norte, por permitir que este sonho se realizasse. Hoje
concluo mais esta grande etapa na minha vida porque o pai celestial concedeu-me
todas as condições necessárias para que isto acontecesse. Muitos foram os
obstáculos durante estes quatro anos de doutorado, mas todos foram vencidos com
muita luta graças à força vinda de Deus. Agradeço também à Mãe Rainha que,
tenho certeza, sempre intercedeu a Deus por mim durante as atribulações que vivi.
Hoje sou mais forte, pois fui lapidada pelo Criador.
Aos meus pais e também minhas maiores inspirações, Jurandir Brasileiro
Salgado e Amair Cristina Rodrigues, por sempre acreditarem que a educação é o
melhor caminho. Apesar da vida humilde, eles sabiam que não há herança maior a
ser deixada para os filhos do que os estudos. Obrigada, meus guerreiros, por todo
apoio e por não medirem esforços em oferecer sempre o melhor. Agradeço também
a minha irmã, Camila Cristina Rodrigues Salgado, pelo companheirismo e por
sempre acreditar em mim. Voce nos orgulha a cada conquista, que não são poucas.
Família, essa vitória é nossa! Amo voces!
Aos demais familiares (tia Ceni, tio Chico, tio João, primos, primas) que,
apesar da distância, fazem-se presentes a todo momento. Em especial agradeço à
tia Ana, pessoa iluminada e que tem uma relação estreita com Deus. Sei o quanto a
senhora pede a Deus por mim e tenho certeza de que as bênçãos na minha vida
surgem também devido a isso. Sou muito feliz por tê-los em minha vida e por saber
que sempre estou em suas orações. Família é a base de tudo e voces são minha
maior riqueza. Muito obrigada pela torcida.
Ao meu namorado e maior companheiro que eu poderia ter, Fagner Carvalho
Leite. Deus sabe que eu não seguiria um milímetro à frente sem toda a força vinda
de voce. Obrigada pela paciência (pois eu não sou nada fácil), por estar ao meu lado
nas horas boas e difíceis, por acreditar em mim quando nem eu mesma acreditava e
por ser esse ser humano com um coração que não cabe no peito. Quanta admiração
tenho por voce! Eu não poderia ser mais abençoada, pois um grande homem
caminha ao meu lado. Te amo!
Ao meu orientador, professor Reinaldo Nóbrega de Almeida, pessoa de
caráter, ética e profissionalismo ímpar! É muito difícil encontrar palavras para
descrever o tamanho da minha admiração pelo senhor. Uma pessoa que vira noites
para cumprir com os inúmeros deveres a ele atribuídos e ainda encontra tempo e
disposição para coordenadar um laboratório e orientar diversos alunos, merece mais
que o meu respeito, merece minhas orações. Muito obrigada por ser mais que um
orientador, e sim, um pai científico. Meus princípios e convicções científicas foram
galgados em um lar amistoso, de excelente convivência, onde o senhor nos mostrou
como fazer ciência. Muito, muito obrigada pelos ensinamentos e por ter dado-me o
privilégio de ser sua orientanda.
Ao professor Damião Pergentino de Sousa, por não apenas fornecer-me as
substâncias objeto de estudo desta tese, mas por inúmeras vezes, durante nossas
conversas, dar-me direcionamentos extremamente importantes para a execução
deste trabalho. Aproveito para agradecer também a sua aluna, Luciana Nalone
Andrade, pela grande colaboração na síntese das referidas substâncias.
Aos membros da banca examinadora, pela imensurável contribuição dada
para a versão final desta tese. Muito obrigada por aceitarem participar desta defesa.
Aos amigos do Laboratório da Psicofarmacologia-UFPB, que acompanharam
o andamento deste trabalho, contribuindo direta ou indiretamente para com o
mesmo.
Diogo Vilar da Fonseca, mais que um amigo, um irmão. Pessoa de
humildade sem igual, que não mede esforços para ajudar o próximo. Por isso voce é
tão abençoado, porque sabe olhar para o amigo com dificuldades e oferecer uma
solução. Agora mais do que nunca estreitamos nossa amizade, não é compadre? É
uma alegria para mim ter pessoas como voce na minha vida, o bem que lhe desejo,
desejo a um irmão. Voce é da família, só veio de outro ventre.
Cynthia Germoglio, nossa recém-chegada, pessoa de um coração imenso e
bondade inquestionável, que sempre nos ajudou nos experimentos, inclusive quando
era requisitada nos finais de semana. Muito obrigada por ser sempre disponível e
também por organizar as melhores reuniões com o pessoal da psico na sua casa.
Anfitriã melhor não há!
Renan Braga e Ingrid Eulália, esse casal lindo que sempre esteve disposto
a me ajudar nos experimentos. Obrigada pela convivência maravilhosa e por serem
amigos tão presentes. Esse doutorado foi mais leve graças a voces.
Marcelo Dutra, também nosso recém-chegado que se ambientou com muita
facilidade no laboratório. Obrigada pela ajuda nos experimentos e pela convivência
sempre harmoniosa. Agradeço também a Aline Kelly e Paula Torres, mestrandas e
colegas de longa data, pelos momentos alegres vividos no laboratório.
Aos alunos de iniciação científica, Humberto Aragão e Terezinha Araújo.
Muito obrigada pela disponibilidade de sempre, fico muito feliz e aliviada em ver que
o futuro do laboratório está em excelentes mãos.
Aos professores e parceiros da psicofarmacologia, Mirian Salvadori, Adriana
Fernandes, Sócrates Golzio, Fábio Tenório, Liana Clébia e Temilce Simões
pelos ensinamentos, convivência amistosa e contribuições diretas e indiretas para
que esta tese nascesse.
À professora Bagnolia Araújo, um verdadeiro manual de como ser um
docente. Seus ensinamentos, desde a graduação, passando pelo mestrado, estão
em mim até hoje. Muito obrigada. Agradeço também a sua doutoranda, Paula
Benvindo, pela imensa ajuda nos experimentos onde era requerida a remoção do
hipocampo. Sua paciência e disponibilidade para ensinar foram muito valiosas.
Aos professores da Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação
Tecnológica em Medicamentos (DITM), em especial à Patricia Lopes, Maria de
Fátima Vanderlei, Matheus Pedrosa, Valdemiro Amaro, Tulio Accioly, Eduardo
Oliveira e Cícero Aragão, por apresentarem-me um mundo novo e diferente de
tudo o que conhecia. Vivi momentos inigualáveis, viajei muito, conheci pessoas
novas, aprendi bastante e tenho orgulho em fazer parte desta família. Sempre tive
inclinação para a área tecnológica e entrar para este programa foi uma das escolhas
mais acertadas que fiz na vida.
À Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezam, pela parceria para a realização dos
testes histopatológicos e na quantificação de citocinas. Agradeço também aos
demais membros do laboratório de Imunofarmacologia-UFPB, Fagner Carvalho
(sim, ele também me ajudou nos experimentos, e como!), Adriano Alves, Raquel
Fragoso e Allysson Gadelha pela valiosa contribuição na execução de metodolgias
que enriqueceram ainda mais este trabalho.
A toda minha turma de doutorado, em especial, Jéssica Maciel, João
Vinagre, Kelly Sivocy, Maria Carolina, Gislaine Portela e Consuelo Fernanda,
pelas alegrias vividas e desesperos compartilhados. Foi maravilhoso conviver e
viajar com voces! Aos que não são da minha turma de doutorado, mas fazem parte
do programa e dividiram estes momentos da mesma forma, Guilherme Eduardo,
Edla Guedes, Yanna Telles, Antonio Carlos, Liane Mangueira, Josué Ramalho e
George Albuquerque, muito obrigada por tudo!
À minha grande amiga e irmã, desde a época de mestrado, Viviane Araújo
da Silva, pelo companheirismo e por estar comigo em todos os momentos da minha
vida, apoiando e torcendo.
Aos funcionários do biotério José Crispim Duarte e Luis Cordeiro por toda
ajuda para realização deste trabalho. À secretária do PPgDITM, Aparecida, pelo
apoio sempre dado aos discentes e à funcionária da limpeza do IPeFarm, Mônica,
pela alegria e simpatia que transmite por onde passa.
Meu sincero respeito a todos os animais utilizados durante os experimentos,
sem os quais este trabalho não poderia ser realizado.
À Universidade Federal da Paraiba e à Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
E, respondendo Simão, disse-lhe: Mestre, havendo trabalhado toda a
noite, nada apanhamos; mas, sobre a tua palavra, lançarei a rede.
(Lucas 5:5)
RESUMO
SALGADO, P.R.R. Estereoisômeros da epóxi-carvona com atividade
anticonvulsivante: um estudo comparativo. 2016. 155p. Tese (Pós-graduação em
Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos) -UFPB/CCS/ João
Pessoa – PB.
A epóxi-carvona (EC) é um monoterpeno presente em plantas aromáticas com
atividades farmacológicas já comprovadas no sistema nervoso central, entre elas,
antinociceptiva e anticonvulsivante. Esta substância apresenta centros quirais que
possibilitam a geração de quatro estereoisômeros, denominados (+)-cis-EC, (-)-cisEC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC, cujos efeitos anticonvulsivantes comparativos nunca
foram estudados. Este trabalho visa investigar de forma comparativa a atividade
anticonvulsivante dos citados estereoisômeros da EC em modelos experimentais de
indução química e elétrica de convulsão em camundongos, bem como quantificar
citocinas pró-inflamatórias e realizar análise histopatológica dos animais tratados. No
teste das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol, todos os estereoisômeros
testados (300 mg/kg; i.p.) foram efetivos na proteção das convulsões, aumentando a
latência para surgimentos das mesmas. Já no teste das convulsões induzidas pela
pilocarpina, as substâncias (+)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC tiveram maior
destaque na redução de parâmetros relacionados à ativação de receptores
colinérgicos, além de aumentarem a latência para início das convulsões. Não foram
obtidos resultados significativos no teste das convulsões induzidas pela estricnina,
sugerindo-se que possivelmente estas drogas não atuem em receptores de glicina.
No modelo do eletrochoque auricular máximo, evidenciou-se diferença no efeito dos
estereoisômeros da EC e apesar de todos reduzirem a duração das convulsões de
forma significativa, as substâncias (+)-trans-EC e (-)-trans-EC apresentaram uma
redução ainda mais acentuada. No teste do “kindling”, (+)-cis-EC e (-)-cis-EC
reduziram a média dos escores apresentados, com pequeno mas visível destaque
para (+)-cis-EC. O estereoisômero (+)-cis-EC diminuiu os níveis das citocinas próinflamatórias IL-1β, IL-6 e TNFα no teste do “kindling”, enquanto, comparativamente,
(-)-cis-EC não reduziu a quantidade de IL-1β. A análise histopatológica do
hipocampo evidenciou proteção neuronal maior para os tratados com (+)-cis-EC. O
grupo que recebeu (-)-cis-EC exibiu componentes inflamatórios neste tecido, o que
elenca mais uma vez (+)-cis-EC como promissor, comparativamente. Sendo assim,
esses resultados mostram que os estereoisômeros da EC tem similar potencial
anticonvulsivante, com destaque para (+)-cis-EC, que possivelmente interfere
potencializando vias inibitórias ou inibindo vias excitatórias, além de alterar os níveis
de citocinas envolvidas no processo epileptogênico e promover proteção neuronal
por mecanismos que requerem maiores investigações.
Palavras-chaves: Anticonvulsivante. Comparativo. Estereoisômeros. Epóxi-carvona.
ABSTRACT
SALGADO, P.R.R. Stereoisomers of epoxy-carvone with anticonvulsant activity:
a comparative study. 2016. 155p. Tese (Pós-graduação em Desenvolvimento e
Inovação Tecnológica em Medicamentos) -UFPB/CCS/ João Pessoa – PB.
The epoxy-carvone (EC) is a monoterpene present in herbs with proven
pharmacological activity in the CNS, including, antinociceptive and anticonvulsant.
This substance has chiral centers that permit the generation of four stereoisomers,
called (+)-cis-EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC and (-)-trans-EC, whose comparative
anticonvulsant effects have never been studied. This work aims to investigate in a
comparative way the anticonvulsant activity of enantiomers of EC cited in
experimental models of chemical and electrical induction of seizures in mice and
quantifying pro-inflammatory cytokines and perform histopathological analysis of the
treated animals. In the test of the seizures induced by pentylenetetrazol, all
stereoisomers tested (300 mg/kg; ip) were effective in protecting seizures, increasing
the latency for appearances thereof. Since the test of the seizures induced by
pilocarpine, substances (+)-cis-EC, (+)-trans-EC and (-)-trans-EC were most
prominent in the reduction of parameters related to the activation of cholinergic
receptors, and increase the latency to onset of seizures. No significant results were
obtained in the test of seizures induced by strychnine, suggesting that possibly these
drugs do not act in glycine receptors. In the maximum atrial electroshock model,
difference was evident in the effect of EC stereoisomers and despite all reduce the
duration of significantly convulsions, substances (+)-trans-EC and (-)-trans-EC
showed a reduction even more pronounced. In the kindling test, (+)-cis-EC and (-)cis-EC reduced the average scores presented with a small but noticeable, especially
(+)-cis-EC. The stereoisomer (+)-cis-EC decreased levels of proinflammatory
cytokines IL-1β, IL-6 and TNFα in the kindling test, whereas comparatively (-)-cis-EC
did not reduce the amount of IL -1β. Histopathological analysis showed greater
hippocampal neuronal protection for those treated with (+)-cis-EC. The group treated
with (-)-cis-CE exhibited inflammatory components in this tissue, which again lists
(+)-cis-EC as a promising, compared. Thus, these results show that the EC
stereoisomers has similar anticonvulsant potential, especially (+)-cis-EC, which
interferes possibly potentiating inhibitory pathways or inhibiting excitatory pathways,
in addition to changing levels of cytokines involved in epileptic condition and promote
neuronal protection mechanisms that require further investigation.
Keywords: Anticonvulsant. Comparative. Stereoisomers. Epoxy-carvone.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Neurotransmissão glutamatérgica e glicinérgica com participação dos
transportadores de glicina nas vias excitatória e inibitória......................................... 35
Figura 2 - Estrutura e localização dos receptores GABAA. ....................................... 36
Figura 3 - Neurotransmissão colinérgica com ativação de receptores M1 e cascata
de sinalização excitatória. ......................................................................................... 37
Figura 4 - Monoterpenos com potencial anticonvulsivante. ....................................... 51
Figura 5 - Exemplo de isomoria óptica cis-trans........................................................ 52
Figura 6 - Molécula enantiomérica. ........................................................................... 53
Figura 7 - Classificação dos tipos de isômeros. ........................................................ 53
Figura 8 - Relação estereoisomérica entre os pares da epóxi-carvona. 1: (+)-cisepóxi-carvona; 2: (-)-cis-epóxi-carvona; 3: (-)-trans-epóxi-carvona; 4: (+)-trans-epóxicarvona...................................................................................................................... 57
Figura 9 - Camundongo (Mus musculus) Swiss. ....................................................... 62
Figura 10 - Aparelho de eletrochoque auricular máximo. .......................................... 64
Figura 11 - Resumo esquemático das metodologias anticonvulsivantes utilizadas no
estudo comparativo envolvendo os estereoisômeros da EC. .................................... 65
Figura 12 - Cronograma de administração do PTZ no teste do “kindling” ou
abrasamento. Os tratamentos são realizados em dias alternados, sendo este um
modelo epileptogênico............................................................................................... 70
Figura 13 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre as alterações
morfológicas no hipocampo (40x) dos animais submetidos ao teste do “kindling”
induzido pelo PTZ (n=3/grupo). ................................................................................. 88
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Efeito dos estereoisômeros da EC na latência para início das convulsões
induzidas pelo pentilenotetrazol em camundongos (n=8/grupo). .............................. 76
induzidas pela pilocarpina em camundongos (n=8/grupo). ....................................... 79
Gráfico 3 - Efeito dos estereoisômeros da EC na latência para morte dos animais no
teste das convulsões induzidas pela pilocarpina em camundongos (n=8/grupo). ..... 79
induzidas pela estricnina em camundongos (n=8/grupo). ......................................... 80
teste das convulsões induzidas pela estricnina em camundongos (n=8/grupo). ....... 81
Gráfico 6 - Efeito dos estereoisômeros da EC na duração das convulsões no teste
do eletrochoque auricular máximo em camundongos (n=8/grupo)............................ 82
Gráfico 7 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC na média de escores
apresentados durante o teste do “kindling” induzido pelo PTZ em camundongos
(n=10/grupo). ............................................................................................................. 84
Gráfico 8 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre os níveis de IL1β, no teste do “kindling” induzido pelo PTZ, em camundongos (n=7/grupo). .......... 85
Gráfico 9 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre os níveis de IL6, no teste do “kindling” induzido pelo PTZ, em camundongos (n=7/grupo). ............ 86
Gráfico 10 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre os níveis de
TNFα, no teste do “kindling” induzido pelo PTZ, em camundongos (n=7/grupo). ..... 87
Gráfico 11 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre a média dos
escores observados no hipocampo dos animais submetidos ao teste do “kindling”
induzido pelo PTZ (n=3/grupo). ................................................................................. 89
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Principais características de algumas drogas anti-epilépticas................. 43
Quadro 2 - Novos tratamentos em fase de liberação. ............................................... 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Classificação das crises. ........................................................................... 28
Tabela 2 - Nova descrição das crises focais de acordo com o grau de
comprometimento durante a crise. ............................................................................ 29
Tabela 3 - Tipos de epilepsia. ................................................................................... 30
Tabela 4 - Modificações terminológicas para a organização das crises e epilepsias
da ILAE de 2010. ....................................................................................................... 32
Tabela 5 - Efeito dos estereoisômeros da EC e do diazepam sobre a porcentagem
de mortalidade após o teste das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol em
camundongos (n=8/grupo). ....................................................................................... 77
Tabela 6 - Efeito dos estereoisômeros da EC no teste das convulsões induzidas pela
pilocarpina em camundongos (n=8/grupo). ............................................................... 78
Tabela 7 - Efeito dos isômeros da EC no teste das convulsões induzidas pela
estricnina. .................................................................................................................. 81
Tabela 8 - Efeito dos isômeros da EC no teste das convulsões induzidas pelo
eletrochoque auricular máximo. ................................................................................ 83
Tabela 9 - Efeito dos isômeros da EC no teste do “kindling” induzido pelo PTZ em
camundongos (n=10/grupo). ..................................................................................... 84
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
%
±
®
°C
(+)-cis-EC
(-)-cis-EC
(+)-trans-EC
(-)-trans-EC
a.C
ACh
AChE
AMPA
ANOVA
BHE
ClCCPG
ChAT
CPC
CTCG
DL50
DZP
EAM
EC
EEG
EMJ
EMP
e.p.m
et al.
FDA
g
g
GABA
GABAA
GlyR
GlyT1
GlyT2
HE
IGF
IL-1β
IL-6
ILAE
i.p.
M
mA
mg/kg
mL
Por cento
Mais ou menos
Marca registrada
Graus Celcius
(+)-cis-Epóxi-carvona
(-)-cis-Epóxi-carvona
(+)-trans-Epóxi-carvona
(-)-trans-Epóxi-carvona
Antes de Cristo
Acetilcolina
Acetilcolinesterase
Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionico
Análise de variância
Barreira hemato-encefálica
Íons cloreto
Crises convulsivas parciais e generalizadas
Colina acetiltransferase
Crises parciais complexas
Crises tônico-clônicas generalizadas
Dose letal que mata 50% dos animais
Diazepam
Eletrochoque auricular máximo
Epóxi-carvona
Eletroencefalograma
Epilepsia mioclônica juvenil
Estado de mal epiléptico
Erro padrão da média
E outros
Food and Drug Administration
Grama
Gravidade
Ácido γ-aminobutírico
Receptor do ácido γ-aminobutírico tipo A
Receptor de glicina
Transportador de glicina tipo 1
Transportador de glicina tipo 2
Hematoxilina-eosina
Fator de crescimento semelhante à insulina
Interleucina 1β
Interleucina 6
International League Against Epilepsy
Intraperitoneal
Molaridade
Miliampére
Miligrama por quilograma
Mililitros
mTOR
n
NF-κB
nm
NMDA
p
PBS
PBST
Pg/mL
pH
PI3K
pKa
PTZ
s
SFB
SNC
TGFβR
TNFα
Tween 80
α
β
γ
κ
µ
μL
µm
Proteína alvo da rapamicina em mamíferos
Número
Fator nuclear kappa B
Nanômetro
N-metil-D-aspartato
Probabilidade de significância
Tampão fosfato de sódio
Tampão fosfato de sódio com adição de tween 20
Picograma por mililitro
Potencial de hidrogênio
Fosfatidilinositol-3-quinase
Constante de acidez
Pentilenotetrazol
Segundos
Soro fetal bovino
Sistema Nervoso Central
Receptor do fator de crescimento transformante β
Fator de necrose tumoral-α
Polioxetileno sorbitano monoleato 80
Alfa
Beta
Gamma
Kappa
Um
Microlitros
Micrômetros
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................. 23
2.1 Epilepsia........................................................................................................... 23
2.2 Abordagem histórica ........................................................................................ 24
2.3 Organização das epilepsias e terminologias .................................................... 27
2.4 Neurobiologia da epilepsia ............................................................................... 33
2.4.1 Neurotransmissão e epilepsia .................................................................... 33
2.4.2 Citocinas inflamatórias e epilepsia ............................................................. 38
2.4.3 Homeostase neuronal ................................................................................ 40
2.4.4 Doença multicausal .................................................................................... 40
2.5 Farmacoterapia anticonvulsivante.................................................................... 41
2.6 Monoterpenos e atividade anticonvulsivante.................................................... 49
2.7 Monoterpeno epóxi-carvona e estereoisômeros .............................................. 51
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 60
3.1 Objetivo geral ................................................................................................... 60
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 60
4 MATERIAL ............................................................................................................. 62
4.1 Substâncias-teste (estereoisômeros da epóxi-carvona) .................................. 62
4.2 Animais ............................................................................................................ 62
4.3 Condições experimentais ................................................................................. 63
4.4 Substâncias utilizadas ...................................................................................... 63
4.4 Preparação dos estereoisômeros da EC e demais substâncias ...................... 64
4.5 Aparelhagem .................................................................................................... 64
5 MÉTODOS ............................................................................................................. 65
5.1 Avaliação da atividade anticonvulsivante dos estereoisômeros da EC ............ 66
5.1.1 Teste das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ) ................... 66
5.1.2 Teste das convulsões induzidas pela pilocarpina ...................................... 67
5.1.3 Teste das convulsões induzidas pela estricnina ........................................ 68
5.1.4 Teste das convulsões induzidas pelo eletrochoque auricular máximo....... 68
5.1.5 Modelo de epilepsia do abrasamento (“kindling”) ...................................... 69
5.1.5a Quantificação de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNFα) no
hipocampo a partir do teste do “kindling” ............................................................ 71
5.1.5b Análise histopatológica de hipocampo a partir do teste do “kindling”....... 72
5.2 Análise estatística ............................................................................................ 73
6 RESULTADOS ....................................................................................................... 76
6.1 Avaliação da atividade anticonvulsivante dos estereoisômeros da EC ............ 76
6.1.1 Teste das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ) ................... 76
6.1.2 Teste das convulsões induzidas pela pilocarpina ...................................... 77
6.1.3 Teste das convulsões induzidas pela estricnina ........................................ 80
6.1.4 Teste das convulsões induzidas pelo eletrochoque auricular máximo....... 82
6.1.5 Modelo de epilepsia do abrasamento (“kindling”) ...................................... 83
hipocampo a partir do teste do “kindling” ............................................................ 85
6.1.5b Análise histopatológica de hipocampo a partir do teste do “kindling”....... 87
7 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 91
8 CONCLUSÕES .................................................................................................... 106
PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 108
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 110
ANEXOS ................................................................................................................. 148
Introdução
SALGADO, P.R.R.
19
1 INTRODUÇÃO
A epilepsia é uma doença do cérebro cuja definição precisou ser alterada ao
longo do tempo, de forma a abranger casos que realmente se enquadrem nesta
patologia. Caracteriza-se por convulsões recorrentes através de sinais transitórios,
bem como sintomas de atividade neuronal anormal, excessiva ou sincrônica
cerebral. (FISHER et al. 2014; LOWENSTEIN, 2015). Esta condição clínica
diversificada apresenta mais de 15 tipos de crises, mais de 30 síndromes epilépticas
e afeta entre 0,5 a 1% da população mundial. Associa-se a casos de morbidade
somática e psicossocial, além de depressão, ansiedade e aumento da mortalidade.
(BERG et al., 2010; LÖSCHER et al., 2013; RAO; LOWENSTEIN 2015).
Diferentemente com o que ocorre no campo da oncologia e doenças infecciosas,
onde as descobertas são feitas em um ritmo mais acelerado, na epilepsia (doença
tão relevante quanto as citadas anteriormente), os avanços acontecem, mas são
mais discretos. Somado a isso, a patogênese das convulsões ainda permanece mal
compreendida, o que reforça a realização de estudos nesta área. (LOWENSTEIN,
2015; RAO; LOWENSTEIN, 2015).
Nas últimas décadas, opções para o tratamento da epilepsia tem sido
fornecidas, como a inserção de mais de 15 drogas anti-epilépticas de terceira
geração, entretanto, estes medicamentos falham no controle das convulsões de 20 a
30% dos pacientes. (BRODIE et al., 2012; LÖSCHER & SCHMIDT, 2011;
SILLANPÄÄ & SCHMIDT, 2006). Outros obstáculos encontrados nos atuais agentes
anti-epilépticos
disponíveis
é
que
eles
parecem
agir
apenas
suprimindo
sintomaticamente as convulsões depois que elas aparecem, não prevenindo o
desenvolvimento da epilepsia no paciente que ainda não apresentou a primeira
convulsão. (SCHMIDT & SILLANPÄÄ, 2012; TEMKIN, 2009). Além disso, alguns
promovem efeitos indesejados significativos no sistema nervoso central (SNC), como
diminuição da capacidade cognitiva e complicações psiquiátricas. (SCHMIDT, 2009).
Dentro desse contexto, é de extrema importância a busca por substâncias
que possam preencher as lacunas existentes no tratamento da epilepsia, sendo os
produtos naturais e os sintetizados a partir de fontes naturais, recursos promissores
para este propósito. Algumas plantas aromáticas têm sido utilizadas no tratamento
de doenças do SNC devido à bioatividade de seus compontentes químicos ou óleos
Introdução
SALGADO, P.R.R.
20
voláteis, os quais, entre outras propriedades, demonstram ação anticonvulsivante.
Este achado tem motivado pesquisas de desenvolvimento de novas drogas antiepilépiticas a partir de produtos à base de plantas, de forma que elas sejam mais
vantajosas que os atuais recursos terapêuticos oferecidos. (ALMEIDA, 2011, 2003).
Os compostos terpênicos majoritários nos óleos essenciais estudados são os
monoterpenos (cerca de 90%) e os sesquiterpenos, sendo os diterpenos detectados
quando os óleos essenciais são extraídos com solventes orgânicos. (DE SOUSA,
2011). Entre os monoterpenos bioativos já conhecidos, tem-se o linalol, que
desempenha ação anticonvulsivante e hipnótica (ELISABETSKY et al., 1995), (-)carvona (GONÇALVES et al., 2008), mirceno (RAO; MENEZES; VIANA, 1990) e 1,8cineol que possuem efeito analgésico (SANTOS; RAO, 2000), e o sesquiterpeno
kessanol, presente nas raízes de Valeriana fauriei, que demonstrou ação
antidepressiva. (OSHIMA et al., 1995).
A epóxi-carvona (EC) é um monoterpeno monocíclico que pode ser
encontrado no óleo essencial de Carum carvi (IACOBELIS et al., 2005), Kaempferia
galanga (JIROVETZ et al., 2001), entre outras plantas (KAISER, 1997). Análogo de
vários
monoterpenos (UMEZU;
SAKATA;
ITO,
2001;
ALMEIDA;
HIRUMA;
BARBOSA-FILHO, 1996), apresenta grupos funcionais e estrutura química
semelhante com os mesmos que possuem atividade farmacológica no SNC, tais
como o limoneno, mentol, mentona, pulegona, carvona e hidroxidihidrocarvona.
(UMEZU et al., 2001; DE SOUSA et al., 2006a; DE SOUSA; OLIVEIRA; ALMEIDA,
2006b).
Foi relatada a capacidade do monoterpeno EC em inibir convulsões em
animais provocadas por agentes convulsivantes químico (pentilenotetrazol) e físico
(eletrochoque auricular), demonstrando um perfil de fármaco anticonvulsivante. (DE
ALMEIDA et al., 2008). Também apresenta atividade antinociceptiva (DE SOUSA et
al., 2007a) e espasmolítica em íleo de cobaia. (DE SOUSA et al., 2008). Além disso,
evidenciaram-se resultados relevantes em testes farmacológicos de coordenação
motora e tempo de sono induzido. (DE SOUSA et al., 2007c).
O estudo da estereoquímica de fármacos tem despertado o interesse da
indústria farmacêutica e de grupos de pesquisa devido ao comportamento diferencial
dos estereoisômeros de muitos fármacos no meio biológico. Considerando-se que
as macromoléculas biológicas são quirais não é surpresa estes tipos de isômeros
apresentarem diferenças nas propriedades farmacodinâmicas, farmacocinéticas e
SALGADO, P.R.R.
Introdução
21
toxicológicas. Desta forma, a busca por fármacos quirais enantiomericamente puros
tem sido alvo de pesquisa na área acadêmica e industrial. (CROSSLEY, 1995).
Diferenças de potência farmacológica foram observadas nos enantiômeros
(+)- e (-)-carvona, os quais são precursores da epóxi-carvona. De fato, (+)-carvona
mostrou-se bioativa em modelos de convulsão, enquanto (-)-carvona foi inativa. (DE
SOUSA et al., 2007b).
Considerando a diversidade de atividades farmacológicas apresentada pela
epóxi-carvona e a importância dos estudos de novas substâncias quirais bioativas e
enantiomericamente puras, bem como a necessidade de desenvolvimento de novos
fármacos anti-epilépticos, o presente estudo investigou, comparativamente, a
estereosseletividade psicofarmacológica de quatro isômeros da epóxi-carvona no
tocante à atividade anticonvulsivante.
SALGADO, P.R.R.
Fundamentação Teórica
23
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 EPILEPSIA
Estima-se que 50 milhões de pessoas no mundo tenham epilepsia, uma das
doenças neurológicas mais comuns e complexas conhecidas, apresentando mais de
12 tipos. Sabe-se que cerca de 60% dos casos de epilepsia surgem a partir de
causas desconhecidas. Nos países desenvolvidos, acomete crianças e idosos em
maior proporção, mas 80% dos indivíduos com epilepsia vivem em países de renda
média a baixa. A manifestação desta condição interefere na rotina do indivíduo, uma
vez que há o comprometimento transitório da consciência e consequente
possibilidade de lesões físicas, problemas sociais e psicológicos, como a depressão.
(LAFRANCE; KANNER; HERMANN, 2008; GOMES, 1997; SAVAGE, 2014;
THURMAN, 2013; WHO, 2015).
O conceito de epilepsia tem passado por alterações que precisaram ocorrer
para que os pacientes não fiquem na incerteza se possuem ou não a doença.
Apresentar uma única convulsão não significa ter epilepsia. (WHO, 2015). Uma
definição correta deve estar de acordo com médicos e pacientes, além de se levar
em conta outras considerações que ajudem na tomada de decisões para o
tratamento.
No seu atual conceito clínico prático, epilepsia é uma doença crônica do
cérebro definida por qualquer uma das seguintes condições:

Pelo menos duas convulsões não provocadas (ou reflexas) que ocorram em
um intervalo menor que 24 horas.

Uma convulsão não provocada (ou reflexa) e a probabilidade de novas
convulsões semelhante ao risco de recidiva geral (pelo menos 60%) após
duas convulsões não provocadas, que ocorram ao longo dos próximos 10
anos.

Diagnóstico de síndrome epiléptica.
Entende-se como convulsão não provocada aquela onde não se identificou
fatores desencadeadores (febre, traumatismo, abstinência de álcool, tumor cerebral)
SALGADO, P.R.R.
24
reversíveis ou temporários que diminuem o limiar para início da convulsão. (FISHER,
2014).
Embora caracterize-se como doença crônica, a epilepsia é dada como
solucionada em indivíduos que apresentaram síndrome epiléptica dependente da
idade, mas que agora já passaram dessa faixa etária ou aqueles que mantiveram-se
livres das convulsões nos últimos 10 anos, sem a utilização de medicamentos
anticonvulsivantes nos últimos 5 anos. (FISHER, 2014).
As últimas definições de epilepsia tem utilizado o termo “distúrbio” ou “família
de distúrbios” para se referir a ela ao invés do termo “doença”. Isso era feito para
enfatizar que a epilepsia compreende vários tipos de doenças e condições
diferentes. O problema destas definições é que o termo distúrbio implica em
perturbações não necessariamente duradouras, além de minimizar a séria origem da
epilepsia, enquanto o termo doença pode relacionar-se a problemas mais
duradouros, condizendo com o quadro apresentado nesta condição clínica. Sendo
assim, a Liga Internacional Contra a Epilepsia concordou recentemente em
considerá-la como sendo uma doença. (FISHER, 2014).
2.2 ABORDAGEM HISTÓRICA
Em quase todas as culturas, durante muitos anos, a epilepsia foi vista como
algo a ser escondido, temido e evitado. O receio de contagiar-se com a doença
existia entre os povos da Roma antiga, levando os pacientes ao isolamento e na
Idade Média estas pessoas eram caçadas como bruxas. Um tratado escrito por
frades dominicanos, em 1494, caracterizava a existência de crises epilépticas como
feitiçaria. Neste período, milhares de mulheres foram perseguidas e torturadas
devido a orientação desse manual. (MASIA; DEVINSKY, 2000).
Em 2000 a.C, na Mesopotâmia, tem-se uma descrição do que seria,
possivelmente, um paciente apresentando crise epiléptica: “[…] o seu pescoço vira
para a esquerda, as suas mãos e pés encontram-se tensos e os seus olhos
arregalados, a sua boca está a espumar e este encontra-se inconsciente”.
(MAGIORKINIS; SIDIROPOULOU; DIAMANTIS, 2010). Os babilônios apresentam
uma das mais antigas descrições desta condição (1050 a.C.), sendo chamada de
“miqtu” ou “doença que cai” e relacionando-a com a presença de fantasmas e
SALGADO, P.R.R.
25
demônios. Estes povos consideravam as doenças como desgostos divinos ou
presença de demônios. Dessa forma, os médicos atuavam como exorcistas em
rituais de feitiçarias e sacrifícios. (LONGRIGG, 2000). Textos escritos pelos
babilônios mostram a sintomatologia clínica característica dessa condição:
Se aquando a sua possessão, enquanto ele se encontra sentado, o
seu olho esquerdo se mover para esse lado, o lábio franzir, saliva
escorrer da sua boca, e a sua mão, perna e tronco do lado esquerdo
se contraírem como uma ovelha recentemente abatida, trata-se de
miqtu. (EADIE, 1995; LONGRIGG, 2000; WILSON, 1990).
Há registros de outras denominações, como “a doença sagrada”, assim
referida pelos antigos gregos, que acreditavam em uma interferência divina para
este estado. As obras da medicina grega reforçam que esta patologia era vista como
uma punição para os indivíduos que pecavam, sendo também atribuída a deuses,
como Selene (deusa da lua), Cibele, Poseidon, Hécate, Hermes e Apolo.
(MAGIORKINIS; SIDIROPOULOU; DIAMANTIS, 2010; TEMKIN, 1994). Pacientes
com tremores excessivos foram descritos por Edwin Smith, no Antigo Egito (1700
a.C.), caracterizando relatos de epilepsia. (MAGIORKINIS; SIDIROPOULOU;
DIAMANTIS, 2010; 2011).
A bíblia também faz menção à doença, quando relata a expulsão de um
demônio do corpo de um menino que apresentava convulsões. Médicos chineses
(770-221 a.C.) debatiam sobre as convulsões generalizadas resultantes da doença
que eles chamavam de Tien-Hs’ien. Eles acreditavam que experiências traumáticas
vividas por uma gestante poderiam causar epilepsia na criança. (CHAUDHARY;
DUNCAN; LEMIEUX, 2011).
Diferentemente do que vinha sendo propagado, por volta de 400 a.C., o físico
grego Hipócrates descreve que as convulsões originam-se no cérebro e possuem o
componente da hereditariedade, mas ainda assim, essa ideia não ganhou força e foi
pouco aceita por muitos anos. (CHAUDHARY; DUNCAN, 2011; GRAVITZ, 2014).
Assim como Hipócrates, o médico e filósofo grego Galeno de Pérgamo também
acreditava que os fenômenos obervados na epilepsia ocorriam no cérebro, e ainda
as separava em tipos: epilepsias onde não se conheciam as causas e as que
resultavam de outras patologias. (MOREIRA, 2004; TEMKIN, 1994). As teorias de
ambos não vigoraram uma vez que a medicina, nessa época, ainda não trazia
respostas em relação a possíveis causas e tratamento da epilepsia.
SALGADO, P.R.R.
26
No século XIX, a forma demoníaca e sobrenatural de se referir à epilepsia,
que se estendeu por tanto tempo, começou a mudar de forma gradativa. Muitos
avanços foram constatados nas ciências biológicas e neurofisiologia, o que englobou
também, especificamente, os estudos acerca da epilepsia. (MOREIRA, 2004).
Merece destaque, nesse momento, o neurologista inglês Hughlings Jackson,
considerado “pai da epilepsia”, relatando sobre as descargas elétricas cerebrais no
surgimento
dos
fenômenos
(HUGHLINGS-JACKSON,
epilépticos
1880;
e
sobre
CHAUDHARY;
as
crises
psicomotoras.
DUNCAN; LEMIEUX,
2011).
Segundo Jackson, a convulsão tratava-se de um sintoma que ocorria após
descargas excessivas e desordenadas dos neurônios do córtex cerebral que
poderiam propagar-se a células vizinhas, lançando o conceito de disseminação do
foco epiléptico. Outra contribuição foi a de que determinados fatores poderiam
desencadear a epilepsia, como um acidente vascular cerebral, tumor e sífilis.
(SHORVON, 2014). Posteriormente, pesquisadores que deram continuidade ao
trabalho de Jackson acabaram confirmando suas descobertas, marcando esse
período pelo entendimento moderno da origem da epilepsia e consequente início da
terapêutica eficaz desta doença. (EADIE, 1995).
Da mesma forma, outros estudiosos do século XIX contribuíram para o
aumento de informações sobre a doença e consequente diminuição do estigma da
loucura, sendo alguns deles: Pinel, 1745-1826; Esquiroll, 1772-1840; Morel, 18091879; Lombroso, 1836-1909. (MOREIRA, 2004).
As mudanças no entendimento da epilepsia continuaram acontecendo à
medida que a neurologia avançava. No século XX, meios de diagnóstico como a
eletroencefalografia, angiografia, mielografia, eletromiografia foram inseridos,
contribuindo para um melhor entendimento das doenças que acometiam o SNC,
entre elas, a epilepsia. (PEREIRA; PITA, 2000; TYLER et al., 2003).
A visão deturpada que se tem acerca da epilepsia decorre do alarde
produzido pelas convulsões tônico-clônicas generalizadas. O indivíduo apresenta
perda de consciência, antes do início das crises, além da possibilidade de outras
manifestações como gritos, perda do controle da bexiga ou intestino e, ao recuperar
a consciência, ficam no estado de confusão e amnésia. O fato de ser uma doença
episódica também contribuiu para o estabelecimento do estigma de que a pessoa
estava possuída, o que traz, para esse indivíduo, o sentimento de vergonha por não
controlar esta situação. (GRAVITZ, 2014).
SALGADO, P.R.R.
27
Os equívocos podem se estender até aos profissionais de saúde, situação
observada, por exemplo, na Nigéria, onde 16% deles acreditam que a epilepsia não
é um distúrbio médico, e sim de saúde mental. Há ainda uma parcela desses
profissionais (6%) que admitem ser uma doença contagiosa, representando assim
mais um obstáculo enfrentado pelos pacientes. (EKENZE; NDUKUBA, 2013). Por
outro lado, a cultura envolvendo a epilepsia, ao passo que isola as pessoas
portadoras da doença, também acaba motivando pesquisas que desmitifiquem e
caracterizem de fato esta condição.
Hoje, sabe-se que a epilepsia é uma doença heterogênea, englobando
alterações cognitivas, emocionais e comportamentais. Já foram descritos genes
relacionados
à
epilepsia
e
os
mecanismos
celulares
e
moleculares
da
epileptogênese estão sendo, aos poucos, esclarecidos. (JACOBS et al., 2009).
2.3 ORGANIZAÇÃO DAS EPILEPSIAS E TERMINOLOGIAS
Denomina-se crise epiléptica aguda a disfunção neurológica que gera
distúrbios de cognição, consciência, movimentos involuntários, manifestações
psíquicas, sensoriais, autonômicas e de comportamento, podendo envolver
diferentes áreas cerebrais. (CHAUDHARY; DUNCAN; LEMIEUX, 2011). No
desenvolvimento de alguns tipos de crises, vê-se o evento conhecido como
convulsão, que consiste em uma alteração do comportamento resultante da
atividade hipersincrônica, excessiva e repetitiva de neurônios do córtex cerebral. A
natureza da crise pode ser apontada de acordo com a duração do evento e
localização cerebral do mesmo. (RAO; LOWENSTEIN, 2015; STEFAN et al., 2009).
Um novo sistema de classifcação das crises epilépticas foi proposto pela Liga
Internacional Contra a Epilepsia, uma vez que os sistemas de classificação
recentemente utilizados datavam da década de 80, necessitando assim de uma
atualização. (GUILHOTO, 2011; GASTAUT, 1969a,b; Comissão Sobre Classificação
e Terminologia da Liga Internacional Contra a Epilepsia, 1981, 1985, 1989).
Antigamente, as crises receberam a classificação de focais (dependendo da região
cerebral onde se iniciavam ou de como elas iniciavam) e generalizadas. (quando as
crises atingiam os dois hemisférios cerebrais). O conhecimento mais aprofundado da
doença e o desenvolvimento de novas tecnologias, como o eletroencefalograma
SALGADO, P.R.R.
28
(EEG), possibilitaram pela ILAE (International League Against Epilepsy) a revisão e
reformulação das classificações. (LÜDERS et al., 1999; ENGEL, 2001, 2006).
Mais
recentemente,
Berg
e
colaboradores
(2010),
baseados
nos
conhecimentos e avanços na área de genética e imagem, publicaram o que seria um
novo documento norteador no diagnóstico da epilepsia. Houve mudanças nos
termos “crises generalizadas” e “crises focais”, que passaram a ser definidas como:
crises distribuídas nos dois hemisférios cerebrais através de redes neuronais e
crises restritas a neurônios de um hemisfério ou discretamente localizadas,
respectivamente. A tabela 1 apresenta a classificação das crises.
Tabela 1- Classificação das crises.
Crises generalizadas
Tônico-clônica
Ausência

Típica

Atípica

Ausências com características especiais
-Ausência Mioclônica
-Mioclonia palpebral
Mioclônica

Mioclônica

Mioclônica atônica

Mioclônica tônica
Clônica
Tônica
Atônica
Crises focais
Não classificáveis

Espasmos epilépticos
Fonte: Berg (2010), Guilhoto (2011).
Durante a crise epiléptica, há diferentes formas de envolvimento muscular,
ocorrendo situações de contração e relaxamento do músculo. As crises do tipo
tônicas caracterizam-se por contração muscular mantida por segundos ou minutos.
SALGADO, P.R.R.
29
Já as crises clônicas consistem em eventos de contração muscular seguidas de
relaxamento, gerando abalos musculares contínuos. A mioclonia representa rápidas
contrações musculares, de forma similar a choques, enquanto as crises atônicas
referem-se à diminuição da contração muscular. (ENGEL, 2001).
O quadro conhecido como status epilepticus pode atingir pacientes epilépticos
(1 a 8%) em algum momento da doença, representando crises prolongadas,
contínuas ou repetidas, havendo grandes chances de desenvolvimento de déficit
cognitivo. (LETTER, 1973).
Em relação às crises focais, deve-se descrevê-las de acordo com o que se
observa durante a crise (tabela 2), não sendo mais utilizados os termos “crise parcial
simples” e “crise parcial complexa”.
Tabela 2 - Nova descrição das crises focais de acordo com o grau de
comprometimento durante a crise.
Sem comprometimento da consciência ou do contato
Assemelha-se ao conceito anterior de crise parcial simples, havendo envolvimento
motor ou autonômico.
Apenas componentes subjetivos ou psíquicos podem ser relatados.
Condizente à ideia de aura.
Com comprometimento da consciência ou do contato
Relaciona-se ao conceito passado de crise parcial complexa
Sugeriu-se o termo “temor discognitivo” para essa classificação
Desencadeamento da crise convulsiva bilateral (englobando abalos tônicos,
clônicos ou tônico-clônicos).
Fonte: Berg (2010), Blume (2001), Guilhoto (2011).
Além da classificação das crises, as epilepsias podem ser classificadas em
diversos tipos, que também foram passíveis de modificações terminológicas.
Atualmente, as epilepsias são organizadas da seguinte forma: síndromes
eletroclínicas, epilepsias não sindrômicas com causas estruturais ou metabólicas e
as de causa desconhecida (tabela 3).
SALGADO, P.R.R.
30
Tabela 3 - Tipos de epilepsia.
(continua)
Síndromes eletroclínicas organizadas pela idade de início
Período neonatal

Epilepsia familiar benigna neonatal; Encefalopatia mioclônica precoce;
Síndrome de Ohtahara.
Lactente
 Epilepsia do lactente com crises focais migratórias; Síndrome de West;
Epilepsia mioclônica do lactente; Epilepsia benigna do lactente; Epilepsia
familiar benigna do lactente; Síndrome de Dravet; Encefalopatia mioclônica
em distúrbios não progressivos.
Infância

Crises
febris
plus
(podem
começar
no
lactente);
Síndrome
de
Panayiotopoulos; Epilepsia com crises mioclônico atônicas (previamente
astáticas); Epilepsia benigna com descargas centrotemporais; Epilepsia
autossômica-dominante noturna do lobo frontal; Epilepsia occipital da
infância de início tardio (tipo Gastaut); Epilepsia cou ausências mioclônicas;
Síndrome de Lennox-Gastaut; Encelalopatia epiléptica com espícula-onda
contínua durante sono; Síndrome de Landau-Kleffner; Epilepsia ausência da
infância.
Adolescência – Adulto

Epilepsia ausência juvenil; Epilepsia mioclônica juvenil; Epilepsia com crises
generalizadas tônico–clônicas somente; Epilepsias mioclônicas progressivas;
Epilepsia autossômica dominante com características auditivas; Outras
epilepsias familiais do lobo temporal.
SALGADO, P.R.R.
31
(conclusão)
Relação menos específica com idade

Epilepsia familiar focal variável (infância à vida adulta); Epilepsias
reflexas.
Constelações distintas

Epilepsia mesial temporal com esclerose hipocampal; Síndrome de
Rasmussen; Crises gelásticas com hamartoma hipotalâmico; Epilepsiahemiconvulsão-hemiplegia; Epilepsias que não se enquadram em
nenhuma
destas categorias diagnósticas podem ser
distinguidas
inicialmente na presença ou ausência de condição estrutural ou
metabólica (causa presumida) e no modo primário do início de crise
(generalizado vs. focal).
Epilepsias atribuídas a causa estrutural-metabólica

Malformações
heterotopia,
do
etc.);
desenvolvimento
Síndromes
cortical
neurocutâeas
(hemimegalencefalia,
(complexo
esclerose
tuberosa, Sturge-Weber, etc.); Tumor; Infecção; Trauma; Angioma;
Insultos perinatais; Acidente vascular cerebral.
Epilepsias de causa desconhecida

Condições com crises epilépticas que são tradicionalmente não
diagnosticadas como uma forma de epilepsia per si; Crises benignas
neonatais; Crises febris.
Diante dos reconhecidos avanços científicos relatados para esta doença, as
referidas modificações mostram-se necessárias no sentido de padronizar a
linguagem médica e tornar cada vez mais preciso o diagnóstico das epilepsias. A
tabela 4 sumariza as modificações mais relevantes nas terminologias, apresentando
os antigos e novos conceitos.
SALGADO, P.R.R.
32
Tabela 4 - Modificações terminológicas para a organização das crises e epilepsias
da ILAE de 2010.
Terminologia e conceitos atuais
Terminologia e conceitos antigos
Etiologia

Genética: problema genético que
pode
contribuir
para
o
seus sintomas. Ex: canalopatias,
indivíduo.

Estrutural/metabólica:
por
origem
distúrbios
à
genética
do
Sintomática: relacionada a um
problema
estrutural/metabólico cerebral. Ex:
de
desconhecida, que pode estar
associado
ocasionada
já
conhecido
do
cérebro.

esclerose tuberosa.

Idiopática:
desencadeamento da epilepsia e
deficiência de GLUT1.


Criptogênica:
de
origem
desconhecida; sintomática.
Desconhecido: não se sabe a
causa,
podendo
pertencer
às
descrições anteriores.
Terminologia


Auto-limitada: com propensão a

Benigna, catastrófica
ser resolvido naturalmente com o

Parcial complexa
tempo.

Parcial simples

Secundariamente generalizada
Farmacoresponsiva:
grandes
chances
controlada
através
com
de
de
ser
terapia
medicamentosa.

Crises
crises
focais:
de
descrição
acordo
características
com
das
suas
(motora,
autonômica, discognitiva).

