Estradiol - Meditecno

Transcrição

Estradiol
DOUBLE ANTIBODY
Double Antibody Estradiol
English
Intended Use: Double Antibody Estradiol
125
is an I radioimmunoassay designed for
in vitro diagnostic use in the quantitative
measurement of estradiol in serum, for the
investigation of precocious puberty in girls
and gynecomastia in men, and for the
differential diagnosis of amenorrhea. It is
also intended for monitoring of ovulation
induction with and without stimulation in
assisted reproductive technology (ART).
Catalog Numbers: KE2D1 (100 tubes).
The 100-tube kit contains less
than 3.5 microcuries
(130 kilobecquerels) of
125
radioactive I-estradiol.
Summary and Explanation
Estradiol (estradiol-17β, E2) is a steroid
hormone with a molecular mass of 272.3
daltons which circulates predominantly
protein-bound. In addition to estradiol,
other natural steroidal estrogens include
estrone, estriol and their conjugates.
Natural estrogens are hormones secreted
principally by the ovarian follicles and also
by the adrenals, corpus luteum, placenta
and, in males, by the testes. Exogenous
estrogens (natural or synthetic) elicit, to
varying degrees, all the pharmacologic
responses usually produced by
endogenous estrogens.
Estrogenic hormones are secreted at
varying rates during the menstrual cycle
throughout the period of ovarian activity.
During pregnancy, the placenta becomes
the main source of estrogens. At
menopause, ovarian secretion of
estrogens declines at varying rates. The
gonadotropins of the anterior pituitary
regulate secretion of the ovarian
hormones, estradiol and progesterone;
hypothalamic control of pituitary
gonadotropin production is in turn
regulated by plasma concentrations of the
estrogens and progesterone. This
complex feedback system results in the
cyclic phenomenon of ovulation and
menstruation.
2
Estradiol determinations have proved of
value in a variety of contexts, including the
investigation of precocious puberty in girls
and gynecomastia in men. Its principal
uses have been in the differential
diagnosis of amenorrhea and in the
monitoring of ovulation induction.
Principle of the Procedure
Double Antibody Estradiol procedure is a
sequential radioimmunoassay in which the
patient sample is preincubated with anti125
estradiol antiserum. I-labeled estradiol
then competes with estradiol in the patient
sample for antibody sites. After incubation
for a fixed time, separation of bound from
free is achieved by the PEG-accelerated
double-antibody method. Finally, the
antibody-bound fraction is precipitated and
counted. Patient sample concentrations
are read from a calibration curve.
Reagents to Pipet: 3
Total Incubation Time: 3 Hours
Total Counts at Iodination:
Approximately 50,000 cpm
Separation: The ready-to-use
Precipitating Solution combines second
antibody and dilute PEG.
Warnings and Precautions
For in vitro diagnostic use.
Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator
designated for incoming radioactive
materials. Dispose of in accordance with
applicable laws.
Do not use reagents beyond their
expiration dates.
Some components supplied in this kit may
contain human source material and/or
other potentially hazardous ingredients
which necessitate certain precautions.
Follow universal precautions, and handle
all components as if capable of
transmitting infectious agents. Source
materials derived from human blood were
tested and found nonreactive for syphilis;
for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis
B surface antigen; and for antibodies to
hepatitis C.
Double Antibody Estradiol (PIKE2D-9, 2010-10-26)
Sodium azide, at concentrations less than
0.1 g/dL, has been added as a
preservative. On disposal, flush with large
volumes of water to prevent the buildup of
potentially explosive metal azides in lead
and copper plumbing.
Water: Use distilled or deionized water.
Radioactivity
A copy of any radioisotope license
certificate (Specific or General) issued to a
US customer must be on file with Siemens
Healthcare Diagnostics before kits or
components containing radioactive
material can be shipped. These
radioactive materials may be acquired by
any customer with the appropriate Specific
license. Under a General license these
radioactive materials may be acquired
only by physicians, veterinarians in the
practice of veterinary medicine, clinical
laboratories and hospitals — and strictly
for in vitro clinical or laboratory tests not
involving external or internal
administration of the radioactive material
or its radiation to human beings or other
animals. Its acquisition, receipt, storage,
use, transfer and disposal are all subject
to the regulations and a (General or
Specific) license of the U.S. Nuclear
Regulatory Commission or a State with
which the NRC has entered into an
agreement for the exercise of regulatory
control.
Handle radioactive materials according to
the requirements of your General or
Specific license. To minimize exposure to
radiation, the user should adhere to
guidelines set forth in the National Bureau
of Standards publication on the Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
and in subsequent publications issued by
State and Federal authorities.
Wipe up spills promptly and
decontaminate affected surfaces. Avoid
generation of aerosols. Dispose of solid
radioactive waste according to license
requirements. General licensees (holders
of NRC Form 483) may dispose of solid
radioactive waste as nonradioactive
waste, after removing labeling. Specific
licensees (NRC Form 313) should refer to
Title 10, Code of Federal Regulations,
Part 20. Licensees in Agreement States
should refer to the appropriate regulations
of their own state. General licensees may
dispose of liquid radioactive waste of the
type contained in this product through a
laboratory sink drain. Licensees must
remove or deface labels from empty
containers of radioactive materials before
disposal of solid waste. Specific licensees
may dispose of small quantities of liquid
radioactive waste of the type used in this
product through a laboratory sink drain.
Refer to the appropriate regulations
applicable to your laboratory.
Materials Supplied:
Initial Preparation
Estradiol Antiserum (E2D1)
Lyophilized estradiol antiserum, raised in
rabbits. At least 10 minutes before use,
reconstitute each vial by adding 10 mL
distilled water. Mix by gentle inversion.
Stable at 2–8°C for 30 days after
reconstitution. Color: blue.
KE2D1: 1 vial (E2D1).
125
I Estradiol (E2D2)
Iodinated synthetic estradiol in liquid form,
ready to use. Each vial contains 11 mL.
Stable at 2–8°C for 30 days after opening,
or until the expiration date marked on the
label.
KE2D1: 1 vial.
Do not transfer the tracer to a plastic
container. Estradiol has a strong tendency
to adsorb to untreated plastic surfaces.
Accordingly, it is important to use
containers made of glass rather than
plastic for the tracer transferred from its
original container.
Estradiol Calibrators (E2D3–9)
Seven silanized glass vials, labeled A
through G, of estradiol calibrators, with
preservative. The calibrators are supplied
in liquid form, ready to use. The zero
calibrator A contains 6 mL, and the
remaining calibrators B through G contain
3 mL each. Stable at 2–8°C for 30 days
after opening. For longer storage, aliquot
and freeze in tightly capped silanized
glass tubes: stable at –20°C for 6 months.
Avoid repeated thawing and freezing.
KE2D1: 1 set.
The calibrators contain, respectively, 0, 5,
10, 20, 50, 150 and 500 picograms of
synthetic estradiol per milliliter (pg/mL) in
processed human serum; equivalently, 0,
0.02, 0.04, 0.07, 0.18, 0.55 and
3
1.84 nanomoles per liter (nmol/L).
Intermediate calibration points may be
obtained by mixing calibrators in suitable
proportions just before assay.
Precipitating Solution (N6)
Precipitating Solution consisting of goat
anti-rabbit gamma globulin (GARGG) and
dilute PEG in saline. The Precipitating
Solution is supplied in liquid form, ready to
use. Stable at 2–8°C for 30 days after
opening. Since a fine precipitate may form
after refrigeration, the precipitating
solution should be thoroughly mixed
before use, without foaming. Color: blue.
KE2D1: 1 vial × 110 mL (N6).
Materials Required But Not
Provided
Gamma counter
Centrifuge — preferably refrigerated and
capable of at least 1500xg
Vortex mixer
Reagent Preparation
Distilled or deionized water
Pipets: 10 mL
Radioimmunoassay
Plain 12x75 mm polypropylene tubes –
available from Siemens Healthcare
Diagnostics (catalog number: PPO).
Micropipets: 100 µL, 200 µL and 1.0 mL
Foam decanting rack – available from
Siemens Healthcare Diagnostics (catalog
number: FDR).
by the laboratory; hence the results should
be interpreted with caution.
Blood collection tubes from different
manufacturers may yield differing values,
depending on materials and additives,
including gel or physical barriers, clot
activators and/or anticoagulants. Double
Antibody Estradiol has not been tested
with all possible variations of tube types.
Volume Required: 200 µL of serum per
tube.
Storage: 2 days at 2–8°C or up to
20
2 months frozen at –20°C.
Before assay, allow the samples to come
to room temperature (15–28°C) and mix
by gentle swirling or inversion. Aliquot, if
necessary, to avoid repeated thawing and
freezing. Do not attempt to thaw frozen
specimens by heating them in a
waterbath.
It is recommended that samples be
collected as serum. EDTA plasma yields
results nearly as high as serum, but
heparinized plasma yields results which
are significantly lower.
Significant variations in total protein
concentration may have an effect on the
assay.
Radioimmunoassay Procedure
All components except the Precipitating
Solution must be at room temperature
(15–28°C) before use.
1
Logit-log graph paper
A tri-level, human serum-based
immunoassay control, containing estradiol
as one of over 25 assayed constituents, is
available from Siemens Healthcare
Diagnostics (catalog number: CON6).
Label eighteen tubes in duplicate: T
(total counts), NSB (nonspecific
binding), A (maximum binding), and B
through G. Label additional tubes,
also in duplicate, for serum samples
and controls.
Calibrators
pg/mL
A (MB)
0
0
Specimen Collection
B
5
0.02
The patient need not be fasting, and no
special preparations are necessary.
21
Collect blood by venipuncture into plain
tubes, noting the time of collection, and
separate the serum from the cells.
C
10
0.04
D
20
0.07
E
50
0.18
F
150
0.55
Lipemia may interfere with the assay. The
use of an ultracentrifuge is recommended
to clear lipemic samples.
G
500
1.84
Hemolyzed samples may indicate
mistreatment of a specimen before receipt
4
2
nmol/L
Pipet 200 µL of the zero calibrator A
into the NSB and A tubes, and 200 µL
of each of the remaining calibrators B
through G into correspondingly
labeled tubes. Pipet 200 µL of each
control and patient serum sample into
the tubes prepared.
It is good practice to use a disposabletip micropipet, changing the tip
between samples, in order to avoid
carryover contamination.
Patient samples expected to contain
estradiol concentrations greater than
the highest calibrator (500 pg/mL)
should be diluted in the zero calibrator
before assay.
3
Add 100 µL of Estradiol Antiserum
(Blue) to all tubes except NSB and T
tubes. Vortex.
A repeating dispenser is
recommended for this step and for the
the addition of tracer at step 5.
4
Incubate for 2 hours at room
temperature (15–28°C).
5
Add 100 µL of
tubes. Vortex.
125
I Estradiol to all
Remove the T tubes for counting at
step 11; they require no further
processing.
6
Incubate for 1 hour at room
7
Add 1.0 mL of cold Precipitating
Solution (Blue) to all tubes. Vortex.
For the 1.0 mL reagent addition, a
repeating dispenser may be
employed.
8
Incubate for 10 minutes at room
9
Centrifuge for 15 minutes at 3000xg –
or for a suitably longer period of time
at a lower acceleration, e.g.
30 minutes at 1500xg.
10 Using a foam decanting rack, decant
(or aspirate) the supernatant, retaining
the precipitate for counting.
Let the tubes stand inverted on
absorbant paper for 10 minutes. Then
tap the tubes gently and blot the rims,
to remove residual droplets.
11 Count each tube for 1 minute.
Calculation of Results
To obtain results in terms of concentration
from a logit-log representation of the
calibration curve, first calculate for each
pair of tubes the average NSB-corrected
counts per minute:
Net Counts = (Average CPM) minus (Average
NSB CPM)
Then determine the binding of each pair of
tubes as a percent of maximum binding
(MB), with the NSB-corrected counts of
the A tubes taken as 100%:
Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts)
× 100
(The calculation can be simplified by
omitting the correction for nonspecific
binding; samples within range of the
calibrators yield virtually the same results
when Percent Bound is calculated directly
from Average CPM.)
Using logit-log graph paper, plot Percent
Bound on the vertical (probability) axis
against Concentration on the horizontal
(logarithmic) axis for each of the nonzero
calibrators, and draw a straight line
approximating the path of these points.
Results for the unknowns may then be
read from the line by interpolation.
It is good practice to inspect results for
agreement within replicates, and to
construct a graph of the calibration curve
(even if the calculations are handled by
computer) as a visual check on the
appropriateness of the transformation
used and as a way to detect deviant
calibration points.
QC Parameters: We recommend keeping
track of these performance measures:
T = Total Counts (as counts per minute)
%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Net Counts / Total Counts)
And the 20, 50 and 80 percent
"intercepts," where
20% = Concentration at 20 Percent Bound, etc.
Note that other approaches, e.g. a sound
implementation of the 4-parameter logistic,
are also acceptable. See Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71.
5
Example Run: For illustration only, not for
calculating results from another run. (See
"Example Run" table.)
Quality Control
Controls (or serum pools) with at least two
estradiol concentration levels — low and
high — should routinely be assayed as
unknowns.
Report patient results only if the control
results for that assay meet your
laboratory's established criteria for
acceptability.
It is good laboratory practice to record for
each assay the lot numbers of the
components used, as well as the dates
when they were first reconstituted or
opened. We also recommend charting
control results from day to day — as
described, for example, in Westgard JO,
et al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Note that
repeat samples can serve as a valuable
additional tool for monitoring interassay
precision, and that pairs of control tubes
can be spaced throughout the assay to
help verify the absence of significant drift.
The procedure calls for centrifuging at
3000xg for 15 minutes. Lower
accelerations are satisfactory only if the
centrifugation time is increased
appropriately – for example, to 30 minutes
at 1500xg. A high-speed, refrigerated
centrifuge is desirable but not essential.
Use the formulas below to calculate the
acceleration of your centrifuge at a given
speed, or the speed (in revolutions per
minute) required to achieve a desired g
force.
g force = 28.38 × (rpm / 1,000)2 × radius [inches]
rpm = 187.7 × √(g force / radius [inches])
or
g force = 11.18 × (rpm / 1,000)2 × radius [cm]
Expected Values
A reference range study performed with
Double Antibody Estradiol kit yielded the
following results in pg/mL.
Group
Median
Central
95%
Range
Absolute
Range
n
Females
Ovulating Females:
Follicular Phase
48
—
9–175
17
Luteal Phase
103
—
44–196
19
Periovulatory
209
—
107–281
9
Treated
Postmenopausals
122
—
42–289
12
Untreated
Postmenopausals
7.4
—
ND–19
13
Oral
Contraceptives
13
ND–91
ND–100
49
19
3–70
<5–93
49
Males
ND: Not detectable.
Consider these limits as guidelines only.
Each laboratory should establish its own
reference ranges.
Limitation
Samples from patients who are
undergoing estrogen replacement therapy
should be extracted before assaying for
estradiol. Contact Siemens Healthcare
Diagnostics if information on extraction
procedures is required.
The Double Antibody Estradiol assay is
calibrated gravimetrically in that the
estradiol concentration of the stock
solution used to prepare the calibrators is
determined by measuring the optical
density at 282 nm (E = 2,100 and MW =
272.4). The assay has not been
standardized using GC/MS derived
values, and therefore values observed
with the assay may not be in agreement
with those derived by GC/MS analysis.
rpm = 299.1 × √(g force / radius [cm])
Performance Data
See Tables and Graphs for data
representative of the Double Antibody
Estradiol kit's performance. Except as
noted, results in the sections below were
obtained on serum samples. Results are
expressed as pg/mL.
Conversion Factor:
pg/mL × 0.003671 → nmol/L
6
Calibration Range: 5 – 500 pg/mL
(0.02 – 1.84 nmol/L)
Analytical Sensitivity: 1.4 pg/mL
Intraassay Precision (Within-Run): A
precision profile, based on approximately
20 degrees of freedom and depicting the
intraassay CVs to be expected for
samples assayed in duplicate, is
displayed. (See "Precision Profile" graph.)
Interassay Precision (Run-to-Run):
Statistics were calculated for samples
from the results of pairs of tubes in 21
different assays. (See "Interassay
Precision" table.)
End-of-Run Effect: None up to
approximately 200 tubes. (See "End-ofRun Effect" table.)
Specificity: The antiserum was generated
with estradiol derivative at 3- position, and
is highly specific for estradiol with an
extremely low crossreactivity to other
naturally occurring steroids or therapeutic
drugs that may be present in patient
samples.
Caution should be used in assaying
pregnancy samples for estradiol, since the
level of estriol in circulation may then be
high enough to interfere; although some
other steroids exhibit slight crossreactivity,
their normal physiological concentrations
are too low compared to estradiol to cause
significant interference in the Double
Antibody Estradiol procedure. Likewise,
caution should be exercised in assaying
samples from neonates, since
crossreacting steroids circulating at high
concentrations in the neonatal period may
cause spuriously elevated results.
Ethinylestradiol [1,3,5(10)-estratrien-17αethinyl-3,17β-diol] and norethindrone are
compounds often used in oral
contraceptive preparations. These
compounds and a number of their
derivatives were also assayed. The results
show that these compounds should have
no clinically significant effect at levels
typically encountered in circulation. (See
"Specificity" table.)
Linearity: Samples were assayed under
various dilutions. (See "Linearity" table.)
Bilirubin: Presence of bilirubin in
concentrations up to 200 mg/L has no
effect on results, within the precision of the
assay.
Hemolysis: Presence of packed red blood
cells in concentrations up to 15 µL/mL has
no effect on results, within the precision of
the assay.
Method Comparison: Nineteen patient
serum samples were assayed by the
Double Antibody Estradiol procedure and
by Coat-A-Count Estradiol, a solid-phase
radioimmunoassay based on antibodycoated tubes. By linear regression:
(DAb) = 1.1 (CAC) – 15 pg/mL
r = 0.955
Means:
40 pg/mL (Double Antibody)
50 pg/mL (Coat-A-Count)
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ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 1994. 21)
National Committee for Clinical Laboratory
Standards. Procedures for the collection of
diagnostic blood specimens by venipuncture;
approved standard. 4th ed. NCCLS Document
H3-A4, Wayne, PA: NCCLS, 1998.
