Volume 6 - Número 1

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Volume 6 - Número 1

Volume 6 - Número 1 - Ano 2010
ISSN 1808-9909
Volume 6, Número 1, 2010
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 6, n. 1, p. 1-55, 2010
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”, editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
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Virginia Silva Carvalho – UENF
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ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
ESTIOLAMENTO E REGENERAÇÃO In vitro DE Ananas comosus var. erectifolius: UMA PLANTA
VALIOSA DA AMAZÔNIA
Etiolation and In vitro regeneration of Ananas comosus var. erectifolius: a valuable Amazon Plant
Flávia Dionísio Pereira, José Eduardo Brasil Pereira Pinto, Helen Cristina de Arruda Rodrigues, Luciana
1-9
Domiciano Silva Rosado, Suzan Kelly Vilela Bertolucci, Osmar Alves Lameira ........................................................
MEIO DE CULTURA, CONCENTRAÇÃO DE BAP E FOTOPERÍODO NA MICROPROPAGAÇÃO DE
ANTÚRIO ‘EIDIBEL’ POR SEGMENTOS CAULINARES
Culture medium, bap concentration and photoperiod on micropropagation of anthurium ‘Eidbel’ stem
segments
Marcos Vinícius Marques Pinheiro, Gabrielen de Maria Gomes Dias, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho,
10 - 17
Levi de Moura Barros ....................................................................................................................................................
INDUÇÃO DE CALOS In vitro A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE Coffea canephora CV.
CONILON
In vitro induction of callus from leaf segments of Coffea canephora CV. Conilon
Maurício Reginaldo Alves dos Santos, Maria das Graças Rodrigues Ferreira, Arêssa de Oliveira Correia, Neidiane
18 - 25
Farias Costa Reis, Manuel de Souza Santos ..................................................................................................................
INDUÇÃO DE CALOS EM NERVURA MEDIANA DE FOLHAS NÃO EXPANDIDAS DE PUPUNHEIRA
(Bactris gasipaes Kunth.)
Callus induction in mid-rib of non expanded leaves of palm peach (Bactris gasipaes Kunth.)
Maurício Reginaldo Alves dos Santos, Maria das Graças Rodrigues Ferreira, Arêssa de Oliveira Correia, Josilene
26 - 32
Félix da Rocha, Keila Cristina de Souza Correa ...........................................................................................................
REDUÇÃO DA NECROSE APICAL E HIPERIDRICIDADE DE PLANTAS DE Lavandula angustifolia
Mill. CULTIVADAS in vitro
Reduction of apical necrosis and hyperhydricity in in vitro cultured lavandula angustifolia mill. Plantlets
33 - 39
Marília Pereira Machado, Luiz Antonio Biasi, Vanessa Reinhart, Gabriel Distéfano Santos.......................................
INFLUÊNCIA DE ANA E BAP E DA MODALIDADE DE CULTIVO in vitro DE TAIOBAS (Xanthosoma
sagittifolium (L.) SCHOTT)
Influence of naa and bap and methods for in vitro growth of tannia (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott)
40 - 48
Cristina Soares de Souza, Fernando Luiz Finger, Adilson Ricken Schuelter ...............................................................
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-55, 2010
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
STAINABILITY AND FLUOROCHROMATIC REACTION IN FRESH MICROSPORES AND POLLEN
ISOLATED FROM Phaseolus vulgaris L.
Coloração e reação fluorocromática em micrósporos e pólen frescos isolados de Phaseolus vulgaris L.
49 - 55
Lia Rosane Rodrigues, Jorge Ernesto de Araujo Mariath .............................................................................................
ESTIOLAMENTO
REGENERAÇÃO
vitro
Ananas
comosus
EstiolamentoEe regeneração
in vitro de Ananasin
comosus
var. DE
erectifolius
...
var. erectifolius: UMA PLANTA VALIOSA DA AMAZÔNIA
1
ETIOLATION AND in vitro REGENERATION OF Ananas comosus var.
erectifolius: A VALUABLE AMAZON PLANT
FLÁVIA DIONÍSIO PEREIRA1 JOSÉ EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2 HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3
LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO4 SUZAN KELLY VILELA BERTOLUCCI5 OSMAR ALVES LAMEIRA6
1
Eng. Agrônoma, Dra., Pós-doutoranda - Universidade Federal de Lavras/UFLA – Dep.de Agricultura - Laboratório de Cultura de
Tecidos e Plantas Medicinais, campus Universitário s/n - Cx. P. 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
2
Doutor, Professor Titular, - Universidade Federal de Lavras/UFLA – Dep.de Agricultura - Laboratório de Cultura de Tecidos e
Plantas Medicinais, campus universitário s/n - Cx. P. 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
3
Doutoranda em Produção Vegetal - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho/UNESP – Dep. de Tecnologia -. Via de
Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, campus universitário -14870-000 - Jaboticabal, SP.
4
Doutoranda em Genética e Melhoramento - Universidade Federal de Viçosa – Dep.de Fitotecnia -. Av. P.H. Rolfs, s/n - 36570-000 Viçosa, MG - [email protected]
5
Professora - Universidade Federal de Lavras - Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais - campus universitário s/n –
Cx. P. 3037 - 37200-000 - Lavras, MG - [email protected]
6
Pesquisador, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia Oriental, Embrapa
Amazônia Oriental. Av. Enéas Pinheiro, s/n, Laboratório de Biotecnologia, Marco - Cx. P.: 48 - 66095100 - Belém, PA - Embrapa,
Amazônia Oriental - [email protected]
RESUMO
Ananas comosus (L.) Merr. var. erectifolius (L.B.Sm.)
Coppens & F. Leal, popularmente conhecida como curauá, é
uma planta nativa da Amazônia. Suas folhas produzem fibras
lignocelulósicas com grande potencial na indústria
automobilística devido a sua resistência, maciez e peso
reduzido. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito
do tamanho da plântula inicial na regeneração de brotos
estiolados, do número de brotos estiolados por frasco na
regeneração de plântulas, a influência da consistência do meio
de cultivo, com ou sem agitação na regeneração de brotos
estiolados, e a obtenção de plântulas de curauá provenientes
dos brotos estiolados. Foram utilizadas plântulas com
tamanhos de 1,0 a 2,5; 3,0 a 4,5 e 5,0 a 6,5 cm. O meio foi o
MS semissólido com 10 mM ANA. Os explantes foram
cultivados em meio MS líquido em frascos sob agitação de 85
rpm utilizando 4, 6 e 8 brotos estiolados. Os segmentos nodais
dos brotos estiolados foram inoculados no meio MS líquido
sem agitação; sob agitação contínua a 85 rpm e no meio
solidificado com ágar a 0,6%. Para o tamanho da plântula, não
houve diferença significativa para número e comprimento
médio dos brotos. Para o número de explante por frasco houve
diferença significativa para o número médio de brotações. Para
os fatores físicos houve diferença significativa entre os sistemas
de cultivo. A micropropagação através de brotos estiolados é
eficiente na produção de mudas de Ananas comosus var.
erectifolius. O tamanho do explante inicial não influência na
indução do número de brotos estiolados. O número de 6 a 8
brotos estiolados inoculados por frasco induz maior número
de plântulas por frasco (13 a 15 plântulas/frasco). O meio
líquido sem agitação induz maior proliferação de brotos. O
sistema radicular é obtido no meio MS sem a presença de
regulador de crescimento.
Termos para indexação: Fibras vegetais, micropropagação,
planta medicinal.
ABSTRACT
Ananas comosus (L.) Merr. var. erectifolius (L.B.Sm.)
Coppens & F. Leal species is native from the Amazon region and
known as “curauá”. Its leaves produce lignocellulose fibers with
great automobile industry potential due to its resistance, softness
and reduced weight. The purpose of this work was to evaluate the
initial plantlet size in etiolated shoot regeneration, the number of
etiolated shoots per flask in plantlet regeneration, the effect of
culture medium consistency with and without shaking in etiolated
shoots regeneration and the production of plantlets from etiolate
shoots. Plantlets size varied from 1.0 to 2.5; 3.0 to 4.5 and 5.0 to
6.5 cm. MS semisolid medium was supplemented with 10 mM
NAA. The explants were cultured in MS medium in flask under 85
rpm shaking using 4, 6 and 8 etiolated shoots. Etiolated shoot from
nodal segments were inoculated in liquid MS medium without
shaking, under 85 rpm continuous shaking and on 0.6% agar solid
medium. For plantlet size, there was no significative difference for
number and shoot average length. For explant number per flask
there was significative difference for shoot average number. For
physical factors there was significative difference among culture
systems. Micropropagation from etiolate shoots is efficient for
the production of Ananas comosus var. erectifolius. The initial
explant size has no influence on the induction of etiolated shoots.
Six to 8 etiolated shoots inoculated per flask induce higher plantlet
number per flask (13 to 15 plantlets/flask). Liquid medium without
shaking induces higher shoot proliferation. The root system is
obtained in MS medium without growth regulator.
Index terms: vegetable fiber, micropropagation, medicinal plant.
(Recebido em 23 de janeiro de 2008 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
2
PEREIRA, F. D. et al.
INTRODUÇÃO
O curauá (Ananas comosus var. erectifolius
(L.B.Sm.) Coppens & F.Leal - Bromeliaceae) é uma planta
cujas folhas produzem fibras lignocelulósicas, de utilização
múltipla e diversificada. Trata-se de uma bromeliácea
rústica, ainda pouco conhecida e estudada, característica
da Amazônia, podendo crescer em solo arenoso e pouco
fértil, chegando a atingir entre um metro e um metro e meio
de altura. Cada planta produz entre 12 e 15 folhas, das
quais são extraídos cerca de 2 quilos de fibra (RAMALHO,
2005).
Estudos recentes têm demonstrado o grande
potencial do uso das fibras dessa planta na fabricação dos
revestimento para a indústria automobilística, devido à sua
resistência, maciez e peso reduzido (RAMALHO, 2005;
SILVA, 2004). Neste contexto, a crescente demanda de
fibras do curauá por grupos empresariais o torna uma
espécie estratégica, criando perspectivas socioambientais
e socioeconômicas. O curauá é fiel às suas origens
amazônicas e só se desenvolve em clima quente e úmido,
criando um problema para a produção de mudas fora desta
região e consequentemente, uma escassez de matéria-prima
para atender à indústria automobilística (SILVA, 2004).
A propagação vegetativa utilizando técnicas de
cultura de tecido tem sido um valioso instrumento na
propagação clonal rápida de diversos tipos de plantas
como, por exemplo, Eremanthus erythropappus (ROSAL
et al., 2007), Lychnophora pinaster Mart. (SOUZA et al.,
2007), Casuarina cunninghamiana D. Macleish (SHEN et
al., 2010), Brassica rapa L. (COGBILL et al., 2010), Pyrus
communis L. (BELL & SRINIVASAN, 2010). A adoção do
método de estiolamento como técnica de propagação
vegetativa mantém a estabilidade genética por ser uma
clonagem. A utilização desta técnica para a
micropropagação foi demonstrada em abacaxi (BARBOZA
& CALDAS, 2001; KISS et al., 1995; PEREIRA et al., 2001).
Como o curauá é uma espécie de grande interesse
industrial, carente de informações científicas e técnicas
adequadas de propagação in vitro, o objetivo do presente
trabalho foi avaliar o efeito do tamanho da plântula inicial
na regeneração de brotos estiolados, o número de brotos
estiolados por frasco na regeneração de plântulas, a
influência da consistência do meio de cultivo com ou sem
agitação na regeneração de brotos estiolados e a obtenção
de plântulas de curauá provenientes dos brotos estiolados.
MATERIAL E MÉTODOS
Estabelecimento da cultura in vitro
Exsicata de Ananas comosus L. Merr. var.
erectifolius (L.B.Sm.) Coppens & F.Leal foi depositada no
Herbário IAN – EMBRAPA Amazônia Oriental sob registro
nº 185100. As gemas axilares de curauá foram retiradas de
plantas matrizes com dois anos de idade provenientes da
Embrapa – CPATU (Belém-PA). Em câmara de fluxo laminar,
as gemas foram imersas em álcool 70% por 30 segundos, e,
posteriormente, em água sanitária 2,5% NaClO e mantidos
sob agitação durante 20 minutos. Após esse período, as
gemas foram lavadas por seis vezes em água destilada
estéril.
Tamanho da plântula na regeneração de brotos estiolados
Foram utilizadas plântulas de curauá com os
seguintes tamanhos: 1,0 a 2,5 cm, 3,0 a 4,5 cm e 5,0 a 6,5 cm.
As plântulas foram desfolhadas e os talos inoculados em
meio líquido MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
suplementado com 10 mM de ANA (Ácido naftaleno
acético). Foi utilizado frasco com volume interno de 250
mL (9,5cm de altura e 5,5cm de diâmetro). As culturas foram
mantidas em sala de crescimento sob temperatura de 26±1°C
e no escuro. Após 40 dias, avaliaram-se o número e o
comprimento médio dos brotos estiolados.
Número de brotos estiolados por frasco na regeneração
de plântulas
A parte apical e o sistema radicular dos brotos
estiolados obtidos acima foram removidos. O segmento
nodal contendo duas gemas por brotos estiolados com
um tamanho aproximadamente de 2,5 cm foi inoculado em
frascos com volume interno de 250 mL contendo 15 mL de
meio MS líquido e mantidos sob agitação de 85 rpm em
mesa agitadora orbital. O número de explantes inoculados
Estiolamento e regeneração in vitro de Ananas comosus var. erectifolius ...
por frasco foram 4, 6 e 8 brotos estiolados. Os explantes
foram mantidos por 90 dias em sala de crescimento à
temperatura de 26±1°C e, fotoperíodo de 16 horas sob uma
intensidade luminosa de 25mmol m-2 s-1. Após esse período,
avaliaram-se o número e o comprimento das plântulas
regeneradas.
Consistência do meio de cultivo e agitação na regeneração
de brotos estiolados
Fase I - Os explantes primários, ou seja, as bases
foram provenientes de plântulas in vitro de curauá
inoculados em meio MS sem regulador de crescimento. As
plântulas foram desfolhadas e cortadas com 5 a 8 mm acima
da base da plântula. As bases foram cultivadas em meio
MS semissólido com 50mL de meio suplementado com 10
mM ANA. As bases foram mantidas por 40 dias no escuro
em sala de crescimento com temperatura de 26±1°C.
Fase II - Após 40 dias, removeram-se a parte apical
3
sala de crescimento. Após 20 a 30 dias, todas as brotações
estavam enraizadas com um comprimento de 4 a 6 cm de
altura. Após esse período, as plântulas foram lavadas para
remover o meio de cultura e colocadas em bandejas
plásticas com composto Plantmax (Eucatex, Jundiaí, SP)
em casa de vegetação sob 50% de sombreamento,
temperatura média de 250C e 80% de umidade.
Analise estatística
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado (DIC), com 10 repetições por
tratamento. Os dados foram submetidos à análise de
variância com aplicação do teste F a 5%, e as médias
analisadas pelo teste de Scott-Knott a 5%. O programa
utilizado para análise dos dados foi o software estatística
(SISVAR).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
e o sistema radicular dos brotos estiolados. Quatro
segmentos nodais de aproximadamente 2,5 cm foram
Todos os segmentos provenientes de diferentes
tamanhos de plântulas regeneram brotos estiolados de
coloração branca com folhas pequenas e finas. No escuro
os entrenós do talo da plântula do curauá se alongaram,
separando os nós que, normalmente, em presença de luz,
permanecem próximos uns aos outros. O estiolamento
promove a separação dos nós e facilita o desenvolvimento
de gemas axilares e a manipulação para fins de
micropropagação.
O número e o tamanho médio de brotos estiolados
produzidos por explante inicial foram estatisticamente
iguais em todos os tratamentos aos 40 dias de cultivo no
escuro (Tabela 1). No tratamento com a plântula de
comprimento 3,0 a 4,5cm obteve-se 3,5 brotos estiolados
com 7,6 cm de altura por explante. No tratamento com 5,0 a
6,5 cm regenerou 3,1 brotos estiolados com 6,5 cm de altura
por explante, enquanto o tratamento com 1,0 a 2,5 cm
obteve-se 2,6 brotos estiolados com 4,5 cm de altura (Tabela
1 e Figura 1). O tamanho no qual as porções basais foram
excisadas para serem inoculadas possibilitou que os
explantes contivessem reservas suficientes para serem
disponibilizadas, o que pode ter levado à uniformidade
inoculados horizontalmente em frasco com volume interno
de 250 mL contendo 15 mL de meio MS líquido sem
regulador de crescimento. Os brotos estiolados foram
cultivados sem agitação (T1); sob agitação contínua a 85
rpm em mesa agitadora orbital (T2) e em meio semissólido
com 0,6% de ágar (T3). Os explantes foram mantidos em
sala de crescimento com temperatura de 26±1°C e
fotoperíodo de 16 horas sob uma intensidade luminosa de
25-30 mmol. m-2. s-1 fornecida por lâmpadas do tipo
fluorescente branca fria. Após 90 dias, avaliaram-se: o
número, o comprimento e a biomassa fresca e seca das
brotações.
Enraizamento in vitro e aclimatização
O enraizamento in vitro foi conduzido apenas em
meio MS sem reguladores de crescimento em sala de
crescimento com a temperatura de 26±1°C e fotoperíodo
de 16 horas de luz sob uma intensidade luminosa de 2530mmol m-2 s-1 fornecida por lâmpadas fluorescentes
brancas frias. Foi utilizado frasco com volume interno de
250 mL (9,5cm de altura e 5,5cm de diâmetro) e mantidos em
4
apresentada pelas brotações em todos os tratamentos. O
tamanho do explante determina suas possibilidades de
sobrevivência, assim como a capacidade de crescimento.
Uma hipótese sugerida para explicar tais resultados,
possivelmente, está relacionada a fatores nutricionais do
explante. Segundo Cappelades et al. (1991) e Pereira et al.
(2001), porções basais apresentam maior quantidade de
reservas acumuladas em seus tecidos, o que poderia levar
as brotações regeneradas a se utilizarem dessas reservas
para sustentar seu crescimento inicial. .
de nós que serão regenerados em novas plântulas
quando expostas à luz. Verificou-se através dos
trabalhos no laboratório que os brotos estiolados
obtidos possuíam um número médio de entrenós de seis
que, conseqüentemente, apresentavam um número
médio de gemas axilares de vinte quatro (PEREIRA et
al., 2008).
Número de brotos estiolados por frasco na regeneração
de plântulas
O número de plântulas regeneradas por broto
A fim de maximizar a regeneração de plantas de
estiolado, aos 90 dias de cultivo em MS líquido, variou
laranja Pêra, Silva et al. (2005) avaliaram tamanhos de
com o número de explantes inoculados por frasco. O
segmentos de epicótilo. Os explantes maiores foram os
frasco inoculado com 8 e com 6 explantes produziu maior
número médio de plântulas, 15,1 e 13,1, respectivamente
e com 4 explantes produziu 5,6 plântulas (Tabela 2 e Figura
1a, 1b e 1c).
A exposição à luz promoveu a regeneração das
gemas axilares dos brotos estiolados em plântulas. As
plântulas regeneradas eram bem formadas e vigorosas. Ao
serem excisadas as folhas eram rígidas, evidenciando a
presença de fibras. Não foi observada a presença de calos.
mais responsivos. Reis et al. (2003), estudando o tamanho
de segmentos internodais na multiplicação de Psychotria
ipecacuanha (Brat.) Stokes, verificaram que explantes com
1,0 e 1,5 cm apresentaram maiores números de brotos (5 a
6 brotos) quando comparados com o de 0,5 cm.
O comprimento do broto estiolado é uma variável
de grande importância no método de estiolamento de
plantas, pois está diretamente relacionada com o número
TABELA 1 - Efeito do tamanho da plântula na regeneração de brotos estiolados.
*
Tamanho da
plântula inicial (cm)
Número de brotos
estiolados/explante
Comprimento de brotos estiolados (cm)
1,0 a 2,5
2,6 a*
4,9 a
3,0 a 4,5
3,5 a
7,6 a
5,0 a 6,5
3,1 a
6,5 a
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott.
TABELA 2 - Efeito do número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas.
Efeito do número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas
Número de brotos
estiolados/frasco
4
*
Número de plântulas/frasco
Comprimento de plântulas (cm)
5,6 b*
4,4 a
6
13,1 a
3,9 a
8
15,1 a
3,8 a
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott.
5
FIGURA 1 – Esquema da micropropagação de Ananas comosus var. erectifolius a partir de brotos estiolados.
Experimento I: 1. Plântulas estabelecidas in vitro; 2. Excisão de plântulas com diferentes tamanhos; 3. Cultivo dos
explantes no escuro nos tratamentos; 4. Formação de brotos estiolados. Experimento II: 5. Excisão de brotos
estiolados; 6. Cultivo na luz de diferentes números de segmentos nodais em meio líquido; 7. Plântulas obtidas no
frasco inoculado com 4 explantes (a); com 6 explantes (b) e com 8 explantes (c).