Evoluindo para crise convulsiva
bilateral: relaciona-se ao tipo de
crise apresentada (tônica, clônica,
tônico-clônica).
SALGADO, P.R.R.
33
2.4 NEUROBIOLOGIA DA EPILEPSIA
Há duas situações de indução da atividade epiléptica: o bloqueio de vias
inibitórias
ou
ativação
de
vias
excitatórias
dependentes
de
voltagem.
(MATSUMOTO; AJMONEMARSAN, 1964; PRINCE; WILDER, 1967; WALTHER et
al., 1986). Seguindo a mesma lógica, o bloqueio das crises dá-se por aumento da
inibição ou diminuição da excitação. (WIECHERT; HERBST, 1966; CROUCHER;
COLLINS; MELDRUM, 1982). A ideia vigente e validada é a de que um desequilíbrio
entre condutâncias excitatórias e inibitórias leva às convulsões em tecidos cerebrais
normais. Porém, o desafio a essa constatação é compreender o mecanismo da
epileptogênese, ou seja, o mecanismo que cria o aumento na probabilidade das
crises espontâneas acontecerem. (SCHARFMAN, 2007; STALEY, 2015).
Neurônios excitatórios e interneurônios inibitórios estão no centro da
discussão sobre epilepsia. Participando da neurotransmissão excitatória, o
glutamato é liberado e liga-se a receptores em outros neurônios promovendo o
disparo da crise convulsiva. Por outro lado, a inibição desta via ocorre através da
liberação do ácido γ-aminobutírico (GABA) por interneurônios inibitórios, o qual ligase a receptores presentes em neurônios, impedindo o disparo da crise. Estes
neurotransmissores atuam nos espaços entre os neurônios (sinapses), havendo,
porém, receptores para o GABA localizados em outras regiões neuronais, que não
as sinapses. Esta seria uma forma do organismo garantir a neurotransmissão
inibitória. (EISENSTEIN, 2014).
2.4.1 NEUROTRANSMISSÃO E EPILEPSIA
Na situação de repouso, os neurônios possuem carga interna negativa e
carga externa positiva, estando polarizados. A ativação da neutrotransmissão
glutamatérgica (figura 1) leva à abertura de canais iônicos na membrana do
neurônio, permitindo o influxo de íons cálcio e sódio. Este evento irá despolarizar a
célula, gerando o disparo neuronal. A neurotransmissão glicinérgica (figura 1)
também
ganha
destaque,
onde
o
aminoácido
glicina
atua
como
um
neurotransmissor inibitório na medula espinhal e tronco cerebral ligando-se ao
receptor de glicina com sítio sensível à estricnina. (ZHAO et al., 2015; TSAI et al.,
SALGADO, P.R.R.
34
2004; SIEGEL et al., 1989). O receptor de glicina (GlyR) é canal iônico pós-sináptico
para íons cloreto, onde, uma vez ativado permitirá o influxo destes íons carregados
negativamente, hiperpolarizando a célula e inibindo a ativação neuronal. (CURTIS;
HOSLI; JOHNSTON, 1967; WERMAN; DAVIDOFF; APRISON, 1967; CURTIS et al.,
1968; LYNCH, 2004). A ativação dos GlyR modulam funções motoras, sensoriais e
mutações nos genes que os codificam são responsáveis por uma grave doença
neurológica, a hiperecplexia ou síndrome do sobressalto. (DU et al., 2015; LYNCH,
2004; GALZI; EDELSTEIN; CHANGEUX, 1996; LEGENDRE, 2001; LYNCH, 2006;
BODE; LYNCH, 2014). Dessa forma, a via glicinérgica atua regulando a
excitabilidade dos neurônios e seus receptores podem também ser encontrados em
regiões superiores do cérebro, como hipocampo e neocórtex, onde atua como
modulador homeostático da função neuronal. (BETZ; LAUBE, 2006; ITO;
CHERUBINI, 1991; BECKER; BETZ; SCHRÖDER, 1993; CHATTIPAKORN;
MCMAHON, 2002; MORI; GAHWILER; GERBER, 2002).
A glicina atua como co-agonista de receptores NMDA (N‑metil-D‑aspartato),
melhorando a cognição, sem gerar riscos de surgimento de convulsões ou
neurotoxicidade;
mecanismos
pró-convulsivos
são
acionados
com
baixas
concentrações de glicina através da ativação de receptores pré-sinápticos de glicina,
enquanto a supressão da excitabilidade neural ocorre com altas concentrações
extracelulares
deste
aminoácido.
Logo,
diminuições
nas
concentrações
extracelulares de glicina favorecem o surgimento de convulsões e comprometem
funções cognitivas. (SHEN et al., 2015; LABRIE; RODER, 2010; BERGERON et al.,
1998; BLACK et al., 2009; MOHLER et al., 2008; YANG; SVENSSON, 2008; CHEN
et al., 2014; KUBOTA et al., 2010; WINKELMANN et al., 2014; EICHLER et al.,
2008; KIRCHNER et al., 2003). Mutações hereditárias que afetam a função destes
receptores podem levar a descargas epileptiformes (DIXON; ZHANG; LYNCH, 2015;
MACDONALD; KANG; GALLAGHER, 2010), bem como a inibição dos mesmos. Já
sua ativação promove um efeito anticonvulsivo em hipocampo de roedores. (CHEN,
2014; POLLEN; LUX, 1966; STRAUB; KÖHLING; SPECKMANN, 1997; PETERSON;
BOEHNKE, 1989; CHATTIPAKORN; MCMAHON, 2003; KIRCHNER et al. 2003).
Os níveis extracelulares do aminoácido glicina em sinapses excitatórias e
inibitórias são controlados por transportadores de glicina tipo 1 e tipo 2 (GlyT1 e
GlyT2, respectivamente) nos terminais nervosos e células da glia, realizando o co-
SALGADO, P.R.R.
35
transporte deste aminoácido juntamente com íons sódio para o interior da célula.
(HARVEY; YEE, 2013; EULENBURG et al., 2005; HARVEY et al., 2008;
SUPPLISSON; ROUX, 2002; AUBREY et al., 2007; LANE et al., 2006). Acerca do
tratamento da epilepsia, estudos demonstraram que inibidores do GlyT1 podem ser
usados como anticonvulsivantes em diferentes modelos (CROUCHER; BRADFORD,
1990, 1991; KALINICHEV et al., 2010; SOCALA et al., 2010).
Figura 1 - Neurotransmissão glutamatérgica e glicinérgica com participação dos
transportadores de glicina nas vias excitatória e inibitória.
Fonte: Adaptado de Harvey (2013).
Por outro lado, a sinalização GABAérgica (figura 2) perimite o influxo de íons
carregados negativamente, como o cloreto, hiperpolarizando a célula neuronal e
inibindo o disparo das crises. A depressão ou facilitação de sinapses GABAérgicas
ou glutamatérgicas podem ser pró-convulsivantes dependendo do tipo de neurônio
pós-sináptico envolvido. (BRACCI et al., 2001; LE DUIGOU; HOLDEN; KULLMANN,
2011; JANE; LODGE; COLLINGRIDGE, 2009; MÉNDEZ; BACCI, 2011). Devido a
isso, quando se refere a epilepsias de origem genética, as mutações geralmente
acomentem receptores do tipo canais iônicos, ainda que o nosso cérebro possua
muitas proteções contra estes defeitos. Os mecanismos compensatórios funcionam
SALGADO, P.R.R.
36
muito bem até que o organismo não consiga mais conter a situação, ocorrendo
então uma convulsão. (EISENSTEIN, 2014).
Figura 2 - Estrutura e localização dos receptores GABAA.
Fonte: Adaptado de Jacob (2008).
A fusão de vesículas contendo neurotransmissores com a membrana présináptica requer a participação de proteínas de ancoragem, onde mutações nestas
proteínas estão também associadas com a epilepsia. (RAJAKULENDRAN; KASKI;
HANNA, 2012; LAZAREVIC et al., 2013). Mecanismos como recaptação de
neurotransmissores, dessensibilização de receptores, movimento dos receptores
NMDA e GABAA dentro do neurônio e modificações pós-traducionais de
subunidades de receptores afetam a afinidade da transmissão e aumentam a
atividade da rede neuronal, relacionando-se com a epilepsia. (GOODKIN et al.,
2008; NAYLOR et al., 2013). Redes de sinalização intracelular envolvendo óxido
nítrico e outros mediadores também podem participar destas mudanças no balanço
entre excitação e inibição (KOVÁCS et al., 2009; CHANG; WALKER; WILLIAMS,
2014).
A neurotransmissão colinérgica (figura 3) também tem participação na
epilepsia, onde a acetilcolina (ACh) é o mediador químico excitatório envolvido. Sua
SALGADO, P.R.R.
estimulação
promove
uma
ativação
majoritária
de
receptores
37
colinérgicos
muscarínicos no sistema nervoso central, em detrimento de uma ativação minoritária
de receptores colinérgicos nicotínicos. (EGLEN, 2006; NATHANSON et al., 1999;
OLNEY et al., 1983, 1986; PEPEU, 1983). Experimentos em roedores para indução
de convulsões utilizam o agonista muscarínico pilocarpina, que ativa receptores
metabotrópicos muscarínicos do tipo M1, promovendo uma cascata de sinalização
intracelular excitatória com ativação da fosfolipase Cβ e consequentes lesões
cerebrais e mudanças de comportamento. (NATHANSON, 2000; ABDUL-RIDHA et
al., 2014; KRUSE et al., 2014; BRUNEAU; AKAABOUNE, 2006; TURSKI et al., 1989;
MARINHO et al., 1997). No cérebro, processos como aprendizagem, memória,
nocicepção e controle da temperatura são modulados por receptores muscarínicos,
e o subtipo M1, pela predominância que tem em regiões do cérebro como
hipocampo, córtex e estriado, estão intimamente envolvidos com a indução das
convulsões, uma vez ativados por agonistas muscarínicos. (EGLEN, 2006; BUBSER
et al., 2012; NEWMAN et al., 2012; OKI et al., 2005; HAMILTON et al., 1997).
Figura 3 - Neurotransmissão colinérgica com ativação de receptores M1 e cascata
de sinalização excitatória.
Fonte: Adaptado de Jones (2012).
SALGADO, P.R.R.
38
2.4.2 CITOCINAS INFLAMATÓRIAS E EPILEPSIA
Apesar da epilepsia ser uma doença neurológica, sabe-se que o sistema
imunológico possui estreita relação com a mesma. Estudos relatam alterações na
expressão de citocinas em pacientes epilépticos, sendo isso visto também em
modelos animais, bem como reações inflamatórias com papel na epileptogênese.
(PLATA-SALAMÁN et al., 2000; RAVIZZA; VEZZANI, 2006; LEHTIMÄKI et al., 2007;
VEZZANI et al., 2002; KALUEFF et al., 2004; BALOSSO et al., 2005). A influência
destes mediadores inflamatórios na doença foi constatada através de pacientes
resistentes às drogas anti-epilépticas convencionais, que tiveram o número de crises
reduzido após iniciar o tratamento com anti-inflamatórios. (RIIKONEN, 2004;
WIRRELL; FARRELL; WHITING, 2007). Os processos inflamatórios tem sido fortes
componentes de problemas neurodenegenerativos agudos e crônicos, como
acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer. (GRIFFIN, 2006; ALLAN;
TYRRELL; ROTHWELL, 2005).
Induções elétricas e químicas da convulsão tem promovido uma liberação
significativa de mediadores inflamatórios, os quais recrutam para o local da
epileptogênese células inflamatórias, como granulócitos. (VEZZANI et al., 2011;
FABENE et al., 2008; RAVIZZA et al, 2008). Um dos mecanismos pelos quais o
quadro inflamatório contribui para o desencadeamento das crises é através do
aumento da expressão de moléculas de adesão que possibilitam a migração de
leucócitos pela barreira hemato-encefálica e de proteínas como a albumina, pelos
mediadores inflamatórios. Estes componentes podem ativar a síntese de glutamato
em células da glia, proporcionando um aumento na excitabilidade neuronal,
necessário para o estabelecimento das crises (VEZZANI et al., 2011).
As citocinas pró-inflamatórias mais comumente relacionadas a quadros
epilépticos são a interleucina 1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose
tumoral-α (TNFα). A IL-1β faz parte de uma família de citocinas que se ligam ao
receptor de interleucina 1, onde ela é mais secretada entre todas, sendo o foco nos
estudos de epilepsia. (PLATA-SALAMÁN, 2000; LEHTIMÄKI, 2003; SAYYAH et al.,
2005; DUBÉ et al., 2005). Há relatos de aumento da expressão de RNAm da IL-1β
em quadros de convulsão, confirmando seu envolvimento na excitotoxicidade e
estresse oxidativo (VEZZANI, 2002; DE SIMONI et al., 2000; MOLDOFSKY et al.,
1986; VIVIANI et al., 2003), sendo esta citocina encontrada, após a realização de
SALGADO, P.R.R.
39
testes de indução de convulsão, em regiões do córtex cerebral, hipocampo e
hipotálamo. (PLATA-SALAMÁN, 2000; MINAMI et al., 1990; DHOTE et al., 2007). Os
mecanismos acerca do efeito pró-convulsivo desta citocina envolvem aumento da
formação de óxido nítrico, inibição direta de receptores GABA A, aumento da função
de receptores NMDA e inibição do efluxo de íons potássio, sendo todos estes
eventos excitatórios e geradores da crise convulsiva. (VIVIANI, 2003; MILLER et al.,
1991; WANG et al., 2000; MEINI et al., 2000; ZHU et al., 2006). A interação da IL-1β
com seu receptor leva à ativação de esfingomielinases e quinases no hipocampo,
ativando receptores NMDA e causando excitabilidade neuronal. (BALOSSO et al.,
2008). Além disso, a inibição da recaptação de glutamato por células gliais e
potencialização da sinalização glutamatérgica excitatória também é atribuída à IL-1β.
(LI et al., 2011).
A IL-6 é uma citocina multifuncional com receptor próprio, importante para o
desenvolvimento normal do SNC. (LI et al., 2011; KISHIMOTO et al., 1995). Após
crises convulsivas, sua expressão aumenta em áreas como hipocampo, córtex, giro
denteado, amigdala e meninges. Esta regulação positiva é vista também após a
execução de determinados modelos animais indutores de convulsão, como a
estimulação elétrica. (VEZZANI et al., 2002). Já os relatos sobre aumento de
expressão dos receptores de IL-6 estão restritos ao hipocampo. (LEHTIMÄKI et al.,
2003; ROSELL et al., 2003). A administração experimental de IL-6 comprova seus
efeitos pró-convulsivantes e neurotóxicos, havendo a potencialização das crises.
(KALUEFF et al., 2004; CAMPBELL et al.,1993; SAMLAND et al., 2003; JONAKAIT,
2007).
O TNFα corresponde a uma citocina presente em vias de sinalização
envolvendo a morte celular programada e o sistema NF-κB (fator nuclear kappa B),
através da ativação dos receptores p55 e p75, respectivamente. (LOETSCHER;
STEINMETZ; LESSLAUER, 1991; MUKAI et al., 2009; NATOLI et al., 1997;
ZHUANG et al., 1999; SHENG et al., 2005). Animais que passaram pelo teste do
kindling apresentaram altos níveis desta citocina no córtex piriforme, parietal, préfrontal, amigdala e hipocampo. (PLATA-SALAMÁN et al., 2000; GODLEVSKY et al.,
2002). Atividades pró e anticonvulsivantes são atribuidas ao TNFα, dependendo dos
receptores envolvidos, onde p55 parece estar relacionado à atividade próconvulsiva, enquanto p75 promove proteção. (BALOSSO et al., 2005). O que ainda
não se explica claramente é o por quê da via neurotóxica se sobressair em relação à
SALGADO, P.R.R.
40
anticonvulsivante. A via de sinalização dos receptores p55 com ativação de
mecanismos pró-apópticos pode explicar a morte neuronal em decorrência das
convulsões. (SHINODA et al., 2003).
2.4.3 HOMEOSTASE NEURONAL
Os neurônios tem a capacidade de regular sua excitabilidade, que fica
comprometida frente à perda neuronal por lesões cerebrais ou doenças
degenerativas. Este quadro também desencadeia a epilepsia. Sendo assim, em
situações de alta atividade neuronal, a condutância excitatória é diminuída, enquanto
a inibitória é aumentada. Ocorre o inverso frente a uma diminuição da excitação
neuronal. (O’LEARY; WYLLIE, 2011). Isto explica por que a maioria das pessoas
não desenvolve epilepsia após um dano cerebral grave: o organismo busca meios
homeostáticos endógenos para regular a excitabilidade neuronal. Da mesma forma,
uma falha nestes mecanismos regulatórios leva o paciente a apresentar as crises.
(FREY, 2003; VOLMAN; BAZHENOV; SEJNOWSKI, 2011; PRINCE; PARADA;
GRABER, 2012).
Estes mecanismos homeostáticos ainda não são bem compreendidos,
embora se saiba que os neurônios podem alterar seu conteúdo de proteínas de
membrana dependentes de voltagem para acionar ou inibir o disparo convulsivo.
Inclusive também não se sabe ainda de que forma as convulsões interferem na
homoestase neuronal. A dificuldade na obtenção destas respostas pode ser
amenizada através das epilepsias genéticas, uma vez que genes com mutações
relacionadas à epilepsia também estão presentes na sinalização intracelular,
podendo estar envolvidos neste circuito homeostático. (RAN et al., 2014).
2.4.4 DOENÇA MULTICAUSAL
Pesquisas sobre o mecanismo da epileptogênese do ano de 2006 reportam
cerca de 13 genes relacionados à epilepsia, onde todos codificavam canais iônicos.
Uma atualização desta informação relata a descoberta de mais de 400 genes
associados à doença. (MCNAMARA; HUANG; LEONARD, 2006; RAN et al., 2014).
O fato é que a ideia de que as mutações estão sempre associadas a genes que
SALGADO, P.R.R.
41
codificam canais iônicos não é verdadeira, uma vez que a maior parte delas não tem
relação com vias inibitórias e excitatórias, havendo a necessidade de mais estudos
sobre estas alterações genéticas relacionadas à epilepsia. Outros caminhos podem
ser percorridos, como o da sobrevivência dos neurônios, já que doenças
neurodegenerativas agravam o quadro epiléptico por instabilidade na rede neuronal.
(GIRARD et al., 2013; CHABROL; CAILLAUD; MINASSIAN, 2013).
Uma das possibilidades que explicam o surgimento das epilepsias está nos
raros altos níveis de atividade neuronal, formando um circuito desequilibrado. Isto
pode ocorrer, por exemplo, através de mutações em determinadas vias relacionadas
a malformações cerebrais, como PI3K (fosfatidilinositol-3-quinase), mTOR (proteína
alvo da rapamicina em mamíferos) e IGF (fator de crescimento semelhante à
insulina), displasias corticais focais, esclerose tuberosa e hemimegalencefalia,
resultando em um quadro epiléptico. (GUERRINI; DOBYNS, 2014; MIRZAA;
PODURI, 2014; BERDICHEVSKY et al., 2013; LASARGE; DANZER, 2014; WONG,
2013).
Outros
mecanismos
responsáveis
pela
excitação
neuronal
são
a
desregulação da concentração de determinados íons nos espaços intra e
extracelular, sendo os principais: potássio, cálcio, prótons e cloreto. (FISHER et al.,
1976;
STALEY;
SOLDO,
B.L.;
PROCTOR,
1995;
RANSOM;
RANSOM;
SONTHEIMER, 2000; RAIMONDO et al., 2013). Mutações nos genes que codificam
proteínas envolvidas na homeostase iônica, que estão amplamente distribuídas no
cérebro, podem estar associadas com a epilepsia. (VEERAMAH et al., 2013;
RAJAKULENDRAN; KASKI; HANNA, 2012; DENG; XIU; SONG, 2014). Assim,
percebe-se que diferentes vias podem levar ao desencadeamento desta patologia
excitatória de auto-reforço. (STALEY, 2015).
2.5 FARMACOTERAPIA ANTICONVULSIVANTE
O tratamento para os mais diversos tipos de convulsões tem ocorrido, nas
últimas três décadas, através da inserção de mais de 15 drogas anti-epilépticas de
terceira geração, porém, infelizmente, cerca de 20 a 30% dos pacientes epilépticos
não respondem adequadamente a estes medicamentos. (LÖSCHER; SCHMIDT,
2011; SILLANPÄÄ; SCHMIDT, 2006; BRODIE et al., 2012). Outra informação
relevante acerca da limitação da farmacoterapia vigente é a de que estas drogas
SALGADO, P.R.R.
42
parecem apenas suprimir sintomaticamente as convulsões depois que elas ocorrem,
não prevenindo o desenvolvimento da doença antes da primeira crise. (TEMKIN,
2009; SCHMIDT; SILLANPÄÄ, 2012).
Estes fármacos também apresentam potencialidade no tratamento condições
não-epilépticas, como enxaquecas, dor neuropática e transtorno bipolar. Tem
utilização contra tremores, distonia, esquizofrenia, sindrome das pernas inquietas,
dependência de álcool e estresse pós-traumático. (ROGAWSKI; LÖSCHER, 2004).
Para que uma droga configure-se como anti-epiléptica, a mesma deve atingir
um ou
mais alvos no
cérebro.
Alguns destes incluem,
canais iônicos,
transportadores de neurotransmissores e enzimas metabólicas neurotransmissoras,
os quais, devidamente estimulados, promovem uma diminuição da excitabilidade e
sincronismo neuronal, impedindo a propagação dos disparos para locais distantes e
o comportamento convulsivo. (ROGAWSKI; LÖSCHER, 2004). Essas abordagens
no tratamento da epilepsia consistem em encontrar as causas moleculares das
convulsões, direcionando as novas drogas nestes alvos.
Para tanto, a utilização
de testes não clínicos na descoberta destes fármacos tem se mostrado bemsucedida,
contribuindo
para
o
desenvolvimento
de
drogas
anti-epilépticas
clinicamente eficazes. (LÖSCHER; SCHMIDT, 2011; WHITE et al., 2006; BIALER;
WHITE, 2010).
As atuais drogas anti-epilépticas não são capazes de reverter a epilepsia
resistente a medicamentos, além do alarmante fato de que, cientificamente, não
foram feitos grandes avanços no controle das convulsões desde a introdução de
fármacos como valproato e carbamazepina no mercado, ao longo dos últimos 50
anos. (LÖSCHER; SCHMIDT, 2011; BEYENBURG; STAVEM; SCHMIDT, 2010). Isto
impacta negativamente na terapia da doença, uma vez que médicos e pacientes
ficam cada vez menos interessados em utilizar as novas e caras drogas
recentemente desenvolvidas.
No quadro 1 foram listadas as características de algumas drogas antiepilépticas presentes no mercado.
SALGADO, P.R.R.
43
Quadro 1 - Principais características de algumas drogas anti-epilépticas.
(continua)
Empresa/
Droga
Ano de
Mecanismo de ação
Indicações
Possivelmente,
Convulsões
potenciação
tônico-clônicas
GABAérgica
generalizadas
Limitações
aprovação
Primeira geração
Brometo de
potássio
Dow / 1857
Atualmente, utilizado
apenas como
adjuvante; promove
sedação
CCPG,
Fenobarbital
Bayer /
Potenciação
1912
GABAérgica
sedação,
Indutor enzimático;
desordens de
hipersensibilidade
ansiedade e
cutânea
do sono
hipersensibilidade
ParkeFenitoína
Davis/
Bloqueio dos canais
Pfizer /
de sódio
cutânea; não utilizada
CCPG
para crises de
ausência ou
1938
convulsões
mioclônicas
Sonolência; perda de
ParkeEtossuximida
Davis/
Bloqueio dos canais
Crises de
Pfizer /
de cálcio tipo T
ausência
1958
apetite; náusea;
vômito; episódios
psicóticos;
depressão; insônia
SALGADO, P.R.R.
44
(continuação)
Droga
Empresa/ Ano
Mecanismo de
de aprovação
ação
Indicações
Limitações
Segunda geração
Diazepam
Roche / 1963
Potenciação
GABAérgica
Disordens
Atualmente, utilizado
convulsivas,
apenas como
status
adjuvante e em
epilepticus,
casos de
ansiedade,
emergência;
abstinência de
promove sedação e
álcool
leva à tolerância
CCPG, dor
Carbamazepina
Novartis /
Bloqueio dos canais
trigeminal e
1964
de sódio
doença
bipolar
hipersensibilidade
cutânea; não
utilizada para crises
de ausência ou
convulsões
mioclônicas
Potenciação
Valproato
Sanofi/Abbott
/ 1967
GABAérgica,
CCPG, crises
inibição de
de ausência,
receptores NMDA,
enxaqueca,
bloqueio de canais
transtorno
de sódio e cálcio
bipolar
Inibidor enzimático;
potencial
teratogênico; ganho
de peso
tipo T
(continuação)
SALGADO, P.R.R.
Droga
Empresa/ Ano de
Mecanismo de
aprovação
ação
Indicações
45
Limitações
Terceira geração
Espasmos
Vigabatrina
Sanofi/Lundbeck/
Potenciação
infantis,
1989
GABAérgica
adjuvante
para CPC
Não é utilizada para
crises de ausência
ou mioclônicas;
perda de visão;
ganho de peso
CCPG,
síndrome de
Lamotrigina
GlaxoSmithKline/
Bloqueio dos
Lennox-
1990
canais de sódio
Gastaut,
transtorno
hipersensibilidade
cutânea
bipolar
hipersensibilidade
Oxicarbazepina
Novartis / 1990
Bloqueio dos
Convulsões
canais de sódio
parciais
cutânea; não
de ausência ou
convulsões
mioclônicas
Atualmente,
Gabapentina
Parke-Davis/
Pfizer / 1993
Bloqueio dos
canais de cálcio
(subunidade α2δ)
CCPG;
neuralgia
diabética e
pós-herpética
utilizado apenas
como adjuvante;
ganho de peso; não
de ausência e
mioclônicas
Potenciação
Topiramato
Janssen/Johnson
& Johnson / 1995
GABAérgica,
CCPG,
Sonolência;
inibição de
síndrome de
tonturas; pedras
receptores
Lennox-
nos rins; problemas
AMPA, bloqueio
Gastaut,
na fala; perda de
de canais de
enxaqueca
peso
sódio e cálcio
(conclusão)
SALGADO, P.R.R.
Droga
Empresa/ Ano de
Mecanismo de
aprovação
ação
Indicações
46
Limitações
Terceira geração
CCPG,
Levetiracetam
Modulação da
CTCG,
UCB Pharma /
glicoproteína de
EMJ,dor
2000
vesícula sináptica
trigeminal e
2ª
doença
Não utilizado para
crises mioclônicas
ou de ausência
bipolar
Atualmente,
Antagonista dos
Perampanel
Eisai / 2012
receptores AMPA
(glutamato)
utilizado apenas
Convulsões
como adjuvante;
parciais
não utilizado para
crises mioclônicas
ou de ausência
Fonte: Löscher (2013). CCPG, crises convulsivas parciais e generalizadas; CTCG, crises
tônico-clônicas generalizadas; EMJ, epilepsia mioclônica juvenil; CPC, crises parciais
complexas; NMDA, N‑metil-D‑aspartato; AMPA, ácido α‑amino‑3‑hidroxi-5‑metil-4‑
isoxazolepropionico.
Cada vez mais as novas abordagens anti-epilépticas buscam drogas que
atuem nas causas moleculares das convulsões. Como exemplo, tem-se a
pregabalina, com um importante papel no tratamento da epilepsia, pois age em um
componente dos canais de cálcio. Outro alvo explorado tem sido os receptores
AMPA para glutamato, que uma vez ativados promovem a excitabilidade neuronal e
disparo das convulsões, sendo o perampanel o fármaco responsável por inibir este
evento através desta via. (DAVIES et al., 2007; ROGAWSKI, 2011).
São muitos os desafios existentes no desenvolvimento de novas drogas
contra a epilepsia, entre eles: atravessar a barreira hemato-encefálica, ser uma
molécula oral ativa e interagir com o receptor alvo, além da demora na aprovação
destes produtos. O último fármaco aprovado foi o perampanel, adjuvante contra
crises parciais.
Outro promissor alvo é o sistema GABAérgico, cujo neurotransmissor GABA
tem a capacidade de inibir neurônios que tendem a ficar no estado excitado durante
uma crise epiléptica. Então, drogas que possam aumentar a disponibilidade deste
neurotransmissor inibitório, como o valproato faz ou ligar-se diretamente aos
SALGADO, P.R.R.
47
receptores GABAérgicos são consideradas potenciais anti-epilépticos. Pesquisas já
estão sendo realizadas com esteroides neuroativos que se ligam a receptores
GABAA, resultando na esperada inibição das convulsões. (CULLY, 2014;
ROGAWSKI, 2011). O bloqueio dos canais de sódio, feito por exemplo pela fenitoina
e carbamazepina, mostra-se eficaz contra convulsões tônico-clônicas por impedir a
propagação dos impulsos através dos neurônios. (BRODIE et al., 2011).
Os estudos também seguem na linha da descoberta dos mecanismos de ação
de medicamentos já presentes no mercado, como o levetiracetam, que se liga à
glicoproteína de vesícula sináptica 2A. Estas vesiculas possuem em seu interior
vários neutronsmissores e o levetiracetam parece inibir as vesículas que contem
neurotransmissores excitatórios, os quais contribuiriam para atividade descontrolada
dos neurônios na epilepsia. (LYNCH et al., 2004). Buscando driblar os efeitos
colaterais (tonturas e sonolência) destas substâncias, pesquisadores encontraram
um fármaco capaz de se ligar mais fortemente à glicoproteína de vesícula sináptica,
semelhante estruturalmente ao levetiracetam, chamado brivaracetam, que tem a
vantagem de ser mais eficaz com doses mais baixas, reduzindo os efeitos colaterais.
Atualmente esta droga está passando pelos testes clínicos de fase III. (MULA, 2014;
VAN PAESSCHEN et al., 2013).
Outras vias de extrema importância nesta área incluem:

Via
do
mTOR:
regula
o
crescimento,
diferenciação,
proliferação e
metabolismo celular no cérebro. Mutações de perda de função em genes
desta via estão associadas a problemas no desenvolvimento neuronal e em
formas de epilepsia adquirida, como epilepsia do lobo frontal. (INOKI;
CORRADETTI; GUAN, 2005; VEZZANI, 2012; RYTHER; WONG, 2012).

Vias inflamatórias: evidências mostram que mediadores inflamatórios
liberados por células do cérebro e do sistema imunológico tem relação com a
origem das convulsões individuais e do processo de epileptogênese.
(VEZZANI, 2008, 2011, 2013).

Co-transporte cátion/cloreto: a transmissão GABAérgica pode ser alterada de
inibitória para excitatória devido a mudanças na concentração intracelular de
cloreto. Isto ocorre por um aumento na expressão de co-transportadores
cátion/cloreto, tornando a via mediada por GABA excitatória, explicando o
surgimento das convulsões. (LÖSCHER et al., 2013; DZHALA et al., 2005).
SALGADO, P.R.R.

Ruptura
da
barreira
hematoencefálica
(BHE):
lesões
48
cerebrais
epileptogênicas tem relação com a disfunção da barreira hematoencefálica.
Danos nesta microvasculatura promovem extravasamento de proteina sérica
no córtex cerebral, o que ativa a cascata de sinalização do receptor do fator
de crescimento transformante β (TGFβR) em astrócitos, causando inflamação
local e aumento da excitabilidade neuronal. (FRIEDMAN; KAUFER;
HEINEMANN, 2009; SHLOSBERG et al., 2010; HEINEMANN; KAUFER;
FRIEDMAN,
2012;
FRIGERIO
et
al.,
2012;
VEZZANI;
FRIEDMAN;
DINGLEDINE, 2013).

Alvos genéticos e epigenéticos: a complexidade da epilepsia tem atraido as
atenções para estudos de regulação transcricional para tratamento da
doença, onde vias envolvendo fatores de transcrição e repressores
transcricionais mostram-se promissoras. (PITKÄNEN; LUKASIUK, 2011;
KOBOW et al., 2012; ROOPRA; DINGLEDINE; HSIEH, 2012; MCCLELLAND
et al., 2011; JIMENEZ-MATEOS et al., 2012).

Rede farmacológica: às vezes, atingir um único alvo não é suficiente para
frear a doença, uma vez que redes epilépticas no cérebro tornam-a complexa
e difícil de controlar. (BERTRAM et al., 1998; ENGEL et al., 2013). Logo,
tratamentos que envolvam múltiplas vias com combinação de drogas podem
ser mais efetivos do que focar em uma proteína alvo, por exemplo.
(HOPKINS, 2008; AINSWORTH, 2011).

Mecanismos de farmacoresistência: explicar as maneiras pelas quais ocorre a
resistências às drogas anti-epilépticas ainda é um dos maiores desafios a
serem elucidados, pois pouco se sabe acerca deste assunto. Uma das teorias
levantadas sugere a participação de transportadores de efluxo na barreira
hematoencefálica,
impedindo
a
entrada
dos
fármacos.
(LÖSCHER;
POTSCHKA, 2005; SCHMIDT; LÖSCHER, 2005; REMY; BECK, 2006;
SCHMIDT; LÖSCHER, 2009; POTSCHKA, 2012).
Atualmente, apenas 5 ensaios clínicos estão sendo realizados para testar
compostos anti-epilépticos inteiramente novos, sendo estes mostrados no quadro 2.
SALGADO, P.R.R.
49
Quadro 2 - Novos tratamentos em fase de liberação.
Droga
Tipo de epilepsia
Fase
Alvo
I / II
GABAA
Adultos com
SAGE-547
status epilepticus
super-refratário
Empresa
Sage
Therapeutics
US National
Epilepsia
PRX-00023
relacionada à
II
localização
Receptores de
serotonina
Institute of
Neurological
Disorders and
Stroke
YKP3089
Crises parciais
II
Desconhecido
Ganaxolone
Crises parciais
II
GABAA
III
GABAA
USL261
Aglomerados
convulsivos
SK Life Science
Marinus
Pharmaceuticals
Upsher-Smith
Laboratories
Fonte: Cully (2014).
Novas opções para o tratamento da epilepsia estão sendo estudadas com a
finalidade de sanar os problemas ainda existentes. Espera-se, então, que o
progresso na descoberta de novos alvos moleculares associado a um maior
entendimento da doença incentive ainda mais as pesquisas e o financiamento das
mesmas por parte das universidades e indústria farmacêutica. Dessa forma, os
esforços irão convergir no sentido de buscar a cura ou a melhor qualidade de vida
possível para o paciente epiléptico.
2.6 MONOTERPENOS E ATIVIDADE ANTICONVULSIVANTE
Durante muito tempo as plantas medicinais tem sido uma importante fonte de
substâncias com atividade farmacológica, testadas em ensaios clínicos ou com
potencial para participar destes testes, onde muitas delas fazem parte da
composição de medicamentos presentes no mercado. (ATANASOV et al., 2015;
KINGHORN et al., 2011; NEWMAN; CRAGG, 2012; HARVEY, 2008, 2015). Entre
1981 e 2010, cerca de 34% dos novos medicamentos aprovados pela FDA (Food
and Drug Administration) eram baseados em produtos naturais ou derivados deles,
destacando quão promissoras estas moléculas são. (MISHRA; TIWARI, 2011;
CARTER, 2011; CRAGG; NEWMAN, 2013). Raza e Chaudhary (2000) descreveram
SALGADO, P.R.R.
50
a utilização de extratos de plantas para o tratamento da epilepsia em vários modelos
animais. Estudo similar realizado por Ekstein e Schachter (2010), mostraram a
utilização de terapias alternativas e complementares, incluindo a utilização de
plantas medicinais, por pacientes epilépticos.
Dentro desse contexto, os óleos essenciais, definidos como sendo
metabólitos secundários odoríferos, complexos e obtidos a partir de matérias-primas
vegetais (ASBAHANI et al., 2015) demonstram possuir uma série de atividades
biológicas interessantes, tais como: antimicrobiana (PRAGADHEESH et al., 2013),
antitumoral (HAMID; AIYELAAGBE; USMAN, 2011), antioxidante (SANCHEZVIOQUE et al., 2013), antidiabética (MISRA; DEY, 2013) e anti-inflamatória.
(BARBIERI XAVIER et al., 2013). Além destas atividades, estudos realizados com
cerca de 30 espécies de plantas também indicam positivamente o uso desta classe
química como potenciais anticonvulsivantes com vantagens sobre a terapia antiepiléptica atual. (ALMEIDA, 2003, 2011).
Um dos principais constituintes dos óleos essenciais são os monoterpenos,
formados por duas unidades de isopreno, resultando em 10 átomos de carbono na
sua estrutura. Estas substâncias terpênicas são voláteis e bastante encontradas em
frutas cítricas, vegetais e especiarias, podendo assumir o formato cíclico ou linear.
Os monoterpenos naturais e seus derivados também tem atribuídos a eles uma série
de atividades farmacológicas, como antinociceptiva, antiarrítmica, antiespasmódica,
anti-inflamatória, anti-tumoral e antioxidante. (TAN et al., 2016; BAKKALI et al.,
2008; CHOI et al., 2000; KAMATOU et al., 2013; HEUBERGER et al., 2008;
LIBROWSKI, 2005). Na terapia anticonvulsivante, alguns monoterpenos (figura 4)
mostraram-se eficazes, como o timol (SANCHETI et al., 2014), carvona (DE SOUSA;
NÓBREGA; DE ALMEIDA, 2007b; COSTA et al., 2012; MARQUES et al., 2014),
timoquinona (HOSSEINZADEH & PARVARDEH, 2004), borneol (JIANG et al., 2015),
linalol (DE SOUSA et al., 2010) e citronelol (DE SOUSA et al., 2006a), sugerindo-se
inclusive a interação destas substâncias com canais de sódio dependentes de
voltagem, estruturas com papel fundamental na geração do potencial de ação em
neurônios e desenvolvimento da epilepsia. (OZ et al., 2015; SAVIO-GALIMBERTI;
GOLLOB; DARBAR, 2012; PETERS; RUBEN, 2014).
SALGADO, P.R.R.
51
Figura 4 - Monoterpenos com potencial anticonvulsivante.
Fonte: Elaborado pelo autor.
2.7 MONOTERPENO EPÓXI-CARVONA E ESTEREOISÔMEROS
O monoterpeno monocíclico epóxi-carvona (EC) é encontrado como
componente do óleo essencial de plantas como Carum carvi (IACOBELLIS et al.,
2005) e Kaempferia galanga (JIROVETZ et al., 2001), além de poder ser obtido por
síntese orgânica. (KLEIN; OHLOFF, 1963). Este monoterpeno já possui relatos de
atividade antimicrobiana, contra Staphylococcus aureus e Candida albicans
(ARRUDA et al., 2006) e ação sobre o SNC (DE SOUSA et al., 2007c), como
atividade antinociceptiva (ROCHA et al., 2013) e anticonvulsivante. (ALMEIDA et al.,
2008).
Diversas moléculas encontradas na natureza apresentam-se sob a forma de
compostos quirais. A quiralidade está relacionada à geometria de moléculas que
possuem orientação tridimensional bem definida, possuindo ao menos um átomo de
carbono, enxofre, nitrogênio, fósforo ou silício assimétrico (átomo ligado a quatro
ligantes diferentes), destacando-se entre elas os isômeros. (HOWLAND, 2009).
Isômeros são substâncias que apresentam a mesma fórmula molecular, mas
diferentes propriedades. Dentro da sua classificação tem-se os isômeros
SALGADO, P.R.R.
52
constitucionais, com mesma fórmula molecular, mas diferentes conectividades entre
os átomos (MCCONATHY; OWENS, 2003) e os estereoiômeros, com mesma
fórmula molecular, mesma conectividade entre os átomos, mas diferentes arranjos
tridimensionais.
(MCNAUGHT;
WILKINSON,
1997;
BRUICE,
2006).
Os
estereoisômeros ainda se subdividem em:

Isômeros geométricos cis-trans (figura 5): quando dois grupos iguais estão do
mesmo lado no plano espacial, tem-se a isomeria cis; quando estão em lados
opostos, isomeria trans (SHRIVER; ATKINS; LANGFORD, 1991).
Figura 5 - Exemplo de isomoria óptica cis-trans.
Fonte: Adaptado de chemistry.tutorvista.com.

Isômeros ópticos: moléculas capazes de girar o plano da luz polarizada.
Atualmente chamado enantiomerismo, por apresentar enantiômeros (figura
6), compostos que representam imagens especulares não sobreponíveis.
Enantiômeros puros são aqueles que apresentam apenas uma das formas
quirais.
(DERUITER,
2005;
DAVIES;
TENG,
2003;
MCNAUGHT;
WILKINSON, 1997). Dentro desta classificação também encontram-se os
diastereoisômeros, que não representam imagens especulares um do outro e
também não são sobreponíveis. (HUTT; O’GRADY, 1996).
SALGADO, P.R.R.
53
Figura 6 - Molécula enantiomérica.
Fonte: http://www.wikiwand.com/it/Enantiomero
Uma abordagem resumida desta classificação é esquematizada na figura 7.
Figura 7 - Classificação dos tipos de isômeros.
Fonte: Adaptado de Anslyn e Dougherty (2005).
Os enantiômeros possuem as mesmas propriedades físico-químicas (ponto
de fusão, solubilidade, pKa), mas cada molécula enantiomérica desvia o plano da luz
polarizada para direções opostas, sendo opticamente ativas. (MURRAY et al., 2012).
SALGADO, P.R.R.
54
Essa característica reflete que, apesar de possuírem a mesma fórmula molecular,
estas
substâncias
tem
diferentes
propriedades
farmacocinéticas
e
farmacodinâmicas. Alguns exemplos de alterações farmacocinéticas entre os
estereoisômeros são:

A absorção do metotrexato (antimetabólito) é melhor que a do D-metotrexato.

A biodisponibilidade do esomeprazol (indicado para o tratamento de doenças
ácido-pépticas) é maior do que a do omeprazol na forma racêmica.

O anticoagulante S-varfarina liga-se mais extensivamente às proteinas
plasmáticas do que a R-varfarina, afetando o volume de distribuição do
fármaco, ocorrendo o mesmo com o anti-histamínico levocetirizina em relação
ao seu dextroisômero.

O anti-hipertensivo D-propranolol liga-se mais extensivamente às proteínas
plasmáticas do que o L-propranolol. (KATZUNG; MASTERS; TREVER, 2009;
BRUNTON et al., 2011; BALTES et al., 2001).
Exemplos de mudanças na farmacodinâmica dos isômeros também podem
ser citados:

A forma D-propranolol é inativa, enquanto L-propranolol bloqueia receptores
beta-adrenérgicos na sua ação anti-hipertensiva.

Usado no tratamento da insuficiência cardíaca, os isômeros S(-) e R(+) tem a
mesma potência no bloqueio de receptores alfa adrenérgicos.

Apesar da potência farmacológica semelhante, S-timolol é um hipotensor
ocular um pouco mais potente do que o R-timolol.

O anti-hipertensivo labetalol é formulado como uma mistura racêmica de
quatro isômeros, onde as formas (S,S) e (R,S) são inativas, a forma (S,R) é
um potente bloqueador alfa-adrenérgico e a forma (R,R) é um potente
bloqueador beta-adrenérgico.

Atualmente, conhecendo-se as diferenças na potêcia farmacológica de
estereosiômeros, o anti-asmático salbutamol é disponibilizado apenas na
forma R-isomérica (levalbuterol).

O analgésico, anti-inflamatório e anti-térmico S-ibuprofeno é ativo, enquanto a
forma R-ibuprofeno é inativa.
SALGADO, P.R.R.

55
A influência da quiralidade também pode ser vista para ferormônios, onde um
enantiômero atrai os insetos enquanto o outro os repele.

Diferentes potências anestésicas são observadas para os fármacos quirais
halotano, enflurano e isoflurano. (KATZUNG; MASTERS; TREVER, 2009;
BRUNTON et al., 2011; COTRONEO; STAGNO D’ALCONTRES, 1992).
Além dessas características, mudanças na atividade farmacológica, inclusive
no sentido de ocasionar sérias reações adversas, podem ser constatadas entre
isômeros:

A quinina é um anti-malárico, enquanto quinidina é um anti-arrítmico.

Levometorfano é um potente analgésico opioide, enquanto dextrometorfano é
um supressor da tosse.

R-talidomida é um sedativo, já o isômero S-talidomida tem efeitos
teratogênicos bem conhecidos.

R-naproxeno tem utilização para artralgias, enquanto S-naproxeno é
teratogênico.

D-etambutol é um fármaco utilizado no tratamento da turbeculose. A forma Letambutol pode causar cegueira.

A forma (S)(+)-cetamina provoca menos reações psicóticas e agitação e
melhor analgesia e amnésia intraoperatória do que seu enantiômero.

L-dopa é utilizada no tratamento da Doença de Parkinson, já o isômero Ddopa não tem utilização, uma vez que torna o indivíduo suscetível a infecções
por causar deficiência de glóbulos brancos. (KATZUNG; MASTERS;
TREVER, 2009; BRUNTON et al., 2011; AGRANAT; CANER; CADWELL,
2002; LIM, 2006).
Estudos quimiosensoriais e bioquímicos já relataram o reconhecimento
dessas moléculas quirais por sistemas de receptores e enzimas (NÓBREGA;
SANTOS; DE ALMEIDA, 2010), comprovando assim as diferenças anteriormente
descritas.
Comparando-se com a mistura racêmica (mistura dos enantiômeros em igual
proporção), a síntese de enantiômeros puros mostra-se muito mais vantajosa, pois
estas substâncias são menos complexas e mais seletivas, diminuindo-se a
possibilidade do surgimento de reações adversas. Além disso, o indivíduo é exposto
SALGADO, P.R.R.
56
a uma menor quantidade da droga, o que é benéfico no sentido de afetar em menor
escala diversos órgãos e sistemas, associando-se a isto o fato de que é mais fácil
monitorar o perfil de fármacos enantiomericamente puros do que de misturas
racêmicas. A indústria farmacêutica, compreendendo estas vantagens, já lançou no
mercado uam série de fármacos na forma de enantiômeros puros, como o
levosalbutamol (anti-asmático), escitalopram (antidepressivo), naproxeno (antiinflamatório) e alguns antibióticos. (CHHABRA; ASERI; PADMANABHAN, 2013;
SLOVAKOVA; HUTT, 1999).
Facilmente são encontrados em plantas os monoterpenos enantioméricos,
com aplicações na indústria de cosméticos, alimentícia e farmacêutica. (GARCIA et
al., 2008; HEUBERGER et al., 2008; KAMATOU; VILJOEN, 2008; DUMAN et al.,
2010). O interesse no ramo da síntese de fármacos quirais a partir de plantas tem
ganhado destaque e tem sido um desafio, até porque ainda há um grande número
de compostos industriais que se dizem naturalmente idênticos, mas são racematos
ou estão opticamente impuros. (KOZIOŁ et al., 2014).
Diversos monoterpenos são opticamente ativos e a literatura relata o
isolamento de formas enantioméricas puras a partir de diferentes fontes, por
exemplo: (+)-carvona, no cominho (Carum carvi; Umbelliferae/Apiaceae); (-)carvona, na hortelã (M. spicata; Labiatae/Lamiaceae); (+)-limoneno e (-)-limoneno na
hortelã-pimenta (M. piperita; Labiatae/Lamiaceae); (+)-α-pineno e (-)-α-pineno
(KNOBLOCH et al., 1989) em pinho (espécies de Pinus; Pinaceae). As
particularidades inerentes a estes estereoisômeros são percebidas inclusive nos
receptores olfativos presentes no nariz. O odor característico de cominho deve-se à
(+)-carvona, enquanto a (-)-carvona proporciona odor de hortelã. A forma isomérica
(+)-limoneno apresenta odor de laranja e forma (-)-limoneno, odor de limão.
(KOZIOŁ et al., 2014).
Diferenças na atividades farmacológica também foram reportadas entre os
enantiômeros monoterpênicos, como os isômeros (+)-limoneno e (-)-limoneno. O
isômero (-)-α-pineno demonstrou ter um efeito antibacteriano melhor que a forma
(+)-α-pineno, apesar de também ter apresentado um forte efeito espasmódico.
(SULLIVAN, 1978; COTRONEO; STAGNO D’ALCONTRES, 1992; NÓBREGA;
SANTOS; DE ALMEIDA, 2010; DUGO; DUGO; COTRONEO, 1992; CASTEEL,
1992). De Sousa e colaboradores (2007b) constataram que a (+)-carvona foi ativa
em modelos animais de convulsão, enquanto a (-)-carvona foi inativa. Estes achados
SALGADO, P.R.R.
57
não surpreendem, uma vez que o próprio ambiente biológico é quiral,
proporcionando estas interações estereosseletivas. (GUARNACCIA;
BOTTA;
COSCIA, 1970). Diante disso, vê-se que estudos farmacológicos envolvendo
monoterpenos estereoisoméricos são cada vez mais necessários.
O monoterpeno EC, objeto de estudo deste trabalho, possui quatro isômeros
(figura 8) obtidos a partir de enantiômeros da carvona, e cuja estereosseletividade
psicofarmacológica permanece desconhecida. Logo, mostra-se pertinente uma
avaliação comparativa do potencial anticonvulsivante destes estereoisômeros,
possibilitando a observação do perfil farmacológico de cada um deles quanto às
semelhanças e diferenças, tornando-os possíveis agentes anti-epilépticos no futuro.
carvona.
Figura
8 - Relação estereoisomérica entre os pares da epóxi-carvona. 1: (+)-cis-epóxicarvona; 2: (-)-cis-epóxi-carvona; 3: (-)-trans-epóxi-carvona; 4: (+)-trans-epóxi-carvona.
O
O
O
O
Diastereoisômeros
Enantiômeros
3
Enantiômeros
1
Diastereoisômeros
O
O
O
O
Diastereoisômeros
2
Fonte: Adaptado de Salgado (2015).
4
Objetivos
SALGADO, P.R.R.
60
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar comparativamente o potencial anticonvulsivante dos estereoisômeros
da epóxi-carvona, através de metodologias específicas comportamentais e
moleculares em animais de laboratório.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Investigar,
comparativamente,
a
eficácia
anticonvulsivante
dos
estereisômeros da EC em modelos comportamentais agudos que envolvam
estímulo químico e elétrico, pela via intraperitoneal.

Avaliar as possíveis vias pelas quais ocorre esta atividade anticonvulsivante,
uma vez que os modelos animais utilizados envolvem a participação dos
sistemas GABAérgico, muscarínico, glicinérgico e canais iônicos de sódio.

Verificar o potencial anti-epileptogênico das substâncias em estudo utilizandose o modelo animal comportamental do kindling ou abrasamento, através de
administrações subconvulsivas de pentilenotetrazol durante 15 dias, em dias
alternados.

Quantificar os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNFα
presentes no hipocampo de camundongos tratados com os estereoisômeros
da EC e submetidos ao teste do kindling.