Technical Assistance
In the United States, contact Siemens
Healthcare Diagnostics Technical
Services department. Tel: 877.229.3711.
To place an order: Tel: 800.255.3232.
Outside the United States, contact your
National Distributor.
www.siemens.com/diagnostics
The Quality System of Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. is certified to ISO 13485:2003.
8
Tables and Graphs
Example Run
Tube1
Duplicate Average
CPM2
CPM3
Net
CPM4
Percent Estradiol
Bound5 pg/mL6
34,817
34,583
34,700
526
522
524
0
A(MB)9
13,984
13,929
13,957
13,433
100%
0
B
12,437
12,269
12,353
11,829
88.1%
5
C
11,344
11,322
11,333
10,809
80.5%
10
D
9,947
9,938
9,943
9,419
70.1%
20
E
7,557
7,530
7,544
7,020
52.3%
50
F
4,971
4,886
4,929
4,405
32.8%
150
G
2,664
2,617
2,641
2,117
15.8%
500
T7
NSB
8
10
Unknowns
X1
8,310
8,107
8,209
7,685
57.2%
41
X2
5,526
5,460
5,493
4,969
37.0%
115
X3
3,624
3,571
3,598
3,074
22.9%
271
Quality Control Parameters:11
T7 = 34,700 cpm
%NSB8 = 1.5%
%MB9 = 39%
20% Intercept12 = 339 pg/mL
50% Intercept = 60 pg/mL
80% Intercept = 10.5 pg/mL
Precision Profile
Interassay Precision (pg/mL)
Mean1
SD2
CV3
1
76
3.7
4.9%
2
163
5.7
3.5%
3
465
25.4
5.5%
End-of-Run Effect (pg/mL)
1
Tubes
59-66
Tubes Tubes Tubes Tubes
115-122 169-176 225-232 253-260
Compound1
ng/mL Apparent. % CrossAdded2 pg/mL3 reactivity4
1,3,5(10)-Estratrien-17αmethyl-3,17β- diol 3methyl ether
50
1,741
3.5%
5(10)-Estren-17α-ethinyl17β-ol-3-one
50
71.0
0.14%
4-Estren-17α-ethinyl-17βol-3-one acetate
50
ND
ND
4-Estren-17α-methyl-17βol-3-one
100
578
0.578%
4-Estren-17β-ol-3-one
100
1,745
1.745%
Estriol
160
376
0.235%
Estriol-16α-glucuronide
10,000
96
ND
115
0.012%
1
101
99
101
89
96
2
154
149
165
159
160
Estriol-3-glucuronide
1,000
3
346
301
306
328
310
Estriol-3-sulfate
Specificity
Compound1
ng/mL Apparent. % CrossAdded2 pg/mL3 reactivity4
Aldosterone
160
ND
ND
5α-Androstan-3,17-dione
160
2.0
0.001%
5-Androsten-3β,17β-diol
100,000
65.9
ND
Androstenedione
100,000
3,570
0.004%
Corticosterone
Cortisone
Danazol
11-Deoxycortisol
Dexamethasone
DHEA-SO4
100,000
4,000
29.1
ND
ND
100,000
ND
ND
4,000
1.6
ND
100,000
ND
ND
5,000
1.4
ND
100,000
476
ND
0.45
19.1
4.2%
Equilin
0.45
ND
ND
17α-Estradiol
100
ND
ND
50
ND
ND
17β-Estradiol-3β-Dglucuronide
5
300
6.0%
17β-Estradiol-17β-Dglucuronide
50
ND
ND
17β-Estradiol-3glucuronide-17-sulfate
50
ND
ND
0.45
1.9
0.43%
ND
β-Estradiol 17-propionate
17β-Estradiol-3-sulfate-17glucuronide
β-Estradiol 17-valerate
Ethiny-Estradiol
1,3,5(10)-Estratrien-17αethinyl-3,17β- diol
1,3,5(10)-Estratrien-17αethinyl-3,17β- diol 3-methyl
ether
83
ND
0.45
56.3
12.5%
Estrone β-D-glucuronide
0.45
7.2
1.6%
Estrone 3-sulfate
0.45
ND
ND
Ethisterone
100
ND
ND
19Hydroxyandrostenedione
1,000
7.7
ND
11β-Hydroxytestosterone
4,000
58.9
0.001%
11-Ketotestosterone
160
2.7
0.002%
Norethindrone
100
ND
ND
Norgestrel
100
ND
ND
50
ND
ND
1,000
6.5
ND
ND
d-Equilenin
5α-Dihydrotestosterone
10,000
Estrone
50
ND
0.45
ND
ND
20
10.1
0.051%
10
ND
ND
20,000
1,516
0.008%
100
874
0.87%
Prednisone
100
ND
ND
Progesterone
100,000
23.9
ND
Testosterone
100,000
63.6
ND
5β-Pregnan-3α-ol-20-one
ND: not detectable5
9
Linearity (pg/mL)
Dilution1 Observed2 Expected3
1
2
3
4
%O/E4
5
21.3
—
—
4 in 8
10.4
10.7
97%
2 in 8
5.5
5.3
104%
1 in 8
2.9
2.7
107%
8 in 8
42.9
—
—
4 in 8
20.3
21.5
94%
2 in 8
10.1
10.7
94%
1 in 8
5.7
5.4
106%
8 in 8
8 in 8
59.9
—
—
4 in 8
31.3
30.0
104%
2 in 8
13.5
15.0
90%
1 in 8
7.7
7.5
103%
8 in 8
112.7
—
—
4 in 8
61.4
56.4
109%
2 in 8
33.6
28.2
119%
1 in 8
15.6
14.1
111%
Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat
CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent
Bindung, 6Ca. Östradiol, pg/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Unbekannte,
11
Qualitätskontrollparameter, 1220% Intercept.
Interassay Precision: 1Mittelwert, 2S
(Standardabweichung), 3CV
(Variationskoeffizient). Linearity: 1Verdünnung,
2
Beobachtet (B), 3Erwartet (E), 4% B/E, 58 in 8.
Specificity: 1Verbindung, 2zugesetzte Menge,
3
Gemessene Konzentration, 4% Kreuzreaktivität,
5
NN: Nicht nachweisbar. End-of-Run Effect:
1
Röhrchen.
Español. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Media CPM, 4CPM Netas, 5Porcentaje de
unión, 6Estradiol, aprox., pg/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Desconocido, 11Parámetros del control
de calidad, 12Corte al 20%. Interassay
Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Linearity: 1
Dilución, 2Observado (O), 3Esperado (E),
4
%O/E, 58 en 8. Specificity: 1Compuesto,
2
Cantidad añadida, 3Concentración aparente, 4%
Reacción cruzada, 5ND: no detectable. End-ofRun Effect: 1Tubos.
Français. Example Run: 1Tube, 2Duplicate
CPM, 3CPM moyen, CPM corrigé, 5Pourcentage
lié, 6Approx. Estradiol, pg/mL, 7Total, 8%NSB,
9
%MB, 10Patients, 11Paramètres Contrôle de
Qualité, 1220% Intercept. Interassay Precision:
1
Moyenne, 2SD, 3CV. Linearity: 1Dilution,
2
Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A, 58 dans 8.
Specificity: 1Composé, 2ajouté, 3Concentration
apparente, 4Réaction croisée %. 5ND: non
détectable. End-of-Run Effect: 1Tubes.
10
Italiano. Example Run: 1Provetta, 2CPM in
duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti,
5
Percentuale di Legato, 6Appross. Estradiolo,
pg/mL, 7Totale, 8%NSB, 9%MB, 10Campioni non
Noti, 11Parametri per il Controllo di Qualità,
12
Intercetta al 20%. Interassay Precision:
1
Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV
(Coefficiente di Variazione). Linearity:
1
Diluizione, 2Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A,
5
8 in 8. Specificity: 1Composto, 2quantità
aggiunta, 3Concentrazione apparente,
4
Percentuale di Crossreattività, 5ND: non
determinabile. End-of-Run Effect: 1Provette.
Português. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado
CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem
de Ligação, 6Aprox. Estradiol, pg/mL, 7Total,
8
%NSB, 9%MB, 10Amostras Desconhecidas,
11
Parâmetros do controlo de qualidade, 1220%
Intercepção. Interassay Precision: 1Média,
2
Desvio padrão, 3Coeficiente de variação.
Linearity: 1Diluição, 2Observado (O), 3Esperado
(E), 4%O/E, 58 em 8. Specificity: 1Composto,
2
Quantidade adicionada, 3Apparent
Concentration, 4Percentagem de reacção
cruzada, 5ND: não detectável. End-of-Run
Effect: 1Tubos.
Deutsch
Östradiol Doppelantikörper RIA
Anwendung: Der Östradiol
125
Doppelantikörper I Radioimmunoassay
ist zum Gebrauch in der in vitro Diagnostik
zur quantitativen Bestimmung von
Östradiol im Serum zur Untersuchung von
vorzeitiger Pubertät bei Mädchen und
Gynäkomastie bei Männern, sowie zur
Differentialdiagnose der Amenorrhoe
konzipiert. Er ist ebenfalls geeignet zur
Beobachtung der unstimulierten und
stimulierten Ovulationsinduktion im
Rahmen der Fortpflanzungsmedizin.
Artikelnummern: KE2D1 (100 Tests)
Die Packung mit 100 Röhrchen
enthält weniger als 3,5 Microcurie
(130 Kilobequerel) an
125
radioaktivem I-markiertem Östradiol.
Klinische Relevanz
Östradiol ist ein Steroidhormon (MG:
272 D), das hauptsächlich in proteingebundener Form im menschlichen Serum
vorkommt. Zusätzlich finden sich im Blut
noch andere natürliche Östrogene, wie z.
B. Östron, Östriol und deren konjugierte
Verbindungen. Östrogene sind Hormone,
die in erster Linie im Ovar produziert
werden. Die Produktion kann aber auch in
der Nebenniere, im Corpus Luteum und
der Plazenta erfolgen. Männer
produzieren Östrogene im Hoden.
Östrogene werden während des
Menstruationszyklus in unterschiedlichen
Konzentrationen entsprechend der
ovariellen Aktivität produziert. Im Laufe
der Schwangerschaft übernimmt die
Plazenta weitgehend die
Östrogenproduktion. In der Menopause
wird die ovarielle Sekretion von
Östrogenen entscheidend reduziert. Die
Gonadotropine der Adenohypohyse
regulieren die Sekretion der ovariellen
Hormone: Östradiol und Progesteron. Die
Hypothalamuskontrolle der HypophysenGonadotropin-Ausschüttung wird mittels
Rückkopplung durch die
Plasmakonzentrationen der Östrogene
und des Progesterons gesteuert. Dieses
komplexe Rückkopplungssystem ist
verantwortlich für den Zyklus von
Ovulation und Menstruation.
Östradiol-Bestimmungen haben ihre große
Bedeutung in vielen Bereichen zeigen
können, einschließlich der Aufklärung
frühentwickelter Pubertät bei Mädchen
und der Vergrößerung der männlichen
Brustdrüse (Gynökomastie).
Hauptanwendungsgebiet ist die
Differenzialdiagnose des Ausbleibens der
Regelblutung und der Beobachtung der
Ovulation.
Methodik
Der Östradiol Doppelantikörper RIA ist ein
sequenzieller Radioimmunoassay in dem
die Patientenprobe mit dem Anti-Östradiol
125
Antiserum vorinkubiert. I-markiertes
Östradiol konkurriert dann mit dem
Östradiol in der Patientenprobe um eine
limitierte Zahl von Antikörpern. Nach einer
definierten Inkubationszeit werden die
gebundenen Komponenten von den freien
durch die PEG-vermittelte
Doppelantikörper Methode getrennt. Am
Ende wird die Antikörper-gebundene
Fraktion präzipitiert und gemessen. Die
Konzentrationen in den Patientenproben
werden an einer Standardkurve
abgelesen.
Zu pipettierende Reagenzien: 3
Testdauer: 3 Stunden
Totalaktivität zum Zeitpunkt der
Markierung: Ca. 50 000 cpm
Trennung: Die gebrauchsfertige
Präzipitationslösung enthält eine
Kombination aus 2. Antikörper und
verdünntem PEG.
Hinweise und
Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnostik.
Reagenzien: Die Packung mit den
Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem
Kühlschrank gelagert werden, der für
radioaktives Material ausgewiesen ist. Die
Entsorgung muss nach den jeweils
gültigen Gesetzen erfolgen.
Die Reagenzien dürfen nur bis zum
Verfallsdatum verwendet werden.
Einige Komponenten des Kits können
Material humanen Ursprungs und/oder in
anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe
enthalten, die es unbedingt notwendig
machen die folgenden
Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten.
Die generell geltenden
Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten
und alle Komponenten als potenziell
infektiös zu behandeln. Alle aus
menschlichem Blut gewonnenen
Materialien wurden auf Syphilis,
Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2,
Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
Hepatitis-C-Antikörper untersucht und
negativ befundet.
Bestimmten Komponenten wurde
Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um
die Bildung von explosiven Metallaziden in
Blei- und Kupferrohren zu vermeiden,
sollten die Reagenzien nur zusammen mit
großen Wassermengen in die Kanalisation
gespült werden.
Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes
Wasser benutzen
Radioaktivität
Der Umgang mit radioaktivem Material ist
in Deutschland genehmigungspflichtig.
Deshalb muss der Siemens Healthcare
Diagnostics eine Kopie der aktuellen
gültigen Umgangsgenehmigung des
Kunden vorliegen, bevor radioaktive
Reagenzien versendet werden dürfen. Die
Strahlenschutzverordnung ist zu
beachten.
11
Das radioaktive Material ist gemäß der
jeweiligen Umgangsgenehmigung zu
handhaben.
Die Strahlenexposition ist zu minimieren.
Spritzer sind sofort aufzuwischen und die
betroffene Oberfläche zu dekontaminieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden.
Flüssiger und fester radioaktiver Abfall
sind unter Beachtung der gültigen
Richtlinien zu entsorgen.
Bestandteile der Testpackung:
Vorbereitung
Östradiol Antiserum (E2D1)
Lyophilisiertes Östradiol Antiserum, vom
Kaninchen. Mindestens 10 Minuten vor
dem Testbeginn, jede Flasche mit 10 ml
destilliertem Wasser rekonstituieren.
Durch vorsichtiges Umdrehen
durchmischen. Bei 2–8°C für 30 Tage
nach der Rekonstitution haltbar. Farbe:
Blau
KE2D1: 1 Flasche (E2D1).
Die Standards enthalten, 0, 5, 10, 20, 50,
150 und 500 pg/ml synthetisches Östradiol
in behandelten Humanserum, bzw., 0,
0,02, 0,04, 0,07, 0,18, 0,55 und
1,84 nmol/l. Weitere
Standardkurvenpunkte können durch
Mischen der Standards hergestellt
werden.
Präzipitierendes Reagenz (N6)
Präzipitierendes Reagenz enthält 2.
Antikörper (Ziege-Anti-Kaninchen-IgG,
GARGG) u. verdünntes PEG in
Kochsalzlösung. Das Präzipitierende
Reagenz wird gebrauchsfertig in flüssiger
Form geliefert. Bei 2–8°C bis 30 Tage
nach dem Öffnen haltbar. Falls nach der
Lagerung im Kühlen feine Präzipitate
auftreten, ist das Reagenz gründlich, ohne
Schaumbildung, zu schütteln. Farbe: Blau.
KE2D1: 1 Flasche × 110 ml (N6).
Erforderliche Laborgeräte und
Hilfsmittel
Gamma Counter
125
I Östradiol (E2D2)
Jodiertes synthetisches Östradiol in
flüssiger Form, gebrauchsfertig. Jede
Flasche enthält 11 ml. Bei 2–8°C für
30 Tage nach dem Öffnen oder bis zum
Verfallsdatum auf dem Etikett haltbar.
KE2D1: 1 Flasche.
Der Tracer darf nicht in Plastikbehälter
umgefüllt werden. Östradiol adsorbiert an
unbehandelte Plastikoberflächen. Es ist
deshalb darauf zu achten, dass die
Überführung des Tracers aus dem
Originalgefäß ausschließlich in
Glasbehälter erfolgt.
Östradiol Standards (E2D3–9)
7 silikonisierte Glasflaschen, A – G,
Östradiol Standards, mit
Konservierungsmitteln. Die Standards
werden in flüssiger Form, gebrauchsfertig,
geliefert. Der 0-Standard A enthält 6 ml,
und die restlichen Standards B – G
enthalten je 3 ml. Bei 2–8°C bis 30 Tage
nach dem Öffnen haltbar. Für eine längere
Lagerung, portionieren und in fest
verschlossenen silikonisierten
Glassröhrchen einfrieren: Bei –20°C für 6
Monate haltbar. Wiederholtes Auftauen
und Einfrieren vermeiden.
KE2D1: 1 Set.
12
Zentrifuge – vorzugsweise gekühlt für
1500xg
Wirbelmischer
Reagenzien Vorbereitung
Destilliertes oder deionisiertes Wasser
Pipetten: für 10 ml
Radioimmunoassay
Unbeschichtete 12x75 mm PolyprophylenRöhrchen – erhältlich bei Siemens
Healthcare Diagnostics (Artikelnummer:
PPO).
Mikropipetten: 100 µl, 200 µl und 1,0 ml
Dekantierständer – erhältlich bei Siemens
Healthcare Diagnostics (Artikelnummer:
FDR).
Logit-Log-Papier
Immunoassay-Kontrolle (> 25 Parameter,
3 Konzentrationen) (Artikelnummer:
CON6).
Probengewinnung
Es ist keine besondere Vorbereitung der
Patienten nötig. Blutentnahme durch
21
Venenpunktion in Röhrchen ohne
Zusatz, Zeitpunkt der Blutentnahme
notieren, Trennung des Serums von den
Blutzellen.
Lipämie kann mit dem Assay interferieren.
Der Einsatz einer Ultrazentrifuge wird zur
Klärung von lipämischen Proben
empfohlen.
Standards
pg/ml
A (MB)
0
0
B
5
0,02
Bei hämolysierten Proben besteht die
Möglichkeit einer unsachgemäßen
Handhabung vor Eintreffen im Labor,
daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu
interpretieren.
