EFAR - Diss - Priscila Gomes Reis - Teses e Dissertações
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EFAR - Diss - Priscila Gomes Reis - Teses e Dissertações
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS (CIPHARMA) TOXI CI DADE DO ARSÊNI O E DO ANTI M ÔNI O TRI VALENTES: I NFLUÊNCI A DA ENCAPSULAÇÃO EM LI POSSOM AS E DA ASSOCI AÇÃO AO ÁCI DO ASCÓRBI CO PRISCILA GOMES DOS REIS Ouro Preto ± MG ± Brasil 2010 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS (CIPHARMA) TOXI CI DADE DO ARSÊNI O E DO ANTI M ÔNI O TRI VALENTES: I NFLUÊNCI A DA ENCAPSULAÇÃO EM LI POSSOM AS E DA ASSOCI AÇÃO AO ÁCI DO ASCÓRBI CO PRISCILA GOMES DOS REIS Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Drª Neila Márcia Silva Barcellos Co-orientadoras: Profa. Dra. Andrea Grabe Guimarães Profa. Dra. Mônica Cristina Teixeira Ouro Preto ± MG ± Brasil 2010 Priscila Gomes dos Reis I R375TReis, Priscila Gomes dos. Toxicidade do arsênio e do antimônio trivalentes[manuscrito]: influência da encapsulação em lipossomas e da associação ao ácido ascórbico / Priscila Gomes dos Reis–2010. xxi, 122f.: il. color.; graf.; tab. Orientadora: ProfªDrªNeila Márcia Silva Barcellos. Coorientadoras: ProfªDrªAndréa Grabe Guimarães. ProfªDrª Mônica Cristina Teixeira. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Fármacos e Medicamentos 1. Toxicidade - Teses. 2. Arsênio - Teses. 3. Antimônio - Teses. 4. Lipossomas - Teses. I. Barcellos, Neila Márcia Silva. II. Guimarães, Andréa Grabe. III. Teixeira, Mônica Cristina. IV. Universidade Federal de Ouro Preto. V. Título. CDU: 615.9:602.628 Catalogação: [email protected] ´Que cada um considere a si mesmo, não como um homem procurando satisfazer sua própria sede de conhecimento,... mas como um colaborador numa grande obra comum UHODFLRQDGDFRPRVLQWHUHVVHVVXSUHPRVGDKXPDQLGDGHµ Hermann Von Helmholtz Priscila Gomes dos Reis II Dedico este trabalho: Aos meus pais, Celso e Lourdes, com quem posso contar e compartilhar todos os momentos e a quem devo profunda admiração e respeito. Muito obrigada pela educação que me deram e por terem feito de mim a pessoa que hoje sou; À minha irmã, Daniela, que sempre me dedicou profunda amizade e esteve ao meu lado em todos os momentos de alegrias e de dificuldades nesta trajetória. Priscila Gomes dos Reis III AGRADECI M ENTOS Em primeiro lugar, agradeço a DEUS, que está comigo em todos os momentos, principalmente nos mais difíceis, e por ter-me guiado a mais esta conquista; À minha orientadora Profa. Neila Márcia Silva Barcelos que, com sua extrema sabedoria e sensatez, me ensinou a extraordinária beleza em acreditar naquilo que se faz e fazer da ciência uma ferramenta para ajudar a humanidade; Às minhas co-orientadoras Profa. Andrea Grabe Guimarães e Profa. Mônica Cristina Teixeira pela dedicação, discernimento, amizade e imprescindível colaboração durante a realização deste trabalho. Sem vocês a conclusão deste não seria possível; Aos colaboradores Profa. Cláudia, Profa. Jacqueline, Prof. Alexandre, equipe do laboratório LGQA, em especial Adriana, Julio e Leonardo, equipe do LAPAC, em especial Roney, Cássio e Adão, pela disponibilização de equipamentos e esclarecimentos durante este trabalho. Aos membros da banca, Prof. Fréderic Frézard e Profa. Raquel Pilar, pela disponibilidade em contribuir com este trabalho. Aos alunos do Laboratório de Farmacologia Experimental, pelo auxílio precioso nos experimentos e na análise dos dados e principalmente pela amizade , em especial Alessandra, Camila, Carol Licio, Carol Moreira, Dani, Eduardo, Gustavo, Kelly, Kemile, Mariana, Miguel, Nívia e Tâmara. Aos colegas do mestrado pela amizade e companheirismo, em especial Renata, Patrícia e Paola. Ao Wilson pela ajuda no manejo dos animais e pela amizade. À república Drosófila por ter me acolhido com tanto carinho durante a graduação e o mestrado. Aos amigos e familiares pelo apoio, compreensão e carinho dedicados. A todas as instituições que possibilitaram a conclusão deste trabalho: - Capes pela concessão da bolsa de estudos; - Fapemig pelo suporte financeiro ao projeto (CDS - APQ-01186-09); - Rede Mineira de Nanotecnologia pelos equipamentos e reagentes; - UFOP por toda a minha formação acadêmica; - Cipharma Priscila Gomes dos Reis IV Resumo RESUM O O arsênio (As) e o antimônio (Sb) são semimetais há muito utilizados na terapêutica de enfermidades sendo que estudos recentes demonstram sua efetividade no tratamento de leishmaniose, esquistossomose e certos tipos de câncer. Estes fármacos apresentam várias semelhanças químicas e biológicas que possivelmente explicam o fato de a forma trivalente destes ser considerada a mais ativa na terapêutica e por outro lado a mais tóxica, principalmente sobre o sistema cardiovascular. Esta toxicidade muitas vezes inviabiliza o uso terapêutico, provoca altos índices de não adesão dos pacientes ao tratamento ou ainda torna necessário o uso de baixas doses, o que acarreta a possibilidade do aparecimento de formas resistentes de agentes infecciosos. Sabe-se que o desenvolvimento de novas formas farmacêuticas e a associação medicamentosa podem promover o rejuvenescimento de fármacos através da diminuição de seus efeitos tóxicos e/ou aumento do potencial terapêutico. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar, no modelo rato Wistar, a possibilidade de redução da toxicidade, principalmente a cardiovascular, do arsênio e antimônio trivalentes por administração concomitante com ácido ascórbico (AA) ou veiculação destes em lipossomas. As preparações lipossomais contendo As ou Sb foram realizadas pelo método de congelamento/descongelamento seguido de extrusão. Para identificação do teor de encapsulação destes nos lipossomas um método de quantificação foi desenvolvido e validado utilizando espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado. A eficiência de encapsulação do arsênio nos lipossomas foi de 8,92%, com vesículas de tamanho médio de 232 nm, índice de polidispersão 0,17 e potencial zeta ± 37,8 mV. A formulação lipossomal de Sb foi realizada pelo nosso grupo de pesquisa, anteriormente a este trabalho, e apresentou coeficiente de encapsulação de 14,5% com vesículas de tamanho médio de 149 nm e índice de polidispersão 0,014. Alterações cardiovasculares nos sinais de pressão (PA) e eletrocardiograma (ECG) foram avaliadas em protocolo agudo, através da administração, por via endovenosa em dose única, da dose máxima tolerada pelos animais (6,5mg/Kg de As e 17,0mg/kg de Sb), dos compostos semi-metálicos em estudo nas formas livre, lipossomal e associada ao ácido ascórbico. Foram identificados no grupo que recebeu As livre, prolongamento do intervalo PR com variação máxima de 22,49%, redução da pressão arterial sistólica e diastólica com variações percentuais máximas de -39,24% e -41,96%, respectivamente, além de redução de 8 a 27% na freqüência cardíaca, não sendo, no entanto, esta redução significativamente diferente do controle. Os animais que receberam As+AA apresentaram prolongamento do intervalo PR com variação percentual máxima de 17,73% não tendo sido observadas, porém, variações na pressão e freqüência cardíaca. Já nos animais tratados com a Priscila Gomes dos Reis V Resumo formulação lipossomal de As não foram observadas alterações significativas nos parâmetros do ECG e pressão. Nos animais que receberam o Sb livre foi observado prolongamento do intervalo QT e aumento do índice QTc com variações máximas de 21,95 e 19,42%, respectivamente, alem disso observou-se redução na pressão arterial sistólica e diastólica com variações máximas de -41,56 e 50,35%, respectivamente. Por outro lado, nos grupos tratados com Sb associado ao AA e com o Sb lipossomal não foram observadas alterações nos parâmetros avaliados. Realizou-se ainda, em protocolo subagudo, a administração do As ou do Sb via intraperitoneal (doses de 3,8 mg/Kg e 3,5mg/Kg, respectivamente) durante 30 dias e posterior avaliação das toxicidades cardiovascular, hepática, renal e hematológica, através de avaliação de ECG e pressão, dosagens bioquímicas, realização de hemograma e analise histopatológica. No grupo que recebeu As livre foram observados indícios de toxicidade cardiovascular tais como prolongamento dos intervalos QT, QTc e PR, na ordem de variação de 44.49, 44,13 e 5,5% respectivamente, além de degeneração hialina, edema, discreta inflamação e vacuolização de vasos no tecido cardíaco. Na avaliação da toxicidade hepática observou-se diminuição de fosfatase alcalina e presença de alargamento de sinusóides, congestão e discreta inflamação no tecido. Já na análise hematológica observou-se redução de linfócitos. No grupo que recebeu AA juntamente com o As, observou-se prolongamento de QT e Qtc com variações de 24,09 e 21,89% respectivamente as quais se mostraram significativamente menores quando comparadas às variações do grupo que recebeu somente As, além disso, não foram observadas quaisquer alterações no tecido cardíaco. A análise do tecido hepático também mostrou normalidade e ocorreu diminuição de fosfatase alcalina. Na análise hematológica observou-se aumento de linfócitos e diminuição de neutrófilos. No grupo tratado somente com Sb também foram observados indícios de toxicidade cardiovascular como prolongamento dos intervalos QT, QRS e índice QTc, na ordem de 33,67, 11,62 e 21,6%, respectivamente, e na análise do tecido cardíaco foram observadas as mesmas alterações relatadas para o arsênio só que em maior intensidade, além de necrose. Alterações indicativas de toxicidade hepática foram encontradas na análise histopatológica (necrose, congestão e inflamação discreta) e na análise bioquímica com o aumento de fosfatase alcalina. O grupo que recebeu Sb e AA também apresentou alterações em QT e QTc, com variação de 26,44 e 19,46% respectivamente. No entanto, estas são significativamente menores quando comparadas às do grupo tratado somente com Sb. Além disso, não foram observadas alterações histológicas, bioquímicas e hematológicas neste grupo. Assim, foi possível concluir que a veiculação do As e do Sb em lipossomas e a associação destes com o AA podem ser consideradas potenciais ferramentas na diminuição dos efeitos tóxicos provocados por estes semimetais no estado trivalente. Priscila Gomes dos Reis VI Abstract ABSTRACT Arsenic (As) and antimony (Sb) are semimetals that were widely used to treat diseases and recent studies have demonstrated its effectiveness in the treatment of leishmaniasis, schistosomiasis and some specific types of cancer. These compounds have many chemical and biological similarities that may explain the therapeutics activity and also the toxic effects, especially on the cardiovascular system, of their trivalent form. This toxicity often restrain the therapeutic use, causes treatment abandonment by patients and requires the use of low doses, resulting in long-term treatments and greater possibility of infectious agents resistant form occurence. It is known that the development of new pharmaceutical forms and therapy using drugs combination can promote the drugs rejuvenation by reducing their toxic effects and / or enhancing its therapeutic potential. The present study aimed to evaluate, model, the possible toxicity reduction, mainly the cardiovascular toxicity in Wistar rats, of As and Sb trivalent forms administrated simultaneously with ascorbic acid or encapsulated in liposomes. The encapsulation of As or Sb was carried out by freeze-thawed and extrusion. To identify the content of As and Sb encapsulation in liposomes, a method of quantification was developed and validated using inductively coupled plasma/optical emission spectrometry (ICPOES). The encapsulation efficiency of 15,5% of As into liposomes was obtained, with a medium size of 232 nm, polydispersity index of 0.17 and zeta potential -37.8 mV. The liposomal formulation of antimony was carried out by our research group, prior to this work, and showed encapsulation efficiency of 14.5 %, with a medium size of 149 nm, polydispersity index of 0.014. Cardiovascular FKDQJHV LQ WKH SUHVVXUH¶V VLJQV $3 DQG HOHFWURFDUGLRJUDP (&* ZHUH HYDOXDWHG in acute and subacute protocols. The first was carried out using a single dose administration of 6.5 mg/Kg of As and 17 mg/kg of Sb, in free or liposomal form or associate with ascorbic acid (AA). In animals that received As in free form was observed PR interval increases of 22.49 %, reduction of systolic (ASP) and diastolic pressure (ADP) of 39.24% and 41.96%, respectively. The animals that received As with AA presented 17.73 % of PR interval increasing, but AP did not change. The animals that received liposomal As did not presented significant changes in ECG parameters and AP. The free antimony induced 21.95 % and 19:42 % of QT interval and QTc index increase respectively, and reduction of SAP and DAP, maximum of -41.56 and -50.35 %, respectively. Moreover, the groups treated with Sb and AA, and liposomal Sb did not present significant changes of the cardiovascular parameters evaluated. In the subacute protocol, As or Sb were i.p. administrated at dose 3.8 mg/kg and 3.5 mg/kg, respectively, during 30 days and after that it was evaluated the cardiovascular (AP and ECG), and hematological (hemogram) toxicities, and for liver and kidney, the biochemical and Priscila Gomes dos Reis VII Abstract histopathological analysis were done. As free form induced cardiovascular toxicity, observed by the increase of QT (44.49 %), QTc (44.13 %) and PR (5.5 %), and hyaline degeneration, oedema, mild vacuolization and inflammation of heart tissue blood vessels. The blood analysis showed a reduction of lymphocytes. The liver evaluation showed decrease of alkaline phosphatase and presence of enlargement of sinusoids, congestion and mild inflammation in the tissue. AA was able to reduce the increase of QT (24.09 %) and QTc (21.89 %) induced by As, and there was not histological alterations of cardiac tissue. The AA also contributed to normal liver tissue and significant decrease of alkaline phosphatase. The blood analysis revealed an increase of lymphocytes and decreased neutrophils in AA with As treated animals. The Sb free form also increased QT (33.67 %), QTc (21.6 %) and QRS (11.62 %) intervals, and the cardiac tissue presented the same changes reported for As, however with greater intensity and with necrosis. The liver toxicity was observed by the presence of necrosis, congestion and mild inflammation, and alkaline phosphatase increase. AA The group that received Sb with showed increase of QT and QTc of 26.44 and 19.46 % respectively, values significantly smaller than the group treated only with Sb. In addition, there were no histological, biochemical and hematological changes in this group. Thus, we conclude that the delivery of As and Sb in liposomes and their association with ascorbic acid may be considered potential tools in reducing the toxic effects caused by these semimetals in the trivalent oxidation state. Priscila Gomes dos Reis VIII Í ndice de figuras Í NDI CE DE FI GURAS Figura 1: Mecanismo de ação e resistência dos antimoniais pentavalentes em amastigotas de Leishmania. Adaptado: Leishmaniasis: drugs in the clinic, resistance and new developments. Marc Ouellette, Jolyne Drummelsmith, Barbara Papadopoulou (2004).........................................10 Figura 2: Desenho esquemático da metabolização intracelular do ácido ascórbico. APX (ascorbato peroxidase), ASC (ascorbato), MDA (monodehidroascorbato), MDAR ( monodehidroascorbato redutase), DHA ( dehidroascorbato), DHAR ( dehidroascorbato redutase), GSSG (glutationa oxidada), GR (glutationa redutase), GSH (glutationa)......................................12 Figura 3: Aparelho ICP/OES da Spectro Ciros.............................................................................21 Figura 4: Desenho esquemático do processo de preparação dos lipossomas................................22 Figura 5: Leituras de arsênio (A) e antimônio (B) em ICP OES. A leitura correspondente à amostra de lipossomas vazios é a verde em (A) e a azul escuro em (B)........................................25 Figura 6: Sistema de aquisição dos sinais de ECG e PA...............................................................37 Figura 7: Traçado normal do ECG e seus intervalos ....................................................................38 Figura 8: Desenho esquemático do protocolo experimental agudo. (A) Protocolo agudo para os grupos As, Sb, PBS, AA, Lipossoma As, Lipossoma Sb, Lipossoma Branco; (B) Protocolo agudo para os grupos, Sb+AA, As+AA.....................................................................................................41 Figura 9: Desenho esquemático do protocolo experimental subagudo.........................................42 Figura 10: Curva padrão de arsênio obtido por ICP/ OES............................................................43 Figura 11: Registro gráfico da análise de tamanho dos lipossomas contendo Arsênio.................44 Figura 12: Registro gráfico do potencial zeta dos lipossomas contendo Arsênio.........................45 Figura 13: Espectro Xanes de amostras de lipossomas contendo arsênio. Eo ± Borda de absorção do As...............................................................................................................................................47 Priscila Gomes dos Reis IX Í ndice de figuras Figura14: Parâmetros do ECG em animais antes e após administração IV de As (A) As+AA (B) e Lipossoma As (C). .........................................................................................................................49 Figura 15: Variação percentual dos intervalos PR e QRS do ECG. Os valores representam a média ± e.p.m.* P < 0,05 em relação ao grupo PBS e #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ...............................................................................50 Figura 16: Variação percentual do intervalo QT do ECG e índice QTc. Os valores representam a média ± e.p.m. ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ..................................................................51 Figura 17: Exemplos de registro de pressão arterial ao longo do tempo após administração IV de PBS (A); As (B); As+AA (C); e Lipossoma As (D). ......................................................................52 Figura 18: Variação percentual de PAD, PAS e FC. Os valores representam a média ± e.p.m. * P < 0,05 em relação ao grupo PBS; #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco e + P< 0,05 em relação ao grupo As± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ...........................................................53 Figura 19: Ilustração de ECG obtido após administração IP. de As (A) e As+AA (B). ................55 Figura 20: Variação percentual dos parâmetros, PR, QRS, QT, QTc, após tratamento sub-agudo. Os valores representam a média ± e.p.m. * P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.........56 Figura 21: PAS PAD e FC após tratamento subagudo.Os valores representam a média ± e.p.m.57 Figura 22: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA (B), As (C), As+AA (D). Hematoxilina Eosina, 40X. .............................................................58 Figura 23: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA (B), As (C), As+AA (D). Observa-se em A, B, e D aspecto histológico compatível com normalidade. Em C observa-se foco inflamatório discreto, alargamento de sinusóides e congestão (setas). Hematoxilina Eosina, 40X. ................................................................................................60 Figura 24: Parâmetros do ECG antes e após administração IV de Sb (A), e Sb+AA (B).............64 Figura 25: Variação percentual dos intervalos PR e QRS do ECG. Os valores representam a média ± e.p.m.± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ...................................................................65 Priscila Gomes dos Reis X Í ndice de figuras Figura 26: Variação percentual do intervalo QT do ECG e do índice QTc. Os valores representam a média ± e.p.m. * P < 0,05 em relação ao grupo PBS, #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco e + P < 0,05 em relação ao grupo Sb+AA ± ANOVA, seguido de teste de Tukey..............66 Figura 27: Exemplos de registro de pressão arterial ao longo do tempo após administração IV de Sb (A) e Sb+AA (B). ......................................................................................................................67 Figura 28: Variação percentual de PAS, PAD eFC. Os valores representam a média ± e.p.m* P < 0,05 em relação ao grupo PBS, #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco e + P < 0,05 em relação ao grupo Lipossoma Sb e &P<0,05 em relação ao grupo Sb+AA ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. ................................................................................................................................68 Figura 29: Parâmetros do ECG antes e após tratamento subagudo com Sb (A), e Sb+AA(B).....69 Figura 30: Variação percentual dos intervalos do ECG e FC, após tratamento subagudo. Os valores representam a média ± e.p.m..* P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey...............70 Figura 31: PAS, PAD E FC após tratamento subagudo dos grupos Sb e Sb +AA . Os valores representam a média ± e.p.m.*P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.............................71 Figura 32: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Hematoxilina Eosina, 40X. *Degeneração hialina em várias células musculares; Setas indicam pequeno grupo de células inflamatórias (seta) e o pontilhado área de necrose em C..............................................72 Figura 33: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Observa-se em A, B, D aspecto histológico compatível com normalidade. Em C observa-se área de necrose e inflamação (pontilhada), alargamento de sinusóides e congestão (setas). Hematoxilina Eosina, 40X.............74 Priscila Gomes dos Reis XI Í ndice de tabelas Í NDI CE DE TABELAS Tabela 1: Parâmetros instrumentais do ICP/OES ...............................................................................20 Tabela 2: Curva analítica do antimônio (Sb) ......................................................................................26 Tabela 3: Curva analítica do arsênio (As) ..........................................................................................26 Tabela 4: Teste de variância para a linearidade...................................................................................27 Tabela 5: Resultados do estudo de repetibilidade ...............................................................................28 Tabela 6: Resultados do estudo de precisão intermediária .................................................................28 Tabela 7: Dados estatísticos do teste t de Student ..............................................................................28 Tabela 8: Dosagem de Arsênio em amostras de lipossomas. Valores expressos em média± erro padrão. .................................................................................................................................................43 Tabela 9: Diâmetro médio e índice de polidispersão da população de lipossomas. Valores expressos em média± erro padrão. .......................................................................................................................44 Tabela 10: Potencial zeta das amostras de lipossomas. Valores expressos em média± erro padrão...45 Tabela 11: Parâmetros indicadores de estabilidade da formulação de lipossomas contendo arsênio no período de 30 dias. ..............................................................................................................................46 Tabela12: Parâmetros indicadores da liberação do arsênio dos lipossomas a 37°C. .........................46 Tabela 13: Percentagem (%) de óbitos de animais que receberam solução de arsênio via IV............48 Tabela 14: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico. ...........59 Tabela 15: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico.............59 Priscila Gomes dos Reis XII Í ndice de tabelas Tabela 16: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade renal avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico.............61 Tabela 17: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos tratados com As submetidos ao tratamento subagudo. ..........................................................................................................................62 Tabela 18: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com Sb. .....................................................................................73 Tabela 19: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com Sb. .....................................................................................73 Tabela 20: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade renal avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com Sb. .....................................................................................75 Tabela 21: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos submetidos ao tratamento subagudo com Sb. ...............................................................................................................................76 Tabela A1: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de PBS. Média ± e.p.m. ..............................................................................................................................................111 Tabela A2: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Lipossoma branco. Média ± e.p.m. ......................................................................................................................112 Tabela A3: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de AA . Média ± e.p.m.. .............................................................................................................................................113 Tabela A4: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de As. Média ± e.p.m.. ................................................................................................................................................114 Tabela A5: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Lipossoma arsênio. Média ± e.p.m. .....................................................................................................................115 Tabela A6: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de As+AA. Média ± e.p.m. ...................................................................................................................................116 Priscila Gomes dos Reis XIII Í ndice de tabelas Tabela A7: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos de As do protocolo subagudo. Média ± e.p.m. ............................................................................................... 