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Identificação de alvos terapêuticos para desenvolvimento de novas drogas anti-esquistossomóticas Dr. Rafael Ferreira Dantas Assistente de Pesquisa em Saúde Pública Laboratório de Bioquímica Experimental e Computacional de Fármacos Praziquantel Resistência Laboratório: Fallon & Doenhoff, 1994; Ismail et al., 1994; Couto et al., 2011; Liu et al., 2011; Liang et al., 2011. Campo: Fallon et al., 1994; Ismail et al., 1996; Bonesso-Sabadini & Souza Dias, Início da infecção ~4 semana A I A Atividade do PZQ A A – ativo; I – baixa atividade/inativo 2002; Lawn et al., 2003; Melman et al., 2009. Ação proposta para o PZQ Baixa atividade contra vermes imaturos Cioli et al., 2012; You et al., 2015; Danso-Appiah & De Vlas, 2002 Alvos moleculares ainda não completamente elucidados Greenberg et al., 2005; Pica-Matoccia et al. 2008,2009. Canal de Ca2+ Bomba de efluxo You et al., 2015; Cioli et al., 2012; Wang et al., 2012 Descoberta de compostos anti-esquistossomóticos Substrato Substrato Enzima Enzima Inibidor Produto In vivo Anos 60-70: Principais fármacos Ensaios fenotípicos Medicina Veterinária Microscopia – Campo claro e fluorescência Metabolismo – Colorimetria, fluorescência e luminescência Geary et al., 2015 Paveley et al., 2012; Marcelino et al., 2012; Mansour & Bickle, 2010, Panic et al., 2015 Ensaios bioquímicos Ex: ensaios enzimáticos Castilho et al., 2010; Lee et al., 2008 Liu et al., 2013; Kannan et al., 2014. Como identificar os alvos moleculares? + resistente x não resistente Cruzamento genético Composto com alvo molecular conhecido em outras espécies resistente não resistente X Ex: hycanthone Pica-Mattocia et al., 1993 Ref: Skinner-Adams et al., 2016 Métodos computacionais Vantagens: seleção mais racional dos compostos diminui o número de ensaios experimentais baixo custo Duas estratégias computacionais gerais são usadas: X Estrutura Requer o conhecimento da estrutura molecular do alvo (ou homólogo) Ex: docking molecular Ligante Requer dados de atividade biológica Ex: QSAR PDB Ferreira e Andricopulo, 2015 https://summerofhpc.prace-ri.eu/re-ranking-virtual-screeningresults-in-computer-aided-drug-design/ Alvos em potencial Enzimas Cinases envolvidas na sinalização intracelular (SmPlk1, SmPKA-C2, SmcGK13, SmAbl4, SmTKs5,6) Metabolismo de xenobióticos (CYP305A17) Metabolismo redox (SmTGR8, Peroxiredoxin9) Peptidases (SmPOP10, SmCB11, SmCD12) Histonas desacetilases (SmHDAC813) Biossíntese de purinas (PNP14) Biossíntese de lipídeos (OAR15) Gametogênese Mitose Transmissão nervosa Estado redox Interação parasito-hospedeiro Receptores Receptor TGFβ5 Tirosina cinases (insulina16 e semelhantes17) SmFGFR18 Transportadores Neurotransmissores (serotonina19-SmSERT,dopamina20-SmDAT) Sobrevivência Morfologia Biossíntese de lipídeos Organização do citoesqueleto Motilidade Ref: 1Long et al., 2012; 2Swierczewski & Davies,2009; 3Leutner et al., 2011; 4Buro et al., 2014; 5Buro et al., 2013, 6Beckmann et al., 2011; 7Ziniel et al., 2014; 8Li et al., 2015; 9Sayed et al., 2006; 10Fajtová et al., 2015; 11Jilková et al., 2014; 12Morales et al., 2008; 13Merek et al., 2015; 14Castilho et al., 2010; 15Liu et al., 