6
Por meio de observações visuais das brotações, pôde-se
observar que não houve nenhuma planta com alterações
morfológicas (Figura 1a, 1b e 1c). Os aspectos morfológicos
encontrados no presente trabalho são semelhantes aos de
Ramirez (1984) em abacaxi. O autor afirma que o método de
estiolamento tem a vantagem de evitar danos na região de
regeneração e de impedir a formação de calos, podendo
assim, proporcionar menores taxas de variabilidade
somaclonal que os protocolos convencionais de
micropropagação. Outro fato relevante no presente
trabalho é que se conseguiu regenerar plântulas em MS
sem a adição de regulador de crescimento, proporcionando
uma redução dos custos de produção dessas mudas.
O comprimento da plântula constitui um indicador
do crescimento do vegetal. Verificou-se que não houve
diferença significativa para o comprimento médio de
plântulas. O frasco inoculado com 4 explantes cresceu 4,4
cm, o frasco com 6 explantes 3,9 cm e o frasco com 8
explantes 3,8 cm.
Efeito dos fatores físicos na regeneração de brotos (Fase
I e Fase II)
Os brotos estiolados cresceram provenientes da
base das plântulas entre 4 e 5 semanas cultivadas no escuro,
porque com a presença de luz esses não estiolam. Houve o
desenvolvimento de mais de um broto estiolado por base,
estes surgiram das gemas axilares.
Os fatores físicos, ou seja, consistência do meio de
cultivo e agitação ou não influenciaram na regeneração
dos brotos estiolados. Os resultados preliminares
indicaram que os segmentos nodais dos brotos estiolados
necessitam de luz para a regeneração de brotos se
permanecerem no escuro ficam apenas estiolado. Todos
os segmentos nodais utilizados regeneram-se em plântulas
bem formadas, vigorosas com a coloração verde-escura
característica das plantas matrizes (Figura 2). Constatouse a ausência de plântulas com alterações morfológicas
após várias repicagens e a existência de poucas raízes.
Embora os sistemas caulinares e radiculares tendam a um
equilíbrio, em bromélia, o crescimento do sistema caulinar
é muito superior.
Segundo Peres & Kerbauy (2000), muitas bromélias
possuem estruturas caulinares capazes de absorver sais,
fato que pode ter garantido a boa formação dos brotos,
mesmo com um número baixo de raízes. Não foi observado
o crescimento em forma de clusters, nem a presença de
calos e nem o estado hiperhídrico das brotações
regeneradas.
O número de plântulas regeneradas por segmento
nodal variou com o tipo de cultivo utilizado. Os dados
mostram diferença significativa (P<0,05) entre os
tratamentos (tabela 3).
O tratamento em meio líquido sem agitação produziu
maior número médio de brotos 9,0 por explante, com
agitação contínua 6,2 brotos por explante e o meio
semissólido 4,4. Para o comprimento médio dos brotos, o
tratamento com agitação contínua foi o que produziu brotos
maiores com 4,5 cm de tamanho, o sem agitação 2,7 cm e o
meio semissólido 1,8 cm. A biomassa fresca do tratamento
sem agitação pesou em média com 3,48 mg, o com agitação
contínua 2,70 mg e no meio semissolido pesou em média
0,57 mg. Os fatores físicos, tanto consistência do meio,
quanto com ou sem agitação, também influenciaram na
biomassa seca onde com agitação se obteve um peso de
0,28 mg, sem agitação contínua 0,15 mg e o no meio
semissólido 0,06 mg de matéria seca (Tabela 3).
É provável que o ágar, como agente solidificante,
tenha interferido nos processos de absorção e de
translocação de íons e de água. Além disso, segundo Ziv
(1995), o maior contato dos explantes e raízes com o meio
faz com que a taxa de assimilação de nutrientes pelo material
vegetal em cultivo seja favorecida no meio líquido.
Neste trabalho, foi observado que o Ananas comosus
var. erectifolius primeiro é estabelecido em meio semissólido
e sua proliferação foi melhor em meio líquido. Venkatachalan
et al. (2006) relataram a formação direta de brotos em banana
(AAB) somente quando cultivados em meio líquido. Chen
et al. (2005) relataram à propagação de lírio em grande escala
usando o meio semissólido para o estabelecimento do
explante e a proliferação usando o meio líquido. Karasawa
et al. (2006) constataram a melhor proliferação de brotos de
7
FIGURA 2 – Micropropagação de Ananas comosus var. erectifolius a partir de brotos estiolados. Fase I:1- Plântulas
in vitro; 2- Plântulas segmentadas; 3- Explante basal cultivado em meio MS + 10 mM ANA; 4- Brotos estiolados
no escuro; Fase II: 5- Brotos estiolados segmentados; 6- Segmento nodal; 7- Segmento nodal cultivado na luz em
diferentes condições; 8- Regeneração de brotos. A – Meio líquido sem agitação; B – Meio líquido com agitação; C –
Meio semissólido. Plantas aclimatizadas mostrando o sistema radicular bem formado.
Pennisetum purpureum Schumach em meio semissólido do
que em meio líquido. Pereira et al. (2008) observaram na
mesma espécie A. erectifolius que no estabelecimento o
meio semissólido foi mais eficiente e a micropropagação em
meio líquido. A resposta na proliferação de brotos é muito
dependente do genótipo.
Alvard et al. (1993) mostraram que cultivos em meio
líquido requerem um suporte ou agitação. Por tal razão, é
8
provável que a agitação do meio líquido tenha fornecido
melhor condição de aeração necessária para a respiração
do explante, proporcionando maior crescimento do explante
e maiores valores da biomassa seca.
Observou-se que, no sistema sem agitação com
Ananas comosus var. erectifolius, a taxa de multiplicação
do material vegetal foi maior do que as demais condições
físicas podendo proporcionar redução dos custos na
produção (Tabela 3).
Enraizamento in vitro e aclimatização
As brotações formaram raízes em meio líquido MS
sem regulador de crescimento e transferidas para a casa de
vegetação com 70% de sombreamento e 80% de umidade
com 100% de sucesso (Figura 2).
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CONCLUSÕES
O protocolo de micropropagação através de brotos
estiolados é eficiente na produção de mudas de Ananas
comosus var. erectifolius.
O tamanho do explante inicial não influência na
indução do número de brotos estiolados.
O número de brotos estiolados de 6 a 8 inoculados
por frasco induz maior número de plântulas por frasco de
13 a 15 plântulas.
O meio líquido sem agitação induz maior proliferação
de brotos.
O sistema radicular é obtido no meio MS sem a
presença de regulador de crescimento.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao CNPq e a FAPEMIG pela
bolsa de produtividade e pelo apoio financeiro, assim como
a CAPES pela bolsa de estudos.
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10
MEIO DE CULTURA,
CONCENTRAÇÃO
DE BAP E
PINHEIRO,
M. V. M. et al.
FOTOPERÍODO NA MICROPROPAGAÇÃO DE
ANTÚRIO ‘EIDIBEL’ POR SEGMENTOS CAULINARES
CULTURE MEDIUM, BAP CONCENTRATION AND PHOTOPERIOD ON
MICROPROPAGATION OF ANTHURIUM ‘EIDIBEL’ STEM SEGMENTS
MARCOS VINÍCIUS MARQUES PINHEIRO1, GABRIELEN DE MARIA GOMES DIAS2,
ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO3, LEVI DE MOURA BARROS3
1
Doutorando em Botânica – Universidade Federal de Viçosa/UFV – Campus Universitário, Departamento de Biologia Vegetal –
36570-000 – Viçosa, MG – [email protected]
2
Doutoranda em Agronomia/Fitotecnia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Campus Universitário, Cx. P. 3037 – 37200-000 –
Lavras, MG – [email protected]
3
Pesquisador (a) – Embrapa Agroindústria Tropical – Rua Dra. Sara Mesquita, nº. 2270, Bairro Pici – 60511-110 – Fortaleza, CE –
[email protected]; [email protected]
RESUMO
Apesar de a micropropagação vir sendo empregada para
a rápida propagação clonal de antúrio, os custos do processo
ainda são altos. Visando a minimizar este problema, o trabalho
objetivou aumentar a taxa de multiplicação in vitro. Para isso,
avaliaram-se os efeitos de meio de cultura (MS e Pierik),
concentração de BAP (2,22; 4,44; 6,66 e 8,88 ìM) e fotoperíodo
(12 e 16 horas) na micropropagação de Anthurium andraeanum
Linden var. Eidibel. Os explantes, segmentos caulinares contendo
dois nós, obtidos a partir de mudas estabelecidas in vitro, foram
inoculados em frascos contendo 30 mL de meio de cultura e
mantidos em câmara de crescimento com temperatura de 25±1º
C, intensidade luminosa de 30 ìmol m-2 s-1 e fotoperíodo de acordo
com o tratamento. A taxa de multiplicação foi avaliada aos 30, 45
e 60 dias após a inoculação dos explantes. Utilizou-se o
delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2 x 4 x
2, constituído de 5 repetições de 3 frascos (4 explantes/frasco).
Os dados foram transformados para a raiz quadrada de (x + 0,5),
submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo
teste de Tukey a 5% de significância. As maiores taxas de
multiplicação foram obtidas no meio Pierik em todas as avaliações,
e quanto aos fotoperíodos testados, os valores registrados não
apresentaram diferença na primeira avaliação. Em relação às
concentrações de BAP testadas, não foram registradas diferenças
no meio Pierik. Com base na análise dos resultados obtidos, para
micropropagação desta variedade de antúrio, recomenda-se o meio
Pierik, acrescido de 2,22 µM de BAP, sob fotoperíodo de 12
horas, com a realização de subcultivos em intervalos de 30 dias.
Termos para indexação: Araceae, Anthurium andraeanum,
floricultura, cultura de tecidos.
ABSTRACT
Although the micropropagation has been used for quick
anthurium clonal propagation the costs of the process are still high.
In order to reduce this problem, the objective of this work was to
increase the in vitro multiplication rate. For this, it was evaluated the
effects of culture medium (MS and Pierik), BAP concentration (2.22;
4.44; 6.66 and 8.88 ìM) and photoperiod (12 and 16 hours) on the
micropropagation of Anthurium andraeanum Linden var. Eidibel.
The explants, stem segments with two nodes, obtained from in vitro
plantlet, were inoculated in flasks with 30 mL of culture media and
maitained in growth room under temperature of 25±1º C, light
intensity of 30 ìmol m-2 s-1 and photoperiod varying as a function of
the treatment. The multiplication rate was evaluated at 30, 45 and
60 days after the explants inoculation. A completely randomized
design was used in a factorial scheme of 2 x 4 x 2 with 5 replicates of
3 flasks (4 explants/flask). The data were transformed to the square
root of (x + 0.5) and the means were compared by Tukey´s test
(p<0.05). The higher multiplication rates were obtained in Pierik
medium in all evaluations, and in relation to the photoperiod, there
were no differences in the first evaluation. No difference was observed
regarding the BAP concentrations used in the Pierik medium. The
results indicate that for the micropropagation of this anthurium
variety, it is recommended the use of Pierik medium supplemented
with 2.22 ìM BAP under 12 hours of photoperiod, subcultured at
each 30 days.
Index terms: Araceae, Anthurium andraeanum, floriculture,
tissue culture.
INTRODUÇÃO
As exportações brasileiras de flores e plantas
ornamentais somaram, em 2009, US$ 31,137 milhões, valor
que representou uma queda substancial de 12,30% em
relação ao desempenho do ano anterior (JUNQUEIRA &
PEETZ, 2010a). Esses autores enfatizam que tal resultado
era aguardado, tendo em vista os efeitos da crise econômica
e financeira internacional que abalou sensivelmente os
principais mercados importadores da floricultura nacional,
(Recebido em 24 de dezembro de 2008 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
Meio de cultura, concentração de bap e fotoperíodo ...
como os EUA, os países da União Européia e o Japão. Ao
longo do primeiro semestre de 2010, as importações
brasileiras de produtos da floricultura atingiram o valor global
de US$ 14,287 milhões, representando um acréscimo de
1,64% em relação ao valor obtido no mesmo período do ano
anterior (US$ 14,056 milhões). O resultado, apesar de
pequeno, não deixou de ser surpreendente, levando-se em
conta a persistência da crise econômica e financeira,
prevalecente nos principais mercados importadores; as
quedas registradas na produção interna brasileira,
decorrentes de fatores climáticos adversos, além do
problema com o trânsito aéreo internacional, em decorrência
dos fechamentos de aeroportos europeus, devido às fortes
fumaças provocadas pela erupção do vulcão na Islândia,
em abril de 2010 (JUNQUEIRA & PEETZ, 2010b).
Os principais pólos de produção de flores e plantas
ornamentais, no Ceará, estão localizados na Região
Metropolitana de Fortaleza, incluindo o Maciço de Baturité,
na Serra da Ibiapaba, na região do Cariri e no Baixo Acaraú.
Atualmente, o Estado ocupa o primeiro lugar nas
exportações de rosas e flores tropicais e o segundo de
flores frescas cortadas do País. Os principais produtos
exportados são rosas (31%), bulbos (28%), flores tropicais
(25%), mudas (10%) e folhagens (3%) (CASTRO, 2007).
Os antúrios se destacam como um dos produtos
comerciais de maior potencial tanto para o mercado interno,
quanto para as exportações. No Brasil, os antúrios são
cultivados principalmente no Estado de São Paulo. Entretanto,
nos últimos anos, tem sido verificada uma relativa dispersão
desta cultura para áreas do norte e do nordeste do país, com
destaque para os Estados de Pernambuco, Bahia, Alagoas e
Ceará (JUNQUEIRA & PEETZ, 2008). No Ceará, os antúrios
merecem destaque entre as flores tropicais sendo cultivados,
principalmente, no Maciço de Baturité.
Os antúrios pertencem ao gênero Anthurium Schott.
(Araceae) que compreende mais de 600 espécies,
normalmente herbáceas, epífitas, eretas ou trepadeiras.
Suas flores são hermafroditas e apresentam o fenômeno
da protoginia, ou seja, quando a parte feminina torna-se
receptiva, a masculina ainda está imatura, o que previne a
11
autofecundação e favorece o cruzamento entre plantas. A
maioria das espécies do gênero é ornamental, destacandose pela beleza da folhagem, sendo Anthurium andraeanum
Lindl. de maior importância, devido ao tamanho, ao colorido
e à durabilidade pós-colheita de suas inflorescências
(TOMBOLATO, 2004; TOMBOLATO et al., 2004).
Os antúrios podem ser propagados por sementes,
rebentos, estacas e cultura de tecidos. A propagação sexuada,
além de demandar cerca de três anos para que ocorra o primeiro
florescimento e cinco para que a cultura possa ser explorada
comercialmente, tem o inconveniente da alta heterogeneidade
das plantas em razão da variabilidade genética nas progênies
resultantes do plantio por sementes (LAMAS, 2002). Esta
variabilidade, no entanto, é fundamental para a obtenção de
novas variedades. A propagação assexuada pode ser feita
por divisão de touceiras, ou seja, por rebentos, estaquia e,
mais recentemente, por micropropagação (TOMBOLATO,
2004). Os métodos por divisão de touceiras e estaquia, porém,
fornecem apenas algumas unidades de novas mudas
anualmente, além de possibilitar a disseminação de pragas e
doenças. A principal vantagem da micropropagação é a
produção de um elevado número de plantas, em curto espaço
de tempo e em área física reduzida, quando comparada com
os métodos tradicionais de multiplicação. A sanidade das
plantas produzidas por essa técnica e seu conseqüente vigor
garantem, além de um material de plantio de qualidade superior,
a obtenção de plantas de tamanho padronizado, permitindo
um manejo mais adequado do cultivo, o que reflete diretamente
nos custos de produção. Além disso, Fuzitani & Nomura (2004)
citam a uniformização de características tais como: época de
floração, coloração, tamanho e forma das inflorescências.
Entretanto, essa técnica tem como desvantagens o elevado
custo final da muda e a possibilidade de ocorrência de
variantes somaclonais.
O uso da micropropagação tem se destacado,
também, no lançamento de novas variedades desenvolvidas
pelos programas de melhoramento genético (SOUZA &
JUNGHANS, 2006). Um exemplo é o programa de
melhoramento desenvolvido pelo Instituto Agronômico
(IAC), no qual são selecionados materiais adaptados às
12
PINHEIRO, M. V. M. et al.
nossas condições climáticas para exploração comercial
tanto para flor de corte quanto para planta de vaso. No
IAC, entre as 12 seleções de Anthurium andraeanum,
quatro foram selecionadas para produção comercial e
lançadas como variedades: ‘IAC Astral’, ‘IAC Cananéia’,
‘IAC Eidibel’ e ‘IAC Ômega’. Dessas, destaca-se a Eidibel,
que por ser uma planta vigorosa, de porte médio, altamente
produtiva, de crescimento rápido, com inflorescências de
formato, brilho e longevidade pós-colheita comercialmente
aceitos, tornou-se muito atrativa aos consumidores. Além
disso, sua inflorescência é de coloração vermelho forte,
cor de maior demanda de mercado entre as flores de corte.
Esses fatores possibilitaram que essa variedade se tornasse,
atualmente, a mais cultivada em todo o Brasil (LEME, 2004).
Considerando-se o potencial desta espécie para a
geração de emprego e renda nas regiões produtoras, sua
grande aceitação nos principais mercados consumidores
e a necessidade de melhoria dos processos de multiplicação
da planta, foi realizado o presente trabalho que objetivou a
otimização do protocolo de multiplicação in vitro de
Anthurium andraeanum var. Eidibel por meio de segmentos
caulinares (microestacas).
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura
de Tecidos e Genética Vegetal da Embrapa Agroindústria
Tropical (CNPAT), em Fortaleza, Ceará, no período de
outubro a dezembro de 2006.
Foram utilizados como explantes segmentos
caulinares contendo dois nós (microestacas), por meio do
seccionamento de mudas de antúrio (Anthurium
andraeanum) var. Eidibel, aos 60 dias após estabelecimento
in vitro. Essas mudas foram obtidas a partir da indução de
calogênese em folhas jovens, com posterior organogênese
de brotações. As plantas matrizes foram cedidas pelo
Instituto Agronômico (IAC) em Campinas, São Paulo.
Em câmara de fluxo laminar, sob condições
assépticas, os explantes foram inoculados em frascos de
vidro transparente com capacidade de 220 mL contendo
30 mL de meio de cultura e mantidos em sala de crescimento,
a 25 ± 1ºC, intensidade luminosa de 30 ìmol m-2 s-1, sob
fotoperíodo, de acordo com o tratamento.
Os meios de cultura utilizados foram MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) e Pierik (PIERIK, 1976)
suplementados com 30 g L-1 e 20 g L-1 de sacarose,
respectivamente. Os meios foram solidificados com ágar a
5,5 g L-1 e o pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem,
realizada a 121ºC por 15 minutos.
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, em arranjo fatorial 2 x 4 x 2, dois meios de
cultura (MS e Pierik), quatro concentrações de 6benzilaminopurina – BAP (2,22; 4,44; 6,66 e 8,88 µM) e
dois fotoperíodos (12 e 16 horas), constituído de cinco
repetições de três frascos, com quatro explantes/frasco,
totalizando 60 explantes/tratamento.
As taxas de multiplicação foram avaliadas aos 30,
45 e 60 dias após a inoculação dos explantes, contando-se
o número de brotos formados/explante. Os dados foram
transformados para a raiz quadrada de (x + 0,5) e submetidos
à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo
teste de Tukey a 5% de significância.
De acordo com a análise de variância, houve
significância para o fator meio de cultura em todos os
períodos avaliados, para o fator fotoperíodo e para a
interação meio de cultura x concentração de BAP nas duas
últimas avaliações efetuadas.
Em relação ao número de brotos formados por
explante nos dois meios de cultura testados, observou-se,
nos três períodos avaliados, que as maiores taxas de
multiplicação foram registradas no meio Pierik (Tabela 1).
A principal diferença entre esses dois meios de
cultura é a concentração utilizada dos macronutrientes.
No meio Pierik, as concentrações dos cinco
macronutrientes (NH 4 NO 3 , KNO 3 , CaCl 2 .2H 2 O,
MgSO 4 .7H 2 O e KH 2PO 4 ) são reduzidas à metade,
comparadas com as concentrações normalmente utilizadas
no meio MS. Especificamente, em relação ao nitrato de
amônio a concentração recomendada é de 1650 mg L-1 e
825 mg L-1 nos meios MS e Pierik respectivamente.
