IVEN NEYLLA FARIAS VALE ASPECTOS CELULARES E

Transcrição

i
UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
IVEN NEYLLA FARIAS VALE
ASPECTOS CELULARES E
MOLECULARES DA ADESÃO EM
ISOLADOS CLÍNICOS DE Candida spp
SÃO LUÍS
2014
ii
UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ASPECTOS CELULARES E MOLECULARES DA ADESÃO EM ISOLADOS
CLÍNICOS DE Candida spp
SÃO LUÍS
2014
iii
ASPECTOS CELULARES E MOLECULARES DA ADESÃO EM ISOLADOS
CLÍNICOS DE Candida spp
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
Orientador: Profa. Dra. Cristina de Andrade
Monteiro
Co-orientador: Profa. Dra. Patrícia de Maria Silva
Figueiredo
SÃO LUÍS
2014
iv
V149a
Vale, Iven Neylla Farias
Aspectos celulares e moleculares da adesão em isolados clínicos de
Candida spp. / Iven Neylla Farias Vale. - São Luís: Universidade
CEUMA, 2014.
94 p.:il.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biologia
Parasitária. Universidade CEUMA, 2014.
1. Adesão. 2. ALS. 3. Candida. 4. Virulência. I. Monteiro, Cristina de
Andrade (Orientador). II. Figueiredo, Patrícia de Maria Silva (Coorientador). III. Título.
CDU: 616.934
v
Aspectos celulares e moleculares da adesão em isolados clínicos de Candida spp
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia
Parasitária, em sessão pública realizada no dia
/
/
, considerou a candidata
(
) APROVADA
(
) REPROVADA
1) Examinador ________________________________________
2) Examinador ________________________________________
3) Examinador ________________________________________
4) Presidente (Orientador)________________________________
vi
A Deus, a minha família e aos meus amigos
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar, por ter permitido que eu chegasse até aqui, por ter me sustentado nos
momentos mais difíceis; e quando muitas vezes pensei em desistir, o Senhor me deu força e vitória.
Aos meus pais, Nedival e Ester, que sempre me incentivaram e acreditaram em mim, mesmo quando
eu chegava triste por um experimento não ter dado certo.
Ao meu marido, André, pelo apoio incondicional, pelo companheirismo e compreensão em todos os
momentos.
À minha querida orientadora, Cristina Andrade, pela paciência durante todos esses anos, por ter me
incentivado e me ensinado tudo o que sei hoje. Por ser pra mim um modelo de profissional, pelo seu
compromisso, sua ética e principalmente pela sua competência em tudo o que faz. Sempre serei grata
a Deus pela sua vida.
A profa Patrícia Figueiredo pela dedicação e por ter me acompanhado desde a graduação com muito
carinho sempre ajudando para o melhor desenvolvimento da pesquisa.
Ao prof. Silvio Monteiro pela análises estatísticas, pela paciência e pela atenção que sempre dedicou
a mim.
Aos amigos que sempre torceram por mim, pelo meu sucesso em especial Millena Azevedo, Cássia
Alves, Rafaella Souza e Daniella Silveira.
À minha querida turma IV, a turma das divas Fernanda, Francyelle, Márcia Machado, Kátia, Jéssica,
Claudia, Carol e Lisiane, pelo companheirismo e pela amizade.
Aos queridos companheiros de laboratório em especial Márcia, Reinaldo, Laura, Anderson, Monique,
Nadine, Enzo, Mariana sempre prontos a ajudar sempre que precisei.
Aos meus “pupilos” Vanessa, Fábio e Josivaldo pelo comprometimento que tiveram no decorrer
dessa pesquisa e por me aguentar todo esse tempo.
A todos os professores do mestrado em biologia parasitária pela dedicação e pelo compromisso com
o ensino e a pesquisa.
Aos professores do Instituto Federal do Maranhão por terem me dado a base que precisei para
chegar até aqui.
Aos queridos amigos e líderes da Igreja Presbiteriana Renovada do Maiobão pelas orações e pelo
apoio.
A FAPEMA pelo apoio financeiro durante dois anos e meio de mestrado.
A todos que fazem parte dessa conquista, meu muito obrigada.
viii
Até aqui nos ajudou o SENHOR.