2013; 16You et al., 2014; 17Dissous et al., 2014; 18Hahnel et al., 2014; 19Patocka & Ribeiro, 2013; 20El-Shehabi et al., 2012. Laboratório de Bioquímica Experimental e Computacional de Fármacos Pavilhão Leonidas Deane LaBECFar – sala 309 Plataforma de Bioensaios e Triagem de Fármacos – sala 605 Coordenação: Dr. Floriano Paes Silva Júnior Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz Av. Brasil, 4365. Campus Manguinhos - Rio de Janeiro, RJ - Brasil Fluxo de trabalho Síntese Modelagem Molecular Ensaios Moleculares Mol 2 Mol 1 Mol 3 Hits Ensaios biológicos Caracterização cinética, estrutural e termodinâmica Grand Chalenges Explorations 2013 Título do Projeto: New Approaches to Neglected Tropical Diseases: An automated drug screening platform for helminthes Parcerias internacionais: X Ramirez et al., 2007. Metodologia 2x • Parasitos 450 cercarias 6 semanas DMEM 37oC / 5% CO2 Perfusão portal Distribuição dos vermes em placas de 96 poços • 300 uL DMEM/poço • 1 verme adulto/poço • Machos X fêmeas Leitura HCA 100 imagens/poço Interface do CellProfiler Módulos de análise Identificação do poço Remoção de bolhas Identificação do objeto Quantificação Resumo do pipeline de análise A E B F C D G H male female Combinação de estratégias computacionais Dra Carolina Horta Andrade Professora Adjunta da UFG • Da análise fenotípica à molecular • In silico Quimiogenômica • Reposicionamento do fármaco Paroxetina • Descoberta de fármacos baseados no ligante • Novos inibidores de SmTGR • Da análise molecular à fenotípica • Descoberta de fármacos baseados no alvo • SmTGR • SmCDs Panic et al., 2014 Transportadores de serotonina (SmSERT) Responsável pela receptação de serotonina. Controla a resposta motora do parasito. Detecção da SmSERT (marcação verde) em vermes adultos e esquistossômulo. Figuras adaptadas de Patocka e Ribeiro, 2013. In silico quimogenômica • Reposicionamento Paroxetin Undefined spaces Chemical space of known actives 40 active compounds 31 inactive compounds 13 predicted compounds PC2 215 active compounds 19 inactive compounds 115 predicted drugs Chemical space of known inactives 115 predicted drugs 100 active compounds 291 inactive compounds 40 predicted compounds PC1 Paroxetin S. mansoni serotonin transporter (SmSERT) inhibitor 8 potential drug targets in S. mansoni 80.9% Drugs with expired patents 61 drugs with potential activity on the neuromuscular function European Patent Office, Google Patents e SciFinder Paroxetina X S. mansoni Antidepressivo Paroxetina como inibidor de SmSERT (Neves et al., 2015). Vermes adultos + paroxetina Esquistossômulos + Paroxetina + resazurina Fêmeas Machos Resultados Tabela – Valores de EC50 (µM) para paroxetina em vermes adultos de S. mansoni. Paroxetine PZQ Time/Gender Male Female Male Female 0h 23.5 17.4 0.11 0.13 24h 5.1 9.9 0.12 0.30 48h 3.8 11.5 0.13 No fit 72h 2.7 11.9 No fit 0.66 EC50 para esquistossômulos (72h): 2,5 µM Modelagem molecular da SmSERT (a) e hSERT(b). Interação da paroxetina com o sítio catalítico da SmSERT (a) e hSERT (b) e comparação entre os dois modelos (c). Tioredoxina glutationa redutase (SmTGR) Um dos principais componentes do sistema antioxidante do Schistosoma spp. Estudos