Análise de Coliformes

PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP
TÍTULO: ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS
TERMOTOLERANTES POR MEMBRANA FILTRANTE
CONTROLE
E MICROBIOLÓGICO
DATA: 15/10/10
P.O.P. N°.: CMI – 003
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1. OBJETIVO
Definir um procedimento para a análise de coliformes totais e termotolerantes pela técnica de
membrana filtrante.
2. ALCANCE
Este procedimento se aplica a análise de coliformes pelo Laboratório de Controle de Qualidade
Microbiológico.
3. POLÍTICA
É política da empresa cumprir com as Boas Práticas de Laboratório.
4. RESPONSABILIDADES
É responsabilidade da Chefia de departamento e da Chefia de setor orientar seus funcionários para a
correta execução deste procedimento.
É responsabilidade dos funcionários do Controle de Qualidade Microbiológica cumprirem com o
estabelecido neste procedimento.
É responsabilidade de quem o elabora e de quem o revisa atualizar e manter vigente este
procedimento.
5. DEFINIÇÕES
Coliformes totais: bacilos Gram - negativos, oxidase negativos, capazes de crescer na presença de
sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sódio) e de fermentar a lactose a 35-37°C,
com produção de gás e aldeído, em 24 horas. A maior parte das bactérias do grupo coliforme
pertencem aos gêneros Escherichia, Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Podem ocorrer no meio
ambiente, fezes humanas, em águas com alta concentração de matéria orgânica, solo ou vegetação em
decomposição.
Coliformes termotolerantes( ou fecais): microorganismos capazes de fermentar a lactose a 44-45°C
sendo representados principalmente pela Escherichia coli (fecal), e algumas bactérias dos gêneros
Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Somente Escherichia coli dentre estes microorganismos é de
origem exclusivamente fecal, estando presente em densidades elevadas nas fezes humanas,
ELABORADO:
REVISADO:
APROVADO CHEFIA:
SUBSTITUI A:
Antonio C. A. Canabarro
Stelamaris B. Ribeiro
Patricia C. Beneli
Controle Microbiológico
Controle Microbiológico
Reginaldo Schiavi
NOVO
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mamíferos e pássaros, sendo raramente encontrada na água ou no solo que não tenham recebido
contaminação fecal. Os demais, podem estar presentes com alto teor de matéria orgânica (efluentes
industriais), ou em material vegetal ou solo em decomposição.
6. MATERIAL E EQUIPAMENTO
- alça plástica estéril (loop)
- bandejas de plástico ou aço inox
- béquer 50mL, 100mL
- bico de Bunsen ou similar
- bolsas plásticas para coleta das amostras 120 mL
- bomba à vácuo
- caixa para esterilização de ponteiras
- cilindros inox para esterilização de placas de Petri
- equipamento ou sistema de filtração
- estantes de inox para tubos de ensaio
- estantes revestidas de PCV para bolsa plástica de coleta
- estojo inox para esterilização de pipetas
- frascos para água de lavagem 100mL, 250mL, 300mL, 500mL, 1000mL
- frascos para coleta das amostras de 250mL
- hastes de madeira esterilizadas
- incubadora bacteriológica ( 35°C ± 2°C)
- micropipetador 100 a 1000µL
- microscópio estereoscópico binocular, com iluminação fluorescente
- papel alumínio
- pinças de aço inox com extremidades arredondadas
- pipetas graduadas de 1mL, 5mL
- placas de Petri 60 x 15 mm
- placas de Petri descartáveis 60 x 15 mm
- ponteiras universais 100 a 1000µL
- provetas graduadas de 100mL, 250mL
- membranas filtrante estéreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de diâmetro e porosidade 0,45µm
(para a determinação de coliformes totais)
6.1. Reagentes
- água destilada estéril, confrome CMI-005
- água fosfatada uso esterilizada, conforme CMI 005
- álcool etílico 95%
ELABORADO:
REVISADO:
APROVADO CHEFIA:
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Stelamaris B. Ribeiro
Patricia C. Beneli
Controle Microbiológico
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- álcool etílico a 70%
- caldo EC Medium preparado conforme CMI 001
- caldo lactose ou caldo lauril sulfato com púrpura de bromocresol , concentração simples, conforme
CMI 001
- caldo verde brilhante com 2% de bile, confome CMI 001
- placas de Petri contendo o meio M-Endo Agar Les preparadas conforme CMI 001
- testes descartáveis com o meio M-Endo (Nutrient pad sets)
- tiossulfato de sódio 1,8%
7. DIAGRAMA DE FLUXO
ELABORADO:
REVISADO:
APROVADO CHEFIA:
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Controle Microbiológico
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Amostra
Filtração
M-Endo Agar Les
35°C / 24 horas
Colonias típicas
(com brilho metálico)
Ausência de colônia
teste negativo p/ coliformes
Colônias atípicas
Ausência de coliformes
Lactose / Lauril Sulfato
24h-48h/ 35ºC
Ausência de gás – Teste
negativo para coliformes
Produção de gás
Meio EC – 44,5ºC / 24h
Caldo Verde Brilhante e Bile
35°C / 24h -48h
Produção de gás
Teste positivo
para Coliformes
totais
ELABORADO:
Ausência de gás
Teste negativo
para Coliformes
totais
REVISADO:
Produção de gás
Teste positivo
para Coliformes
termotolerantes
APROVADO CHEFIA:
Ausência de gás
Teste negativo
para Coliformes
termotolerantes
SUBSTITUI A:
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Stelamaris B. Ribeiro
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8. PROCEDIMENTO
8.1. Preparação:
8.1.1 Antes de iniciar a análise desinfete a bancada de trabalho com álcool a 70%.
8.1.2. Disponha na bancada de trabalho o equipamento de filtração com porta filtro, placas de
Petri de de 60 x 15 mm contendo meio M-Endo Agar Les (para determinação de coliformes
totais), identifique-as com o número da amostra ou a identificação da amostra e a data, disponha
também a água de lavagem estéril, contida em frascos, para enxágüe, pinças com as
extremidades arredondadas, podendo flambá-las com álcool etílico contido em um béquer. Deixe
próximo também as membranas filtrantes estéreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de
diâmetro e porosidade de 0,45µm. Os bicos de Bunsen, acesos próximos, permitem manter um
ambiente asséptico e efetuar a flambagem das pinças utilizadas.