C
10
0,04
D
20
0,07
E
50
0,18
F
150
0,55
Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen
Herstellern können differierende Werte
verursachen. Dies hängt von den
verwendeten Materialien und Additiven
(Gel oder physische Trennbarrieren,
Gerinnungsaktivatoren und /oder
Antikoagulantien) ab. Double Antibody
Östradiol sind nicht mit allen möglichen
Röhrchenvariationen ausgetestet worden.
G
500
1,84
2
Erforderliche Menge: 200 µl of Serum
pro Röhrchen.
Die Proben vor Testbeginn auf
Raumtemperatur (15-28°C) bringen und
vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes
Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei
Bedarf portionieren. Gefrorene Proben
dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad
aufgetaut werden.
Patientenproben, in denen
Konzentrationen oberhalb des
höchsten Standards (500 pg/ml)
erwartet werden, sind mit 0-Standard
vor dem Einsatz in den Test zu
verdünnen.
3
Alle Testkomponenten, mit Ausnahme des
Präzipitierenden Reagenz, vor Testbeginn
auf Raumtemperatur (15–28°C) bringen.
1
Jeweils zwei Röhrchen mit T
(Totalaktivität), NSB (Unspezifische
Bindung), A (Maximale Bindung) und
B bis G beschriften. Jeweils 2
Röhrchen pro Serumprobe und
Kontrolle beschriften.
100 µl Östradiol Antiserum (Blau) in
alle Röhrchen, außer NSB und T
Röhrchen, hinzufügen. Mischen.
Für diesen Schritt und für die Zugabe
des Tracers in Schritt 5 wird die
Verwendung eines Dispensers
empfohlen.
Signifikante Schwankungen in Gesamt
Protein Konzentrationen können einen
Einfluss auf den Assay haben.
Testansatz und Durchführung
Jeweils 200 µl des 0-Standards A in
die NSB und A Röhrchen, und jeweils
200 µl der restlichen Standards in die
entsprechend beschrifteten Röhrchen
pipettieren. Jeweils 200 µl von jeder
Patientenserumprobe und Kontrolle in
die vorbereiteten Röhrchen
pipettieren.
Es ist gute Laborpraxis Pipetten mit
Einmalspitzen zu verwenden und die
Spitze von Probe zu Probe zu
wechseln um Verschleppung zu
vermeiden.
Lagerung: 2 Tage bei 2–8°C oder für bis
20
zu 2 Monaten gekühlt bei –20°C.
Es wird empfohlen die Proben als Serum
zu sammeln. EDTA Plasma erzielt
Ergebnisse, die fast genauso hoch sind
wie Serum, aber Heparin Plasma erzielt
Ergebnisse, die signifikant niedriger sind.
nmol/l
4
Für 2 Stunden bei Raumtemperatur
(15–28°C) inkubieren.
5
100 µl I Östradiol in alle Röhrchen
hinzufügen. Mischen.
125
Die T-Röhrchen bis zur Messung
(siehe Schritt 11) beiseite stellen; sie
bedürfen keiner weiteren Behandlung.
6
Für 1 Stunde bei Raumtemperatur
7
1,0 ml kaltes Präzipitierendes
Reagenz (Blau) in alle Röhrchen
hinzufügen. Mischen.
Für die 1,0 ml Reagenzienzugabe,
wird die Verwendung eines
Dispensers empfohlen.
13
8
Für 10 Minuten bei Raumtemperatur
9
15 Minuten bei 3000xg zentrifugieren
– oder entsprechend länger bei
niedrigerer Beschleunigung, z.B.
30 Minuten bei 1500xg.
10 Mit Hilfe eines Dekantierständers alle
Röhrchen (außer die T-Röhrchen)
dekantieren oder absaugen, das
Präzipitat zur Messung zurückhalten.
Röhrchen für 10 Minuten umgedreht
auf Fließpapier stehen lassen.
Anschließend werden die Röhrchen
vorsichtig ausgeklopft und abgestreift,
um alle restlichen Tröpfchen zu
entfernen.
11 Alle Röhrchen 1 Minute messen.
Berechnung der Ergebnisse
Um die Konzentrationen aus der Logit-Log
Darstellung der Standardkurve abzulesen
werden zunächst der Mittelwert der zwei
Röhrchen bereinigt um den Mittelwert der
NSB Counts pro Minute (cpm) berechnet:
Netto Counts = (Mittelwert CPM) minus
(Mittelwert NSB CPM)
Anschließend wird die Bindung jedes
Röhrchenpaars als Prozent der
Maximalbindung (MB, B0) bestimmt.
Hierzu werden die mittleren CPM des AStandards korrigiert um die mittlere NSB
als 100% gesetzt:
Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB
Counts) × 100
(Die Berechnung kann durch weglassen
der Korrektur um die NSB vereinfacht
werden. Für Proben innerhalb des
Standardbereichs werden nahezu
identische Konzentrationen berechnet,
wenn B/B0 direkt aus den CPM ermittelt
wird.)
Die so ermittelten B/B0 aller Standards
außer des 0-Standards werden auf der yAchse auf Logit-Log Papier gegen die
Konzentration auf der x-Achse
(logarithmisch) aufgetragen. Die Punkte
werden mit bestmöglicher Annäherung
durch eine gerade Linie verbunden. Die
Ergebnisse der unbekannten Proben
können dann durch Interpolation an der
Kurve abgelesen werden.
14
Es ist gute Laborpraxis die Ergebnisse der
Doppelbestimmung auf Übereinstimmung
zu prüfen und eine Grafik der
Standardkurve darzustellen (auch wenn
die eigentliche Berechnung durch ein
Computerprogramm erfolgt) um visuell zu
überprüfen, ob für die Standardkurve die
geeignete Transformation verwendet
wurde und um eventuell abweichende
Standardkurvenpunkte zu entdecken.
Qualitätskontrollparamter: Es wird
empfohlen, folgende Parameter der
Berechnung zu protokollieren:
T = Totalaktivität (als Counts pro Minute)
%NSB = 100 × (Mittelwert NSB Counts / Total
Counts)
%MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts)
und die 20, 50 und 80 Prozent
"intercepts," wobei
20% = Konzentration bei 20 Prozent Bindung,
etc.
Bitte beachten Sie, dass auch andere
Auswertungen z. B. nach der 4-Parameter-Logistik akzeptabel sind. Siehe:
Dudley RA, et al. Guidelines for
immunoassay data reduction. Clin Chem
1985;31:1264-71.
Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient
nur zur Veranschaulichung und ist nicht
dazu geeignet Werte aus einem anderen
Testansatz damit zu ermitteln. (siehe
Tabelle "Example Run").
Qualitätskontrolle
Es wird empfohlen Kontrollen mit
mindestens 2 Konzentrationen (niedrig
und hoch) an Östradiol routinemäßig als
unbekannte Proben einzusetzen.
Patientenergebnisse dürfen nur dann
freigegeben werden, wenn die
laborspezifischen Akzeptanzkriterien
erfüllt sind. Hierzu sind die jeweils gültigen
Richtlinien zu berücksichtigen.
Es ist gute Laborpraxis die
Chargennummern, sowie das Datum der
ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der
verwendeten Komponenten zu
protokollieren. Die wiederholte Messung
von Proben kann bei der Beurteilung der
Interassay Präzision hilfreich sein. Der
Einsatz von Kontrollprobenpaaren an
unterschiedlichen Positionen des
Testansatzes ist hilfreich, um einen
eventuellen Drift zu erkennen. Die
Durchführung erfordert eine Zentrifugation
bei 3000xg für 15 Minuten. Niedrigere
Beschleunigungen sind ebenfalls
akzeptabel, wenn die Zentrifugationszeit
verlängert wird, z. B. auf 30 Minuten bei
1500xg. Eine gekühlte
Hochgeschwindigkeitszentrifuge ist
empfehlenswert, aber nicht zwingend
notwendig. Mit den unten genannten
Formeln kann die Beschleunigung der
eingesetzten Zentrifuge bei einer
bestimmten Umdrehungszahl oder die
benötigte Umdrehungszahl
(Umdrehungen pro Minute) für die
erforderliche Zentrifugalbeschleunigung
berechnet werden.
g = 28,38 × (U/min / 1 000)2 × Radius [zoll]
extrahiert werden. Für weitere
Informationen zu dem
Extraktionsverfahren, bitte Siemens
Healthcare Diagnostics kontaktieren.
Der Östradiol Doppelantikörper Assay ist
gravimetrisch kalibriert in der Form, dass
die Östradiol Konzentration der StockLösung, die zur Herstellung der
Kalibratoren verwendet wird, durch
Messung der optischen Dichte bei 282 nm
(E=2 100 und MW=272,4) ermittelt wurde.
Der Assay wurde nicht durch Verwendung
von GC-MS ermittelten Werten
standardisiert, dementsprechend könnten
die mit diesem Assay ermittelten Werte
nicht in Übereinstimmung mit solchen
gefunden werden, die von einer GC-MS
Analyse abgeleitet sind.
U/min = 187,7 × √(g / Radius [zoll])
Leistungsdaten
oder
Im folgenden Abschnitt sind Daten
gezeigt, die für die Leistung des Östradiol
Doppelantikörper RIA repräsentativ sind.
Wenn nicht anders angegeben, sind die
Ergebnisse anhand von Serumproben
ermittelt worden. Die Ergebnisse sind in
pg/ml angegeben.
2
g = 11,18 × (U/min / 1 000) × Radius [cm]
U/min = 299,1 × √(g / Radius [cm])
Referenzwerte
In einer Referenzwertstudie mit dem
Östradiol Doppelantikörper RIA wurden
die folgenden Ergebnisse in pg/ml
gefunden.
Gruppe
Zentraler
95%
Median Bereich
Absolut
Bereich
Umrechnungsfaktor:
pg/ml × 0,003671 → nmol/l
n
Analytische Sensitivität: 1,4 pg/ml
Frauen
Ovulierende Frauen:
Follikel Phase
48
—
9–175
17
Luteal Phase
103
—
44–196
19
Periovulation
209
—
107–281
9
behandelte
Postmenopausale
122
—
42–289
12
unbehandelte
Postmenopausale
7.4
—
ND–19
13
13
ND–91
ND–100
49
19
3–70
<5–93
49
Orale
Kontrazeptiva
Männer
Messbereich: 5 – 500 pg/ml
(0,02 – 1,84 nmol/l)
ND: nicht nachweisbar
Diese Grenzwerte sind lediglich als
Richtlinien aufzufassen. Jedes Labor
sollte seine eigenen Referenzbereiche
etablieren.
Grenzen der Methode
Proben von Patienten, die sich einer
Östrogenersatz Therapie unterziehen,
sollten vor der Östradiol Bestimmung
Intraassay-Präzision: Ein Präzisionsprofil
auf der Basis von ca. 20 Freiheitsgraden,
in dem die erwarteten Intra-Assay VK´s für
Proben in Doppelbestimmung eingetragen
sind, wird gezeigt. (Siehe Grafik "Precision
Profile".)
Interassay-Präzision: Statistische
Berechnung der Ergebnisse von Proben,
die in 21 Röhrchenpaaren in
verschiedenen Ansätzen gemessen
wurden. (Siehe Tabelle „InterassayPrecision“.)
"End of Run" Effekt: Tritt bis ca.
200 Röhrchen nicht auf. (siehe Tabelle
"End-of-Run Effect").
Spezifität: Das Antiserum wurde mit
einem an der 3-Position derivatisierten
Östradiol hergestellt und ist hoch
spezifisch für Östradiol mit extrem
niedriger Kreuzreaktivität zu natürlich
vorkommenden Steroiden und
15
Medikamenten, die in Patientenproben
vorkommen können.
Seren von Schwangeren sollten wegen
hoher Östriol-Konzentrationen mit Vorsicht
interpretiert werden. Obwohl das
Antiserum auch mit einigen anderen
Steroiden gering kreuzreagiert, ist deren
normale physiologische Konzentration im
Vergleich zu Östradiol jedoch zu gering,
um die Ergebnisse zu beeinflussen.
Konzentrationen, die unterhalb der
Nachweisgrenze des Assays liegen,
wurden mit „nicht nachweisbar”
angegeben. In neonatalen Proben können
die hohen Konzentrationen der
kreuzreagierenden Steroide zu leicht
erhöhten Werten führen.
Ethinylöstradiol [1,3,5(10)-Östratrien-17αEthinyl-3,17β-diol] und Norethindron sind
Substanzen, die häufig in oralen
Kontrazeptiva enthalten sind. Diese
Substanzen und deren Derivate wurden
untersucht und die Ergebnisse zeigen,
dass sie im Kit nicht klinisch signifikant
interferieren. (siehe Tabelle „Specificity“.)
Linearität: Proben wurden in
verschiedenen Verdünnungen getestet.
(Siehe Tabelle "Linearity".)
Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentrationen
bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die
Ergebnisse, der größer als die Impräzision
des Assays selbst ist.
Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate
haben in Konzentrationen bis zu 15 µl/ml
keinen Einfluss auf die Messung, der
größer als die Impräzision des Assays
selbst ist.
Methodenvergleich: 19 Serumproben
wurden im Östradiol Doppelantikörper RIA
und im Coat-A-Count Östradiol, ein Festphasen-Radioimmunassay mit Antikörper
beschichteten Röhrchen, verglichen.
Berechung der linearen Regression:
(DA) = 1,1 (CAC) – 15 pg/ml
r = 0,955
Mittelwerte:
40 pg/ml (Doppelantikörper)
50 pg/ml (Coat-A-Count)
Anwendungsberatung
Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an
Ihre Niederlassung.
16
Das Qualitätsmanagement-System der Siemens
Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach
DIN EN ISO 13485:2003.
Español
Doble Anticuerpo Estradiol
Utilidad del análisis: El Estradiol Doble
Anticuerpo es un radioinmunoensayo con
125
I diseñado para el diagnóstico in vitro,
mediante la determinación cuantitativa de
estradiol en suero, de pubertad precoz en
chicas y ginecomastia en hombres, y para
la diagnosis diferencial de amenorreas.
También está indicado en la
monitorización de la inducción de la
ovulación, con o sin estimulación, en
técnicas de reproducción asistida.
Referencia: KE2D1 (100 tubos)
El kit de 100 tubos contiene
menos de 3,5 microcurios (130
kilobequerelios) de estradiol
125
marcado con I radiactivo.
Resumen y Explicación del
Test
El estradiol es una hormona esteroidea
con una masa molecular de 272,3 daltons,
la cual circula predominantemente unida a
proteínas. Además del estradiol, otros
estrógenos esteroideos naturales incluyen
la estrona, el estriol y sus conjugados. Los
estrógenos son hormonas secretadas
principalmente por los folículos ováricos y
también por las glándulas suprarrenales,
el cuerpo lúteo, la placenta, y en los
hombres por los testículos.
La secreción de las hormonas
estrogénicas varía durante el ciclo
menstrual durante todo el período de
actividad ovárica. Durante el embarazo, la
placenta se convierte en la fuente
principal de estrógenos. En la
menopausia, la secreción ovárica de
estrógenos decae de diferentes formas.
Las gonadotropinas de la hipófisis anterior
regulan la secreción de las hormonas
ováricas, del estradiol y de la
progesterona; a su vez, el control
hipotalámico de la producción de
gonadotropina hipofisiaria está regulado
por las concentraciones plasmáticas de
los estrógenos y la progesterona. Este
complejo sistema de retroalimentación da
lugar al fenómeno cíclico de ovulación y
menstruación.
Las determinaciones de estradiol han
demostrado ser útiles en una variedad de
contextos, incluyendo en la investigación
de la pubertad precoz en las niñas y de la
ginecomastia en los hombres. Se las ha
usado principalmente en el diagnóstico
diferencial de la amenorrea y para
controlar la inducción de la ovulación.
Principio del análisis
El procedimiento Doble Anticuerpo
Estradiol es un radioinmunoensayo
secuencial, en el cual la muestra del
paciente se incuba previamente con un
antisuero anti-estradiol. El estradiol
125
marcado con I compite con el estradiol
de la muestra del paciente por los sitios
de unión en los anticuerpos. Después de
incubar por un tiempo determinado, la
separación de la forma unida de la libre se
logra mediante un método de doble
anticuerpo acelerado por PEG.
Finalmente, la fracción unida al anticuerpo
se precipita y cuenta. Las concentraciones
en la muestra del paciente se leen a partir
de una curva de calibración.
Reactivos a pipetear: 3
Tiempo total de incubación: 3 horas
Cuentas totales en la iodización:
Aproximadamente 50 000 cpm
Separación: La Solución de Precipitación
lista para usar contiene el segundo
anticuerpo y PEG diluido.
Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro.
Reactivos: Almacenar a 2–8°C en una
cámara preparada para almacenar
material radiactivo. Desechar de acuerdo
a la legislación en vigor.
infecciosos. Los materiales derivados de
sangre humana han sido analizados y son
negativos para sífilis; para anticuerpos
frente al VIH 1 y 2; para el antígeno de
superficie de hepatitis B y para los
anticuerpos de hepatitis C.
Se ha usado Azida sódica, en
concentraciones menores de 0,1 g/dl,
como conservante. Para su eliminación,
lavar con grandes cantidades de agua
para evitar la constitución de residuos de
azidas metálicas, potencialmente
explosivas, en las cañerías de cobre y
plomo.
Agua: Usar agua destilada o desionizada
Radiactividad
Una copia de cualquier certificado de
licencia de radioisótopos (específico o
general) emitido a la aduana de los
EE.UU. se registrará en los ficheros de
Siemens Healthcare Diagnostics antes de
que se puedan enviar kits o componentes
conteniendo material radiactivo. Estos
materiales radiactivos pueden adquirirse
por cualquier cliente con la licencia
específica apropiada. Con una licencia
general, estos materiales radiactivos
pueden adquirirse solo por médicos,
veterinarios en la práctica de la medicina
veterinaria, laboratorios clínicos y
hospitales — y estrictamente para la
clínica in vitro o tests de laboratorio que
no conlleven la administración interna o
externa de material radiactivo o su
radiación a humanos u otros animales. Su
adquisición, recepción, almacenaje, uso,
trasferencia y desecho están regulados y
se expenderá una licencia (general o
específica) de la Comisión Nuclear de
EE.UU. o de un Estado con el NRC para
su consiguiente control.
Algunos componentes suministrados en el
kit pueden contener material de origen
humano y/o otros componentes
potencialmente peligrosos que necesitan
ciertas precauciones.