com RNAi mostram que a atividade enzimática é essencial para a sobrevivência do S. mansoni (Kuntz et al., 2007) e S. japonicum (Han et al., 2014) em modelos in vitro e in vivo. Esquema adaptado de Cioli et al. , 2008 GSH – glutationa reduzida Trx - tioredoxina Principais classes de inibidores de SmTGR Phosphoric amides IC50 =0.025 µM oltipraz IC50 = 80.0 µM isoxazolones IC50 =0.15 µM fosforamidites IC50 =0.2 µM Kuntz, A. N. et al, PLoS Med. 2007, 4, e206. Simeonov, A. et al, PLoS Negl. Trop. Dis. 2008, 2, e127. Potassium antimonium tartrate IC50 =0.05 µM oxadiazois IC50 = 1.8 µM Naftazarine IC50 =2.5 µM Auranofin IC50 =0.007 µM Molecular hybridization IC50 =0.01 µM Inibidores de SmTGR Edital Fundo Newton RCUK/FAPERJ 2014 150,000 compounds Resultados Esquistossômulos (48h de incubação) Compound Motility adjusted index (mean Phenotype adjusted index (mean ± ± SD) SD) LabMol-23 -0.74 ± 0.08 -0.64 ± 0.01 LabMol-28 -0.61 ± 0.09 -0.48 ± 0.05 LabMol-37 -0.92 ± 0.04 -0.58 ± 0.01 LabMol-49 -0.93 ± 0.02 -0.61 ± 0.09 LabMol-50 -0.89 ± 0.02 -0.40 ± 0.03 LabMol-51 -0.33 ± 0.13 -0.24 ± 0.05 PZQ -0.48 ± 0.04 -0.17 ± 0.02 OLT -0.90 ± 0.04 -0.34 ± 0.07 Compound A – DMSO (0.625 %) B – 49 (10 µM) C – PZQ (10 µM) D – OLT (10 µM) LabMol-23 LabMol-28 LabMol-37 LabMol-49 LabMol-50 LabMol-51 PZQ OLT Schistossomula (µM) Motility Phenotype >20 >20 3.23 2.62 >20 >20 N.D. N.D. >20 >20 6.60 3.41 >20 >20 N.D. N.D. WSS-1 (µM) 17.48 133.40 16.38 28.49 >400 >400 >400 >400 Selectivity index (SI) Motility Phenotype <0.87 <6.7 5.07 10.87 N.D. N.D. N.D. N.D. <0.87 <6.7 2.48 8.35 N.D. N.D. N.D. N.D. L L L a L a L a L b a b a b a b o M M b o M M b o M M b o M M b l o l o l o l o 4 l 3 l 2 l 2 l 9 4 7 3 8 2 3 2 4 0 0 (2 (1 9 0 (2 (1 7 0 (2 (1 8 0 (2 (1 3 (1 (2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 tr o M M M M M M M M M M n 0 o ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) l 0 a a -6 4 20 L L E -6 C Adultos E % a c t iv it y Resultados Efeito off-target ??? Ensaio da atividade de papaína (cisteíno protease) 120 100 80 60 40 * * Catabolismo de hemácias em S. mansoni Hemácias 330.000/h Hemolisina ESÔFAGO GASTRODERME Hemoglobina Endopeptidases Polipeptídeos Oligo- e dipeptídeos Aminoácidos livres SmCL1 SmCL2 SmCD SmAE S. mansoni catepsina D-like SmCB1 Exopeptidases SmCC Caffrey et al., 2004 Identificação de novas isoformas de SmCD 30-40% identidade nas sequências de bases VALIDAÇÂO POR RNAi!!! Inibidores de SmCD Microformat DIVERSet-EXP Diversidade química Triagem virtual Aspartil proteases (SmCD1-3) 10 para cada isoforma 20 para as três isoformas 50 compostos • Podem ser multi-alvo; • Via metabólica inibida. Estudos com enzimas recombinantes de S. mansoni Expressão intracelular Proteínas secretadas SmTGR SmCD2 SmCD1 Avaliar e caracterizar parâmetros cinéticos e termodinâmicos de ligantes sobre SmTGR e SmCDs recombinantes (em execução). Cristais de SmTGR • Condition: JCSG-plus HT-96 (D06) • 0.1 M TRIS pH=8.50 • 0.2 M Magnesium Chloride • 20.0% w/v Polyethylene glycol 8000 Day 0: 12.12.15 Day 1: 13.12.15 Cristais de SmCD1 • Condition: Index (H09) • 0.05 M Zinc Acetate • 20.0% w/v Polyethylene Glycol 3350 Day 0: 08.01.16 Day 20: 28.01.16 Agradecimentos