O crescimento e a morfogênese das plantas
cultivadas in vitro são influenciados tanto pela quantidade,
quanto pela forma inorgânica, nitrato (NO3-) e amônio (NH4+),
disponibilizadas do nitrogênio. A razão entre as
concentrações dessas duas formas parece ser o fator
determinante do crescimento, sendo que a de amônio deve
ser, no máximo, um terço da de nitrogênio total (CALDAS et
al., 1998), tendo em vista que este íon é tóxico para maioria
das plantas (GEORGE et al., 2008). Em meios de cultura, com
elevadas concentrações de amônio, pode ocorrer aumento
da produção de etileno (BARKER & COREY, 1987; COREY
& BARKER, 1987), acarretando a formação de brotos com
crescimento retardado ou com hiperhidricidade. Além disso,
altas concentrações de amônio também podem afetar as
respostas das células aos reguladores de crescimento, em
especial na divisão celular e na morfogênese (MOTT et al.,
1985). Em circunstâncias normais, o efeito tóxico do amônio
é evitado por sua conversão em aminoácido e rápida
assimilação pelos tecidos vegetais. Na composição da
maioria dos meios de cultura, o íon nitrato necessita ser
suplementado juntamente com o íon amônio, uma vez que
as plantas não se desenvolvem adequadamente tendo o
nitrato como única fonte de nitrogênio (GEORGE et al., 2008).
Pierik e colaboradores (PIERIK, 1976; PIERIK et al.,
1979) foram pioneiros em demonstrar a importância da
concentração de amônio, presente no meio de cultura, para
o cultivo in vitro do antúrio. Esses autores observaram
formação de partes aéreas, apenas quando a concentração
de NH4NO3 foi reduzida de 825 mg L-1 para 200 mg L-1,
constatando que esse efeito era causado pelo íon amônio
e não pelo íon nitrato, substituindo o NH4NO3 tanto por
(NH4)2SO4 quanto por NaNO3.
Os resultados obtidos no presente trabalho, no qual
se verificou que baixas concentrações de NH4NO3 foram
favoráveis para a multiplicação in vitro de antúrio, confirmam
as observações de Geier (1986), Lightbourn & Prasad (1990),
Pierik (1976) e Puchooa & Sookun (2003). Na maioria dos
trabalhos com cultura de tecidos de antúrios, os meios de
cultivo derivam da formulação básica do meio MS, utilizandose para os macronutrientes, concentrações reduzidas à metade
13
ou a concentrações ainda menores. Pierik (1976) introduziu
uma seqüência de modificações do meio MS, alterando as
concentrações dos macronutrientes, para as fases de indução
de calos, multiplicação e regeneração de plantas. E, embora
com menor freqüência, também tem sido empregadas
modificações do meio de cultivo Nitsh (1969) cuja composição
é muito semelhante aos meios MS e Pierik, para produção de
mudas in vitro de espécies do gênero Anthurium (GEIER,
1990). Tombolato & Costa (1998) recomendam a utilização do
meio Pierik para micropropagação das variedades de antúrio
lançadas pelo Instituto Agronômico (IAC).
O número de brotos produzidos por explante, aos
30 dias de cultivo in vitro (em média 2,50), foi
estatisticamente igual nos dois fotoperíodos testados.
Entretanto, nas culturas mantidas, até os 45 e 60 dias, o
número médio de brotos formados por explante foi superior,
no fotoperíodo de 16 horas.
Aos 30 dias de cultivo in vitro, as culturas expostas
por 16 horas de luz diária apresentaram maior valor para
formação de brotos/explante, apesar de não terem sido
identificadas diferenças significativas em relação ao
fotoperíodo de 12 horas. Verificou-se que o cultivo dos
explantes sob regime de 16 horas de luz contínua, condição
para a maioria dos cultivos realizados em laboratórios,
proporcionou o melhor resultado em termos de número de
mudas obtidas (Tabela 2).
A intensidade luminosa ótima depende da espécie,
do tipo de cultura e do fenômeno morfogenético a ser
controlado ou induzido e em geral o período de iluminação
varia entre 12 e 16 h/dia (HANDRO & FLOH, 1990).
Não se dispõe de informações sobre o efeito do
fotoperíodo na micropropagação de antúrio, entretanto
algumas modificações no regime de luz são citadas. Geier
(1990) recomenda, para a fase de multiplicação, que as culturas
sejam mantidas sob fotoperíodo de 14 horas com intensidade
luminosa variando de 30 a 50 ìmol m-2 s-1. Já Tombolato &
Costa (1998) sugerem que as culturas sejam mantidas, sob
fotoperíodo de 16 horas, e Vargas et al. (2004) sob 24 horas de
luz continua de 50 ìmol m-2 s-1. Do ponto de vista econômico,
a otimização de um sistema comercial de micropropagação
requer diminuição dos gastos com energia elétrica, que,
14
segundo Grattapaglia & Machado (1998), é um dos principais
componentes do custo de uma planta micropropagada.
Na interação meio de cultura x concentração de BAP,
foi identificada significância para os parâmetros avaliados
aos 45 e aos 60 dias de cultivo in vitro. Os maiores valores
para o número de brotos formados por explante, tanto aos
45 quanto aos 60 dias de cultivo in vitro, foram registrados
no meio de cultura Pierik, exceto para a concentração de
4,4 µM de BAP, cujos valores foram estatisticamente iguais
para os dois meios testados (Tabela 3).
TABELA 1 - Número médio de brotos formados/explante de Anthurium andraeanum var. Eidibel, aos 30, 45 e 60 dias
de cultivo in vitro, nos meios de cultura MS e Pierik.
Dias de cultivo in vitro
Meio de cultura
30
45
60
MS
2,36 b
2,89 b
3,14 b
Pierik
2,64 a
3,30 a
3,77 a
CV (%)
6,92
6,83
6,87
*Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
TABELA 2 - Número médio de brotos formados/explante de Anthurium andraeanum var. Eidibel, aos 30, 45 e 60 dias
de cultivo in vitro, em fotoperíodos de 12 e 16 horas.
Dias de cultivo in vitro
Fotoperíodo
(número de horas)
30
45
12
2,42 a
2,98 b
3,28 b
16
2,59 a
3,22 a
3,63 a
CV (%)
6,92
6,83
6,87
60
*Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
TABELA 3 - Número médio de brotos formados/explante de Anthurium andraeanum var. Eidibel, em função do meio de
cultura e da concentração de BAP, aos 45 e aos 60 dias de cultivo in vitro.
45 dias de cultivo in vitro
BAP (µM)
60 dias de cultivo in vitro
Meio de cultura
MS
Pierik
2,22
2,73 a B
3,32 a A
4,44
3,21 a A
6,66
Meio de cultura
Média
Média
MS
Pierik
3,03 A
2,78 b B
3,78 a A
3,28 A
3,02 a A
3,11 A
3,59 a A
3, 42 a A
3,50 A
2,76 a B
3,38 a A
3,07 A
2,99 ab B
3,96 a A
3,47 A
8,88
2,88 a B
3,49 a A
3,18 A
3,20 ab B
3,92 a A
3,56 A
Média
2,89 b
3,30 a
-
3,14 b
3,77 a
-
CV(%)
6,83
6,87
*Médias seguidas de letras iguais minúsculas, nas colunas, e maiúsculas, nas linhas, por época de avaliação, não
diferem entre si, pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
No meio de cultura Pierik, a redução da concentração
de BAP de 4,44 para 2,22 µM, proporcionou aumento da
taxa de multiplicação de 3,02 para 3,32 e de 3,42 para 3,78 aos
45 e 60 dias de cultivo, respectivamente. Comportamento
semelhante foi relatado por Puchooa & Sookun (2003) que
verificaram, nas três variedades de antúrio estudadas,
intensificação na formação de parte aérea quando, no meio
Nitsch (1969), a concentração de BAP foi reduzida de 4,44
para 2,22 µM. Entretanto, efeito contrário foi verificado por
Atak & Çelik (2009), comparando as variedades de antúrio
Arizona e Sumi cultivadas em meio MS contendo metade
das concentrações de sais e adicionado com 4,44 µM de
BAP e 0,45 µM de 2,4D e observando maior número de
brotos na variedade Arizona.
No meio de cultura MS, a concentração de 4,44 µM
de BAP acarretou aumento no número de brotos formados/
explantes (3,21), em comparação com os demais
tratamentos.O mesmo comportamento foi relatado por
Liendo & Mogollón (2009), que verificaram para cv. Nicoya
um aumento no número de brotos quando cultivados em
meio MS na concentração de 4,44 µM de BAP. Para a cv.
Rubrun, Maira et al. (2010) recomendam o meio de cultura
MS suplementado com 9 µM de BAP e 2,26 µM de ANA
como o mais indicado para a produção de brotos.
Lightbourn & Prasad (1990) registraram os melhores
índices de multiplicação, para todas as variedades de
antúrio testadas, no meio de cultura Nitsch (1969)
adicionado de 0,9 a 3,6 µM de BAP, obtendo de 3 a 5
brotos por calos quando as culturas foram mantidas sob
fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de 50
ìmol.m-2s-1. Os autores constataram que concentrações
superiores a 4,44 µM de BAP estimularam a proliferação
de calos e reduziram a formação de brotos. No presente
trabalho, quando foram adicionadas concentrações de 2,22
e 4,44 µ M de BAP ao meio Pierik, os índices de
multiplicação foram muito semelhantes, variando de 3,02 a
3,78. Entretanto, a utilização de concentrações maiores de
BAP não reduziu formação de brotos.
Vargas et al. (2004) obtiveram, em média, 3,6
brotações por explante quando as culturas foram
15
subcultivadas em meio MS contendo 4,4 µM de BAP e
0,05 µM de ácido naftalenoácetico (ANA) e mantidas sob
24 horas de luz contínua e intensidade luminosa de 50 ìmol
m-2 s-1, após 30 dias de cultivo in vitro. Comparando-se
esses resultados com os obtidos no presente trabalho,
verifica-se que, no meio de cultura MS, utilizando-se a
mesma concentração de BAP, o número de brotos formados
por explante foi de 3,21 e 3,59, aos 45 e 60 dias de cultivo in
vitro, respectivamente. Entretanto, as culturas foram
mantidas em regime de luz inferior, isto é, 12 e 16 horas de
luz diária e intensidade luminosa reduzida de apenas 30
ìmol m-2 s-1.
Na literatura são poucas as informações disponíveis
em relação ao número de mudas de antúrio obtidas ao final
do processo de micropropagação, além disso, os valores
mencionados apresentam grande variação. No protocolo
descrito por Castro et al. (1982), foram obtidas, em média,
30 mudas/segmento foliar, após 12 meses de cultura, por
meio da organogênese indireta. Por outro lado, via
organogênese direta, a metodologia proposta por Martin
et al. (2003) possibilitou a obtenção de aproximadamente
300 mudas/explante foliar, no período de 200 dias. No
presente trabalho, utilizando-se o meio de cultura Pierik
acrescido de 2,22 µM de BAP, sob fotoperíodo de 12 horas,
a taxa média de multiplicação foi de 2,65. Nessas condições,
ao final de 6 meses, efetuando-se subcultivos sucessivos
de 30 dias cada, podem ser obtidas 346 mudas a partir de
um único segmento caulinar da cultivar de antúrio Eidibel.
Entretanto, se os subcultivos forem efetuados a cada 45
(3,07) e 60 dias (3,34), seriam obtidas 89 e 37 mudas,
respectivamente, após este mesmo intervalo de tempo.
O período de incubação mais comum entre
repicagens é de quatro semanas, podendo este não ser o
intervalo ideal para otimizar a taxa de multiplicação
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). George (1993)
informa que o intervalo entre subcultivos depende da taxa
de crescimento da cultura e que, a ± 25oC, a repicagem é,
geralmente, efetuada de quatro a seis semanas. Para a
variedade de antúrio estudada, pode-se recomendar a
realização de subcultivos com intervalos de 30 dias.
16
CONCLUSÕES
A redução dos macronutrientes associada à
diminuição da concentração de BAP para 2,22 µ M
proporciona as maiores taxas de formação de brotos de
Anthurium andraeanum var. Eidibel.
Os diferentes fotoperíodos afetam a formação de
brotos de Anthurium andraeanum var. Eidibel.
Durante a fase de multiplicação, o intervalo mais
indicado para a realização de subcultivos sucessivos é de
30 dias.
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AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Instituto Agronômico
(IAC) por ceder as mudas in vitro para a realização desse
trabalho e a Embrapa Agroindústria Tropical e ao CNPq
pela concessão das duas bolsas e auxílio à pesquisa.
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18
REDUÇÃO DA NECROSE
APICAL
MACHADO,
M. P. etEal. HIPERIDRICIDADE DE
PLANTAS DE Lavandula angustifolia Mill.
CULTIVADAS in vitro
REDUCTION OF APICAL NECROSIS AND HYPERHYDRICITY IN in vitro
CULTURED Lavandula angustifolia Mill. PLANTLETS
MARÍLIA PEREIRA MACHADO1; LUIZ ANTONIO BIASI2; VANESSA REINHART3;
GABRIEL DISTÉFANO SANTOS3
1
Doutoranda em Agronomia – Universidade Federal do Paraná/UFPR – Rua dos Funcionários, 1540, Juvevê, Laboratório de
Micropropagação de Plantas – 81531-990 – Curitiba, PR – [email protected]
2
Professor Associado do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo – Universidade Federal do Paraná/UFPR - Rua dos
Funcionários, 1540, Juvevê – 81531-990 – Curitiba, PR – [email protected]
3
Graduando (a) em Agronomia – Universidade Federal do Paraná /UFPR – Rua dos Funcionários, 1540, Juvevê – 81531-990 –
Curitiba, PR – [email protected]; [email protected]
RESUMO
A necrose apical e a hiperidricidade que ocorrem em
plantas cultivadas in vitro podem inviabilizar o processo de
micropropagação. Em lavanda micropropagada, estes problemas
são frequentes, dificultando a obtenção de protocolos eficientes.
O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes concentrações
de cloreto de cálcio (CaCl2) no meio de cultura sobre a necrose
apical e hiperidricidade das brotações micropropagadas de
Lavandula angustifolia Mill. Brotações micropropagadas de L.
angustifolia foram subcultivadas em meio de cultura MS
suplementado com 1,0 µM BAP e concentrações de 440, 880,
1320, 1760, 2200 e 2640 mg L-1 de CaCl2. Foram testadas as
mesmas concentrações no meio de enraizamento. As avaliações
foram realizadas a cada 40 dias. O delineamento experimental
foi em blocos casualizados, com quatro repetições e 10 brotações
por parcela. O aumento da concentração de CaCl2 no meio de
cultura MS reduziu significativamente a necrose apical e a
hiperidricidade das brotações micropropagadas de L.
angustifolia, apresentando efeito no enraizamento das brotações,
pois afetou o comprimento e o número de raízes principais
formadas, embora não tenha afetado o percentual de brotações
enraizadas. As concentrações de 1320, 1760 e 2200 mg L-1 de
CaCl2 no meio de cultura MS, durante a fase de multiplicação,
foram mais efetivas na redução da necrose apical e hiperidricidade
das brotações de L. angustifolia, não interferindo na
porcentagem de enraizamento.
Termos para indexação: Alfazema, micropropagação, cálcio.
ABSTRACT
The apical necrosis and hyperhydricity which occur in
in vitro cultured plantlets may turn micropropagation
impracticable. These problems are frequently seen in
micropropagation of lavender, complicating the establishment
of an efficient propagation protocol. The objective of this work
was to evaluate the effect of different concentrations of calcium
chloride (CaCl2) in the culture media on apical necrosis and
hyperhydricity of Lavandula angustifolia Mill.
micropropagated shoots. Shoots were sub-cultivated in MS
media supplied with 1.0 µM of BAP and 440, 880, 1320, 1760,
2200 and 2640 mg L-1 CaCl2. The same concentrations were
used in the rooting media. Evaluations were performed each 40
days. A completely randomized design with four replicates and
10 shoots in each parcel was used. The increase of CaCl2
concentration in the MS medium significantly reduced apical
necrosis and hyperhydricity of L. angustifolia micropropagated
shoots and the number of main roots formed. The most effective
CaCl2 concentrations against apical necrosis and hyperhydricity
of L. angustifolia shoots during the multiplication phase were
1320, 1760 and 2200 mg L-1. There was no influence on rooting
percentage.
Index terms: Lavender, micropropagation, calcium.
INTRODUÇÃO
A Lavandula angustifolia Mill. (Lamiaceae),
popularmente conhecida como lavanda ou alfazema, é
considerada uma espécie medicinal e aromática de grande
importância econômica por constituir uma fonte rica de
componentes bioativos (GHELARDINI et al., 1999). Seu
óleo essencial, que contém geraniol, furfurol, linalol,
cariofileno, acetato de linalila e cumarinas (MARTINS et
al., 2000), é amplamente utilizado na perfumaria, muito
embora também seja empregado nas indústrias cosmética,
alimentícia e farmacêutica (BOELENS, 1995; CHEMAT et
al., 2006). Por exemplo, os compostos acetato de linalila e
linalol, que são os dois mais importantes constituintes
químicos do óleo essencial de L. angustifolia (JAGER et
(Recebido em 02 de fevereiro de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
Reduçãoda necrose apical e hiperidricidade de plantas ...
químicos do óleo essencial de L. angustifolia (JAGER et
al., 1992), possuem propriedades sedativa (BUCHBAUER
et al., 1991) e anestésica (GHELARDINI et al., 1999). Além
disso, o linalol tem efeito antibacteriano (PATTNAIK, 1997)
e inseticida (JAGER et al., 1992).
Na propagação de L. angustifolia por sementes,
observa-se desuniformidade no desenvolvimento das
mudas e das plantas a campo devido à variabilidade natural
resultante da propagação sexuada (BIASI & DESCHAMPS,
2009) e a propagação por estaquia tem sido dificultada
pela baixa capacidade de enraizamento das estacas (CALVO
& SEGURA, 1989). Uma alternativa para a propagação de
L. angustifolia é a micropropagação, pois a sua aplicação
tem possibilitado a obtenção de plantas, geneticamente
idênticas à planta matriz, em larga escala e em curto espaço
de tempo. Porém, seu sucesso depende do controle da
morfogênese, a qual é influenciada por vários fatores como
espécie, tipo de explante, componentes do meio nutritivo,
reguladores de crescimento e ambiente de cultivo
(CARVALHO et al., 2006).
O desajuste no controle desses fatores pode causar
desordens fisiológicas nas plantas cultivadas in vitro,
dentre as quais estão a necrose apical, que prejudica o
crescimento e pode causar a morte da planta e a
hiperidricidade, caracterizada por plantas com baixos níveis
de celulose e lignina, baixa resistência de parede celular
(KEVERS & GASPAR, 1986), hipertrofia celular (VIEITEZ
et al., 1985), baixo conteúdo de cálcio (KEVERS et al., 2004),
folhas intumescidas e quebradiças (LESHEM et al., 1988) e
reduzida taxa de sobrevivência em condições autotróficas
(RADMANN et al., 2001). Essas desordens podem estar
relacionadas com a deficiência de cálcio na planta in vitro.
O cálcio é essencial para manter a integridade
estrutural e funcional das membranas e da parede celular e
sua deficiência leva à senescência precoce (MALAVOLTA,
2006). Esse nutriente depende da transpiração da planta
para ser transportado, no xilema, até as regiões
meristemáticas de crescimento ativo (BIDDULPH et al.,
1959). Os frascos de cultura utilizados na micropropagação
retêm alta umidade relativa, suprimindo a taxa de
19
transpiração das brotações cultivadas in vitro, o que leva
à deficiência de nutrientes menos móveis. Dessa forma,
sugere-se que os sintomas de deficiência de cálcio na
micropropagação estejam relacionados com sua mobilidade
(BARGHCHI & ALDERSON, 1996). O enraizamento também
é prejudicado pela deficiência de cálcio, que afeta
particularmente os pontos de crescimento da raiz (VITTI
et al., 2006).
Protocolos de micropropagação de Lavandula spp.,
descritos anteriormente, relatam a ocorrência de
hiperidricidade nas brotações (ANDRADE et al., 1999;
DIAS et al., 2002; TSURO et al., 2000), porém não há
indicações para a solução desse problema. Em estudos
preliminares foram observadas necrose apical e
hiperidricidade das brotações de L. angustifolia in vitro,
limitando a obtenção de um protocolo eficiente. Diante
disso, este trabalho teve como objetivo avaliar diferentes
concentrações de cloreto de cálcio (CaCl2) no meio de
cultura sobre a necrose apical e hiperidricidade das
brotações micropropagadas de L. angustifolia.