Manejar los materiales radiactivos de
acuerdo a los requerimientos de su
licencia general o específica. Para
minimizar la exposición a la radiación, el
usuario debe adherirse al cuarto conjunto
de guías publicadas por el National
Bureau of Standards con el nombre Safe
Handling of Radioactive Materials
(Handbook No. 92, issued March 9, 1964)
y en las consiguientes publicaciones de
las autoridades Federales o Estatales.
Siga las precauciones universales y
manipule todos los componentes como si
fueran capaces de transmitir agentes
Limpiar y decontaminar rápidamente las
superficies afectadas. Evitar la generación
de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos
No usar los reactivos después de su fecha
de caducidad.
17
radiactivos de acuerdo con los
requerimientos de su licencia. Licencias
generales (NRC Form 483) pueden
eliminar sus residuos sólidos radiactivos
como residuos no radiactivos, después de
retirar las etiquetas. Licencias específicas
(NRC Form 313) se deben referir al Título
10, Código de Regulaciones Federales,
Parte 20. Las licencias en Estados
Asociados deben referirse a las
normativas de su correspondiente Estado.
Licencias generales pueden eliminar sus
residuos líquidos radiactivos contenidos
en este tipo de productos como cualquier
otro material líquido, quitando las
etiquetas de los contenedores y
procesándolos como residuos sólidos.
Licencias específicas pueden eliminar
pequeñas cantidades de residuos líquidos
radiactivos contenidos en este tipo de
productos como cualquier otro material
líquido. Refiérase a la normativa aplicable
a su laboratorio.
Materiales Suministrados:
Preparación Inicial
Antisuero para Estradiol (E2D1)
Antisuero liofilizado para estradiol de
conejo. 10 minutos, como mínimo, antes
de su uso: reconstituir cada vial con 10 ml
de agua destilada o desionizada. Mezclar
por inversión suave. Estable a 2–8°C
durante 30 días tras su reconstitución.
Color: azul.
KE2D1: 1 vial (E2D1).
125
I Estradiol (E2D2)
125
Estradiol sintético marcado con I en
forma líquida y listo para usar. Cada vial
contiene 11 ml. Estable a 2–8°C durante
30 días después de su apertura, o hasta
la fecha de caducidad impresa en la
etiqueta.
KE2D1: 1 vial.
No transferir el trazador a un recipiente de
plástico. El estradiol tiene una fuerte
tendencia a adsorberse a las superficies
de plástico no tratadas. Por ello, es
importante usar recipientes de vidrio y no
de plástico para el trazador, si se lo va a
transferir de su recipiente original.
Calibradores de estradiol (E2D3–9)
Siete viales de vidrio siliconados de
calibradores de estradiol, marcados A –
G, con conservante. El calibrador cero A
18
contiene 6 ml, y los calibradores
restantes, viales B – G, contienen cada
uno 3 ml. Estable a 2–8°C durante 30 días
después de su apertura. Para almacenar
por más tiempo, alicuotar y congelar en
tubos de vidrio siliconados bien cerrados.
Estable a –20°C durante 6 meses. Evitar
la repetición de congelación y
descongelación.
KE2D1: 1 juego.
Los calibradores contienen
respectivamente: 0, 5, 10, 20, 50, 150 y
500 picogramos de estradiol sintético por
mililitro (pg/ml) en suero humano
procesado; equivalentemente: 0, 0,02,
0,04, 0,07, 0,18, 0,55 y 1,84 nanomoles
por litro (nmol/l). Los puntos de calibración
intermedios pueden obtenerse mezclando
los calibradores en las proporciones
adecuadas.
Solución de Precipitación (N6)
Solución de Precipitación que consiste de
globulina de cabra anti-conejo y PEG en
solución salina. La Solución de
Precipitación se suministra en forma
líquida, lista para usar. Estable a 2–8°C
durante 30 días después de su apertura.
Debido a que después de refrigerar se
puede formar un precipitado fino, la
solución de precipitación deberá
mezclarse bien antes de usar, sin crear
espuma. Color: azul.
KE2D1: 1 vial × 110 ml (N6).
Materiales Requeridos pero no
suministrados
Contador Gamma
Centrífuga – preferiblemente refrigerada y
capaz de producir por lo menos 1500 xg
Vortex
Preparación de los reactivos
Agua destilada o desionizada
Pipetas: 10 ml
Radioinmunoanálisis
Tubos de ensayo de polipropileno de
12 x 75 mm, disponibles en Siemens
Healthcare Diagnostics (Referencia:
PPO).
Micropipetas: 100 µl, 200 µl y 1,0 ml
Gradilla de decantación – disponible en
Siemens Healthcare Diagnostics
(Referencia: FDR).
Papel gráfico Logit-log
Un control de inmunoensayo de tres
niveles con base de suero humano,
conteniendo estradiol junto con más de
otros 25 analitos que puede obtenerse en
(Referencia: CON6).
Procedimiento del
Radioinmunoanálisis
Todos los componentes, excepto la
Solución de Precipitación, deben llevarse
a temperatura ambiente (15–28°C) antes
de usar.
1
Recogida de la muestra
El paciente no necesita estar en ayunas
así como tampoco cualquier otro tipo de
preparación. Recoger la sangre por
21
venipunción en tubos no tratados, y
separar el suero de las células registrando
la hora en que se tomó la muestra.
La lipemia puede interferir con el ensayo.
Se recomienda el uso de una
ultracentrífuga para aclarar las muestras
lipémicas.
Las muestras hemolizadas podrían indicar
una mala manipulación de las muestras
antes de ser recibidas por el laboratorio;
en este caso, los resultados deben
interpretarse con precaución.
Los tubos para recoger sangre de
distintos fabricantes pueden producir
valores diferentes, dependiendo del
material del tubo y de los aditivos,
incluyendo barreras de gel o barreras
físicas, activadores de la coagulación y/o
anticoagulantes. El Estradiol Double
Antibody no ha sido analizado con todos
los distintos tipos de tubos.
2
Conservación: 2 días a 2–8°C o 2
20
meses (congeladas) a –20°C.
pg/ml
A (MB)
0
nmol/l
0
B
5
0,02
C
10
0,04
D
20
0,07
E
50
0,18
F
150
0,55
G
500
1,84
Pipetear 200 µl del calibrador cero A
en los tubos NSB y A, y 200 µl de
cada uno de los calibradores
restantes B a G en tubos
correspondientemente marcados.
Pipetear 200 µl de cada muestra de
suero del paciente y control en los
tubos preparados.
Las muestras de los pacientes que se
espera que contengan
concentraciones de estradiol mayores
que la del calibrador más alto
(500 pg/ml) se deberán diluir con el
calibrador cero antes del ensayo.
3
Se recomienda recolectar las muestras
como suero. El plasma con EDTA produce
resultados casi tan altos como el suero,
pero el plasma heparinizado da resultados
significativamente más bajos.
Las variaciones significativas en la
concentración de proteína total pueden
tener un efecto sobre el ensayo.
Calibradores
Es una buena práctica el uso de
micropipetas con punta desechables,
cambiando las puntas entre las
muestras, para evitar la
contaminación por arrastre.
Volumen requerido: 200 µl suero por
tubo.
Antes del ensayo, llevar todas las
muestras a temperatura ambiente (15–
28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si
es necesario, para evitar la repetición de
congelación y descongelación. No intentar
la descongelación de muestras
congeladas calentándolas en un baño de
agua.
Marcar dieciocho tubos por duplicado:
T (cuentas totales), NSB (unión no
específica), A (unión máxima) y B a
G. Marcar tubos adicionales, también
por duplicado, para los controles y las
muestras de suero.
Añadir 100 µl de Antisuero para
estradiol (azul) a todos los tubos,
excepto a los tubos NSB y T. Mezclar
en el Vortex.
Para este paso y para añadir el
trazador en el paso 5 se recomienda
usar un dispensador de repetición.
4
Incubar durante 2 horas a
temperatura ambiente (15–28°C).
19
5
125
Añadir 100 µl de I Estradiol a todos
los tubos. Mezclar en el Vortex.
Dejar los tubos T a un lado para su
contaje (paso 11); no requieren más
procesamiento posterior.
6
Incubar durante 1 hora a temperatura
ambiente (15–28°C).
7
Añadir 1,0 ml de la Solución de
Precipitación (azul) fría a todos los
tubos. Mezclar en el Vortex.
Para la adición de 1,0 ml de reactivo,
se puede utilizar un dispensador de
repetición.
8
Incubar durante 10 minutos a
9
Centrifugar durante 15 minutos a
3000 xg, o durante un periodo de
tiempo mayor a una aceleración
menor, por ejemplo, 30 minutos a
1500 xg.
10 Usando una gradilla de decantación
de espuma, decantar (o aspirar) el
sobrenadante, reteniendo el
precipitado para el contaje.
Dejar escurrir los tubos invertidos
sobre papel absorbente durante 10
minutos. Luego, golpear los tubos
suavemente y secar los bordes para
remover las gotas residuales.
11 Contar cada tubo durante 1 minuto.
Cálculo de resultados
Para obtener resultados en términos de
concentración a partir de una
representación logit-log de la curva de
calibración, primero hay que calcular para
cada pareja de tubos las cuentas medias
por minuto corregidas con el NSB:
Cuentas netas = (Media CPM) menos
(Media NSB CPM)
Entonces, determinar la unión de cada
pareja de tubos como un porcentaje de la
unión máxima (MB), tomando las cuentas
corregidas con el NSB de los tubos A
como 100%:
Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas
MB netas) × 100
(El cálculo puede simplificarse omitiendo
la corrección de las uniones no
específicas; las muestras dentro del rango
de calibración van a dar virtualmente el
20
mismo resultado cuando el porcentaje de
unión se calcula directamente a partir de
la media de las CPM).
Usando papel gráfico logit-log, representar
el porcentaje de unión en el eje vertical
frente a la concentración en el eje
horizontal (logarítmico) para cada
calibrador no cero y trazar la línea que
pase por esos puntos aproximadamente.
Los resultados de las muestras pueden
ser leídos en la curva por interpolación.
Es una buena práctica inspeccionar los
resultados para comprobar la
concordancia entre los replicados, y
realizar una gráfica de la curva de
calibración (aunque los cálculos se
realicen por ordenador) para ver la
transformación más apropiada a usar y las
posibles desviaciones en los puntos de
calibración.
Parámetros de Control de Calidad:
Recomendamos controlar estos
parámetros de rendimiento:
T = Cuentas totales (como cuentas por minuto)
%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / cuentas
totales)
%MB = 100 × (Cuentas netas / Cuentas totales)
Y los cortes 20, 50 y 80 por ciento, donde
20% = Concentración al 20 por ciento de unión,
etc.
Otras aproximaciones, por ejemplo,
logística 4-parámetros, también son
aceptables. Ver Dudley RA, et al.
Guidelines for immunoassay data
Ejemplo: Sólo como ilustración, no se
puede utilizar para calcular resultados.
(Ver la tabla "Example Run").
Control de Calidad
Se deben procesar de manera rutinaria al
menos dos niveles de controles (o pool de
sueros) con diferente concentración de
estradiol — baja y alta.
Informar los resultados de los pacientes
sólo si los resultados de los controles para
este ensayo están dentro de los criterios
de aceptabilidad establecidos por su
laboratorio.
Es una buena práctica de laboratorio
registrar para cada ensayo los números
de lote de los componentes usados, así
como las fechas en las que fueron
abiertos por primera vez y reconstituidos.
También recomendamos el uso de
gráficos diarios de los controles — como
se describe, por ejemplo, en Westgard
JO, et al. A multi-rule chart for quality
control. Clin Chem 1981;27:493-501. Las
muestras repetidas pueden servir como
una herramienta de valor adicional para
monitorizar la precisión interensayo, y las
parejas de los tubos del control pueden
espaciarse a lo largo de la tanda de
ensayo para verificar la ausencia de
deriva significativa. El procedimiento
establece centrifugar a 3000 g durante 15
minutos. Aceleraciones menores han
probado ser satisfactorias sólo cuando el
tiempo de centrifugación se aumenta
adecuadamente, por ejemplo, 30 minutos
a 1500 xg. El uso de una centrífuga de
alta velocidad refrigerada es deseable
pero no esencial. Usar las fórmulas que
se dan a continuación para calcular la
aceleración de su centrífuga a una
velocidad dada, o la velocidad (en
revoluciones por minuto) requerida para
lograr la fuerza g deseada.
Estos límites han de considerarse sólo
como una guía. Cada laboratorio deberá
establecer sus propios intervalos de
referencia.
Fuerza g = 28,38 × (rpm / 1 000)2 × radio
[pulgadas]
rpm = 299,1 × √(fuerza g / radio [cm])
Para obtener datos representativos del
rendimiento del kit Péptido-C Doble
Anticuerpo, ver la sección Tablas y
Gráficos. Excepto cuando se indica, todos
los resultados en las secciones siguientes
se obtuvieron en muestras de suero. Los
resultados se expresan en pg/ml.
Valores esperados
Factor de Conversión:
pg/ml × 0,003671 → nmol/l
rpm = 187,7 × √(fuerza g / radio [pulgadas])
o
Fuerza g = 11,18 × (rpm / 1 000)2 × radio [cm]
Un estudio del intervalo de referencia
realizado con el kit Doble Anticuerpo
Estradiol produjo los siguientes resultados
en pg/ml.
Grupo
Mediana
Rango
95%
central
Rango
absoluto
n
Mujeres
Mujeres que ovulan:
Fase folicular
48
—
9–175
17
Fase lútea
103
—
44–196
19
Fase periovulatoria
209
—
107–281
9
Posmenopáusicas
tratadas
122
—
42–289
12
Posmenopáusicas
no tratadas
7.4
—
ND -19
13
Anticonceptivos
orales
13
ND–91
19
3–70
Hombres
ND–100 49
<5–93
ND: no detectable
49
Limitación
Las muestras de los pacientes que estén
siendo tratados con una terapia de
reemplazo con estrógenos deberán
extraerse antes de analizar el estradiol.
Comunicarse si se requiere información
sobre procedimientos de extracción.
El ensayo Estradiol Doble Anticuerpo está
calibrado gravimétricamente. Para ello, la
concentración de estradiol de la solución
stock para preparar los calibradores, se
determina midiendo la densidad óptica a
282 nm (E = 2 100 y MW = 272,4). El
ensayo no ha sido estandarizado usando
valores derivados GC/MS y por tanto los
valores observados con el ensayo podrían
no correlacionar con aquellos derivados
de los análisis GC/MS.
Características analíticas
Intervalo de calibración: 5 – 500 pg/ml
(0,02 – 1,84 nmol/l)
Sensibilidad analítica: 1,4 pg/ml
Precisión intraensayo (dentro de una
tanda): Se muestra un perfil de precisión
basado en 20 grados de libertad, el cual
representa los CV intraensayo a
esperarse para muestras analizadas por
duplicado. (Ver el gráfico "Precision
Profile".)
Precisión entre ensayos (de una tanda
a otra): Las estadísticas fueron
calculadas en muestras procesadas por
duplicado en 21 ensayos diferentes. (Ver
la tabla "Interassay Precision").
Efecto deriva: Ninguno hasta
aproximadamente 200 tubos. (Ver la tabla
"End-of-Run Effect").
Especificidad: El antisuero fue generado
con un derivado en la posición 3 del
21
estradiol, y es altamente específico para
el estradiol con una reactividad cruzada
extremadamente baja frente a otros
esteroides naturales o fármacos que
podrían estar presentes en las muestras
de los pacientes.
(DAb) = 1,1 (CAC) – 15 pg/ml
r = 0,955
Se deberá tener precaución al analizar el
estradiol en muestras de mujeres
embarazadas, ya que el nivel de estriol en
la circulación puede ser lo suficientemente
alto en esta etapa para interferir; si bien
otros esteroides exhiben una reactividad
cruzada leve, sus concentraciones
fisiológicas normales son demasiado
bajas, comparadas con la del estradiol,
para causar una interferencia significativa
en el procedimiento Doble Anticuerpo
Estradiol. De la misma manera, se deberá
tener cuidado al analizar muestras de
neonatos, ya que las reacciones cruzadas
con los esteroides que circulan a
concentraciones altas durante el periodo
neonatal pueden causar resultados
falsamente elevados.
Asistencia técnica
El etinilestradiol [1,3,5(10)-estratrieno17α-etinil-3,17β-diol] y la noretindrona son
compuestos que frecuentemente se
utilizan en las preparaciones
anticonceptivas orales. También se
analizaron estos compuestos y un número
de sus derivados. Los resultados
muestran que estos compuestos no
deberían tener ningún efecto clínicamente
significativo en los niveles en que
típicamente se encuentran en la
circulación. (Véase la tabla "Specificity".)
Medias:
40 pg/ml (Doble Anticuerpo)
Póngase en contacto con el distribuidor
nacional.
El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. está certificado por la ISO
13485:2003.
Français
Estradiol Double Anticorps
Domaine d'utilisation : Estradiol Double
Anticorps est un dosage
radioimmunologique à l'iode 125 réservé à
un usage diagnostic in vitro pour la
mesure quantitative de l'estradiol dans le
sérum. Il est une aide au diagnostic de la
puberté précoce chez les jeunes filles, la
gynécomastie chez les hommes, et au
diagnostic différentiel des aménorrhées. Il
est également destiné à la surveillance
d'ovulation provoquée, avec ou sans
stimulation, lors de lors de procréation
médicale assistée (PMA).
Référence catalogue : KE2D1 (100 tubes)
Linealidad: Las muestras fueron
analizadas con varias diluciones. (Ver la
tabla "Linearity".)
Le coffret de 100 tubes contient
moins de 3,5 microcuries (130
kilobecquerels) d'estradiol
marqué à l'iode 125.
Bilirrubina: La presencia de bilirrubina,
en concentraciones de hasta 200 mg/l, no
tiene ningún efecto sobre los resultados
en términos de precisión.
Introduction
Hemólisis: La presencia de eritrocitos
hasta concentraciones de 15 µl/ml no
tiene efecto en los resultados, en lo
concerniente a la precisión del ensayo.