Realizar análise histopatológica do hipocampo de animais tratados com os
estereoisômeros da EC e submetidos ao teste do kindling.
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
62
4 MATERIAL
4.1 Substâncias-teste (estereoisômeros da epóxi-carvona)
Os estereoisômeros (+)-cis-EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC foram
sintetizados de acordo com o descrito na literatura (KLEIN; OHLOFF, 1963;
VALEEV; VOSTRIKOV; MIFTAKHOV, 2009; LINDQUIST et al., 1985; SZAKONYI,
2008, 2011) e fornecidos pela equipe do prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa, da
Universidade Federal da Paraíba.
4.2 Animais
Para a realização dos experimentos foram utilizados camundongos (Mus
musculus) Swiss (figura 9), machos, com três meses de idade, pesando entre 25-35
g, provenientes do Biotério Prof. Dr. Thomas George da Universidade Federal da
Paraíba.
Os animais foram mantidos no biotério, em gaiolas de polietileno, contendo,
no máximo, 20 camundongos por caixa, os quais permaneceram sob condições
controladas de temperatura (21 ± 1 °C), com livre acesso a uma dieta de ração tipo
pellets (Purina®) e água disponível em garrafas de polietileno. Os animais foram
mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, sendo a fase clara de 6:00 às 18:00
horas.
Figura 9 - Camundongo (Mus musculus) Swiss.
Fonte: http://www.unifenas.br/pesquisa/bioterio/animais.asp
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
63
4.3 Condições experimentais
No dia do experimento, as gaiolas de polietileno, contendo quatro animais em
cada, foram levadas à sala de experimentação, a fim de proporcionar uma
adaptação ao novo ambiente, para minimizar possíveis alterações comportamentais.
Os camundongos foram privados de ração 4 horas antes do experimento.
As bancadas metálicas e os aparelhos utilizados foram higienizados com
álcool 70%, entretanto, durante os testes, foi utilizado etanol com baixa graduação
(10%), na tentativa de diminuir possíveis odores que possam interferir no
comportamento dos animais.
Todos os procedimentos experimentais aconteceram no período entre 12:00 e
17:00 horas, sendo previamente aprovados pelo CEUA - Comissão de Ética no Uso
de Animais da UFPB, sob a certidão de nº 0109/2011.
4.4 Substâncias utilizadas

Cloreto de sódio (Merck – E. U. A.);

Cloridrato de pilocarpina (Sigma – E.U.A);

Diazepam (Sigma – E.U.A);

Etanol (IPeFarM / UFPB – Brasil);

Estereoisômeros da epóxi-carvona (IPeFarM / UFPB – Brasil);

Estricnina (Sigma – E.U.A);

Formalina tamponada (IPeFarM / UFPB – Brasil);

Hematoxilina-eosina (Sigma – E.U.A);

Kit para dosagem de IL-1β, IL-6 e TNF-α (eBioscience – E.U.A);

Pentilenotetrazol (Sigma – E.U.A);

Solução tampão fosfato (Sigma – E.U.A);

Tween 80 (Vetec – Brasil);

Xilol (Sigma – E.U.A).
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
64
4.4 Preparação dos estereoisômeros da EC e demais substâncias
As substâncias utilizadas foram preparadas minutos antes do início do teste,
sendo dissolvidas em solução de cloreto de sódio 0,9%, e, quando necessário,
adicionou-se Tween 80 (Polissorbato 80) com o objetvo de facilitar a solubilização.
Os estereoisômeros da EC foram especificamente emulsionados com o auxílio de
Tween 80 à 5% em solução de cloreto de sódio 0,9%.
A escolha da dose dos estereoisômeros da EC utilizada nos experimentos
(300 mg/kg) baseou-se em estudos prévios onde a mesma apresentou o melhor
efeito farmacológico entre as demais doses testadas. Além disso, a DL 50 (dose letal
que mata 50% dos animais) determinada foi de 923 mg/kg (ALMEIDA et al., 2008;
DE SOUSA et al., 2007c; ROCHA et al., 2013), tornando a dose escolhida
relativamente segura para a realização dos testes.
As doses foram calculadas de forma a possibilitar a administração via
intraperitoneal de 0,1 mL/10 g de peso do camundongo.
4.5 Aparelhagem

Aparelho de eletrochoque auricular (ECT UNIT 7801-Ugo Basile), na figura 10;

Citocentrífuga (Bio Research – E.U.A);

Micrômetro digital (Great – Brasil);

Microscópio óptico (Olympus – Japão);

Leitor de microplaca ELISA (Titertek Multiskan Reader – E.U.A).
Figura 10 - Aparelho de eletrochoque auricular máximo.
Fonte: Santos (2008).
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
65
5 MÉTODOS
O delineamento metodológico do estudo da atividade anticonvulsivante dos
estereoisômeros da EC em camundongos está esquematizado na figura 11.
Figura 11 - Resumo esquemático das metodologias anticonvulsivantes utilizadas no
estudo comparativo envolvendo os estereoisômeros da EC.
Fonte: Elaborado pelo autor.
Material e Métodos
SALGADO, P.R.R.
66
5.1 Avaliação da atividade anticonvulsivante dos estereoisômeros da EC
5.1.1 Teste das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ)
Considerada uma das metodologias laboratoriais clássicas para triagem de
novas
drogas
anticonvulsivantes,
o
teste
das
convulsões induzidas
pelo
pentilenotetrazol utiliza este agente químico como um indutor de convulsão e
epileptogênese. (LÖSCHER; SCHMIDT, 1988; PEDERSEN et al., 2009; SAYYAH;
NADJAFNIA; KAMALINEJAD, 2004). Este teste pode ser empregado para vários
tipos de crises, desde as que envolvem crises generalizadas de ausência e crises
mioclônicas até crises tônico-clônicas. (LÖSCHER, 2002a).
Como resultado da administração do PTZ, há uma mioclonia súbita e
involuntária (contração da cabeça e músculos faciais) seguida de convulsões tônicoclônicas generalizadas e mantidas. (HUOT; RADOUCO-THOMAS, 1973; RHODES;
FRYE, 2004).
O mecanismo pelo qual o PTZ atua envolve a inibição de canais iônicos
GABAA para íons cloreto, promovendo um quadro excitatório. Além disso, registros
eletrofisiológicos relacionam esta substância com canais iônicos de sódio e cálcio,
aumentando as correntes de membrana e consequentemente a excitabilidade
neuronal. (LÖSCHER, 1998; FAINGOLD, 1987).
Para a realização deste experimento, seis grupos de oito camundongos
receberam pela via intraperitoneal (i.p.) os seguintes tratamentos: solução tween 80
a 5% (veículo), (+)-cis EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC (todos na dose de
300 mg/kg) e diazepam (DZP) na dose de 4 mg/kg, droga padrão.
Transcorridos 30 minutos dos pré-tratamentos, administrou-se em todos os
animais o PTZ na dose de 75 mg/kg, i.p. Imediatamente após, os animais foram
observados por um periodo de 15 minutos no tocante aos seguintes parâmetros:
latência para a primeira convulsão e porcentagem de mortalidade. (ALMEIDA, 2006).
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
67
5.1.2 Teste das convulsões induzidas pela pilocarpina
Por reproduzir bem os eventos da epilepsia do lobo temporal em humanos,
este modelo animal é extensivamente utilizado, ajudando na compreensão dos
mecanismos do processo convulsivo. A administração local ou sistêmica dessa
substância em altas doses gera o chamado status epilepticus ou estado de mal
epiléptico (EMP), uma crise duradoura que causa lesão cerebral similar a um quadro
epileptogênico em humanos. (TURSKI et al, 1983; MATHERN et al., 1996). Esta
lesão decorrente da injeção de pilocarpina ocasiona nos animais tratados um quadro
de perda neuronal, gliose e degeneração vacuolar no hipocampo. (SANTOS et al.,
2008; 2010). Alterações nos parâmetros neuroquímicos e histopatológicos
associados à epilepsia também podem ser vistos através desta metodologia
(FREITAS; DEJIANG; JORDAN, 2011).
Apesar de ainda não se saber muito a respeito, o possível mecanismo
desencadeador das crises convulsivas seria através da ativação de receptores
muscarínicos, acionando uma cascata de sinalização intracelular que envolve
fosfoinositídios, levando às alterações de comportamento (MARINHO et al., 1997;
1998). A pilocarpina atua também na região do hipocampo de roedores em enzimas
como colina acetiltransferase (ChAT) e acetilcolinesterase (AChE). (FREITAS,
2010).
Os animais foram então separados em seis grupos de oito camundongos, que
receberam pela via intraperitoneal (i.p.) os seguintes tratamentos: solução tween 80
a 5% (veículo), (+)-cis-EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC (todos na dose de
300 mg/kg) e diazepam (DZP) na dose de 4 mg/kg, considerado como droga padrão
de ação antiepiléptica.
animais a pilocarpina na dose de 400 mg/kg, i.p. Para comparar a severidade das
convulsões entre os grupos, após a administração desse agente químico, procedeuse à observação dos seguintes parâmetros: surgimento de sinais colinérgicos
periféricos (miose, diarreia, micção excessiva), movimentos estereotipados (lamber e
cheirar a pata), tremores, convulsões, latência para o aparecimento das convulsões,
latência de morte, status epilepticos e mortalidade. Cada animal foi observado
Material e Métodos
SALGADO, P.R.R.
68
durante um período de 1 hora. (ZHOU et al., 2008; SHIN et al., 2011; MORENO et
al., 2015; CAVALHEIRO, 1996).
5.1.3 Teste das convulsões induzidas pela estricnina
A estricnina possui ação convulsivante por atuar como antagonista seletivo
competitivo dos receptores inibitórios de glicina pós-sinápticos localizados na
medula espinhal, promovendo aumento da excitabilidade neuronal, causando as
convulsões. (APRISON; LIPPKWITZ; SIMON, 1987; VOGEL, 2008). Observa-se
apenas o desenvolvimento de crises tônicas nos animais tratados com estricnina.
Os animais foram divididos em grupos de seis (n=8), recebendo os
respectivos tratamentos pela via intraperitoneal: solução tween 80 a 5% (veículo),
(+)-cis EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC (todos na dose de 300 mg/kg) e
DZP na dose de 4 mg/kg, droga padrão de ação antiepiléptica.
animais uma solução de estricnina na dose de 20 mg/kg, i.p. Comparou-se o perfil
dos estereoisômeros nesta metodologia através da observação dos seguintes
parâmetros: latência para surgimento da primeira convulsão, latência para morte,
porcentagem de animais que exibiram convulsão e porcentagem de mortalidade.
(IDRIS; SULE; SALLAU, 2010; WIELAND et al., 1995).
5.1.4 Teste das convulsões induzidas pelo eletrochoque auricular máximo (EAM)
Inicialmente descrito por Putnam e Merritt (1937), esta metodologia, assim
como
as
anteriormente
descritas,
avalia
potenciais
drogas
com
ação
anticonvulsivante. Essa metodologia tem ampla utilização a drogas que atuam em
canais de sódio, como carbamazepina e fenitoina. (MELDRUM, 1996; 2002). Baseiase na aplicação de pulsos elétricos repetitivos, o que induz e mimetiza em diferentes
estruturais neuronais crises generalizadas do tipo tônico-clônicas. (LÖSCHER;
FASSBENDER; NOLTING, 1991; LUSZCZKI et al., 2010).
Nesse experimento foram utilizados seis grupos (n=8) que receberam pela via
intraperitoneal: solução tween 80 a 5% (veículo), (+)-cis EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
69
e (-)-trans-EC (todos na dose de 300 mg/kg) e fenitoina na dose de 25 mg/kg (droga
padrão).
Transcorridos 30 minutos dos pré-tratamentos, aplicou-se um estímulo
elétrico (0,5 mA, 150 pulsos/segundo, duração de 0,5 segundo) através dos
eletrodos com clipes auriculares nos camundongos. Os parâmetros avaliados foram:
o número de animais que apresentaram convulsões tônicas (extensões completas
dos membros posteriores), duração das convulsões e porcentagem de mortalidade
(PRAVEEN et al., 2013; TORTORIELLO; ORTEGA, 1993).
5.1.5 Modelo de epilepsia do abrasamento (“kindling”)
O “kindling” ou abrasamento consiste em um modelo crônico de epilepsia
onde um estímulo químico subconvulsivante é administrado de forma repetitiva,
podendo levar a uma amplificação progressiva das convulsões e consequente
atividade convulsiva generalizada. (MCNAMARA, 1984). Segundo Goddard (1969),
aplicações de estímulos elétricos subconvulsivos em ratos causava convulsões
crescentes, assim como visto para alguns tipos de epilepsia. Isso ocorre devido a
mudanças duradouras no cérebro proporcionadas por esse teste.
Este quadro também foi observado com a administração de doses
subconvulsivantes (20-40 mg/kg; i.p.) intermitentes de PTZ, resultando no
desenvolvimento de convulsões generalizadas em roedores. (IZQUIERDO et al.,
1975; BECKER et al., 1992). Esses estímulos repetitivos, tanto de origem química
quanto elétrica, são chamados de abrasamento, uma vez que através deles tem-se
o desenvolvimento de crises espontâneas que podem ocorrer mesmo após dias ou
meses da estimulação inicial. (KARLER et al., 1989; LÖSCHER, 2002b). Essas
convulsões podem acompanhar o animal por toda a vida, fazendo com que esse
teste avalie a epilepsia e epileptogênese. (MELDRUM & ROGAWSKI, 2007).
O abrasamento químico é mais fácil de ser realizado do que o elétrico, já que
não emprega implantação de eletrodos ou cirurgia, tornando-o um método escolhido
com maior frequencia. As substâncias que podem ser utilizadas nesse experimento
são antagonistas GABAérgicos (PTZ, bicuculina, picrotoxina), N-metil-D-aspartato e
cocaína. Por ser um modelo clássico de bloqueio de uma via inibitória gerando
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
70
convulsões severas, o abrasamento através do PTZ é a metodologia mais utilizada
entre as existentes. (ORLOFF; WILLIAMS; PFEIFFER, 1949; DHIR, 2012).
Para a realização desse experimento, os animais foram divididos em 5 grupos
(n=10), recebendo pela via i.p.: solução tween 80 a 5% (veículo), (+)-cis-EC, (-)-cisEC (ambos na dose de 30 mg/kg) e DZP na dose de 4 mg/kg (droga padrão). Trinta
minutos após os respectivos tratamentos, administrou-se nos animais uma dose
subconvulsiva de PTZ (35 mg/kg). Após cada injeção de PTZ, os animais foram
observados durante 30 minutos, sendo o comportamento enquadrado em uma
escala de acordo com os seguintes critérios: nível 0 (nenhuma resposta); nível 1
(movimento involuntário das orelhas e mandíbulas); nível 2 (1 a 10 espasmos
mioclônicos); nível 3 (acima de 10 espasmos mioclônicos); nível 4 (convulsão clônica
generalizada); nível 5 (convulsão tônico-clônica generalizada e status epilepticus) e
nível 6 (convulsão seguida de morte do animal). Foram feitos 7 tratamentos
subconvulsivos, em dias alternados, onde a cada tratamento os referidos parâmetros
eram registrados. No oitavo tratamento, os animais receberam a maior dose de PTZ
(75 mg/kg) e foram avaliados em relação aos mesmos parâmetros citados
anteriormente. (DHIR, 2012). A figura 12 esquematiza o cronograma de tratamentos.
Figura 12 - Cronograma de administração do PTZ no teste do “kindling” ou
abrasamento. Os tratamentos são realizados em dias alternados, sendo este um
modelo epileptogênico.
Fonte: Adaptado de Dhir (2012).
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
71
hipocampo a partir do teste do “kindling”
No último dia do teste do “kindling”, após os devidos tratamentos e
observações, todos os animais foram sacrificados utilizando-se uma gilhotina, os
encéfalos foram retirados e colocados sobre uma superfície com gelo. Com o auxílio
de uma pinça de microdissecação, a camada cortical foi aberta para os lados,
expondo a região do hipocampo, que foi retirada. Finalizando-se a etapa de
dissecação, o hipocampo retirado foi colocado em papel alúmino devidamente
identificado e pesado, sendo imediatamente acondicionado em freezer a -80ºC para
posterior utilização. (PAXINOS; WATSON, 1998).
Para realizar o ensaio de ELISA, onde serão quantificadas as citocinas próinflamatórias objeto deste estudo, o tecido cerebral (hipocampo) foi homogeneizado
em tampão fosfato de sódio (pH 7,4; 0,05M). Os homogenatos foram centrifugados a
18.200g por 30 minutos a 4ºC, e, logo em seguida, o sobrenadante foi coletado e
estocado a -80ºC para posterior análise. (OBUCHOWICZETAL et al., 2006).
A determinação dos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α
foi realizada a partir do sobrenadante do homogenato dos hipocampos dos animais,
utilizando-se kit de ELISA de acordo com o protocolo especificado pelo fabricante
(BIOSCIENCE, Inc. Science Center Drive, San Diego, CA-USA).
De forma suscinta, placas de ELISA de 96 poços (NUNC-Immuno™) foram
sensibilizadas com o anticorpo de captura, anti-IL-1β, anti-IL-6 e anti-TNF-α e
incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, utilizou-se a solução de bloqueio
(PBS contendo 10% de SFB) nos sítios inespecíficos por uma hora. Novamente, as
placas foram lavadas em PBST e adicionou-se 50 μL das amostras e diferentes
concentrações das citocinas recombinantes. As placas foram novamente incubadas
por uma noite a 4°C. Em sequência, os poços foram lavados e uma mistura de
anticorpos biotinilados secundários foi adicionada. Após a incubação por 1 hora,
estreptavidina conjugada com a proteína fluorescente, R-ficoeritrina (estreptavidinaRPE) foi adicionada aos poços da placa e então incubada por 30 minutos.
Após a lavagem para remoção dos reagentes não aderidos, adicionou-se a
placa uma solução tampão sheath fluid (Luminex®, MiraiBio, Alameda, CA). Em
sequência, realizou-se a leitura em leitor de microplaca (MICROPLATE READER
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
72
versa Max, tunable, BN 2529 Molecular Devices) a 450 nm. As quantidades de
citocinas foram calculadas a partir das curvas-padrão e expressos como quantidade
total por mililitro (pg/mL).
5.1.5b Análise histopatológica de hipocampo a partir do teste do “kindling”
Ao término do teste do “kindling”, nem todos os hipocampos dos animais
sacrificados foram utilizados para quantificação de citocinas pró-inflamatórias.
Alguns (n=3/grupo) permaneceram intactos, sendo fixados em formalina 10% e
estocados para posterior análise histopatológica utilizando o corante hematoxilinaeosina (HE). A descrição das etapas subsequentes correspondente ao preparo do
material histológico dá-se da seguinte forma (ROSS; PAWLINA, 2012; JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2008):

Desidratação: inicialmente, o tecido passou pelo processo de desidratação
para evitar a retração do tecido e consequentemente lesões estruturais
irreversíveis. Este processo consiste em imergir os cassetes contendo os
órgãos em uma concentração crescente de álcool etílico.

Diafanização ou clarificação: o material foi então imerso duas vezes no xilol
com duração de 1 h cada imersão. O xilol, por suas propriedades químicas
lipofílicas, funciona como solvente da parafina e ao mesmo tempo como
desalcolizante.

Impregnação: o material histológico foi banhado duas vezes em parafina, préaquecida no dispensador, cada banho com duração de 1 hora. Devido ao
calor, o xilol evapora e os espaços anteriormente ocupados ficam livres.

Emblocagem: após a impregnação, o material histológico foi colocado em
formas com parafina oriunda do seu dispensador. Após a imersão do material
em parafina, cada fôrma foi deixada ao ar livre para solidificação da parafina e
a obtenção dos blocos.

Microtomia: as amostras nos blocos foram retiradas das formas, e foram
realizados os cortes histológicos no micrótomo. Os blocos de parafina
contendo as amostras foram seccionados pela navalha do micrótomo em
cortes de aproximadamente 5µm de espessura. Os cortes foram levados ao
banho maria a uma temperatura em torno de (39 – 40ºC).
SALGADO, P.R.R.

Material e Métodos
73
Pescaria: Com auxílio de uma lâmina, foi pescado o corte na fita de parafina
no banho-maria. A fim de facilitar a aderência à lâmina, adiciona-se ao banho
albumina ou gelatina. Em seguida, as lâminas foram colocadas na estufa (60
ºC) por 10 minutos para secagem.

Coloração e montagem da lâmina: com os cortes aderidos às lâminas, o
processo de coloração foi realizado com o corante hematoxilina-eosina (HE)
para análise da estrutura tecidual (presença ou ausência de morte celular)
como também os corpúsculos característicos do modelo da doença utilizado.
Em seguida, foi realizada a montagem das lâminas com colocação de
lamínulas. Como meio de montagem foi utilizado o bálsamo do canadá.