117 Tabela A8: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Sb. Média ± e.p.m. .................................................................................................................................................118 Tabela A9: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Lipossoma Sb. Média ± e.p.m. ...........................................................................................................................119 Tabela A10: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Sb+AA. Média ± e.p.m. ...................................................................................................................................120 Tabela A11: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos Sb do protocolo subagudo. Média ± e.p.m. .................................................................................................121 Priscila Gomes dos Reis XIV Í ndice de abreviaturas Í NDI CE DE ABREVI ATURAS AA Ácido ascórbico ALT Aspartato alaninatransferase APL Leucemia promielocítica aguda APX Ascorbato peroxidase AQP1 Aquaglicerporina de tipo 1 As Arsênio ASC Ascorbato AST Aspartato aminotransferase ATP Adenosina trifosfato bpm Batimentos por minuto BPR Vermelho de Bromopirogalol CDC Centro de controle de doenças CHOL Colesterol CKMB Creatino quinase fração MB DHA Dehidroascorbato DHAR Dehidroascorbato redutase DNA Ácido desoxiribonucleotídeo DSPC Distearoil-fosfatidilcolina DSPE Distearoil-fosfatidiletanolamina ECG Eletrocardiograma EE Eficiência de encapsulação EPM Erro padrão médio FA Fosfatase Alcalina FC Frequência cardíaca FDA Food and Drug Administration Priscila Gomes dos Reis XV Í ndice de abreviaturas GR Glutationa redutase GSH Glutationa reduzida GSSG Glutationa oxidada GTP Guanosina trifosfato GVS Lipossomas gigantes HE Hematoxicilina-Eosina ICH Harmonised Tripatite Guideline ICP-MS Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado ICP-OES Espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado INCA Instituto Nacional do Câncer IP Intraperitoneal IV Intravenoso LD Limite de detecção LQ Limite de quantificação LQTS Síndrome do intervalo QT longo LUVs Lipossomas unilamelares grandes MDA Monodehidroascorbato MDAR Monodehidroascorbato redutase MLVs Vesículas mutilamelares pequenas MRP Proteína associada a multirresistência a fármacos NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato OMS Organização Mundial da Saúde PA Pressão arterial PAD Pressão arterial diastólica PAS Pressão arterial sistólica Priscila Gomes dos Reis XVI Í ndice de abreviaturas PC Fosfatidil colina PE Fosfatidiletanolamina PEG Polietilenoglicol PLGA Copolímero de ácido lático e glicólico PML Proteína de leucemia promielocítica ROS Espécies reativas de oxigênio Sb Antimônio SCV Sistema Cardiovascular SIDA Doença da imunodeficiência adquirida SNA Sistema Nervoso Central SUVs Lipossomas unilamelares pequenos T(SH)2 Tripanotiona reduzida TDR1 Enzima redutase dependente de tiol TOA ou ATO Trióxido de arsênio Priscila Gomes dos Reis XVII Sumário SUM ÁRI O RESUM O.............................................................................................................................................V ABSTRACT......................................................................................................................................VII LI STADE FI GURAS.........................................................................................................................IX LI STA DE TABELAS.......................................................................................................................XII LI STADE ABREVI ATURAS..........................................................................................................XV 1.I NTRODUÇÃO.................................................................................................................................1 2. REVI SÃO DA LI TERATURA........................................................................................................5 2.1. Arsênio............................................................................................................................................6 2.2. Antimônio........................................................................................................................................8 2.3. Ácido Ascórbico............................................................................................................................11 2.4. Lipossomas ...................................................................................................................................13 3. OBJETI VOS...................................................................................................................................16 3.1. Objetivo Geral ..............................................................................................................................17 3.2. Objetivos Específicos....................................................................................................................17 4. CAPÍ TULO 1: Validação de método analítico para quantificação de arsênio e antimônio em lipossomas através de espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado..............................................................................................................................................18 4.1 Introdução......................................................................................................................................19 4.2 Materiais e Métodos.......................................................................................................................20 4.2.1 Reagentes..................................................................................................................................20 4.2.2 Equipamentos...........................................................................................................................20 4.2.3 Lipossomas...............................................................................................................................21 4.2.4 Especificidade..........................................................................................................................23 4.2.5 Linearidades.............................................................................................................................23 4.2.6 Precisão....................................................................................................................................23 Priscila Gomes dos Reis XVIII Sumário 4.2.7 Exatidão....................................................................................................................................23 4.2.8 Robustez...................................................................................................................................24 4.2.9 Limites de detecção e quantificação.........................................................................................24 4.3 Resultados......................................................................................................................................25 4.3.1 Especificidade..........................................................................................................................25 4.3.2 Linearidade...............................................................................................................................26 4.3.3 Precisão....................................................................................................................................27 4.3.4 Exatidão....................................................................................................................................29 4.3.5 Robustez...................................................................................................................................29 4.3.6 Aplicação do método................................................................................................................29 4.4 Discussão........................................................................................................................................30 5. CAPÍ TULO 2: Avaliação da toxicidade do arsênio e antimônio trivalentes............................31 5.1 Introdução.....................................................................................................................................32 5.2 Métodos..........................................................................................................................................32 5.2.1. Lipossomas.................................................................................................................................32 5.2.1.1. Caracterização da preparação dos lipossomas........................................................................32 5.2.1.1.1. Determinação da eficiência de encapsulação.......................................................................32 5.2.1.1.2. Determinação do tamanho dos lipossomas..........................................................................33 5.2.1.1.3. Determinação da carga superficial dos lipossomas..............................................................33 5.2.1.1.4. Perfil de liberação in vitro a partir dos lipossomas..............................................................33 5.2.1.1.5. Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas......................................................34 5.2.1.1.6. Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostra de lipossomas .....................34 5.2.2. Experimentos in vivo..................................................................................................................36 5.2.2.1.Animais ...................................................................................................................................36 5.2.2.2. Obtenção da dose máxima tolerada (DMT) ...........................................................................36 5.2.2.3.Obtenção dos parâmetros cardiovasculares.............................................................................37 Priscila Gomes dos Reis XIX Sumário 5.2.2.4. Avaliação dos parâmetros cardiovasculares............................................................................38 5.2.2.5. Avaliação Hematológica..........................................................................................................38 5.2.2.6.Avaliação Bioquímica..............................................................................................................39 5.2.2.7. Avaliação Histopatológica.......................................................................................................39 5.2.2.8. Protocolos Experimentais........................................................................................................40 5.2.2.8.1. Protocolo Agudo...................................................................................................................40 5.2.2.8.2. Protocolo Subagudo.............................................................................................................41 5.2.2.9. Análise estatística ...................................................................................................................42 5.3. Resultados.....................................................................................................................................43 5.3.1. Arsênio.......................................................................................................................................43 5.3.1.1. Lipossomas..............................................................................................................................43 5.3.1.1.1. Caracterização da preparação de lipossomas.......................................................................43 a Determinação da eficiência de encapsulação....................................................................................43 b Determinação do tamanho dos lipossomas.......................................................................................44 c Determinação da carga superficial dos lipossomas...........................................................................45 d Perfil de liberação in vitro a partir dos lipossomas...........................................................................46 e Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas...................................................................46 f Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostra de lipossomas.. .................................47 5.3.1.2. Experimentos in vivo ..............................................................................................................48 5.3.1.2.1. Obtenção da dose máxima tolerada (DMT) ........................................................................48 5.3.1.2.2.Protocolo agudo....................................................................................................................48 5.3.1.2.3. Protocolo Subagudo.............................................................................................................54 a. Avaliação da toxicidade cardiovascular............................................................................................54 b. Avaliação da toxicidade hepática.....................................................................................................59 c. Avaliação da toxicidade Renal..........................................................................................................61 d. Avaliação da toxicidade Hematológica............................................................................................62 Priscila Gomes dos Reis XX Sumário 5.3.2. Antimônio...................................................................................................................................63 5.3.2.1. Lipossomas..............................................................................................................................63 5.3.2.2. Experimentos in vivo...............................................................................................................63 5.3.2.2. Obtenção da dose máxima tolerada (DMT) ...........................................................................63 5.3.2.2.2.Protocolo agudo....................................................................................................................63 5.3.2.2.3. Protocolo Subagudo.............................................................................................................69 a. Avaliação da toxicidade cardiovascular........................................................................................... 69 b. Avaliação da toxicidade hepática.................................................................................................... 73 c. Avaliação da toxicidade Renal..........................................................................................................75 d. Avaliação da toxicidade Hematológica............................................................................................76 5.4. Discussão.......................................................................................................................................77 5.4.1. Lipossomas.................................................................................................................................77 5.4.2. Avaliação das alterações cardiovasculares ................................................................................79 5.4.3. Avaliação Hepática ....................................................................................................................84 5.4.4. Avaliação Renal..........................................................................................................................86 5.4.5. Avaliação Hematológica.............................................................................................................87 6. CONCLUSÃO................................................................................................................................89 7. REFERÊNCI AS BI BLI OGRÁFI CAS.........................................................................................91 8. ANEXOS ......................................................................................................................................109 Priscila Gomes dos Reis XXI I ntrodução 1. I NTRODUÇÃO Priscila Gomes dos Reis 1 I ntrodução Diversos e milenares são os relatos do uso de compostos de metais e semi-metais como agentes terapêuticos, dentre estes se encontram o arsênio (As) e o antimônio (Sb), os quais apresentam várias semelhanças químicas e biológicas: ambos possuem os mesmos estados oxidativos, interagem com grupos tiois intracelulares no organismo e aparentemente são transportados pelas mesmas famílias de proteínas nas células humanas. Sabe-se, ainda, que a forma trivalente destes é considerada a forma mais ativa no tratamento das enfermidades em que atuam, sendo por outro lado a mais tóxica. Na antiguidade, o As foi utilizado no tratamento de diversas doenças na forma de trióxido em XPDVROXomRGHQRPLQDGD³)RZOHU´HDWXDOPHQWHYHPVHQGRHPSUHJDGRFRPVXFHVVRQRWUDWDPHQWR de neoplasias mielóides. Já o Sb, na forma de tártaro emético (composto de antimônio trivalente), foi o primeiro medicamento sintético utilizado no tratamento da esquistossomose. Atualmente este é utilizado no tratamento da leishmaniose, entretanto, somente através de compostos pentavalentes devido aos efeitos adversos atribuídas à sua forma trivalente. No entanto, estudos sugerem que o Sb(V), na realidade, se trata de um pró-fármaco e que, in vivo, é ionizado e reduzido a Sb(III) para somente assim exercer sua atividade. As enfermidades que são ou têm potencial de voltarem a ser tratadas com As e Sb, como o câncer, leishmaniose e esquistossomose, apresentam elevada incidência mundial. O câncer é responsável por aproximadamente 13% das mortes, cerca de sete milhões de pessoas a cada ano, sendo que, no Brasil constitui a segunda maior causa de morte por doença (INCA, 2009). A leishmaniose é endêmica em 88 países (Desjeux, 2005) e está associada a 2-4 milhões de casos com incapacitação de vida durante anos, além de cerca de 70.000 mortes por ano (Desjeux, 1996). Já a esquistossomose mansônica é uma endemia mundial, ocorrendo em 52 países e territórios, principalmente na América do Sul, Caribe, África e Leste do Mediterrâneo. No Brasil, a transmissão ocorre em 19 estados (Brasil, 2005) onde se estima que haja 8 milhões de portadores (Neves, 2004). Por outro lado, é conhecido que estes fármacos induzem marcantes efeitos tóxicos, principalmente sobre o sistema cardiovascular e renal. Esta toxicidade muitas vezes inviabiliza o uso terapêutico, provoca altos índices de desistência do tratamento pelos pacientes ou ainda torna necessário o uso de baixas doses, o que acarreta em tratamentos longos e em maior possibilidade de aparecimento de formas resistentes de agentes infecciosos. Neste contexto, justifica-se a pesquisa e otimização de formulações que possam atenuar a toxicidade destes fármacos, como recomendado pela Organização Mundial de Saúde, OMS (Liew, et al., 1993). Há dois métodos de abordagem para fazer induzir melhorias na quimioterapia. Em primeiro Priscila Gomes dos Reis 2 I ntrodução lugar, há a necessidade óbvia de continuar a busca de novos fármacos, o que muitas vezes é um processo demorado e de elevado custo, e que nem sempre resulta na descoberta de algo mais eficaz. Em segundo lugar, há a possibilidade de melhorar o potencial terapêutico e reduzir a toxicidade dos fármacos já estabelecidos e devidamente testados modificando sua formulação ou associando-os a outros que induziriam atividade sinérgica. No que diz respeito à associação de fármacos, estudos têm demonstrado aumento da atividade, diminuições de efeitos tóxicos e da resistência do As em pacientes tratados concomitantemente com ácido ascórbico (AA) (Bahlis et al.,2002; Singh, 2007). Tal ação provavelmente está relacionada à depleção de glutationa, tiol intracelular, provocada por este composto. A ação do AA sobre o Sb, fármaco cujo mecanismo de ação também envolve grupos tiois, ainda não foi investigada, até onde se tem conhecimento. Já com relação à modificação de formulações, uma evolução é o transporte desses fármacos através de nanocarreadores (Bungaard, Hasan e Kofod, 1982), que oferecem não só um meio de alterar a distribuição tecidual, mas são também capazes de alterar a toxicidade, farmacocinética e consequentemente a excreção renal desses fármacos. Lipossomas, vesículas nanométricas constituídas de fosfolipídios, possuem a propriedade de veicular substâncias ativas hidrofílicas ou lipofílicas, podendo conferir distribuição corporal diferenciada, lenta liberação, baixa excreção renal, maior estabilidade e modificadas interações com células hospedeiras e patogênicas (Blume e Cevic, 1990). Permitem, ainda, o direcionamento a alvos específicos, como células e tecidos, aumento da potência e/ou redução da toxicidade da substância encapsulada (Chon e Cullis, 1995; Lasic, 1998). Compostos de As e Sb trivalentes, substâncias hidrossolúveis, possuem elevado potencial para serem veiculados no compartimento aquoso dos lipossomas e, a partir deste compartimento ser liberado lentamente induzindo o prolongamento de seu tempo de ação, bem como redução de possíveis efeitos tóxicos. Recentemente nosso grupo de pesquisa avaliou a redução da cardiotoxicidade do tártaro emético, através de análise de traçado do eletrocardiograma e pressão arterial, quando encapsulado em lipossomas estabilizados estericamente, obtendo resultados relevantes (dados não publicados). Com relação ao As, desde que o TRISENOX (marca comercial do trióxido de arsênio) foi aprovado para uso no tratamento da LPA (Leucêmia promielocítica aguda), vários estudos têm sido realizados no intuito de desenvolver formulações deste medicamento encapsulado em lipossomas. No entanto, estudos in vivo da atividade e/ou efeitos adversos destas formulações ainda não foram Priscila Gomes dos Reis 3 I ntrodução descritos. Face ao exposto, este trabalho teve por objetivo avaliar a possibilidade de redução da toxicidade, principalmente a cardiovascular, do As e do Sb trivalentes por administração concomitante com AA ou veiculação em lipossomas. Priscila Gomes dos Reis 4 Revisão Bibliográfica 2. REVI SÃO DE LI TERATURA Priscila Gomes dos Reis 5 Revisão Bibliográfica 2.1. Arsênio O uso medicinal do arsênio e seus derivados data de 2400 anos (Antman, 2008). Sua fase áurea como agente terapêutico foi entre o final do século XIX e meados do século XX, através do XVR GH XPD IRUPXODomR FRQWHQGR DUVrQLR WULYDOHQWH FRQKHFLGD FRPR ³6ROXomR GH )RZOHU´ (VWD solução era empregada no tratamento de enfermidades tão numerosas quanto distintas, tais como a psoríase, pênfigo, dermatite herpetiforme, leishmaniose, sífilis dentre outras (Gontijo e Bittencourt, 2005). Além disso, no final de 1800's o arsênio foi relatado como o primeiro agente terapêutico eficaz no tratamento da leucemia (Kwong e Todd, 1997). Atualmente, o arsênio vem sendo utilizado no tratamento de tripanossomíases que acometem o sistema nervoso central (Kuzoe, 1993), como agente antineoplásico no tratamento da leucemia promielocítica aguda (LPA) recidiva ou refratária e em casos de pacientes com múltiplos mielomas resistentes às quimioterapias convencionais (Bahlis et al., 2002). Em 25 de setembro de 2000, o