1 Samuel 7.12
ix
RESUMO
As diferentes espécies de Candida são capazes de expressar produtos gênicos distintos para adaptação
e crescimento em uma variedade de condições fisiológicas extremas, proporcionando infecções.
Muitos são os fatores responsáveis pela virulência como as lípases, as proteases, e as adesinas. A
adesão é fator crítico inicial no processo de infecção sendo essencial tanto para a colonização e
indução da doença mucosa subsequente. Este estudo foi realizado com quatro espécies de Candida (C.
albicans, C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis) sendo avaliado: 1 – a capacidade hidrofóbica; 2a aderência a materiais inertes (vidro, látex siliconado e aço inox) e a células (HEp-2); 3 – a influência
de carboidratos (glicose, manose, rafinose, galactose, e lactose) no processo de aderência ao vidro; 4 –
a presença de genes da família ALS e sua correlação com as propriedades adesivas em C. albicans. C.
albicans apresentou maior hidrofobicidade entre as espécies testadas apresentando aglutinação desde
as menores concentrações de sulfato de amônio. A aderência a lamínulas foi observada em 66,67% dos
isolados de C. albicans, número inferior aos obtidos em C. parapsilosis (75%) e C. tropicalis
(83,33%). C. parapsilosis apresentou melhor desempenho para aderência ao silicone com maior
positividade (90%) e maior número de isolados classificados como aderentes muito fortes (15%). C.
albicans e C. glabrata aderiram ao inox em 100% dos isolados testados enquanto que C. parapsilosis
e C. tropicalis apresentaram positividade de 95 e 94,44% respectivamente. C. glabrata e C. albicans
apresentaram maior capacidade de aderência às células HEp-2 (76,47 e 70,83% respectivamente)
seguidas de C. tropicalis (66,67%). Manose inibiu a adesão em C. albicans, C. tropicalis e C.
parapsilosis. Já rafinose intensificou o processo em C. tropicalis e mais intensamente em C. glabrata.
Galactose também atuou incrementando adesão em C. glabrata e C. albicans. De um modo geral, o
gene ALS6 foi o mais predominante (82,51%). Os genes ALS3 e ALS5 foram detectados em 31,82%
dos isolados. Os demais genes foram detectados em frequência que não ultrapassou 20%. Foi
verificada correlação positiva entre a presença de ALS1 e os padrões de aderência difuso e agregativo.
ALS3 e ALS5 apresentaram correlação negativa com a aderência a lamínula. ALS1 ALS3 e ALS5
apresentaram correlação com a hidrofobicidade.
Palavras-chave: adesão, ALS, Candida, virulência
x
ABSTRACT
The different Candida species are capable of expressing various gene products for adaptation and
growth in a variety of extreme physiological conditions, providing infections. Many are the factors
responsible for the virulence as lipases, proteases, and adhesins. This study was performed with four
Candida species (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis) being evaluated: 1 – the
hydrophobicity; 2 - adherence to inert materials (glass, stainless steel and silicone) and cells (HEp-2);
3 - The influence of carbohydrates (glicone, mannose, raffinose, galactose, and lactose) in glass
adhesion process; 4 - the presence of the ALS gene family and its correlation with adhesive properties
in C. albicans. C. albicans showed greater hydrophobicity between the species tested showing
agglutination since lower concentrations of ammonium sulfate. The adhesion to glass coverslips were
observed in 66.67 % of the isolates of C. albicans, the lower the number found in C. parapsilosis
(75%) and C tropicalis (83.33%). C. parapsilosis showed better performance for adhesion to silicone
with greater positivity (90%) and a higher number of isolates classified as very strong adherent (15%).
C. albicans and C. glabrata adhered to stainless in 100% of tested isolates, while C. parapsilosis and
C. tropicalis were positive in 95 and 94.44 % respectively. C. glabrata and C. albicans showed greater
ability to adhere to HEp - 2 cells (76.47 and 70.83 % respectively) followed by C. tropicalis (66.67%).