MATERIAL E MÉTODOS
Ápices caulinares de aproximadamente 5,0 mm de
comprimento foram coletados de planta matriz de L.
angustifolia (Provence Blue proveniente da França)
mantida em vaso contendo solo como substrato em casade-vegetação, em março de 2008. A assepsia foi realizada
pela lavagem por uma hora em água corrente, seguida pelo
tratamento com Cercobin® (2%) por 40 minutos, imersão
em etanol (70%) por 20 segundos, hipoclorito de sódio
(1%) combinado com Tween-20 (0,2%) por 20 minutos sob
agitação e quatro lavagens em água deionizada e
esterilizada, sendo este procedimento realizado em câmara
de fluxo laminar.
Após a assepsia, os ápices meristemáticos foram
cultivados individualmente em frascos contendo 10 ml de
meio de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), 100
mg L-1 de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose, 0,5 µM de
BAP, 6 g L-1 de ágar (Vetec®) e o pH foi ajustado para 5,8.
Os meios de cultura foram esterilizados à temperatura de
20
MACHADO, M. P. et al.
121°C durante 20 minutos e 1,5 atm.
Para a manutenção das culturas in vitro, as
brotações obtidas no cultivo inicial foram subcultivadas a
cada 40 dias no mesmo meio de cultura anterior, porém
suplementado com 1,0 µM de BAP.
Brotações de 2,0 cm de altura, provenientes do
cultivo inicial, foram cultivadas em frascos de 250 ml
contendo 30 ml de meio de cultura MS, concentrações de
440, 880, 1320, 1760, 2200 e 2640 mg L-1 de CaCl2, 100 mg L-1
de mio-inositol, 30 g L-1 de sacarose, 1,0 µM de BAP, 6 g L-1 de
ágar (Vetec®) e o pH foi ajustado para 5,8. Os meios de
cultura foram esterilizados à temperatura de 121°C durante
20 minutos e 1,5 atm.
Foram realizadas duas avaliações a cada 40 dias.
As variáveis analisadas foram altura das brotações (cm),
número de folhas por brotação, número de brotação por
explante, porcentagem de hiperidricidade e porcentagem
de necrose apical.
Na fase de enraizamento, as brotações cultivadas
em meio de cultura de multiplicação com diferentes
concentrações de CaCl2 foram subcultivadas no mesmo
meio de cultura descrito anteriormente, mas sem a adição
de regulador de crescimento. Após 30 dias de cultivo, foram
avaliados a altura das plantas, número de raízes principais,
comprimento das raízes e porcentagem de enraizamento.
Para todos os experimentos, o delineamento
experimental foi em blocos ao acaso com quatro
repetições e quatro frascos por parcela com cinco
brotações por frasco. Os resultados foram submetidos
à análise de variância (ANOVA) e as médias foram
comparadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade.
Dados em porcentagem foram transformados em arc sen
“(x/100). O programa utilizado foi o ASSISTAT versão
7.5 beta (2008).
No primeiro subcultivo, as concentrações de
CaCl2 não influenciaram estatisticamente a altura das
brotações e o número de brotações por explante (Tabela 1).
Em estudos com Gypsophila paniculata L., observouse o crescimento lento das brotações com a utilização
de 3520 mg L-1 de CaCl2 no meio de cultura MS, sendo
associado ao excesso de cálcio ou à toxidez de cloro
(TAKANE et al., 1994). O número de folhas por brotação
foi influenciado pelas concentrações de CaCl2 nos dois
subcultivos, sendo que as concentrações de 2640 mg L-1 e
1320 mg L-1 foram significativamente superiores no
primeiro e segundo subcultivos, respectivamente
(Tabelas 1 e 2).
A altura das brotações sofreu efeito das
concentrações de CaCl2 no segundo subcultivo, sendo
obtida a altura média de 1,7 cm na concentração original
TABELA 1 - Efeito de CaCl2 na altura, número de folhas e brotações por explante de L. angustifolia, no primeiro
subcultivo, em meio de cultura MS suplementado com 1,0 µM BAP.
1
2
CaCl2 (mg L-1)
Altura (cm)1
Nº folhas2
Brotações/explante1
440
1,8 ± 0,38
7,8 ± 0,29 e
3,1 ± 0,22
880
2,4 ± 0,31
11,0 ± 1,86 b
2,5 ± 0,66
1320
2,4 ± 0,24
8,5 ± 0,95 d
3,0 ± 0,68
1760
2,5 ± 0,26
9,7 ± 0,14 c
3,0 ± 0,85
2200
2,3 ± 0,73
10,0 ± 2,30 c
3,0± 1,28
2640
2,7 ± 0,39
12,5 ± 1,78 a
2,0 ± 0,34
CV(%)
18,06
3,82
26,35
Dados não diferem estatisticamente pela analise de variância.
Letras seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Ducan a 5% de probabilidade.
21
TABELA 2 - Efeito de CaCl2 na altura, número de folhas e brotações por explante de L. angustifolia, no segundo
subcultivo, em meio de cultura MS suplementado com 1,0 µM BAP.
1
2
CaCl2 (mg L-1)
Altura (cm)2
N° folhas2
Brotações/explante1
440
1,7 ± 0,24 c
5,1 ± 0,58 c
2,1 ± 0,16
880
1,9 ± 0,21 bc
5,2 ± 0,68 c
2,7 ± 0,50
1320
2,7 ± 0,39 a
11,1 ± 1,23 a
2,3 ± 0,33
1760
1,5 ± 0,19 c
8,0 ± 1,63 b
2,2 ± 0,45
2200
1,9 ± 0,50 bc
9,0 ± 2,04 b
2,4 ± 0,43
2640
2,4 ± 0,17 ab
8,0 ± 0,36 b
2,8 ± 0,48
CV(%)
16,05
17,21
17,45
Dados não diferem estatisticamente pela análise de variância.
Letras seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Ducan a 5 % de probabilidade.
de CaCl 2 do meio de cultura MS, e de 2,7 cm na
concentração de 1320 mg L-1 (Tabela 2). Gypsophila
paniculata apresentou crescimento reduzido quando
verificada uma redução significativa da porcentagem de
cultivada em meio de cultura MS com 2640 mg L-1 de
cultura MS (440 mg L-1) nos dois subcultivos avaliados
CaCl2 (JUN TAKANE et al., 1994). Esse efeito do CaCl2
(Figura 1). A hiperidricidade é um fenômeno que afeta a
não foi observado em L. angustifolia, nos dois
anatomia, a morfologia e a fisiologia das plantas (ZIV,
subcultivos realizados, podendo ser observado pela altura
1996), podendo inviabilizar o processo de
das brotações e pelo número de folhas. A altura das
micropropagação devido à baixa sobrevivência das
brotações, no primeiro subcultivo, apesar de não haver
plantas na aclimatização. A redução da hiperidricidade
diferença estatística significativa entre as médias, foi de
com o aumento do cálcio no meio de cultura pode estar
-1
hiperidricidade nas concentrações mais elevadas de
CaCl2 em relação a concentração original do meio de
1,8 cm na concentração de 440 mg L e 2,7 cm na
relacionada com a razão Ca++/NH 4+ no meio, pois a
concentração de 2640 mg L-1. O número de folhas no
hiperidricidade pode ser induzida por uma proporção
primeiro subcultivo foi maior na concentração de
inadequada desses dois nutrientes (ZIV et al., 1987). Em
2640 mg L-1 (aproximadamente 13 folhas por brotação),
Dianthus caryophyllus L., observou-se uma redução
quando comparado com a concentração de 440 mg L-1
na porcentagem de hiperidricidade das brotações
(aproximadamente 8 folhas por brotação). No segundo
quando foi utilizada a metade da concentração dos
subcultivo, a altura das brotações e o número de folhas
macronutrientes do meio de cultura mantendo-se
-1
por brotação na concentração de 2640 mg L foram
somente a concentração normal de CaCl2 (ZIV et al.,
estatisticamente maiores do que na concentração de
1987). Cuzzuol et al. (1995), trabalhando com a mesma
440 mg L-1 (Tabelas 1 e 2).
espécie, eliminaram parcialmente a hiperidricidade com
No
segundo
subcultivo,
as
diferentes
o aumento de cálcio no meio de cultura, enquanto a
concentrações de CaCl2 também não influenciaram o
ausência de CaCl2 aumentou a hiperidricidade em 50%.
número de brotações por explante (Tabela 2).
Foram observados sintomas de hiperidricidade
A porcentagem de necrose apical das brotações
foi reduzida com o aumento de CaCl2 no meio de cultura
nas brotações de L. angustifolia cultivadas in vitro
no primeiro e no segundo subcultivo (Figura 2). Esses
(Figura 3A) em todos os tratamentos, porém foi
resultados evidenciam que a necrose apical, ocorrida nas
22
70
70
a
Segundo subcultivo
Primeiro subcultivo
a
60
Hiperidricidade (%)
60
Hiperidricidade (%)
50
40
b
30
b
b
20
c
50
40
b
b
30
b
b
20
c
d
10
10
0
0
440
880
1320
1760
CaCl2 (mg L-1 )
2200
2640
440
880
1320
1760
2200
2640
CaCl2 (mg L-1)
FIGURA 1 – Efeito de diferentes concentrações de CaCl2 na porcentagem de hiperidricidade das brotações de L.
angustifolia, no primeiro e segundo subcultivos. Barras: médias ± desvio padrão. Diferenças significativas (p < 0,05)
pelo teste de Duncan entre os tratamentos estão indicadas por letras diferentes.
20
40
a
a
18
Primeiro subcultivo
Segundo subcultivo
16
Necrose Apical (%)
Necrose Apical (%)
35
30
25
20
b
15
10
c
c
c
5
14
12
10
b
8
6
b
4
b
b
2
c
b
0
0
440
880
1320
1760
CaCl2 (mg L-1 )
2200
2640
440
880
1320
1760
2200
2640
CaCl2 (mg L-1 )
FIGURA 2 – Efeito de diferentes concentrações de CaCl2 na porcentagem de necrose apical das brotações de L.
angustifolia, no primeiro e segundo subcultivos. Barras: médias ± desvio padrão. Diferenças significativas (p < 0,05)
pelo teste de Duncan entre os tratamentos estão indicadas por letras diferentes.
FIGURA 3 – Brotações de L. angustifolia cultivadas in vitro. A) Brotações hiperídricas. B) Brotação com necrose
apical (seta). C) Brotações normais. Barras: 10 mm.
brotações de L. angustifolia in vitro (Figura 3B), pode
estar relacionada com a deficiência do cálcio nas
brotações. Abousalii & Mantell (1994) preveniram
completamente a necrose apical de Pistacia vera com
imersões periódicas das brotações em meio de cultura
líquido suplementado com cálcio. O cálcio apresenta
limitações, na sua translocação na planta intacta, que
podem ser observadas também in vitro. Como o cálcio
depende da transpiração da planta para seu transporte
no xilema, as condições de alta umidade do ar que se
estabelecem in vitro podem induzir deficiência de cálcio
em partes aéreas. A micropropagação de espécies mais
exigentes em cálcio pode requerer um aumento desse íon
no meio de cultura (CALDAS et al., 1998; SHA et al.,
1985).
Os resultados sugerem que a necrose apical de
L. angustifolia pode estar relacionada à deficiência de
cálcio e que o problema pode ser reduzido com o
aumento de cálcio no meio de cultura. Porém, o problema
não foi eliminado, visto que, mesmo sob altas
concentrações de cálcio, as condições in vitro não
favoreceram a transpiração e, provavelmente, a absorção
de cálcio (não houve diferença estatística). Assim, os
23
resultados também podem sugerir a influência de outros
fatores sobre a necrose apical e a senescência foliar
como o acúmulo de etileno no interior do frasco, a
sensibilidade da espécie a este acúmulo e a necessidade
de estudar e controlar outros fatores, além do cálcio
presente no meio de cultura, para eliminar
completamente esse problema e de reduzir a umidade
relativa no interior do frasco, favorecendo a transpiração
das plantas e reduzindo o acúmulo de etileno.
A altura das brotações cultivadas em meio de
cultura de enraizamento, isento de regulador de
crescimento, foi influenciada pelas diferentes
concentrações de CaCl2, sendo obtida a maior altura (3,8
cm) na concentração de 1320 mg L -1 , diferindo
estatisticamente da concentração de 440 mg L-1 (2,9 cm)
(Tabela 3).
O número de raízes principais e o comprimento
das raízes principais foram influenciadas pelas
concentrações de CaCl2. Na concentração de 2200 mg L-1,
houve uma redução no número de raízes, quando
comparado com as demais concentrações. E foram
obtidos os maiores comprimentos das raízes principais
nas concentrações de 880 e 1320 mg L-1 (1,9 e 1,8 cm,
respectivamente) (Tabela 3).
TABELA 3 - Efeito de CaCl2 na altura, número de raízes e comprimento das raízes principais de L. angustifolia, em meio
de cultura MS isento de regulador de crescimento.
CaCl2 (mg L-1)
Altura (cm)2
N° de raízes
principais2
Comprimento das
raízes principais2
Enraizamento (%)1
440
2,9 ± 0,08 c
1,8 ± 0,21 a
1,1 ± 0,16 bc
39,0
880
2,9 ± 0,32 c
1,9 ± 0,43 a
1,9 ± 0,26 a
22,8
1320
3,8 ± 0,41 a
2,1 ± 0,63 a
1,8 ± 0,43 a
30,5
1760
3,3 ± 0,09 b
2,2 ± 0,24 a
0,7 ± 0,08 c
37,5
2200
3,4 ± 0,06 b
1,1 ± 0,25 b
1,3 ± 0,50 bc
31,8
2640
3,6 ± 0,06 ab
2,0 ± 0,41 a
1,4 ± 0,42 ab
35,0
CV(%)
6,97
21,32
27,41
21,09
1
Dados não diferem estatisticamente pela análise de variância.
Letras seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Ducan a 5 % de
probabilidade.
2
24
Não houve efeito das diferentes concentrações
de CaCl2 na porcentagem de enraizamento (Tabela 3).
CONCLUSÕES
CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios
nutritivos, In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A.
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O aumento da concentração de CaCl2 no meio de
cultura MS reduziu significativamente a necrose apical e a
hiperidricidade das brotações micropropagadas de L.
angustifolia. O aumento na concentração de CaCl 2
apresentou efeito sobre o enraizamento, afetando o
comprimento e o número de raízes principais formadas. A
partir desse trabalho, sugere-se que mais estudos sejam
realizados, para que os problemas de necrose apical e a
hiperidricidade das brotações cultivadas in vitro de L.
angustifolia sejam eliminados.
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26
INDUÇÃO DE CALOSSANTOS,
in vitro
PARTIR
DE SEGMENTOS
M. R. A
A. dos
et al.
FOLIARES DE Coffea canephora CV. CONILON
In vitro INDUCTION OF CALLUS FROM LEAF SEGMENTS
OF Coffea canephora CV. CONILON
MAURÍCIO REGINALDO ALVES DOS SANTOS1; MARIA DAS GRAÇAS RODRIGUES FERREIRA1;
ARÊSSA DE OLIVEIRA CORREIA2; NEIDIANE FARIAS COSTA REIS2; MANUEL DE SOUZA SANTOS3
1
Pesquisador (a) – Embrapa Rondônia – BR 364, km 5,5, Zona Rural – 78900-970 – Porto Velho, RO – [email protected];
[email protected]
2
Mestre – Universidade Federal de Rondônia/UNIR – BR 364 km 9,5, Laboratório de Biogeoquímica Ambiental – 78900-500 – Porto
Velho, RO – [email protected]; [email protected]
3
Mestrando em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente – Universidade Federal de Rondônia/UNIR – BR 364 km 9,5, Laboratório
de Biogeoquímica Ambiental – 78900-500 – Porto Velho-RO – [email protected]
RESUMO
A espécie Coffea canephora Pierre ex Froehner cv.
Conilon possui características genéticas relevantes e que são de
amplo interesse em programas de melhoramento vegetal. O
objetivo desse trabalho foi avaliar a indução de calos em
segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon, visando a
facilitar seu posterior desenvolvimento em embriões ou na
formação de órgãos. Foram utilizados segmentos foliares dessa
cultivar. Os explantes foram inoculados em meio MS 50% (sais
e vitaminas) com diferentes concentrações de ANA (0,00, 5,37,
10,74 e 26,85 µM) e AIB (0,00, 4,92, 14,76 e 24,61 µM). Na
ausência de reguladores de crescimento, não foi observada
calogênese. O processo de indução de calos teve início na primeira
semana de cultivo. Aos 20 e 30 dias após a inoculação, observouse grande variação na calogênese entre os tratamentos; aos 40
dias, houve grande manifestação de indução de calos, ou seja,
todos os tratamentos com reguladores expressaram calogênese
em 100% dos explantes.
Termos para indexação: Café, reguladores de crescimento,
calogênese.
ABSTRACT
Coffea canephora Pierre ex Froehner. species cv. Conilon
presents relevant genetic characteristics for plant breeding
programs. The objective of this study was to evaluate the callus
formation from leaf segments of Coffea canephora cv. Conilon,
in order to facilitate its development in embryos or organ
formation. Leaf segments were used. The explants were
inoculated in MS 50% (half strength salts and vitamins) with
different concentrations of NAA (0.00, 5.37, 10.74 and 26.85
µM) and IBA (0.00, 4.92, 14.76 and 24.61 µM). The callus
formation was not observed on growth regulators free media.
The induction of callus initiated in the first week of culture.
After 20 and 30 days, a great variation between the treatments
was observed; after 40 days a great induction of callus occurred,
that is, all the treatments with regulators induced callus
formation in all the explants.
Index terms: Coffee, growth regulators, callus formation.
INTRODUÇÃO
O gênero Coffea apresenta aproximadamente 100
espécies de cafeeiros, mas apenas cinco são cultivadas
comercialmente, sendo que Coffea arabica L. (cafeeiro
Arábica) e C. canephora Pierre ex Froehner. (cafeeiro
Robusta) são as mais comercializadas (CARVALHO et al.,
2001).
No Brasil, a quase totalidade das lavouras cafeeiras,
genericamente conhecidas por Robusta, pertence à cultivar
Conilon, sendo o Espírito Santo o maior produtor nacional,
destacando-se ainda os Estados de Rondônia, Minas
Gerais, Mato Grosso, Bahia e Rio de Janeiro (MARTINS et
al., 2006). Um levantamento efetuado pela Companhia
Nacional de Abastecimento (CONAB) apontou que o Brasil
produziu, em 2006, 33 milhões de sacas beneficiadas de
café arábica e 9,5 milhões de sacas de robusta,
representando 77,7 e 22,3% da produção nacional
respectivamente (FASSIO & SILVA, 2007). O seu produto,
embora de qualidade pouco inferior ao de C. arabica em
relação à bebida, concorre no mercado internacional por
ser cotado a um menor preço e por seu emprego em misturas
e na indústria de café solúvel, já que permite alta extração
de sólidos solúveis (ANDREOLI et al., 1993).
Os programas de melhoramento genético do
cafeeiro no Brasil têm alcançado êxito na obtenção de
cultivares produtivas, elevando em cerca de 200% a
produtividade atual em relação à primeira variedade
(Recebido em 15 de maio de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
Indução de calos In vitro a partir de segmentos foliares ...
plantada no Brasil. Entretanto, o tempo e os recursos gastos
são fatores limitantes para o melhoramento do cafeeiro por
meio de métodos convencionais, uma vez que, nos últimos
anos, surgiram novos problemas como doenças, pragas,
nematóides e maior exigência em qualidade pelo mercado
consumidor (MENDES, 1997). Contudo, a micropropagação
vegetal in vitro surge como uma alternativa viável e de curto
prazo para a solução desses problemas (PALÚ et al., 2004).
Coffea canephora cv. Conilon possui
características genéticas relevantes e de amplo interesse
em programas de melhoramento vegetal, como a resistência
ao agente causador da ferrugem (Hemileia vastatrix Berk
et Br.), a elevada capacidade produtiva e resistência à seca,
devido ao grande desenvolvimento do seu sistema
radicular, menor exigência em fertilidade, elevada resistência
ao nematóide Meloidogyne exigua Gaeldi, 1887 e certo
grau de tolerância a M. incognita (Kofoid and White 1919)
Chitwood, 1949 (MARTINS et al., 2006).
No Coffea canephora, a fecundação é cruzada, desse
modo, as plantações apresentam-se desuniformes quando
observadas características vegetativas (porte, arquitetura,
ângulo dos galhos, formato e tamanho das folhas), de
produção (produtividade, tamanho, formato e maturação dos
frutos) e de susceptibilidade a doenças (PAULINO et al.,
1985). Essa variabilidade dificulta os tratos culturais e reduz a
produtividade. A qualidade do café Conilon pode ser
aumentada com a utilização da micropropagação de plantasmatrizes selecionadas através de técnicas de cultura de tecidos
vegetais in vitro (BRAGANÇA, 2001).