FDA (Food and Drug administration) aprovou o trisenox, nome comercial do TOA (trióxido de arsênio) injetável, como agente terapêutico no tratamento de LPA nos Estados Unidos da América. No estudo pivô multicêntrico deste medicamento, 70% dos pacientes apresentaram completa remissão do quadro patológico (Jean, 2001). Além disso, estudos in vitro com linhagens de células e culturas de tumores primários demonstraram sensibilidade ao TOA o que mostra possível ação em outros tipos de neoplasias (Borad et al, 2005; Bahlis et al, 2002; Wang, 2001). No entanto, a expansão de sua utilidade clínica tem sido limitada pela toxicidade provocada quando utilizado em doses maiores (Evens et al, 2004). São diversos os efeitos tóxicos do arsênio trivalente. Há aqueles que, apesar de incômodos, não comprometem o tratamento com estes compostos, dentre os quais podem ser citados as reações cutâneas, perturbações gastrointestinais, hepatite e ocasionalmente leucocitose. No entanto, o efeito sobre o sistema cardiovascular muitas vezes limita a terapia com compostos contendo este metal. A principal alteração cardiovascular é o prolongamento do intervalo QT do eletrocardiograma o qual pode vir a induzir arritmias graves, principalmente quando pacientes apresentam doenças cardiopulmonares ou distúrbios eletrolíticos como hipocalemia e hipomagnesemia. Tal efeito parece ser dependente da dose e mediado por inibição dos canais de íon potássio (Au e Kwong, 2008). Possível mecanismo que explicaria este efeito adverso seria a afinidade do arsênio por grupos sulfidrilas de proteínas, inibição da respiração mitocondrial e a competição com o fosfato durante a fosforilação oxidativa (Verstovsek et al, 2006). São variadas as vias pelas quais o TOA atua sobre células cancerígenas. Estudos têm Priscila Gomes dos Reis 6 Revisão Bibliográfica demonstrado que o TOA induz a célula a apoptose, estimula a diferenciação e inibe a angiogênese no interior de tumores. Segundo Chen e colaboradores, 1998 a apoptose se daria através da indução da célula tumoral ao stress oxidativo, visto que, o TOA interage com a glutationa (GSH) intracelular, um tripeptídeo responsável pela inativação de compostos reativos de oxigênio, ao diminuir a regeneração desta através da glutationa redutase, e, conseqüentemente, ativa enzimas e co-fatores que são redox-sinalizados como a p53, proteína que regula a restauração de danos no DNA celular e leva a célula a apoptose em casos nos quais estes são irreparáveis (Akay e Gazitt , 2003; Karlsson et al., 2004; Kircelli et al., 2007) . Já o estímulo à diferenciação celular seria através da degradação da proteína PML-RAR-alfa (Miller et al., 2002) ,que é o que também ocorre com células neoplásicas na presença de antimônio trivalente. A semelhança observada entre o antimônio e o arsênio não se limita ao anteriormente citado e a muito vem sendo relatada na literatura (Muller et al, 2009; Salerno e Garnier-Suillerot, 2003; Rosen et al, 2002; Gebel, 1998). Ambos possuem os mesmos estados de oxidação (-3, 0, +3 e +5) e em ambientes redutores as espécies pentavalentes destes íons podem ser convertidas nas espécies trivalentes. A elevada toxicidade dos compostos trivalentes desses metais parece estar associada ao fato de que estas espécies apenas se dissociam em valores de pH superior ao fisiológico e portanto permeiam mais facilmente as membranas celulares (Frézard, et al., 2001). Sofrem, também, efluxo celular por mecanismos dependentes de glutationa e de proteínas de membrana da família MRP (Ashutosh e Goyal, 2007). Também deve ser destacada a afinidade do arsênio e antimônio pelos grupamento sulfidrol encontrado em moléculas de glutationa e cisteína, importantes no combate intracelular de radicais livres, a qual pode estar associada ao mecanismo de ação e de toxicidade destes semimetais (Frézard et al., 2001 e Teixeira et al, 2005 ). A interação do arsênio com grupos tióis é bem estabelecida na literatura (Duncan et al., 2006; Jiang et al., 2003; Kala et al., 2000; Shimizu et al., 1998; Kreppel et al.,1993; Scott et al., 1993). Alguns estudos em células resistentes ao TOA comprovam a relação entre esta interação e sua ação antineoplásica. Células leucêmicas desenvolveram resistência a este fármaco devido à elevação do GSH in vitro (Kitamura et al., 2000; Seo et al. , 2007) e em modelo animal (Lee et al., 2006). Uma vez que a interação espontânea de arsênico com GSH é lenta, a conjugação celular mostrou-se principalmente catalisada pela GSH S-transferase (GST) (Leslie et al., 2004 ; Wang e Lee, 1993), o que está de acordo com a super expressão desta enzima em várias linhagens de células resistentes ao arsênio (Brambila et al., 2002, Kojima et al., 2006, Liu et al., 2001 ; Wang e Lee, 1993). Baseado no conhecimento que a diminuição dos níveis de GSH tornam as células neoplásicas Priscila Gomes dos Reis 7 Revisão Bibliográfica mais sensíveis ao TOA (Heffete et al.,2008; Duechler et al., 2007; Grad et al., 2001 e Huang e Lee, 1996) e que o ácido ascórbico (AA) é conhecido por empobrecer reservatórios celulares de GSH , este tem sido utilizado em combinação com o AA (Qazilbash et al, 2008). Além disso, alguns estudos têm demonstrado possíveis diminuições de efeitos tóxicos causados pelo arsênio em pacientes tratados com esta associação (Bahlis et al.,2002 e Singh, 2007). Diante disso, pode se esperar que fármacos semelhantes ao arsênio, como o antimônio, que também interagem com tióis intracelulares, poderiam ter o seu índice terapêutico e atividade melhorados, além da diminuição de resistência, se associados ao ácido ascórbico. 2.2. Antimoniais O uso de antimoniais, data da antiguidade, sendo que seu estabelecimento como fármaco ocorreu em 1657 quando Louis XIV relatou ter-se curado de febre tifóide com o uso de tártaro emético, um antimônio trivalente. Há relatos, até o século XVIII, do uso deste composto no tratamento de diversas enfermidades como sífilis, lepra, peste, dentre outras, sendo sua utilização interrompida devido aos efeitos adversos que provocava (MacCallum, 1999). No século XX, no entanto, Gaspar Vianna testou o tártaro emético no tratamento da leishmaniose cutânea obtendo resultados extremamente satisfatórios (Leonidas, 1985) e três anos mais tarde, em 1915, na Itália, foi comprovada a eficácia deste no tratamento de leishmaniose visceral (Rath et al, 2003). Já em 1918, Christopherson demonstrou a atividade esquistossomicida do tártaro emético no tratamento da esquistossomose, o que foi um grande avanço e ponto de partida para a busca de novos fármacos sintéticos (Harder, 2002). Devido aos graves efeitos tóxicos associados aos antimoniais trivalentes estes foram sendo substituídos por compostos pentavalentes no tratamento da leishmaniose (Marsden, 1985) e por compostos não antimoniais no tratamento da esquistossomose (Harder, 2002). Atualmente, o praziquantel é o fármaco de escolha nesta ultima doença (Cioli et al. 1995; Cioli, 1998) enquanto que no tratamento da leishmaniose os antimoniais utilizados são complexos de SbV (antimoniato de meglumina ou Glucantime® ou estibogluconato de sódio ou Pentostam®), com exceção na região de Bihar, na Índia, onde foi detectada a ocorrência de cepas de Leishmania resistentes (Marsden, 1985; Murray, 2001). Há estudos que tentam explicar os mecanismos desta resistência. Ashutosh e colaboradores (2007) e Haimeur e colaboradores (2000) propuseram que a diminuição do fármaco ativo dentro da célula ocorre por diferentes mecanismos: uma possível redução da captação de Sb através da regulação negativa do transportador de membrana AQP1 (Aquaglicerporina de tipo 1); Priscila Gomes dos Reis 8 Revisão Bibliográfica aumento do efluxo do fármaco causado por regulação positiva de transportadores da família MRP (Proteína de Multirresistêcia a drogas) e família ABC; menor conversão de Sb(V) a Sb (III) através da diminuição da GSH no macrófago e T(SH)2 no parasita. Nos últimos anos, na tentativa de evitar o surgimento de cepas de leishmania com resistência primária aos antimoniais, principalmente em países como Sudão, Quênia e Índia, doses progressivamente maiores, tem sido recomendadas pela OMS e pelo Centro de Controle de Doenças ± CDC dos Estados Unidos da América. A taxa de resistência aos antimoniais pentavalentes na Índia pode chegar a 50% (Brasil, 2004; Medeiros et al., 2005). Por outro lado, os efeitos tóxicos limitam o aumento das doses destes fármacos sendo o efeito cardiotóxico o maior responsável (Marsden, 1985; Murray, 2001). Em pacientes que receberam compostos pentavalentes alterações dose-dependente nos eletrocardiogramas (ECG) foram encontradas (Chulay, et al, 1985; Katlama, et al,1985; Muller, et al., 1982; Saenz, et al., 1987; Antezana, et al., 1992), sendo as mais comuns, o achatamento ou inversão da onda T e o prolongamento do intervalo QT, que pode ser observado até mesmo em terapias de curto prazo e em baixas doses. Em alguns casos, esse aumento no intervalo QT é de mais de 500 ms, aumento este que pode ser relacionado à morte súbita durante o tratamento, ocorrendo também uma pequena redução de duração da onda P (Ribeiro, et al. 1999). Em contradição à maior toxicidade atribuída a compostos trivalentes, Lacerda-junior e colaboradores (1965) em estudo comparativo das alterações eletrocardiográficas entre tratamentos com antimoniais trivalentes e pentavalentes, demonstraram que não há qualquer correlação entre o tipo de composto e a alteração encontrada no ECG, determinando que ambos provocam as mesmas alterações. Neste mesmo estudo, além das alterações já citadas, foram observados também alteração difusa da repolarização ventricular, isquemia subepicárdica e traçado sugestivo de pericardite aguda. Visto que os antimoniais trivalentes, apesar de causar inúmeros efeitos colaterais, apresentam grande eficácia, estudos recentes buscam a redução desses efeitos para que este possa novamente ser utilizado em terapêutica. De Melo e colaboradores em 2003, demonstraram o aumento da eficácia e redução dos efeitos adversos do tártaro emético, em camundongos infectados com schistossomas, através de sua encapsulação em lipossomas furtivos. Há também fortes indícios da possível utilização destes compostos no tratamento do câncer (Müller et al, 2009; Sharma et al, 2008; Hsu et al, 1963; Hsu et al, 1963). Quanto ao mecanismo de ação dos antimoniais, apesar de serem utilizados na terapêutica a mais de meio século, até o presente momento não foi completamente elucidado (Marsden, 1985, Priscila Gomes dos Reis 9 Revisão Bibliográfica Ephros et al., 1999, Frézard, et al., 2001), permanecendo dúvidas quanto à espécie ativa do antimônio e organelas ou moléculas alvo. Com relação à ação antiparasitária dos compostos pentavalentes, supõe-se que o complexo organometálico sofra, inicialmente, uma reação de dissociação para que o antimônio, na sua forma iônica, seja reduzido à forma trivalente e, assim, exerça a sua atividade (Figura 1). Recentemente, foi demonstrado que a glutationa (GSH) poderia ser o agente redutor humano envolvido na redução in vivo do Sb(V) e que essa reação é mais rápida em pH 5 - que corresponde ao valor de pH dos compartimentos celulares, onde o parasita Leishmania se aloja - do que em pH 7,2, pH do citosol (Wyllie et al, 2004; Frézard, et al., 2001). Já Yan e colaboradores (2002), Ferreira e colaboradores (2003) e Denton e colaboradores (2004) demonstraram que essa reação provavelmente ocorre através da tripanotiona (T(SH)2), tiol mais abuntante encontrado na Leishmania. Outra possibilidade de mecanismo de ação seria a inibição de enzimas envolvidas no metabolismo do DNA e do RNA do parasita (Lucumi, et al., 1998) ou ainda há a hipótese de que ocorra por inibição dos adenosina (ATP) e guanosina trifosfatos (GTP ou AGP) (Berman, 1988), através do bloqueio da atividade glicolítica e oxidativa de ácidos graxos de amastigotas, uma vez que esta diminui a capacidade de fosforilação de ADP a ATP levando à depleção de ATP intracelular (Berman, 1988; Koff e Rosen, 1994). Figura 1: Mecanismo de ação e resistência dos antimoniais pentavalentes em amastigotas de Leishmania. Adaptado: Leishmaniasis: drugs in the clinic, resistance and new developments. Marc Ouellette, Jolyne Drummelsmith, Barbara Papadopoulou (2004) Priscila Gomes dos Reis 10 Revisão Bibliográfica Estudos buscam explicar ainda o possível mecanismo de ação envolvido na atividade antineoplásica dos compostos antimoniais. Müller e colaboradores (2009) observaram que ao expor clones de células encontradas na leucemia promielocítica aguda (LPA), como a NB4 e NB4R4 (sendo a primeira linhagem sensível ao ácido retinóico, medicamento de escolha em LPA, e a segunda resistente) ao trióxido de antimônio ou ao tártaro emético, ocorre a degradação da enzima responsável pela não diferenciação das células mielóides progenitoras (PML-RAR-alfa), reorganização dos corpos nucleares de PML e aumento da apoptose dessas células, que como já citado, é o que acontece em células tratadas com trióxido de arsênio o que nos leva a crer que o mecanismo de ação destes seja semelhante. 2.3. Ácido ascórbico O ácido ascórbico (AA) é uma vitamina hidrossolúvel que se constitui em um suplemento natural na nossa dieta, sendo a forma naturalmente encontrada o L-isômero. A metabolização do ácido ascórbico intracelular se dá por intermédio da ação da glutaredoxina com conversão de glutationa a glutationa dissulfeto. Esta via desintoxica o peróxido de hidrogênio (H2O2), que é uma das espécies reativas de oxigênio produzidas pelo metabolismo humano. Na primeira etapa desta via, H2O2 é reduzido à água pela ascorbato peroxidase, usando o ascorbato como doador de elétrons. O ascorbato oxidado (monodehidroascorbato) é regenerado pela monodehidroascorbato redutase (Wells e Xu, 1994). No entanto este é um radical e, caso não seja rapidamente reduzido, se dissocia em ascorbato e dehidroascorbato, o qual é, então, reduzido a ascorbato pela enzima dehidroascorbato redutase à custa de GSH, produzindo glutationa oxidada (GSSG). Finalmente GSSG é reduzido pela glutationa redutase, usando NADPH como doador de elétrons (Whitbread et al, 2005; Rouhier et al, 2002) (Figura 2). Priscila Gomes dos Reis 11 Revisão Bibliográfica Figura 2: Desenho esquemático da metabolização intracelular do ácido ascórbico. APX (ascorbato peroxidase), ASC (ascorbato), MDA (monodehidroascorbato), MDAR ( monodehidroascorbato redutase), DHA ( dehidroascorbato), DHAR ( dehidroascorbato redutase), GSSG (glutationa oxidada), GR (glutationa redutase), GSH (glutationa). O ácido ascórbico é importante na síntese de colágeno e carnitina. Ajuda a manter os vasos capilares, ossos e dentes além de auxiliar na absorção de ferro (Sies e Stahl, 1995; Levine et al., 1995), porém é principalmente reconhecido por sua atividade antioxidante agindo como redutor de espécies reativas de oxigênio (Weber, Bendich e Schalch, 1996). Estudos epidemiológicos sugerem que a ingestão do AA está negativamente correlacionada com a incidência de doença vascular. Tal atividade pode ser atribuída à ação antioxidante e a regulação do metabolismo do colesterol, visto que, o ácido ascórbico evita a oxidação das lipoproteínas de baixa densidade e regula a enzima responsável pela conversão do colesterol em ácidos biliares. Além disso, este protege células vasculares de músculo liso e células endoteliais da citotoxicidade pelo estresse oxidativo (Arakawa et al, 2003). A ação deste composto na prevenção e combate do câncer é há muito relatada (Kaegi, 1998). Segundo revisão realizada por Cameron e colaboradores (1979), o ácido ascórbico é essencial para a integridade da matriz intercelular e sua resistência ao crescimento infiltrativo de células malignas, além de permitir que o organismo produza uma barreira de tecido fibroso em volta do tumor. Há, ainda, fortes indícios de envolvimento deste na inibição de enzimas neoplásicas e estimulação do Priscila Gomes dos Reis 12 Revisão Bibliográfica sistema imunológico contra essas células malignas. Oferece, também, proteção contra uma variedade de agentes cancerígenos químicos, físicos e biológicos. Estudos têm demonstrado que o ácido ascórbico pode ter um papel inesperado no tratamento do câncer quando administrado via endovenosa em concentrações farmacológicas. Trabalho realizado por Chen e colaboradores (2005) investigaram, em experimento in vitro, a mortalidade de células neoplásicas e de células normais quando expostas ao arsênio associado ao ácido ascórbico. As células normais não foram afetadas, o que não ocorreu com as neoplásicas, sendo a morte celular destas correlacionada com a formação de H2O2 extracelular uma vez que a geração deste foi dependente da concentração de ácido ascórbico, tempo de incubação e presença de soro. Além disso, tem sido observado o aumento da atividade e redução de desenvolvimento de resistência à antineoplásicos, que tem seu mecanismo de ação envolvido com tióis intracelulares, quando estes estão associados ao ácido ascórbico. Este é o caso do TOA, como citado anteriormente, que além desses benefícios apresentou redução de sua toxicidade em rins, miocárdio e fígado de ratos (Rana et al., 2006; Single et al., 2006). Diante disso, pode se esperar que fármacos semelhantes ao arsênio, como o antimônio, que também interagem com tióis intracelulares, poderiam ter o seu índice terapêutico e atividade melhorados, além da diminuição de resistência, se associados ao ácido ascórbico. 2.4. Lipossomas Outra possível tentativa de contornar os efeitos adversos do arsênio e do antimônio seria a possibilidade de encapsulação desses semimetais em sistemas de vetorização de fármacos, como os lipossomas, vesículas esféricas compostas por uma bicamada fosfolipídica concêntrica, que encerram no seu interior um determinado volume de solução aquosa. Inicialmente usados como modelos de membranas biológicas (Bangham et al., 1965), estes vetores têm sido freqüentemente utilizados s no transporte e liberação de fármacos, podendo encapsular substâncias hidrofílicas em seu interior, hidrofóbicas em suas bicamadas lipídicas e anfifílicas na interface lipídio/água (Lasic, 1998). Existe uma ampla variedade de lipossomas no que diz respeito à composição, estrutura e tamanho. Assim, de acordo com a lamelaridade e tamanho, os lipossomas convencionais são classificados em (Gregoriadis, 1993): lipossomas unilamelares pequenos (SUVs); lipossomas unilamelares grandes (LUVs); lipossomas multilamelares (MLVs) e lipossomas gigantes (GVs). O processo de preparação dos lipossomas é crucial para delinear o tipo de estrutura a ser obtida. O desenvolvimento bem sucedido de uma formulação depende de fatores como seleção dos Priscila Gomes dos Reis 13 Revisão Bibliográfica lipídios, natureza da substância encapsulada, método utilizado na incorporação do agente a ser encapsulado e metodologia de obtenção das vesículas. Existem várias metodologias (Hope et al., 1986) para a preparação de lipossomas, as quais, de modo geral, são compostas por três etapas básicas: 1) diluição dos fosfolipídios em solvente orgânico seguida de evaporação deste para obtenção do filme lipídico; 2) hidratação do filme lipídico em meio aquoso; 3) redução do tamanho da vesícula e/ou do número de camadas, se for o caso A encapsulação de substâncias em lipossomas permite sua distribuição corporal diferenciada, podendo demonstrar maior estabilidade, excreção reduzida, modificadas interações com células hospedeiras e patogênicas (Blume e Cevic, 1990), além de atingir alvos específicos, como células e tecidos, aumentando a potência e/ou reduzindo a toxicidade da substância encapsulada. O tipo de lipossoma utilizado para uma determinada finalidade está diretamente relacionado à sua composição e estrutura e, dependendo da forma de administração, pode alcançar diferentes sítios no organismo (Lasic, 1998). Após administração endovenosa, os lipossomas convencionais são rapidamente removidos da corrente circulatória e intensamente capturados no fígado pelos macrófagos. A remoção desses lipossomas da corrente circulatória depende do tamanho, carga de superfície e estabilidade. Geralmente, vesículas grandes e carregadas positivamente são fagocitadas mais rapidamente que aquelas com carga negativa (Patel, 1992). A adição de polietilenoglicol (PEG) à superfície lipossomal origina estruturas furtivas, estericamente estabilizadas, as quais escapam do sistema fagocitário devido à redução da opsonização das vesículas pelas proteínas plasmáticas, proporcionando maior tempo de circulação (Klibanov et al., 1990; Woodle, 1995). Experimentos de Palmer e colaboradores (1984) demonstraram que o acúmulo de lipossomas em tecidos com isquemia, como a que ocorre no câncer e em tecidos infartados, é um fenômeno geral, que pode ser explicado por menor filtração nestas áreas. Ao estudar o acúmulo de imuno lipossomas no tecido infartado de coelho, Torchilin e colaboradores (1992) observaram que lipossomas de circulação prolongada, estabilizados estericamente com PEG, sofrem maior acúmulo no tecido infartado de coelhos em relação aos lipossomas convencionais. A dimensão deste acúmulo dependeria, ainda, do tamanho das vesículas (Torchilin et al., 1996). Maruyama (1998) relata que elevado acúmulo de lipossomas revestidos com PEG foi observado em modelos de tumor em ratos e que resultados de estudos clínicos de tratamentos com a doxorrubicina encapsulada em lipossomas PEG-(DOXIL), em sarcoma de Kaposi relacionado com a Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA), revelou um aumento de eficácia terapêutica com a droga livre. Priscila Gomes dos Reis 14 Revisão Bibliográfica Os compostos antimoniais, incluindo o Glucantime®, já foram testados sob a forma encapsulada em lipossomas contra a leishmaniose visceral experimental, em hamster, camundongo e cão. O efeito da encapsulação destes compostos em lipossomas na sua eficiência contra a leishmaniose visceral foi espetacular, com um aumento de até 700 vezes (Alving, 1986; Croft, 1986). Frézard e colaboradores (2000) desenvolveram um novo método para encapsulação do antimoniato de meglumina em lipossomas, o qual apresenta várias vantagens em relação ao método convencional, pois, permite a encapsulação do fármaco com maior rendimento e, além disso, a formulação resultante não apresenta os problemas de estabilidade encontrados na formulação convencional, por poder ser liofilizada e reconstituída no momento do uso. Outros fármacos, cuja atividade foi aumentada por sua administração na forma encapsulada em lipossomas, são a pentamidina e a anfotericina B. Como já citado, De Melo e colaboradores (2003) avaliaram o tartarato emético encapsulado no tratamento da esquistossomose, em modelos de camundongos infectados com Shistosoma mansoni. Lipossomas de circulação prolongada foram identificados como mais efetivos que lipossomas convencionais, provavelmente por reduzir a toxicidade do antimônio e liberar efetivamente este fármaco em estágios avançados da infecção pelo parasita. Com relação ao arsênio, vários são os estudos do desenvolvimento de formulações deste composto em lipossomas. Kallinteri e colaboradores (2004) testaram a encapsulação do ATO em lipossomas constituídos de duas composições lipídicas diferentes (EggPC/Chol (1:1) e DSPC/Chol (1:1)) e através três técnicas diferentes (hidratação de filme, sonicação e método DRV), obtendo taxas de encapsulação que variaram de 0,003 a 0,506 mol de TOA/mol de lipídeo. Chen e colabodores (2006) avaliaram o aumento da estabilidade de lipossomas através da liberação lenta de compostos de arsenito ligados a metais de transição. No entanto, não foram encontrados na literatura trabalhos que avaliassem a atividade ou redução da toxicidade do arsênio veiculado em lipossomas. Priscila Gomes dos Reis 15 Objetivos 3. OBJETI VOS Priscila Gomes dos Reis 16 Objetivos 3.1. Objetivo Geral: Avaliar a possibilidade de redução da toxicidade do arsênio e antimônio, no modelo rato, por administração concomitante com ácido ascórbico ou ainda pela encapsulação do arsênio trivalente em lipossomas. 