Mannose inhibited adhesion in C. albicans, C. tropicalis and C. parapsilosis. Have raffinose
intensified the process in C. tropicalis and more intensely in C. glabrata. Galactose acted also
increasing membership in C. glabrata and C. albicans. In general, the ALS6 gene was most prevalent
(82.51%). ALS3 and ALS5 genes were detected in 31.82% of the isolates. The remaining genes were
detected in frequency did not exceed 20%. Positive correlation between the presence of ALS1 and
patterns of diffuse and aggregative adherence was checked. ALS3 and ALS5 were negatively correlated
with the cover slip grip. ALS1 ALS3 and ALS5 correlated with hydrophobicity.
Keywords: adhesion, ALS, Candida, virulence
xi
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 1
2.
REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................................................... 4
2.1
Patogênese de Candida ....................................................................................................... 4
2.2
O processo de aderência em Candida .................................................................................. 6
2.2.1 Parede Celular ................................................................................................................ 6
2.2.2 Aderência ....................................................................................................................... 7
2.3
Adesão a células epiteliais .................................................................................................11
2.4
Adesão a materiais inertes ..................................................................................................13
2.5
Influência de carboidratos no processo de aderência ...........................................................14
2.6
Aspectos moleculares da adesão ........................................................................................15
2.6.1 A família gênica ALS .....................................................................................................18
3.
4
OBJETIVOS .............................................................................................................................21
3.1
Geral 21
3.2
Específicos ....................................................................................................................21
METODOLOGIA .....................................................................................................................22
4.1
Isolamento das Amostras ...............................................................................................22
4.2
Determinação da hidrofobicidade celular........................................................................22
4.3
Ensaio de adesão a material inerte ..................................................................................23
4.3.1 Adesão à lamínula..........................................................................................................23
4.3.2 Classificação da aderência .............................................................................................23
4.3.3 Adesão ao silicone e inox ...............................................................................................24
4.4
Ensaio de adesão a células epiteliais ...............................................................................25
4.4.1 Cultivo e preparo das monocamadas celulares ................................................................25
4.4.2 Preparação do Inóculo e Teste de Adesão .......................................................................25
4.4.3 Classificação da aderência .............................................................................................25
4.5
Influência de carboidratos no processo de aderência .......................................................26
4.5.1 Preparação dos carboidratos ...........................................................................................26
4.5.2 Teste de aderência..........................................................................................................26
4.6
Identificação molecular de genes da família ALS ...........................................................27
4.6.1 Extração de DNA...........................................................................................................27
4.6.2 Amplificação por PCR ...................................................................................................27
4.7
Análise estatística ..........................................................................................................28
xii
5
RESULTADOS e DISCUSSÃO ................................................................................................29
5.1
Determinação da hidrofobicidade celular ...........................................................................29
5.2
Ensaio de adesão a material inerte ......................................................................................31
5.2.1 Aderência à lamínula .....................................................................................................31
5.2.2 Adesão ao silicone e inox ...............................................................................................38
5.3
Ensaio de adesão a células epiteliais...................................................................................45
5.4
Influência de carboidratos no processo de adesão ...............................................................50
5.5
Identificação molecular de genes da família ALS ...............................................................53
6
CONCLUSÕES ........................................................................................................................62
REFERÊNCIAS ...............................................................................................................................64
APÊNDICE ......................................................................................................................................77
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Secreção e ancoramento na superfície celular de adesinas fúngicas
(VERSTREPEN; KLIS, 2006). .......................................................................................... 8
Figura 2 - Etapas do processo de invasão tecidual por Candida (GOW et al., 2012) ............. 12
Figura 3 - Possível atuação dos genes da família SAP na patogênese de Candida (NAGLIK, J.