Captura das imagens: As fotografias digitais foram capturadas pela câmera
Moticam 5.0 MP acoplada ao microscópio óptico. A análise histológica foi
realizada com o software ImageJ (Fiji version 1.46r, de domínio público, o
programa de processamento de imagens baseado em Java desenvolvido no
Instituto Nacional de Saúde para o Macintosh).
Para quantificação da lesão neuronal vista a partir da análise histolopatológica
do hipocampo, criou-se um escore neuronal, o qual consiste em pontuações que
variam de 0 a 4 pontos. Os parâmetros avaliados a partir dos quais foram gerados
os escores, foram: neurônios de aparência normal, ou seja, que possuem contornos
nucleares presentes com nucléolos claros; morte celular, sendo esta por necrose ou
apoptose; presença de processo inflamatório, sendo neste quesito avaliado a
presença de células inflamatórias e por fim, edema.
Quando presente uma dessas características, soma-se 1 ao escore do
animal, totalizando 4, caso estejam presentes todas as lesões. (FANG; LEI; 2010).
5.2 Análise estatística
Os resultados foram analisados utilizando o método de Análise de Variância
(ANOVA) “one-way” seguido do teste de Tukey ou Newman-Keuls para comparação
entre as médias. Fischer foi utilizado para realização de análises de contingência
2x2. Os dados foram analizados utilizado-se o programa Graph Pad Prism, versão
5.0 (GraphPad Sotware Incorporated, San Diego, CA, USA) e foram expressos como
SALGADO, P.R.R.
Material e Métodos
74
média ± e.p.m (erro padrão da média), sendo os valores considerados significativos,
quando apresentassem um nível de significância (p) menor que 0,05.
Resultados
SALGADO, P.R.R.
76
6 RESULTADOS
6.1 Avaliação da atividade anticonvulsivante dos estereoisômeros da EC
6.1.1 Teste das convulsões induzidas pelo PTZ
No teste agudo das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol, os 4
isômeros da epóxi-carvona testados, na dose de 300 mg/kg, aumentaram
significativamente a latência para surgimento da primeira convulsão (gráfico 1). Os
dados são os seguintes: (+)-cis-EC (900,0 ± 0,0s); (-)-cis-EC (763,3 ± 69,2s); (+)trans-EC (791,1 ± 108,9s) e (-)-trans EC (743,0 ± 83,7s), comparados com o grupo
controle que recebeu o veículo (59,0 ± 3,5s). Resposta similar aos grupos tratados
com os isômeros foi vista nos animais que receberam a substância padrão
diazepam, na dose de 4 mg/kg (900,0 ± 0,0s).
induzidas pelo pentilenotetrazol em camundongos (n=8/grupo).
1000
***
L a t ê n c ia ( s )
800
***
***
***
***
C o n tro le
( + ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
( - ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
600
( + ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
( - ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
400
D ia z e p a m ( 4 m g /k g )
200
0
T r a t a m e n t o s ( m g /k g ; i.p .)
Fonte: Elaborado pelo autor. Os valores representam a média ± erro padrão da média.
ANOVA one way seguido do teste de Tukey. ***p<0,001, comparado com o grupo controle
(veículo).
Na tabela 5 tem-se os dados relacionados às mortes dos animais, após os
tratamentos. Não foram registradas mortes nos grupos tratados com os
SALGADO, P.R.R.
Resultados
77
estereoisômeros da EC (300 mg/kg) e com a droga antiepiléptica padrão, diazepam
(4 mg/kg), ao contrário do que se observou no grupo tratado com o veículo.
Tabela 5 - Efeito dos estereoisômeros da EC e do diazepam sobre a porcentagem
de mortalidade após o teste das convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol em
camundongos (n=8/grupo).
Grupos
Dose mg/kg
Mortalidade (%)
Controle (Tween 5%)
50
Diazepam (padrão)
4 (i.p.)
0***
(+)-cis-EC
300 (i.p.)
0***
(-)-cis-EC
300 (i.p.)
0***
(+)-trans-EC
300 (i.p.)
0***
(-)-trans-EC
300 (i.p.)
0***
Fonte: Elaborado pelo autor. Teste exato de Fisher, ***p<0,001, comparado com o grupo
controle (veículo).
6.1.2 Teste das convulsões induzidas pela pilocarpina
Os resultados das alterações comportamentais induzidas pela administração
de pilocarpina (400 mg/kg) nos animais tratados com os estereoisômeros (300
mg/kg), veículo e diazepam (4 mg/kg) estão agrupados na tabela 6. Todos os
animais apresentaram sinais colinérgicos periféricos, com destaque para os grupos
tratados com (+)-trans-EC (50%) e (-)-trans-EC (50%), ambos na dose de 300
mg/kg, que apresentaram uma redução na porcentagem dos animais que exibiram
estes sinais. O grupo controle e o grupo tratado com os estereoisômeros na dose de
300 mg/kg tiveram convulsões (100%), enquanto o grupo tratado com diazepam (4
mg/kg) apresentou uma porcentagem menor neste parâmetro (12,5%). A
porcentagem de morte foi alta nos animais que receberam veículo (100%) e (-)-cisEC (100%). Já os animais que receberam diazepam (4 mg/kg), não morreram
durante o experimento. Todos os animais exibiram tremores, sendo essa
porcentagem menor nos grupos (+)-trans-EC e (-)-trans-EC (50%). Em relação ao
surgimento do status epilepticus, o grupo tratado com (+)-cis-EC (0%) não
apresentou este parâmetro, já o grupo controle que recebeu veículo teve 100% de
exibição desse princípio. Todos os grupos apresentaram movimentos estereotipados
decorrentes da adiministração de pilocarpina (400 mg/kg), com exceção do grupo
padrão, que recebeu diazepam na dose de 4 mg/kg (0%).
Resultados
SALGADO, P.R.R.
78
Tabela 6 - Efeito dos estereoisômeros da EC no teste das convulsões induzidas pela
pilocarpina em camundongos (n=8/grupo).
Grupos
SCP (%)
ME (%)
Tremores
(%)
Convulsões
(%)
SE (%)
Mortalidade
(%)
Controle
100
100
100
100
100
100
(Tween 5%)
Diazepam (4
100
0
50***
12,5***
0***
0***
mg/kg)
(+)-cis-EC
100
50***
100
100
0***
75***
(300 mg/kg)
(-)-cis-EC
100
100
100
100
50***
100
(300 mg/kg)
(+)-trans-EC
50***
100
50***
100
50***
50***
(300 mg/kg)
(-)-trans-EC
50***
100
50***
100
50***
50***
(300 mg/kg)
Fonte: Elaborado pelo autor. SCP: Sinais Colinérgicos Periféricos; ME: Movimentos
Estereotipados; SE: Status epilepticus. Teste exato de Fisher, ***p<0,001, comparado com o
grupo controle (veículo).
A latência para a primeira convulsão (gráfico 2) aumentou significativamente
nos 4 estereoisômeros da EC (300 mg/kg): (+)-cis-EC (846,6 ± 35,5s); (-)-cis-EC
(890,8 ± 76,2s); (+)-trans-EC (1044 ±49,1s); (-)-trans-EC (888,4 ± 78,3s) em relação
ao grupo controle (429,3 ± 25,4s). Resultado similar foi observado na latência de
morte dos animais (gráfico 3), onde os tratados com (+)-trans-EC (2896 ± 343,3s) e
(-)-trans-EC (2345 ± 478,0s), ambos na dose de 300 mg/kg, tiveram esse parâmetro
aumentado em comparação com o grupo controle (817.6 ± 22,3s). Os
estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC (300 mg/kg) não levaram ao aumento
significativo deste parâmetro. Outro dado interessante é que, para este parâmetro,
(+)-trans-EC (2896 ± 343,3s) aumentou significativamente a latência de morte dos
animais em relação à substância (-)-cis-EC (1136 ± 68,1s).
Resultados
SALGADO, P.R.R.
79
induzidas pela pilocarpina em camundongos (n=8/grupo).
4000
***
C o n tro le
( + ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
3000
( - ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
( + ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
2000
1000
( - ) - tr a n s - E C
***
***
***
( 3 0 0 m g /k g )
***
0
(veículo).
teste das convulsões induzidas pela pilocarpina em camundongos (n=8/grupo).
4000
##
***
3000
***
C o n tro le
( + ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
*
( - ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
( + ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
2000
( - ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
1000
0
ANOVA one way seguido do teste de Tukey. *p<0,05, ***p<0,001, comparado com o grupo
controle (veículo); ##p<0,01, comparado com o grupo (-)-cis-EC.
Resultados
SALGADO, P.R.R.
80
6.1.3 Teste das convulsões induzidas pela estricnina
Não foram observadas diferenças significativas na latência para a primeira
convulsão entre os animais tratados com os estereoisômeros da EC (300 mg/kg) e o
grupo controle tratado com o veículo (gráfico 4), no modelo de indução das
convulsões pelo agente químico estricnina. Entretanto, constatou-se um aumento
significativo na latência para morte (gráfico 5) dos animais que receberam (+)-cis-EC
(306,5 ± 55,3s) e (+)-trans-EC (396,5 ± 61,5s), ambos na dose de 300 mg/kg,
comparando-se com o grupo controle (53,0 ± 0,6s).
induzidas pela estricnina em camundongos (n=8/grupo).
200
*
C o n tro le
( + ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
150
( - ) - c is - E C
( 3 0 0 m g /k g )
( + ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
100
( - ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
50
0
ANOVA one way seguido do teste de Tukey. *p<0,05, comparado com o grupo controle
(veículo).
Resultados
SALGADO, P.R.R.
81
teste das convulsões induzidas pela estricnina em camundongos (n=8/grupo).
600
***
**
400
C o n tro le
( + ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
( - ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
*
( + ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
( - ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
200
0
ANOVA one way seguido do teste de Tukey. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, comparado com
o grupo controle (veículo).
Como pode ser visto na tabela 7, todos os animais exibiram convulsões após
a administração de estricnina e não houve sobreviventes, com exceção do grupo
tratado com diazepam (4 mg/kg; i.p.).
Tabela 7 - Efeito dos isômeros da EC no teste das convulsões induzidas pela
estricnina.
Presença de
Grupos
Dose mg/kg
Mortalidade (%)
convulsões (%)
Controle (Tween 5%)
100
100
Diazepam (padrão)
4 (i.p.)
100
0***
(+)-cis-EC
300 (i.p.)
100
100
(-)-cis-EC
300 (i.p.)
100
100
(+)-trans-EC
300 (i.p.)
100
100
(-)-trans-EC
300 (i.p.)
100
100
Resultados
SALGADO, P.R.R.
82
6.1.4 Teste das convulsões induzidas pelo eletrochoque auricular máximo
Verificou-se uma diminuição da duração das convulsões induzidas pelo
eletrochoque auricular máximo (gráfico 6) nos grupos tratados com (+)-cis-EC (9,8 ±
0,5s); (-)-cis-EC (8,3 ± 1,4s); (+)-trans-EC (0,7 ± 0,7s) e (-)-trans-EC (0,0 ± 0,0s),
todos na dose de 300 mg/kg, quando comparados ao grupo controle (16,3 ± 0,9s).
Conforme esperado, os animais que receberam a droga padrão fenitoína (25 mg/kg;
i.p.) também apresentaram inibição das convulsões (0,0 ± 0,0s). Na tabela 8, o
percentual de convulsões tônicas foi expressivo nos grupos tratados com (+)-cis-EC
(100%) e (-)-cis-EC (87.5%). Já os grupos que receberam (+)-trans-EC (25%) e (-)trans-EC (12.5%) apresentaram menos convulsões do tipo tônicas. O grupo controle
tratado com o veículo (100%) e padrão (0%) exibiram respostas esperadas. Nenhum
grupo tratado com os isômeros ou com a fenitoína apresentou mortalidade, em
detrimento ao grupo controle (37.5%).
D u r a ç ã o d a s c o n v u ls õ e s ( s )
Gráfico 6 - Efeito dos estereoisômeros da EC na duração das convulsões no teste
do eletrochoque auricular máximo em camundongos (n=8/grupo).
20
C o n tro le
( + ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
15
10
( - ) - c is - E C ( 3 0 0 m g /k g )
***
( + ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
***
( - ) - tr a n s - E C ( 3 0 0 m g /k g )
F e n ito in a ( 2 5 m g /k g )
5
***
0
***
***
(veículo).
SALGADO, P.R.R.
Resultados
83
Tabela 8 - Efeito dos isômeros da EC no teste das convulsões induzidas pelo
eletrochoque auricular máximo.
Presença de
Grupos
Dose mg/kg convulsões tônicas
Mortalidade (%)
(%)
Controle (Tween 5%)
100
37.5
Fenitoína (padrão)
25 (i.p.)
0***
0***
(+)-cis-EC
300 (i.p.)
100
0***
(-)-cis-EC
300 (i.p.)
87.5***
0***
(+)-trans-EC
300 (i.p.)
25***
0***
(-)-trans-EC
300 (i.p.)
12.5***
0***
controle.
6.1.5 Modelo de epilepsia do abrasamento (“kindling”)
Neste modelo de epileptogênese, o tratamento subconvulsivo com PTZ (35
mg/kg; i.p.), em dias alternados, durante 15 dias, promoveu um progressivo e
significativo aumento do escore no grupo tratado com veículo + PTZ (3,2 ± 0,3),
comparando-se com o grupo tratado com o veículo + salina (0,0 ± 0,0),
apresentando um escore máximo no último dia de tratamento, com a dose
convulsiva (75 mg/kg; i.p.) do PTZ. Os animais que receberam (+)-cis-EC e (-)-cisEC (ambos na dose de 30 mg/kg; i.p.) antes do tratamento com PTZ (35 ou 75
mg/kg; i.p.), ao longo dos 15 dias de experimento, tiveram suas médias de escore
diminuídas significativamente (1,2 ± 0.2; 1,7 ± 0,2, respectivamente), com média de
escores maior no dia 11 de tratamento, quando comparados com a média do grupo
tratado com veículo + PTZ (3,2 ± 0,3).
Não foram constatadas diferenças significativas no tocante à média dos
escores entre os grupos tratados com os estereoisômeros. Assim como visto com os
estereoisômeros, o grupo tratado previamente com diazepam (droga padrão; 4
mg/kg) e em seguida com PTZ demonstrou diminuição significativa dos escores (1,2
± 0,2) em comparação com os animais tratados com veículo + PTZ (3,2 ± 0,3),
inclusive no último dia de administração ao receber a dose convulsiva do PTZ (75
mg/kg; i.p.). Estes dados estão expressos no gráfico 7.
Resultados
SALGADO, P.R.R.
84
Gráfico 7 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC na média de escores
apresentados durante o teste do “kindling” induzido pelo PTZ em camundongos
(n=10/grupo).
6
M é d ia d o s e s c o r e s
***
***
4
***
***
D ia z e p a m + P T Z
( + ) - c is - E C + P T Z
***
***
***
***
###
###
###
###
###
2
( - ) - c is - E C + P T Z
###
###
V e íc u lo + P T Z
V e ic u lo + s a lin a
###
5
1
3
1
1
1
9
7
5
3
1
0
D ia s d e t r a t a m e n t o ( m g /k g ; i.p .)
ANOVA one way seguido do teste de Tukey. ***p<0,001, comparado com o grupo veículo +
salina; ###p<0,001, comparado com o grupo veículo + PTZ.
Apenas o grupo tratado com veículo + PTZ apresentou mortalidade. Já os
demais grupos não exibiram esse escore máximo (tabela 9).
Tabela 9 - Efeito dos isômeros da EC no teste do “kindling” induzido pelo PTZ em
camundongos (n=10/grupo).
Grupos
Dose mg/kg
Mortalidade (%)
Veículo + salina
0
Veículo + PTZ
35 e 75 mg/kg
40
Diazepam (padrão)
4 (i.p.)
0***
(+)-cis-EC
30 (i.p.)
0***
(-)-cis-EC
30 (i.p.)
0***
Resultados
SALGADO, P.R.R.
85
hipocampo a partir do teste do “kindling”
Conforme visto no gráfico 8, o estereoisômero (+)-cis-EC (30 mg/kg) foi capaz
de diminuir significativamente (27,5 ± 2,2) os níveis de IL-1β no hipocampo dos
animais submetidos ao abrasamento (teste do “kindling”) em comparação com o
grupo que recebeu veículo + PTZ (38,4 ± 0,6), que apresentou o aumento esperado
dessa citocina pró-inflamatória. O mesmo não foi visto para (-)-cis-EC (30 mg/kg),
que não conseguiu reduzir significativamente os níveis de IL-1β. Os animais tratados
com diazepam (4 mg/kg) seguido do PTZ, ao longo dos 15 dias de experimento,
reduziu (19,6 ± 0,9) os níveis de IL-1β em relação ao grupo tratado com veículo +
PTZ (38,4 ± 0,6).
Gráfico 8 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre os níveis de IL1β, no teste do “kindling” induzido pelo PTZ, em camundongos (n=7/grupo).
50
IL -1  ( p g /m L )
40
( + ) - c is - E C + P T Z
30
**
( - ) - c is - E C + P T Z
***
20
10
0
T r a ta m e n to s
ANOVA one way seguido do teste de Newman-Keuls. ***p<0,001, **p<0,01, comparado com
o grupo veículo + PTZ.
Em relação ao níveis da citocina IL-6 (gráfico 9), ambos estereoisômeros (+)cis-EC e (-)-cis-EC (30 mg/kg) diminuiram significativamente (23,7 ± 2,3; 20,0 ± 1,3,
respectivamente) a quantidade da mesma no hipocampo dos animais submetidos
ao abrasamento (teste do “kindling”) em comparação com o grupo que recebeu
veículo + PTZ (29,6 ± 1,3). Diferentemente do que ocorreu na quantificação de IL-1β,
para IL-6 os dois estereoisômeros foram efetivos. O diazepam também reduziu
Resultados
SALGADO, P.R.R.
86
significativamente (16,5 ± 2,0) os níveis de IL-6, nesta metodologia, comparando-se
com o grupo que recebeu veículo + PTZ (29,6 ± 1,3).
Gráfico 9 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre os níveis de IL6, no teste do “kindling” induzido pelo PTZ, em camundongos (n=7/grupo).
40
IL - 6 p g /m L
30
( + ) - c is - E C + P T Z
*
**
20
( - ) - c is - E C + P T Z
***
10
0
T r a ta m e n to s
ANOVA one way seguido do teste de Newman-Keuls. ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05,
comparado com o grupo veículo + PTZ.
Os estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC também promoveram redução
significativa (24,4 ± 0,9; 26,0 ± 1,3, respectivamente) dos níveis de TNFα, assim
como para IL-6, no hipocampo dos animais submetidos ao abrasamento (teste do
“kindling”) em comparação com o grupo que recebeu veículo + PTZ (31,6 ± 1,3). O
mesmo perfil foi constatado para o grupo tratado com diazepam (4 mg/kg), onde
houve uma diminuição significativa (24,4 ± 1,7) desta citocina em comparação com
os animais tratados com veículo + PTZ (31,6 ± 1,3). Estes achados podem ser
visualizados no gráfico 10.
Resultados
SALGADO, P.R.R.
87
Gráfico 10 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre os níveis de
TNFα, no teste do “kindling” induzido pelo PTZ, em camundongos (n=7/grupo).
40
T N F -  p g /m L
30
**
**
**
( + ) - c is - E C + P T Z
( - ) - c is - E C + P T Z
20
10
0
T r a ta m e n to s
ANOVA one way seguido do teste de Newman-Keuls. **p<0,01, comparado com o grupo
veículo + PTZ.
6.1.5b Análise histopatológica de hipocampo a partir do teste do “kindling”
A figura 13 mostra as alterações morfológicas encontradas no hipocampo dos
animais submetidos ao teste do “kindling” ou abrasamento durante um período de 15
dias. Conforme esperado, o hipocampo representativo dos animais que receberam
veículo + salina apresenta-se livre de processo inflamatório, bem como exibe
corpúsculos íntegros, preservados e sobrevivência neuronal (figura 13A). Já nos
grupos que receberam um posterior tratamento com PTZ, dentro de um periodo de
15 dias, diferentes graus de alteração foram observados. Células com ausência de
núcleo, instalação de processo inflamatório, aumento do número de corpúsculos e
possibilidade de apoptose na região do córtex, além de inchaço celular em CA3
correspondem à descrição do grupo tratado com veículo + PTZ (figura 13B),
caracterizando os efeitos histopatológicos induzidos por esse agente químico.
O grupo pré-tratado com o estereoisômero (+)-cis-EC (figura 13D) que
recebeu posteriormente as administrações subconvulsivas (dias 1, 3, 5, 7, 9, 11 e
13) e convulsiva (dia 15) do PTZ apresentou menores alterações morfológicas no
hipocampo, com células preservadas e ausência de processos inflamatórios, em
relação ao grupo tratado com veículo + PTZ. A descrição referente ao outro
SALGADO, P.R.R.
Resultados
88
estereoisômero (-)-cis-EC (Figura 13E), ao contrário do que foi relatado para (+)-cisEC, apresenta leve edema e leve apoptose centro-medular, apesar de também exibir
ausência de processo inflamatório e preservação neuronal. Percebe-se, então,
discretas, mas importantes diferenças entre estas substâncias teste sobre a
influência no tecido cerebral intimamente relacionado à epilepsia.
O tratamento prévio com a droga padrão (diazepam, 4 mg/kg) e posterior
administração de PTZ mostrou preservação neuronal, ausência de processo
inflamatório agudo e presença abundante de corspúsculos, como pode ser
observado na figura 13C.
Figura 13 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre as alterações
morfológicas no hipocampo (40x) dos animais submetidos ao teste do “kindling”
induzido pelo PTZ (n=3/grupo).
Fonte: Elaborado pelo autor. A: grupo veículo + salina; B: grupo veículo + PTZ; C: grupo
diazepam + PTZ; D: grupo (+)-cis-EC + PTZ; E: grupo (-)-cis-EC + PTZ.
Em relação aos escores que mensuravam o dano neuronal causado na região
do hipocampo dos animais tratados, o gráfico 11 expressa as respectivas médias
obtidas, onde os grupos que receberam (+)-cis-EC e (-)-cis-EC tiveram as médias
dos escores significativamente diminuídas (0,1 ± 0,0; 0,4 ± 0,0, respectivamente) em
relação ao grupo tratado com veículo + PTZ (0,9 ± 0,0). Os animais tratados com
Resultados
SALGADO, P.R.R.
89
diazepam, conforme esperado, também apresentaram escores reduzidos (0,1 ± 0,0).
O grupo que recebeu a administração do veículo + salina, por não receber o agente
convulsivo, teve a média dos escores igual a zero (0,0 ± 0,0), sendo esse valor
significativo em relação ao grupo tratado com veículo + PTZ.
Gráfico 11 - Efeito dos estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC sobre a média dos
escores observados no hipocampo dos animais submetidos ao teste do “kindling”
induzido pelo PTZ (n=3/grupo).
M é d ia d o s e s c o r e s
1 .5
1 .0
( + ) - c is - E C + P T Z
_ _ _ _ _ _***
________
( - ) - c is - E C + P T Z
0 .5
0 .0
***
T r a ta m e n to s
ANOVA one way seguido do teste de Tukey. ***p<0,001, comparado com o grupo veículo +
PTZ.
Discussão
SALGADO, P.R.R.
91
7 DISCUSSÃO
Dentro dos produtos naturais, os óleos essenciais constituem uma classe
química de interessantes propriedades físico-químicas, não agredindo o meio
ambiente
e
com
uma
série
de
atividades
biológicas
relevantes,
como
gastroprotetora, anti-inflamatória, antibacteriana e no tratamento do câncer.
Provavelmente, as mais diversas estruturas químicas atribuidas aos constituintes de
óleos essenciais são responsáveis pela gama de efeitos verificados. (ASBAHANI et
al., 2015; ALMEIDA et al., 2011).
Uma variedade de compostos naturais oriundos de plantas aromáticas
possuem comprovadas ações anticonvulsivantes em modelos animais de convulsão,
como o terpinen-4-ol (ATANASOVA-SHOPOVA; RUSINOV; BOICHEVA, 1973; DE
SOUSA et al., 2009), citral, β-mirceno, limoneno (ARORA; SHARMA; KAPILA, 1958;
QUINTANS-JUNIOR, 2010), safranal (HOSSEINZADEH; TALEBZADEH, 2005;
PATHAN et al., 2009), linalool (NWAIWU; AKAH, 1986; DE SOUSA et al., 2010), γdecanolactona (ELISABETSKY et al., 1995; OLIVEIRA et al., 2008), α-terpineol (DE
SOUSA; QUINTANS; DE ALMEIDA, 2007d), (-)-isopulegol (SILVA et al., 2009),
citronelol (DE SOUSA et al., 2006a), timoquinona (HOSSEINZADEH; PARVARDEH,
2004), eugenol, metileugenol, isoeugenol, estragol, safrol (DALLMEIER; CARLINI,
1981), trans-anetol (BOISSIER; SIMON; LE BOURHIS, 1967), (-)-borneol e
carvacrol. (QUINTANS-JUNIOR et al., 2010).
Também há estudos de atividade anticonvulsivante com o monoterpeno α,βepoxi-carvona (DE ALMEIDA et al., 2008) e (S)-(+)-carvona (DE SOUSA;
NÓBREGA; DE ALMEIDA, 2007b), onde a forma isomérica (R)-(-)-carvona não
apresentou o mesmo perfil farmacológico. A importância desta informação reside no
fato de moléculas quirais podem apresentar diferentes interações com o receptor
farmacológico, o que resulta em efeitos diversos ou até mesmo na ausência deles.
Tendo em vista quão promissoras são as abordagens envolvendo substâncias
quirais naturais, este estudo buscou realizar uma investigação anticonvulsivante
comparativa entre 4 estereoisômeros do monoterpeno epóxi-carvona, sendo eles:
(+)-cis-EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC, (-)-trans-EC, com fins de esclarecer o perfil
farmacológico dos mesmos, buscando semelhanças e diferenças de ação entre si.
SALGADO, P.R.R.
Discussão
92
Inicialmente fez-se o teste das convulsões induzidas pelo PTZ, metodologia
validada e extensivamente utilizada na triagem de novas drogas anticonvulsivantes
(ROGAWSKI, 2006; MEHLA et al., 2010; NOZADZE et al., 2011) que mimetiza no
animal crises convulsivas generalizadas de ausência e mioclônicas. (WADA, 1977;
LÖSCHER; SCHMIDT, 1988; LÖSCHER, 2002a; LÖSCHER; SCHMIDT, 2006).
O mecanismo que explica a potente ação convulsivante do PTZ dá-se pela
inibição de receptores ionotrópicos inibitórios GABA A para cloreto (Cl-), cujo
neurotransmissor inibitório desta via é o GABA. Outra forma de promover excitação
neuronal descrita para o PTZ é atuando diretamente sobre a membrana do neurônio,
através da ativação de canais de sódio. (WHITE; SMITH; WILCOX, 2007;
LÖSCHER; SCHMIDT, 1988; FAINGOLD, 1987). Por outro lado, substâncias da
classe dos benzodiazepínicos e barbitúricos são capazes de potencializar a
transmissão GABAérgica, inibindo o neurônio e aumentando o limiar para
desencadeamento das convulsões. (GOODMAN; GILMAN, 2012).
Neste experimento, todos os isômeros testados, (+)-cis-EC, (-)-cis-EC, (+)trans EC e (-)-trans EC (300 mg/kg) aumentaram a latência para surgimento das
convulsões de forma similar (gráfico 1). Esse dado ressalta o potencial
anticonvulsivante atribuído aos 4 isômeros, e não necessariamente em apenas um
ou alguns deles, nessa metodologia. A proteção estendeu-se também ao parâmetro
de mortalidade dos animais, tendo em vista que não houve mortes nos grupos
tratados com as substâncias teste (tabela 5).
Agentes anticonvulsivantes como diazepam e fenobarbital têm a capacidade
de facilitar a abertura dos canais para cloreto GABA A, inibindo as convulsões
induzidas pelo PTZ (PRAVEEN et al., 2013), substância que impede a atividade do
ácido gama-aminobutírico. (ROCHA, 2008). A ativação da neurotransmissão
GABAérgica inibe ou atenua as convulsões, enquanto a inibição dessa
neurotransmissão promove a facilitação das crises. (SHIN et al., 2011).
Idris e colaboradores (2010) analisaram o perfil anticonvulsivante de 3
isômeros da substância N-benzil-3-[(metilfenil) amino] propanamida, onde todos
demostraram excelentes propriedades anticonvulsivantes no teste das convulsões
induzidas pelo pentilenotetrazol, na dose de 30 mg/kg. Outro estudo conduzido por
Wieland (1995) também observou, comparativamente, o efeito de dois isômeros
esteroides endógenos neuroativos, 3α-hidroxi-5α-pregnan-20-ona e 3α-hidroxi-5βpregnan-20-ona, quanto às possíveis diferenças comportamentais no teste das
Discussão
SALGADO, P.R.R.
93
convulsões induzidas pelo pentilenotetrazol. O resultado mostrou atividade
anticonvulsivante similar entre estes isômeros, o que reforça os achados da
presente pesquisa. A inibição das convulsões no teste do PTZ pelos 4 isômeros
sugere que, possivelmente, há uma interferência na neurotransmissão GABAérgica.
A fisiopatologia da epilepsia tem sido compreendida graças a modelos
animais
que
induzem convulsões.
Um
desses
modelos que
reproduzem
componentes de epilepsias humanas é o teste das convulsões induzidas pela
pilocarpina. (ZGRAJKA et al., 2010). A pilocarpina é um agonista não seletivo dos
receptores muscarínicos de acetilcolina, e estruturas cerebrais com alta densidade
de receptores muscarínicos são também os principais locais de origem das
convulsões induzidas por esse agente químico. (CLIFFORD et al., 1987).
A atividade convulsiva é decorrente da administração de uma alta dose de
pilocarpina, onde após a crise tem-se um período de latência que precede crises
focais espontâneas e recorrentes. Mudanças neuropatológicas, como esclerose
hipocampal, ocorrem com a indução do status epilepticus gerado pela pilocarpina,
de forma semelhante à epilepsia do lobo temporal em humanos. (SCHAUWECKER,
2012). Os animais tratados com os estereoisômeros da EC na dose de 300 mg/kg
apresentaram sinais colinérgicos periféricos, porém, observou-se uma proteção
maior nos animais tratados com (+)-trans-EC e (-)-trans-EC, que tiveram a
porcentagem desse dado reduzida. Já no tocante ao surgimento do status
epilepticus, a substância (+)-cis-EC mostrou-se mais protetora (tabela 6).
A diminuição da ocorrência de tremores, como visto com os isômeros (+)trans-EC e (-)-trans-EC, aumento no tempo para início das convulsões, visto em
todos, e proteção contra a morte dos animais, observada nos grupos tratados com
(+)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC, constitui-se de grande interesse no