3.2. Objetivos Específicos: z Desenvolver e Validar método analítico de quantificação de arsênio e antimônio em lipossomas através espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES). z Encapsular o arsênio trivalente em lipossomas e realizar sua caracterização físico-química. z Identificar, no modelo rato, as alterações cardíacas agudas advindas da administração da dose única, por via endovenosa (IV), da dose máxima tolerada do arsênio e do antimônio trivalentes nas formas livre, administrados concomitante com ácido ascórbico e encapsulados em lipossomas z Avaliar as alterações cardíacas, hematológicas, renais e hepáticas indicativas de toxicidade, advindas da administração por via intraperitonial (IP), de doses utilizadas na terapêutica, em regime subagudo (30 dias), dos compostos em estudo, nas formas livre e concomitante com ácido ascórbico. Priscila Gomes dos Reis 17 Capítulo 1 4. CAPÍ TULO 1: Validação de método analítico para quantificação de arsênio e antimônio em lipossomas através de Espectrometria de Emissão Atômica com Plasma I ndutivamente Acoplado Priscila Gomes dos Reis 18 Capítulo 1 4.1. I ntrodução Neste capítulo é apresentada a validação de um método analítico para quantificar os compostos de arsênio e antimônio em matriz lipossomal. Em geral, métodos espectrométricos e espectrofotométricos são utilizados para a quantificação destes compostos, como espectrofotômetro de absorção atômica acoplado a gerador de hidretos, espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES), dentre outros (Rath et al, 1997; Kallinteri et al, 2004; Antimisiaris et al, 2005; Langdon et al, 2005, Schettini et al, 2006). No entanto, de acordo com a matriz no qual o composto está inserido, há a necessidade de processo de digestão da amostra, reações de acoplamento com outras substâncias, dentre outros procedimentos os quais muitas vezes tornam a metodologia trabalhosa e onerosa. Neste contexto, ao trabalharmos com estes compostos veiculados em lipossomas, identificamos a necessidade de desenvolver uma técnica simples, rápida e econômica que nos permitisse avaliar rotineiramente o teor de encapsulação de As e Sb em nossas amostras. Para alcançar este objetivo, utilizou-se o ICP/OES, um tipo de espectroscopia de emissão que utiliza o plasma indutivamente acoplado para a excitação de íons e átomos que emitem radiação eletromagnética em comprimentos de onda característicos de um elemento em particular (Stefánsson et al, 2007). A intensidade desta emissão é indicativa da concentração do elemento na amostra. Este é um método usado para a detecção de traços de metais e tem vantagens relevantes como a análise de pequenos volumes de amostras, baixas concentrações, a determinação simultânea de muitos elementos, alta sensibilidade e curto tempo de análise (Giné-Rosias, 1998). Para garantir a confiabilidade de métodos aplicáveis a análises quantitativas é imprescindível que estes sejam previamente validados (Bressolle et al., 1996; Causon, 1997; Shah et al., 2000; Brasil, 2003; Bansal e DeStefano, 2007; Chandran e Singh, 2007). A validação do método em questão foi estabelecida através da avaliação dos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) segundo os critérios estabelecidos pela Resolução 899 da ANVISA (Agência de Vigilância Sanitária no Brasil) e normas do ICH (Harmonised Tripatite Guideline). Priscila Gomes dos Reis 19 Capítulo 1 4.2. M ateriais e M étodos 4.2.1. Reagentes Tartarato Emético, Arsenito de sódio e colesterol foram adiquiridos da Sigma (USA). L-Įdistearoylphosphatidylcholine (DSPC) e PEG (2000)-distearoylphosphatidyl-ethanolamine (DSPEPEG) foram fornecidos pela Lipoid GmBh (Ludwigshafen, Alemanha). Todos os solventes utilizados foram de grau analítico. 4.2.2. Equipamentos O equipamento utilizado foi o espectrômetro ótico Ciros CCD (Spectro) com plasma acoplado indutivamente (ICP/OES) (Figura 3). Neste a amostra é nebulizada em plasma de argônio através de um nebulizador cross-flow para ICP e as leituras da radiação eletromagnética emitida pelos elementos estudados são realizadas em linhas específicas. Diferentes linhas de emissão foram avaliadas para identificação daquelas que permitiriam melhores leituras das emissões originárias das amostras lipossomais de As e Sb. Demais parâmetros utilizados pelo aparelho encontram-se descritos na tabela 1. Tabela 1: Parâmetros instrumentais do ICP/OES Potência do Plasma 1350 W Fluxo de Refrigeração 12,0 l/min Fluxo do Gás Auxiliar 1,0 l/min Fluxo de gás nebulizador 0,90 l/min Priscila Gomes dos Reis 20 Capítulo 1 Figura 3 ± Aparelho ICP/OES da Spectro Ciros. 4.2.3. Lipossomas Foram preparados lipossomas de arsenito de sódio e de tártaro emético compostos pelos lipídios distearoil-fosfatidilcolina (DSPC) (Lipoid GmBh, Alemanha) colesterol (CHOL) (Sigma, EUA), e distearoil-fosfatidiletanolamina acoplado a um polímero de etilenoglicol (DSPE-PEG) (Lipoid GmBh, Alemanha) na relação molar 5:4:0,3 em um total de lipídios de 76,9g/L. Os lipossomas foram obtidos através da metodologia de congelamento/descongelamento proposta por Mayer e colaboradores. (1985) seguida de extrusão através de membranas de policarbonato de 200 nm como proposta por Nayar e colaboradores (1989). Os lipídios foram solubilizados em clorofórmio e este evaporado com auxílio de um evaporador rotatório (Laborota4000®, Heidolph Instruments, Alemanha) a 70 rpm e 60°C por 10 minutos, levando à formação de um fino filme lipídico nas paredes do balão. Após completa remoção do solvente orgânico, o filme lipídico foi hidratado por solução de arsenito de sódio (39,0 mg/ml) ou tártaro emético (80 g/l) isotônica em relação ao plasma para obtenção de lipossomas multilamelares contendo a substância ativa, ou por solução salina tamponada para a obtenção de lipossomas ³EUDQFRVRXYD]LRV´ As soluções obtidas foram, então, homogeneizadas por 5 minutos em evaporador rotatório e Priscila Gomes dos Reis 21 Capítulo 1 submetidas a 10 ciclos de congelamento e descongelamento utilizando nitrogênio líquido e banho a 60°C, o que favorece a encapsulação da substância ativa hidrofílica no compartimento aquoso lipossomal. Em seguida, pDUD REWHQomR GH YHVLFXODV XQLODPHODUHV /89¶V FRP GLVSHUVmR GH tamanho uniforme, a solução de lipossomas foi filtrada sob pressão em extrusora (Lipex Biomembranes, Canadá). Foram realizados dez ciclos de extrusão através de duas membranas de policarbonato de 25 mm de diâmetro e poros de 0,2ȝm, sob pressão de 200 a 300 psi e temperatura controlada a 60°C. A separação dos compostos encapsulados do não encapsulado nos lipossomas foi realizada mantendo-se a preparação em diálise em tampão fosfato (150mM NaCl, 10mM fosfato, pH 7.2) durante 24 horas, utilizando membrana de celulose de 10 mm x 6mm de diâmetro (Sigma Aldrick, EUA). Pequena fração da preparação antes da diálise foi separada para determinação da eficiência de encapsulação. A figura 4 apresenta esquematicamente o processo de preparação dos lipossomas descrito. Figura 4: Desenho esquemático do processo de preparação dos lipossomas. Para análise do teor de encapsulação por ICP/OES as amostras foram preparadas através da transferência de uma alíquota de 100 µl da formulação de lipossomas de As ou Sb para um balão aferido de 10 ml. Em seguida, adicionou-se 0,5 ml de metanol. A solução foi então submetida à agitação para romper a estrutura lamelar dos lipossomas e liberar o conteúdo encapsulado. Por último, o volume foi completado com água ultra-pura. Priscila Gomes dos Reis 22 Capítulo 1 4.2.4. Especificidade Para identificar possíveis interferências da matriz lipossomal nas análises de As e Sb, foi observado se a linha base na formulação de lipossomas brancos coincidia com a linha base do aparelho. Para isso foram analisadas formulações com e sem os semimetais. 4.2.5. Linearidade A linearidade foi estabelecida pela análise estatística de três curvas padrão elaboradas a partir da diluição de soluções estoques de concentração de 100,0 mg/l. As soluções de trabalho foram obtidas a partir dessas soluções e foram diluídas em diferentes concentrações dos metais, 3,0 a 50,0 mg/l de antimônio e 3,0 a 40,0 mg/l para o As. A linearidade foi avaliada através de análise de regressão, utilizando ajuste dos dados pelo método dos mínimos quadrados. Para avaliar numericamente a qualidade do ajuste do modelo, utilizou-se a análise de variância (ANOVA), p < 0,05. 4.2.6. Precisão Para o estudo da precisão foram avaliadas a repetibilidade (intra-dia) e a precisão intermediária (inter-dia). Ambos foram obtidos através da determinação de três concentrações de As e Sb (5,0, 10,0 e 30,0 mg/l) que abrange o intervalo linear do método, com três réplicas cada. Para a repetibilidade as determinações ocorreram em um curto período de tempo e de precisão intermediária em dois dias diferentes. Os resultados foram avaliados pelo teste t de Student ( p <0,05). 4.2.7. Exatidão A exatidão foi avaliada através da recuperação de quantidades conhecidas dos semimetais As e Sb adicionada às formulações lipossomais placebo em três diferentes concentrações: 5,0, 10,0 e 30,0 mg/l. Todas as amostras foram preparadas em triplicata (n = 9). O coeficiente de variação e a porcentagem de recuperação foram utilizados para avaliar a exatidão, a qual foi definida como: Exatidão = (concentração obtidos experimental / teórico de concentração) x 100 Priscila Gomes dos Reis 23 Capítulo 1 4.2.8. Robustez A robustez do método proposto foi verificada pela variação do analista na preparação da amostra (A1 e A2) e pela variação do fabricante do metanol (Merck (A) e OmniSolv (B)). A concentração de 20,0 mg/l das substâncias foi determinada em triplicata e a avaliação da robustez foi realizada pela análise dos coeficientes de variação utilizando o teste t de Student (teste bicaudal, p <0,05). 4.2.9. Limites de Detecção e de Quantificação Os limites de quantificação foram obtidos através da avaliação de concentrações decrescentes das amostras. Estes foram experimentalmente estabelecidos como a menor concentração quantificada com precisão e exatidão. Os limites de detecção foram determinados, matematicamente, a partir da curva analítica resultante da média das três curvas analíticas. O cálculo para determinar os valores baseia-se no desvio padrão residual da linha de regressão e sua relação com a inclinação da reta (coeficiente angular) na curva analítica, seguindo a relação: LD = (D.P./I) x 3,3 , Onde: D.P.: desvio padrão do intercepto com relação ao eixo dos Y; I: valor da inclinação da curva analítica. Priscila Gomes dos Reis 24 Capítulo 1 4.3.Resultados No desenvolvimento do método as linhas de emissão identificadas com melhor emissão foram 189,042 para o arsênio e 206,833 para o antimônio, sendo as mesmas utilizadas para determinação dos parâmetros de validação. 4.3.1. Especificidade A leitura da amostra composta somente por matriz lipossomal representado pela linha verde na leitura de arsênio (figura 5A) e azul na leitura do antimônio (figura 5B) coincidiu com a linha base do aparelho. (A) (B) Figura 5: Leituras de As (A) e Sb (B) em ICP OES. A leitura correspondente à amostra de lipossomas vazios é a verde em (A) e a azul escuro em (B). Priscila Gomes dos Reis 25 Capítulo 1 4.3.2. Linearidade Os dados das curvas analíticas, resultantes de três curvas padrão, foram ajustados por análise de regressão linear (Tabelas 2 e 3). A equação da reta de As é dada por: Emissão = 2052,23 [As] (mg/l) + 464,41, com coeficiente de correlação de 0,9997. Já a equação da curva do Sb é: Emissão= 3704,30 [Sb] (mg/l) -1523,48 com coeficiente de correlação de 0,9996. O teste de análise de variância (ANOVA) avaliou a qualidade do ajuste do modelo linear (tabela 4), visto que, os valores de F calculados apresentaram-se menores que os valores de F teóricos, com 95% de confiança. Tabela 2: Curva analítica do antimônio (Sb) Concentração de Sb Média da Emissão Concentração calculada de Sb (mg/l) (±D.P.)* (±D.P.)* 3,0 10987,3 ± 441,98 3,4 ± 0,12 5,0 17525,7 ± 97,59 5,1 ± 0,03 7,5 26586,3 ± 250,80 7,6 ± 0,07 10,0 35279,7 ± 659,70 9,9 ± 0,18 20,0 70324,3 ± 1727,97 19,4 ± 0,47 30,0 107721,7 ± 132,07 29,5 ± 0,04 40,0 147485,0 ± 1984,69 40,2 ± 0,54 50,0 184798,3 ± 4326,50 50,3 ± 1,17 *DP = Desvio Padrão, n=3 Tabela 3: Curva analítica do arsênio (As) Concentração de As Média da Emissão Concentração calculada de (mg/l) (± D.P.)* As (± D.P.)* 3,0 6094,7 ± 32,52 2,7 ± 0,01 5,0 10450,7 ± 109,82 5,0 ± 0,05 7,5 15937,0 ± 73,37 7,5 ± 0,04 10,0 21012,0 ± 73,61 10,0 ± 0,04 20,0 41858,3 ± 416,06 20,2 ± 0,20 30,0 62771,7 ± 167,86 30,4 ± 0,08 40,0 81835,3 ± 463,75 39,7 ± 0,22 *DP = Desvio Padrão, n=3 Priscila Gomes dos Reis 26 Capítulo 1 Tabela 4: Teste de variância para a linearidade Sb As Variáveis dfa SS F calculado b F Teórico c Regressão 2 2026000 0,0002364 3,37 Resíduos 24 102900000000 Total 26 Regressão 2 375200 0,0002216 3,42 Resíduos 21 17780000000 Total 23 a Graus de liberdade. b Fl = s2l/s2e and Fnl = s2nl/s2e. c Valor teórico de F [1, p(n-1), 1-Į@ 4.3.3. Precisão A precisão foi avaliada através dos estudos de repetibilidade e precisão intermediária. O estudo de repetibilidade demonstrou coeficientes de variação entre 0.12 e 1.81% para o antimônio e 0.88 e 1.60 % para o arsênio (Tabela 5). O estudo de precisão intermediária, que avalia a variação de ensaios realizados em dias diferentes, demonstrou coeficiente de variação entre 1.01 e 2.85% para o antimônio e 1.12 e 1.90% para o arsênio (Tabela 6). Ambos abaixo do valor máximo exigido de 5%. Através do teste t de Student, foi avaliada a possível existência de uma diferença estatisticamente significativa entre os resultados obtidos nos ensaios realizados em dias diferentes e com diferentes analistas. Como se pode observar na tabela 7, em todos os casos o t calculado foi menor que o t teórico, com 95% de confiança. Priscila Gomes dos Reis 27 Capítulo 1 Tabela 5: Resultados do estudo de repetibilidade Concentração (mg/l) Teórica Sb As D.P. * C.V.% * Exatidão Experimental (%) 5,0 5,0 5,1 5,0 0,03 052 101,32 10,0 9,8 10,1 9,8 0,04 1,81 98,72 30,0 29,5 29,5 29,4 0,08 0,12 98,26 5,0 4,9 5,0 4,8 0,08 1,60 100,36 10,0 9,9 9,8 9,7 0,09 0,88 100,03 30,0 29,6 29,8 29,8 0,09 1,48 99,98 *DP = Desvio Padrão: C.V.= Coeficiente de Variação Tabela 6: Resultados do estudo de precisão intermediária Concentração Média da Emissão (mg/l) Dia 1 Dia 2 Média da Coefficient of Concentração Variation calculada (C.V.%) (± S.D.)* Sb As 5,0 17525,7 16883,0 5,0 ± 0,14 2,85 10,0 35279,7 34644,0 9,9 ± 0,10 1,02 30,0 107721,7 103237,0 29,7 ± 0,30 1,01 5,0 11531,0 10450,7 5,0 ± 0,14 1,12 10,0 22560,0 21012,0 9,8 ± 0,19 1,90 30,0 67359,7 62771,7 30,0 ± 0,43 1,42 Tabela 7: Dados estatísticos do teste t de Student t cauculado t teórico Inter-Analistas Metanol Inter-dia Intra-dia Sb 0,23 1,33 2,88 0,01 As 0,18 0,93 0,66 0,01 Priscila Gomes dos Reis 2,92 28 Capítulo 1 4.3.4. Exatidão A exatidão foi verificada para três níveis de concentração: baixo, médio e alto. Os dados experimentais obtidos revelaram uma recuperação porcentual que variou entre 98,26 e 101,32% para o antimônio e 99,98 e 100.36% para o arsênio (Tabela 5). 4.3.5. Robustez A mudança de analistas no preparo das amostras não provocou variação nas emissões do As e do Sb. As concentrações obtidas pelas analises realizadas pelo analista 1 foram de 19,8 ± 0,60 mg/l de antimônio e 20,3 ± 0,55 mg/l de As, enquanto pelo analista 2 foi de 19,9 ± 0,13 mg/l de Sb e 20,3 ± 0,15 mg/l de As. A mudança da fonte fornecedora de metanol resultou em concentrações médias de antimônio de 20,2 ± 0,07 mg/l para o tipo A e 19,8 ± 0,41 mg/l para o tipo B e as concentrações de As foram 20,2 ± 0.53 mg/l para o tipo A e 20,46 ± 0.50 mg/l para o tipo B. Dentre todos os resultados o maior coeficiente de variação encontrado foi de 1,22%. De acordo com o teste t de student (Tabela 7) não há diferença entre os resultados obtidos, com 95,0% de confiança. 4.3.6. Limite de detecção e Limite de Quantificação Os valores de limite de detecção foram 0,02 mg/l para o Sb e 0,06 mg/l para o As, o que corresponde a 0,11% e 0,29% da concentração teste, respectivamente. Já o valor do limite de quantificação, estabelecido experimentalmente, foi de 3,0 mg/l para ambos. 4.3.7. Aplicação do método Em nosso laboratório foram desenvolvidas formulações de arsenito de sódio e tártaro emético de acordo com a metodologia proposta acima e em seguida realizou-se a quantificação dos semimetais utilizando a técnica aqui validada. Foram obtidos coeficientes de encapsulação de 9,87% de encapsulação para a formulação de arsenito de sódio e 13,65% para a formulação de tártaro emético. Priscila Gomes dos Reis 29 Capítulo 1 4.4. Discussão A literatura apresenta diversos métodos para quantificar As e Sb em matrizes como solo, amostras de material biológico dentre outras, no entanto, em muitos há complexidade no preparo das amostras como etapas de purificação e digestão ou utilização de grandes volumes de solventes. Além disso, métodos validados para quantificação destes semimetais em matriz lipossomal são escassos, dentre estes pode ser citado o trabalho de Oliveira e colaboradores (2006) que validaram um método fotométrico para quantificação de Sb em lipossomas. Neste sentido, um método sensível, simples e adequado para quantificação de As e Sb em lipossomas, foi aqui validado o que garantiu a qualidade e a confiabilidade dos resultados obtidos na caracterização das formulações utilizadas no estudo de cardiotoxicidade. O método validado pode ser considerado específico, visto que, a leitura da amostra somente com lipossomas brancos coincidiu com a linha base do aparelho o que demonstra que não haverá interferência da matriz nas leituras das amostras com As ou Sb. Os coeficientes de correlação de 0,9997 e 0,9996 para As e Sb, respectivamente, demonstraram que 99,97% e 99,96% da variação total em torno da média é explicada pela regressão linear e a análise de variância (ANOVA) demonstrou ser a regressão altamente significativa, bem como não foi evidenciada a falta de ajuste do modelo, uma vez que, os valores de F calculados foram menores do que os valores de F críticos no nível de 95,0% de confiança. Os resultados do estudo de exatidão demonstram que pequenas variações da concentração dos semimetais estudados podem ser prontamente quantificadas pelo método, bem como não há interferência dos excipientes da forma lipossomal na dosagem do produto final, portanto, o método analítico desenvolvido é suficientemente exato. O método demonstrou também ser preciso, visto que, não ocorreu diferença estatística entre as dosagens realizadas intra e inter dia. Os limites de quantificação e detecção estão abaixo das concentrações encontradas em formulações de lipossomas com estes compostos, como a formulação de Wang e colaboradores (2007) cuja formulação de As em nanoparticulas com PEG apresentou concentração de 73,6 mg/l, Chen e colaboradores (2006) cuja formulação apresentou concentração de l6,73 g/l de arsênio e De Melo e colaboradores (2003) cuja formulação de Sb possui concentração de 950,0mg/L. No caso das formulações desenvolvidas em nosso laboratório as concentrações são de 1,74 g/l para o As e 11,6 g/l para o Sb. Isso torna o método viável para a quantificação destes semimetais em formulações lipossomais. Priscila Gomes dos Reis 30 Capítulo 2 5. CAPÍ TULO 2: Avaliação da Toxicidade do Arsênio e do Antimônio trivalentes Priscila Gomes dos Reis 31 Capítulo 2 5.1.I ntrodução Como anteriormente citado, apesar da aplicabilidade dos semimetais As ou Sb na terapêutica de doenças endêmicas relevantes, sua utilização é limitada devido à indução de marcantes efeitos tóxicos, principalmente sobre o sistema cardiovascular. Diante das já relatadas semelhanças entre estes semimetais e tendo em vista que em estudos anteriores com pacientes leucêmicos tratados com As concomitante ao AA foram demonstrados aumento da eficácia e redução da toxicidade (Bahlis et al.,2002; Singh, 2007), foi idealizado a avaliação da possível redução da toxicidade de Sb pela administração concomitante com AA. Além disso, diante da ausência de estudos de avaliação da proteção do AA contra a toxicidade cardiovascular do As, este também foi avaliado neste trabalho. Por outro lado, a demonstração anterior por nosso grupo de pesquisa de redução da cardiotoxicidade do tártaro emético veiculado em lipossomas gerou também o objetivo de avaliar a possível redução da cardiotoxicidade do As trivalente veiculado em lipossomas. Assim, este capítulo apresenta a metodologia empregada e os resultados e discussão dos dados obtidos visando atender aos objetivos acima propostos. 5.2. M étodos 5.2.1. Lipossomas Lipossomas de arsenito de sódio foram obtidos utilizando-se a metodologia de congelamento/descongelamento como descrito por Mayer e colaboradores. (1985), seguida de extrusão através de membranas de policarbonato de 200 nm como proposto por Nayar e colaboradores (1989) e descrita no capitulo 1. 5.2.1.1. Caracterização da preparação de lipossomas de arsênio 5.2.1.1.1. Determinação da eficiência de encapsulação Para a quantificação de As encapsulado nos lipossomas, 100,0 µl de amostra foram solubilizados em 0,5 ml de metanol, para o rompimento da membrana vesicular e a conseqüente liberação do conteúdo encapsulado. O volume foi completado para 10,0 ml com água ultra-pura. As dosagens foram realizadas em triplicata por ICP OES utilizando metodologia descrita no capítulo 1. As leituras das emissões das amostras lipossomais contendo As foram corrigidas pelas leituras de Priscila Gomes dos Reis 32 Capítulo 2 emissão de amostras de lipossomas brancos ou vazios, utilizando-se como referência a curva padrão de As, linear no intervalo de concentração entre 3,0 e 40,0 ppm. A eficiência de encapsulação (EE) foi calculada como o teor de substância presente na formulação após diálise de 24 horas, em relação ao total encontrado na preparação não submetida à diálise, através da equação abaixo: EE% = Concentração da substância nos lipossomas x 100 Concentração total de arsênio 5.2.1.1.2. Determinação do tamanho dos lipossomas O tamanho das vesículas e o índice de polidispersão da preparação foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons, utilizando Nanosizer N5 (Beckman Coulter, EUA). As preparações contendo As ou salina tamponada foram diluídas na proporção de 1:250 em água ultrapura e a distribuição de tamanho e a polidispersão foram avaliadas efetuando-se a leitura de 4 amostras em triplicata. 5.2.1.1.3. Determinação da carga superficial dos lipossomas O potencial zeta foi determinado pela mensuração da mobilidade eletroforética, utilizando o Zetasizer 3000 HS (Malvern Instruments, Reino Unido). As preparações contendo As ou salina tamponada foram diluídas na proporção de 1:250 em água ultra-pura e as leituras efetuadas em triplicata para o total de 4 amostras. 5.2.1.1.4. Perfil de liberação in vitro do Arsênio a partir dos lipossomas Com o objetivo de avaliar a capacidade dos lipossomas reterem o As em condições fisiológicas, amostras de 100,0 µl de formulação lipossomal de As foram incubadas em 1,0 ml de solução de plasma humano a 5,0 % e a 3,07 °C, de forma a garantir a condição sink (excesso de volume de meio que irá permitir que o ativo dissolva-se continuamente), e após 0,5, 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 72 horas, alíquotas de 200,0 ȝl foram colocados em ultra filtros de celulose (Microcon® 50,000 MWCO) e centrifugados por 30 minutos a 12000 rpm, de modo a permitir que a fração livre passasse livremente pela membrana de filtração e a fração encapsulada fosse retida sob o filtro. Ambas as amostras, filtradas ou não, coletadas nos diferentes tempos, foram solubilizadas em Priscila Gomes dos Reis 33 Capítulo 2 0,5 ml de metanol e diluídas para 10,0 ml. Em seguida foram submetidos à dosagem por ICP/OES, sendo os valores obtidos comparados àqueles referentes à preparação inicial, a fim de determinar o perfil de liberação in vitro do As a partir dos lipossomas. 5.2.1.1.5. Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas Com o objetivo de avaliar o percentual de As liberado do interior das vesículas em condições de armazenamento e em função do tempo, formulação lipossomal contendo ou não As foi armazenada em geladeira, a 4,0°C, por 30 dias. Nos tempos 3, 7, 14, 21 e 30 dias, uma amostra de 100,0 ȝl da formulação lipossomal contendo arsênio e da preparação de lipossomas brancos foram colocados em ultrafiltros de celulose (Microcon® 50,000 MWCO) e centrifugados por 30 minutos a 12000 rpm, de modo a permitir que a fração não encapsulada passasse livremente pela membrana de filtração e a fração encapsulada fosse retida. Amostras do filtrado ou retido coletadas nos diferentes tempos foram solubilizados em 0,5 ml de metanol, diluídos para 10,0 ml e, em seguida, submetidos a dosagem do semimetal por ICP/OES, sendo os valores obtidos comparados àqueles referentes à preparação inicial, para fim de cálculo do percentual de liberação do As a partir dos lipossomas, através da equação: Liberação% = 100 - Concentração de arsênio na preparação armazenada x 100 Concentração de arsênio na preparação inicial 5.2.1.1.6. Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostra de lipossomas Com o objetivo de confirmar a permanência do As no estado de oxidação trivalente após a técnica de encapsulação deste em lipossomas, realizou-se a análise de uma amostra da formulação através de Espectroscopia de Absorção de Raio-X (X-Ray Absorption Fine Spectroscopy, XAFS). Foram analisados e comparados os espectros XANES (X-Ray Near-Edge Structure) das preparações lipossomais contendo arsênio e de padrões deste elemento. Estas análises foram realizadas por meio de parceria com a Professora Mônica Cristina Teixeira da Universidade Federal de Ouro Preto, em colaboração com pesquisadores do Departamento de Metalurgia da Universidade Federal de Minas Gerais no Laboratório Nacional de Luz Síncroton (LNLS) em Campinas, SP. O princípio básico da espectroscopia de absorção de raios-X é a excitação de elétrons Priscila Gomes dos Reis 34 Capítulo 2 localizados nos níveis atômicos K, L e M do átomo absorvedor de raios-X. Se a energia do fóton incidente é suficiente para retirar os elétrons localizados nos níveis internos, a absorção aumenta drasticamente, mostrando um salto no espectro de absorção. Esse aumento observado no espectro é chamado de borda (E0) da banda de absorção e a energia com que isso acontece depende da absorção de energia de ligação dos elétrons do átomo, sendo, portanto, característica de cada elemento químico. O espectro XAFS é dividido em duas regiões: EXAFS (Extended X-Ray Absorption Fine Structure), que fornece informações sobre o número de coordenação, as distâncias interatômicas e a natureza dos átomos vizinhos ao átomo absorvedor e XANES (X-Ray Absorption Near Edge Structure) que fornece informações sobre o estado de oxidação do átomo ao apresentar alterações estreitas e intensas na borda de absorção. Em nosso trabalho analisamos apenas a região XANES dos espectros coletados (Ciminelli et al,2009). Para isso foram analisadas as seguintes amostras sólidas: pó resultante da liofilização da formulação lipossomal contendo arsênio, arsenato de sódio (Na2HAsO4.7H2O ) e arsenito de sódio (NaAsO2) ambos com teor de pureza superior a 99% fornecidos pela Sigma. Os espectros XANES referentes a borda K de absorção característica do Arsênio (E0=11868 eV, para o As0) foram coletados na linha XAFS2. As amostras sólidas foram colocadas em portaamostras acrílicos selados com fita Kapton®. Todos os espectros foram coletados à temperatura ambiente, com uma corrente de aproximadamente 250mA, utilizando-se detectores monocromadores 6LDQG6L³double crystal´FRPXPa abertura de feixe vertical de 0,5mm. Os espectros dos padrões e da amostra foram medidos pelo monitoramento da energia transmitida e também da fluorescência emitida utilizando-se um detector Ge multielementos. (15-element Ge detector, Canberra Industries) e ar na câmara de ionização. A calibração da energia foi obtida pela medida simultânea da absorção do Ouro (Au) na borda L3 utilizando-se para isso uma amostra de folha de ouro metálico (que atua como um branco). As resoluções de energia empregadas foram: 3,0 eV na região pré borda, entre 11670 e 11840 eV com tempo de aquisição de 1 segundo; 0,5 eV na região do espectro XANES situada entre 11840 e 11900eV com tempo de aquisição de 1 segundo; 1,0 eV na região compreendida entre 11900 eV e 12070, com tempo de aquisição de 2s; 2,0 eV entre 12070 e 12270 Ev, com tempo de aquisição de 4 segundos e finalmente na região compreendida entre 12270 e 12570 foi empregado um passo de energia de 3,0 eV e tempo de contagem de 4 segundos. As médias dos espectros coletados foram matematicamente tratadas para remoção do ³background´ e a determinação do valor da borda de absorção do As utilizando-se os softwares Origin 6.0TM e Athena 0.8.056. A borda de absorção do elemento é obtida após a derivação de cada Priscila Gomes dos Reis 35 Capítulo 2 curva experimental. O valor da borda de absorção equivale ao ponto máximo da primeira derivada de cada espectro. Este valor é mais facilmente obtido pela análise da segunda derivada de cada curva, considerando-se que o máximo da primeira derivada equivale ao zero da segunda derivada da curva, assim, basta identificar, para cada curva, o ponto exato onde a curva da segunda derivada de cada espectro corta o eixo de x, sendo y=0. O valor da borda de absorção E0 de um elemento será tanto maior quanto maior for o seu estado de oxidação e difere um pouco do valor observado no espectro original. 5.2.2. Experimentos in vivo 5.2.2.1. Animais Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 200 e 250 g, fornecidos pelo biotério central da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os animais foram mantidos no biotério da Escola de Farmácia da UFOP até sua utilização, sob ciclo de 12 horas claro/escuro e recebendo água e ração (Socil®) ad libitum. 5.2.2.2. Determinação da dose máxima tolerada (DM T) A dose máxima tolerada do As e Sb pelos animais foi determinada pela administração por via endovenosa de diferentes doses (n=6 para cada dose) destes semimetais contidas em soluções de arsenito de sódio e tártaro emético. As soluções foram preparadas utilizando como veículo solução salina tamponada, pH 7,2. Os animais receberam tiopental sódico na dose de 60,0 mg/kg, por via intraperitonial (IP). Após a anestesia ter alcançado a profundidade necessária, foi inserido catéter de polietileno na veia femoral esquerda para administração intravenosa (IV) da solução de As ou de Sb. Os catéteres foram confeccionados, unindo-se por aquecimento 5,0 cm de tubo de PE10 a 15,0 cm de tubo de PE50, preenchidos com solução salina heparinizada e ocluídos por agulhas 25x7 cortadas. Após este procedimento, a porção do catéter exterior ao vaso foi deslocada abaixo da pele do animal e sua extremidade exteriorizada através de uma incisão realizada em seu dorso. As incisões foram suturadas ao final do procedimento. Após a recuperação cirúrgica (24 horas), os animais receberam as soluções dos semimetais via catéter endovenoso e foram observados por 72 horas sendo dose máxima tolerada definida como a maior dose que não causou morte ou sinal visível de toxicidade (motilidade intestinal, piloereção e emese). Priscila Gomes dos Reis 36 Capítulo 2 5.2.2.3. Obtenção dos sinais cardiovasculares Os animais receberam tiopental sódico na dose de 60,0 mg/kg, por via IP. Após a anestesia ter alcançado a profundidade necessária, os animais foram traqueostomizados e deixados sob respiração espontânea. Foram inseridos cateteres de polietileno na artéria e veia femorais esquerdas para obtenção dos sinais da pressão arterial (PA) e administração IV das formulações, respectivamente. Após a cateterização, a extremidade PE10 se localizava na aorta abdominal, abaixo das artérias renais, para registro da pressão arterial, e veia cava inferior, para injeção das formulações. A extremidade PE50 do catéter inserido na artéria femoral foi acoplada a um transdutor de pressão TruWave® (Edwards Lifescience, Canadá) para aquisição do sinal de PA. Para a obtenção da diferença de potencial relativa à derivação DII do ECG, agulhas hipodérmicas de aço inoxidável foram inseridas no tecido subcutâneo dos animais. Os sensores de ECG e transdutor de PA foram acoplados a um sistema condicionador que fornecia sinais em tempo real a uma freqüência de 1200 Hz, processados por uma placa conversora analógico-digital (DaqBoard/2001, EUA). Figura 6: Sistema de aquisição dos sinais de ECG e PA. Priscila Gomes dos Reis 37 Capítulo 2 5.2.2.4. Análise dos parâmetros cardiovasculares Os registros digitais dos experimentos foram convertidos através do software Matlab 7.0 (MathWorks, EUA) e analisados por inspeção visual com o auxílio do software WinDaq (DATAQ Instruments, EUA). Foram selecionados segmentos de 2,0 segundos em instantes específicos dos quais foram extraídos os seguintes parâmetros cardiovasculares: pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD), freqüência cardíaca (FC), intervalos QT, RR, PR e complexo QRS do ECG e correção do intervalo QT pelo índice de Fridericia (1920): QTc = QT/(RR)1/3. Figura 7: Traçado normal do ECG e seus intervalos 5.2.2.5. Avaliação Hematológica A avaliação dos parâmetros hematológicos foi realizada nos animais dos grupos submetidos ao tratamento subagudo no dia seguinte ao termino do tratamento, após obtenção dos parâmetros cardiovasculares, quando foram coletadas amostras de sangue total em tubo contendo heparina sódica. Os parâmetros hematológicos avaliados incluíram contagem de hemácias, hemoglobina, hematócrito, contagem de leucócitos (total e diferencial) e contagem de plaquetas. Estes foram realizados em um analisador automatizado (VET2800-MINDRAY, Brasil) com exceção da contagem diferencial de leucócitos que foi realizada pela análise de esfregaço sanguíneo, corado com corante panótica rápida (Instant Prov) , em microscópio óptico Olympus CX 21 do LAPAC, UFOP.. Priscila Gomes dos Reis 38 Capítulo 2 5.2.2.6. Avaliação Bioquímica Para as dosagens de parâmetros bioquímicos também realizadas nos animais dos grupos submetidos ao tratamento subagudo, o procedimento foi o mesmo para o item anterior, porém a coleta de sangue para a obtenção de soro, ou seja, sem anticoagulante. O soro foi obtido através da centrifugação da amostra sanguínea a 3000 rpm por 15 minutos e congelado a -18 0C até o momento da análise. Os parâmetros bioquímicos avaliados incluíram aspartato alaninatransferase(ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA), proteína total para avaliação da função hepática, creatinina e uréia para avaliação da nefrotóxicidade e creatino quinase fração MB (CKMB) para avaliação de lesão cardíaca. As quantificações foram realizadas espectrofotometricamente utilizando um analisador automatizado (Airone 200, pais) e Kits diagnósticos do laboratório Bioclin. 5.2.2.7. Avaliação Histopatológica Análise histopatológica foi realizada no coração e fígado dos animais dos grupos submetidos ao tratamento subagudo por meio de parceria com a Professora Claudia Martins Carneiro da Universidade Federal de Ouro Preto. Após obtenção dos parâmetros cardiovasculares e coleta de sangue os órgãos foram removidos, lavados com solução de NaCl 0,9% (p/v) e fixados em formaldeído 10% (v/v) tamponado (pH 7,2), com o objetivo de preservar a morfologia e a composição do tecido até a confecção das lâminas no Laboratório de Imunopatologia, NUPEB, UFOP. Os tecidos foram submetidos à desidratação para remover toda a água presente nos mesmos. O processo foi realizado em concentrações crescentes de álcool (alcoóis 70, 80, 90 e absoluto), deixando-se os tecidos imersos por um período de 20 minutos em cada concentração. Após a desidratação, seguiu-se a diafanização a fim de tornar o tecido translúcido. Para isso, os tecidos foram submetidos a dois banhos de xilol com duração de 10 minutos cada. Seguiu-se então a inclusão dos tecidos em parafina, utilizando dois banhos de parafina para sua penetração nos vasos e espaços intercelulares. Foram confeccionados blocos contendo cada um o fígado, e o coração de cada animal. Os blocos de parafina contendo os tecidos impregnados foram, então, submetidos à microtomia obtendo-se dois cortes seriados com 4 µm de espessura cada um, para cada bloco. Os cortes foram colocados em banho-maria para que as fitas fossem esticadas e colocadas sobre as Priscila Gomes dos Reis 39 Capítulo 2 lâminas de vidro que foram mantidas em estufa a 60o C para secarem. Com os tecidos já aderidos às lâminas, foi realizada a coloração Hematoxilina-Eosina para proporcionar uma análise geral das alterações histopatológicas. O processo de coloração se inicia com a imersão das lâminas em dois banhos de xilol de 15 minutos cada, para desparafinização. Em seguida, essas lâminas foram imersas em banhos de álcool (alcoóis absoluto, 90, 80 70) e água, cada um de 5 minutos, para re-hidratação. Seguiu-se um banho de 10 minutos no corante hematoxilina (corante ácido), em seguida as lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos. Foi realizada então a diferenciação com a passagem rápida das lâminas em álcool-acidulado. Novamente as lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos e imersas no corante eosina (corante básico) por 30 segundos e em seguida lavadas em água corrente por 1 minuto. Para finalizar o processo, as lâminas foram imersas em três banhos de álcool absoluto rapidamente e levadas à estufa a 60o C por alguns minutos para secagem. Depois de secas, as lâminas foram imersas em xilol e montadas com Entellan (Merck) e lamínula. As avaliações foram feitas utilizando-se objetiva de 40X do microscópio Olympus BX50, pentaocular localizado na Escola de Farmácia, UFOP. A fotodocumentação foi realizada no Laboratório Multiusuários do NUPEB, UFOP utilizando-se a objetiva de 40X de um microscópio Leica, DM5000, acoplado a câmera digital e computador. 5.2.2.8. Protocolos Experimentais 5.2.2.8.1. Agudo Alterações cardiovasculares, avaliadas pelos sinais de ECG e PA, foram avaliadas após administração por via endovenosa e em dose única dos compostos semimetálicos em estudo, nas formas livre, lipossomal e livre associada ao ácido ascórbico. Os tempos avaliados foram de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5,0, 7,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0 60,0 minutos. Os animais foram divididos em nove grupos (n=6 em cada grupo) que receberam: 1) Controle: salina tamponada; 2) As: solução de arsenito de sódio na dose de 6,5 mg/kg; 3) Sb: solução de tártaro emético na dose de 17mg/kg; 4) AA: solução de ácido ascórbico na dose de 650mg/kg; 5) As+AA: solução de arsenito de sódio + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas; 6) Sb+AA: solução de tártaro emético + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas; 7) Lipossoma Arsênio: formulação lipossomal de arsenito de sódio na dose de 6,5 mg/kg; 8) Lipossoma Branco: formulação lipossomal de PBS; 9) Lipossoma Sb: formulação lipossomal de Sb (realizado em trabalho anterior). Priscila Gomes dos Reis 40 Capítulo 2 O protocolo experimental está esquematizado em etapas abaixo, sendo os tópicos 3 e 4 somente para os grupos As+AA e Sb+AA (grupos 5 e 6). 1. Anestesia dos animais 2. Procedimento cirúrgico 3. Registro controle por 5 minutos de ECG e PA 4. Administração endovenosa de ácido ascórbico 5. Intervalo de 5 minutos 6. Administração do semimetal 7. Registro de ECG e PA por 60 minutos (A) (B) Figura 8: Desenho esquemático do protocolo experimental agudo. (A) Protocolo agudo para os grupos As, Sb, PBS, AA, Lipossoma As, Lipossoma Sb, Lipossoma Branco; (B) Protocolo agudo para os grupos, Sb+AA, As+AA. 5.2.2.8.2. Subagudo As alterações cardiovasculares avalidas pelos sinais de ECG e PA, e as alterações hematológicas, bioquímicas e histopatológicas foram avaliadas após administração, dos compostos semimetálicos por via IP durante 30 dias, nas formas livre e juntamente com o ácido ascórbico. Os animais foram divididos em seis grupos (n=6 em cada grupo): 1) Controle: salina tamponada; 2) As: solução de arsenito de sódio na dose de 3,5 mg/kg; 3) Sb: solução de tártaro emético na Priscila Gomes dos Reis 41 Capítulo 2 concentração de 3,8 mg/kg; 4) AA: solução de ácido ascórbico na concentração de 15 mg/kg; 5) As+AA: solução de arsenito de sódio + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas; 6) Sb+AA: solução de tártaro emético + solução de ácido ascórbico nas doses já citadas. O protocolo experimental está esquematizado em etapas abaixo: 1. Anestesia dos animais 2. Registro controle de ECG por 5 minutos 3. 24 horas de intervalo para recuperação dos animais 4. Tratamento por 30 dias 5. Anestesia e procedimento cirúrgico no dia seguinte ao término do tratamento 6. Registro por 5 minutos de ECG e PA 7. Coleta de sangue e retirada de órgãos para análises posteriores Figura 9: Desenho esquemático do protocolo experimental subagudo 5.2.10. Análise Estatística Após atenderem ao teste de normalidade os parâmetros foram analisados por One-way ANOVA seguida do pós-teste de Turkey. Os dados não paramétricos foram analisados por teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Duns. O software GraphPad Prism® 5.0 (GraphPad Software, EUA) foi utilizado como ferramenta para as análises estatísticas. Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m) e as diferenças foram consideradas significativas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P < 0,05). Priscila Gomes dos Reis 42 Capítulo 2 5.3. Resultados Para melhor entendimento, os dados foram divididos em tópicos de acordo com o semimetal analisado. 5.3.1. Arsênio 5.3.1.1. Lipossomas 5.3.1.1.1. Caracterização da preparação de lipossomas de arsênio a. Determinação da eficiência de encapsulação As concentrações de As nas amostras foram determinadas por ICP/OES a partir equação da reta obtida de curva padrão visualizada na figura 10. A tabela 8 apresenta a média da eficiência de encapsulação de 4 amostras de formulações de As lipossomal após diálise da preparação por 24 Emissão horas. Média R2 = 0.9996 Linear Equação da reta: Emissão= 2052.23 [As] (mg.L-1) + 464.41 Figura 10: Curva padrão de arsênio obtido por ICP/ OES Tabela 8: Dosagem de Arsênio em amostras de lipossomas. Média ± e.p.m. Concentração de arsênio na preparação sem diálise (mg/ml) Concentração de arsênio na amostra de lipossomas após diálise (mg/ml) Eficiência de Encapsulação (% ) 22,2 ± 2,13 2,0± 0,05 9,0 ± 0,12 Priscila Gomes dos Reis 43 Capítulo 2 b. Determinação do tamanho dos lipossomas A tabela 9 apresenta os valores do diâmetro médio das vesículas lipídicas e índice de polidispersão do tamanho da população, determinados por espectroscopia de correlação de fótons, dos lipossomas brancos e contendo arsênio. A figura 11 apresenta graficamente os resultados apresentados na tabela. Tabela 9: Diâmetro médio e índice de polidispersão da população de lipossomas. Valores expressos em média ± e.p.m. Amostras Diâmetro médio (nm) Í ndice de polidispersão Arsênio 231,8 ± 6,42 0,167 ± 0,0189 PBS 204,5 ± 3,38 0,146 ± 0,0112 % in class Size distribution(s) 15 10 5 50 100 500 1000 Diameter (nm) Figura 11: Registro gráfico da análise de tamanho dos lipossomas contendo As. Priscila Gomes dos Reis 44 Capítulo 2 c . Determinação da carga superficial dos lipossomas A tabela 10 apresenta os valores da determinação da carga superficial (potencial zeta) para a preparação de lipossomas contendo As e para a preparação de lipossomas brancos. A figura 12 apresenta graficamente os valores de potencial zeta apresentados na tabela. Tabela 10: Potencial zeta das amostras de lipossomas. Valores expressos em média ± erro padrão da média. Amostras Potencial Zeta (mV) Arsênio - 37,80 ± 0,8 PBS - 41,75 ± 0,3 Intensity Zeta Potential(mV) 15 10 5 -200 0 Zeta Potential(mV) 200 Figura 12: Registro gráfico do potencial zeta dos lipossomas contendo As. Priscila Gomes dos Reis 45 Capítulo 2 d Avaliação da estabilidade da formulação de lipossomas Os valores obtidos na avaliação da estabilidade da formulação de arsênio encapsulada em lipossomas e armazenada em geladeira (4,0°C) estão apresentados na tabela abaixo. Tabela 11: Parâmetros indicadores de estabilidade da formulação de lipossomas contendo As no período de 30 dias. Período após preparação (dias) Concentração (mg/ml) %Liberação 0 1,74 - 3,0 1,31 24,71 7,0 0,91 47,92 14,0 0,58 66,76 21,0 0,38 77,93 30,0 0,38 78,23 e. Perfil de liberação in vitro do Arsênio a partir dos lipossomas Os valores obtidos na avaliação da liberação in vitro do As a partir dos lipossomas incubados com solução de plasma a 5,0% a 37,0°C estão apresentados na tabela 12. Tabela12: Parâmetros indicadores da liberação do arsênio dos lipossomas a 37°C. Tempo de incubação (horas) Concentração (mg/ml) % Liberação 0 1,81 - 0,5 1,80 0,55 1,0 1,78 1,66 3,0 1,78 1,66 6,0 1,76 2,76 12,0 1,73 4,42 24,0 1,69 6,63 36,0 1,57 13,26 72,0 1,34 25,97 Priscila Gomes dos Reis 46 Capítulo 2 f. Determinação do estado de oxidação do arsênio em amostras lipossomais A figura 13 apresenta graficamente os espectros XANES obtidos para a amostra de lipossomas contendo As e os padrões. A energia de absorção (Eo) da amostra foi de 11867,96 eV, muito próxima do valor obtido para o padrão de As III que apresentou valor de E 0 de 11868,79. Além disso, as características dos dois espectros foram muito semelhantes. Em contra partida, o pico de absorção do padrão de AsV apresentou valor mais elevado, de 11870,50, condizente com um estado de oxidação maior, além de características um pouco diferentes, os espectros de AsV geralmente apresentam uma segunda elevação na região após a borda de absorção, o que não se observa na amostra de lipossoma, nem no padrão de AsIII. As linhas retas acrescentadas à figura servem apenas como base de comparação, mostrando o deslocamento da borda de absorção do As em função do seu estado de oxidação e não representam os valores reais do E0 do elemento visto que, a borda de absorção real encontra-se alguns eV abaixo do pico máximo de cada espectro. Espectro Xanes Lipossoma/As 2,0 1,8 1,6 AsIII E0 U.A. Intensidade do Sinal 1,4 1,2 Padrão AsIII sólido 1,0 0,8 0,6 As Lipossomal 0,4 0,2 Padrão AsV 0,0 -0,2 AsV E0 -0,4 -0,6 11840 11860 11880 11900 11920 11940 Energia (eV) Figura 13: Espectro Xanes de amostras de lipossomas contendo Arsênio e padrões de arsênio trivalente e arsênio pentavalente. Eo ± Borda de absorção do arsênio da amostra. Priscila Gomes dos Reis 47 Capítulo 2 5.3.1.2. Experimentos in vivo 5.3.1.2.1. Dose máxima tolerada (DM T) do arsênio Para a determinação da dose máxima tolerada do As inicialmente foi utilizada a dose de 10,0 mg/kg, a qual causou a morte de 100% dos animais. Foram avaliadas, então, doses decrescentes até àquela na qual não se observou óbito (6,0 mg/kg). Doses entre as que causaram 100,0% (7,0 mg/kg) e 0% (6mg/kg) de óbitos foram então avaliadas e a DMT do As determinada como 6,5 mg/Kg. A tabela 12 apresenta os valores da percentagem de mortes observadas para cada dose de solução de As administrada IV nos animais experimentais. Tabela 13: Percentagem (%) de óbitos de animais que receberam solução de As IV. Dose de arsênio (mg/Kg) M ortalidade (% ) 10,0 100,0 9,0 100,0 8,0 100,0 7,0 65,0 6,7 12,0 6,5 0,0 6,0 0,0 5.3.1.2.2. Protocolo agudo Para melhor visualização dos resultados, os dados de variação percentual após administração dos compostos são apresentados em forma de gráfico (figuras 15 a 17) e os valores absolutos em tabelas em anexo. Na figura 14 representação de ECG dos grupos em estudo. Ao analisar conjuntamente os parâmetros obtidos do ECG dos diferentes grupos, foi observado prolongamento significativo do intervalo PR no grupo As a partir de 25,0 minutos com variação máxima de 22,49% em comparação aos grupos controle PBS e Lipossoma Branco. Já os parâmetros QT, QTc, e QRS não apresentaram alterações estatisticamente significativas. Os animais que receberam AA simultaneamente ao As demonstraram prolongamento do intervalo PR com variação percentual máxima de 17,73%, não sendo observadas alterações nos demais parâmetros do ECG. Já o grupo que recebeu somente ácido ascórbico não apresentou Priscila Gomes dos Reis 48 Capítulo 2 alterações significativas em nenhum dos parâmetros avaliados. O grupo que recebeu a formulação lipossomal de arsênio não apresentou alterações significativas nos parâmetros do ECG quando comparados aos controles PBS e Lipossoma Branco, apenas um ligeiro e não significativo aumento no intervalo PR foi observado. Figura14: Parâmetros do ECG em animais antes e após administração IV em dose única da dose máxima tolerada de arsênio (A) arsênio+ácido ascórbico (B) e Lipossoma contendo arsênio (C). Priscila Gomes dos Reis 49 Capítulo 2 % Variação do intervalo PR 25 # 20 * # * # # * # * 15 # # * # * * * 10 5 0 -5 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 PBS Lipossoma Branco AA As Lipossoma As As+AA % Variação do intervalo QRS 10 5 0 -5 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 Figura 15: Variação percentual dos intervalos PR e QRS do eletrocardiograma dos grupos tratados em protocolo agudo com arsênio (As; As+AA e Lipossoma As) e controles (PBS, AA e Lipossoma branco). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6). * P < 0,05 em relação ao grupo PBS e #P< 0,05 em relação ao grupo lipossoma branco ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. Priscila Gomes dos Reis 50 Capítulo 2 % Variação do intervalo QT 10 5 0 -5 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 PBS Lipossoma Branco AA As Lipossoma As As+AA % Variação do índice QTc 10 5 0 -5 -10 -15 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 Figura 16: Variação percentual do intervalo QT do eletrocardiograma e índice QTc dos grupos tratados com arsênio em protocolo agudo (As; As+AA e Lipossomas As) e controles (PBS, AA e Lipossoma branco). Os valores representam a média ± e.p.m.(n=6) ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. Ao serem avaliadas as variações percentuais de PA, intensa queda da PAS e PAD foi observada apenas no grupo tratado com As livre, sendo que, as variações percentuais máximas foram Priscila Gomes dos Reis 51 Capítulo 2 de -39,24% para PAS e -41,96%, para PAD e diferenças significativas em relação ao grupo PBS ocorreram entre 2,5 e 15,0 minutos e não significativas, mas expressivas, após 20,0 minutos. Foram também identificadas diferenças significativas entre 5,0 e 15,0 minutos na PAS, quando os grupos As e lipossoma As foram comparados. Vale salientar que nos grupos AA, As+AA, lipossoma branco e lipossoma As não foram observados variações percentuais significativas quando comparadas ao controle PBS. Foi observada redução de 8 a 27% na FC em todos os momentos avaliados no grupo As, no entanto, esta não foi significativamente diferente dos controles. Abaixo representação de registro de PA dos grupos analisados (figura 17) e gráficos das variações percentuias de PA e FC (figura 18). Figura 17: Exemplos de registro de pressão arterial ao longo do tempo após administração IV de salina (A); arsênio (B); arsênio + ácido ascórbico (C); e Lipossoma contendo arsênio (D). Priscila Gomes dos Reis 52 Capítulo 2 45 % Variação de PAS 30 15 + + + + # * 0 -15 * -30 # # * * # * -45 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 20 % Variação de FC 10 0 -10 -20 -30 Figura 18: Variação percentual de pressão arterial diastólica (PAD), pressão arterial sistólica (PAS) e freqüência cardíaca (FC) dos grupos tratados com arsênio e controles em protocolo agudo. Os valores representam a média ± e.p.m.