et al., 2004) ..................................................................................................................... 16
Figura 4 - Desenho esquemático da estrutura dos genes da família ALS (Fonte: Hoyer, 1998)
........................................................................................................................................ 19
Figura 5 - Avaliação da hidrofobicidade de Candida em concentrações crescentes de sulfato
de amônio. Até 1,5 M: hidrofobicidade forte; entre 1,5 e 2,5M: moderada; acima de 2,5M:
fraca ................................................................................................................................ 30
Figura 6–Frequência de isolados de Candida com capacidade de aderência a lamínula ........ 31
Figura 7 - Frequência da intensidade de aderência à lamínula entre as diferentes espécies de
Candida........................................................................................................................... 32
Figura 8 - Frequência dos padrões de aderência a lamínulas observados nas diferentes
espécies de Candida ........................................................................................................ 34
Figura 9 - Distribuição dos padrões de aderência entre os isolados de Candida em relação ao
sítio de origem ................................................................................................................. 36
Figura 10 - Padrões de aderência a lamínulas evidenciando arranjos celulares distintos
encontrados nas amostras de Candida. A) Difuso B) Agregativo C) Localizado D) Pseudohifa. Aumento: 1000x ...................................................................................................... 37
Figura 11–Relação entre a intensidade de aderência e o padrão de aderência apresentado pelos
isolados de Candida ........................................................................................................ 38
Figura 12–Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de
adesão ao silicone. ........................................................................................................... 39
Figura 13 – Frequência da intensidade de aderência ao silicone entre as diferentes espécies de
Candida. Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a
499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs. ............................ 40
xiv
Figura 14 -Frequência da intensidade de aderência ao silicone entre os diferentes sítios de
origem analisados. Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs;
Moderado: 200 a 499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs.. 41
Figura 15 - Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de
adesão ao inox ................................................................................................................. 42
Figura 16 - Frequência da intensidade de aderência ao inox entre as diferentes espécies de
Candida . Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a
499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs. ............................ 43
Figura 17 - Frequência da intensidade de aderência ao inox entre os diferentes sítios de
origem analisados. Classificação: Negativo: 0UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs;
Moderado: 200 a 499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs.. 44
Figura 18 - Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de
adesão às células HEp-2 .................................................................................................. 46
Figura 19 - Padrões distintos de agregação observados em isolados de C. glabrata. Aumento:
1000x ao microscópio ótico. A) Agregativa; B) Localizada; C) Difusa ............................ 48
Figura 20 - Frequência de padrões de aderência distintos observados em isolados de Candida
a células HEp-2 ............................................................................................................... 49
Figura 21 – Número de células aderidas na presença de carboidratos ................................... 50
Figura 22 - Influência dos carboidratos no processo de adesão ............................................. 51
Figura 25 - Capacidade de aderência em C. parapsilosis na presença de carboidratos: A)
Controle; B) Aderência na presença de galactose; C) Aderência na presença de lactose.
Aumento: 1000x .............................................................................................................. 52
Figura 23 - Capacidade de aderência em C. albicans na presença de carboidratos: A) Controle
B) Aderência na presença de manose; C) Aderência na presença de galactose. Aumento:
1000x .............................................................................................................................. 52
Figura 24 - Capacidade de aderência em C. glabrata na presença de carboidratos: A)
Controle; B) Aderência na presença de galactose; C) Aderência na presença de rafinose.
Aumento: 1000x .............................................................................................................. 52
xv
Figura 26 - Distribuição dos resultados de PCR para verificar a presença dos genes ALS em
isolados de Candida albicans. ......................................................................................... 54
Figura 27 - Distribuição dos resultados de PCR para verificar a presença do gene ALS5