desenvolvimento de novas drogas anti-epilépticas. Pela primeira vez, diferenças
significativas entre os estereoisômeros foi constatada, onde no parâmetro latência
para morte dos animais, (+)-trans-EC foi mais protetora do que (-)-cis-EC. Este
resultado sugere que, nesta metodologia, o estereoisômero (+)-trans-EC foi o mais
promissor realizando-se uma avaliação comparativa entre as demais substâncias,
uma vez que demonstrou eficácia significativa no aumento da latência para início
das convulsões e aumento da latência para morte dos animais, além de se destacar
em outros parâmetros já citados anteriormente (tabela 6; gráficos 2 e 3).
SALGADO, P.R.R.
Discussão
94
As substâncias (+)-cis-EC e (-)-cis-EC foram efetivas apenas no aumento da
latência para início das convulsões, não sendo protetoras significativamente no
parâmetro latência para morte dos animais (gráficos 2 e 3). Estas descobertas
iniciais nesse experimento não são suficientes para sugerir a via muscarínica de
ação anticonvulsivante dos estereoisômeros, mas reforçam o potencial das
substâncias (+)-cis-EC, e especialmente (+)-trans-EC e (-)-trans-EC, como futuros
candidatos ao tratamento da epilepsia.
Vê-se nos experimentos já citados, incluindo este, que, no geral, todos os
isômeros são eficazes em relação à atividade anticonvulsivante, exibindo apenas
discretas diferenças entre eles em alguns parâmetros mencionados. Isso mostra que
as diferenças estereoquímicas presentes muito pouco afetam a farmacodinâmica
destes isômeros, ao menos nas metodologias testadas. Um isômero constitucional
da valprimida mostrou eficácia no teste das convulsões induzidas pela pilocarpina.
(WHITE et al., 2012). Um outro estudo destacou um derivado como mais ativo de
uma série de derivados quirais do pyrrolo[1,2-a]pyrazine, através da prevenção do
status epilepticus no teste das convulsões induzidas pela pilocarpina (DAWIDOWSKI
et al., 2013), diferindo dos achados anteriores onde todas as substâncias testadas
que apresentam similaridade estrutural também tinham efeitos farmacológicos
parecidos. Este tipo de estudo é importante no sentido de fornecer informações
acerca de moléculas isoméricas e elencar, se possível, a que se mostrar mais
promissora para abordagens posteriores.
No teste das convulsões induzidas pela estricnina, há um antagonismo direto
dos receptores de glicina sensíveis à estricnina em regiões superiores do cérebro,
medula espinhal e tronco cerebral. Esse antagonismo promove distúrbios motores e
aumento do tônus muscular, entre outros eventos que resultam em convulsões
tônicas e morte por paralisia respiratória ou espinhal ou por parada cardíaca
(PHILIPPE et al., 2004). Não foi observada proteção dos animais tratados com os
isômeros em relação à latência para início das convulsões (gráfico 4), sugerindo que
possivelmente os estereoisômeros testados não atuam nos receptores de glicina da
medula espinhal. (VOGEL; VOGEL, 2002). A estricnina atua como agente
convulsivante através do antagonismo competitvo de todos os receptores de glicina,
um importante transmissor inibitório pós-sináptico. (KUNO; WEAKLY, 1972). Em
contrapartida, verificou-se que os isômeros (+)-cis-EC e (+)-trans-EC (300 mg/kg),
embora possivelmente não atuem em receptores de glicina, apresentaram um
Discussão
SALGADO, P.R.R.
95
aumento na latência para morte dos animais por mecanismos ainda desconhecidos
(gráfico 5). Isômeros estruturais e enantiômeros do pineno, um monoterpeno com
ação fitotóxica já conhecida, apresentaram diferenças em parâmetros fisiológicos
relacionados à germinação e crescimento do milho, provavelmente, devido a
diferentes mecanismos de ação dos isômeros estudados. (ARECO et al., 2014).
Trabalhos desta natureza, envolvendo comparações isoméricas, são de grande
importância, uma vez que tentam reforçar particularidades das substâncias
estudadas, direcionando futuros estudos de desenvolvimento de novos fármacos.
Realizou-se também o teste das convulsões induzidas pelo eletrochoque
auricular máximo, modelo amplamente utilizado e aceito para estudar agentes
anticonvulsivantes.
(TOMAN;
SWINYARD;
GOODMAN,
1946;
SWINYARD;
KUPFERBERG, 1985; KRALL et al., 1978). O fundamento desse teste que produz o
chamado “grande mal epiléptico” baseia-se na aplicação de cargas elétricas por um
curto período de tempo, despolarizando células nervosas e produzindo convulsões
do tipo tônico-clônicas, que consistem em extensão tônica dos membros posteriores.
(BARROS; LEITE, 1986; FAINGOLD; FROMM, 1991).
No teste do EAM, drogas que suprimem convulsões tônico-clônicas, tendo a
capacidade de prevenir a propagação da descarga convulsiva através de tecidos
neuronais, diminuindo a duração das convulsões e aumentando o limiar para
surgimento das crises são consideradas potenciais agentes anticonvulsivantes.
(SWINYARD, 1969; YA’U et al. 2008; LUSZCZKI et al., 2010; LÖSCHER;
FASSBENDER; NOLTING, 1991).
Diante dos resultados apresentados, evidenciou-se diferença no efeito dos
estereoisômeros da EC e apesar de todos reduzirem a duração das convulsões
significativamente em relação ao grupo controle, as substâncias (+)-trans-EC e (-)trans-EC apresentaram uma redução ainda mais acentuada (gráfico 6). Isômeros
constitucionais de derivados de amida do ácido valpróico foram testados
comparativamente quanto à atividade anticonvulsivante no teste das convulsões
induzidas pelo eletrochoque auricular máximo, observando-se que poucas
alterações ocorrem no tocante a esta ação. (MAWASI et al., 2015). Trans-1-propenil2,4,5-trimetoxi-benzeno], também conhecido como α-asarona, exibiu propriedades
anticonvulsivantes no referido teste. (CHEN et al., 2013).
Como previamente reportado, o monoterpeno α,β-epoxy-carvone preveniu as
convulsões tônicas induzidas neste teste (ALMEIDA et al., 2008), assim como visto
Discussão
SALGADO, P.R.R.
96
com os quatro estereoisômeros. Enantiômeros de neuroesteroides (ZOLKOWSKA et
al., 2014) também apresentaram marcante efeito anticonvulsivante no teste das
convulsões induzidas pelo eletrochoque auricular máximo, o que fortalece os
resultados desta pesquisa.
Todos os isômeros apresentaram um controle significativo das convulsões
tanto no teste do PTZ, quanto no teste do EAM, o que destaca o potencial
anticonvulsivante dos mesmos e sugere a realização de mais estudos em relação à
possível participação das vias envolvendo o receptor GABA A e outros canais iônicos
relacionados a vias excitatórias. Estudo de Almeida e colaboradores (2008) mostrou
que o efeito anticonvulsivante do monoterpeno α,β-epóxi-carvona não foi revertido
pelo pré-tratamento com o antagonista seletivo do sítio benzodiazepínico do receptor
GABAA, flumazenil. Levando-se em conta que a substância α,β-epóxi-carvona é um
dos isômeros [(+)-cis-EC] analisados nesse trabalho comparativo e de posse dessa
informação sobre mecanismo de ação, sugere-se que uma possível atuação no
receptor GABAérgico ocorreria em outras subunidades envolvidas com a
epileptogênese em modelos animais (BROOKS-KAYAL et al.,1998) e em humanos.
(LOUP et al., 2000).
O modelo animal de abrasamento induzido por PTZ também chamado de
“kindling” é uma simulação da epilepsia sintomática vista na prática clínica. Logo, a
investigação de drogas neste modelo fornece dados sugestivos de eficácia clínica
das mesmas. (LOSCHER, 2002b; MEHLA et al. 2010). O fundamento desse teste
baseia-se em repetidas estimulações subconvulsivas químicas (PTZ ou picrotoxina)
e elétricas, de forma a causar um desenvolvimento progressivo de convulsões
generalizadas tônico-clônicas que se agrava nos últimos dias de tratamento.
(RACINE; GARTNER; BURNHAM, 1972; WALKER; WHITE; SANDER, 2002;
STABLES et al., 2003; PITKANEN et al., 2007; RAHMATI et al., 2013). Através da
indução do abrasamento ou “kindling” pelo PTZ, tem-se a oportunidade de investigar
os possíveis mecanismos epileptogênicos e as manifestações comportamentais das
convulsões, apesar da forma como esses eventos epileptogênicos ocorrem ainda
serem mal compreendidos. (STONE; GOLD, 1988; KUMAR; LALITHA; MISHRA,
2013). A excitabilidade
neuronal é
diminuída
sob influência de
agentes
anticonvulsivantes como benzodiazepínicos e barbitúricos. (LÖSCHER & SCHMIDT,
2006).
SALGADO, P.R.R.
Discussão
97
A administração de doses subconvulsivas do PTZ (35 mg/kg), em dias
alternados, durante 15 dias, iniciou uma cadeia de eventos que tornou o cérebro dos
animais suscetivel ao surgimento de convulsões, como observado no grupo tratado
com veículo + PTZ, que demonstrou aumento progressivo nos escores ao longo dos
dias, atingindo a maior média no último dia de tratamento, conforme esperado.
Estudo conduzido por Schmoll e colaboradores (2003) demonstrou que apenas duas
administrações subconvulsivas de PTZ foram necessárias para estabelecer o quadro
completo de “kindling”, diferentemente do constatado por Davoudi (2013) e Kumar
(2013), onde quatro injeções subconvulsivas de PTZ foram necessárias para tornar
o cérebro dos animais excitado o suficiente para surgimento das convulsões, assim
como no presente trabalho, onde quatro intervenções estabeleceram o “kindling”.
Estes dados acabam elencando entre o terceiro e quarto dia de administração como
o período onde começa a ocorrer o abrasamento nos animais e consequente
facilitação do aparecimento das crises, indicando inclusive não serem necessárias
as injeções posteriores de PTZ, já que as crises ocorreriam de forma espontânea.
(DAVOUDI et al., 2013).
A droga padrão, diazepam (4 mg/kg), foi capaz de prevenir as convulsões
induzidas pelo PTZ, diminuindo a média dos escores de forma significativa em
relação ao grupo tratado com veículo + PTZ. Os animais que receberam diazepam
apresentaram uma regularidade na média dos escores, ficando sempre abaixo de
(2), ao longo do tratamento, confirmando a proteção fornecida e já esperada por
essa substância (gráfico 7). Conforme estudos prévios, drogas que ativam
diretamente os receptores GABAA, como o diazepam, tem a capacidade de inibir as
convulsões induzidas pelo PTZ. (SAYYAH et al., 2005; BRUM; ELISABETSKY,
2000).
Devido à indisponibilidade dos estereoisômeros (+)-trans e (-)-trans-EC, para
esta metodologia, utilizou-se apenas as substâncias (+)-cis e (-)-cis-EC, cuja síntese
mostrou-se viável. O tratamento com o monoterpeno (+)-cis-EC (30 mg/kg) foi capaz
de reduzir significativamente a média dos escores apresentados, mostrando um pico
no comportamento convulsivo no último dia de tratamento subconvulsivo com PTZ.
Isso confirma o efeito protetor desse estereoisômero mesmo diante de exposições
repetidas ao PTZ (gráfico 7). Apesar de não apresentar significância estatística em
relação ao grupo tratado com diazepam, observou-se uma redução dos escores foi
Discussão
SALGADO, P.R.R.
98
ainda maior nos animais tratados com (+)-cis-EC do que com a droga padrão, na
maior parte do tempo.
Resultados como este, apesar de preliminares, exibem a potencialidade
desse estereiosômero em modelos de epileptogênese, fornecendo mais um caminho
para futuras investigações acerca dos mecanismos sobre os quais (+)-cis-EC atua.
Por outro lado, o estereosiômero (-)-cis-EC (30 mg/kg), apesar de também ser
efetivo nesta metodologia de forma significativa em relação ao grupo que recebeu
veículo + PTZ, visivelmente tem potencialidade inferior à (+)-cis-EC, apresentando
escores um pouco maiores, ou seja, os animais tratados com (-)-cis-EC mais
facilmente exibiram o comportamento convulsivo após estímulos repetidos com PTZ
(gráfico 7). De forma interessante, o perfil de resposta dos dois estereoisômeros foi
bem semelhante, inclusive no pico de resposta convulsiva para (-)-cis-EC, que
ocorreu no dia 11 de tratamento subconvulsivo com PTZ, assim como visto para (+)cis-EC.
Outro dado relevante é que não se registrou mortes dos animais tratados com
ambos estereoisômeros, assim como com a droga padrão, em detrimento do
observado e esperado com os animais que receberam veículo e PTZ (tabela 9).
Além da apresentação dos escores indicativos de desenvolvimento das crises
convulsivas, esta informação também reforça que as substâncias teste objeto desse
estudo são promissores agentes anticonvulsivantes em metodologias que envolvem
estímulo convulsivo agudo e intermitente, tornando as pesquisas nesta área
passíveis
de
serem
estereoisômeros
foi
continuadas.
discreta,
mas
Novamente,
estas
as
diferenças
pequenas
entre
particularidades
os
e
esclarecimentos poderão ser importantes em abordagens futuras.
Estudo conduzido por Sancheti e colaboradores (2014) relatou o potencial
anti-epileptogênico do timol, substância pertencente a mesma classe química
(monoterpeno) dos estereoisômeros testados. Os referidos autores confirmaram a
eficácia anticonvulsivante do timol através do modelo do “kindling”, onde este
monoterpeno demonstrou uma diminuição dos escores em relação ao grupo tratado
com veículo e PTZ.
Simjee (2012)
avaliou comparativamente uma
mistura isomérica de
isoxilitonas ([E/Z]-2-propanona-1,3,5,5-trimetil-2-ciclohexen-1-ilidina) com potente
ação anticonvulsivante em relação à atividade anti-epileptogênica através do teste
do “kindling”, em camundongos, na mesma dose utilizada para os estereosiômeros
Discussão
SALGADO, P.R.R.
99
(+)-cis-EC e (-)-cis-EC. Estes isômeros reduziram o desenvolvimento das
convulsões induzidas por administrações subconvulsivas de PTZ de forma similar
entre si, assim como visto para as substâncias testadas neste trabalho.
Além disso, os autores sugerem uma possível interferência destas isoxilitonas
na neurotransmissão GABAérgica, porém, sem explicar exatamente como isto
ocorreria, assim como sugerido também para (+)-cis-EC e (-)-cis-EC. Estudos em
nível de receptor são requeridos para elucidar estes questionamentos. Tem-se então
mais um caso de isômeros com perfis farmacológicos parecidos.
Por outro lado, estudo conduzido por Stark e colaboradores (1987), utilizando
também duas substâncias isoméricas no teste do “kindling”, constatou que a forma
β-hexaclorociclohexano atua como anticonvulsivante, diminuindo a taxa de
abrasamento nos animais, enquanto a forma γ- hexaclorociclohexano, de forma
contrária, facilita o surgimento das convulsões no referido teste. Juntos, esses
achados exibem as mais variadas ações que substâncias estruturalmente similares
podem possuir, sendo importante conhecer cada atividade apresentada, traçando
assim o perfil farmacológicos das mesmas.
O isômero trans-2-en-valproato mostrou potência anticonvulsivante maior do
que o valproato no teste do “kindling” ou abrasamento, apesar deste evento ocorrer
em doses que promoviam incoordenação motora nos animais. (HÖNACK;
RUNDFELDT; LÖSCHER, 1992).
A epileptogênese, por ser um processo altamente complexo, não deve ser
vista apenas através do componente neuronal. Confirmando isto, estudos não
clínicos e clínicos tem, cada vez mais, mostrado a participação de outras estruturas
no desenvolvimento da epilepsia, como células da glia (WETHERINGTON;
SERRANO; DINGLEDINE, 2008), vasculatura cerebral (FRIEDMAN; KAUFER,
HEINEMANN, 2009) e leucócitos perféricos. (GREENWOOD et al., 2002). As células
da glia, por exemplo, tem seu mecanismo epileptogênico explicado através do
aumento da excitabilidade neuronal e por ocasionar a instalação de processos
inflamatórios, cujo papel na epilepsia vem sendo extensivamente investigado.
Um outro olhar tem sido lançado sobre a associação entre inflamação e
epilepsia. Prova disto é que, antigamente, focava-se apenas nos estudos com
drogas anti-epilépticas cujo mecanismo envolvia atuação em canais iônicos,
transportadores e neurotransmissão excitatória ou inbitória. (MACDONALD;
ROGAWSKI,
2008).
Hoje,
os
efeitos
anti-inflamatórios
de
substâncias
SALGADO, P.R.R.
Discussão
100
anticonvulsivantes tem ganhado destaque e mostrado resultados promissores no
controle da epilepsia. Drogas utilizadas na prática clínica, como a carbamazepina e
levetiracetam, reduzem a expressão de mediadores inflamatórios em cultura de
células da glia. Já se sabe também da capacidade destes fármacos anti-epilépticos
em amenizar a influência dos mediadores inflamatórios, normalizando o potencial de
membrana de células gliais e até mesmo suprimindo a ativação dessas células,
evento este produzido pelo levetiracetam. (HAGHIKIA et al., 2008; MATOTH et al.,
2000).
Além disso, reforçando a participação dos mediadores inflamatórios na
gênese da epilpesia, disfunções na barreira hemato-encefálica causam vasamento
de proteínas séricas e leucócitos para o cérebro. Uma vez neste ambiente, os
leucócitos liberam citocinas inflamatórias, as quais diminuem o limiar para
surgimento das convulsões, podendo alterar a sensibilidade dos canais iônicos, a
captação ou liberação de neurotransmissores e a regulação da concentração de
íons como o potássio. (WETHERINGTON; SERRANO; DINGLEDINE, 2008;
FRIEDMAN; KAUFER, HEINEMANN, 2009; VIVIANI; GARDONI; MARINOVICH,
2007; VEZZANI et al., 2011). Modelos animais de estimulação farmacológica ou
elétrica das convulsões produzem convulsões acompanhadas de resposta
inflamatória no cérebro destes animais, e estes mediadores inflamatórios
apresentam estreita relação com parâmetros como latência para início das
convulsões, frequencia, duração e gravidade das crises. (MINAMI; KURAISHI;
SATOH, 1991; ERIKSSON et al., 2000; DE SIMONI et al., 2000; VEZZANI et al.,
2000; TURRIN; RIVEST, 2004; VOUTSINOS-PORCHE et al., 2004; GORTER et al.,
2006; JUNG et al., 2006; YOSHIKAWA et al., 2006; ARONICA; GORTER, 2007;
DHOTE et al., 2007; LEE et al., 2007; KULKARNI; DHIR, 2009; HOLTMAN et al.,
2010; POLASCHECK; BANKSTAHL; LÖSCHER, 2010; AUVIN et al., 2010;
MAROSO et al., 2010).
Experimentos com camundongos que superexpressam citocinas inflamatórias
como IL-6 e TNFα dentro de astrócitos, demonstraram que esses animais
desenvolveram algumas disfunções neurológicas em decorrência do aumento
dessas moléculas inflamatórias, como redução no limiar para surgimento das
convulsões, crises espontâneas frequentes e perda neuronal. (CAMPBELL et al.,
1993; PROBERT et al., 1997). Outra citocina pró-inflamatória, IL-1β, regula a
excitabilidade neuronal de várias formas, onde uma delas é através da diminuição
Discussão
SALGADO, P.R.R.
101
da produção do neurotransmissor inibitório GABA e inibição da corrente de Ca 2+
para fora da célula. (VIVIANI; GARDONI; MARINOVICH, 2007; RODGERS et al.,
2009; WANG et al., 2000; SCHÄFERS; SORKIN, 2008). Logo, estes dados
corroboram com a hipótese de que a inflamação está relacionada com o
desencadeamento das crises e epileptogênese. (SHIMADA et al., 2014).
Os resultados apresentados sobre a quantificação de citocinas próinflamatórias no hipocampo dos animais submetidos ao teste do “kindling”, mostrou
que o estereoisômero (+)-cis-EC foi efetivo em reduzir os níveis de IL-1β, IL-6 e
TNFα (gráficos 8, 9 e 10), destacando-se como potencial agente anticonvulsivante
por diferentes vias, como constatado em metodologias comportamentais anteriores,
mas também alterando a sinalização que envolve estas moléculas pró-inflamatórias,
aumentando assim o limiar convulsivo. Comparativamente, (-)-cis-EC também se
mostrou efetivo, reduzindo os níveis de IL-6 e TNFα (gráficos 9 e 10), porém, não
diminuiu significativamente a quantidade de IL-1β (gráfico 8) no hipocampo dos
camundongos. Este achado mostra que, mais uma vez, (+)-cis-EC sobressaiu-se em
relação a (-)-cis-EC, sendo importante salientar que essas diferenças também foram
discretas, como visto em testes anteriores.
Apesar das diferenças entre os estereoisômeros serem relativamente
pequenas, estas informações tornam o estereoisômero (+)-cis-EC mais promissor,
uma vez que Kołosowska e colaboradores (2014) dão papel de destaque à IL-1β,
caracterizando-o como marcador principal do teste do “kindling” e uma importancia
menor às demais citocinas pró-inflamatórias, como IL-6 e TNFα. Com esta visão, por
ter diminuído significativamente a concentração de IL-1β, enquanto (-)-cis-EC não o
fez, (+)-cis-EC novamente seria a melhor droga anticonvulsivante. Outro estudo que
ressalta o papel da IL-1β, mostrando que esta citocina continua sendo expressa
mesmo após a realização de experimentos agudos, e, nas metodologias crônicas,
onde se observa a epileptogênese, esta citocina continua com um padrão de
superexpressão, ao contrário da IL-6 e TNFα, cuja expressão é transitória. (DE
SIMONI et al., 2000). Além disso, IL-1β estimula a síntese de IL-6 e TNFα em
células da glia, amplificando a sinalização pró-convulsiva e salientando mais uma
vez o papel desta citocina na epilepsia. (SCHÖBITZ; DE KLOET; HOLSBOER, 1994;
BENVENISTE, 1992; BARTFAI; SHULTZBERG, 1993).
O
fato
de
ambos
estereosiômeros
interferirem
na
diminuição
da
susceptibilidade às convulsões alterando os níveis das citocinas pró-inflamatórias de
SALGADO, P.R.R.
diferentes
formas,
caracteriza-os
como
agentes
Discussão
102
anticonvulsivantes
que,
possivelmente, atuam em diferentes vias. Isso pode ser constatado, já que IL-1β, IL6 e TNFα tem papeis diversos na epilepsia, promovendo o surgimento das
convulsões cada um a sua maneira. (BERNARDINO et al., 2005; PENKOWA et al.,
2001).
Tabassum e colaboradores (2015) relataram que o monoterpeno álcool
perílico tem a capacidade de reduzir os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-1β,
IL-6 e TNFα, consequetemente promovendo proteção neuronal. Da mesma forma,
isômeros sesquiterpênicos obtidos da planta Ferula fukanensis inibiram a expressão
das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNFα (MOTAI; DAIKONYA; KITANAKA, 2013),
caracterizando o potencial de compostos naturais isoméricos em interferir nos níveis
destas importantes moléculas participantes do processo de epilepsia.
Neuroesteroides também possuem relatos de modular positivamente ou
negativamente o receptor GABAA, e entre os exemplos de regulação positiva no
sentido de potencializar esta via inibitória, tem-se dois metabólitos isoméricos da
progesterona: 5α-pregnano-3α-ol-20-ona (alopregnanolona) e 5α-pregnano-3β-ol-20ona. (pregnanolona; GASIOR et al., 1999). Estes isômeros naturais, mas que
também podem ser obtidos sinteticamente (REY; COIRINI, 2015), assim como (+)cis-EC e (-)-cis-EC, já são conhecidos como anticonvulsivantes, e em um estudo
coordenado por He (2004), alopregnanolona e pregnanolona reduziram os níveis
das citocinas IL-1β e TNFα em modelo de trauma cerebral, sendo esse um dos
possíveis mecanismos anticonvulsivantes das referidas substâncias.
Situações de excitação extrema, como convulsões severas e outros quadros
neuropatológicos crônicos têm a capacidade de promover dano ou destruição
neuronal. (SCHARFMAN; SOLLAS; GOODMAN, 2001). Estudos têm demonstrado
que após a instalação de crises epilépticas ou durante a epileptogênese, ocorrem
alterações morfológicas, moleculares e reorganizações sinápticas em diversas
estruturas cerebrais, como perda de neurônios, gliose e degeneração vacuolar em
áreas do hipocampo, córtex cerebral, amigdala, tálamo, entre outras regiões.
(GARCIA-CAIRASCO et al., 1996; HOLMES et al., 2004; MARCHETTI et al., 2005;
FREITAS, 2003).
O hipocampo é uma estrutura cerebral intimamente relacionada à epilepsia,
onde estudos de imagem da morfologia desta área auxiliam no diagnóstico de
pacientes portadores da doença. (ISNARD; BOURDILLON, 2015). Os resultados
Discussão
SALGADO, P.R.R.
103
obtidos com a análise histopatológica dos animais tratados com os estereoisômeros
da EC e diazepam submetidos à doses subconvulsivas de PTZ mostraram que (+)cis-EC e (-)-EC promoveram proteção neuronal, em diferentes proporções entre si. O
isômero (+)-cis-EC, assim como tem ocorrido em resultados anteriores, foi mais
efetivo do que (-)-cis-EC, uma vez que o tratamento com este último ainda exibiu
traços de dano celular e processo inflamatório (figura 13).
Estes dados reforçam a relevância do estereoisômero (+)-cis-EC, que
aumenta o tempo em que os animais levam para apresentar convulsões; diminui a
incidência das crises, como visto no teste do “kindling”; reduz os níveis de citocinas
pró-inflamatórias relacionadas com o desencadeamento da epilepsia, bem como é
capaz de causar uma maior proteção de neurônios da região do hipocampo, uma
vez que estas células sejam continuamente expostas a agentes químicos
convulsivos. Isto aponta a substância (+)-cis-EC como promissora para a
continuidade dos estudos envolvendo a mesma no mecanismo da epilepsia.
Conforme esperado, o grupo de animais que recebeu o veículo seguido do
PTZ apresentou lesão cerebral e instalação de processo inflamatório. Já os animais
tratados com o DZP não demonstraram alterações histopatológicas significativas,
sugerindo a participação da via GABAérgica no bloqueio dessas lesões. De acordo
com Pohle e colaboradores (1997), a injeção de pentilenotetrazol promove grande
perda neuronal em diferentes regiões do hipocampo após o teste do “kindling”.
Becker (1997) relata proteção neuronal também no hipocampo de animais tratados
com diazepam, cujo possível mecanismo protetor envolve bloqueio de canais de
sódio (FERN et al., 1993) e potencialização da via GABAérgica.
Uma série de triazolopirimidinas isoméricas foram sintetizadas e testadas
quanto
ao
potencial
anticonvulsivante,
onde
uma
delas,
a
(R)-7-[1-(4-
clorofenoxy)etil]-1,2,4-triazolo(1,5-α)pirimidina, mostrou-se neuroprotetora em testes
de isquemia cerebral através de análise histopatológica. (SMITH et al., 2001).
Trabalho conduzido por Pérez-Hernández e colaboradores (2016) destacam o
papel dos compostos derivados de plantas no tratamento de doenças envolvendo o
sistema nervoso central. Magnolol e honokiol, isômeros isolados da planta Magnolia
officinalis, apresentaram efeito neuroprotetor, além de outras atividades. O extrato
de chá verde e seu composto isolado polifenólico, (-)-epigalocatequina-3-galato,
protegem os neurônios dopaminérgicos, além de diminuirem o estresse oxidativo. O
mesmo tipo de efeito é observado também com os compostos naturais antocianidina
Discussão
SALGADO, P.R.R.
104
e pelargonidina, reduzindo o dano histológico e a peroxidação lipídica. O extrato
etanólico de Knema laurina exibiu proteção de neurônios do hipocampo e atividade
anti-inflamatória, o que mostra a influência dos produtos naturais e de seus
compostos nas desordens neurológicas. (LEVITES et al., 2001; VAN KAMPEN et al.,
2003; MATSUI et al., 2009; CHUANG et al., 2013; ROGHANI et al., 2010; HÄKE et
al., 2009).
Em suma, os resultados apresentados neste trabalho demonstram, de forma
comparativa,
o
potencial
anticonvulsivante
de
quatro
estereoisômeros
do
monoterpeno de origem natural, mas obtido por síntese para a realização deste
trabalho, epóxi-carvona. Constatou-se que (+)-cis-EC, (-)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)trans-EC tem perfis farmacológicos similares, com pequenas porém notáveis
diferenças entre si. O estereoisômero (+)-cis-EC mostrou-se como mais efetivo nos
modelos agudos, bem como em modelos envolvendo epileptogênese, sendo um dos
que mais se destacaram entre os quatro avaliados.
Evidentemente, por ser um estudo comparativo preliminar, os resultados
apresentados dão um direcionamento futuro para que se tente explicar os possíveis
mecanismos envolvidos na ação anticonvulsivante das substâncias isoméricas
testadas, tornando-as promissoras no desenvolvimento de novos fármacos antiepilépticos.
Conclusões
SALGADO, P.R.R.
106
8 CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no estudo anticonvulsivante comparativo entre
os estereoisômeros da EC, pode-se fazer as seguintes constatações:

Todos os estereoisômeros possuem ação anticonvulsivante nas metodologias
agudas envolvendo estímulo químico e elétrico, mas em diferentes
proporções, onde (+)-cis-EC, (+)-trans-EC e (-)-trans-EC ganharam destaque
positivo.

O mecanismo de ação anticonvulsivante dos referidos estereoisômeros
envolvendo canais iônicos ainda é passível de estudos mais detalhados,
apesar de possivelmente não envolver a via glicinérgica.

As substâncias (+)-cis-EC e (-)-cis-EC demonstraram potencial antiepileptogênico
no
teste
do
“kindling”
e
(+)-cis-EC
sobressaiu-se
comparativamente.

Houve correlação entre a diminuição de citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6
e TNFα envolvidas em quadros de epilepsia e os tratamentos com (+)-cis-EC
e (-)-cis-EC no teste do “kindling”, onde, novamente, (+)-cis-EC foi mais
efetiva.

Ambos os estereoisômeros (+)-cis-EC e (-)-cis-EC exibiram neuroproteção em
hipocampo de animais submetidos ao teste do “kindling”, com maior
preservação deste tecido cerebral no grupo que recebeu (+)-cis-EC.

Estes
achados
caracterizam
a
relevância
da
estereoquímica
de
monoterpenos em sua ação, bem como servem de base para as pesquisas
acerca desta temática.
Perspectivas
SALGADO, P.R.R.
108
PERSPECTIVAS
Os importantes resultados obtidos e expressos neste estudo, conforme já
mencionado
anteriormente,
são
preliminares,
havendo
a
necessidade
da
continuidade dos trabalhos com o intuito de se responder o máximo de perguntas a
respeito destes estereoisômeros.
Uma lacuna ainda presente reside na elucidação do mecanismo de ação das
substâncias em questão. Deve-se conhecer de forma mais detalhada a possível
interferência dos estereoisômeros em vias de sinalização excitatórias e inibitórias.
Possíveis alvos de investigação são os receptores GABA A (de forma mais
minuciosa), canais de sódio, canais de cálcio e receptores para o glutamato.
A verificação da expressão de proteínas associadas à epilepsia também é
passível de investigação, onde seria observada a presença de caspase-1 (envolvida
na ativação de IL-1β), caspase-8, caspase-3 e BDNF (fator neurotrófico derivado do
cerébro).
Sugere-se também a utilização de outras vias de administração, como a oral,
observando-se a possível permanência do efeito anticonvulsivante. Abordagens
toxicológicas agudas e crônicas maiores também são necessárias, uma vez que um
medicamento de qualidade deve apresentar segurança de uso.
A incorporação destes monoterpenos em nanomateriais também se mostra
como algo interessante, uma vez que haveria a possibilidade da redução da dose
administrada com permanência dos efeitos farmacológicos, além dos inúmeros
benefícios obtidos com a aplicação da nanotecnologia.
Extremamente importante na coitinuidade deste trabalho é o entendimento da
estereosseletividade
destas
substâncias,
através
da
explicação
de
como
determinada conformação química apresenta melhores efeitos farmacológicos em
detrimento de outras. Estudos de farmacocinética também embasarão ainda mais os
resultados obtidos com os estereoisômeros, tornando-os candidatos aptos a serem
inseridos na clínica.
SALGADO, P.R.R.
Referências
110
REFERÊNCIAS
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SALGADO, P.R.R.
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p.3325–3332, 2014.
Anexos
SALGADO, P.R.R.
148
ANEXOS

Artigos publicados ou submetidos na vigência do doutorado
DE SOUSA SANTOS, ALINE KELY FELÍCIO, DA FONSECA, DIOGO VILAR,
SALGADO, PAULA REGINA RODRIGUES, MUNIZ, VANESSA MORAIS, DE
ARRUDA
TORRES,
PAULA,
LIRA,
NARLIZE
SILVA,
DA
SILVA
DIAS,
CELIDARQUE, DE MORAIS PORDEUS, LIANA CLÉBIA, BARBOSA-FILHO, JOSÉ
MARIA, DE ALMEIDA, REINALDO NOBREGA. Antinociceptive activity of Sargassum
polyceratium and the isolation of its chemical components. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v.25, n.6, p.683-689, 2015. (ARTIGO PUBLICADO).
DE QUEIROZ, RONALDO, DE CARVALHO, FABÍOLA, FONSÊCA, DIOGO,
BARBOSA-FILHO, JOSÉ, SALGADO, PAULA, PAULO, LUCIANO, DE QUEIROZ,
ANA, PORDEUS, LIANA, DE SOUZA, SEVERINO, SOUZA, HELIVALDO, LIRA,
BRUNO, DE ATHAYDE-FILHO, PETRÔNIO. Antinociceptive Effect of Hydantoin 3Phenyl-5-(4-ethylphenyl)-imidazolidine-2,4-dione in Mice. Molecules (Basel. Online).,
v.20, p.974-986, 2015. (ARTIGO PUBLICADO).
SALGADO, P. R. R., FONSÊCA, D. V., BRAGA, R. M., MELO, C. G. F., ANDRADE,
L. N., ALMEIDA, R. N, SOUSA, D. P. Comparative Anticonvulsant Study of
Epoxycarvone Stereoisomers. Molecules (Basel. Online)., v.20, p.19660-19673,
2015. (ARTIGO PUBLICADO).
FONSÊCA, DIOGO V., SALGADO, PAULA R. R., DE CARVALHO, FABÍOLA L.,
SALVADORI, MIRIAN GRACIELA S. S., PENHA, ANTÔNIA ROSÂNGELA S.,
LEITE, FAGNER C., BORGES, CLÓVIS JOSÉ S., PIUVEZAM, MARCIA R.,
PORDEUS, LIANA CLÉBIA DE MORAIS, SOUSA, DAMIÃO P., ALMEIDA,
REINALDO N. Nerolidol exhibits antinociceptive and anti-inflammatory activity:
involvement of the GABAergic system and proinflammatory cytokines. Fundamental
& Clinical Pharmacology, 2015. (ARTIGO PUBLICADO).
Anexos
SALGADO, P.R.R.
149
LEITE, FAGNER, RIBEIRO-FILHO, JAIME, COSTA, HERMANN, SALGADO,
PAULA, CALHEIROS, ANDREA, CARNEIRO, ALAN, DE ALMEIDA, REINALDO,
DIAS, CELIDARQUE, BOZZA, PATRICIA, PIUVEZAM, MARCIA. Curine, an Alkaloid
Isolated
from
Chondrodendron
platyphyllum
Inhibits
Prostaglandin
E2
in
Experimental Models of Inflammation and Pain. Planta Medica, v.80, p.1072 - 1078,
2014. (ARTIGO PUBLICADO).
PAULA REGINA SALGADO; DIOGO FONSECA; CYNTHIA MELO; FAGNER LEITE;
ADRIANO ALVES; PAULA FERREIRA; MARCIA PIUVEZAM; DAMIÃO SOUSA;
REINALDO NÓBREGA DE ALMEIDA. Comparison of behavioral, neuroprotective,
and proinflammatory cytokine modulating effects exercised by (+)-cis-EC and (-)-cisEC stereoisomers in a PTZ induced kindling test in mice. Neuroscience Letters.
(ARTIGO SUBMETIDO).

Resumos publicados em anais de eventos científicos na vigência do
doutorado
LEITE, F.C., FERREIRA, L.K.D.P., SALGADO, P.R.R., MONTEIRO, T.M.M.,
FERREIRA, L.A.M.P., PEREIRA, R.F., ALMEIDA, R.N, PIUVEZAM, M.R. ANTIINFLAMMATORY AND ANTINOCICEPTIVE ACTIVITIES OF 1,4-CINEOLE. In: 10th
International Congress of Pharmaceutical Sciences - CIFARP, 2015, Ribeirão
Preto-SP. 10th International Congress of Pharmaceutical Sciences - CIFARP, 2015.
ARAGAO NETO, H.C., FONSÊCA, D.V., SALGADO, P.R.R., MELO, C.G.F.,
BRAGA, R.M., CALDAS FILHO, M.R.D., ALMEIDA, R.N. Antinociceptive activity of
phenylpropanoid 2-allylphenol. In: Antinociceptive activity of phenylpropanoid 2allylphenol, 2015, Foz do Iguaçu-PR. 23rd International Congress of the IUBMB
and 44th Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and
Molecular Biology (SBBq), 2015.
ARAGAO NETO, H.C., SALGADO, P.R.R., FONSÊCA, D.V., LIMA, C.L.S., SOUSA,
D.P., ALMEIDA, R.N. Atividade anticonvulsivante comparativa dos isômeros (+)-cis e
(+)-trans da epóxi-carvona em camundongos. In: III Congresso Brasileiro sobre
SALGADO, P.R.R.
Anexos
150
Saúde Mental e Dependência Química, 2015, João Pessoa-PB. III Congresso
Brasileiro sobre Saúde Mental e Dependência Química, 2015.
SALGADO, P.R.R., FONSÊCA, D.V., BRAGA, R.M., MELO, C.G.F., ARAGAO
NETO, H.C., CALDAS FILHO, M.R.D., LEITE, F.C., SOUSA, D.P., ALMEIDA, R.N.
Comparative anticonvulsant activity of the isomers of epoxy-carvone in mice. In: 23rd
International Congress of the IUBMB and 44th Annual Meeting of the Brazilian
Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2015, Foz do Iguaçu-PR.
23rd International Congress of the IUBMB and 44th Annual Meeting of the
Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2015.
MELO, C.G.F., SALGADO, P.R.R., FONSÊCA, D.V., CALDAS FILHO, M.R.D.,
BRAGA, R.M., ARAGAO NETO, H.C., FARIAS, I.E.V., SOUSA, D.P., ALMEIDA,
R.N. Evaluation of anticonvulsant activity of the monoterpene synthetic (1s)-(-)verbenone. In: 23rd International Congress of the IUBMB and 44th Annual Meeting of
the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2015, Foz do
Iguaçu-PR. 23rd International Congress of the IUBMB and 44th Annual Meeting
of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2015.
SALVADORI, M.S., FONSÊCA, D.V., ARAGAO NETO, H.C., SALGADO, P.R.R.,
BRAGA, R.M., CALDAS FILHO, M.R.D., MELO, C.G.F., BARBOSA-FILHO, J.M.,
ALMEIDA, R.N. Glutamatergic system involvement in activity antinociceptive oeugenol. In: 9th IBRO World Congress on Neuroscience, 2015, Rio de Janeiro-RJ.
9th IBRO World Congress on Neuroscience, 2015.
CALDAS FILHO, M.R.D., FONSÊCA, D.V., MELO, C.G.F., SALGADO, P.R.R.,
BRAGA, R.M., ARAGAO NETO, H.C., SOUSA, D.P., ALMEIDA, R.N. Investigation of
antinociceptive activity of the monoterpene (+)-3-carene in mice. In: 23rd
International Congress of the IUBMB and 44th Annual Meeting of the Brazilian
Anexos
SALGADO, P.R.R.
151
FONSÊCA, D.V., ARAGAO NETO, H.C., SALGADO, P.R.R., LEITE, F.C., MELO,
C.G.F., CALDAS FILHO, M.R.D., BRAGA, R.M., ALMEIDA, R.N. Ortho-eugenol
exhibits anti-inflammatory activity: involvement of the proinflammatory cytokines. In:
23rd International Congress of the IUBMB and 44th Annual Meeting of the Brazilian
LUNA, V.R., PORDEUS, L.C.M., SALGADO, P.R.R., SILVA, J.A., OLIVEIRA, K.H.
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CONGRESSO
BRASILEIRO
DE
NUTRIÇÃO
&
V
CONGRESSO
IBERO-
AMERICANO DE NUTRIÇÃO, 2014, Vitória-ES. XXIII CONGRESSO BRASILEIRO
DE NUTRIÇÃO & V CONGRESSO IBERO-AMERICANO DE NUTRIÇÃO, 2014.
SALGADO, PAULA, MEDEIROS, V.M., LIRA, N.S., LIMA, C.L.S., SOUSA, D.P.,
ALMEIDA, R.N. Anticonvulsant activity of the isomers (+) - cis-epoxy-carvone and (-)cis-epoxy-carvone in mice. In: 7th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry
(BrazMedChem2014), 2014, Campos do Jordão-SP. 7th Brazilian Symposium on
Medicinal Chemistry (BrazMedChem2014), 2014.
FONSÊCA, D.V., SALGADO, P.R R., MUNIZ, V.M., SANTOS, A.K.F.S., ROCCA,
V.L., CARVALHO, F.L., SALVADORI, M.G.S.S., BARBOSA-FILHO, J.M., ALMEIDA,
R.N. Antinociceptive activity of two analogues structural eugenol. In: 46th Brazilian
Congress on Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2014, Fortaleza-CE.
46th Brazilian Congress on Pharmacology and Experimental Therapeutics,
2014.
SANTOS, C.C.M.P., MOTA, V.G., SALVADORI, M.G.S.S., BENEDITO, R.B.,
SALGADO, P.R.R., SOUSA, D.P., ALMEIDA, R.N. Avaliação da atividade
antinociceptiva do fitol em camundongos. In: IX Reunião Regional da Federação de
Sociedades de Biologia Experimental, 2014, João Pessoa-PB. IX Reunião Regional
da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2014.
Anexos
SALGADO, P.R.R.
152
SANTOS, A.K.F.S., MONTE, L.O., SALGADO, P.R.R., FONSÊCA, D.V., MUNIZ,
V.M., DIAS, C.S., TORRES, P.A., ALMEIDA, R.N. Efeito antinociceptivo do extrato
etanólico bruto de Sargassum polyceratium em camundongos. In: IX Reunião
Regional da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2014, João
Pessoa-PB. IX Reunião Regional da Federação de Sociedades de Biologia
Experimental, 2014.
MONTE, L.O., OLIVEIRA, K.H.D., PENHA, A.R.S., SALGADO, P.R.R., CARVALHO,
F.L., SIMOES, S.M.Q., RODRIGUES, L.C., ALMEIDA, R.N. Efeito antinociceptivo do
salicilato de bornila em camundongos. In: IX Reunião Regional da Federação de
Sociedades de Biologia Experimental, 2014, João Pessoa-PB. IX Reunião Regional
da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2014.
LEITE, F.C., RIBEIRO-FILHO, JAIME, COSTA, H.F., SALGADO, P.R.R., ALVES,
A.F., CALHEIROS, A.S., FONSÊCA, D.V., BOZZA, P.T., PIUVEZAM, M.R. Antiinflammatory and analgesic effect of curine, a bisbenzylisoquinoline alkaloid isolated
from Chondrodendron platyphyllum (MENISPERMACEAE). In: 11th World Congress
on Inflammation
and XXXVIII Congress of the Brazilian Society of Immunology,
2013, 11th World Congress on Inflammation
and XXXVIII Congress of the
Brazilian Society of Immunology, 2013.
MONTEIRO, T.M.M., MATIAS, W.N., SOUZA, M.F.V, COSTA, H.F., SALGADO,
PAULA,
SALVADORI,
M.G.S.S.,
NALIVALKO,
E.,
PIUVEZAM,
M.R.
Anti-
inflammatory and anxiolytic effects Herissantia tiubae (K. Schum) Brizicky
(MALVACEAE) in experimental model of Asthma. In: 11th World Congress on
Inflammation and XXXVIII Congress of the Brazilian Society of Immunology, 2013,
Natal-RN. 11th World Congress on Inflammation and XXXVIII Congress of the
Brazilian Society of Immunology, 2013.
SANTOS, A.K.F.S., FONSÊCA, D.V., SALVADORI, M.G.S.S., PENHA, A.R.S.,
SALGADO, P.R.R., PEREIRA, C.K.S., CARVALHO, F.L., SOUSA, D. P., ALMEIDA,
R.N. Avaliação da toxicidade aguda do monoterpeno (-)- mirtenol. In: XVIII
Congresso Brasileiro de Toxicologia, 2013, Porto Alegre-RS. XVIII Congresso
Brasileiro de Toxicologia, 2013.
SALGADO, P.R.R.
Anexos
153
OLIVEIRA, K.H.D., FONSÊCA, D.V., GUEDINE, C.R.C., SALGADO, P.R.R., LIMA,
E.Q., MORAIS, L.C.S.L. Avaliação do efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de
cajarana (Spondias sp.) em roedores. In: 3º Encontro Brasileiro para Inovação
Terapêutica, 2013, Jaboatão dos Guararapes. 3º Encontro Brasileiro para
Inovação Terapêutica, 2013.
MONTE, L.O., PINHEIRO, L.S., CARVALHO, F.L., FONSÊCA, D.V., SALGADO,
P.R.R., SIMOES, S.M.Q., MUNIZ, V.M., RODRIGUES, L.C., ALMEIDA, R.N. Efeitos
centrais e antinociceptivo de um novo derivado salicílico, o salicilato de borneol. In:
V Simpósio em Psicobiologia, 2013, Natal-RN. V Simpósio em Psicobiologia,
2013.
SIMOES, S.M.Q., SALVADORI, M.G.S.S., PENHA, A.R.S., SALGADO, PAULA,
FONSÊCA, D.V., SOUSA, D.P., ALMEIDA, R.N. Antinociceptive activity of Myrtenol:
a terpenoid alcohol. In: 6th Brazilian Medicinal Chemistry Symposium, 2012. 6th
Brazilian Medicinal Chemistry Symposium, 2012.
MONTE, L.O., PENHA, A.R.S., PEREIRA, C.K.S., SALGADO, PAULA, SALVADORI,
M.G.S.S., OLIVEIRA, A.M.F.O., MOURA, R.O., MENDONCA-JUNIOR, F.J.B.,
ALMEIDA, R.N, ASSIS, T.S. Antinociceptive activity of 2-amine-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carbonitrile (6CN) thiophene derivative. In: 6th Brazilian
Medicinal Chemistry Symposium, 2012. 6th Brazilian Medicinal Chemistry
Symposium, 2012.
CARVALHO, F.L., FONSÊCA, D.V., SALVADORI, M.G.S.S., PENHA, A.R.S.,
SALGADO, P.R.R., BRAGA, R.M., PAULO, L.L., FIGUEIREDO, D.A.F., SOUZA,
S.A., ATHAYDE-FILHO, P.F., ALMEIDA, R.N. Antinociceptive mechanism of the
hydantoin IM-7 does not involve GABAA receptors nor KTP channels pathways. In:
6th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, 2012, Canela-RS. 6th Brazilian
Symposium on Medicinal Chemistry, 2012.
SALGADO, P.R.R.
Anexos
154
SANTOS, A.K.F.S., SALVADORI, M.G.S.S., FONSÊCA, D.V., LEITE, F.C.,
SALGADO, PAULA, SOUSA, D.P., PIUVEZAM, M.R. Avaliação da atividade antiinflamatória do mirtenol. In: IV Simpósio Nacional de Produtos Naturais, 2012, João
Pessoa-PB. IV Simpósio Nacional de Produtos Naturais, 2012.
PAULO, L.L., FONSÊCA, D.V., CARVALHO, F.L., BRAGA, R.M., SALGADO,
PAULA, SOUZA, S.A., ATHAYDE-FILHO, P.F., ALMEIDA, R.N, MORAIS, L.C.S.L.
Avaliação do efeito ansiolítico de dois derivados imidazólicos: IM-3 e IM-7. In: VII
Reunião Regional de Sociedades de Biologia Experimental - FeSBE, 2012. VII
Reunião Regional de Sociedades de Biologia Experimental - FeSBE, 2012.
PAULO, L.L., FONSÊCA, D.V., BRAGA, R.M., SALGADO, PAULA, FIGUEIREDO, D.
A.F., MORAIS, L.C.S.L. Avaliação psicofarmacológica preliminar da farinha da
semente de melancia. In: VII Reunião Regional de Sociedades de Biologia
Experimental - FeSBE, 2012, Maceió-AL. VII Reunião Regional de Sociedades de
Biologia Experimental - FeSBE, 2012.
PENHA, A.R.S., PEREIRA, C.K.S., SALGADO, P.R.R., SALVADORI, M.G.S.S.,
MOURA, R.O., MENDONCA-JUNIOR, F.J.B., ALMEIDA, R.N, ASSIS, T.S.
Evaluation of the anxiolytic and sedative activity of 2-amino-4,5,6,7-tetrahydro-benzo
[b] thiophene-3-carbonitrile. In: 6th Brazilian Medicinal Chemistry Symposium, 2012,
Canela-RS. 6th Brazilian Medicinal Chemistry Symposium, 2012.
FONSÊCA, D.V., CARVALHO, F.L., SALGADO, P.R.R., SALVADORI, M.G.S.S.,
PENHA, A.R.S., BRAGA, R.M., PAULO, L.L., FIGUEIREDO, D.A.F., SOUSA, D.P.,
MORAIS, L.C.S.L., ALMEIDA, R.N. Involvement of GABAergic sytem in the
antinociceptive effect induced by nerolidol In: 6th Brazilian Symposium on Medicinal
Chemistry, 2012, Canela-RS. 6th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry,
2012.
SALGADO, P.R.R.
Anexos
155

universidade federal da paraíba centro de ciências da

Transcrição

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