(n=6). Diferença estatisticamente significativa representada por * em relação ao grupo PBS; # em relação ao grupo lipossoma branco e + em relação ao grupo As ± P < 0,05 ANOVA, seguido de teste de Tukey. Priscila Gomes dos Reis 53 Capítulo 2 5.3.1.2.3. Protocolo subagudo a. Avaliação da toxicidade cardiovascular A Figura 19 abaixo ilustra ECG típico obtido em animais dos grupos As e As+AA. As Figuras 20 e 21 apresentam os resultados obtidos nos experimentos do protocolo subagudo referentes aos parâmetros do ECG e PA. Ao avaliar os grupos, diferenças significativas foram identificadas no grupo As em relação ao grupo PBS nos parâmetros QT, Qtc e PR, com variações percentuais médias de 44,13; 5,5 e 44,49%, respectivamente, sendo que nos dois primeiros ocorreu aumento quando comparado ao grupo controle e no intervalo PR redução. Já nos percentuais de variação do complexo QRS e na FC não foram observadas diferenças significativas No grupo As+AA foram identificadas diferenças significativas no intervalo QT (variação de 24,09%) e QTc (variação de 21,86%) em relação ao grupo PBS (variação de -1,74% e 1,73% de QT e QTc, respectivamente). Variações percentuais em média 50% menores que as observadas no grupo As. Nos demais parâmetros do ECG avaliados não foram observados alterações significativas. No grupo AA não foram observadas alterações significativas nas variações percentuais dos parâmetros do ECG quando comparado com o grupo controle PBS. Priscila Gomes dos Reis 54 Capítulo 2 Figura 19: Ilustração de ECG obtido antes e após tratamento em protocolo subagudo de arsênio (A) e arsênio + ácido ascórbico (B). Priscila Gomes dos Reis 55 Capítulo 2 15 % Variação de QRS % Variação de PR 20 15 10 # & * 5 10 5 0 0 # & * & 30 15 0 * * 50 40 30 & * 20 10 0 1 % Variação de QT 45 # & % Variação de QTc 60 60 PBS AA As As + AA -15 Figura 20: Variação percentual dos parâmetros do eletrocardiograma, PR, QRS, QT, QTc , dos grupos após tratamento sub-agudo com arsênio (As) arsênio + ácido ascórbico (As+ AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m (n=6) .Valores estatisticamente diferentes (ANOVA/ Tukey , P < 0,05) representados por * comparado com PBS, & comparado com AA e # comparado com As+ AA. Priscila Gomes dos Reis 56 Capítulo 2 Com relação aos parâmetros PAS, PAD e FC, não foram identificadas diferenças significativas após comparação entre os grupos (Figura 21). 160 140 PAS (mmHg) 120 100 80 60 40 20 0 PBS AA 160 As 140 As + AA PAD (mmHg) 120 100 80 60 40 20 0 % Variação de FC 0 -5 -10 -15 -20 -25 Figura 21: Valores absolutos de pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD) e variação percentual da freqüência cardíaca (FC) após tratamento subagudo com arsênio (As), arsênio +ácido ascórbico (As+AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m (n=6). Priscila Gomes dos Reis 57 Capítulo 2 Com relação à análise histopatológica do tecido, foi observado que o grupo As+AA mostrou aspecto compatível com os grupos PBS e AA (controles). Por outro lado, no grupo As ocorreu degeneração hialina em várias células musculares, edema, inflamação discreta e vacuolização nos vasos sangüíneos regionais; podendo ainda ser ressaltado o espaçamento entre as células e a perda de densidade citoplasmática em várias células (figura 22C). A * * B * * C D Figura 22: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA (B), As (C), As+AA (D). Hematoxilina Eosina, 40X. Priscila Gomes dos Reis 58 Capítulo 2 Em relação aos parâmetros bioquímicos, a administração subaguda de As e As+AA não induziram alterações significativas nos parâmetros CKMB sérico e AST, indicadores de lesão miocárdica (Tabela 14). Tabela 14: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico, (n=6). Parâmetros Controle AA As As+AA AST (UI /L) 267,8 ± 48,05 165,5 ± 11,77 223,5 ± 35,89 233,1 ± 58,00 CKM B (UI ) 966,9 ± 145,7 920,0 ± 186,4 416,8 ± 34,48 1146,0 ± 203,9 AST (aspartato aminotransferase), b a Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Representa diferença significativa entre os tratamentos com arsênio e arsênio concomitante com ácido ascórbico. b. Avaliação da toxicidade hepática A administração subaguda de As e As+AA não induziu alterações significativas nos parâmetros ALT, AST, albumina e proteínas totais. Por outro lado, diminuição significativa da FA, foi observada (Tabela 15). Tabela 15: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico, (n=6). Parâmetros Controle AA As As+AA ALT (UI /L) 79,5 ± 26,03 45,0 ± 6,61 57,7 ± 11,96 62,2 ± 17,93 AST (UI /L) 267,8 ± 48,05 165,5 ± 11,77 223,5 ± 35,89 233,1 ± 58,00 Albumina (g/dL) 3,0 ± 0,06 2,8 ± 0,07 3,1 ± 0,10 3,5 ± 0,12 Proteína Total (g/dL) 5,6 ± 0,17 5,7 ± 0,16 5,9 ± 0,19 6,0 ± 0,29 FA (UI /L) 123,4 ± 14,09 112,1 ± 10,96 61,5 ± 5,91 a 60,4 ± 4,84 a ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), FA (Fosfatase Alcalina). a b Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Representa diferença significativa entre os tratamentos com arsênio e arsênio concomitante com ácido ascórbico. Priscila Gomes dos Reis 59 Capítulo 2 A análise histológica do tecido hepático demonstrou, como na análise histopatológica do coração, alterações unicamente no grupo As sendo observados alargamento de sinusóides, congestão e discreta inflamação (Figura 23). A C B D Figura 23: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle PBS (A) e AA (B), As (C), As+AA (D). Observa-se em A, B, e D aspecto histológico compatível com normalidade. Em C observa-se foco inflamatório discreto, alargamento de sinusóides e congestão (setas). Hematoxilina Eosina, 40X. Priscila Gomes dos Reis 60 Capítulo 2 c. Avaliação da toxicidade renal A administração subaguda de As e As+AA não induziu alterações significativas nos parâmetros bioquímicos creatinina sérica, uréia sérica e relação creatinina/uréia sérica que são indicativos de toxicidade renal (Tabela 16). Tabela 16: Parâmetros bioquímicos para avaliação de toxicidade renal avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com arsênio e arsênio concomitante a ácido ascórbico, (n=6). a b Parâmetros Controle AA As As+AA Uréia Sérica (g/dL) 49,6 ± 2,04 50,3 ± 1,37 61,0 ± 3,19 56,3 ± 2,74 Creatinina (mg/dL) 0,5 ± 0,03 0,5 ± 0,04 0,5 ± 0,03 0,5 ± 0,035 Í ndice Ureia/Creatinina 116,8 ± 10,87 108,8 ± 5,64 125,7 ± 7,78 121,4 ± 13,31 Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Representa diferença significativa entre os tratamentos com arsênio e arsênio concomitante com ácido ascórbico. Priscila Gomes dos Reis 61 Capítulo 2 d. Avaliação Hematológica Os parâmetros hematológicos obtidos ao serem avaliadas as amostras sanguineas dos diferentes grupos submetidos ao protocolo subagudo encontram-se sumarizadas na tabela 17. Não foram observadas diferenças significativas dos grupos tratados quando comparados com o grupo controle, com exceção da diminuição da contagem de leucócitos no grupo tratado com arsênio, caracterizando leucopenia. Foi observado aumento do número de linfócitos e diminuição de neutrófilos no grupo tratado As+AA quando comparado com o grupo As. Tabela 17: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos tratados com As submetidos ao tratamento subagudo, (n=6). Parâmetros Controle AA As As+AA Hemácia (109/L) 8,6 ± 0,78 7,9 ± 0,2 7,1 ± 0,4 7,4 ± 0,49 Hemoglobina (g/dl) 14,1 ± 1,59 13,3 ± 0,42 13,5 ± 1,28 12,2 ± 0,48 a Hematócrito (% ) 41,1 ± 2,84 32,2 ± 1,29 35,0 ± 1,92 30,8 ± 1,13 Leucócito (109/L) 6,8 ± 1,17 4,5 ± 0,2 3,4 ± 0,4 a 5,0 ± 0,47 Linfócito (% ) 69,1 ± 3,51 69,3 ± 3,33 51,9 ± 5,93 75,0 ± 4,77 b Neutrófilo (% ) 33,3 ± 3,45 29,7 ± 3,82 45,6 ± 5,66 22,1 ± 5,08 b M onócito (% ) 0,7 ± 0,33 1,0 ± 0,34 1,1 ± 0,35 2,6 ± 1,04 Eosinófilo (% ) 0,1 ± 0,09 0,0 ± 0,00 0,5 ± 0,38 0,0 ± 0,00 Bastonete (% ) 0,4 ± 0,22 0,0 ± 0,00 0,1 ± 0,13 0,0 ± 0,00 Basófilo (% ) 0,1 ± 0,09 0,0 ± 0,00 0,3 ± 0,16 0,0 ± 0,00 Plaquetas (% ) 399,8 ± 40,71 291,7 ± 16,24 401,6 ± 36,89 339,6 ± 20,36 Os valores representam a média ± EPM (erro padrão da média), o nível de significância foi considerado para valores de P a < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. Diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. b Diferença significativa entre os tratamentos com arsênio e arsênio concomitante com ácido ascórbico. Priscila Gomes dos Reis 62 Capítulo 2 5.3.2. Antimônio 5.3.2.1. Lipossomas Os dados relativos ao estudo da possível redução de cardiotoxicidade do tártaro emético encapsulado em lipossomas estão apresentados nesta dissertação para a comparação aos dados obtidos com a administração do tártaro emético livre ou na forma livre associado ao ácido ascórbico e ainda para comparar aos dados do arsênio nos diferentes tratamentos. Esses dados foram anteriormente obtidos em nosso laboratório e submetidos para publicação no periódico Toxicology Letters. A técnica utilizada no preparo da formulação lipossomal foi a mesma utilizada para a formulação de arsênio. A eficiência de encapsulação foi de 14,5% e o tamanho das vesículas foi de 149nm (índice de polidisperção 0,014). 5.3.2.2 Experimentos in vivo 5.3.2.2.1. Obtenção da dose máxima tolerada (DM T) A dose máxima tolerada de tártaro emético foi obtida a partir de experimentos também anteriormente realizados por este grupo de pesquisa (dados submetidos para publicação). Esta foi estabelecida como sendo de 17 mg/kg de Sb na forma de tártaro emético. 5.3.2.2.2. Protocolo agudo A figura 24 ilustra seguimentos de ECG obtidos de animais dos grupos Sb e Sb+AA. E as figuras 25 e 26 apresentam os dados obtidos das variações percentuais dos parâmetros QT, QTc, PR e QRS em função do tempo para os grupos Sb, Sb+AA e lipossoma Sb. Ao serem analisados conjuntamente os parâmetros obtidos do ECG dos diferentes grupos, apenas o grupo Sb apresentou alteração significativa em relação aos controles PBS e Lipossoma branco. Foi observado prolongamento significativo do intervalo QT e do índice QTc (Figura 26) sendo a variação máxima de QT de 21,95% e QTc de 19,42% em todos os tempos avaliados a partir de 0,5 minutos após a administração. Ao comparar o grupo Sb livre com o grupo lipossoma Sb observou-se diferença significativa a partir de 1,5 minutos. A análise das variações dos demais parâmetros do ECG (PR e QRS) não indicou a ocorrência de diferenças significativas entre os demais grupos estudados. Priscila Gomes dos Reis 63 Capítulo 2 Figura 24: Parâmetros do ECG antes e após administração IV de antimônio (A), e antimônio + ácido ascórbico (B), em protocolo agudo. Priscila Gomes dos Reis 64 Capítulo 2 % Variação de PR 15 10 5 0 -5 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 % Variação de QRS 10 PBS Lipossoma Branco AA Sb Sb+AA Lipossoma Sb 5 0 -5 Figura 25: Variação percentual dos intervalos do eletrocardiograma PR e QRS dos grupos tratados em protocolo agudo com antimônio (Sb), antimônio + ácido ascórbico (Sb+AA), Lipossoma contendo antimônio (Lipossoma Sb), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6) ± ANOVA, seguido de teste de Tukey. Priscila Gomes dos Reis 65 Capítulo 2 30 + + + # +# # * + # * ** % Variação de QT 20 # * + # * * + # + * + # * * * # * * + * # * 10 + + 0 ++ + + + + + + + -10 0 10 20 30 Tempo (min) 30 % Variação de QTc ++# 20 +# +# * * +# # ** * * ++ + ++ + + # * * * 50 + + # 40 # * * * 60 + + # * PBS Lipossoma Branco AA Sb Sb+AA Lipossoma Sb * # * 10 0 + + + + + -10 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 Figura 26: Variação percentual dos intervalos do eletrocardiograma QT e QTc dos grupos tratados em protocolo agudo com antimônio (Sb), antimônio + ácido ascórbico (Sb+AA), Lipossoma contendo antimônio (Lipossoma Sb), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6). Diferenças estatisticamentes significativas (ANOVA/ Tukey, com P<0,05) representadas por * em relação ao grupo PBS, # em relação ao grupo lipossoma branco e + em relação ao grupo Sb+AA. Priscila Gomes dos Reis 66 Capítulo 2 Quanto ao parâmetro pressão arterial, o Sb livre induziu significativa hipotensão logo após sua administração (figura 27), sendo as variações máximas de ± 41,56% para o parâmetro PAS e 50,35% para PAD. As diferenças significativas entre as variações percentuais deste grupo quando comparado com os grupos PBS e lipossoma branco ocorreram entre 1,5 e 15,0 minutos na pressão arterial sistólica e entre 1,0 e 10,0 minutos na pressão arterial diastólica (figuras 28). O grupo Sb apresentou, ainda, diferenças significativas entre 1,5 e 10 minutos em PAS e PAD quando comparado ao grupo Lipossoma Sb e 2,5 e 10 minutos em PAS e entre 1,5 e 7,5 minutos em PAD quando comparado ao grupo Sb+ AA. Não foram observadas alterações na FC. Figura 27: Exemplos de registro de pressão arterial ao longo do tempo após administração IV de antimônio (A) e antimônio+ácido ascórbico (B), em protocolo agudo. Priscila Gomes dos Reis 67 Capítulo 2 40 % Variação de PAS 30 20 10 0 -10 & -20 & +# +# + + + # ** * * * # -30 -40 # + * + * -50 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 40 % Variação de PAD 30 PBS Lipossoma Branco AA Sb Sb+AA Lipossoma Sb 20 10 0 -10 +& # & && & + # -20 *+ -30 # + # * ** -40 * + # * -50 -60 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 0 10 20 30 Tempo (min) 40 50 60 10 % Variação de FC 5 0 -5 -10 -15 Fi gura 28: Variação percentual dos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC) dos grupos tratados em protocolo agudo com antimônio (Sb), antimônio + ácido ascórbico (Sb+AA), Lipossoma contendo antimônio (Lipossoma Sb), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6). Diferenças estatisticamentes significativas (ANOVA/ Tukey, com P<0,05) representadas por * em relação ao grupo PBS, # em relação ao grupo lipossoma branco e + em relação ao grupo Sb+AA e & em relação ao grupo AA. Priscila Gomes dos Reis 68 Capítulo 2 3.2.2.3. Protocolo subagudo a. Análise dos parâmetros cardiovasculares A figura 29 ilustra ECG obtido dos grupos tratados com Sb e Sb+AA. Por outro lado, a figura 30 apresenta os resultados obtidos nos experimentos do protocolo subagudo referentes à variação percentual e valores absolutos dos parâmetros do ECG avaliados. Ao serem avaliados conjuntamente, diferenças significativas foram identificadas no grupo tratado somente com antimônio livre (Sb) em relação ao grupo controle (PBS) nos parâmetros QT, QTc e QRS com variações percentuais médias de 33,67; 21,6 e 11,62 %, respectivamente. O grupo Sb+AA também apresentou variações significativas no intervalo QT (26,44%) e em QTc (19,46%), quando comparado ao grupo controle PBS. No entanto, a variação no intervalo QT deste grupo foi significativamente menor quando comparada ao grupo Sb. Por outro lado, não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros avaliados no grupo AA quando comparado aos demais. Figura 29: Parâmetros do ECG antes e após tratamento subagudo com antimônio (A), e antimônio + ácido ascórbico (B). Priscila Gomes dos Reis 69 Capítulo 2 # & 15 * % Variação de QRS % Variação de PR 20 15 10 5 10 5 0 0 # & % Variação de QT 50 * 40 & * 30 20 10 0 % Variação de QTc 30 PBS AA Sb Sb + AA & * 25 & * 20 15 10 5 0 1 -10 Figura 30: Variação percentual dos parâmetros do eletrocardiograma, PR, QRS, QT e QTc , dos grupos após tratamento sub-agudo com antimônio (Sb) antimônio + ácido ascórbico (Sb+ AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6) .Valores estatisticamente diferentes (ANOVA/ Tukey , P < 0,05) representados por * comparado com PBS, & comparado com AA e # comparado com Sb+ AA. Priscila Gomes dos Reis 70 Capítulo 2 Com relação ao parâmetro pressão arterial não foi identificada diferença significativa nos valores absolutos de PAS e PAD ao realizar comparação entre os grupos. (Figura 31). O mesmo foi observado no parâmetro de FC. 150 PAS (mmHg ) 125 100 75 50 25 0 150 PBS AA Sb Sb + AA PAD (mmHg) 125 100 75 50 25 0 % Variação de FC 0 -10 -20 -30 Figura 31: Valores absolutos de pressão arterial sistólica (PAS) e pressão arterial diastólica (PAD) e variação percentual da freqüência cardíaca (FC) após tratamento subagudo com antimônio (Sb), antimônio +ácido ascórbico (Sb+AA), salina tamponada (PBS) e ácido ascórbico (AA). Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6). Priscila Gomes dos Reis 71 Capítulo 2 A análise histológica do tecido cardíaco do grupo Sb mostrou alterações como degeneração hialina em várias células musculares (*), pequeno grupo de células inflamatórias (seta) e área de necrose (pontilhado). Por outro lado o grupo Sb+AA apresentou aspecto histológico compatível com os grupos tratados com PBS e AA (controles) (figura 32). A B A * C * * D * C D Figura 32: Cortes histológicos do coração de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Hematoxilina Eosina, 40X. *Degeneração hialina em várias células musculares; Setas indicam pequeno grupo de células inflamatórias (seta) e o pontilhado área de necrose em C. Priscila Gomes dos Reis 72 Capítulo 2 Quanto às dosagens bioquímicas dos de CKMB e AST, indicadores de lesão miocárdica, não foram observadas quaisquer alterações significativas. Tabela 18: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade cardíaca avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com Sb, (n=6). Parâmetros Controle AA Sb Sb+AA AST (UI /L) 267,8 ± 48,05 165,5 ± 11,77 228,3 ± 37,22 312,1 ± 61,77 CKM B (UI ) 966,9 ± 145,70 920,0 ± 186,40 692,5 ± 106,60 892,9 ± 139,80 a AST (aspartato aminotransferase) Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. b Representa diferença significativa entre os tratamentos com antimônio e antimônio concomitante com ácido ascórbico. b. Avaliação da toxicidade hepática Os parâmetros bioquímicos indicativos de toxicidade hepática, ALT, AST, albumina e proteínas totais não apresentaram alterações. Por outro lado, ocorreu aumento da FA no grupo Sb quando comparado aos grupos controle e Sb+AA . Tabela 19: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade hepática avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com Sb, (n=6). Parâmetros Controle AA Sb Sb+AA ALT (UI /L) 79,5 ± 26,03 45,0 ± 6,61 217,8 ± 118,9 96,9 ± 18,61 AST (UI /L) 267,8 ± 48,05 165,5 ± 11,77 228,3 ± 37,22 312,1 ± 61,77 Albumina (g/dL) 3,0 ± 0,06 2,8 ± 0,07 3,3 ± 0,07 3,0 ± 0,09 Proteína Total (g/dL) 5,6 ± 0,17 5,7 ± 0,16 5,9 ± 0,25 5,6 ± 0,23 FA (UI /L) 123,4 ± 14,09 112,1 ± 10,96 Í ndice Ureia/Creatinina 116,8 ± 10,87 108,8 ± 5,64 174,1 ± 15,52 ª, b 101,5 ± 7,24 89,4 ± 5,87 117,7 ±7,69 ALT (alanina aminotransferase), AST (aspartato aminotransferase), FA (Fosfatase Alcalina). a b Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Representa diferença significativa entre os tratamentos com antimônio e antimônio concomitante com ácido ascórbico. Priscila Gomes dos Reis 73 Capítulo 2 A análise histológica do tecido hepático demonstrou alterações unicamente no grupo Sb onde foi observada necrose, congestão e discreta inflamação. (figura 33) A A B C C D D Figura 33: Cortes histológicos do fígado de ratos pertencentes aos grupos controle (A) e tratados com ácido ascórbico (B), antimônio (C), antimônio/ácido ascórbico (D). Observa-se em A, B, D aspecto histológico compatível com normalidade. Em C observa-se área de necrose e inflamação (pontilhada), alargamento de sinusóides e congestão (setas). Hematoxilina Eosina, 40X. Priscila Gomes dos Reis 74 Capítulo 2 c. Avaliação da toxicidade renal A administração subaguda de Sb e Sb+AA não induziu alterações significativas nos parâmetros bioquímicos indicativos de toxicidade renal que são creatinina sérica, uréia sérica e relação creatinina sérica/uréia sérica. Tabela 20: Parâmetros bioquímicos para avaliação da toxicidade renal avaliados em ratos Wistar submetidos ao tratamento subagudo com Sb, (n=6). a b Parâmetros Controle AA Sb Sb+AA Uréia Sérica (g/dL) 49,6 ± 2,04 50,3 ± 1,37 51,6 ± 1,51 52,3 ± 1,76 Creatinina (mg/dL) 0,5 ± 0,03 0,5 ± 0,04 0,5 ± 0,04 0,5 ± 0,03 Í ndice Ureia/Creatinina 116,8 ± 10,87 108,8 ± 5,64 101,5 ± 7,24 117,7 ±7,69 Representa diferença significativa entre os grupos tratados e o grupo controle. Representa diferença significativa entre os tratamentos com antimônio e antimônio concomitante com ácido ascórbico. Priscila Gomes dos Reis 75 Capítulo 2 d. Avaliação Hematológica Os parâmetros hematológicos obtidos ao serem avaliadas as amostras sanguíneas dos diferentes grupos submetidos ao protocolo subagudo encontram-se sumarizadas na tabela 21. Não foram observadas diferenças significativas após comparação entre os grupos. Tabela 21: Parâmetros hematológicos obtidos nos diferentes grupos submetidos ao tratamento subagudo com Sb, (n=6). Parâmetros Controle AA Sb Sb+AA Hemácia (109/L) 8,6 ± 0,78 7,9 ± 0,2 9,6 ± 0,94 9,2 ± 0,87 Hemoglobina (g/dl) 14,1 ± 1,59 13,3 ± 0,42 16,2 ± 1,32 16,2 ± 1,58 Hematócrito (% ) 41,1 ± 2,84 32,2 ± 1,29 42,3 ± 4,7 40,2 ± 3,18 Leucócito (109/L) 6,8 ± 1,17 4,5 ± 0,2 7,2± 0,94 7,2 ± 0,87 Linfócito (% ) 69,1 ± 3,51 69,3 ± 3,33 76,2 ± 4,05 78,3 ± 2,94 Neutrófilo (% ) 33,3 ± 3,45 29,7 ± 3,82 19,2 ± 4,29 18,0 ± 2,59 M onócito (% ) 0,7 ± 0,33 1,0 ± 0,34 2,9 ± 1,05 2,9 ± 0,60 Eosinófilo (% ) 0,1 ± 0,09 0,0 ± 0,00 0,6 ± 0,24 0,5 ± 0,34 Bastonete (% ) 0,4 ± 0,22 0,0 ± 0,00 0,1 ± 0,11 0,0 ± 0,00 Basófilo (% ) 0,1 ± 0,09 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 Plaquetas (% ) 399,8 ± 40,71 291,7 ± 16,24 607,7 ± 143,45 386,3 ± 57,48 Os valores representam a média ± e.p.m. O nível de significância foi considerado para valores de P < 0,05 ± ANOVA, seguido de teste de Tukey.. Priscila Gomes dos Reis 76 Capítulo 2 5.4. Discussão 5.4.1. Lipossomas O As em sua forma trivalente tem demonstrado atividade antineoplásica significativa no tratamento do mieloma múltiplo refratário recidivante (Bahlis et al., 2002). No entanto, a expansão da utilidade clínica para outros tipos de câncer tem sido limitada pela toxicidade deste quando utilizado em maiores doses e à baixa biodisponibilidade no local do tumor (Chen et al,2002; Evens et al, 2004; Dilda et al, 2007). Sistemas carreadores de fármacos, como os lipossomas, asseguram um tempo de circulação sanguínea prolongado, lenta liberação do composto encapsulado, menor acúmulo em tecidos normais e maior em áreas com tumor, o que diminui efeitos adversos e aumenta a efetividade do fármaco (Allen e Cullis, 2004). Diante disto, trabalhos têm sido realizados na tentativa de obter-se uma formulação lipossomal de arsênio desde a aprovação, pela FDA, do trisenox como medicamento anticancerígeno. Kallinteri e colaboradores (2004) avaliaram a encapsulação do TOA em lipossomas, constituídos de diferentes lipídeos e através de diferentes técnicas, obtendo taxas de encapsulação que variaram de 0,003 a 0,506 mol de TOA/mol de lipídeo. Wang e colaboradores (2007) encapsularam TOA em nanopartículas com PEG e PLGA. Aumento da estabilidade de lipossomas através da liberação lenta de compostos de arsenito ligados a metais de transição foi pesquisado por Chen e colaboradores (2006). A metodologia de preparação lipossomal utilizada neste trabalho demonstrou eficiência de encapsulação do arsenito de sódio, aproximadamente 9%, compatível com as descritas nos estudos nos estudos acima citados. E foi considerada viável para atender ao objetivo de avaliação da possível redução da cardiotoxicidade do arsênio, tendo em vista possuir concentração suficiente do fármaco que possibilite a administração endovenosa da DMT de 6,5 mg/kg em volume de até 1,0 ml. A eficiência de encapsulação pode variar dependendo da dimensão dos lipossomas, do peso molecular das moléculas encapsuladas, composição lipídica das vesículas e procedimento de preparação dessas (Monnard et al, 1997; Crossasso et al 2000). Assim, após a obtenção de resultados satisfatórios de redução de toxicidade e, até mesmo, aumento de atividade dos compostos de arsênio quando veiculados em lipossomas, seria justificável trabalhos futuros que tenham por objetivo a otimização dessas formulações, viabilizando-as para o uso terapêutico. Em média, o tamanho das partículas obtidas foi condizente com o esperado, uma vez terem sido calibradas, no processo de extrusão, através de membranas com poros de 200 nm. Além disso, o baixo índice de polidispersão obtido reflete a homogeneidade de tamanho das partículas, sendo as Priscila Gomes dos Reis 77 Capítulo 2 amostras consideradas monodispersas quando o IP é inferior a 0,3 (Hunter e Frisken, 1998). O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (Schaffazick e Guterres, 2003; Magenheim e Benita, 1991; Mosqueira et al, 2000). Um valor de potencial zeta relativamente alto (em módulo) é importante para uma boa estabilidade físico-química da suspensão coloidal, pois grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação em função das colisões ocasionais de nanopartículas adjacentes (Schaffazick e Guterres, 2003). Logo, o obtido neste trabalho paras as preparações de lipossomas contendo arsênio (-37,80 ± 0,8 mV) ou lipossomas vazios (- 41,75 ± 0,3 mV) foram considerados satisfatórios. A carga negativa provavelmente é proveniente do lipídeo PEG e influenciado pelo solvente utilizado. Em relação à avaliação da estabilidade da formulação em condições de armazenamento, os resultados obtidos mostraram que os lipossomas contendo arsênio quando armazenados a 4 °C conservaram por três dias 75 % da substância ativa em seu interior, indicando que, para garantir sua eficácia, esta formulação deve ser utilizada em curto período. Assim, nos experimentos realizados no presente trabalho, a formulação foi utilizada até 24 horas após o preparo, visando à confiabilidade dos resultados obtidos. Sabe-se que as formulações de lipossomas provenientes de soluções concentradas de arsênio liberam quantidades significativas do princípio ativo em poucas horas (Kallinteri et al, 2004) principalmente devido a fácil difusão da espécie neutra As(OH)3 pela membrana. Estudos buscando a melhora da estabilidade das formulações de lipossomas contendo arsênio estão obtendo sucesso em um sistema no qual são empregados gradientes transmembrana de íons de metal de transição para produzir nanopartículas com o AsIII dentro dos lipossomas (Chen et al 2006; Chen et al 2009). A análise do perfil de liberação in vitro mostrou a habilidade dos lipossomas reterem 95% do arsênio até 12 horas de incubação a 37 °C em condições sink, com liberação exponencial a partir deste tempo. O experimento realizado neste trabalho avaliou a cardiotoxicidade do arsênio até uma hora de experimento, assim os resultados obtidos podem ser atribuídos à lenta liberação do arsênio a partir dos lipossomas. Ainda no intuito de garantir uma formulação viável para a análise da cardiotoxicidade do arsênio trivalente, uma análise qualitativa do arsênio encapsulado foi realizada por EXAFS após liofilização das amostras, tendo sido constatada a manutenção do estado de oxidação trivalente do arsênio encapsulado a partir de soluções de arsenito de sódio. As características de superfície das partículas também podem alterar a resposta biológica do Priscila Gomes dos Reis 78 Capítulo 2 fármaco associado. Quando se administram intravenosamente sistemas de nanopartículas convencionais, estes são rapidamente removidos da circulação sanguínea pela ação de células do sistema fagocitário mononuclear, dificultando a chegada do fármaco ao sítio de ação. Diferentes estratégias têm sido propostas para modificar a distribuição in vivo das nanopartículas, baseadas principalmente na redução da hidrofobicidade da superfície dessas através da adsorção física de um polímero hidrofílico, como polimero de etilenoglicol (PEG) utilizado em nossa formulação. O PEG é capaz de influenciar o potencial zeta tornando-o negativo e prevenindo a agregação das vesículas (Harasym et al., 1995), além de contribuir para o direcionamento destas a sítios onde ocorre menor filtração, como no caso do câncer (Gacizon e Papahadjapoulos, 1988; Papahadjopoulos, 1991). A obtenção da formulação lipossomal contendo arsênio neste trabalho foi considerada satisfatória para a avaliação da possibilidade de redução de toxicidade cardiovascular proveniente do uso destes nanocarreadores. 