(tandem repeats) em isolados de Candida albicans. ......................................................... 56
Figura 28 - Reação de PCR amostras de C. albicans isoladas de urina. L – DNA ladder de 100
pb; 1 – controle negativo; 2 a 7 – produtos de PCR dos isolados de Candida abicans. .... 57
Figura 29 - Correlação entre a presença do gene ALS1 e os padrões de aderência exibidos por
Candida albicans............................................................................................................. 58
Figura 30 - Correlação entre a presença dos genes ALS3 e ALS5 e a aderência à lamínula .... 59
Figura 31 - Correlação entre a presença do gene ALS1 e a hidrofobicidade em concentração de
0,5M em sulfato de amônio ............................................................................................. 60
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição dos 79 isolados clínicos de Candida entre as diferentes espécies e
sítios de origem ............................................................................................................ 22
Tabela 2 - Primers para amplificação por PCR utilizados na pesquisa .................................. 28
Tabela 3 - Frequência de genes da família ALS em isolados clínicos de Candida.................. 55
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – graus Celsius ou graus centígrados
ALS – Agglutinin-Like Sequence
BHI – Brain Heart Infusion
CIA – Clorofórmio Álcool-Isoamílico
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
CNCA – Candida não Candida albicans
COF – candidíase orofaríngea
CPH1 – Candida Pseudohyphal Regulator
CVV – candidíase vulvovaginal
DMEM – Dulbecco's modified Eagles's medium
DNA – Ácido desoxirribonucleico
dNTPs – Desoxirribonucleotídeo trifosfatado
EDTA – ácido etileno diamono tetracético
EFG1 – Enhanced Filamentous Growth
EPA1 – Epithelial adhesin
GPI – Glycosyl Phosphatidyl Inositol
HEp-2 – Human Epitelioma type 2
HEPES – ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico
HWP – Hyphal Wall Protein
MEM – Meio Essencial Mínimo
pb – pares de bases
xviii
PBS – Phosphate buffered saline
PCR – Polimerase Chain Reaction
PGA – Protein GPI Anchored
RHE – Epitélio humano reconstituído
SAP – Secreted Aspartic Proteinase
SDA – Saboraud Dextrose Agar
SDS – Sodium dodecyl sulfate
TE – Tris e EDTA
TL – Tampão de lise
TRIS – tampão TRIS-EDTA
UFCs – Unidades formadoras de colônias
YNB – Yeast Nitrogen Base
μL – microlitros
1
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos tem crescido o número de infecções fúngicas sistêmicas causadas
por leveduras do gênero Candida consistindo um perigo potencial principalmente a
saúde de pessoas imunocomprometidas como pacientes com AIDS ou doentes a espera
de transplantes (COLOMBO et al., 2006; BERGAMASCO et al., 2013; COLOMBO et
al., 2013)
As leveduras do gênero Candida existem como comensais no organismo, estando
presentes na microbiota humana desde o nascimento sem causar infecções durante toda
vida. Podem colonizar, principalmente, cavidade oral, vagina, aparelho respiratório,
urinário, entre outras localizações (CARDOSO, 2004a; COSTA, 2009). No entanto, em
certas condições, podem causar infecções superficiais em diferentes mucosas como
candidíase orofaríngea (COF) ou candidíase vulvovaginal (CVV) (FIDEL, 1999; 2011).
A alteração destas leveduras comensais para agente infeccioso se dá,
principalmente, em razão dos fatores de virulência do micro-organismo e da resposta
imunológica do hospedeiro, o que coloca as espécies de Candida entre os principais
fungos oportunistas (JAIN, 2010; SALIBA, 2012).
Além disso, o uso de dispositivos médicos como, por exemplo, cateteres e o
aumento do número de pacientes que recebem terapia com antibióticos e drogas
imunossupressores podem aumentar o risco de penetração de fungos através das
barreiras mucosas (KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010). Estudos indicam que Candida
albicans é a principal causa de infecções sistêmicas com taxa de mortalidade de 40%
(WENZEL; GENNINGS, 2005; KAUFMAN et al., 2006).
C. albicans é o fungo mais comumente encontrado em laboratórios hospitalares e
constitui a quarta causa mais comum de hemoculturas positivas em pacientes
hospitalizados na América do Norte (KLOTZ, 2010). Além disso, candidíase é a
infecção oportunista mais comum em indivíduos infectados pelo HIV (KLOTZ, S. A. et
al., 2007). Embora C. albicans seja a principal espécie isolada de pacientes com
fungemia (CHAKRAVARTHI; WEI; NAGARAJA, 2010), relatos recentes indicam
uma tendência para o aumento da prevalência de infecções causadas por espécies de
2
Candida não C. albicans (BASSETTI et al., 2006; COLOMBO et al., 2006;
HINRICHSEN et al., 2009; FALAGAS; ROUSSOS; VARDAKAS, 2010; DUTTA;
PALAZZI, 2011). No Brasil as espécies mais prevalentes são C. albicans, tropicalis,
Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei e Candida guillermondii
(HINRICHSEN et al., 2009).
De maneira semelhante a todas as doenças infecciosas a adesão de um microorganismo ao tecido hospedeiro ou à superfície de um dispositivo médico deve ocorrer
antes que a infecção se estabeleça. Assim como muitos micro-organismos, a capacidade
de Candida albicans aderir a superfícies é, presumidamente, uma característica
importante de sobrevivência e/ou patogenicidade (JAIN et al., 2010).