Essas técnicas têm sido utilizadas com sucesso na
multiplicação de espécies que apresentam dificuldades na
propagação sexuada pois, além de possibilitarem a
uniformidade genética do material, permitem a obtenção
de um grande número de plantas em pouco tempo
(SANTOS, 2008). Os trabalhos pioneiros em cultura de
tecidos em cafeeiro foram publicados por Staritsky (1970),
que obteve êxito na indução de calos a partir de folhas de
várias espécies. Após esse período, muitos trabalhos foram
realizados com a adoção de métodos e espécies diversas
(SANTOS, 2008).
27
A calogênese sofre influência de diversos fatores:
tipo de explante, composição do meio nutritivo e condições
físicas de incubação como luz e temperatura (PINTO &
LAMEIRA, 2001). O índice de divisão celular dos calos
pode elucidar as mudanças fisiológicas das células e auxiliar
a otimização dos protocolos de regeneração e
transformação genética (SERRA et al., 2000).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar a
indução de calos em segmentos foliares de Coffea
canephora cv. Conilon em relação a diferentes
combinações de reguladores de crescimento, visando a
facilitar seu posterior desenvolvimento em embriões
somáticos ou formação de órgãos.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório
de Cultura de Tecidos Vegetais da Embrapa Rondônia de
Porto Velho, utilizando segmentos foliares de plantas com
seis meses de idade de Coffea canephora cultivar Conilon
(clone nº 194, pertencente ao Programa de Melhoramento
da Embrapa Rondônia). Foram coletadas folhas do
segundo par dos ramos plagiotrópicos e a assepsia foi
realizada por meio da lavagem com esponja estéril em
água bidestilada estéril por 5 minutos, seguida de imersão
em etanol a 70% (v/v) por 1 minuto e em solução de
hipoclorito de sódio a 1,25% (v/v) por 30 minutos, com
três enxágües em água bidestilada estéril. As folhas foram
segmentadas em segmentos de 1 cm2 de forma que todos
os explantes contivessem uma porção da nervura central.
Estes foram inoculados em meio contendo 50% dos
minerais e vitaminas do meio MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962). O meio foi suplementado com 3% de
sacarose e 0,8% de ágar. Utilizou-se as concentrações
0,00, 5,37, 10,74 e 26,85 µM de ácido naftalenoacético
(ANA) e 0,00, 4,92, 14,76 e 24,61 µM de ácido indolbutírico
(AIB), em esquema fatorial 4 x 4, totalizando 16
tratamentos. O pH foi ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da
autoclavagem a 120°C e 1 atm, durante 20 minutos. Após
inoculação, os explantes foram mantidos no escuro, em
sala de crescimento, a 25 ± 1ºC, por um período de 40
28
SANTOS, M. R. A. dos et al.
dias. O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado com 16 tratamentos e 10
repetições. Observaram-se as variáveis, porcentagem de
indução de calos (%IC) e porcentagem da área foliar
coberta por células de calo (%AFCC). Foi utilizado o teste
de Tukey a 5% para comparação das médias.
Nos segmentos foliares de C. canephora
cultivados em meio de cultura sem reguladores de
crescimento, não foi observada calogênese. O processo
de indução de calos teve início na primeira semana de
cultivo quando observaram-se pontos que se expandiam
e recobriam a superfície dos explantes. A calogênese foi
observada tendo início nos locais em que as nervuras
foliares estavam em contato com o meio de cultura, o que
se deve ao fato de que o procâmbio contém células
meristemáticas (totipotentes) capazes de se diferenciar
em outros tipos celulares (TAIZ & ZEIGER, 2004).
Posteriormente, a formação de calos se expandiu para as
bordas dos explantes e, a partir daí, para a região central
dos mesmos (Figura 1).
Os tratamentos contendo 26,85 µM de ANA em
combinação com 14,76 ou 24,61 µM de AIB foram os
primeiros a induzir a calogênese. A média da porcentagem
de indução em 20 dias foi superior a 70% para todos os
tratamentos com auxina (Figura 2).
Aos 30 dias, os tratamentos que continham 4,92 µM
de AIB (na ausência de ANA); 5,37 µM de ANA em
combinação com 14,76 µM de AIB; e 10,74 µM de ANA (na
ausência de AIB) apresentaram 87,7% de indução de calos;
os demais tratamentos apresentaram 100% (Figura 3). Após
40 dias houve alta indução de calos, ou seja, todos os
tratamentos com hormônio manifestaram 100% de
calogênese. Este estudo demonstrou também que as
concentrações mais altas de reguladores utilizadas em alguns
tratamentos não tiveram efeito tóxico. A adição de auxinas
ao meio é essencial para a formação de calos nessa cultivar.
Resultados bastante inferiores foram obtidos por
Maciel et al. (2003) que testaram combinações fatoriais de
ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) e cinetina para a indução
de calos em explantes foliares de Coffea arabica cv. Obatã,
atingindo o valor máximo de 20% no meio suplementado
com 9,29 µM de cinetina, sem a adição de 2,4-D.
Costa et al. (2008) verificaram que a adição da auxina
ANA nas concentrações de 2,5 e 5,0 mg L-1 em Piper
hispidinervum C. DC. possibilitou os maiores percentuais
de formação de calos e que o tipo de explante usado teve
forte influência sobre esta variável. Nessas concentrações
de ANA, a formação de calos em segmentos foliares foi de
83,2 a 91,6%, valores significativamente superiores àqueles
observados para os segmentos internodais, que resultaram
em 43,1 e 49,6% de calogênese.
FIGURA 1 – Calos formados em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon após 20 (A) e 40 (B) dias de
cultivo.
29
100
90
80
%IC
70
60
50
40
30
20
10 dias
10
20 dias
26,85 ANA + 24,61 AIB
26,85 ANA + 14,76 AIB
26,85 ANA + 4,92 AIB
26,85 ANA
10,74 ANA + 24,61 AIB
10,74 ANA + 14,76 AIB
10,74 ANA + 4,92 AIB
10,74 ANA
5,37 ANA + 24,61 AIB
5,37 ANA + 14,76 AIB
5,37 ANA + 4,92 AIB
5,37 ANA
24,61 AIB
14,76 AIB
4,92 AIB
Controle
0
Concentrações (micromolar)
FIGURA 2 – Efeito dos tratamentos com auxina na indução de calos (IC) em segmentos foliares de Coffea canephora
cv. Conilon, aos 10 e 20 dias de cultivo.
100
90
80
% IC
70
60
50
40
30
20
10
30 dias
26,85 ANA + 24,61 AIB
26,85 ANA + 14,76 AIB
26,85 ANA + 4,92 AIB
26,85 ANA
10,74 ANA + 24,61 AIB
10,74 ANA + 14,76 AIB
10,74 ANA + 4,92 AIB
10,74 ANA
5,37 ANA + 24,61 AIB
5,37 ANA + 14,76 AIB
5,37 ANA + 4,92 AIB
5,37 ANA
24,61 AIB
14,76 AIB
4,92 AIB
Controle
0
40 dias
Concentrações (micromolar)
FIGURA 3 – Efeito dos tratamentos com auxina na indução de calos (IC) em segmentos foliares de Coffea canephora
cv. Conilon, aos 30 e 40 dias de cultivo.
30
Considerando que houve 100% de indução de calos
após 30 dias nos tratamentos que continham 26,85 µM de
ANA, na ausência de AIB ou em combinação com as
concentrações de 4,92, 14,76 e 24,61 µM deste regulador,
em comparação com outros resultados, pode-se constatar
a eficiência dessa concentração para desenvolvimento de
calos em segmentos foliares. Os tratamentos com 26,85
µM de ANA em combinação com 14,76 ou 24,61 µM de
AIB foram os que promoveram a indução mais rápida, já
observada com apenas 10 dias de cultivo. Esse estudo
mostra também que os tecidos foliares de C. canephora
cv. Conilon são altamente responsivos às auxinas para a
indução de calos.
Flores & Nicoloso (2006), ao estudar a indução de
calos em explantes de Pfaffia tuberosa (Maq. ex DC.)
Hicken, verificaram que explantes de origem foliar foram
os que proporcionaram os melhores resultados quando
cultivados em meio contendo 10,0 ìM da auxina 2,4-D. Dhar
& Joshi (2005) cultivaram vários tipos de explantes de
Saussurea obvallata (DC.) Sch. bip., e observaram
significativa influência do tipo primário de explantes
(hipocótilo, raízes, cotilédones e folhas) sobre a taxa de
formação de calos, sendo as folhas a melhor fonte, com
100% de calogênese na presença de 1,0 ìM de ANA e 2,5
ìM de benzilaminopurina (BAP).
Após 40 dias de inoculação, observou-se a
%AFCC (Tabela 1). Os tratamentos que apresentaram
explantes com porcentagens de AFCC acima de 25%
são os que contém ANA (5,37, 10,74 e 26,85 µM). Na
ausência de ANA, não se observou explantes com
porcentagens acima de 25% da área foliar coberta por
células de calo.
TABELA 1 – Porcentagem da área foliar coberta por células de calos (%AFCC) em segmentos foliares de Coffea
canephora cv. Conilon, em função dos tratamentos com auxina, 40 dias após inoculação.
Concentrações (µM)
%AFCC*
ANA
AIB
Sem indução
0-25%
25-50%
50-75%
75-100%
-
-
10a
0d
0
0
0
-
4,92
0
10a
0
0
0
-
14,76
0
10a
0
0
0
-
24,61
0
10a
0
0
0
5,37
-
0
9ab
1c
0
0
5,37
4,92
0
8bc
2b
0
0
5,37
14,76
0
9ab
1c
0
0
5,37
24,61
0
8bc
2b
0
0
10,74
-
0
8bc
2b
0
0
10,74
4,92
0
8bc
2b
0
0
10,74
14,76
0
8bc
2b
0
0
10,74
24,61
0
1d
8a
1b
0
26,85
-
0
8bc
2b
0
0
26,85
4,92
0
8bc
2b
0
0
26,85
14,76
0
7c
1c
2a
0
26,85
24,61
0
8bc
2b
0
0
*Valores seguidos por letras diferentes em cada coluna, diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a
5%.
A interação entre duas auxinas mostrou-se
importante no aumento da calogênese em explantes foliares
de C. canephora. Os únicos tratamentos que apresentaram
explantes com mais de 50% da AFCC foram 10,74 µM de
ANA + 24,61 µM de AIB e 26,85 µM de ANA + 14,76 µM de
AIB, sendo que o primeiro se destacou de todos os demais
apresentando 90% dos explantes com mais de 25% da
AFCC e 10% com AFCC acima de 50%. A interação entre
os dois reguladores de crescimento se mostrou importante
quanto a esta variável. É interessante observar que estas
auxinas são geralmente reconhecidas por seu papel no
enraizamento.
Quanto à concentração de AIB, também se
observou seu efeito na formação de calos, sendo que as
concentrações utilizadas nesse estudo foram ideais para a
indução de calo. A combinação de auxinas para indução
de calos em anteras de C. arabica ‘Rubi’ e ‘Acaiá Cerrado’
foi testada por Palú et al. (2004), que observaram as maiores
porcentagens de indução de calos na presença de 9,84 ìM
de AIB, na ausência de 2,4-D, com 3,89 ìM de 2,4-D
combinado com a concentração de 4,92 ìM de AIB e com
9,05 ìM de 2,4-D, na ausência de AIB. Porém, resultado
diferente foi relatado por Santos (2008), quando comparou
a atividade calogênica do explante foliar de C. canephora
cv. Apoatã, cultivado na presença de diferentes
concentrações de AIB, não observando diferença
31
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significativa entre os resultados. Contudo, utilizando AIB,
independente de sua concentração, em combinação com
2,4-D na concentração de 4,52 µM, observou-se aumento
de 19% na produção de calos.
CONCLUSÃO
Após as análises dos resultados, pode-se afirmar
que os tecidos foliares de C. canephora cv. Conilon, clone
194, são altamente responsivos às auxinas para indução
de calos. A presença de reguladores de crescimento no
meio de cultura é essencial quanto a este aspecto e a
interação entre as duas auxinas AIB e ANA é extremamente
positiva para a calogênese em explantes foliares destas
plantas.
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INDUÇÃO DE CALOS
EM
NERVURA
MEDIANA
Indução
de calos
em nervura mediana
de folhas ... DE FOLHAS NÃO
33
EXPANDIDAS DE PUPUNHEIRA (Bactris gasipaes Kunth.)
CALLUS INDUCTION IN MID-RIB OF NON EXPANDED
LEAVES OF PALM PEACH (Bactris gasipaes Kunth.)
MAURÍCIO REGINALDO ALVES DOS SANTOS1; MARIA DAS GRAÇAS RODRIGUES FERREIRA1; ARÊSSA DE
OLIVEIRA CORREIA2; JOSILENE FÉLIX DA ROCHA3; KEILA CRISTINA DE SOUZA CORREA3
1
Pesquisador (a) – Embrapa Rondônia – BR 364, km 5,5, Zona Rural – 78900-970 – Porto Velho, RO – [email protected];
[email protected]
2
Mestre – Universidade Federal de Rondônia/UNIR – BR 364 km 9,5, Laboratório de Biogeoquímica Ambiental – 78900-500 – Porto
Velho, RO – [email protected]
3
Graduanda em Ciências Biológicas – Faculdade São Lucas/FSL – BR 364, km 5,5, Zona Rural – 78900-970 – Porto Velho, RO –
[email protected]; [email protected]
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi induzir calos em segmentos
de nervura mediana de folhas não expandidas do palmito de Bactris
gasipaes Kunth., visando ao desenvolvimento de metodologia de
propagação in vitro que permita a produção uniforme e em larga
escala de mudas de variedades clonais dessa espécie. Os explantes
foram inoculados em meio MS, acrescido de 3% de sacarose,
0,8% de agar e combinações dos reguladores de crescimento 2,4D (0, 5, 10 e 20 µM) e 2iP (0, 9, 18 e 36 µM), em esquema
fatorial 4 x 4, totalizando 16 tratamentos. Os cultivos foram
mantidos no escuro a 24 ± 2º C. Aos 49 dias de cultivo, observouse indução de calos na maioria dos tratamentos empregados, sendo
que os mais responsivos foram as combinações: 5 µM de 2,4-D
+ 18 µM de 2iP; 10 µM de 2,4-D + 18 µM de 2iP; e 20 µM de
2,4-D + 36 µM de 2iP, nas quais obteve-se indução de calos em
todos os explantes. Observou-se também a porcentagem da área
do explante coberta por células de calo, a qual foi maior no meio
contendo 10 µM de 2,4-D + 18 µM de 2iP, onde a maioria dos
explantes apresentava 50 a 75%, além de alguns explantes com
75 a 100% da área coberta por células de calos. Os calos obtidos
neste trabalho serão subcultivados para testar combinações de
reguladores visando à indução de brotações e posterior regeneração
de plantas.
Termos para indexação: reguladores de crescimento, calogênese.
ABSTRACT
The objective of this work was to induce callus in
mid-rib segments of non expanded leaves from the heart of
palm of Bactris gasipaes Kunth., in order to development an
in vitro propagation system that allows the uniform
production of plantlets on large scale of clonal varieties of
these species. The explants were inoculated in MS medium,
supplemented with 3% sucrose and 0.8% agar, with
combinations of the growth regulators 2,4-D (0, 5, 10 and 20
µM) and 2iP (0, 9, 18 and 36 µM), in factorial design of 4 x 4,
totalizing 16 treatments. The cultures were maintained in the
dark at 24±2º C. After 49 days of culture, callus induction
was observed in most treatments with the most responsive
being the following combinations: 5 µM 2,4-D + 18 µM 2iP;
10 µM 2,4-D + 18 µM 2iP and 20 µM 2,4-D + 36 µM 2iP,
with calli developed in all explantes. The percentage of the
area of the explant covered with callus cells was also observed,
which was higher in the medium with 10 µM 2,4-D + 18 µM
2iP, where the majority of the explants presented 50 to 75%,
and some explants with 75 to 100%, of the area covered by
callus cells. The callus obtained in this work will be
subcultivated to test combinations of regulators in order to
induce shoot growth and plant regeneration.
Index terms: growth regulators, calogenesis.
INTRODUÇÃO
A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth.) é uma
espécie tropical, pertencente à família Arecaceae
(Palmaceae), sendo também conhecida como palma doce
ou pupunha no Brasil e pejibaye no Peru (BOVI, 1993).
Trata-se de uma palmeira de grande interesse econômico,
pois produz palmito de alta qualidade, podendo ser
cultivada como cultura agrícola racional e rentável, da qual
o palmito pode ser extraído anualmente (TOZETTI &
CONTEL, 2003). O palmito da pupunheira pode substituir
o da juçara (Euterpe edulis Mart.) e do açaí (E. oleracea
Mart.), cujos estoques naturais já estão bastante reduzidos
devido à exploração predatória (VILLACHICA, 1996). No
interior da Amazônia, constitui-se em uma valiosa e versátil
planta de subsistência. Tradicionalmente, os frutos são
cozidos em água com sal durante 30 a 60 minutos, sendo
em seguida descascados, partidos ao meio, extraída a
semente e consumidos. Outro uso para os frutos cozidos
(Recebido em 30 de julho de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
34
são preparações culinárias caseiras ou fabricação de
farinha e óleo de uso humano ou animal. Devido às suas
múltiplas possibilidades de utilização, essa espécie vem
despertando acentuado interesse por parte dos agricultores
(BRASIL, 2002).
Em virtude da excelente qualidade do palmito, seu
cultivo é cada vez mais frequente, com plantios em escalas
consideráveis no Pará, Acre, Rondônia e Mato Grosso.
Além disso, a cultura encontra-se em intenso processo de
disseminação fora da Amazônia, principalmente no Sudeste,
sendo plantada em praticamente todo o Estado de São
Paulo (ALMEIDA et al., 2005).
Além de ser ecologicamente correto seu cultivo, ainda
se tornou a principal fonte produtora de palmito, tanto para o
mercado interno quanto para o mercado externo, por apresentar
vantagens devido a características agronômicas importantes
em relação às demais produtoras de palmito, tais como:
precocidade, rusticidade, adaptabilidade e capacidade de
perfilhamento ao longo dos anos, fácil processamento, boa
produtividade e qualidade (FERNANDES et al., 2003;
HERNANDEZ et al., 2001).
A experimentação com palmeiras visando à produção
de palmito é diferente daquela destinada a frutos. Devido à
colheita periódica e constante, as plantas apresentam-se em
permanente estágio vegetativo, e a velocidade com que a
fitomassa cresce, após cada colheita, torna-se um indicador
da produtividade e da vida econômica do cultivo. Variáveis
relacionadas ao crescimento e à precocidade da planta são
fundamentais, visto que o produto, palmito, nada mais é do
que um conjunto de folhas imaturas envoltas pelas bainhas
das folhas mais velhas (CLEMENT, 1995).
Um dos problemas que tem dificultado a expansão
da cultura no Brasil é a ausência de campos de produção
de sementes onde sejam utilizadas plantas matrizes que
tenham superioridade agronômica para produção de
palmito (BERGO et al., 2002). Em termos de melhoramento
genético, independentemente do produto almejado
(palmito ou fruto), as formas convencionais de propagação
são extremamente lentas, podendo comprometer a eficiência
dos programas de melhoramento. O número limitado de
perfilhos inviabiliza a obtenção de grandes populações
genotipicamente idênticas às plantas selecionadas
(ALMEIDA & ALMEIDA, 2006; SOUZA et al., 1996).
Neste contexto, os métodos de propagação de
plantas in vitro podem ser uma ferramenta extremamente
promissora para subsidiar programas de melhoramento, pois
a micropropagação envolve a propagação vegetativa em
larga escala, uniforme e com alta qualidade fitossanitária.
Dessa forma, pode-se clonar uma determinada planta que
reúna características de interesse no melhoramento, sem as
dificuldades apresentadas pela propagação convencional
(GRATTAPLAGLIA & MACHADO, 1998).
Pesquisadores de Costa Rica, Brasil e Peru estudam a
viabilidade da obtenção de clones de pupunheira por meio de
cultivo in vitro. Palmeiras, em geral, são difíceis de propagar
dessa forma, com poucos genótipos se adaptando a este tipo
de cultivo. O desenvolvimento de métodos de propagação
vegetativa é essencial, tanto por técnicas in vitro como por
métodos convencionais. Estes últimos devem ser
aperfeiçoados, pois a taxa de sucesso é de apenas 10%. Os
métodos in vitro são mais complicados, mas em médio prazo
são mais importantes, porque têm potencial para multiplicar
genótipos com maior rapidez, permitindo assim a instalação
de ensaios de clones em todas as regiões produtoras do Brasil.
Esses ensaios, por sua vez, identificarão genótipos adaptados
a cada região, que podem ser distribuídos aos produtores de
sementes, reduzindo a necessidade futura de se importarem
sementes (CLEMENT & BOVI, 1999).