NOTA: Esta análise pode ser realizada em câmara de segurança biológica classe II sem o uso
de bico de Bunsen, as pinças estéreis, se disponíveis em número suficiente, podem ser
utilizadas individualmente por ponto de coleta.
8.1.3. Quando utilizadas as placas de testes descartáveis com o meio M-Endo (Nutrient pad
sets), disponha na bancada as placas, água destilada estéril, pipetas, pêra ou ponteiras e
micropipetador para hidratá-las. A hidratação deve seguir as orientações do fornecedor. Não
inverta estas placas para a incubação.
8.2. Análise:
8.2.1. Homogenize a amostra, no mínimo 25 vezes, inclinando o frasco até formar um ângulo de
45° entre o braço e o antebraço, e coloque 100 mL de água a ser filtrada.
NOTA: Caso o porta filtro não seja graduado, há necessidade de dosagem prévia do volume a
ser filtrado, nesta situação utilize uma proveta graduada estéril (100 mL), com a abertura
recoberta pelo papel alumínio da esterilização, e marque o filtro para as próximas amostras.
8.2.2. Retire a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça flambada e esfriada, coloque, na
base do suporte do filtro, uma membrana estéril, com a face quadriculada voltada para cima.
8.2.3. Recoloque a parte superior do porta filtro, tendo o cuidado para não danificar a membrana.
Ajuste e rosqueie.
8.2.4. Verta cuidadosamente no porta-filtro o volume da amostra a ser examinado, evitando que
a água respingue nas paredes do filtro.
NOTA: Se o volume da amostra a ser filtrado for inferior a 20 mL, é necessário adicionar ao
porta-filtro 20 mL a 30 mL de água de diluição estéril, antes de adicionar o volume da amostra.
8.2.5. Proceda à filtração da amostra, ligando a bomba à vácuo.
8.2.6. Enxágüe a membrana com porções de 20 a 30 mL de água de diluição estéril.
8.2.7. Desligue a bomba à vácuo, ao finalizar a operação. Evite a secagem excessiva da
membrana filtrante.
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8.2.8. Com o auxílio da pinça flambada e fria, retire a membrana do filtro, tomando o cuidado
para que a pinça toque apenas a parte periférica da membrana.
8.2.9. Obedecendo aos cuidados de assepsia, coloque a membrana sobre o meio de cultura MEndo Agar Les, evite a formação de bolhas de ar entre a membrana e o meio de cultura, pois
pode prejudicar o crescimento das colônias de bactérias.
8.2.10. Lave o filtro com 20 a 30 mL de água de diluição, antes de colocar a próxima membrana
para filtrar outra amostra.
NOTA: Cada unidade de filtração deve ser usada até no máximo para 30 amostras de água,
sucessivamente. Quando o intervalo, entre uma amostra e outra, ultrapassar 30 minutos, usar
nova unidade de filtração.
8.2.11. Após a filtração das amostras, coloque as placas em posição invertida, em bandejas
forradas com papel toalha umedecido.
8.2.12. Incube as placas, em estufa de incubação, a 35º ± 2°C por 24 + 2 horas.
8.2.13. Após a incubação, faça a leitura das amostras.
8.3. Resultados:
8.3.1. Uma placa que não apresente formação de colônias na membrana significa ausência para
coliformes totais.
8.3.2. Uma placa que apresente formação de colônias atípicas (incolores até vermelho escuras,
sem brilho metálico em sua superfície), ausência de coliformes totais.
8.3.3. Uma placa que apresente formação de colônias típicas (de coloração rosa a vermelho
escuro, com brilho verde metálico superficial recobrindo toda colônia ou parte dela), presença de
coliformes totais.
8.3.4. Para confirmar se dentre estes coliformes totais existem coliformes termotolerantes
proceda à confirmação das colônias.
8.4. Confirmação da presença de termotolerantes:
8.4.1. Passe o inóculo da placa com colônias típicas para o caldo lactosado, incube por 24 a 48
horas a 35º + 2°C.
8.4.2. Na ausência de formação de gás o teste é negativo para coliformes.
8.4.3. Se houve produção de gás passe o inóculo do caldo lactosado para o meio EC e incube a
44,5º C por 24 horas, passe o inoculo do caldo lactosado para o meio Verde Brilhante e Bile e
incube por 24 a 48 horas a 35º C.
8.4.4. No caldo verde brilhante e bile: se houve produção de gás o teste é positivo para
coliformes totais, na ausência de gás o teste é negativo para coliformes totais.
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8.4.5. No caldo EC: se houve produção de gás o teste é positivo para coliformes termotolerantes,
na ausência de gás o teste é negativo para coliformes termotolerantes.
9. ANEXOS
Não se aplica.
10. BIBLIOGRAFIA
Procedimento elaborado pelo Controle de Qualidade Microbiológico da ETA Cerrado do SAAE
Sorocaba de acordo com o manual:
___ CETESB ___ Técnicas de Análises Microbiológicas da água Membrana Filtrante. São Paulo,
2001.
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