Muitos são os fatores responsáveis pela virulência dos fungos como as lipases, as
proteases, e as adesinas. (GHANNOUM, 2000; NAGLIK, J. R.; CHALLACOMBE;
HUBE, 2003; TAVANTI et al., 2003; FAVERO et al., 2008). Adesinas são proteínas de
superfície celular importantes no processo de infecção, pois fazem a ligação da Candida
à superfície da célula hospedeira a ser infectada.
C. albicans possui uma família de genes Agglutinin-like sequence (Als) que codifica
a principal classe de glicoproteínas de superfície celular relacionadas ao processo de
adesão às superfícies das membranas mucosas e ao fenômeno de agregação celular
(KLOTZ, 2010). Entretanto, as proteínas Als não foram identificadas em todas as
espécies de Candida e, provavelmente, outros polipeptídeos diferentes possam exercer a
função de aderência (NASCIMENTO, 2009; KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010).
Muitos estudos têm descrito a capacidade de aderência de C. albicans a vários tipos
celulares, mas pouco se conhece sobre esta propriedade em outras espécies de Candida
e o seu papel no reconhecimento da superfície celular do hospedeiro (LIMA-NETO et
al., 2009). Alguns autores sugerem mecanismos distintos para o processo de adesão em
outras espécies de Candida (KING; LEE; MORRIS, 1980; BENDEL; HOSTETTER,
1993; GILFILLAN et al., 1998; CORMACK; GHORI; FALKOW, 1999; LIMA-NETO
et al., 2009; SILVA, S. et al., 2011). Há também sugestão de que a capacidade de
adesão varie entre os isolados de diferentes espécies como o que foi verificado trabalho
de Biasoli et al (2002) onde foram apontadas diferenças entre C. albicans, C. glabrata,
C. krusei e Candida lusitaniae. (BIASOLI; TOSELLO; MAGARO, 2002)
3
Estes fatos evidenciam que provavelmente haja diferenças inter e intra-específicas
com relação à presença, estrutura molecular e a expressão de genes responsáveis por
mecanismos de adesão em isolados de Candida clinicamente importantes.
A análise in vitro da propriedade de aderência das espécies de Candida pode
contribuir para a compreensão do comportamento destes organismos em um processo de
infecção específico.
4
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Patogênese de Candida
Patogênese é a habilidade de um micro-organismo de causar infecções (KHAN et al.,
2010). Os fatores de virulência são características inerentes a esses micro-organismos
que facilitam a invasão e a colonização e são conhecidos como determinantes da
patogenicidade. A habilidade de C. albicans ser a principal espécie em termos de
colonização e patogenicidade no homem está relacionada a seus fatores e propriedades
de virulência. Os principais fatores de virulência atribuídos às espécies de gênero
Candida são a habilidade de produzir enzimas hidrolíticas extracelulares: proteinases
(responsáveis pela hidrolização de ligações peptídicas promovendo adesão, invasão e
dano tecidual) e fosfolipases (hidrolisam os fosfoglicerídeos de membrana) (MOHAN
DAS; BALLAL, 2008), enzimas funcionam como facilitadoras da interação do fungo às
células do hospedeiro (CAFARCHIA et al., 2008; AOKI et al., 2011); a expressão de
fatores de adesão e a subsequente formação de biofilme; a capacidade de variação da
morfologia celular; a habilidade de responder rapidamente às mudanças do meio e a
penetração ao tecido afetado. Todas esses fatores são considerados relevantes na
patogênese da candidíase (LIONAKIS; NETEA, 2013).
O processo de adesão, propriedade primária de virulência das leveduras, envolve
fatores não biológicos, relacionados a forças de van der Walls, interações hidrofóbicas e
eletrostáticas; e biológicos que se referem a mecanismos moleculares específicos como
a expressão de adesinas, biomoléculas que promovem a aderência (SILVA, S. et al.,
2011; STANISZEWSKA et al., 2012). A adesão pode ocorrer a diferentes superfícies
como às células e aos polímeros inertes, e muitos fatores do hospedeiro podem alterar a
expressão destas adesinas ou sua ligação às células hospedeiras influenciando na
patogênese (AL-ZAHARAA et al., 2012). Alterações no hospedeiro são geralmente
necessárias para que micro-organismos comensais tornem-se patógenos oportunistas e
desencadeiem a infecção (YANG, 2003).