5.4.2. Avaliação das alterações cardiovasculares Alterações cardiovasculares são freqüentemente observadas em tratamentos que utilizam metais e semimetais, como é o caso dos compostos de arsênio e antimônio. Tal toxicidade é considerada fator limitante para tratamento com antimoniais em pacientes que utilizam betabloqueadores ou anti-arrítmicos, e em casos de ocorrência no ECG, de intervalo QTc superior a 400 ms em homens e 450 ms em mulheres (Brasil, 2006). No caso do arsênio, interrupções do tratamento ou uso de subdoses são necessárias em casos de pacientes que apresentam arritmias (Yamazaki et. al., 2006). As principais alterações no ECG induzidas em humanos pelo arsênio são prolongamento do intervalo QT e do índice QTc. A prevalência de pacientes tratados com trióxido de arsênio que apresentam essas alterações está por volta de 60% (Vizzardi et al, 2008; Unnikrishnan et al, 2004; Ohnishi et al, 2000). Barbey e colaboradores (2003) realizaram um estudo com 56 pacientes tratados com TOA, dentre os quais 38 apresentaram prolongamento de QT e QTc maior que 500 ms, além de aumento na frequência cardíaca maior que 100 bpm. O antimônio também induz a alterações no ECG, principalmente inversão do segmento ST, prolongamento do intervalo QT e conseqüentemente torsades de pointes e morte cardíaca súbita (Lacerda-Júnior et al., 1965, Chulay et al., 1985). Primariamente, este trabalho identificou no modelo experimental, rato Wistar macho, as alterações no ECG e na pressão arterial induzidas pelo arsenito de sódio livre e indicativas de sua toxicidade. Esta caracterização permitiu posterior avaliação da possível redução da cardiotoxicidade Priscila Gomes dos Reis 79 Capítulo 2 do arsênio ao ser veiculado em lipossomas ou administrado concomitantemente ao AA. No tratamento agudo, aumento do intervalo PR, bradicardia e diminuição da pressão arterial foram detectados, já no subagudo foram identificados prolongamento dos parâmetros QT, QTc e QRS. Estas alterações encontradas no tratamento subagudo refletiram aquelas encontradas em pacientes tratados com TOA. Já no tratamento agudo, ao contrário, isto não ocorreu o que sugere que estas alterações sejam dependentes do tempo de tratamento. Em relação aos dados obtidos com a administração de tártaro emético livre foram observados prolongamento de QT e QTc em ambos os protocolos agudo e subagudo. Sendo ainda observada forte hipotensão no protocolo agudo e prolongamento de QRS no subagudo. Possíveis mecanismos que expliquem as alterações no intervalo QT induzidas são descritos na literatura. Ribeiro e colaboradores (1999) e Ohnishi e colaboradores (2000) descreveram o retardo da repolarização ventricular como possível causa do prolongamento deste intervalo. Smits e colaboradores (2008) relacionaram a síndrome de QT longo com disfunções nos canais de sódio. Kuryshev e colaboradores (2006) demontraram em porcos guinea que o tártaro emético pode prolongar o potencial de ação de miócitos ventriculares via aumento de correntes de calcio apresentando um papel pró-arrítmico, como verificado pela presença de prolongamento do intervalo QT. Recentemente, Dennis e colaboradores (2007) descreveram a inibição do tráfego de canais hERG/IK para a superfície da célula, e consequentemente redução da corrente de potássio, como um possível mecanismo para o aumento de intervalo QT induzido por fármacos (LQTS), tendo atribuído esse novo mecanismo ao TOA, pentamidina, probucol, fluoxetina e tártarato emético (SbIII). O prolongamento do intervalo PR, identificado neste trabalho, nos animais tratados com arsênio possivelmente demonstra a ocorrência de bloqueio atrioventricular de primeiro grau, no qual, todas as ondas P são conduzidas sempre com retardo (Myerburg et al, 1998). Sabe-se que fatores transitórios, como isquemia miocárdica e a ação de drogas que deprimem a condução atrioventricular (ex: betabloqueadores, antiarrítmicos, digital e bloqueadores dos canais de cálcio) podem precipitar ou agravar os bloqueios atrioventriculares (Myerburg et al, 1998). Wey e colaboradores (1997) e Ohnishi e colaboradores.(2000) demonstraram que o arsênio e o antimônio causariam a sobrecarga de cálcio intracelular o que seria fator predisponente para a morte de miócitos cardíacos. Além dos parâmetros de ECG e pressão, a função cardíaca foi também avaliada através da dosagem de CKMB e AST, bem como por análise histopatológica dos corações. A elevação da atividade plasmática da CKMB é o indicador mais específico de lesão miocárdica, particularmente, de infarto agudo do miocárdio (Motta et al, 2003). Assim, avaliação da atividade de CKMB sérica é importante ferramenta que auxilia não apenas no diagnóstico precoce de Priscila Gomes dos Reis 80 Capítulo 2 infarto do miocárdio, como também a identificação de injúrias locais (Liu et al., 2008). Alterações significativas na dosagem destes parâmetros não foram identificadas nos diferentes grupos estudados (para As e Sb). Também as dosagem de AST, enzima que se eleva em casos de necrose cardíaca (Alarcón-Corredor et al, 2000), não apresentaram alterações significativas nos grupos em estudo. Estes resultados indicam a não indução pelos compostos de As e Sb estudados de lesões cardíacas suficientes para causarem alterações nas dosagens bioquímicas. Em relação à análise histopatológica, pequenas alterações foram identificadas no tecido cardíaco de animais tratados com arsênio, tais como degeneração hialina, edema, inflamação discreta e vacuolização de vasos. Já no grupo tratado com antimômio, além do já citado para o arsênio, também foi observada necrose tecidual. Como as dosagens de CKMB e AST não foram indicativas da ocorrência de lesões extensas no miocárdio dos animais tratados com arsênio ou antimônio e, no entanto, a análise histológica dos corações destes animais demonstrou alterações, mesmo que singelas, no tecido cardíaco, sendo que nos animais tratados com antimônio foram encontradas áreas de necrose, provavelmente outros fatores contribuiram paras as alterações eletrocardiográficas encontradas. Para melhor correlação das alterações no tecido cardíaco com aquelas ocorridas na pressão e ECG seria necessário análise em locais específicos do coração. Análise esta que será realizada em trabalhos futuros por este grupo de pesquisa. É descrito que tanto o arsênio como o antimônio são responsáveis por induzir estress oxidativo, através de depleção de agentes redutores como a glutationa, provocando injúrias ao miocárdio (Tirmenstein et al., 1997; Li et al, 2002). O arsênio provoca, também, injúrias nas células endoteliais o que resultaria em isquemia do miocárdio e finalmente fibrose cardíaca e disfunção (Li, 2002, Ohnishi et al, 2000; Gyenes, 1998). Em contra-partida, doses não-letais do tártaro emético reduziram a capacidade de miócitos cardíacos para mobilizar cálcio durante uma excitação-contração (Toraason et al., 1997). A freqüência cardíaca pode ser alterada principalmente por ações reflexas conseqüente a ações regulatórias da pressão arterial, por mediadores do SNA (Sistema Nervoso Autônomo) ou como conseqüência direta da ação de fármacos na atividade marcapasso cardíaca (Herring et al.,2002; Guyton e Hall, 2002). Neste trabalho foi observada bradicardia, a qual provavelmente não poderia ser explicada pela hipótese de ação reflexa, uma vez que a pressão arterial apresentou redução, assim pode ser proposta uma ação direta na atividade cardíaca. Reduções na pressão arterial em geral podem ser devidas ao mau funcionamento cardíaco causado por arritmias, lesões, perda ou mau funcionamento do músculo cardíaco ou ainda por uma possível dilatação dos vasos sanguíneos (Manual Merck, 2010). Assim, a acentuada queda na PA nos Priscila Gomes dos Reis 81 Capítulo 2 experimentos realizados no protocolo agudo por não apresentarem descrição previa na literatura, pode ser atribuída a uma destas causas. É possível ainda atribuir esta redução de pressão à elevada dose utilizada, a qual é muito maior que a utilizada em terapêutica e publicada. Diante dos relatos de injúria cardíaca provocada por estes semimetais e dos dados apresentados na análise histopatológica do grupo subagudo, a primeira hipótese de presença de arritmias e lesões pode ser considerada como a mais provável, sendo a recuperação da pressão arterial, dentro do período de uma hora para o antimônio, ou a quase normalidade, no caso do arsênio, reflexo de mecanismos compensatórios. O ácido ascórbico (vitamina C), um suplemento natural na nossa dieta, há muito encontra-se envolvido na prevenção do câncer. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que, apesar do TOA, por si só matar células leucêmicas quando esse é associado ao ácido ascórbico há o aumento significativo desta atividade (Qazilbash et al, 2008; Bahlis et al.,2002). Além dessa potencialização da atividade, possível ação protetora sobre os efeitos adversos provocados pelo arsênio tem sido relatada. Singh e colaboradores (2007) e Rana e colaboradores (2006) observaram o efeito protetor do ácido ascórbico sobre o estresse oxidativo induzido pelo arsênico inorgânico no fígado e rins de ratos. A redução ou eliminação da maioria das alterações cardiovasculares no ECG, pressão e análise histológica induzidas pela administração concomitante do AA ao As e Sb na forma livre, vêm demonstrar a potencial ação cardioprotetora exercida pelo AA não só sobre os efeitos do arsênio, mas também do antimônio, sendo que, para o grupo agudo Sb + AA os valores de variação reduziram até a normalidade e nos grupos subagudos Sb + AA (p<0,05) e As + AA (p<0,0001), as variações, apesar de serem maiores que as do grupo controle, foram significativamente menores quando comparados a aquelas dos grupos tratados somente com arsênio ou antimônio. O prolongamento do intervalo PR observado no grupo As+AA agudo, não apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo tratado somente com arsênio, no entanto, diminuiu o suficiente para também não apresentar diferença com relação ao grupo controle. Já as alterações encontradas nos grupos subagudo nos intervalos PR e QRS foram eliminadas quando AA foi administrado concomitantemente. As alterações na freqüência cardíaca e pressão arterial, caracterizadas nos grupos agudos As e Sb, não foram observadas nos grupos tratados simultaneamente com ácido ascórbico. Há indícios que a cardioproteção observada com a administração concomitante de AA, seja oriunda da ação antioxidante do ácido ascórbico sobre o estress oxidativo provocado pelo arsênio ou antimônio. Taglialatela e colaboradores (1997) demonstraram que o aumento na produção de radicais livres (ROS), associado a condições de isquemia, influencia a mobilização de potássio realizada pelos canais hERG/IK . Sabe-se que em tecidos excitáveis o potássio desempenha papel crucial na modulação do potencial da membrana em repouso, na freqüência de disparo e na definição do Priscila Gomes dos Reis 82 Capítulo 2 potencial de ação, influenciando a freqüência cardíaca e o tônus muscular. Bhandari e colaboradores (2004) observaram o papel do ácido ascórbico como um redutor de radicais livres na proteção contra os efeitos deletérios da perda excessiva de sangue, uma situação isquêmica. Já Nandi e colaboradores (2005) observaram em ratos tratados com arsênio que a administração de vitaminas e aminoácidos resultava em reversão do estresse oxidativo e melhora do nível de peróxido lipídico e da atividade das enzimas antioxidantes como a glutationa. Tais relatos estão de acordo com a ausência de alterações no tecido cardíaco de animais tratados concomitantemente com ácido ascórbico, visto neste trabalho. Outra hipótese a ser levantada para um possível mecanismo de cardioproteção do AA, seria a indução da liberação de acetilcolina. Kuo e colaboradores (1979) e Pinchasi e colaboradores (1979), observaram que o ácido ascórbico estimulava a liberação de acetilcolina em vesículas sinápticas isoladas. Baseado no benefício da estimulação vagal em proteger o coração contra episódios de fibrilação ventricular, alterando favoravelmente a automaticidade cardíaca (Waxman et al., 1988; Eliakim et al., 1961) e a refratariedade in vivo (Schwartz et al., 1977; Martins e Zipes, 1980), foi proposto que fármacos colinérgicos também poderiam atuar como cardioprotetores (De Ferrari et al., 1992). Quanto a avaliação de diminuição da cardiotoxicidade através da encapsulação de As e Sb em lipossomas, os resultados obtidos no experimento agudo demonstram uma efetiva normalização nos parâmetros do ECG e pressão arterial demonstrando a efetiva e potencial ação protetora dos lipossomas. Como anteriormente relatado, os experimentos de liberação in vitro da formulação lipossomal de arsênio identificaram uma retenção de 95% do As até 12 horas de incubação a 37 0C em condições Sink. Como os experimentos agudos foram realizados até 1 hora após a administração de As e Sb livre ou encapsulados, a não ocorrência de alterações no ECG após administração da forma lipossomal destes semi metais pode, então, ser atribuída a lenta liberação dos semimetais induzida pelos lipossomas, a qual levaria à menor concentração de arsênio ou antimônio disponível para associação com o tecido cardíaco em comparação com estes na forma livre e conseqüente menor toxicidade. Diante desses resultados, pode-se concluir que as condições experimentais utilizadas neste trabalho mostraram-se satisfatórias para o estudo da toxicidade cardíaca causada pelos compostos trivalentes do arsênio e do antimônio e que o uso concomitante de ácido ascórbico e a encapsulação dos compostos de arsênio e antimônio em lipossomas apresentaram potencial ação cardioprotetora. 5.4.3. Avaliação hepática Priscila Gomes dos Reis 83 Capítulo 2 A aspartato alaninatransferase (ALT) e a aspartato aminotransferase (AST) são enzimas intracelulares presentes em grandes quantidades nos hepatócitos. A ALT é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito, enquanto 80% da AST está presente nas mitocôndrias. Lesões ou destruição das células hepáticas liberam estas enzimas para a circulação. Em dano hepatocelular leve, a forma predominante no soro é a citoplasmática, e em lesões graves, há liberação da enzima mitocondrial, elevando a relação AST/ALT (Motta, 2003). A ALT é utilizada para diagnóstico das enfermidades hepatobiliares agudas, já a AST eleva-se em casos de necrose cardíaca. O predomínio da ALT indica somente uma alteração na membrana, enquanto o predomínio da AST revela lesão das organelas citoplasmáticas (Alarcón-Corredor et al, 2000). A FA localiza-se nas membranas de revestimento dos canalículos biliares, assim, a enzima encontra-se elevada em desordens do trato biliar, nas hepatites virais e cirrose e pode também elevarse em resposta a alguns fármacos e insuficiência renal crônica (Motta, 2003). A Albumina é uma proteína produzida especificamente pelo fígado, e pode ser medida de forma barata e fácil. É o principal constituinte da proteína total; a fração restante é chamada de globulina (incluindo as imunoglobulinas). Os níveis de albumina estão diminuídos em doenças crônicas do fígado, como a cirrose. A disfunção hepática é comum em pacientes que apresentam hipoalbuminemia com edema ou ascite (Davidson, 1998). Fibrose não cirrótica no fígado é comum em indivíduos expostos cronicamente ao arsênio presente na água. Santra e colaboradores (2000) no intuito de investigar os possíveis mecanismos dessa alteração realizaram experimentos com camudongos Balb C. Estes receberam água potável com arsênio (3,2mg/L) e foram sacrificados entre 3 e 15 meses. Observou-se a partir de 12 meses aumento do peso do fígado, das dosagens de ALT e AST e diminuição de glutationa hepática, glicose- 6-fosfato e glutationa peroxidase, além de infiltração gordurosa após 12 meses. Observações semelhantes de redução na atividade da superoxido desmutase e catalase foram também encontradas em células de mamíferos V79 CH com o tratamento com As III (Sinha et al, 2005; Mukherjee, 2006). Aumento nos teores das enzimas hepáticas tem sido observado em pacientes com o uso de compostos antimoniais (Chulay et al., 1983; Lawn et al., 2006; Lima et al., 2007) sendo que elevações de duas a três vezes em relação aos valores basais são freqüentemente observados durante a terapia (Berman, 1988). Estibogluconato de sódio, composto antimonial pentavalente, está associado a danos hepáticos agudos e diminuição na capacidade funcional metabólica do fígado, as quais são normalmente reversíveis com interrupção do tratamento (Hepburn et al., 1993). Dieter (1992) Priscila Gomes dos Reis 84 Capítulo 2 observou em ratos, após administração de tartarato emético nas doses de 0, 1.5, 3, 6, 11, ou 22 mg/kg, degeneração hepatocelular e necrose que foram associados com as elevações dosedependente nas atividades das enzimas hepáticas específicas, sorbitol desidrogenase e alanina aminotransferase. Estudo realizado por Alkhawajah e colaboradores (1992) mostraram aumento no nível de fosfatase alcalina em ratos tratados por 30 dias com a dose de 300 mg/kg de antimoniato de meglumina e, aumento AST e ALT em animais tratados com estibogluconato de sódio na mesma dose. Já Ikeda-Garcia e colaboradores (2007) observaram aumento de ALT, AST e FA em cães após 30 dias de tratamento com 75 mg/kg de antimoniato de meglumina, mas com ausência de sinais clínicos. Em nosso estudo observou-se, curiosamente, redução nos níveis de FA nos grupos As e As+AA o que demonstra que não há danos hepatobiliares sérios, no entanto, essa diminuição pode ser encontrada no hipotireoidismo, na anemia perniciosa e nas hipofosfatemias. Leves alterações no tecido hepático foram observadas no grupo tratado somente com arsênio, o que não ocorreu com o grupo As+AA. Já o grupo Sb apresentou elevação da FA o que pode demonstrar possível lesão hepatotóxica neste grupo, o que é compatível com a presença de necrose e células inflamatórias observadas na análise histopatológica. No entanto, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de ALT, AST, albumina e proteínas totais. Pode-se ainda, observar que o ácido ascórbico promoveu proteção contra esta toxicidade ao observarmos que não ocorreu o aumento de FA, nem alterações nos cortes histológicos. Ramanathan e colaboradores (2002) mostraram que a administração combinada de alfatocoferol e ácido ascórbico preveniu e protegeu o sistema orgânico da intoxicação provocada pelo arsênio e que esta combinação pode melhorar as alterações moleculares induzidas pelo arsênio. Em estudos com ratos, Singh e Rana (2007) observaram que o arsênio promove a depleção do ácido ascórbico e esta deficiência inibiria as funções antioxidantes do organismo. Observou também que a suplementação deste aumenta a excreção de arsênio, inibi a peroxidação lipídica, melhora os níveis de GSH e restaura a atividade de glutationa-S-transferases no fígado e rins. Banerjee e colaboradores (2009) em estudo com ratos demonstraram o potencial hepatoprotetor da vitamina C através da capacidade deste de restaurar os níveis de dosagens bioquímicas para próximas do normal, além de danos histopatológicos e até mesmo aberrações cromossômicas dentre outras. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os estudos que mostram que o ácido ascórbico apresenta potencial efeito protetor sobre os efeitos do estresse oxidativo provocado pelo Priscila Gomes dos Reis 85 Capítulo 2 arsênio e antimônio no fígado. 5.4.4. Avaliação Renal É descrito na literatura que os compostos de arsênio e antimônio causam efeitos tóxicos nos rins. Estes são excretados via renal e, portanto, podem se acumular neste local. Goodwin e colaboradores (1943) apontaram a membrana tubular como sítio de predição dos efeitos funcionais dos metais pesados no rim, embora estes formem complexos intracelulares com proteínas. Os compostos antimoniais alteram reversivelmente a capacidade de concentração urinária, porém o mecanismo de ação ainda está sob investigação (Veiga et al., 1985).O tratamento de ratos com antimoniais pentavalentes na dose de 30,0 mg/kg do antimoniato de meglumina ou estibogluconato de sódio, durante trinta dias, induziu disfunção tubular caracterizada por diminuição da capacidade de concentração urinária, porém tais alterações parecem ser reversíveis após suspensão do uso desses fármacos e, nessa dose não foram observadas alterações histopatológicas renais. Por outro lado, a dose de 200,0 mg/100g/dia do Pentostam® induziu alterações histopatológicas renais na medida em que demonstrou necrose aguda tubular (Veiga et al., 1990). Um relato de caso em um paciente de 60 anos mostrou quadro de insuficiência renal aguda, com necrose tubular acompanhada de aumento plasmático de uréia, creatinina, proteinúria e queda da depuração de creatinina com o uso de 30,0 gramas de Glucantime®/dia. A biópsia renal revelou aspecto histopatológico de acometimento renal caracterizado por agressão e necrose dos túbulos renais. No entanto, com a suspensão da terapia, a função renal retornou à normalidade (Cuce et al., 1990). Outro relato de caso em um paciente masculino de 50 anos com leishmaniose cutânea generalizada mostrou necrose tubular aguda com a administração de Glucantime® após 15 dias de tratamento seguido de óbito (Rodrigues et al., 1999). Em relação ao arsênio, Keith e colaboradores (1995) mostraram que este semimetal é citotóxicos ao tecido renal em concentrações elevadas. Haung e colaboradores (1995) e Hussein (2003) descreveram lesões renais, creatinina sérica elevada, uréia no sangue e proteinúria, em estudos clínicos de pacientes em uso de TOA, medicamento utilizado na leucemia promielocítica aguda. A morte celular provocada pelo arsênio pode ser a causa destas alterações, e esta pode ser induzida por um ou mais mecanismos, incluindo a ativação da caspase, geração maior de espécies reativas de oxigênio, aumento de expressão do gene HMOX1, dentre outros (Zheng et al, 2005; Sasaki et al, 2007). Saxena e colaboradores (2008) avaliaram, em ratos, a nefrotoxicidade do TOA através da estimativa dos níveis séricos de uréia, creatinina e ácido úrico. As doses, por via oral, foram de Priscila Gomes dos Reis 86 Capítulo 2 0,007, 0,01, 0,02 e 0,15 mg para cada 100g de peso corporal para tratamentos subagudo (21,14 e 7 dias) e agudo (1 dia), respectivamente. Foi observado aumento significativo dos níveis séricos dos parametros bioquímicas em comparação ao controle, devido à disfunção renal. Em nosso trabalho não foram observados alterações significativas nas dosagens de creatinina e uréia sérica. Alguns estudos relatam que o comprometimento renal também pode ser expresso em função do aumento dos níveis plasmáticos de uréia e creatinina. Entretanto, na fase inicial de injúria renal não poderia, pois ocorreria um aumento da secreção de creatinina, conseqüentemente evitando um aumento dos níveis plasmáticos da mesma (Asna et al, 2005). Assim, nessa fase inicial é comum expressar o dano renal pelo índice uréia/creatinina, uma vez que o valor elevado desse índice reflete a redução da perfusão renal bem como da taxa de filtração glomerular. No entanto, neste trabalho também não foram observadas diferenças significativas na relação uréia/creatinina nos grupos tratados com antimônio ou arsênio. Isto demonstra que as doses e protocolo utilizado não foram capazes de causar alterações renais, em contradição à literatura. 