A propagação por meio de cultura de tecidos
vegetais pode ser feita por via direta ou indireta. Esta última
ocorre por meio da formação de calos, que é considerada
uma forma potencial de propagação em massa. O cultivo
de calos pode ser utilizado para se estudar o
desenvolvimento celular, explorar produtos provenientes
do metabolismo primário e secundário e obter suspensões
celulares e propagação via formação de gemas ou embriões
somáticos (LANDA et al., 2000). Estudos com calos devem
ser desenvolvidos para determinar as condições de cultura
que os explantes requerem para sobreviver e crescer
(SANTOS et al., 2005). A calogênese tem sido utilizada
Indução de calos em nervura mediana de folhas ...
35
para propagação em massa de diversas espécies por meio
da formação de múltiplas brotações ou da embriogênese
somática, respostas morfogênicas a partir das quais é
possível produzir plântulas com excelentes carracterísticas
agronômicas (TSURO et al., 2000).
Potencialmente, a indução de calos ocorre em
qualquer tecido vegetal, porém, são mais suscetíveis
tecidos com células meristemáticas (totipotentes) capazes
de se diferenciar em outros tipos celulares. A calogênese
em folhas geralmente tem início nas nervuras foliares, o
que se deve ao fato de que o câmbio vascular contém
células meristemáticas (GRATTAPAGLIA & MACHADO,
1998; TAIZ & ZEIGER, 2004).
O objetivo do presente trabalho foi estabelecer um
protocolo eficiente para indução de calos em explantes de
nervura mediana de folhas não expandidas do palmito de
Bactris gasipaes, visando subsidiar o desenvolvimento
de metodologia de propagação in vitro para a produção
clonal da espécie.
sacarose, 0,8% de agar (Cial®), com a adição de combinações
MATERIAL E MÉTODOS
TABELA 1 – Combinações de reguladores de crescimento
(2,4-D e 2iP) utilizadas para indução de calos em explantes
de nervura mediana de folhas de B. gasipaes.
Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório
de Cultura de Tecidos Vegetais da Embrapa Rondônia, em
Porto Velho. As coletas de material vegetal foram realizadas
na coleção de germoplasma de pupunheira mantida atualmente
no Campo Experimental dessa Unidade. Retiraram-se duas
camadas de bainhas que envolvem o palmito, o qual foi cortado
em estruturas de aproximadamente 15 cm de comprimento x 5
cm de diâmetro. Esse material foi lavado em água corrente
com auxílio de esponja e detergente e imerso em etanol a 70%
(v/v) durante 1 minuto e em solução de hipoclorito de sódio a
1,25% (v/v) durante 20 minutos. Após esse procedimento, em
câmara de fluxo laminar, os palmitos foram lavados três vezes
em água destilada e autoclavada. Em seguida, o restante das
bainhas e das folhas não expandidas do palmito foram retiradas
até que ficasse somente a nervura mediana, utilizando-se os 7
cm acima do ponto onde inicia-se o ápice caulinar. A nervura
mediana foi cortada em forma de cubos de aproximadamente
0,245 cm3 (0,7 cm de largura, 0,7 cm de profundidade e 0,5 cm
de altura), os quais foram inoculados em meio MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 3% de
fatoriais de 2,4-D (0; 5; 10; 20 µM) e 2iP (0; 9; 18; 36 µM)
(Tabela 1). O pH foi ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da
autoclavagem a 120°C e 1 atm durante 20 minutos. Os
tratamentos foram dispostos em delineamento inteiramente
casualizado em esquema fatorial 4 x 4, totalizando 16
tratamentos, com cinco repetições, sendo cada repetição
representada por quatro tubos de ensaio contendo um
explante cada. Após a inoculação, os explantes foram mantidos
no escuro a 25 ± 1ºC. As avaliações foram realizadas, em
intervalos de 7 dias, durante os 49 dias subseqüentes à
inoculação, avaliando-se a porcentagem de indução de calos
e a área de cada explante coberta por células de calo. Os
dados foram submetidos à análise de regressão polinomial
para avaliar a indução de calos em função das diferentes
combinações de reguladores de crescimento utilizadas. As
análises estatísticas foram realizadas com o auxílio dos
programas SAS/Stat e SISVAR versão 3.01.
Tratamentos
2,4-D (µM)
2iP (µM)
1
0
0
2
5
0
3
10
0
4
20
0
5
0
9
6
5
9
7
10
9
8
20
9
9
0
18
10
5
18
11
10
18
12
20
18
13
0
36
14
5
36
15
10
36
16
20
36
36
quais não foi observada indução de calos. Conforme
Nos segmentos de nervura mediana de B. gasipaes
inoculados na ausência de reguladores de crescimento,
ou seja, no tratamento controle, não foi observada
calogênese (Figura 1). O processo de indução de calos
teve início aos 30 dias de cultivo após a inoculação, sendo
que os explantes apresentaram intumescimento, indicando
desta forma o início do processo de indução de calos. Os
fatores concentrações de 2,4-D e 2iP, isoladamente e em
interação, afetaram significativamente (P<0,05) a variável
porcentagem de indução de calos nos explantes. Na análise
de regressão, o modelo que melhor se ajustou à relação
porcentegem de indução de calos em função das
combinações de reguladores foi o polinomial quadrático,
com valores para R2 variando de 0389 a 0,95.
Aos 49 dias de cultivo, todos os tratamentos foram
eficientes para a formação de calos, com exceção dos
tratamentos 1 (sem reguladores de crescimento), 3 (10
pode-se observar, a combinação dos dois reguladores
µM de 2,4-D), 5 (9 µM de 2iP) e 9 (18 µM de 2iP), nos
foi positiva para a indução de calos. Quando se utilizou
apenas 2,4-D (0, 5, 10 e 20 µM), somente a concentração
de 20 µM de 2,4-D induziu à formação de calos, em 65%
dos explantes, não havendo indução nos outros três
tratamentos. Da mesma forma, quando se utilizou 2iP
isoladamente, apenas os tratamentos com 9 e 36 µM deste
regulador levaram à formação de calos, mas em apenas
25% dos explantes. Os tratamentos 10 (5 µM de 2,4-D +
18 µM de 2iP), 11 (10 µM de 2,4-D + 18 µM de 2iP) e 16 (20
µM de 2,4-D + 36 µM de 2iP) resultaram em 100% de
indução de calos (Figura 1), o que pode ser explicado
devido ao fato dos níveis de citocininas e auxinas
promoverem um balanço hormonal que pode estimular o
crescimento da planta (PALÚ et al., 2004). Como se pode
inferir pela observação dos resultados apresentados na
Figura 1, o balanço hormonal indicado seria 18 µM de 2iP
e concentrações entre 5 e 10 µM de 2,4-D.
120
y = -0,68x 2 + 17,61x - 7,91
R2 =0,89
Porcentagem de indução de calos (%)
100
80
y = -0,33x 2 + 10,16x + 28,41
R2 =0,94
60
40
y = 0,14x 2 -1,20x + 27,05
R2 =0,94
20
y = 0,30x 2 - 2,78x + 1,77
R2 =0,95
0
0 µM 2iP
9 µM 2iP
-20
0
5
10
Concentrações de 2,4 (µM)
20
FIGURA 1 – Efeito de concentrações de 2,4-D e 2iP sobre a porcentagem de indução de calos em B. gasipaes, 49 dias
após a inoculação.
A porcentagem da área do explante coberta por
células de calo comportou-se de maneira diferenciada nos
tratamentos utilizados. Na maioria dos tratamentos, esta
área correspondeu à faixa de 0 a 25%. Os tratamentos 15
(10 µM de 2,4-D + 36 µM de 2iP) e 16 (20 µM de 2,4-D + 36
µM de 2iP) apresentaram, em sua maioria, explantes com
porcentagens na faixa de 25 a 50%. O tratamento 11 (10 µM
de 2,4-D + 18 µM de 2iP) foi o mais eficiente, com base na
porcentagem da área foliar coberta por células de calo,
com porcentagens de 50 a 75% e alguns explantes com 75
a 100%. No tratamento controle, sem reguladores de
crescimento, não houve desenvolvimento, ocorrendo
necrose (morte celular) de todos os explantes (Tabela 2).
Em todos os casos, os calos observados foram do
tipo friável. As concentrações de cada um dos reguladores
de crescimento determinam o tipo de calo induzido e sua
distribuição no explante. Como relatado anteriormente, o
tratamento 11, que combinou concentrações de 10 µM de
2,4-D + 18 µM de 2iP, resultou na maior porcentagem da área
do explante coberta por células de calo. A morfogênese e o
crescimento vegetal são regulados pela interação, pelo
balanço entre reguladores de crescimento adicionados ao
meio e pelos níveis endógenos, produzidos nas células
cultivadas in vitro. Em geral, concentrações semelhantes de
auxina e citocinina, no meio de cultura, promovem a formação
de calos, entretanto, as respostas à interação dessas classes
37
de reguladores podem variar de acordo com as condições da
cultura, tipo de explante e genótipo da planta (CORDEIRO et
al., 2007). Na calogênese, os reguladores de crescimento agem
sobre a expressão gênica, de forma sinérgica ou não, fazendo
com que, a partir de células de tecidos organizados e
diferenciados, se forme uma massa de células com
características meristemáticas cujo crescimento é, geralmente,
muito rápido e irregular (SANTOS, 1998).
A interação entre auxinas e citocininas, em
concentrações similares, tem sido muito utilizada para a
indução de calos em diversas espécies, embora alguns
trabalhos relatem a utilização de altas concentrações de
auxinas e baixas de citocininas, resultando em grande
proliferação celular e posterior indução de calos, ou ainda a
indução de calos apenas com auxinas no meio de cultivo
(FLICK et al., 1983; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Arias & Huete (1983) relatam que a auxina 2,4-D
tem um efeito estimulador na formação de calos na
pupunha. Em estudo realizado com ápices caulinares,
segundo os autores, a formação de calos foi induzida por
concentrações de 20 a 50 mg L-1 de 2,4-D em dois meses de
cultivo. Após os dois meses iniciais, os explantes foram
transferidos para meio sem reguladores e em alguns cultivos
se observaram embriões que, aos cinco meses de
desenvolvimento, geraram vários brotos apicais com um
sistema radial.
TABELA 2 – Porcentagens da área do explante coberta por células de calo em relação às diferentes combinações
reguladores de crescimento em explantes de B. gasipaes aos 49 dias de cultivo.
Tratamentos T1* T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9* T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16
Sem calos
0
2
8
3
2
1
2
3
0
0
0
1
7
1
1
0
0-25%
0
6
0
5
6
7
6
4
0
8
2
1
1
5
2
0
25-50%
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
3
0
1
4
6
50-75%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
2
1
1
1
2
75-100%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1
0
0
0
0
*100% de necrose dos explantes.
38
Ferreira & Pasqual (2008), trabalhando com a figueira
cultivar Roxo de Valinhos, relatou a formação de calos em
segmentos caulinares apenas nos tratamentos que
continham auxinas. Por outro lado, Santos et al. (2000)
verificaram a influência positiva da relação auxina/citocinina
em ensaios envolvendo indução de calos em cultivares de
cafeeiro, assim como Cunha & Ferreira (1996) e Gomes
(1999), que observaram uma eficiente calogênese em
explantes de Maclura tinctoria D. Don ex Stend. e Linun
usitatissimum L., respectivamente, devido à interação entre
esses reguladores.
Vidal et al. (2005), trabalhando com explantes de
cultivares de algodão em meio MS suplementado por
combinações de 2iP e 2,4-D, observaram que, dentre os
tratamentos testados, o que produziu maior número de
explantes com calos foi a combinação de 0,1 mg L-1 de 2,4-D
com 0,5 mg L-1 de 2iP.
A interação da auxina 2,4-D com a citocinina 2iP
mostrou importância na indução de calos para os explantes
de B. gasipaes, sendo que os tratamentos mais responsivos
(com maior porcentagem de indução de calos) foram
aqueles que combinaram esses dois reguladores, obtendose 100% de indução. Nos tratamentos nos quais havia
apenas citocinina ou apenas auxina, os explantes foram
menos responsivos, mostrando que esses explantes, para
maior obtenção de calos, dependem da combinação dos
dois reguladores de crescimento.
Os calos obtidos neste trabalho serão
subcultivados para testar combinações de reguladores
visando à indução de brotações e posterior regeneração
de plantas, subsidiando o desenvolvimento de
metodologia de propagação in vitro para a produção clonal
de B. gasipaes.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos permitem concluir que, para
indução de calos em nervura mediana de folhas não
expandidas de pupunheira, foram eficientes as
combinações: 5 µM de 2,4-D + 18 µM de 2iP; 10 µM de
2,4-D + 18 µM de 2iP; e 20 µM de 2,4-D + 36 µM de 2iP, nas
quais obteve-se indução de calos em todos os explantes.
A maior porcentagem da área do explante coberta por
células de calo foi obtida no meio contendo 10 µM de
2,4-D + 18 µM de 2iP, no qual maior parte dos explantes
apresentou 50 a 100% da área coberta por células de calos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq pelo
financiamento da pesquisa e pela concessão de bolsa de
Iniciação Científica.
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40
INFLUÊNCIA DE ANA E BAP
E DA
MODALIDADE
DE CULTIVO
SOUZA,
C. S. et
al.
in vitro DE TAIOBAS (Xanthosoma sagittifolium (L.) SCHOTT)
INFLUENCE OF NAA AND BAP AND METHODS FOR in vitro
GROWTH OF TANNIA (Xanthosoma sagittifolium (L.) SCHOTT)
CRISTINA SOARES DE SOUZA1; FERNANDO LUIZ FINGER2; ADILSON RICKEN SCHUELTER3
1
Doutoranda em Genética e Melhoramento – Universidade Federal de Viçosa/UFV – Campus Universitário, Departamento de
Fitotecnia – 36570-000 – Viçosa, MG – [email protected]
2
Professor Associado – Universidade Federal de Viçosa/UFV – Campus Universitário, Departamento de Fitotecnia – 36570-000 –
Viçosa, MG – [email protected]
3
Pesquisador – Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola/COODETEC – Rod. BR467 km 98 – 85813-450 – Cascavel, PR –
[email protected]
RESUMO
Objetivou-se com o presente trabalho estabelecer
protocolos rotineiros para propagar dois acessos (Roxa e BGH/
UFV5932) de taioba originados de brotos de rizoma, cultivados
em meio semissólido e líquido, com diferentes concentrações de
ANA e BAP. Para avaliar o crescimento das plântulas, foi
determinado o número de brotações (NB), comprimento da parte
aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), bem como a matéria
fresca total (MF) e a matéria seca total (MS). O comprimento
das raízes foi estimulado por BAP, e o maior desenvolvimento da
parte aérea foi obtido na presença da auxina ANA. O BAP induziu
maior número de brotações, com maior produção de plântulas
para o acesso BGH/UFV5932 na concentração de 8,88 µM em
meio líquido com agitação e meio semissólido; e de 6,66 µM em
meio líquido estacionário. Para a variedade Roxa, maior número
de brotos foi obtido quando 6,66 µM foram aplicados em meio
líquido com agitação e meio semissólido; e 4,44 µM foram
acrescidos em meio líquido estacionário. A presença de citocinina
no cultivo in vitro surte efeitos positivos na formação de raízes e
brotos de taioba. O acesso BGH/UFV5932, em presença de BAP
apresenta maior eficiência em gerar mudas, comparado a variedade
Roxa. O meio líquido pode ser adotado para multiplicação in
vitro de taioba.
Termos para indexação: Taioba, Reguladores de crescimento,
Propagação in vitro.
ABSTRACT
The objective of the present work was to establish
protocols for the propagation of two accessions of tannia (Roxa
and BGH/UFV 5932) from rhizome buds, grown in semisolid
and liquid media containing different concentrations of NAA and
BAP. Shoot number (NB), length of aerial portion (CPA), root
length (CR), total fresh weight (MF) and total dry weight (MS)
were determined in order to evaluate plantlet growth. Root length
was stimulated by BAP, while the shoot growth was higher in
the presence of NAA. BAP induced a larger number of shoots,
with higher yield of plantlets for the accession BGH/UFV 5932
at concentration of 8.88 mM in liquid media under shaking and
semisolid media; similar to 6.66 mM in liquid media without
shaking. For the variety Roxa, the larger number of shoots was
obtained using 6.66 M BAP in liquid media with shaking and in
semisolid media; and 4.44 mM BAP in liquid media without
shaking. The addition of cytokinin induced positive effects for in
vitro growth of roots and shoots in tannia. The accession BGH/
UFV 5932, in the presence of BAP, presented higher efficiency
in generating plantlets compared to the Roxa variety. The results
indicate that liquid media may be used for in vitro multiplication
of tannia.
Index terms: Tannia, Growth regulators, In vitro propagation
INTRODUÇÃO
A espécie Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott,
originária das regiões tropicais da América do Sul e
popularmente conhecida como taioba, é uma espécie
monocotiledônea, pertencente à família Araceae e
considerada hortaliça folhosa e herbácea rizomatosa
(SEGANFREDO et al., 2001). As folhas e rizomas dessa
planta são aproveitados na alimentação, sendo fonte de
vitamina A e C, ferro, potássio, cálcio e manganês
(OMOKOLO et al., 2003). No Brasil, apesar da cultura ser
pouco explorada, há comércio regular de suas folhas nos
Estados da Bahia, Rio de Janeiro, Minas Gerais e Espírito
Santo, nos quais diversas variedades são cultivadas
destacando-se a Taioba Comum, a Taioba Roxa e a BGH/
UFV 5932.
A falta de órgãos de propagação tem dificultado a
implantação das culturas de propagação vegetativa, uma
vez que a propagação convencional por rizomas exige muito
tempo, sendo onerosa pelo grande volume a transportar, e
(Recebido em 01 de outubro de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p.40-48, 2010
Influência de Ana e Bap e da modalidade de cultivo in vitro ...
a necessidade de grandes áreas destinadas à produção
dos órgãos de propagação (CARVALHO & CORDEIRO,
1990). Métodos alternativos de propagação rápida podem
solucionar o problema dessa escassez e reduzir o tempo
de produção, bem como os custos de produção.
Além disso, uma nova demanda para folhas e
material propagativo vem aumentando em países como os
E.U.A. devido à grande presença de imigrantes brasileiros
(MANGAN et al., 2008; SILVA, 2007). Esse novo mercado
exigirá a produção de material originado de propagação
assexual, principalmente de propagação in vitro, que provê
uma produção em larga escala e de maneira rápida para
atender às necessidades dos fazendeiros, com plantas
uniformes e livres de doenças. Porém, as respostas para
micropropagação variam grandemente em função do
genótipo, estado fisiológico, concentrações endógenas
de hormônios nos explantes e da composição do meio de
cultivo (KOZAY et al., 1997). Assim, há a necessidade para
desenvolver a composição do meio de cultivo ideal, com
concentração ótima de nutrientes e reguladores de
crescimento, devendo esse meio propiciar os nutrientes
necessários ao metabolismo das células vegetais em cultivo
para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos
(FOGAÇA et al., 2007).
A adição de reguladores de crescimento ao meio de
cultivo, em particular das auxinas e citocininas, estimula a
formação de raízes laterais e adventícias e a formação de
brotações, respectivamente (CARVALHO et al., 2006). O
ácido naftalenoacético (ANA) é uma auxina sintética com
capacidade de induzir a formação de raízes in vitro (LIMA
et al., 2002). A 6-benzilaminopurina (BAP) é uma citocinina
sintética extensamente usada em cultura de tecidos para
estimular a formação de grande número de brotos,
proporcionando assim, rápida multiplicação dos explantes
(TORRES et al., 2001). A utilização desses fitorreguladores
supre as deficiências naturais dos níveis endógenos
observados em explantes desenvolvidos por
micropropagação (CARVALHO et al., 2006).
O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos
rotineiros para propagar dois acessos (Roxa e BGH/UFV
41
5932) de taioba originados de brotos de rizoma e cultivados
em meio semissólido e líquido, com diferentes
concentrações de ANA e BAP.
MATERIAL E MÉTODOS
Material Vegetal
Rizomas de plantas maduras de taioba (Xanthosoma
sagittifolium), cultivares Roxa e BGH/UFV 5932,
provenientes do Banco de Germoplasma de Hortaliças da
Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas
Gerais, foram assepticamente lavados e seccionados para
remoção das gemas, subsequentemente cultivados em
meio de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) em
ausência de reguladores de crescimento. Cinco subcultivos
foram realizados durante o período de doze meses visando
obter as brotações empregadas no presente trabalho.
Efeito do ANA no Enraizamento e Alongamento e do BAP
nas Brotações Múltiplas de Taioba
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado em arranjo fatorial 2x3x9, sendo testadas duas
variedades (Roxa e BGH/UFV 5932); três tipos de meio
quanto à natureza física (semissólido, líquido estacionário
e líquido com agitação) e nove concentrações de
reguladores de crescimento (controle; ANA - 1,34; 2,68;
4,02 e 5,36 µM; BAP - 2,22; 4,44; 6,66 e 8,88 µM). As
unidades experimentais foram constituídas de 1 brotação
por repetição, totalizando 4 repetições.