Comparación de los métodos: Se
analizaron diecinueve muestras de suero
de pacientes mediante el procedimiento
Doble Anticuerpo Estradiol y con el kit
Coat-A-Count Estradiol, un
radioinmunoensayo en fase sólida basado
en tubos recubiertos con anticuerpos. Por
regresión lineal:
22
L'estradiol (17β-estradiol, E2) est une
hormone stéroïde de masse moléculaire
272,3 daltons qui circule dans le sang
principalement sous forme liée à des
protéines. En plus de l'estradiol, les autres
estrogènes stéroïdes naturels sont
l'estrone, l'estriol et leurs conjugués. Les
estrogènes sont des hormones
naturellement synthétisées en majorité par
les follicules ovariens et aussi par les
surrénales, le corps lutéal, le placenta et
chez les hommes par les testicules. Les
estrogènes exogènes (naturels ou
synthétiques) provoquent, à des degrés
variables, les mêmes réponses
pharmacologiques que les estrogènes
endogènes.
matériel radioactif. Éliminer les déchets
conformément aux lois en vigueur.
Les estrogènes sont sécrétés à des taux
variables pendant le cycle menstruel, tout
au long de la période d'activité ovarienne.
Pendant la grossesse, le placenta devient
la source principale d'estrogènes. A la
ménopause, la sécrétion ovarienne
d'estrogènes diminue à des taux
variables. Les gonadotrophines
hypophysaires régulent la sécrétion des
hormones ovariennes estradiol et
progestérone; le contrôle hypothalamique
de la production des gonadotrophines
hypophysaires est à son tour régulé par
les concentrations plasmatiques
d'estrogènes et de progestérone. Ce
mécanisme complexe de rétrocontrôle
provoque les phénomènes cycliques
d'ovulation et menstruation.
Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur
date d'expiration.
Le dosage de l'estradiol a prouvé son
utilité dans des contextes variés tels la
puberté précoce chez les jeunes filles, la
gynécomastie chez les hommes. Sa
principale application reste le diagnostic
différencié des aménorrhées et la
surveillance d'ovulation provoquée.
De l'azide de sodium à des concentrations
inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme
conservateur ; lors de l'élimination,
l'évacuer avec de grandes quantités d'eau
pour éviter une accumulation d'azides
métalliques explosifs dans les
canalisations.
Principe du test
Eau : utiliser de l'eau distillée ou
désionisée
La procédure du Double Anticorps
Estradiol est une technique
radioimmunologique par compétition, dans
laquelle l'estradiol marqué à l'iode 125
rentre en compétition avec l'estradiol du
sérum du patient vis-à-vis des sites
d'anticorps. Après une incubation d'une
durée fixée, la séparation entre la partie
libre et liée est réalisée par un deuxième
anticorps entraîné par le PEG. Enfin, la
fraction d'anticorps liée est précipitée et
comptée. La concentration de l'échantillon
est lue sur la courbe d'étalonnage
Réactifs à distribuer: 3
Temps d'incubation totale : 3 heures
Activité totale en début de marquage :
Environ 50 000 cpm
Séparation: la solution précipitante prête
à l'emploi combine un second anticorps et
du PEG dilué.
Précautions d'emploi
Réservé à un usage diagnostique in vitro.
Réactifs : Conserver à +2/+8°C dans un
réfrigérateur autorisé à recevoir du
Certains composants fournis avec ce
coffret peuvent contenir des agents
humains et/ou d'autres éléments
potentiellement infectieux qui nécessitent
certaines précautions.
Respecter les précautions d'emploi et
manipuler tous les composants du coffret
comme des produits potentiellement
infectieux. Les réactifs dérivés de produits
humains et utilisés dans ce coffret ont subi
un test sérologique pour la Syphilis et des
tests de dépistage pour les anticorps antiVIH1 et 2, anti-HCV et pour l'antigène de
surface de l'hépatite B, qui se sont tous
avérés négatifs.
Radioactivité
Ce coffret de réactif est reservé à l'usage
in vitro (Autorisation DGSNR).
Règles de base de protection contre les
rayonnements ionisants et précautions
d'emploi.
Ce produit radioactif ne peut être reçu,
acheté, détenu ou utilisé que par des
personnes autorisées à cette fin et dans
des laboratoires dotés de cette
autorisation. Cette solution ne peut en
aucun cas être administrée à l'homme ou
aux animaux. Respecter impérativement
les dates de péremption indiquées sur
l'emballage extérieur et sur les étiquettes
des différents réactifs du coffret. Tous les
réactifs, dont les tubes revêtus
d'anticorps, doivent être conservés à
+ 4/+ 8° C dans leur conditionnement
d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la
possession, l'utilisation et l'échange de
matières radioactives sont soumis aux
réglementations en vigueur dans le pays
de l'utilisateur. Les règles de base de
protection contre les rayonnements
ionisants doivent être respectées selon
23
des procédures en vigueur. Ne pas
pipeter des solutions radioactives avec la
bouche. Eviter le contact direct avec la
peau ou les muqueuses de tout produit
radioactif en utilisant des blouses et gants
de protection. Toute manipulation de
matières radioactives se fera dans un
local ad hoc éloigné de tout passage. Les
produits radioactifs seront stockés dans
leur conditionnement d'origine dans un
local approprié. Un cahier de réception et
de stockage de produits radioactifs sera
tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la
verrerie qui ont été contaminés doivent
être éliminés au fur et à mesure afin
d'éviter une contamination croisée de
plusieurs isotopes. Chaque contamination
ou perte de substance radioactive devra
être réglée selon les procédures établies.
Toute mise aux déchets de matière
radioactive se fera en accord avec les
réglementations en vigueur. Ne pas
manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer
des cosmétiques dans les laboratoires où
des produits radioactifs sont utilisés. Les
réactifs radioactifs ne peuvent être vendus
qu'à des personnes habilitées à manipuler
des substances radioactives.
Materiel Fourni :
Préparation Initiale
Anticorps anti-Estradiol (E2D1)
Antisérum anti Estradiol lyophilisé. Au
moins 10 minutes avant utilisation,
reconstituer chaque flacon en ajoutant
10 ml d'eau distillée ou désionisée.
Mélanger doucement par retournements.
Conserver réfrigéré: stable à +2°/+8°C
pendant 30 jours après reconstitution.
Code couleur : bleue.
KE2D1: 1 Flacon (E2D1).
Traceur Estradiol marqué à l'iode 125
(E2D2)
Estradiol de synthèse marqué sous forme
liquide. Chaque flacon contient 11 ml.
Stable à +2°/+8°C pendant 30 jours après
ouverture, ou jusqu'à la date de
péremption indiquée sur le flacon.
KE2D1: 1 Flacon.
Ne pas transférer ce traceur dans des
récipients en plastiques. l'estradiol a
tendance à s'adsorber sur des surfaces
plastiques non traitées. Utiliser dans ce
cas des récipients en verre.
24
Standards Estradiol (E2D3–9)
Sept flacons de standards A à G, en
sérum humain prétraité, avec
conservateur. Sous forme liquide prêts à
l'emploi. Le standard zéro A contient 6 ml,
et les autres standards B à G 3 ml chacun.
Stable à +2/+8°C pendant 30 jours après
ouverture. Pour une conservation plus
longue, aliquoter et congeler dans des
flacons de verre hermétiquement
bouchés, stables 6 mois à –20°C. Eviter
des congélations et décongélations
successives.
KE2D1: 1 jeu.
Ces standards contiennent
respectivement, 0, 5, 10, 20, 50, 150 et
500 picogrammes d' estradiol de synthése
par millilitre (pg/ml) dans du sérum humain
traité soit, 0, 0,02, 0,04, 0,07, 0,18, 0,55 et
1,84 nanomoles par litre (nmol/l). Des
points intermédiaires peuvent être
obtenus en mélangeant des standards
dans des proportions adéquates juste
avant dosage.
Solution Précipitante (N6)
Solution précipitante constituée de
gammaglobulines de chèvre anti-lapin et
diluée dans une solution saline de
polyéthylène glycol (PEG). La solution
précipitante est fournie sous forme liquide,
prête à l'emploi. Stable à +2°/+8°C
pendant 30 jours après ouverture. Bien
mélanger sans former de mousse avant
emploi pour dissoudre un éventuel
précipité pouvant se former durant la
réfrigération. Couleur: bleue.
KE2D1: 1 flacon × 110 ml (N6)
Matériel requis mais non fourni
Compteur gamma
Centrifugeuse – de préférence réfrigérée
et d'une capacité d'au moins 1500xg
Agitateur de type Vortex
Préparation du réactif
Eau distillée ou désionisée
Pipette: pour distribuer 10 ml
Radioimmunodosage
Tubes secs en polypropylène 12x75 mm –
disponibles chez Siemens Healthcare
Diagnostics (Référence catalogue : PPO).
Micropipettes — 100 µl, 200 µl et 1,0 ml
Un portoir de décantation – disponible
chez Siemens Healthcare Diagnostics
(Référence catalogue : FDR).
De fortes variations des protéines totales
peuvent avoir un effet sur ce dosage.
Papier graphe Logit-log
Protocole de dosage
Un contrôle lyophilisé, à base de sérum
humain, à trois niveaux, contenant
différentes concentrations d'estradiol, est
disponible chez Siemens Healthcare
Diagnostics (Référence catalogue :
CON6).
Tous les composants, excepté la solution
précipitante, doivent être à température
ambiante (15–28°C) avant leur utilisation.
1
Recueil des échantillons
Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et
aucune préparation spéciale n'est requise.
21
Prélever le sang par ponction veineuse
sur tube sec, en notant l'heure de
prélèvement, et séparer le sérum des
cellules.
Une forte lipémie peut interférer dans ce
dosage : Il est recommandé de clarifier les
échantillons hyperlipémiques par
ultracentrifugation.
Des échantillons hémolysés peuvent être
révélateurs d'une préparation inadéquate
du prélèvement avant son envoi au
laboratoire ; il faudra donc interpréter les
résultats avec prudence.
2
Des tubes pour prélèvements sanguins
provenant de fabricants différents peuvent
donner des résultats différents, selon les
matériaux et additifs utilisés, y compris
gels ou barrières physiques, activateurs
de la coagulation et/ou anticoagulants. Le
coffret Estradiol Double Antibody n'a pas
été testé sur tous les types de tubes
possibles.
pg/ml
nmol/l
A (B0)
0
0
B
5
0,02
C
10
0,04
D
20
0,07
E
50
0,18
F
150
0,55
G
500
1,84
Pipeter 200 µl du standard zéro A
dans les tubes LNS et A, et 200 µl des
autres standards B à G, sérums de
contrôle et échantillons de patients
dans les tubes respectifs. Pipeter
200 µl de chacun des échantillons de
patients de des contrôles dans les
tubes préparés.
Les échantillons de patients
suspectés de contenir des
concentrations d'estradiol supérieures
au standard le plus élevé (500 pg/ml)
doivent être dilués avec le standard
zéro avant le dosage.
Conservation: 2 jours à +2/+8°C ou
20
2 mois à –20°C.
Le sérum est recommandé comme type
d'échantillon, un plasma EDTA donnera
des résultats proches du sérum tandis
qu'un plasma hépariné donnera des
valeurs significativement plus basses.
Standards
Il est bon d'utiliser des embouts de
micropipettes jetables, de changer
d'embout entre les échantillons de
manière à éviter toute contamination.
Volume nécessaire : 200 µl de sérum par
tube.
Avant le dosage, laisser les échantillons
revenir à température ambiante (15–
28°C), mélanger doucement par rotations
ou retournement. Aliquoter, si nécessaire,
afin d'éviter de répéter les cycles
congélation / décongélation. Ne pas tenter
de décongeler les spécimens congelés à
l'aide d'un bain marie.
Etiqueter 18 tubes en duplicate: T
(activité totale, LNS (liaison non
spécifique), A (liaison maximale LM)
et de B à G. Etiqueter les tubes
supplémentaires, également en
duplicate, pour les échantillons de
patients et les contrôles.
3
Ajouter 100 µl d'anticorps anti
estradiol (bleu) dans chaque tube.
(sauf tube LNS et T) Agiter au vortex.
Une multipette est recommandée pour
cette étape et pour l'ajout d'antisérum
et pour l'addition de traceur à l'étape
5.
4
Incuber 2 heures à température
ambiante (15–28°C).
25
5
125
Ajouter 100 µl du traceur I Estradiol
à chaque tube. Agiter au vortex.
calculée directement à partir de la
moyenne des CPM.)
Les tubes T peuvent être mis de côté
jusqu'au comptage (étape 11); ils
n'ont pas d'autre traitement.
En utilisant un papier logit-log, on porte en
ordonnée les pourcentages de liaison en
fonction des concentrations des standards
qui ne sont pas à zéro, en abscisse. On
trace une ligne droite passant
approximativement par ces points. Les
concentrations des échantillons inconnus
sont déterminées par interpolation sur la
courbe standard.
6
Incuber 1 heure à température
7
Ajouter 1,0 ml de solution précipitante
froide (Bleue) à tous les tubes. Agiter
au vortex.
Une multipette peut être utilisée pour
cette addition de ce réactif.
8
Incuber 10 minutes à température
9
Centrifuger 15 minutes à 3000xg – ou
pendant une plus longue période à
une accélération plus basse, par
exemple 30 minutes à 1500xg.
10 Utiliser un portoir pour la décantation,
laisser décanter (ou aspirer), séparer
le surnageant en retenant le précipité
pour le comptage.
Laisser les tubes retournés durant 10
minutes sur du papier absorbant.
Tapoter doucement les tubes, essuyer
les bords afin d'éliminer les
gouttelettes résiduelles.
11 Compter chaque tube pendant 1
minute.
Calcul des Résultats
Afin d'obtenir des résultats en
concentrations à partir d'une
représentation logit-log de la courbe de
calibration, calculer pour chaque doublet
de tubes les coups corrigés: moyenne
cpm-moyenne des cpm du LNS:
CPM corrigés = (Moyenne cpm) moins
(Moyenne cpm LNS)
Puis déterminer pour chaque doublet la
capacité de liaison en pourcentage de
liaison maximale (MB), corrigée des cpm
dus au NSB des tubes A tubes considérés
à 100%:
% liaison = (cpm corrigés / cpm corrigés LM) ×
100
(Le calcul peut être simplifié en
négligeant la correction due au LNS. Les
échantillons dans la gamme de calibration
donnent des résultats pratiquement
identiques quand la capacité de liaison est
26
Il est bon de vérifier les doublets et de
construire une représentation graphique
de la courbe de calibration (même si celleci est faite par ordinateur) avec les
différentes valeurs de façon à visualiser le
meilleur tracé et c'est une façon de
détecter les points deviants.
Paramètres de contrôle qualité: Nous
recommandons aussi de suivre les
paramètres suivants :
T = Activité totale (cpm)
%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS /
cpm Totaux)
%LM = 100 × (cpm corrigés / cpm totaux)
Et les intercepts à 20, 50 et 80 % avec
20% = Concentration à 20% de liaison, etc.
Note: d'autres approches sont possibles
comme l'intégration de paramètres 4-p
logistique. Se rapporter à Dudley RA, et
al. Guidelines for immunoassay data
Exemple de série : A titre d'exemple
uniquement, et non pour calculer des
résultats provenant d'une autre série. (Voir
le tableau « Example Run ».)
Contrôle de Qualité
Les contrôles (ou pools de sérums) avec
au moins deux taux de concentration
d'estradiol – haut et bas – doivent être
dosés en routine comme des échantillons
inconnus.
Les résultats de patient ne doivent être
validés que si les résultats des contrôles
correspondent aux critères d'acceptation
établis par votre laboratoire.
Il est bon d'enregistrer pour chaque
dosage les numéros de lots des
composants utilisés ainsi que la date à
laquelle ils ont été reconstitués ou ouverts.
Nous recommandons également de noter
jour après jour les résultats des contrôles
– comme décrit par exemple dans
Westgard JO, et al. A multi-rule chart for
quality control. Clin Chem 1981;27:493501. Noter qu'un redosage d'échantillon
peut être précieux pour suivre la précision
inter essai, et que les doublets de tubes
contrôle peuvent être espacés de façon à
vérifier l'absence de dérive significative.
La procédure nécessite une centrifugation
à 3000×g pendant 15 minutes. Des
accélérations plus basses sont
satisfaisantes uniquement si le temps de
centrifugation est augmenté de manière
appropriée – par exemple, 30 minutes à
1500xg. Une ultra-centrifugeuse réfrigérée
est souhaitable mais non essentielle.
Utiliser les formules ci-dessous pour
calculer l'accélération de votre
centrifugeuse à une vitesse donnée ou la
vitesse (en tours par minute) requise pour
atteindre la force g désirée.
force g = 28,38 × (tpm / 1 000)2 × rayon [pouces]
tpm = 187,7 × √(force g / rayon [pouces])
ou
tpm = 299,1 × √(force g / rayon [cm])
Le dosage Estradiol Double Anticorps est
calibré par gravimétrie: la concentration en
estradiol de la solution étalon utilisée pour
préparer les calibrateurs est déterminée
en mesurant la densité optique à 282 nm
(E = 2 100 et MW = 272,4). Le dosage n'a
pas été standardisé à partir des valeurs
issues de la CG/SM et, de ce fait, les
valeurs observées avec ce dosage
peuvent ne pas être en concordance avec
celles obtenues par CG/SM.
Performances du test
Voir les tableaux et graphiques pour
obtenir les données représentatives
obtenus sur des sérums (sauf indication
contraire) avec le coffret Double Antibody
Estradiol. Résultats exprimés en pg/ml.
Intervalle de linéarité : 5 – 500 pg/ml
(0,02 – 1,84 nmol/l)
Valeurs de référence
Sensibilité analytique : 1,4 pg/ml
Une étude du domaine de normalité avec
le coffret Double Antibody Estradiol a
fourni les résultats suivants en pg/ml.
Médiane
Les échantillons de patients sous thérapie
oestrogénique de substitution devront être
extraits avant analyse avec le coffret
Double Anticorps Estradiol, une procédure
est disponible sur demande.