5.4.5. Avaliação hematológica Alterações hematológicas são observadas em pacientes tratados com trióxido de arsênio, sendo leucocitose a principal delas, normalmente reversível podendo ocorrer juntamente com febre, dispnéia, ganho de peso, infiltrados pulmonares e derrames pleurais ou pericárdicos, caracterizando uma síndrome de diferenciação que pode ser fatal. Em um estudo de fase II do medicamento Trisenox, 55% dos pacientes (26 de 47) desenvolveram hiperleucocitose em um tratamento de duração média de 17 dias (Tallman, 2001). Leucocitose provavelmente ocorre devido a um efeito do TOA de induzir a diferenciação parcial dos clones leucêmicos (Au e Kwong, 2008), ao degradar a proteína PML-RAR-alfa (Miller et al, 2002). No entanto, contraditoriamente, a continuação do tratamento com o trióxido de arsênio leva à supressão dos clones leucêmicos podendo causar leucopenia. Tendo em vista que o modelo utilizado neste trabalho constituiu-se do uso de animais saudáveis, e que por isto não havia células leucêmicas que estariam com a diferenciação celular incompleta, não poderia ter sido observado o efeito do aumento de leucócitos presente em pacientes com LPA. Foi observado leucopenia no grupo tratado com arsênio livre quando comparado com o grupo controle, o que pode ter ocorrido devido à indução a apoptose celular provocada pelo arsênio trivalente. A leucopenia não foi observada no grupo que recebeu o ácido ascórbico, no entanto, não há diferença significativa entre esses dois grupos. Sabe-se que o ácido ascórbico vem sendo utilizado Priscila Gomes dos Reis 87 Capítulo 2 em terapêutica juntamente com o arsênio por aumentar a ação apoptótica deste último, ao diminuir o GSH intracelular (Grad et al, 2009). No entanto, não foi observado o efeito desta combinação em células normais demonstrando que, provavelmente, há seletividade para as células malignas, sem causar toxicidade grave aos tecidos normais (Dai et al, 1999), o que poderia explicar os resultados encontrados neste trabalho. Além disso, os resultados de contagem diferencial de leucócitos obtidas neste trabalho demonstraram aumento significativo de linfócitos e diminuição significativa de neutrófilos do grupo As+AA quando comparado com o grupo As. Não foram encontradas tais alterações descritas na literatura. É importante salientar que o tratamento diário contínuo com TOA (10 mg) em pacientes com outras doenças malignas que envolvem a medula óssea, além da LPA, como a leucemia aguda, mielodisplasia, mieloma e linfoma, pode causar pancitopenia de leve a grave caracterizando a mielossupressão como o principal efeito dose-limitante do trióxido de arsênio nos pacientes com estas enfermidades. Além disso, a administração concomitante de outros mielo supressores pode agravar, ainda mais, a mielo toxicidade o que torna necessário a redução da dosagem de TOA quando é utilizado outra quimioterapia ou radioterapia concomitante (Au e Kwong, 2008).Diante disto, o ácido ascórbico ao aumentar a atividade do trióxido de arsênio, pode vir a viabilizar o seu uso em outras neoplasias além da LPA, visto que, este tornaria viável o uso de menores doses do medicamento em questão e conseqüentemente diminuiria os efeitos adversos hematológicos que limitam o seu uso. Ao contrário do grupo As, não foram observadas alterações no grupo tratado com antimônio. O que condiz com o estudo do programa de toxicologia do departamento de saúde e serviços humanos dos EUA realizado por Dieter em 1992, o qual demonstrou que o tártaro emético não produzia mudanças significativas nos parâmetros hematológicos mensurados em camundongos e ratos tratados 3 vezes por semana com injeção IP das doses de 0, 1,5, 3, 6, 12 ou 24 mg / kg de peso corporal durante 3 semanas. A ausência de alterações no grupo tratado com Sb no presente trabalho pode vir a demonstrar uma seletividade deste composto às células neoplásicas visto que já foi demonstrada a seletividade da ação apoptótica somente sobre estas (Müller et al, 2009; Sharma et al, 2008; Hsu et al, 1960; Hu et Priscila Gomes dos Reis al, 1995). 88 Referências Bibliográficas 6. CONCLUSÕES Priscila Gomes dos Reis 89 Referências Bibliográficas De acordo com os objetivos propostos e os resultados obtidos, pode-se concluir que: O método de análise por espectrometria aplicada para quantificação de arsênio e antimônio encapsulado em lipossomas foi validado. Este mostrou ser simples, rápido, preciso, exato e reprodutível e com a vantagem de utilizar pequenos volumes de amostra, tornando-se uma ferramenta alternativa para o controle de qualidade de formulação de lipossomas contendo arsênio ou antimônio. A formulação de lipossomas contendo arsênio foi satisfatória para administração in vivo, o que permitiu a avaliação da redução de toxicidade deste semimetal quando encapsulado. O modelo animal utilizado reproduziu as alterações cardíacas observadas em pacientes tratados com compostos de arsênio e antimônio viabilizando o seu uso na avaliação de toxicidade destes metais. O ácido ascórbico demonstrou potencial ação cardioprotetora quando administrado concomitantemente aos metais avaliados neste trabalho ao reduzir as alterações provocadas por estes sobre a PA e ECG, parâmetros bioquímicos e histológicos. A encapsulação do arsênio e antimônio em lipossomas atenuou a cardiotóxicidade induzida pela forma livre. O estudo aqui apresentado, portanto, foi apenas o início de uma investigação com o intuito de viabilizar redução da toxicidade de arsênio e antimônio trivalente para uso. Em continuidade são necessários estudos visando estabilidade da formulação lipossomal de arsênio, avaliação de eficácia da mesma e da associação As e Sb com AA, além de toxicidade em animais acometidos de enfermidades. Priscila Gomes dos Reis 90 Referências Bibliográficas 7. REFERÊNCI AS BI BLI OGRÁFI CAS Priscila Gomes dos Reis 91 Referências Bibliográficas AKAY, C; GAZITT, Y. 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Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 66,60 ± 1,24 122,29 ± 1,83 52,10 ± 2,46 25,54 ± 0,60 372,91 ± 15,43 113,66 ± 4,86 119,11 87,91 ± 4,20 0,5 67,21 ± 1,24 122,11 ± 2,26 52,59 ± 2,35 25,46 ± 0,56 362,96 ± 19,92 ± 3,44 123,25 ± 3,61 81,75 ± 3,75 1,0 67,23 ± 1,24 122,20 ± 1,95 52,53 ± 2,37 25,34 ± 0,53 362,15 ± 16,69 116,13 ± 5,46 85,48 ± 3,45 1,5 67,36 ± 1,11 122,43 ± 1,79 52,61 ± 2,38 25,52 ± 0,58 361,96 ± 15,78 118,45 ± 5,97 80,60 ± 4,41 2,0 67,29 ± 1,21 122,22 ± 1,84 52,72 ± 2,44 25,52 ± 0,68 361,75 ± 15,42 119,14 ± 6,28 85,69 ± 5,15 2,5 67,32 ± 1,04 122,17 ± 1,79 52,72 ± 2,48 25,51 ± 0,68 360,25 ± 17,40 114,45 ± 4,71 90,54 ± 5,68 5,0 67,51 ± 1,38 122,70 ± 2,07 52,96 ± 2,37 25,80 ± 0,68 362,66 ± 17,35 123,38 ± 6,37 89,70 ± 4,73 7,5 67,66 ± 1,27 122,80 ± 2,00 52,77 ± 2,46 25,60 ± 0,67 361,44 ± 19,47 122,45 ± 7,16 64,27 ± 6,74 10,0 68,24 ± 1,34 123,71 ± 2,04 52,66 ± 2,50 25,61 ± 0,62 360,95 ± 20,43 118,30 ± 5,99 74,02 ± 6,64 15,0 67,72 ± 1,44 122,63 ± 2,13 52,83 ± 2,42 25,50 ± 0,64 358,63 ± 17,33 117,61 ± 6,21 83,93 ± 5,54 20,0 68,04 ± 1,46 123,29 ± 2,16 52,72 ± 2,43 25,45 ± 0,72 360,55 ± 20,82 116,95 ± 8,45 74,06 ± 6,00 25,0 67,90 ± 1,39 122,17 ± 2,32 52,75 ± 2,44 25,76 ± 0,69 353,84 ± 22,64 118,61 ± 6,45 74,01± 6,81 30,0 68,10 ± 1,37 122,56 ± 2,42 52,58 ± 2,44 25,61 ± 0,71 354,05 ± 24,37 118,64 ± 6,98 85,13 ± 6,72 35,0 67,78 ± 1,65 121,24 ± 2,69 52,69 ± 2,47 25,67 ± 0,73 347,87 ± 23,66 120,23 ± 6,81 72,25 ± 5,95 40,0 68,07 ± 1,46 121,53 ± 2,47 52,88 ± 2,36 25,59 ± 0,70 346,31 ± 25,79 119,44 ± 6,32 64,51 ± 6,10 45,0 67,67 ± 1,55 119,83 ± 2,97 52,51 ± 2,48 25,72 ± 0,58 343,58 ± 28,06 114,97 ± 6,27 71,24 ± 6,53 50,0 67,94 ± 1,46 120,51 ± 2,59 52,81 ± 2,42 25,55 ± 0,74 338,71 ± 22,15 111,96 ± 6,89 80,23 ± 5,24 55,0 67,92 ± 1,48 120,21 ± 2,66 52,69 ± 2,45 25,74 ± 0,64 339,59 ± 28,87 119,43 ± 5,99 74,33 ± 6,17 60,0 68,06 ± 1,34 120,29 ± 2,84 52,78 ± 2,35 25,66 ± 0,67 336,98 ± 27,33 Priscila Gomes dos Reis 82,17 ± 5,95 111 Anexos Tabela A2: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Lipossoma branco. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 70,62 ±1,83 128,64 ± 3,16 49,89±1,61 18,28±1,64 360,72±10,39 117,82±4,54 85,55±5,64 0,5 72,86 ±1,90 131,81± 3,55 50,03±1,3 18,66±1,53 356,11±9,84 115,44±4,52 86,17±4,83 1,0 72,26 ±1,03 130,17±2,80 50,00±1,38 18,75±1,34 350,66±10,29 118,02±4,06 89,85±5,69 1,5 72,77 ±1,03 130,80±2,94 50,68±1,24 18,59±1,45 350,56±9,92 117,12±3,72 90,45±5,55 2,0 71,69 ±1,02 129,19±2,70 50,85±1,35 18,70±1,55 352,91±9,29 117,81±3,73 90,40±6,35 2,5 72,78 ±1,03 131,55±2,75 51,09±1,42 18,62±1,36 355,63±9,55 113,16±6,94 85,31±8,08 5,0 72,61 ±1,58 130,61±3,01 52,22±1,73 18,58±1,45 353,78±11,28 113,59±4,53 82,42±3,05 7,5 70,54 ±2,13 127,30±3,89 51,23±1,47 18,58±1,47 357,20±10,65 114,29±5,52 80,58±4,68 10,0 71,88 ±1,36 130,26±2,63 51,08±1,55 17,94±1,34 360,28±8,77 108,52±5,71 76,64±4,56 15,0 74,40 ±1,87 134,08±3,14 50,62±1,49 17,99±1,35 352,98±13,42 111,06±4,80 77,80±3,96 20,0 74,86 ±1,68 137,52±2,60 50,17±1,19 18,03±1,16 352,48±7,84 108,11±5,09 75,21±3,91 25,0 74,90 ±1,68 133,25±2,65 50,17±1,00 18,13±1,42 340,79±23,49 108,43±4,72 76,21±8,00 30,0 74,43 ±1,69 133,88±3,19 50,31±1,21 18,04±1,33 352,51±17,29 106,38±5,39 76,10±7,48 35,0 73,79 ±1,56 137,94±3,00 50,28±0,87 17,98±1,28 378,96±28,29 115,60±4,88 77,22±4,25 40,0 73,31 ±1,45 132,28±4,03 50,82±0,77 18,11±1,25 361,66±15,53 111,18±6,91 73,86±6,30 45,0 74,03 ±1,34 128,99±3,07 50,11±1,13 18,25±1,28 342,49±25,97 118,75±5,25 81,19±6,81 50,0 72,02 ±1,16 131,97±3,66 50,94±0,83 18,08±1,33 370,21±16,59 109,70±5,96 79,15±6,09 55,0 72,28 ±1,56 128,29±2,80 51,43±1,16 18,27±1,27 352,56±22,57 119,23±4,77 82,35±7,15 60,0 73,37 ±1,47 134,53±3,48 50,92±1,84 18,05±1,44 372,05±15,95 Priscila Gomes dos Reis 117,76±3,89 81,69±5,75 112 Anexos Tabela A 3: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de AA . Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 60,5 ± 1,69 108,4 ± 3,38 49,8 ± 1,20 19,7 ± 0,30 380,3 ± 20,56 122,7 ± 2,94 87,9 ± 4,20 0,5 60,3 ± 1,69 107,9 ± 2,63 49,8 ± 1,07 19,8 ± 0,33 365,5 ± 19,92 128,9 ± 9,96 97,3 ± 2,35 1,0 60,1 ± 1,77 107,7 ± 3,18 50,8 ± 0,85 19,6 ± 0,23 366,7 ± 19,40 135,9 ± 10,51 99,4 ± 5,47 1,5 58,9 ± 1,39 106,0 ± 2,90 50,8 ± 0,91 19,8 ± 0,26 367,2 ± 17,66 138,8 ± 9,49 99,2 ± 7,89 2,0 60,4 ± 1,65 108,5 ± 2,43 51,5 ± 0,93 19,8 ± 0,11 366,1 ± 16,88 138,4 ± 13,37 98,3 ± 6,24 2,5 59,9 ± 1,42 107,1 ± 2,07 51,2 ± 1,18 19,6 ± 0,33 375,3 ± 16,35 137,2 ± 8,17 91,1 ± 6,89 5,0 61,0 ± 1,22 106,1 ± 3,20 54,1 ± 2,24 20,0 ± 0,19 359,4 ± 25,33 127,1 ± 2,91 91,5 ± 1,93 7,5 60,0 ± 1,54 107,6 ± 2,84 51,6 ± 1,46 19,9 ± 0,36 371,0 ± 16,78 127,7 ± 2,98 90,3 ± 16,96 10,0 60,6 ± 1,77 109,9 ± 3,36 50,9 ± 1,20 19,8 ± 0,31 382,0 ± 14,61 126,1 ± 5,95 89,3 ± 5,77 15,0 60,7 ± 1,31 110,1 ± 2,65 51,6 ± 1,80 19,9 ± 0,27 379,4 ± 19,29 124,6 ± 5,71 87,6 ± 6,22 20,0 60,4 ± 1,87 110,1 ± 4,12 50,2 ± 2,08 19,8 ± 0,22 389,6 ± 16,69 122,2 ± 2,62 84,5 ± 2,73 25,0 59,4 ± 2,06 107,1 ± 4,76 52,6 ± 2,83 20,2 ± 0,29 376,9 ± 19,20 118,1 ± 2,69 79,6± 2,56 30,0 61,3 ± 1,76 109,4 ± 3,48 51,5 ± 1,82 19,9 ± 0,37 374,5 ± 18,67 111,2 ± 4,20 78,4 ± 3,94 35,0 62,4 ± 1,22 113,3 ± 2,28 51,5 ± 1,61 19,9 ± 0,39 375,4 ± 13,24 109,5 ± 4,45 82,6 ± 9,73 40,0 61,7 ± 1,65 111,7 ± 2,72 52,4 ± 2,34 20,0 ± 0,31 384,3 ± 14,78 115,4 ± 10,36 82,6 ± 9,73 45,0 61,1 ± 1,82 105,4 ± 0,15 51,4 ± 1,98 20,1 ± 0,36 351,5 ± 5,66 115,3 ± 10,36 85,6 ± 13,10 50,0 61,7 ± 1,72 110,4 ± 2,30 52,0 ± 2,09 20,3 ± 0,35 369,8 ± 13,86 119,5 ± 12,69 87,4 ± 12,92 55,0 62,1 ± 1,12 110,3 ± 0,15 52,5 ± 2,34 20,1 ± 0,23 390,4 ± 8,62 122,1 ± 14,37 84,4 ±15,58 60,0 62,4 ± 1,26 110,7 ± 2 ,33 53,2 ± 2,63 20,1 ± 0,39 363,8 ± 14,70 117,8 ± 2,23 85,0 ±13,73 Priscila Gomes dos Reis 113 Anexos T abela A4: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de As. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 62,9 ± 1,55 110,3 ± 3,43 52,1 ± 3,10 23,0 ± 0,48 339,9 ± 16,62 130,6 ± 4,47 87,1 ± 6,58 0,5 63,0 ± 1,85 110,4 ± 2,82 52,4 ± 3,25 23,1 ± 0,52 328,1 ± 17,07 120,2 ± 8,63 75,5 ± 9,66 1,0 63,7 ± 1,75 111,8 ± 3,18 53,3 ± 3,21 23,3 ± 0,46 326,4 ± 17,19 110,8 ± 9,47 67,2 ± 9,63 1,5 62,4 ± 1,78 108,3 ± 2,94 53,4 ± 3,43 22,8 ± 0,58 321,0 ± 16,87 104,2 ± 10,43 62,5 ± 10,02 2,0 62,4 ± 2,14 108,5 ± 3,45 54,1 ± 3,52 22,8 ± 0,52 317,2 ± 17,13 97,8 ± 9,95 59,2 ± 9,29 2,5 62,5 ± 1,35 107,7 ± 2,71 54,5 ± 3,37 22,9 ± 0,81 314,5 ± 17,73 93,9 ± 9,29 58,0 ± 9,11 5,0 63,2 ± 1,40 108,0 ± 3,53 55,7 ± 3,30 23,1 ± 0,71 300,8 ± 20,96 87,8 ± 8,62 53,8 ± 8,49 7,5 61,9 ± 1,69 103,9 ± 4,18 57,4 ± 4,25 22,7 ± 0,81 285,9 ± 25,31 82,3± 11,08 51,8 ± 9,79 10,0 62,8 ± 1,92 104,5 ± 4,26 57,7 ± 4,22 23,0 ± 1,15 278,0 ± 24,83 79,4 ± 11,30 50,6 ± 9,50 15,0 63,1 ± 2,20 103,4 ± 3,98 57,6 ± 4,20 23,1 ± 1,00 267,5 ± 22,90 87,3 ± 11,24 55,0 ± 9,38 20,0 64,0 ± 2,23 105,1 ± 4,08 58,1 ± 4,64 23,4 ± 8,75 265,4 ± 23,79 97,6 ± 9,87 62,9 ± 8,41 25,0 63,6 ± 2,36 102,7 ± 4,43 62,1 ± 5,89 23,3 ± 1,45 255,1 ± 25,90 101,6 ± 11,02 66,6 ± 9,78 30,0 62,6 ± 2,39 101,2 ± 5,27 62,1 ± 5,72 22,9 ± 2,12 252,4 ± 30,50 100,1 ± 10,35 65,6 ± 11,65 35,0 63,0 ± 2,36 101,5 ± 5,57 62,4 ± 5,92 23,0 ± 1,92 255,3 ± 29,21 103,2 ± 10,02 69,6 ± 9,26 40,0 63,2 ± 2,48 102,0 ± 5,56 61,9 ± 5,90 23,1 ± 1,50 255,4 ± 28,38 104,1 ± 8,95 69,4 ± 9,21 45,0 62,8 ± 2,31 100,3 ± 4,00 61,1 ± 5,44 23,0 ± 1,29 249,1 ± 25,82 99,6± 10,11 66,9 ± 22,71 50,0 63,2 ± 1,69 102,4 ± 4,53 61,5 ± 7,26 23,1 ± 1,58 254,3 ± 30,48 101,1 ± 11,01 67,4 ± 9,37 55,0 63,6 ± 1,74 102,4 ± 4,06 63,1 ± 7,28 23,3 ± 1,64 256,0 ± 21,71 99,2 ± 8,72 67,9 ± 9,37 60,0 63,7 ± 1,99 102,8 ± 4,30 62,6 ± 6,80 23,3 ± 1,97 256,0 ± 27,94 101,1 ± 11,13 69,2 ± 9,33 Priscila Gomes dos Reis 114 Anexos Tabela A5: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Lipossoma arsênio. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 71,8±2,24 130,0±3,34 53,5±2,70 19,7±0,53 300,9±24,90 97,3±11,06 86,0±10,01 0,5 72,4±2,41 131,1±3,17 53,9±2,87 19,6±0,65 300,9±23,86 97,3±8,26 91,5±7,11 1,0 70,5±2,20 127,9±2,25 54,5±3,02 19,5±0,64 302,3±24,04 97,7±10,93 87,1±9,58 1,5 71,8±2,01 129,9±3,14 53,4±3,21 20,0±0,56 302,2±22,24 97,7±6,60 85,2±7,26 2,0 71,9±2,35 130,8±2,52 54,8±3,28 19,6±0,64 305,2±21,78 98,7±8,70 83,7±7,12 2,5 72,6±2,16 131,9±2,60 54,5±3,10 19,6±0,65 305,7±18,93 98,8±12,55 87,2±11,17 5,0 72,7±1,82 132,5±2,09 54,7±3,36 19,7±0,62 309,1±14,71 99,9±11,04 87,5±11,92 7,5 72,9±2,89 133,8±4,61 55,3±3,08 19,7±0,54 314,1±16,81 101,9±10,17 88,9±11,21 10,0 71,3±2,94 130,9±6,01 55,6±2,87 19,6±0,47 311,6±16,05 101,0±8,57 87,6±9,48 15,0 71,5±3,48 131,0±4,55 56,2±2,89 19,9±0,48 314,5±14,24 101,7±5,06 88,0±5,37 20,0 70,2±2,81 129,0±4,34 56,0±2,86 19,9±0,51 315,2±15,02 102,1±8,27 91,0±9,74 25,0 71,0±3,15 129,6±4,95 57,0±2,97 19,9±0,55 307,3±13,48 99,2±3,57 89,0±6,12 30,0 71,0±3,29 129,0±5,60 57,6±2,34 20,2±0,49 306,0±14,54 98,3±10,91 90,6±10,69 35,0 71,1±3,68 128,3±4,08 58,2±2,73 20,1±0,42 300,7±14,24 97,1±2,54 85,2±6,51 40,0 72,1±2,82 129,8±4,05 59,0±2,77 20,2±0,49 298,9±13,54 96,0±9,67 84,6±9,67 45,0 73,3±2,91 131,1±3,85 59,6±2,77 20,1±0,47 291,8±12,86 94,3±2,28 82,8±9,67 50,0 70,5±2,68 125,9±3,65 59,9±2,90 20,1±0,58 288,1±12,30 93,1±8,97 80,2±8,18 55,0 72,2±2,95 127,5±3,85 60,1±2,63 20,0±0,60 283,2±12,37 91,6±2,11 84,4±2,30 60,0 72,4±2,65 128,4±3,32 60,4±2,77 19,8±0,45 283,3±12,67 91,6±7,38 81,8±7,11 Priscila Gomes dos Reis 115 Anexos Tabela A 6: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de As+AA. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 66,4 ± 1,56 116,0 ± 1,60 48,2 ± 1,92 22,5 ± 0,72 310,5 ± 13,72 125,3 ± 4,77 86,5 ± 4,09 0,5 64,5 ± 1,62 109,6 ± 2,79 51,2 ± 2,42 22,9 ± 0,84 307,0 ± 11,33 130,8 ± 5,46 90,1 ± 3,74 1,0 64,8 ± 1,41 111,0 ± 1,18 51,2 ± 2,50 23,2 ± 0,65 317,5 ± 15,12 120,2 ± 7,05 84,8 ± 4,68 1,5 66,4 ± 1,65 113,4 ± 1,98 51,2 ± 2,66 23,1 ± 0,76 304,8 ± 14,54 117,8 ± 12,80 78,4 ± 9,41 2,0 66,6 ± 1,80 113,1 ± 1,99 51,3 ± 2,55 22,7 ± 0,71 310,4± 17,33 111,5 ± 12,93 79,3 ± 9,61 2,5 65,4 ± 1,50 111,8 ± 1,93 51,5 ± 2,87 23,2 ± 0,75 315,0 ± 15,22 121,0 ± 7,04 81,8 ± 6,84 5,0 65,7 ± 1,70 111,1 ± 3,40 51,5 ± 2,43 22,2 ± 0,48 301,5 ± 19,29 114,7 ± 10,58 82,9 ± 9,49 7,5 67,0 ± 1,67 112,9 ± 2,03 52,7 ± 2,55 22,7 ± 1,11 290,6 ± 16,75 110,3 ± 12,97 78,7± 11,14 10,0 63,9 ± 1,52 106,7 ± 2,63 53,3 ± 2,81 22,6 ± 0,96 283,9 ± 13,42 104,8 ± 12,13 75,4 ± 10,50 15,0 64,5 ± 1,47 105,9 ± 2,98 53,6 ± 3,19 23,5 ± 0,60 282,3 ± 14,34 108,1 ± 9,50 79,1 ± 9,19 20,0 64,0 ± 1,44 106,7 ± 2,26 54,2 ± 2,72 15,0 ± 8,22 280,6 ± 14,56 110,4 ± 9,37 79,4 ± 9,35 25,0 64,3 ± 1,32 103,6 ± 2,93 54,8 ± 2,71 23,4 ± 0,57 270,4 ± 19,74 103,1 ± 7,63 75,2 ± 7,47 30,0 65,3 ± 1,42 108,3 ± 2,05 54,7 ± 2,57 24,0 ± 0,91 278,1 ± 14,98 110,9 ± 6,64 82,5 ± 7,48 35,0 64,4 ± 1,23 108,3 ± 1,40 54,5 ± 2,64 23,7 ± 1,07 283,0 ± 11,67 109,9 ± 7,44 81,2 ± 8,45 40,0 65,0 ± 1,07 107,8 ± 2,54 54,6 ± 2,59 23,8 ± 1,12 276,6 ± 18,00 108,1 ± 7,73 76,1 ± 7,45 45,0 65,5 ± 1,33 110,9 ± 2,44 54,0 ± 2,73 23,9 ± 0,99 293,3 ± 10,41 109,5 ± 8,68 75,0 ± 9,95 50,0 64,5 ± 1,62 108,4 ± 2,05 54,9 ± 2,88 23,8 ± 0,98 290,4 ± 11,14 110,9 ± 6,75 80,6 ± 7,95 55,0 64,7 ± 1,27 111,1 ± 1,32 55,1 ± 2,95 23,7 ± 0,93 299,3 ± 10,46 112,0 ± 6,27 78,6 ± 7,04 60,0 64,3 ± 0,98 108,5 ± 2,10 56,1 ± 3,13 23,6 ± 0,87 292,8 ± 11,81 113,5 ± 6,13 82,7 ± 7,83 Priscila Gomes dos Reis 116 Anexos Tabela A 7: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos de As do protocolo subagudo. Os valores representam a média ± e.p.m. (n=6). Grupos Tratamento QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) Controle Antes 51,8 ± 1,50 95,8 ± 3,07 48,0 ± 1,73 14,4 ± 0,61 438,3 ± 5,30 Depois 51,0 ± 0,92 97,7 ± 2,15 54,6 ± 1,30 13,9 ± 0,51 385,8 ± 7,00 Antes 57,9 ± 0,23 114,4 ± 1,03 43,7 ± 0,19 18,8 ± 0,20 462,2 ± 9,64 Depois 61,4 ± 0,68 113,0 ± 1,35 49,5 ± 0,67 20,3 ± 0,15 376,1 ± 15,79 Antes 64,2 ± 1,14 119,0 ± 1,58 45,4± 1,36 22,4 ± 0,70 386,6 ± 18,77 Depois 92,7 ± 2,11 175,6 ± 2,29 47,9 ± 1,58 22,6 ± 0,50 316,7 ± 20,41 Antes 57,8 ± 1,23 113,9 ± 2,48 42,5 ± 0,80 16,8 ± 0,43 465,0 ± 6,75 Depois 71,7 ± 1,85 136,6 ± 19,62 48,9 ± 1,06 18,4 ± 0,13 369,6 ± 17,15 AA As As+AA Priscila Gomes dos Reis 117 Anexos Tabela A 8: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração de IV de Sb. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 63,8 ± 2,40 111,3 ± 1,44 57,0 ± 1,50 20,2 ± 0,88 351,2 ± 20,72 123,5 ± 3,98 93,5 ± 6,21 0,5 71,3 ± 3,89 124,9 ± 3,33 57,7 ± 1,50 21,4 ± 1,08 335,3 ± 17,23 102,6 ± 6,51 78,7 ± 5,84 1,0 75,5 ± 3,88 128,3 ± 3,91 58,0 ± 1,34 20,7 ± 1,10 335,0 ±16,64 86,4 ± 8,15 62,5 ± 7,34 1,5 75,5 ± 1,47 131,7 ± 2,36 59,7 ±1,02 21,6 ± 1,07 318,3 ± 15,70 74,0 ± 10,82 52,9 ± 9,52 2,0 75,5 ± 1,93 132,9 ± 2,36 60,2 ± 1,02 22,1 ± 1,24 319,4 ± 15,46 70,7 ± 10,41 47,8 ± 10,33 2,5 75,4 ± 0,80 132,0 ± 2,36 59,2 ± 0,99 21,5 ± 1,23 322,4 ±16,11 72,6 ± 9,20 48,9 ± 9,50 5,0 74,3 ± 0,68 127,9 ± 1,99 58,0 ± 1,32 20,6 ± 0,84 322,9 ± 14,85 80,7 ± 2,73 57,8 ± 2,82 7,5 76,6 ± 2,91 130,7 ± 2,36 58,4 ± 1,46 22,1 ± 1,16 319,5 ± 14,86 75,3 ± 2,14 57,3 ± 5,79 10,0 74,0 ± 1,98 124,5 ± 4,96 58,2 ± 1,72 24,0 ± 2,20 318,8 ± 15,62 82,2 ± 5,64 58,2 ± 4,32 15,0 74,5 ± 1,78 127,1 ± 3,91 64,1 ± 4,63 23,1 ± 1,67 294,8 ± 24,45 87,9 ± 5,12 70,7 ± 4,34 20,0 74,9 ± 3,03 126,0 ± 3,65 59,6 ± 1,94 18,7 ± 1,34 313,1 ± 12,97 91,5 ± 7,09 72,8 ± 4,89 25,0 76,1 ± 1,33 127,5 ± 3,91 65,7 ± 4,69 23,0 ± 1,18 288,5 ± 23,07 97,2 ± 5,89 75,1 ± 6,85 30,0 73,3 ± 1,73 121,8 ± 4,01 64,8 ± 5,25 22,8 ± 1,19 313,1 ± 12,25 101,8 ± 6,08 78,1 ± 4,90 35,0 76,6 ± 1,01 127,9 ± 4,08 61,0 ± 2,47 22,0 ± 0,88 313,3 ± 13,08 104,3 ± 5,42 83,3 ± 4,26 40,0 75,0 ± 3,52 129,0 ± 3,42 61,6 ± 2,73 21,7 ± 0,88 311,9 ± 13,54 106,0 ± 3,99 87,4 ± 3,69 45,0 77,8 ± 1,69 132,0 ± 2,89 62,0 ± 2,54 22,2 ± 1,04 302,4 ± 16,36 108,5 ± 4,85 84,6 ± 4,10 50,0 75,4 ± 2,54 130,3 ± 6,45 61,7 ± 2,60 21,9 ± 1,06 309,3 ± 15,24 109,7 ± 1,13 94,8 ± 1,62 55,0 75,6 ± 1,60 126,6 ± 2,36 61,8 ± 2,73 22,2 ± 1,09 306,3 ± 15,87 112,3 ± 1,39 93,5 ± 0,43 60,0 74,3 ± 0,52 123,6 ± 5,32 62,4 ± 3,00 22,2 ± 0,87 308,8 ± 16,18 115,2 ± 0,89 93,2 ± 0,52 Priscila Gomes dos Reis 118 Anexos Tabela A 9: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Lipossoma Sb. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) 0,0 64,1±1,19 0,5 PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 121,3±2,19 48,5±0,92 25,1±0,70 406,9±6,30 131,3±6,51 97,6±3,55 64,7±0,83 122,0±1,57 48,9±0,84 26,0±0,66 401,8±6,76 137,3±11,1 107,0±6,47 1,5 63,8±0,90 120,5±1,61 49,3±0,80 25,5±0,68 405,3±6,68 139,6±8,35 105,8±5,33 2,5 64,1±1,31 121,2±2,08 50,7±0,94 25,1±0,52 406,5±6,93 134,9±9,64 106,7±4,84 5,0 63,5±1,37 120,2±2,23 50,4±0,75 25,3±0,59 407,4±7,04 133,1±8,18 99,7±5,71 7,5 63,3±1,26 119,6±2,12 49,7±0,78 25,7±0,67 405,4±6,89 125,8±8,12 93,8±5,36 10,0 64,5±1,18 121,9±2,03 50,0±0,81 25,4±0,59 405,3±7,59 125,9±7,22 92,6±4,10 15,0 63,6±0,96 120,4±1,71 49,5±0,75 25,6±0,81 407,9±7,18 120,8±8,75 88,8±6,47 20,0 63,7±1,26 120,6±2,03 49,6±0,50 24,9±0,59 407,7±7,48 124,5±7,80 90,6±5,71 30,0 63,9±0,81 121,2±1,27 49,0±0,62 25,5±0,60 409,0±7,02 124,4±9,34 91,1±8,19 40,0 63,5±1,31 120,0±2,37 50,5±0,60 25,2±0,63 405,1±6,09 122,3±10,2 89,728,66 50,0 66,2±1,52 124,3±2,66 49,8±0,60 25,8±0,66 397,2±7,55 113,5±12,1 82,8±10,7 60,0 64,9±1,97 120,1±2,66 50,9±0,85 25,2±0,44 382,8±15,07 118,6±13,0 85,7±11,1 Priscila Gomes dos Reis Qtc (ms) 119 Anexos Tabela A 10: Valores absolutos dos parâmetros do ECG e PA após administração IV de Sb+AA. Média ± e.p.m. (n=6). Tempo (min) QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) PAS (mmHg) PAD (mmHg) 0,0 70,6 ± 2,14 116,4 ± 1,93 60,9 ± 2,16 24,8 ± 3,59 266,2 ± 13,32 96,7 ± 5,85 68,6 ± 5,10 0,5 74,9 ± 2,85 120,1 ± 4,12 64,2 ± 1,97 22,0 ± 0,28 250,2 ± 4,03 94,9 ± 4,84 72,4 ± 3,52 1,0 74,9 ± 2,84 120,8 ± 3,86 63,6 ± 1,97 21,9 ± 0,50 254,1 ± 6,14 85,5 ± 3,77 71,2 ± 4,66 1,5 75,3 ± 2,72 121,9 ± 3,79 64,2 ± 1,72 22,3 ± 0,50 255,8 ± 4,78 88,97 ± 7,66 69,7 ± 4,54 2,0 75,2 ± 3,41 121,7 ± 4,92 64,4 ± 1,60 21,8 ± 0,28 256,4 ± 5,45 84,3 ± 8,56 67,9 ± 4,70 2,5 76,9 ± 3,20 124,9 ± 4,47 63,3 ± 1,58 21,8 ± 0,25 257,1 ± 5,07 90,3 ± 7,09 69,7 ± 4,95 5,0 79,9 ± 2,51 125,6 ± 5,11 62,6 ± 1,85 22,0 ± 0,52 238,9 ± 15,66 87,3 ± 5,79 71,2 ± 5,47 7,5 78,9 ± 1,46 128,1 ± 2,65 62,4 ± 1,97 21,7 ± 0,23 258,6 ± 7,26 85,7 ± 5,13 67,3 ± 5,66 10,0 77,0 ± 1,54 125,2 ± 2,95 61,8 ± 1,49 21,8 ± 0,22 260,9 ± 8,11 86,2 ± 5,58 64,2 ± 5,91 15,0 76,5 ± 0,89 125,5 ± 2,48 63,9 ± 2,03 22,4 ± 0,57 259,8 ± 8,36 81,7 ± 3,38 65,3 ± 2,57 20,0 76,5 ± 0,99 124,4 ± 2,13 64,3 ± 1,62 11,8 ± 8,98 261,1 ± 8,96 78,2 ± 1,47 61,3 ± 2,96 25,0 76,9 ± 1,27 124,9 ± 1,72 64,5 ± 1,50 21,9 ± 0,34 256,5 ± 11,37 81,1 ± 7,56 60,1 ± 4,49 30,0 75,7 ± 0,35 121,5 ± 1,52 64,1 ± 1,61 22,0 ± 0,54 257,8 ± 10,70 79,1 ± 9,43 57,4 ± 6,76 35,0 77,2 ± 1,23 123,4 ± 0,66 65,7 ± 2,37 22,4 ± 0,67 251,1 ± 12,62 88,2 ± 6,55 61,7 ± 4,98 40,0 78,0 ± 1,32 125,3 ± 1,66 65,6 ± 2,48 22,3 ± 0,50 252,8 ± 11,58 84,5 ± 7,72 66,4 ± 2,84 45,0 77,6 ± 0,78 126,1 ± 2,55 67,0 ± 2,69 22,6 ± 0,45 255,2 ± 14,27 87,2 ± 11,03 61,3 ± 7,24 50,0 77,5 ± 0,56 124,6 ± 2,16 67,2 ± 2,63 22,5 ± 0,40 252,8 ± 11,54 86,2 ± 7,15 62,3 ± 4,89 55,0 77,8 ± 0,94 124,1 ± 1,17 66,4 ± 3,02 22,8 ± 0,65 245,3 ± 16,80 90,2 ± 9,37 64,4 ± 6,17 60,0 75,5 ± 1,64 121,3 ± 3,40 66,0 ± 3,07 22,5 ± 0,75 249,6 ± 12,63 90,5 ± 5,71 69,7 ± 3,10 Priscila Gomes dos Reis 120 Anexos Tabela A 11: Valores absolutos dos parâmetros do ECG obtidos nos diferentes grupos Sb do protocolo subagudo. Média ± e.p.m. (n=6). Grupos Tratamento QT (ms) Qtc (ms) PR (ms) QRS (ms) FC (bpm-1) Controle Antes 51,8 ± 1,50 95,8 ± 3,07 48,0 ± 1,73 14,4 ± 0,61 438,3 ± 5,30 Depois 50,9 ± 0,92 97,7 ± 2,15 46,3 ± 1,30 13,9 ± 0,51 385,8 ± 7,00 Antes 57,9 ± 0,23 114,4 ± 1,03 43,7 ± 0,19 18,8 ± 0,20 462,2 ± 9,64 Depois 61,8 ± 0,68 113,0 ± 1,35 49,7 ± 0,67 20,3 ± 0,15 376,1 ± 15,79 Antes 58,3 ± 0,58 115,6 ± 1,35 42,2 ± 0,55 19,7 ± 0,27 453,3 ± 9,93 Depois 77,9 ± 2,70 140,57 ± 4,95 47,5 ± 3,30 20,8 ± 0,89 355,9 ± 16,01 Antes 58,5 ± 1,18 113,3 ± 2,09 42,2 ± 0,38 19,8 ± 0,85 436,5 ± 9,82 Depois 74,0 ± 0,98 135,4 ± 1,92 47,1 ± 1,25 21,7 ± 0,86 360,9 ± 11,63 AA Sb Sb + AA Priscila Gomes dos Reis 121 Resumos apresentados em congresso Reis, P.G., Guimarães, H.N., Teixeira, M.C., Grabe-Guimarães, A., Silva-Barcellos, N.M.. EVALUATI ON OF CARDI OVASCULAR CHANGES I NDUCED BY CHRONI C TREATM ENT WI TH TRI VALENT ARSENI C I N RATS I N VI VO . In: VII International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2009, Ribeirão Preto. Reis, P.G., Almeida, W.M., Guimarães, H.N., Leite, R., Teixeira, M.C., Grabe-Guimarães, A, Silva-Barcellos, N.M..EVALUATI ON OF CARDI OVASCULAR CHANGES I NDUCED BY CHRONI C TREATM ENT WI TH TRI VALENTS ARSENI C AND ANTI M ONY I N RATS I N VI VO. In: 41 Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 2009, Ribeirão Preto. Reis, P.G., Guimarães, H.N., Teixeira, M.C., Grabe-Guimarães, A., Silva-Barcellos, N.M.. ALTERAÇÕES CARDI OVASCULARES I NDUZI DAS PELO TRI ÓXI DO DE ARSÊNI O EM RATOS I N VI VO. In: 40 Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, 2008, Ribeirão Preto. Priscila Gomes dos Reis 122