Após o quinto subcultivo, brotações das
variedades Roxa e BGH/UFV 5932, com aproximadamente
2 cm, passaram por um processo de remoção da parte aérea
e do sistema radicular (ARIMURA, 2000), sendo então,
inoculadas em meio MS, variando-se a concentração de
reguladores de crescimento e o tipo de meio quanto à
natureza física.
Os meios de cultura com natureza semissólida foram
obtidos pelo emprego de Fitagel (2,3 g/L), em tubos de ensaio
(22 x 150 mm), contendo 12 mL de meio. Os meios de cultura
de natureza líquida (ausência de agente geleificante) foram
mantidos na condição estacionária e com agitação (mesas
agitadoras orbitais Modelos – TE 140 e 109) em frascos de
42
SOUZA, C. S. et al.
vidro de 300 mL contendo 20 mL de meio de cultivo, eram
completados à medida que as plantas íam crescendo. Não
foi utilizado nenhum tipo de suporte das plantas e a
velocidade de agitação dos tratamentos foi de 80 rpm.
Em todos os experimentos, o pH dos meios foi
ajustado a 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem. Conduziramse os experimentos em regime luminoso de 16 horas luz e 8
horas diárias de escuro à temperatura de 25 ± 1ºC e
irradiância de 50-60 µmol m-2 s-1.
CARNEIRO, 2007; REZENDE et al., 2008). Além disso, os
crescimento x variedades x meios de cultivo, também foi
estatisticamente significativa.
A adição dos fitorreguladores auxina e citocinina
ao meio de cultura é procedimento normal por promover o
crescimento e o desenvolvimento organizados no tecido
da planta (GASPAR et al., 1996). A presença de reguladores
de crescimento, principalmente as citocininas, favorece o
processo de microtuberização em Xanthosoma
sagittifolium (OMOKOLO et al., 2003). Porém, durante as
avaliações deste experimento, não foi observada formação
de microrrizomas, provavelmente pela curta permanência
das plântulas in vitro perfazendo 60 dias.
O enraizamento está associado ao suprimento
adequado de auxinas. Segundo Souza & Pereira (2007), um
dos fatores mais importantes relacionados ao processo de
formação de raízes adventícias in vitro é inerente à presença
e/ou ausência de auxina. Naves (2003) detectou inibição
da formação de raízes nos explantes de bromélias em meio
de cultura com BAP, sendo estimuladas por ANA. Pathak
et al. (2009), estudando o efeito de reguladores de
crescimento na multiplicação e enraizamento in vitro de
variedades de cana-de-açúcar, obtiveram até 95% de
enraizamento utilizando ANA. Quirino et al. (1996) relataram
que a presença de BAP prejudicou, sensivelmente, o
crescimento das raízes, sendo os maiores comprimentos
encontrados na ausência dessa citocinina. Entretanto, na
variedade BGH/UFV 5932 mantida em meio líquido com
agitação (Tabela 1), a raiz teve maior crescimento (19,25
cm) com 4,44 µM de BAP, além disso, em meio líquido na
forma estacionária (Tabela 2) e em meio semissólido
(Tabela 3), o meio basal promoveu alongamento das raízes
(21,50 e 12,38 cm, respectivamente). Carneiro et al. (1999)
não utilizou auxina em Cryptanthus sinuosus, Neoregelia
dados não mostraram distribuição homogênea, sendo
cruenta e Quesnelia arvensis, obtendo enraizamento em
transformados pela equação: raiz quadrada de (X + 1,0)
meio MS. De acordo com Souza & Pereira (2007), há
(BIANCONI et al., 2008; GRAVINA et al., 2004).
espécies que enraízam com facilidade e não necessitam da
Diferenças significativas foram encontradas para
as concentrações de reguladores de crescimento para
todos os caracteres morfológicos avaliados, para as
variedades e meios de cultivo. A interação reguladores de
presença de auxinas, o que pode ser explicado pelo elevado
Variáveis Quantificadas
Para avaliar o desenvolvimento das plântulas, após
60 dias de cultivo foram determinados o número de
brotações (NB), o comprimento da parte aérea (CPA), o
comprimento da raiz mais longa (CR), além da matéria fresca
total (MF) e da matéria seca total (MS). Para essa última, as
plântulas foram submetidas durante 72 horas em estufa
com temperatura controlada de 65ºC.
Análise Estatística
Os dados foram submetidos à análise de variância
pelo software Sisvar versão 5.1 (FERREIRA, 2008) e para a
comparação das médias dos tratamentos utilizou-se do teste
Scott-Knott a 5% de probabilidade. A transformação
realizada em todas as variáveis foi raiz quadrada de
(X + 1,0) (BIANCONI et al., 2008; GRAVINA et al., 2004).
Os coeficientes de variação, na análise de variância,
oscilaram entre 30 e 50%, que podem ser considerados
estatisticamente elevados (CLEMENTE & MUNIZ, 2000;
STORCK et al., 2002). Porém, esse tipo de variação é comum
em cultura de tecidos (RADMANN et al., 2003; RAMOS &
nível endógeno desses fitohormônios.
Na variedade Roxa foram observadas raízes maiores
em presença de citocinina nas três formas de meio de cultura.
43
Assim, quando a variedade Roxa foi crescida em meio líquido
sob agitação (Tabela 4), a concentração de 2,22 µM de BAP
foi mais eficiente (23,13 cm). Já em meio líquido estacionário
(Tabela 5) e semissólido (Tabela 6) a melhor concentração
foi 4,44 µM de BAP (19 e 12,13 cm, respectivamente). Pereira
et al. (2000) obtiveram resultados similares na indução de
raízes adventícias in vitro em plântulas de Echinodorus
scaber Rataj. quando estas foram cultivadas em meio MS
suplementado somente com a citocinina 6-benzilaminopurina
(BAP) na concentração de 1,00 mg L-1. De acordo com Souza
& Pereira (2007), a adição de citocininas ao meio de cultura
também podem favorecer o enraizamento adventício.
TABELA 1 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba BGH/UFV
5932 em meio Líquido sob Agitação (LA) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da
parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)].
RC (µM)
NB
CPA
CR
MF
MS
Médias
Médias
Médias
Médias
Médias
0
1,00
c
6,75
a
7,63
b
1,56
b
0,10
b
1,34/ANA
2,00
c
8,13
a
17,88
a
3,74
a
0,22
a
2,68/ANA
2,00
c
9,13
a
17,75
a
4,17
a
0,21
a
4,02/ANA
3,00
c
4,13
b
2,00
c
1,02
b
0,06
b
5,36/ANA
5,00
b
3,88
b
0,00
d
1,25
b
0,06
b
2,22/BAP
4,00
b
7,13
a
3,88
c
1,63
b
0,11
b
4,44/BAP
4,00
b
8,38
a
19,25
a
3,19
a
0,17
a
6,66/BAP
7,00
a
4,50
b
0,00
d
1,46
b
0,08
b
8,88/BAP
8,00
a
6,25
a
3,00
c
2,27
b
0,14
a
Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott.
5932 em meio Líquido Estacionário (LE) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte
aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)].
RC (µM)
NB
CPA
CR
MF
MS
Médias
Médias
Médias
Médias
Médias
0
2,00
b
10,38
b
21,50
a
4,22
a
0,26
a
1,34/ANA
3,00
b
13,25
a
18,63
a
5,16
a
0,31
a
2,68/ANA
4,00
a
13,13
a
11,75
b
6,12
a
0,35
a
4,02/ANA
5,00
a
8,00
c
7,88
c
3,23
b
0,18
b
5,36/ANA
2,00
b
10,63
b
7,50
c
6,22
a
0,33
a
2,22/BAP
4,00
a
6,63
c
4,00
d
1,51
b
0,12
b
4,44/BAP
5,00
a
6,25
c
12,50
b
2,68
b
0,17
b
6,66/BAP
7,00
a
7,13
c
13,00
b
3,99
a
0,19
b
8,88/BAP
6,00
a
7,13
c
8,75
c
2,99
b
0,24
a
44
SOUZA, C. S. et al.
5932 em meio Semissólido (S) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea
(CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)].
RC (µM)
NB
CPA
CR
MF
MS
Médias
Médias
Médias
Médias
Médias
0
1,25
c
12,88
a
12,38
a
5,23
a
0,27
a
1,34/ANA
3,00
b
6,20
d
4,68
b
2,44
b
0,13
b
2,68/ANA
7,25
a
7,13
c
3,45
b
2,76
b
0,16
b
4,02/ANA
6,25
a
8,88
b
2,25
b
3,02
b
0,17
b
5,36/ANA
4,25
b
4,08
d
0,00
c
0,81
c
0,06
b
2,22/BAP
6,75
a
7,00
c
5,45
b
2,75
b
0,15
b
4,44/BAP
5,50
a
5,75
d
3,38
b
2,42
b
0,12
b
6,66/BAP
6,50
a
4,83
d
2,00
b
1,45
c
0,09
b
8,88/BAP
8,00
a
4,63
d
0,88
c
1,39
c
0,09
b
O uso do BAP foi importante pelo aumento na
formação de brotos, em maior número nas variedades
testadas, e contribuindo para o crescimento da variedade
Roxa, pois, geralmente, quanto maior o número de
brotações e o comprimento da parte aérea, maior é a síntese
de fotoassimilados pela planta e, consequentemente, maior
é a massa seca.
número de mudas por explante no final da multiplicação
em meio suplementado com BAP.
Dessa forma, as concentrações que promoveram o
comprometendo a rizogênese, bem como o crescimento
aumento do número de brotações e o comprimento da parte
da parte aérea, o que não foi observado neste
aérea da BGH/UFV 5932 em meio líquido sob agitação
experimento. Segundo esses autores, cada órgão vegetal
(Tabela 1) foram 8,88 µM de BAP (8 brotações/explante) e
pode requerer distintas concentrações de auxina.
2,68 µM de ANA (9,13 cm), respectivamente. Em meio líquido
Concentrações de ANA acima do ótimo podem induzir a
estacionário (Tabela 2) foram 6,66 µM de BAP (7 brotações/
síntese de outro hormônio, o etileno, propiciando
explante) e 1,34 µM de ANA (13,25 cm), respectivamente.
senescência.
A concentração de auxina promotora do
crescimento da parte aérea pode inibir o enraizamento
da mesma planta. De acordo com Souza & Pereira (2007),
a excessiva concentração de auxina no meio de cultura
pode ser tóxica e também favorecer a formação de calos,
Em meio semissólido (Tabela 3), o número de brotações foi
Na variedade Roxa, em meio líquido sob agitação
incrementado por 8,88 µM de BAP (8 brotações/ explante).
(Tabela 4), com 6,66 e 8,88 µM de BAP e 1,34 µM de ANA,
O comprimento da parte aérea foi maior no meio MS0
aumentaram o número de brotações (7 brotações/explante) e
(12,88 cm), dispensando a aplicação de hormônio. Em meio
o comprimento da parte aérea (11 cm), respectivamente. Em
de cultura isento de regulador de crescimento, Lima et al.
meio líquido estacionário (Tabela 5), 4,44 e 6,66 µM de BAP (3
(2002) também notaram maior comprimento da parte aérea
brotações/explante) e 2,68 µM de ANA (11,88 cm) e em meio
em plantas de mandioca. Camolesi et al. (2010), testando o
semissólido (Tabela 6), 6,66 µM de BAP (5,75 brotações/
tratamento meio líquido x frasco de 500 mL na multiplicação
explante), aumentaram as brotações. Sem fitorregulador, o
in vitro de mudas de bananeira ‘Maçã’, observaram maior
comprimento aéreo das plantas foi melhor (12,63 cm).
45
TABELA 4 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba Roxa em
meio Líquido sob Agitação (LA) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea
RC (µM)
NB
CPA
CR
MF
MS
Médias
Médias
Médias
Médias
Médias
0
6,00
a
7,63
b
15,25
b
2,13
b
0,10
b
1,34/ANA
1,00
c
11,00
a
13,88
b
5,02
a
0,27
a
2,68/ANA
4,00
b
9,13
b
13,00
b
4,06
a
0,25
a
4,02/ANA
2,00
c
10,88
a
11,00
b
4,99
a
0,28
a
5,36/ANA
0,00
d
10,13
a
14,00
b
4,63
a
0,31
a
2,22/BAP
0,00
d
9,00
b
23,13
a
4,74
a
0,18
b
4,44/BAP
6,00
a
9,75
a
20,00
a
4,67
a
0,31
a
6,66/BAP
7,00
a
7,50
b
13,00
b
3,10
b
0,17
b
8,88/BAP
7,00
a
8,00
b
14,63
b
3,44
b
0,23
a
meio Líquido Estacionário (LE) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea
RC (µM)
NB
CPA
CR
MF
MS
Médias
Médias
Médias
Médias
Médias
0
0,00
b
5,00
c
4,63
c
1,65
b
0,14
b
1,34/ANA
0,00
b
6,13
c
1,38
d
1,36
b
0,10
b
2,68/ANA
0,00
b
11,88
a
12,00
b
5,15
a
0,32
a
4,02/ANA
0,00
b
11,63
a
14,25
b
5,99
a
0,37
a
5,36/ANA
0,00
b
8,25
b
9,63
b
2,27
b
0,14
b
2,22/BAP
1,00
b
9,88
b
11,50
b
5,01
a
0,28
a
4,44/BAP
3,00
a
11,50
a
19,00
a
4,42
a
0,27
a
6,66/BAP
3,00
a
5,25
c
0,00
d
1,18
b
0,11
b
8,88/BAP
2,00
a
3,75
c
0,63
d
0,74
b
0,06
b
A obtenção de melhores resultados, em meio líquido, pode
ser explicado pelo fato de que altas concentrações de ágar,
ou meios muito consistentes, acabam limitando a difusão
de nutrientes até o explante. Em meio líquido, a difusão de
nutrientes é mais rápida do que em meio semissólido
(SOUZA & PEREIRA, 2007), uma vez que, nos meios
semissólidos, pode ocorrer a criação de gradientes na
distribuição de nutrientes com o crescimento dos tecidos,
o que não acontece em meios líquidos, por serem mais
homogêneos (CAMOLESI et al., 2010). Em Musa sp.,
Lameira et al. (1990) observaram maior número de brotações
em meio líquido quando comparado ao meio semissólido.
Fráguas et al. (2009) observaram que, em abacaxi ‘Gomode-mel’, o meio MS líquido proporciona, além de maior
46
SOUZA, C. S. et al.
meio Semissólido (S) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA),
comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)].
RC (µM)
NB
CPA
CR
MF
MS
Médias
Médias
Médias
Médias
Médias
0
0,00
d
12,63
a
11,75
a
7,64
a
0,33
a
1,34/ANA
0,25
d
10,88
a
10,13
a
6,75
a
0,30
a
2,68/ANA
2,00
c
6,38
b
3,20
b
2,56
c
0,17
b
4,02/ANA
2,25
c
4,13
b
0,50
c
1,16
c
0,11
b
5,36/ANA
5,00
a
4,88
b
1,88
b
2,19
c
0,20
b
2,22/BAP
3,25
b
10,63
a
11,13
a
5,20
b
0,28
a
4,44/BAP
3,50
b
8,88
a
12,13
a
6,44
a
0,34
a
6,66/BAP
5,75
a
9,38
a
8,13
a
4,73
b
0,28
a
8,88/BAP
5,25
a
5,75
b
0,75
c
1,55
c
0,12
b
número de brotações, maior indução de gemas e menor
porcentagem de hiperhidricidade. Pereira & Fortes (2003)
verificaram que houve maior eficiência na multiplicação de
batata em condições in vitro quando se utilizou meio de
cultura líquido. Em igual forma, em Zingiber officinale
Roscoe, Arimura (2000) constatou maior comprimento das
brotações em meio líquido na ausência de ANA e em meio
semissólido com o nível de 2,63 µM ANA.
Em meio líquido, neste experimento, a citocinina
induziu mais a brotação e a auxina foi melhor no crescimento
da parte aérea. Fogaça et al. (2007) também obtiveram maior
investimento na parte aérea das plantas de taro cultivadas
em meio desprovido de BAP, tendo o desenvolvimento
reduzido, naquelas com presença do fitohormônio devido
à sua ação que controla a orientação do fluxo de
carboidratos solúveis e, dessa forma, intervém no
desenvolvimento dos tubérculos. Em meio semissólido, o
melhor crescimento da parte aérea foi com ausência de
hormônio.
Em meio líquido com agitação (Tabela 4) e em meio
semissólido (Tabela 6), a variedade Roxa demonstrou ter
maior potencial, exceto para indução de brotação,
enquanto que, em meio líquido estacionário (Tabela 2), a
BGH/UFV 5932 apresentou melhor desempenho para todas
as variáveis. Melhores resultados para multiplicação e
crescimento de material propagativo, em meio líquido com
agitação contínua, também foram obtidos por Pereira &
Fortes (2003) com a cultura da batata.
Além da composição química, a consistência do
meio pode influenciar no tipo de crescimento e na taxa de
multiplicação de plantas in vitro, por isso deve ser bastante
discutida. O meio líquido normalmente exige alguma forma
de suporte (não utilizado neste experimento) ou agitação
que fornecem o oxigênio necessário para a respiração do
explante. Pereira & Fortes (2003) alertam para que a agitação
do meio de cultura seja feita especialmente na primeira
semana de cultivo, uma vez que é o período em que os
explantes permanecem totalmente imersos no meio de
cultura, o que pode influenciar o crescimento inicial. De
acordo com Camolesi et al. (2010), os frascos de conserva
de 250 mL e 500 mL podem ser utilizados em cultura de
tecidos e permitem maior rendimento no trabalho.
CONCLUSÕES
A presença de citocinina no cultivo in vitro surte
efeitos positivos na formação de raízes e brotos de taioba.
O comprimento da parte aérea é maior em plantas
de taioba, quando estimulado pela auxina ANA.
O acesso BGH/UFV 5932, em presença da citocinina
BAP, tem maior eficiência em gerar mudas, quando
comparado a variedade Roxa.
O meio líquido pode ser adotado para multiplicação
in vitro de taioba, por propiciar maior enraizamento e
número de brotações, bem como, melhor desenvolvimento
da parte aérea.
47
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STAINABILITY AND
FLUOROCHROMATIC
Stainability
and fluorochromatic reaction ... REACTION IN
FRESH MICROSPORES AND POLLEN ISOLATED FROM
Phaseolus vulgaris L.
49
COLORAÇÃO E REAÇÃO FLUOROCROMÁTICA EM
MICRÓSPOROS E PÓLEN FRESCOS ISOLADOS DE Phaseolus vulgaris L.
LIA ROSANE RODRIGUES1, JORGE ERNESTO DE ARAUJO MARIATH2
1
Researcher – Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária – Rua Gonçalves Dias, 570, Menino Deus – 90130-060 – Porto Alegre,
RS – [email protected]
2
Professor – Federal University of Rio Grande do Sul/UFRGS – Av. Bento Gonçalves, 9500, Setor 4, Prédio 43423, Sala 206 – 91501970 – Porto Alegre, RS – [email protected]
ABSTRACT
In bean (Phaseolus vulgaris L.) microspore culture, the
standardization of a viability test is a prerequisite to analyze the
microspore and pollen responses to isolation procedure and to in
vitro culture. While mature pollen viability can be estimated by
means of germination tests, microspores and uninucleate pollen
alive can not be scored by this way. In order to study and compare
viability assays in bean microspores and pollen, stainability to
aniline blue in lactophenol (ABL) and 2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT) were compared with fluoresceine diacetate
(FDA) reaction. Androecium from 2mm buds (containing
microspores and immature pollen) and 4.5mm buds (containing
mature pollen) were excised under stereoscope. Five anthers from
each bud were prepared to FDA reaction and the others five
anthers from the same bud were squashed in ABL. Positive and
negative reaction was scored in 32 glass slides under microscope
in brightfield and fluorescence, totaling 3,837 observations. Similar
test was conducted with MTT. Normality test, analysis of
variance, correlation and regression analysis were performed on
the data. Reaction to FDA were low with a mean of 18%. A mean
of 90% of the microspores and pollen reacted to ABL. MTT
stain was not successfully, probably because the steps required
to reaction speed up the cell death, since bean pollen presents
low longevity and high susceptibility. There was highly significant
difference between ABL and FDA reactions, but not between
microspores and pollen, indicating that results obtained in mature
bean pollen are representative of the microspore viability.
com a reação ao diacetato de fluoresceína (FDA). No
estereoscópio, foram excisados androceus de botões de 2mm
(contendo micrósporos e pólen imaturo) e de botões de 4,5mm
(contendo pólen maduro). Cinco anteras de cada botão foram
preparadas para reação ao FDA e as outras cinco foram esmagadas
em AA. Reações positivas e negativas foram avaliadas em 32
lâminas histológicas no microscópio em campo claro e
fluorescência, totalizando 3837 observações. Testes similares
foram conduzidos com DTB. Os dados foram submetidos aos
testes de normalidade, análise de variância, correlação e regressão.