Facteur de conversion :
pg/ml × 0,003671 → nmol/l
force g = 11,18 × (tpm / 1 000)2 × rayon [cm]
Groupe
Limites
Domaine Domaine
95% ile
Absolu
n
Femmes
Femmes en période
ovulatoire:
Phase folliculaire
48
—
9–175
17
Phase lutéale
103
—
44–196
19
Peri-ovulatoire
209
—
107–281
9
Postmenopausées
sous substitution
122
—
42–289
12
Postmenopausées
sans traitement
7.4
—
ND–19
13
Sous
Contraceptifs oraux
13
ND–91
ND–100
49
Hommes
19
3–70
<5–93
49
ND: non détectable
Utiliser ces valeurs à titre indicatif
uniquement. Chaque laboratoire devra
établir ses propres valeurs de référence.
Précision intra-dosage (au sein d'une
même série) : Un profil de précision
obtenu à partir de 20 séries indique les
coefficients de variation intra-dosage
pouvant être attendus sur des échantillons
analysés en duplicate (Voir "Precision
Profile")
Précision inter-dosage (entre plusieurs
séries) : Calculée sur 3 échantillons
analysés en double dans 21 séries. (Voir
le tableau « Interassay Precision ».)
Effet de la position des tubes : Aucun
jusqu'à 200 tubes. (Voir le tableau « Endof-Run Effect ».)
Spécificité : L'antisérum a été généré
avec un dérivé d'estradiol en position 3, il
est hautement spécifique de l'estradiol
avec une réaction croisée extrèmement
basse avec les stéroïdes naturellement
présents ou les médicaments qui
pourraient se trouver dans l'échantillon du
patient.
Des précautions sont à considérer lors
d'analyses d'échantillon de femmes
27
enceintes car des taux élevés d'estriol en
circulation peuvent interférer dans ce
dosage. Bien que certains stéroïdes
présentent un léger pourcentage de
réactions croisées, leur concentration
physiologique est trop faible par rapport à
l'estradiol pour interférer de manière
significative sur le dosage Double
Antibody Estradiol. De manière identique,
les stéroïdes présents en très fortes
concentrations dans des échantillons de
nouveaux-nés pourraient augmenter les
résultats
Ethinylestradiol [1,3,5(10)-estratrien-17αethinyl-3,17β-diol] et norethindrone sont
des composés utilisés dans les
contraceptifs oraux. Ces composés et
leurs dérivés ont aussi été testés ; les
résultats montrent qu'ils n'interfèrent pas
sur le résultat clinique du dosage aux taux
habituels présents dans la circulation
sanguine. (Voir le tableau « Specificity ».)
Test de dilution : Des échantillons ont
été dosés à différentes concentrations.
(Voir le tableau "Linearity".)
Bilirubine : La présence de bilirubine ne
présente aucun effet sur les résultats ni
sur la précision du dosage si la
concentration ne dépasse pas 200 mg/l.
Hémolyse : La présence d'agrégat
d'hématies jusqu'à une concentration de
15 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats
quant à la précision du dosage.
Comparaison de méthodes: Des
échantillons de patients ont été dosés en
parallèle avec le coffret Double Antibody
Estradiol et le coffret avec tubes coatés
Coat-A-Count Estradiol. Par régression
linéaire :
(DAb) = 1,1 (CAC) – 15 pg/ml
r = 0,955
Moyennes :
40 pg/ml (Double Antibody)
Assistance technique
Contacter votre distributeur national.
Le Système Qualité de Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.
Italiano
Doppio Anticorpo Estradiolo
125
Uso: Il doppio Anticorpo Estradiolo è un
dosaggio radioimmunologico progettato
per l'uso diagnostico in vitro nella
misurazione quantitativa dell'estradiolo nel
siero, per lo studio della pubertà precoce
nelle donne e della ginecomastia negli
uomini, e per la diagnosi differenziale
dell'amenorrea. E' inoltre studiato per il
monitoraggio dell'induzione dell'ovulazione
con o senza stimolazione nelle tecniche di
riproduzione assistita (ART).
Codice: KE2D1 (100 provette)
Il kit da 100 determinazioni
contiene meno di 3,5 microcurie
(130 kilobecquerel) di estradiolo
125
radioattivo marcato con I .
Riassunto e Spiegazione del
Test
L'Estradiolo è un ormone steroideo con un
peso molecolare di 272,3 dalton che
circola prevalentemente legato alle
proteine. Oltre all'Estradiolo altri estrogeni
steroidei naturali comprendono l'Estrone,
l'Estriolo ed i loro coniugati. Gli estrogeni
sono ormoni secreti principalmente dai
follicoli ovarici, dalle ghiandole surrenali,
dal corpo luteo, dalla placenta e, nei
maschi, dai testicoli.
Gli estrogeni vengono secreti con ritmi
variabili nel corso del ciclo mestruale per
tutto il periodo di attività delle ovaie. Nel
corso della gravidanza la placenta diventa
la sorgente principale di estrogeni.
Durante la menopausa la secrezione
ovarica diminuisce con ritmi variabili. Le
gonadotropine dell'ipofisi anteriore
regolano la secrezione degli ormoni
ovarici, quali l'estradiolo ed il
progesterone, il controllo ipotalamico della
produzione di gonadotropina ipofisaria
viene regolato dai livelli plasmatici di
estrogeni e di progesterone. Questo
complesso sistema di feedback provoca il
fenomeno ciclico dell'ovulazione e della
mestruazione.
Le determinazioni di estradiolo si sono
rivelate valide in un numero elevato di
contesti, incluse le indagini sulla pubertà
precoce nelle donne e sulla ginecomastia
28
negli uomini. Il suo utilizzo principale
risiede nella diagnosi differenziale di
amenorrea e nel monitoraggio
dell'induzione dell'ovulazione.
dell'eliminazione, irrorare con molta acqua
per evitare la formazione di azidi
metalliche potenzialmente esplosive nelle
tubature di piombo e di rame.
Procedura del Dosaggio
Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o
deionizzata
Il Dosaggio Doppio Anticorpo Estradiolo è
un radioimmunodosaggio sequenziale nel
quale il campione viene preincubato con
un antisiero anti-estradiolo. L'estradiolo
125
marcato con I compete con l'estradiolo
presente nel campione del paziente per i
siti anticorpali leganti. Dopo incubazione
per un tempo prefissato, la separazione
della frazione legata dalla libera viene
raggiunta attraverso il metodo doppio
anticorpo accelerato con PEG. Infine, la
frazione legata all'anticorpo viene
precipitata e contata. Le concentrazioni
del campione vengono lette dalla curva di
calibrazione.
Reagenti da Dispensare: 3
Tempo Totale di Incubazione: 3 ore
Conte Totali alla iodinazione: Circa
50 000 cpm
Separazione: La Soluzione Precipitante
pronta all'uso si combina con il secondo
anticorpo e con il PEG diluito.
Avvertenze e Precauzioni
Ad uso diagnostico in vitro.
Reagenti: Conservare a 2–8°C in un
frigorifero appositamente destinato al
materiale radioattivo. Eliminare secondo le
normative di legge vigenti.
Non utilizzare reagenti oltre la data di
scadenza.
Alcuni componenti forniti in questo kit
possono contenere materiale di origine
umana e/o altri ingredienti potenzialmente
pericolosi che necessitano di precauzioni
di utilizzo.
Seguire le precauzioni universali, e
manipolare tutti i componenti come se
potessero trasmettere agenti infettivi.
Sono stati dosati i materiali di origine
umana e sono stati trovati non reattivi per
la Sifilide; per gli Anticorpi Anti-HIV 1 e 2;
per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B;
e per gli Anticorpi Anti-Epatite C.
E' stata aggiunta Sodio Azide a
concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come
conservante. Al momento
Radioattività
Una copia di tutti i certificati di
Autorizzazione per radioisotopi (Specifica
o Generica) rilasciata ad un cliente
americano deve essere conservata in file
presso la Siemens Healthcare Diagnostics
prima che i kit o i componenti contenenti
materiale radioattivo possano essere
spediti. Questi materiali radioattivi
possono essere acquisiti da qualsivoglia
cliente in possesso dell'Autorizzazione
Specifica. Con l'Autorizzazione Generica
questi materiali radioattivi possono essere
acquistati solo da medici, veterinari che
esercitino la professione, laboratori clinici
ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di
test clinici o di laboratorio in vitro che non
implichino somministrazione interna o
esterna del materiale radioattivo o delle
sue radiazioni alle persone o animali. La
sua acquisizione, ricevimento,
conservazione, utilizzo, trasferimento ed
eliminazione sono soggette a
regolamentazioni e ad Autorizzazione
(Generica o Specifica) della Commissione
Statunitense per il Nucleare o dello Stato
con il quale l'NRC abbia stipulato un
accordo per l'esercizio del controllo
regolatorio.
Manipolare i materiali radioattivi secondo
quanto previsto dall'Autorizzazione
Generica o Specifica. Per minimizzare
l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore
deve attenersi alle linee guida stabilite dal
National Bureau of Standards publication
su “Safe Handling of Radioactive
Materials” “Norme per una corretta
manipolazione dei Materiali
Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9
Marzo 1964) e successive edizioni
pubblicate dallo Stato e dalle Autorità
Federali.
Assorbire immediatamente le fuoriuscite e
decontaminare le superfici contaminate.
Evitare la formazione di aerosol. Eliminare
i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto
previsto dall'Autorizzazione. Le licenze
generiche (possessori di NRC Form 483)
possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi
come non radioattivi, dopo aver rimosso
29
l'etichetta. I detentori di autorizzazioni
specifiche (NRC Form 313) devono fare
riferimento al Titolo 10, Codice delle
Regolamentazioni Federali Parte 20. I
detentori di Autorizzazioni negli Stati che
hanno stipulato un accordo con l'NRC
dovrebbero far riferimento alle
regolamentazioni idonee dei loro stati. I
detentori di Autorizzazioni Generali
possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi
del tipo contenuto in questo prodotto
attraverso il lavello del laboratorio. I
detentori di autorizzazione devono
eliminare o rendere illeggibili le etichette
dei contenitori vuoti di materiali radioattivi
prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori
di autorizzazioni specifiche possono
eliminare piccoli quantitativi di rifiuti
radioattivi liquidi del tipo utilizzato in
questo prodotto attraverso il lavello del
laboratorio. Fare riferimento alle
regolamentazioni appropriate applicabili al
Vostro laboratorio.
Materiali Forniti:
Preparazione Iniziale
Antisiero Estradiolo (E2D1)
Antisiero estradiolo di coniglio liofilo.
Almeno 10 minuti prima dell'utilizzo,
ricostituire ciascun flacone aggiungendo
10 mL di acqua distillata. Mescolare
capovolgendo il flacone. Stabile a 2–8°C
per 30 giorni dopo la ricostituzione.
Colore: blu.
KE2D1: 1 flacone (E2D1).
125
Estradiolo marcato con I (E2D2)
Estradiolo sintetico iodinato in forma
liquida, pronto all'uso. Ciascun flacone
contiene 11 mL. Stabile a 2–8°C per 30
giorni dopo l'apertura, o fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta.
KE2D1: 1 flacone.
Non trasferire il tracciante in contenitori di
plastica. L'Estradiolo ha una forte
tendenza ad assorbire superfici di plastica
non trattate. E' pertanto importante
utilizzare contenitori di vetro piuttosto che
di plastica per il trasferimento del
tracciante dal contenitore originario.
Calibratori Estradiolo (E2D3–9)
Sette flaconi di vetro silanizzato, etichettati
dalla A all G, di calibratori estradiolo con
conservanti. I calibratori sono forniti in
forma liquida, pronti all'uso. Il calibratore
30
zero A contiene 6 mL, ed i rimanenti
calibratori dalla B alla G contengono 3 mL
ciascuno.Stabili a 2–8°C per 30 giorni
dopo l'apertura. Per periodi di
conservazione prolungata, aliquotare e
congelare in provette di vetro silanizzato
sigillate: stabile a –20°C per 6 mesi.
Evitare cicli ripetuti di congelamento e
scongelamento.
KE2D1: 1 set.
I calibratori contengono, rispettivamente,
0, 5, 10, 20, 50, 150 e 500 picogrammi di
Estradiolo sintetico per millilitro (pg/mL) in
siero umano processato; equivalente a 0,
0,02, 0,04, 0,07, 0,18, 0,55 e
1,84 nanomoli per litro (nmol/L). I punti
intermedi della calibrazione possono
essere ottenuti mescolando i calibratori in
proporzioni idonee prima del dosaggio.
Soluzione Precipitante (N6)
Soluzione Precipitante composta da
gamma globuline di capra anti-coniglio
(GARGG) e da PEG diluito in soluzione
salina. La Soluzione Precipitante è fornita
in forma liquida, pronta all'uso. Stabile a
2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura.
Poiché può verificarsi la formazione di un
sottile strato di precipitato dopo la
refrigerazione, la soluzione precipitante
deve essere mescolata completamente
prima dell'utilizzo, senza formazione di
schiuma. Colore: blu.
KE2D1: 1 flacone × 110 mL (N6).
Materiali Richiesti Ma Non
Forniti
Gamma counter
Centrifuga — preferibilmente refrigerata
ed in grado di effettuare almeno 1500xg
Vortex mixer.
Preparazione dei Reagenti
Acqua distillata o deionizzata
Pipette: 10 mL
Radioimmunodosaggio
Provette da 12×75 mm di polipropilene –
disponibili da Siemens Healthcare
Diagnostics (Codice: PPO).
Micropipette: 100 µL, 200 µL e 1,0 mL
Foam per la decantazione delle provette –
disponibile presso Siemens Healthcare
Diagnostics (Codice: FDR).
Carta per grafici logit-log
Un controllo a tre-livelli su base sierica
umana, contenente estradiolo tra gli oltre
25 costituenti dosati, disponibile presso
Siemens Healthcare Diagnostics (Codice:
CON6).
portati a temperatura ambiente (15–28°C)
prima del dosaggio.
1
Prelievo dei Campioni
Non è necessario che il paziente sia a
digiuno, non sono necessarie preparazioni
21
particolari. Prelevare il sangue in
provette semplici, annotando l'ora del
prelievo e separare il siero dalle cellule.
Calibratori
La lipemia può interferire con il dosaggio.
Si consiglia l'utilizzo di un'ultracentrifuga
per schiarire i campioni lipemici.
I campioni emolizzati possono indicare un
trattamento non idoneo del campione
prima dell'arrivo al laboratorio; per questo
motivo, i risultati devono essere
interpretati con prudenza.
Provette per il prelievo di sangue di
produttori diversi possono dare valori
differenti, a seconda dei materiali e degli
additivi usati, incluso gel o barriere fisiche,
attivatori di coaguli e/o anticoagulanti.
L'Double Antibody Estradiolo non é stato
verificato con tutte le possibili variazioni di
tipi di provette.
2
Volume Richiesto: 200 µL di siero per
provetta.
Si consiglia di prelevare i campioni come
siero. Il plasma EDTA produce risultati
quasi elevati quanto il siero, ma il plasma
eparinizzato produce risultati che sono
significativamente più bassi.
Variazioni significative sulla
concentrazione di proteine totali possono
avere effetto sul dosaggio.
Dosaggio Radioimmunologico
pg/mL
nmol/L
A (MB)
0
0
B
5
0,02
C
10
0,04
D
20
0,07
E
50
0,18
F
150
0,55
G
500
1,84
Dispensare 200 µL del calibratore
zero A nelle provette NSB ed A, e
200 µL di ciascuno dei calibratori
rimanenti dalla B alla G nelle provette
etichettate in maniera corrispondente.
Dispensare 200 µL di ciascun
controllo e campione di siero nelle
provette preparate.
Si consiglia di utilizzare un puntale
monouso, cambiando il puntale tra un
campione e l'altro, per evitare la
contaminazione da carryover.
Conservazione: 2 giorni a 2–8°C o fino a
20
2 mesi congelato a –20°C.
Prima del dosaggio, consentire ai
campioni di raggiungere temperatura
ambiente (15–28°C) e mescolare
scuotendo leggermente o capovolgendo la
provetta. Aliquotare, se necessario per
evitare cicli ripetuti di congelamento e
scongelamento. Non tentare di scongelare
i campioni congelati riscaldandoli in un
bagnetto termostatato.
Etichettare diciotto provette in
duplicato: T (conte totali), NSB
(legame non specifico), A (legame
massimo), e da B a G. Etichettare
altre provette, anch'esse in duplicato,
per i campioni di siero ed i controlli.
Campioni con concentrazioni attese di
estradiolo superiori al calibratore più
elevato (500 pg/mL) devono essere
diluiti con il calibratore zero prima del
dosaggio.
3
Aggiungere 100 µL di Antisiero
Estradiolo (Blu) a tutte le provette
eccetto le provette NSB e T.
Vortexare.
Si consiglia per questo passaggio e
per l'aggiunta del tracciante al punto 5
l'utilizzo di un dispensatore a
ripetizione.
4
Incubare per 2 ore a temperatura
5
Aggiungere 100 µL di Estradiolo
125
marcato con I a tutte le provette.
Vortexare.
Tutti i componenti ad eccezione della
Soluzione Precipitante devono essere
Mettere da parte le provette T per la
conta al punto 11; non sono necessari
ulteriori passaggi.
31
6
Incubare per 1 ora a temperatura
7
Aggiungere 1,0 mL di Soluzione
Precipitante fredda (Blu) a tutte le
provette. Vortexare.
Per l'aggiunta di 1,0 mL di reagente,
può essere utilizzato un dispensatore
a ripetizione.
8
Incubare per 10 minuti a temperatura
9
Centrifugare per 15 minuti a 3000xg
– o per un periodo di tempo più esteso
ad un'accelerazione inferiore, i.e. 30
minuti a 1500xg.
10 Utilizzare un foam per la
decantazione, decantare (o aspirare) il
supernatante, trattenendo il precipitato
per le conte.
Lasciare le provette capovolte su
carta assorbente per 10 minuti. Quindi
scuotere gentilmente le provette e
blottarne i bordi per rimuovere le
gocce residue.
11 Contare ciascuna provette per
1 minuto.
Calcolo dei Risultati
Per ottenere i risultati in termini di
concentrazione da una rappresentazione
logit-log della curva di calibrazione,
calcolare inizialmente per ogni coppia di
provette le conte medie al minuto corrette
con NSB:
Conte Nette = (Media dei CPM) Meno (Media
CPM NSB)
Quindi determinare il legame di ogni
coppia di provette come percentuale del
legame massimo (MB), con le conte
corrette-NSB delle provette A prese al
100%:
Percentuale di Legato = (Conte Nette / Conte
Nette MB) × 100
(Il calcolo può essere semplificato
omettendo la correzione per il legame non
specifico; i campioni entro il range dei
calibratori danno virtualmente gli stessi
risultati quando la Percentuale di Legato
viene calcolata direttamente dai CPM
Medi).