Subsequente ao processo de adesão celular ocorre a formação de biofilme, que está
diretamente relacionada ao potencial de virulência de Candida. Esta propriedade
consiste no surgimento de uma comunidade séssil caracterizada por células que formam
5
micro-colônias aderentes a um substrato, uma interface ou ainda a uma matriz
exopolimérica de substâncias extracelulares permitindo, assim, uma proteção ambiental
contra agentes externos favorecendo o desenvolvimento de infecções e uma resistência
a agentes antimicrobianos (DONLAN; COSTERTON, 2002).
C. albicans é bem conhecida no meio clinico pela sua capacidade de aderir a tecido
humano danificado seja ele membrana de mucosas, o epitélio da bexiga, da válvula
cardíaca ou dos vasos da retina. Além disso, a capacidade de invasão de tecidos e
adesão a materiais artificiais tais como sondas, cateteres de látex, e vários tipos de
materiais plásticos são responsáveis por causar infecções importantes (TAMURA et al.,
2007).
Sabe-se que a adesão de C. albicans às superfícies artificiais e às mucosas é
intensificado por vários fatores como produção de tubos germinativos, fosfolipases,
proteases, outras atividades enzimáticas extracelular, carboidratos, pH e temperatura
(GHANNOUM; ABU-ELTEEN, 1990; SITHEEQUE; SAMARANAYAKE, 2003)
Carboidratos da dieta como glicose e sacarose comumente consumidos, podem ser de
importância na patogênese de C. albicans na cavidade oral, devido o efeito de tais
açúcares na aderência da levedura in vitro (OLSEN, 1990; SANTANA et al., 2013).
Outros fatores químicos e físicos podem interferir no processo de aderência como
presença de ácidos, pepstatina A, concanavalina A, heparina, glutaraldeído, peptídeos
sintéticos (OLLERT et al., 1993), favorecendo-a ou impedindo que a mesma aconteça.
Da mesma forma, a interação destas leveduras com outros micro-organismos pode
proporcionar ou não o mecanismo de aderência ou de formação de biofilme (NOBBS et
al., 2010), mas também são poucos os dados sobre estas interações.
Proteínas como as aspartil-proteases são enzimas proteolíticas que também possuem
um papel essencial na adesão em C. albicans. Isso pode ser demonstrado através de
estudos que revelam que isolados clínicos de Candida fortemente proteolíticos
apresentaram uma alta capacidade de adesão, comparadas com outras de expressão de
protease mais discreta. Isso porque essas proteases são capazes de degradar substratos
como colágeno, queratina, albumina, hemoglobina, cadeias pesadas de imunoglobulina
e proteínas de matriz extracelular (OLIVEIRA et al., 1998; PICHOVA et al., 2001). A
6
atividade da proteinase está relacionada com a expressão de uma família de genes da
família SAP (secreted aspartic proteinase).
Apesar de haver estudos complexos destes fatores de virulência com relação à C.
albicans, os mesmos não são totalmente compreendidos em outras espécies de Candida.
Além disso, as variabilidades inter e intra-específicas existentes dentro do gênero
Candida também instigam um crescente e urgente avanço nas pesquisas relacionadas
aos fatores de virulência (YANG, 2003).
2.2 O processo de aderência em Candida
2.2.1 Parede Celular
A parede celular de C. albicans não apresenta apenas função de conferir rigidez e
proteção a célula, mas também é o local inicial das interações hospedeiro-agente
patogênico e é um alvo óbvio para o desenvolvimento de vacinas e antifúngicos.
Aproximadamente 80 a 90% da parede celular de Candida é constituída por
carboidratos havendo três constituintes que representam a maioria dos polissarcarídeos
de parede celular:
•
Polímeros de glicose com ramificações contendo ligações ß-1,6 e ß-1,3;
•
Polímeros de N-acetil-D-glicosamina (GlcNac) ligados a moléculas de quitina
por ligações ß-1,4;
•
Polímeros de manose ligados covalentemente a manoproteínas.