A percentagem de reação ao FDA foi baixa, em torno de 18%. Ao
AA reagiram, em média, 90% dos micrósporos e do pólen. A
coloração em DTB não funcionou, provavelmente porque os
passos requeridos à reação aceleraram a morte celular, uma vez
que o pólen de feijão é pouco longevo e muito suscetível. Houve
diferença altamente significativa entre as reações ao AA e ao
FDA, mas não entre micrósporos e pólen indicando que os
resultados obtidos em pólen maduro são representativos da
viabilidade do micrósporo.
Index terms: Bean; stain; microspore; haplodiploidization;
viability, Phaseolus vulgaris L.
breeding (HÖFER et al., 1999; KYO & HARADA, 1986;
RESUMO
No cultivo de micrósporos isolados de feijão (Phaseolus
vulgaris L.), a padronização do teste de viabilidade é pré-requisito
para a análise das respostas de micrósporos ao procedimento de
isolamento e ao cultivo in vitro. Enquanto a viabilidade do pólen
maduro pode ser estimada em testes de germinação, micrósporos
e pólen imaturo vivos não podem ser contabilizados dessa maneira.
Com o objetivo de estudar e comparar testes em micrósporos e
pólen de feijão, a coloração em azul de algodão em lactofenol
(AA) e em 2,5-difenil-tetrazólio-brometo (DTB) foi comparada
at the end of the isolating process, appropriate viability
Termos para indexação: Feijão, corante, micrósporo,
haplodiploidização, viabilidade, Phaseolus vulgaris L.
In vitro culture of isolated microspores and
immature pollen contribute to basic and applied studies
and to biotechnological tools development in the plant
RODRIGUES et al., 2004, 2006). Since cells must stay alive
tests are necessary.
Assessment of pollen viability is required in plant
breeding programs to pollen conservation and storage, to
germplasm exchange and to enable crosses between
parental with pollen shed and gynophyte maturity
asynchronous (DAFNI, 1992; GALLETA, 1983).
(Recebido em 08 de dezembro de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010)
50
RODRIGUES, L. R. et al.
However, while mature pollen viability can be
estimated by means of germination tests, microspores and
immature (unicellular) pollen alive can not be scored by
this way. These two categories are in appropriate
undifferentiated condition to induction to in vitro
embryogenesis (PECHAN & SMYKAL, 2001).
Microspores and immature pollen isolation protocols have
been developed to numerous plant species (HÖFER et al.,
1999; KYO & HARADA, 1986; RODRIGUES et al., 2006)
and, in these cases, techniques to score pollen viability
have been adapted.
In the literature, pollen viability is estimated by
various techniques. Initially, fixed material was stained, for
example, in carmine (DAFNI, 1992) or in Alexander stain
(ALEXANDER, 1980) associating viability to the protoplast
presence. Presently, these tests are believed inconsistent,
because protoplasts presence or typical morphology can
not be considered as viability, mainly in cells already dead
by immersion in fixative (RODRIGUES et al., 2005, 2006).
Fluorochromatic reaction to fluoresceine diacetate
(FDA) (HESLOP-HARRISON & HESLOP-HARRISON,
1970) is a well-established technique to viability
determination in plant cells in culture (WIDHOLM, 1972).
Alternatively, there are stain techniques to fresh pollen in
light microscope, like aniline blue in lactophenol (ABL,
cotton blue) (HAUSER & MORRISON, 1964) and 2,5diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (RODRIGUEZ-RIANO
& DAFNI, 2000).
Therefore, in order to quantify the microspore and
pollen viability in bean [Phaseolus vulgaris L., 2n=2x=22
(KARPECHENKO, 1925)] stainability to ABL and MTT
were compared with FDA reaction.
Seeds of the cultivar BR IPAGRO – 44 ‘Guapo
Brilhante’ of P. vulgaris germinated in vases containing 8
L commercial substrate in a greenhouse at Porto Alegre
city, Rio Grande do Sul State (RS), Brazil (latitude 30º03’S
and longitude 51°10’W). Average air temperatures ranged
from 14 to 30oC. In the flowering, closed flower buds were
collected between 8 and 9 h and placed in plastic vials at
room temperature. Subsequently, bracts were removed and
two groups of bud length (2 and 4.5 mm) were selected
under stereomicroscope. Bud length choice considered
that 2 mm buds present a high microspores and
uninucleated pollen proportion and 4.5 mm buds present a
high mature (binucleated) pollen proportion according to
Rodrigues et al. (2007).
Androecium from 2 and 4.5 mm buds were excised
and conserved separately by few minutes in a previously
tested 90 g L-1 sucrose solution. Five anthers from the
same bud were squashed in FDA work-solution and
incubated at 26±1 oC in darkness by 35 min according to
Heslop-Harrison & Heslop-Harrison (1970). Immediately,
the others 5 anthers were squashed in ABL modified by
Hauser & Morrison (1964). Microspores and uninucleated
pollen (from 2 mm buds) and mature pollen (from 4.5 mm
buds) stained by ABL were scored in brightfield at DM
Leica microscope. In the same way, positive and negative
fluorochromatic reaction to FDA was scored under
fluorescence by means of 513808 filter set.
Similar test was conducted with MTT according to
Rodriguez-Riano & Dafni (2000) in order to compare
stainability and fluorochromatic reaction to FDA.
The statistical design was entirely randomized, in a
factorial design (two bud lengths and two reactions) with
eight repetitions by each combination of treatments and a
mean of 120 observations per glass slide, totaling 3,837
observations. Normality test, equal variance test,
parametric analysis of variance (Tukey 5%), correlation
analysis and regression analysis were performed on the
data. Statistical tests were performed in absolute numbers,
but presented in percentage.
Since reactions do not show nuclei morphology, it
was necessary to confirm binucleated condition of pollen
from 4.5 mm buds. Anthers from four 4.5 buds were excised
and gently compressed in gelled drops of germination modified
medium from Farlow et al. (1979) [1200 ppm Ca (NO3)2.4H2O;
0.1% yeast extract; 15% sucrose; 2% agar with pH adjusted
to 7.3 with KOH] under glass slides on moistened absorbent
paper inside 9 cm Petri dish. Material was incubated at 16±1oC
in darkness by 4 h and, subsequently, 100 ìL of 4’-6-diamidino-
Stainability and fluorochromatic reaction ...
2-phenylindole (DAPI) work-solution (COLEMAN &
GOFF, 1985) were dropped under germination medium.
After covered by coverglass, nuclei and nucleoli
morphology was immediately analyzed in fluorescence
microscope by means of 513804 filter set. The test was
repeated and similar trends were obtained.
Usually high microspore viability in vivo is
related to microsporogenesis regularity. However,
viability can be drastically diminished along the
isolating procedure and along the in vitro culture time
(RODRIGUES et al., 2006; WIDHOLM, 1972).
In plant cell culture, the more recommendable
microspore viability assay is fluorochromatic reaction
to FDA (WIDHOLM, 1972) because FDA reaction
requires active esterases and implies that the integrity
of the cell membrane of the vegetative cell is preserved.
In this technique, viable microspore presents yellow
green fluorescence (HESLOP-HARRISON & HESLOPHARRISON, 1970) (Figure 1C).
51
In many species, elevated percentages of
fluorochromatic reaction to FDA were recorded in fresh
microspores and pollen, also in isolated populations
in vitro, like 60-80% in Malus domestica Borkh.
(HÖFER et al., 1999) and 100% in Nicotiana tabacum
L. (KYO & HARADA, 1986). In bean (Table 1), reaction
to FDA were low, with a percentage mean of 18 and
amplitude 1.4 to 35.7%. Therefore, the low reaction
could not be attributed to high male sterility, since it
was recorded few atypical events in microsporogenesis
and microgametogenesis in the same plant material
form bean cultivar BR IPAGRO 44 (RODRIGUES et al.,
2007).
This response to FDA is not exclusive of bean. In
Glycine max (L.) Merr., 28 to 45% of the microspores and
uninucleate pollen presented fluorochromatic reaction to
FDA before isolation in liquid culture medium (RODRIGUES
et al., 2006). Despite this, soybean also presents regular
meiosis (LAUXEN et al., 2003).
TABLE 1 – Percentage of Phaseolus vulgaris microspores and pollen grains with positive reaction to fluorescein
diacetate (FDA) and aniline blue in lactophenol (ABL).
Factors
Means
Percentage
Reaction to
Categories from
Significance
Tukey test
FDA
18
B
ABL
90
A
2 mm buds
53
-
4.5 mm buds
56
-
General mean
54
Coefficient of variation (%)
18.09
Means for Reaction x Categories
2 mm buds
4.5 mm buds
FDA
19
17
ABL
87
94
Different letters indicate significant differences at p<0.05 level by Tukey test.
<0.001
0.465
52
The low response from these species, contrasting
with the meiosis regularity, could be due to the incubation
conditions required to viability assay. It is possible that
the exposition time to the work-solution be hurtful to
enzymatic activity and cell membrane integrity.
Microspores and pollen may be damaged before expired
the incubation time of 35 min.
Others disadvantages of the FDA reaction were
the instability of the work-solution and the variation on
the optimum moment of fluorescein retention by cell
membrane, both already pointed by Heslop-Harrison &
Heslop-Harrison (1970).
In ABL reaction, viable pollen turned blue while
non-viable pollen remained uncolored (Figure 1A). In
Cucumis sativus L., 93% of the microspores and 96% of
the pollen reacted to ABL, while 87 and 93%, respectively,
reacted to FDA (VIZINTIN & BOHANEC, 2004). In bean,
the difference between FDA and ABL was higher, since
90% of the microspores and pollen reacted to ABL. Similar
percentage was recorded in the same material fixed and
carmine stained (RODRIGUES et al., 2007) in which 93% of
the observations corresponded to carmine stained
category. Empty sporoderms and plasmolized pollen were
considered non-stained. So, it is possible that ABL also
only detected protoplasm presence, like carmine stain, with
the disadvantage that ABL reaction do not allows nuclei
visibility (Figure 1B), therefore do not permit inferences
about microsporogenesis and microgametogenesis stages.
In Cucumis sativus, the advantage of MTT over
FDA were the higher contrast between viable and nonviable pollen, a faster protocol offering a longer time
interval for sample examination and the fluorescence
disposal (VIZINTIN & BOHANEC, 2004). In bean
microspores and pollen, MTT reaction was not
successfully, probably because the three steps required
to MTT reaction damaged microspores and pollen.
According to Rodriguez-Riano & Dafni (2000) and Vizintin
& Bohanec (2004), the sample is put in a drop of reagent
and allowed to dry; the reaction is enhanced by gently
heating; followed by the addition of glycerol to the dried
sample. This sequence of steps (drying, heating and
glycerol addition) kill the majority of the cells. Only a small
number of microspores and pollen reacted to MTT, but
presented bright red unsatisfactory reaction. MTT
technique indicated to these species is not feasible in bean.
Bean microspore and pollen susceptibility to temperature
was previously recorded in different conditions (PORCH
& JAHN, 2001; SUZUKI et al., 2001; VARA PRASAD, et al.
2002; WEAVER & TIMM, 1988). Due to its low longevity
under high temperature, the salt concentration and the
period of incubation can not be standardized to bean pollen.
Fluorochromatic reaction to DAPI allowed
characterization of the pollen nuclei morphology and
confirmed the exclusive presence of mature pollen in 4.5
mm flower buds (Figure 1E). In vitro germination medium
from Farlow et al. (1979) inducted pollen tube emission
(Figure 1F) but were observed frequent bursting in tube
up to 50 µm and sporoderm disrupting, indicating that the
medium do not offered the stigmatic conditions, including
inappropriate osmotic potential. To further studies in bean
microspore and pollen germination, mainly to score
germination percentages, osmolarity of the medium and of
the DAPI work-solution must be adjusted.
Microspore and pollen number with positive
reaction to ABL and FDA presented normal distribution
and equal variance. Parametric analysis of variance (Table 1)
detected highly significant difference between reactions,
but not between categories from the two bud lengths,
indicating that viability assays in pollen are representative
of the microspore condition.
In correlation tests (Table 2), correlation
coefficient between categories from 2 mm and 4.5 mm
was positive and highly significant, confirming that
viability assays in 2 mm buds are representative of the
pollen mature condition recorded by analysis of variance.
So it was possible to estimate bean microspore viability
by means of the pollen viability. On the other side,
correlation coefficient between FDA and ABL reactions
was negative and significant, indicating that categories
from the same buds reacted inversely to each technique.
53
TABLE 2 - Correlation coefficients (r) of number of Phaseolus vulgaris microspores and pollen grains with positive
reaction to FDA and ABL (ns= non-significant).
Data cluster
Factors correlated
r
Significance
Reaction to FDA
2 mm x
4.5 mm
0.378
ns
Reaction to ABL
2 mm x
4.5 mm
0.032
ns
Categories from 2 mm buds
FDA x
ABL
-0.668
ns
Categories from 4.5 mm buds
FDA x
ABL
-0.638
ns
4.5 mm
0.947
1%
ABL
-0.602
5%
Both reactions
2 mm x
Both categories
FDA x
FIGURE 1 - Fresh microspores and pollen grains stainability to aniline blue in lactophenol (ABL) in brightfield (A, B) and
fluorochromatic reaction to fluorescein diacetate (FDA) (C, D) and to 4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (E, F)
recorded in Phaseolus vulgaris L. A) Stained (black arrows) and non-stained (white arrow) pollen in ABL. B) Lack of
organellar and nuclear contrast in pollen stained in ABL. C) Positive (black arrows) and negative (white arrow)
fluorochromatic reaction to FDA. D) Non-fluorescent polarized vacuole (arrow) in uninucleated pollen. E) Vegetative (V)
and generative (G) nuclei in typical binucleated mature pollen from 4.5 mm floral bud. F) In vitro germination of bean
pollen. Only the nucleolus from vegetative nucleous is visible (arrow). All bars correspond to 30 µm.
54
Both analysis of variance and correlation tests indicate
ACKNOWLEDGMENTS
that the two techniques offer distinct inferences about
The authors thank the Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) by
postdoctoral fellowship to first author and financial
support.
microspore and pollen condition.
In regression test, microspores and pollen were
presented conjunctly since there was not significant
difference between categories from 2 and 4.5 mm according
to the analysis of variance. Trend lines were quadratic
linear to FDA reaction (y= -0.305x2 + 3.9908x + 85.083; R2=
0.6485) and simple linear to ABL reaction (y= 1.8772x +
2.1921; R2= 0.9314). Regression analysis also confirmed
differences between responses to FDA and ABL, either
highly significant difference between reactions, or inverse
relation between them detected by correlation test.
Similarly to the sporophytic generation, pollen was
submitted to a selective process along the biological
evolution. Gametophytic competition induced alogamous
species to invest in a numerous, longevous and highly
viable pollen population. In contrast, as an autogamous
species, bean male gametophyte germination and
fecundation occur inside the closed bud, not submitted to
the rigorous outer environment, including radiation,
dissection and extreme temperatures. Therefore, bean
microspores and pollen are few vigorous and highly
susceptible to environmental variations (FARLOW et al.,
1979; SUZUKI et al., 2001; VARA PRASAD et al., 2002;
WEAVER & TIMM, 1988).
It is possible that FDA subestimated and ABL
overestimated the viability in bean microspores and pollen.
Results do not permit to point an appropriate viability assay
to bean microspores and pollen. Due to the low vigour and
susceptibility to physical and chemical factors, bean
microspores and pollen require a rapid and stable reaction,
an appropriate osmolarity and warm temperatures.
Our further studies will be focused on adaptation
of alternative viability assays, including dead cell staining
by techniques like phenosafranine (WIDHOLM, 1972) and
Evan’s blue (GAFF & OKONG’O-OGOLA, 1971). Anyway,
an effective viability assay is a requisite to the
establishment of protocols to genetic manipulation in the
gametophytic generation.
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and bacteria. Stain Technology, London, v. 55, p. 13-18,
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phenosafranine for determining viability of cultured plant
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NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS E COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”
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científicos e comunicações científicas da área de cultura
de tecidos de plantas, elaborados por membros da
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(Associação de Cultura de Cultura de Tecidos de Plantas).
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Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os pareceres têm
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1. SUBMISSÃO:
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original e não ter sido submetido a nenhuma outra revista,
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Originais: quatro vias impressas e uma via em CDR, com
texto e ilustrações e gráficos. Das 4 vias impressas apenas
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XP ou 2003)
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Fonte: Times New Roman, tamanho 12
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas
consecutivamente, incluindo as ilustrações
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser
apresentadas no módulo tabela do Word. O título deve
ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados
em preto e branco, nítidos e com contraste, escaneados,
inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão “tif” ou “jpg”,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito, sem caixa de textos e agrupados, em arquivo à
parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor
está filiado – endereço da instituição – CEP – cidade, estado
– endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito
aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituirse em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da
pesquisa. Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos
Devem seguir as normas para citação no texto e na
seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na
seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação – instituição a que o autor
está filiado – endereço da instituição – CEP – cidade, estado
– endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro – Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que
o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este não
esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.”
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão
“Disponível em:” e da data de acesso ao documento,
precedida da expressão “Acesso em:”.
Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes” (ABNT, NBR6023/2000, p. 4).
Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de
institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000.
Disponível em: <http://www.abipti.org.br>. Acesso em:
01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
O INFORMARÁ SOBRE SUA PUBLICAÇÃO. OS
ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇÕES
SERÃO DEVOLVIDOS AO AUTOR PARA A DEVIDA
REVISÃO.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM
DE APROVAÇÃO.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR DO
RECEBIMENTO DO ORIGINAL E, POSTERIORMENTE,
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO
DEVOLVIDOS.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS PELA
COMISSÃO EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras – MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
“Plant Cell Culture & Micropropagation”, a
semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. One of the authors must
be associated and have paid all charges required by the
ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order to be
tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies that
it is neither under consideration for publication elsewhere
nor has appeared previously in part or in whole. On
acceptance for publication, authors assign to the Editors
full copyright of the manuscript in all languages and
countries. Publications will depend on editorial rules and
on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer
and editorial opinions will be anonymously communicated
to authors.
Concepts and affirmations included in articles and
communications are of the entire responsibility of the
authors.
1. SUBMISSION
The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed
by all authors and also contain the full address,
telephone number and e-mail of the authors. Any
inclusion, exclusion or alteration in the authors order must
be notified and signed by all authors including the one
excluded.
Original: Four copies and CD with text and illustrations.
Only one of the 4 printed copies must contain the full
names of the authors and footnote in the first page.
Format: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou 2003)
Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper and
lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
footnote
Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper and
they must be presented in Word or Excel. The title should
be above and be presented in the language in which the
article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in
the text after citation and also in a separate file (on the
same diskette as the article) saved in extension “tif” or
“jpg”, with resolution of 300 dpi. The title should be below
and presented in the language in which the article was
written and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented using
a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words in
capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation – name of the institution to which the
authors belong – address of institution – ZIP CODE – city,
state – mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all written
in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five. They
should not repeat words that are already in the title. These
may include phrases as well as individual words and should
be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject area
that the paper will discuss. It should neither give an
extensive review nor should it include details about the
results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIALAND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
RESULTS AND DISCUSSION
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(S) OF THE AUTHOR(S)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation – name of the institution to which the
authors belong – address of institution – ZIP CODE – city,
state – mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must
not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after
the abstract using terms different from those used in the
title and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article
ABSTRACT AND INDEX TERMS IN PORTUGUESE
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension “TIFF” or “JPEG” with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation and
also in a separate file (on the same diskette as the article)
saved in extension “TIFF” or “JPEG” with resolution of
300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman
font, size 10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
5. THE BRAZILIAN ASSOCIATION OF PLANT TISSUE
CULTURE (ABCTP) WILL INFORM THE AUTHOR THE
RECEIPT OF THE ORIGINAL MANUSCRIPT AND
EVENTUALLY IT WILLALSO SEND INFORMATION
REGARDING ITS PUBLICATION. MANUSCRIPTS
THAT REQUIRE MODIFICATIONS WILL BE
RETURNED TO THE AUTHOR FOR THE RESPECTIVE
REVISION ANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON’T BE
RETURNED TO THE AUTHOR.
7. ARTICLES WILL BE PUBLISHED ACCORDING TO
THE ORDER OF RECEIPTAND APPROVAL.
8. IFANY OFTHESE RULES ARE NOTATTENDED THE
MANUSCRIPTWILL BE RETURNED TO THE AUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED BY
THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWINGADDRESS:
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 – Lavras – MG – BRAZIL

Volume 6 - Número 1

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