Utilizzando la carta logit-log, tracciare la
Percentuale di Legato sull'asse verticale
(probabilità) verso la Concentrazione
32
sull'asse orizzontale (logaritmica) per
ciascuno dei calibratori non zero e
tracciare una linea retta
approssimativamente lungo il tracciato di
questi punti. I risultati per i campioni non
noti possono essere letti dalla retta
attraverso interpolazione.
Si consiglia di visionare i risultati per
stabilire la correlazione entro i replicati e
tracciare un grafico della curva di
calibrazione (anche se i calcoli vengono
effettuati dal computer) per visualizzare
l'appropriatezza della trasformazione
utilizzata e per individuare i punti devianti
all'interno della calibrazione.
Parametri di QC: Consigliamo di
annotare le prestazioni di questo
dosaggio:
T = Conte Totali (conte al minuto)
%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte
Totali)
%MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali)
E le "intercette" al 20, 50 ed 80%, dove
20% = Concentrazione al 20% di Legato ecc.
Nota: sono accettabili anche altri tipi di
approccio, quali: l'implementazione della
logistica a 4 parametri. Vedi Dudley Ra et
al. Guidelines for immunoassay data
Seduta Esemplificativa: a solo scopo
illustrativo e non per calcolare i risultati di
un'altra seduta. (vedi tabella "Example
Run").
Controllo di Qualità
Devono sempre essere dosati come
campioni non noti controlli (o pool di sieri)
con almeno due livelli di concentrazione di
estradiolo — basso ed alto —.
Riportare i risultati dei pazienti solo se i
risultati dei controlli sono conformi ai criteri
di accettabilità del Vostro laboratorio.
Si consiglia per ogni dosaggio di annotare
i numeri di lotto dei componenti utilizzati,
le date di ricostituzione o di apertura. Si
consiglia anche di tracciare i grafici dei
risultati dei controlli giorno dopo giorno –
come descritto, ad esempio, in Westgard
JO, et al. A multi-rule chart for quality
control. Clin Chem 1981;27:493-501.
Campioni ripetuti possono servire come
ulteriore strumento per monitorare la
precisione inter-dosaggio; coppie di
campioni intervallate lungo tutto il
dosaggio possono essere d'aiuto nel
verificare l'assenza di deviazioni
significative. La procedura richiede la
centrifugazione a 3000xg per 15 minuti.
Accelerazioni inferiori sono soddisfacenti
solo se il tempo di centrifugazione viene
conformemente aumentato – ad esempio,
30 minuti a 1500xg. Una centrifuga ad
elevata velocità è auspicabile, ma non
essenziale. Utilizzare le formule di seguito
riportate per calcolare l'accelerazione
della vostra centrifuga ad una data
velocità o la velocità (rivoluzioni per
minuto) richiesta per raggiungere una
forza g desiderata.
2
forza g = 28,38 × (rpm / 1 000) × raggio [pollici]
rpm = 187,7 × √(forza g / raggio [pollici])
o
forza g = 11,18 × (rpm / 1 000)2 × raggio [cm]
rpm = 299,1 × √(forza g / raggio [cm])
Uno studio su un range di riferimento con
il dosaggio Doppio Anticorpo Estradiolo ha
prodotto i seguenti risultati in pg/mL.
Gruppo
Prestazioni del Dosaggio
Vedi Tabelle e Grafici per dati
rappresentativi delle prestazioni del
dosaggio Doppio Anticorpo Estradiolo. Ad
eccezione di quanto indicato, i risultati
nelle sezioni di seguito sono stati ottenuti
su campioni di siero. I risultati sono
espressi in pg/mL.
Fattore di Conversione:
pg/mL × 0,003671 → nmol/L
Valori Attesi
Range
Centrale
Mediana
95%
Il dosaggio Estradiolo a Doppio Anticorpo
è calibrato in modo ponderale in modo
che la concentrazione d'estradiolo della
soluzione stock usata per preparare i
calibratori è determinata attraverso la
misurazione della densità ottica a 282 nm
(E= 2 100 e MW= 272,4). Il dosaggio non
è stato standardizzato utilizzando i valori
derivati GC/MS perciò i valori osservati
con questo dosaggio non possono essere
conformi con quelli derivati d'analisi
GC/MS.
Range
Assoluto
n
Donne
Donne in ovulazione:
Fase follicolare
48
—
9–175
17
Fase Luteinica
103
—
44–196
19
Periovulatoria
209
—
107–281
9
Trattate
Postmenopausa
122
—
42–289
12
Non trattate
Postmenopausa
7.4
—
ND–19
13
Contraccettivi orali
13
ND–91
ND–100
49
Maschi
19
3–70
<5–93
49
ND: non determinabile
Considerare questi limiti soltanto come
linee guida. Ogni laboratorio dovrebbe
stabilire i propri range di riferimento.
Limiti
Campioni di pazienti sottoposti a terapia
estrogenica sostitutiva devono essere
estratti prima del dosaggio dell'Estradiolo.
Contattare la Siemens Healthcare
Diagnostics se si richiedono informazioni
sulle procedure di estrazione.
Range di Calibrazione: 5 – 500 pg/mL
(0,02 – 1,84 nmol/L)
Sensibilità Analitica: 1,4 pg/mL
Precisione Intra-Dosaggio (All'interno
della stessa seduta): Viene presentato
un profilo di precisione basato su circa 20
gradi di libertà e che riporta i CV attesi
intra-dosaggio per i campioni dosati in
duplicato. (Vedi grafico “Precision
Profile”).
Precisione Inter-Dosaggio (Da una
seduta all'altra): Sono state calcolate
statistiche per i campioni dai risultati di 21
dosaggi diversi. (Vedi tabella “Interassay
Precision”.)
Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa
200 provette (vedi tabella "End-of-Run
Effect").
Specificità: L'antisiero è stato generato
con un derivato dell'estradiolo modificato
in posizione -3, ed è altamente specifico
per l'estradiolo con una crossreattività
estremamente bassa verso altri steroidi
che si manifestano naturalmente o farmaci
terapeutici che possono essere presenti
nei campioni dei pazienti.
Occorre fare attenzione nel dosare
campioni di donne in gravidanza per
l'Estradiolo, poiché i livelli di estradiolo nel
circolo possono essere abbastanza elevati
da interferire; benché alcuni altri steroidi
33
presentino una leggera crossreattività, le
loro concentrazioni fisiologiche normali
sono troppo basse paragonate
all'estradiolo da causare un'interferenza
significativa nel Dosaggio Doppio
Anticorpo Estradiolo. In maniera analoga,
occorre fare attenzione nel dosaggio di
campioni provenienti da neonati, poiché
gli steroidi che crossreagiscono presenti
nel circolo a concentrazioni elevate nel
periodo neonatale possono causare
risultati falsamente elevati.
L'Etinilestradiolo [1,3,5(10)-estratrien-17αetinil-3,17β-diol] ed il noretindrone sono
composti sovente utilizzati nei
contraccettivi orali. Questi composti ed un
numero dei loro derivati sono stati
anch'essi dosati. I risultati dimostrano che
questi composti non dovrebbero avere
nessun effetto clinicamente significativo a
livelli tipicamente incontrati nel circolo
sanguigno. (Vedi tabella "Specificity".)
Linearità: I campioni sono stati dosati a
varie diluizioni. (Vedi tabella "Linearity".)
Bilirubina: La presenza di bilirubina in
concentrazioni fino a 200 mg/L non ha
nessun effetto sui risultati entro il range di
precisione del dosaggio.
Emolisi: La presenza di globuli rossi
impaccati in concentrazioni fino a
15 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il
range di precisione del dosaggio.
Comparazione di Metodi: diciannove
campioni di siero sono stati dosati con il
dosaggio Doppio Anticorpo Estradiolo e
con il dosaggio Coat-A-Count Estradiolo,
un radioimmunodosaggio in fase solida
basato su provette coattate con anticorpo.
Mediante regressione lineare:
(DAb) = 1,1 (CAC) – 15 pg/mL
r = 0,955
Valore Medio:
40 pg/mL (Doppio Anticorpo)
Assistenza Tecnica
All'estero: Si prega di contattare il proprio
Distributore Nazionale.
Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare
Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.
34
Português
Estradiol Duplo Anticorpo
Utilização: O kit de Estradiol Duplo
Anticorpo utiliza uma metodologia de
125
radioimunoensaio I para uso
diagnóstico in vitro para a detrminação
quantitative do estradiol no soro, no
estudo da puberdade precoce em
mulheres jovens e ginecomastia em
homens, e para o diagnóstico diferencial
da amenorreia. Também é usado para a
monitorização da indução de ovulação,
com ou sem estimulação, na tecnologia
de reprodução assistida (TRA).
Números de catálogo: KE2D1 (100 tubos)
O kit de 100 tubos contem menos
que 3,5 microcuries
(130 kilobecquerels) de estradiol
125
marcado com I radioactivo.
Sumário e explicação do teste
O estradiol é uma hormona esteróide com
P.M. de 272,3 daltons, que circula no
sangue e está predominantemente ligada
a proteínas séricas. Além do estradiol
existem outras hormonas esteróides
naturais incluindo a estrona, o estriol e
seus conjugados. Os estrogenos são
hormonas segregadas principalmente
pelos folículos do ovário e também pelas
glândulas supra-renais, corpo luteum,
placenta e, no homem, pelos testículos.
Estrogenios exógenos (naturais ou
sintéticos) simulam, em graus variados,
todas as respostas farmacológicas
geralmente produzidas por estrogeneos
endógenos.
As hormonas esteróides são segregadas
em níveis variáveis durante o ciclo
menstrual, por todo o período de
actividade ovariana. Durante a gravidez, a
placenta torna-se a fonte principal de
estrogenios. Na menopausa, a secreção
ovariana de estrogenios decresce
atingindo valores basais variáveis. As
gonadotrofinas da glândula pituitária
anterior regulam a secreção das
hormonas ovarianas – estradiol e
progesterona; o controlo hipotalâmico da
produção da gonadotrofina pituitária é, por
sua vez, regulado pelas concentrações de
estrogenios e progesterona no plasma.
Este complexo sistema de “feedback"
resulta no fenómeno cíclico da ovulação e
menstruação.
As determinações de estradiol provêem
um valor para vários contextos, incluindo
a investigação de puberdade precoce em
meninas, e ginecomastia em homens. Sua
principal função tem sido o diagnóstico
diferencial da amenorreia e o
monitoramento da indução de ovulação.
Princípio do Procedimento
O Estradiol Duplo Anticorpo é um
procedimento de radioimunoensaio
sequencial no qual a amostra do paciente
é pré-incubada com anti-soro anti125
estradiol. O estradiol marcado com I
compete com o estradiol na amostra do
paciente para sítios do anticorpo. Após a
incubação por um período fixo de tempo,
a separação do ligado livre é realizada
pelo método de Duplo Anticorpo
acelerado pelo PEG. Finalmente, fracção
ligada ao anticorpo é precipitada e
contada. As concentrações das amostras
dos pacientes são lidas de uma curva de
calibração.
Reagentes para Pipetar: 3
Tempo de Incubação: 3 horas
Contagens Totais na Marcação com o
Iodo: Aproximadamente 50 000 cpm
Separação: A Solução Precipitante,
pronta para uso, combina o segundo
anticorpo e PEG diluído.
Precauções
Para uso de diagnóstico in vitro.
Reagentes: Conservar a 2–8°C num
frigorífico destinado para materiais
radioactivos. Eliminar de acordo com as
leis aplicáveis.
Não utilize reagentes com prazo de
validade expirado.
Alguns componentes fornecidos com este
dispositivo podem conter matéria de
origem humana e/ou outros ingredientes
potencialmente perigosos que necessitem
de algumas precauções.
Manipule com as devidas precauções
todos os materiais capazes de transmitir
doenças infecciosas. As matérias primas,
obtidas de soro humano, foram testadas,
revelando resultados negativos para a
sífilis, para os anticorpos do vírus da
imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2;
para o antígeno de superfície da hepatite
B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus
da hepatite C.
Azida de sódio foi adicionada como
conservante; para evitar acumulações de
azidas metálicas explosivas em
canalizações de cobre e alumínio, os
reagentes devem ser rejeitados no esgoto
apenas se estiverem diluídos e forem
lavados com grandes volumes de água.
Água: Utilize água destilada ou
deionizada
Radioactividade
Uma cópia da licença de uso de produtos
radioactivos (especifico ou geral) enviada
pelo cliente, deve estar em poder da
Siemens Healthcare Diagnostics antes do
envio dos kits ou componentes contendo
material radioactivo. Estes materiais
radioactivos podem ser adquiridos por
qualquer cliente que possua a necessária
licença especifica. Com uma licença
generalista estes produtos radioactivos só
podem ser adquiridos por médicos,
veterinários na prática de medicina
veterinária, laboratórios clínicos e
hospitais. E somente para uso clinico in
vitro ou testes laboratoriais não
envolvendo administração externa ou
interna do material radioactivo ou da sua
radiação para o ser humano ou outros
animais. A sua aquisição, receita,
armazenamento uso, transporte e
eliminação estão sujeitas aos
regulamentos e à licenciada Comissão de
Regulação Nuclear ou do Estado
respectivo de acordo com a lei em vigor.
Tratar os materiais radioactivos de acordo
com a regulamentação da sua licença,
específica ou generalista. De modo a
minimizar a exposição à radiação deve o
utilizador seguir as instruções da
publicação do Departamento Nacional de
Padrões (Utilização segura de materiais
radioactivos-Livro No. 92, publicado em
Março de 1964) e publicações seguintes
do Estado e Autoridades Federais.
Limpar os derrames prontamente e
descontamine as superfícies afectadas.
Evitar os aerossóis. Elimine os lixos
radioactivos de acordo com a
regulamentação da licença. As licenças
generalistas (portadores da licença NRC
35
483) podem eliminar os lixos sólidos
radioactivos como lixo não radioactivo
depois de remover os rótulos. Licenças
Especificas (Licença NRC 313) devem ter
em conta o Capitulo 10 do artigo 20, do
Código de Regulamentações Federais.
Cada Estado deve referir a legislação em
vigor aprovada para o seu território. As
licenças generalistas podem eliminar os
lixos radioactivos líquidos do tipo deste
produto para um esgoto de laboratório. Os
licenciados devem remover os rótulos dos
frascos vazios de materiais radioactivos
antes de os colocar no esgoto sólido. As
licenças especificas podem eliminar
pequenas quantidades de lixo radioactivo
deste tipo de produto para o esgoto
normal do laboratório. Ter em atenção as
regulamentações em vigor para o seu
laboratório.
Materiais fornecidos:
Preparação inicial
Anti-soro Estradiol (E2D1)
Anti-soro estradiol liofilizado,
desenvolvidos em coelhos. Pelo menos
10 minutos antes do uso, reconstitua cada
frasco pela adição de 10 mL de água
destilada. Misture gentilmente por
inversão. Estável a 2–8°C por 30 dias
após reconstituição. Cor: azul.
KE2D1: 1 frasco (E2D1).
125
Estradiol I (E2D2)
Estradiol sintético iodado na forma líquida,
pronto para uso. Cada frasco contem
11 mL. Estável a 2–8°C por 30 dias após
aberto, ou até a data de expiração
marcada no rótulo.
KE2D1: 1 frasco.
Não transferir o traçador para container
plástico. O Estradiol possui uma forte
tendência de ser absorvido por superfícies
plásticas não tratadas. Assim sendo é
importante o uso de containers feitos de
vidro ao invés de plástico para
transferência do traçador do seu container
original.
Calibradores de Estradiol (E2D3–9)
Sete frascos de vidros siliconizados,
rotulados de A a G, de calibradores de
estradiol, com conservante. Os
calibradores são fornecidos na forma
líquida, pronto para uso. O calibrador zero
A contem 6 mL, e os calibradores
36
remanescentes de B a G contem 3 mL
cada. Estável a 2–8°C durante 30 dias
após abertura. Para períodos mais longos
de armazenagem, aliquotar e congelar em
em tubos de vidro siliconizados,
fortemente tampados: estável a –20° por
6 meses. Evite ciclos repetitivos de
congelamento e descongelamento.
KE2D1: 1 conjunto.
Os calibradores contem respectivamente
0, 5, 10, 20, 50, 150 e 500 picogramas de
estradiol sintético por mililitro (pg/mL) em
soro humano processado; equivalente, 0,
0,02, 0,04, 0,07, 0,18, 0,55 e 1,84
nanomoles por litro (nmol/L). Pontos de
calibração intermediários podem ser
obtidos pela mistura dos calibradores em
proporções adequadas antes do ensaio.
Solução Precipitante (N6)
A Solução Precipitante consiste de
gamma globulina de cabra anti-coelho
(GARGG) e PEG diluíd em salina. A
Solução Precipitante é fornecida na forma
líquida, pronto para uso. Estável a 2–8°C
durante 30 dias após abertura. Desde que
uma precipitação fina pode aparecer após
a refrigeração, a solução precipitante
deve ser gentilmente misturada antes do
uso, sem formação de espuma. Cor: azul.
KE2D1: 1 frasco × 110 mL (N6).
Materiais necessários mas não
fornecidos
Contador Gamma
Centrífuga — preferencialmente
refrigerada e capaz de pelo menos
1500xg
Agitador Vortex
Preparação dos Reagentes
Água destilada ou deionizada
Pipetas: 10 mL
Radioimunoensaio
Tubos comuns de polipropileno 12x75 mm
– disponível na Siemens Healthcare
Diagnostics (Números de catálogo: PPO).
Micropipetas: 100 µL, 200 µL e 1,0 mL
Espuma de decantação– disponível na
(Números de catálogo: FDR).
Papel gráfico logit-log
Um controle de imunoensaio baseado em
soro humano com três níveis, contendo
estradiol como um dos 25 constituintes
ensaiados, disponível na Siemens
Healthcare Diagnostics.
(Números de catálogo: CON6).
temperatura ambiente (15–28°C) antes do
uso.
1
Colheita
O paciente não necessita dieta. Não são
necessárias preparações especiais.
Colher o sangue em tubos comuns por
21
punção venosa, anotar a hora da
colheita, e separar o soro das células.
Calibradores
A lipemia pode interferir com o ensaio.
Recomenda-se o uso de uma ultra
centrífuga para clarear amostras
lipemicas.
Amostras hemolisadas podem indicar
tratamento incorrecto de uma amostra
antes do envio para o laboratório; portanto
os resultados devem ser interpretados
com cuidado.
Os tubos para colheita sanguínea de
diferentes fabricantes, podem originar
diferentes valores, dependendo dos
materiais e aditivos, incluíndo gel ou
barreiras fisicas, activadores do coágulo
e/ou anti coagulantes. Double Antibody
Estradiol não foram ainda testados com
todas as possiveis variações originadas
pelos tipos de tubos.
2
Volume de Amostra: 200 µL de soro por
tubo.
É recomendado que as amostras sejam
colectadas como soro. Plasma com EDTA
normalmente produzem resultados mais
elevados que o soro, mas plasma
heparinizado produz resultados os quais
são significativamente inferiores.
Variações significantes na concentração
de proteína total podem ter efeito no
ensaio.
nmol/L
A (MB)
0
0
B
5
0,02
C
10
0,04
D
20
0,07
E
50
0,18
F
150
0,55
G
500
1,84
Pipetar 200 µL do calibrador zero A
no interior dos tubos NSB e A, e
200 µL de cada um dos calibradores
remanescentes de B a G no interior
dos tubos correspondentemente
rotulados. Pipetar 200 µL de cada
controle e amostra de soro de
paciente no interior dos tubos
preparados.
Espera-se conterem nas amostras do
paciente concentrações de estradiol
superiores ao do calibrador mais alto
(500 pg/mL) deve ser diluído com o
calibrador zero antes do ensaio.
3
Adicione 100 µL de Anti-soro de
Estradiol (Azul) à todos os tubos
excepto tubos T e NSB. Vortex.
Um dispensador repetitivo é
recomendado para este item e para a
adição do traçador no item 5.
4
Incubar por 2 horas à temperatura
5
Adicione 100 µL de Estradiol
todos os tubos. Vortex.
125
Ià
Deixar os tubos T para as contagens
(item 11); pois os mesmos não
necessitam mais processamento.
Técnica de Radioimunoensaio
Todos os componentes excepto a
Solução Precipitante devem estar a
pg/mL
É boa prática usar uma pipeta de
pontas descartáveis, mudando a
ponta entre as amostras de modo a
evitar contaminação.
Armazenagem: 2 dias a 2–8°C ou por
20
2 meses congelados a –20°C.
Deixar as amostras atingir a temperatura
ambiente (15–28°C) e agitar suavemente
ou por inversão. Aliquotar se necessário
para evitar repetidos
congelamentos/descongelamentos. Não
descongelar as amostras por aquecimento
em banho-maria.
Rotular dezoito tubos em duplicata: T
(contagens totais), NSB (ligação não
específica), A (ligação máxima), e B a
G. Rotular tubos adcionais também
em duplicata, para amostras de soro e
controles.
6
Incubar por 1 hora à temperatura
37
7
Adicionar 1,0 mL de Solução
Precipitante resfriada (Azul) à todos
os tubos. Vortex.
Para a adição de 1,0 mL de reagente,
um dispensador repetitivo pode ser
empregado.
8
Incubar por 10 minutos à
9
Centrifugar por 15 minutos à 3000xg
– ou adequadamente por um longo
período de tempo à aceleração baixa,
e.g. 30 minutos à 1500 xg (ou
adequadamente por um longo período
de tempo à baixa aceleração, e.g.
30 minutos à 1500xg.)
10 Usar uma estante de espuma para
decantação, decante (ou aspire) o
sobrenadante, retendo o precipitado
para contagem.
Deixe os tubos invertidos em papel
absorvente por 10 minutos.
Gentilmente dar leve batidas nos
tubos, e escorrer suas bordas para
remover gotículas residuais.
11 Contar cada tubo por 1 minute.
Cálculo dos Resultados
(logarítmico) para cada um dos
calibradores diferentes de zero, e
representar uma linha recta em função da
trajectória destes pontos. Resultados de
amostras desconhecidas podem então ser
lidas nessa recta por interpolação.
È boa prática verificar os resultados pela
concordância entre as réplicas, e construir
um gráfico da curva de calibração (mesmo
que os cálculos sejam efectuados por
computador) para verificação visual da
aplicabilidade da transformação usada e
como forma para detectar pontos de
calibração que se afastem.
Parâmetros de QC: Nós recomendamos
a manutenção dos registros das medidas
da performance:
T = Contagens Totais (como contagens por
minuto)
%NSB = 100 × (Média Contagens NSB /
Contagens Totais)
%MB = 100 × (Contagens reais / Contagens
Totais)
E os 20, 50 e 80 porcento "intercepta,"
onde
20% = Concentração a 20 por cento de Ligação,
etc.
Para obter resultados de concentrações
duma representação logit-log da curva de
calibração, deve em primeiro lugar
calcular-se para cada par de tubos a
média de NSB-contagens por minuto
corrigidas:
Note que para outras perspectivas, como
a implementação de uma logística de 4
parâmetros, também é aceitável. Ver
Dudley RA, et al. Guidelines for
immunoassay data reduction. Clin Chem
1985;31:1264-71.
Contagens reais = (Média CPM) minutos (Média
NSB CPM)
Exemplo de Ensaio: Apenas para
ilustração, não para calcular resultados de
outro ensaio. (Ver tabela "Exemplo de
Ensaio".)
Determine a ligação de cada par de tubos
como percentagem do máximo de ligação
(MB), com o NSB-contagens por minuto
corrigidas dos tubos A tidas como 100%:
Percentagem de Ligação = (Contagens reais /
Contagens MB reais) × 100
(O cálculo pode ser simplificado omitindo
a correcção para a ligação não especifica;
amostras dentro da gama de calibração
originam virtualmente os mesmos
resultados quando a Percentagem de
Ligação é calculada directamente da
Média de CPM.)
Usando um papel milimétrico logit-log,
represente a Percentagem de Ligação no
eixo vertical (probabilidade) contra a
Concentração no eixo horizontal
38
Controlo de Qualidade
Controles (ou pools de soro) com pelo
menos dois níveis de concentração de
estradiol — baixo e alto — devem ser
rotineiramente ensaiados como
desconhecidos.
Os resultados dos pacientes devem
apenas ser reportados se os resultados
dos controlos para este ensaio estiverem
dentro dos critérios de aceitação
estabelecidos pelo laboratório.
È boa prática laboratorial registar para
cada ensaio o número do lote dos
componentes usados, bem como as datas
de quando foram primeiro reconstituídas
ou abertas. Recomenda-se registar os
valores diários em gráfico – como
descrito, por exemplo, in Westgard JO, et
al. A multi-rule chart for quality control.
Clin Chem 1981;27:493-501. Note que
amostras repetidas podem servir como
ferramenta adicional para monitorizar a
precisão inter-ensaio, e que pares de
controlos podem ser colocados ao longo
do ensaio para ajudar a verificar a
ausência de variação significativa. O
procedimento pede por uma centrifugação
à 3000 xg por 15 minutos. Baixas
acelerações são satisfatórias somente se
o período de centrifugação for
apropriadamente aumentado – por
exemplo, por 30 minutos à 1500 xg. Uma
centrifuga refrigerada, de alta velocidade,
é recomendada mas não essencial. Use
as fórmulas abaixo para calcular a
aceleração de sua centrífuga a uma dada
velocidade, ou à velocidade (em
revoluções por minuto) requerida para
alcançar uma força g desejada.
estabelecer os seus próprios valores de
referência.
força g = 28,38 × (rpm / 1 000)2 × raio [em
polegadas]
rpm = 299,1 × √(força g / raio [cm])
Ver tabelas e Gráficos para dados
representativos da performance do kit de
Estradiol Duplo Anticorpo. Excepto se
outra maneira especificada, os resultados
nas secções abaixo foram obtidos de
amostras de soro. Os resultados estão
expressos em pg/mL.
Valores de Referência
Factor de conversão:
pg/mL × 0,003671 → nmol/L
rpm = 187,7 × √(força g / raio [polegadas])
ou
força g = 11,18 × (rpm / 1 000)2 × raio [em cm]
Um estudo da faixa de referência
realizada com o kit Estradiol Duplo
Anticorpo gerou os seguintes resultados
em pg/mL.
Grupo
Mediana
Faixa
Central
95%
Faixa
Absoluta n
Mulheres
Mulheres Ovulantes
Fase Folicular
48
—
9–175
Fase Lutea
103
—
44–196 19
17
Peri-ovulatório
209
—
107–281 9
Pós-menopausa
tratada
122
—
42–289 12
Pós-menopausa não
tratada
7.4
—
ND–19
Contraceptivos Orais
13
ND–91
Homens
19
3–70
13
ND–100 49
<5–93
ND: não detectável
Considere estes limites apenas como
directrizes. Cada laboratório deve
49
Limitação
Amostras de pacientes que estão sob
terapia de reposição estrogenica, devem
ser extraídas antes do ensaio de
Estradiol. Contactar a Siemens Healthcare
Diagnostics para requerer informações a
respeito do procedimento de extracção.
O ensaio Estradiol Double Antibody está
calibrado gravimetricamente em como a
concentração de Estradiol da solução
stock usada para preparar os
calibradores, é determinada medindo a
densidade óptica a 282 nm (E = 2 100 e
MW = 272,4). O ensaio não está
padronizado usando valores derivados de
GC/MS, e por isso valores observados no
ensaio podem não estar de acordo com
valores obtidos por análise GC/MS.
Características do Ensaio
Calibração: 5 – 500 pg/mL
(0,02 – 1,84 nmol/L)
Sensibilidade Analítica: 1,4 pg/mL
Precisão Intra-ensaio (Entre ensaios):
Um perfil de precisão, baseado em
aproximadamente 20 graus de liberdade e
representar os CVs de Intra-ensaio
esperados para amostras ensaiadas em
duplicata, é apresentado. (Ver gráfico
“Precision Profile”.)
Precisão Inter-ensaio (Ensaio a
ensaio): Estatísticas são calculadas para
amostras de resultados de pares de tubos
em 21 ensaios diferentes. (Consulte a
tabela “Interassay Precision ".)
Efeito fim-de-série: Nenhum até
aproximadamente 200 tubos. (Ver tabela "
End-of-Run Effect ".)
Especificidade: O antisoro foi obtido com
derivado de estradiol na posição-3, e é
altamente específico para o estradiol com
reactividade cruzada extremamente baixa
39
com outros esteróides naturais ou
fármacos que possam estar presentes nas
amostras de pacientes.
Deve-se ter cuidado ao ensaiar amostras
de grávidas para estradiol, pois o nível de
estriol em circulação pode ser
suficientemente alto para interferir; no
entanto alguns outros esteróides irão
exibir uma pequena reacção cruzada, no
entanto a sua concentração fisiológica
normal são também muito baixas
comparadas ao estradiol para causar
interferência significante no procedimento
Estradiol Duplo Anticorpo. Deste modo,
deve-se ter cuidado ao ensaiar amostras
de recém-nascidos, pois reacção cruzada
de esteroides circulantes à altas
concentrações no período neonatal
podem causar resultados anormalmente
elevados.
Etinil-estradiol [1,3,5(10)-estratrien-17αetinyl-3,17β-diol] e noretindrona são
compostos usados nas combinações
usadas nos contraceptivos orais. Estes
compostos e seus números de derivados
também foram ensaiados. Os resultados
mostraram que estes compostos não
possuem efeito clinicamente significativos
nos níveis tipicamente encontrados em
circulação. (Ver tabela de "Specificity".)
Linearidade: As amostras foram
doseadas sob várias diluições. (Ver tabela
“Linearity”).
Bilirrubina: A presença de bilirrubina em
concentrações até 200 mg/L não tem
efeito em resultados, dentro da precisão
do ensaio.
Hemólise: A Presença de eritrocitos em
concentrações até 15 µL/mL não tem
efeito no resultado, dentro da precisão do
ensaio.
Comparação de Métodos: Dezenove
amostras de soro de pacientes foram
ensaiadas pelo procedimento Estradiol
Duplo Anticorpo e pelo Estradiol Coat-ACount, um radioimunoensaio fase-sólida
baseado em tubos recobertos com
anticorpo. Regressão linear:
(DAb) = 1,1 (CAC) – 15 pg/mL
r = 0,955
Médias:
40 pg/mL (Duplo Anticorpo)
40
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Por favor contacte o seu Distribuidor
Nacional.
O Sistema da Qualidade da Siemens Healthcare
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Symbol Definition
En: In vitro diagnostic medical
device
De: Medizinisches Gerät zur
In-vitro Diagnose
Es: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
Fr: Dispositif médical de
diagnostic in vitro
It: Dispositivo medico per
diagnostica in vitro
Pt: Dispositivo médico para
diagnóstico in vitro
En: Catalog Number
De: Katalog-Nummer
Es: Número de referencia
Fr: Numéro de référence
catalogue
It: Numero catalogo
Pt: Número de catálogo
En: Manufacturer
De: Hersteller
Es: Fabricante
Fr: Fabricant
It: Produttore
Pt: Fabricante
En: Authorized Representative in
the European Community
De: Autorisierte Vertretung in der
Europäischen Union
Es: Representante autorizado en
la Unión Europea
Fr: Représentant agréé pour
l’Union européenne
It: Rappresentante autorizzato
nella Comunità europea
Pt: Representante Autorizado na
Comunidade Europeia
En: CE Mark
De: CE-Kennzeichen
Es: Símbolo de la CE
Fr: Marque CE
It: Marchio CE
Pt: Marca CE
En: CE Mark with identification
number of notified body
De: CE-Kennzeichen
Identifikationsnummer der
benannten Stelle
Es: Marca de la CE con número
de identificación del organismo
notificado
Fr: Marque CE avec numéro
d’identification du corps notifié
It: Marchio CE con numero
identificativo dell'ente notificato
Pt: Marca CE, com número de
identificação do órgão notificado
Symbol Definition
En: Consult instructions for use
De: Bedienungshinweise
beachten
Es: Consulte las instrucciones de
uso
Fr: Consulter le mode d’emploi
It: Consultare le istruzioni per
l'uso
Pt: Consulte as instruções de
utilização
En: Caution! Potential Biohazard
De: Vorsicht! Biologisches
Risikomaterial
Es: ¡Precaución! Peligro Biológico
Potencial
Fr: Avertissement ! Risque
biologique potentiel
It: Attenzione! Potenziale Pericolo
Biologico
Pt: Precaução! Potenciais Riscos
Biológicos
En: Radioactive Materials
De: Radioaktives Material
Es: Materiales radiactivos
Fr: Matériaux radioactifs
It: Materiali radioattivi
Pt: Materiais Radioactivos
En: Caution
De: Vorsicht
Es: Precaución
Fr: Avertissement
It: Attenzione
Pt: Precaução
En: Temperature limitation
(2–8°C)
De: Temperaturgrenze (2–8°C)
Es: Limitación de la temperatura
(2–8°C)
Fr: Limites de température
(2–8°C)
It: Limiti di temperatura (2–8°C)
Pt: Limites de temperatura
(2–8°C)
En: Upper limit of temperature
(≤ -20°C)
De: Obere Temperaturgrenze
(≤ -20°C)
Es: Limitación superior de la
temperatura (≤ -20°C)
Fr: Limite supérieure de
température (≤ -20°C)
It: Limite superiore di temperatura
(≤ -20°C)
Pt: Limite máximo de temperatura
(≤ -20°C)
41
Symbol Definition
En: Lower limit of temperature
(≥2°C)
De: Mindesttemperatur (≥2°C)
Es: Temperatura maxima (≥2°C)
Fr: Limite inférieure de
température (≥2°C)
It: Limite inferiore di temperature
(≥2°C)
Pt: Limite inferior de temperatura
(≥2°C)
En: Do not freeze (> 0°C)
De: Nicht einfrieren (> 0°C)
Es: No congelar (> 0°C)
Fr: Ne pas congeler (> 0°C)
It: Non congelare (> 0°C)
Pt: Não congele (> 0°C)
En: Keep away from sunlight
De: Vor Sonneneinstrahlung
schützen
Es: Mantener protegido de la luz
solar
Fr: Maintenir hors de portée de la
lumière du soleil
It: Non esporre alla luce del sole
Pt: Manter protegido da luz solar
LOT
En: Batch code
De: Chargenbezeichnung
Es: Código de lote
Fr: Numéro de code du lot
It: Codice lotto
Pt: Código de lote
Symbol Definition
En: Harmful
De: Gesundheitsschädlich
Es: Nocivo
Fr: Nocif
It: Nocivo
Pt: Nocivo
En: Corrosive
De: Ätzend
Es: Corrosivo
Fr: Corrosif
It: Corrosivo
Pt: Corrosivo
En: Toxic
De: Giftig
Es: Tóxico
Fr: Toxique
It: Tossico
Pt: Tóxico
En: Dangerous for the
environment
De: Umweltgefährlich
Es: Peligroso para el medio
ambiente
Fr: Dangereux pour
l'environnement
It: Pericoloso per l'ambiente
Pt: Perigoso para o ambiente
En: Contains sufficient for (n)
tests
De: Es reicht für (n) tests
Es: Contiene material para (n)
pruebas
Fr: Suffisant pour (n) tests
It: Contiene materiale sufficiente
per (n) test
Pt: Contém o suficiente para (n)
testes
2008-01
En: Date format (year-month)
De: Datumsformat (Jahr-Monat)
Es: Formato de fecha (año-mes)
Fr: Format de la date
(année-mois)
It: Formato data (anno-mese)
Pt: Formato de data (ano-mês)
En: Use by
De: Verwendbar bis
Es: Fecha de caducidad
Fr: A utiliser avant
It: Usare entro
Pt: Use até
42

Estradiol - Meditecno

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Oração Oficial Ó Pai, enviaste o Teu Filho Eterno para salvar o

Achtung Caution Attention A vvertenza Advertencia Opgelet

AlgoMod (algoFMS8)

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