A parede celular contém ainda 6 a 25% de proteínas e 1 a 7% de lipídeos. Os
componentes estruturais são: os ß-glucanos e a quitina. Polímeros de manose
(manoproteínas) representam 40% dos polissarcarídeos e são os principais constituintes
da célula - grupo na qual pertence as adesinas (CARDOSO, 2004b).
A maioria das proteínas de parede é ligada covalentemente a β-1,6-glucanos por
âncoras glicosil fosfatidilinositol (GPI). O genoma de C. albicans contém 115 prováveis
proteínas GPI que podem ser ligadas à parede (RICHARD; PLAINE, 2007). A maior
parte destas proteínas são expressas apenas sob condições específicas. Um estudo
7
recente sugere que não há mais do que aproximadamente 20-30 proteínas de parede
expressas em qualquer dado momento (KLIS; BRUL; DE GROOT, 2010). Proteínas de
parede GPI geralmente mostram uma estrutura modular, com um domínio conservado
no N-terminal seguido por uma região altamente glicosilada, o domínio rico em serina e
de treonina, que também podem incluir uma região de repetições (KLIS et al., 2009).
Em particular, a glicosilação por manose em proteínas de parede é importante para
limitar a porosidade da parede (DE GROOT; RAM; KLIS, 2005). Proteínas de parede
apresentam uma variedade de funções que vão desde aderência (HOYER; PAYNE;
HECHT, 1998; STAAB et al., 1999) e aquisição de ferro (ALMEIDA et al., 2008) até a
invasão de tecidos (SCHALLER et al., 2005) e defesa contra a resposta imune
(FROHNER et al., 2009). Recentemente, a resposta do proteoma da parede para
alterações no pH do ambiente tem sido descrita (SOSINSKA et al., 2011).
2.2.2 Aderência
A adesão das células de Candida a vários substratos é um processo complexo
influenciado por vários fatores. São várias as proteínas envolvidas, algumas funcionam
como fatores de transcrição que interferem na taxa de expressão de adesinas e outras
como mantenedoras da estrutura da parede celular. Entre os fatores de transcrição de
Candida estão Efg1 e Cph1 que atuam promovendo o crescimento pseudo-hifal em S.
cerevisiae. Isolados nulos para efg1 e efg1/cph1 apresentam intensa redução das
propriedades adesivas, bem como o perfil transcricional de genes que codificam
prováveis proteínas da parede celular gravemente alterado (DIETERICH et al., 2002;
SOHN et al., 2003)
Outro grupo de proteínas com ação, principalmente indireta, no processo de adesão
atua através de alterações da estrutura da parede celular. A ancora GPI ligada à parede
celular, quando anulada, possui efeito negativo sobre a filamentação e também na
aderência à células de mamíferos (ALBERTI-SEGUI et al., 2004).
Algumas proteínas de C. albicans são codificadas por uma família de genes ALS
(Agglutinin-like Sequence). São glicoproteínas de superfície celular implicadas no
processo de adesão às superfícies das membranas mucosas, as adesinas (KLOTZ,
LIPKE, 2010). As adesinas são também responsáveis pelo fenômeno de agregação
celular como revelam trabalhos anteriores (KING; LEE; MORRIS, 1980). A adesão
8
seguida de agregação celular tem sido documentada em vários estudos envolvendo uma
miríade de alvos biológicos. Quando C. albicans encontra uma proteína ancorada, uma
célula, ou tecido, o fungo adere e então agrega (KLOTZ, LIPKE, 2010).
Além de promoverem a agregação celular, as adesinas medeiam a adesão a epitélio, a
formação de biofilme além de estarem ativamente envolvidas na patogênese de C.
albicans. As adesinas codificadas pelos genes da família ALS são proteínas de superfície
celular com características estruturais bem semelhantes entre os membros. A primeira
proteína identificada foi denominada Als1p e é caracterizada por três domínios. A
região N-terminal contém um provável peptídeo sinal e é relativamente conservada
entre proteínas da família Als. É uma região caracterizada pela pouca glicosilação
(ZHAO, 2003 e HOYER, 2001). A porção central das proteínas consiste de um número
variável de repetições em série (aproximadamente 36 aminoácidos de comprimento) e
seguida pela região C-terminal rica em aminoácidos serina e treonina que contém uma
sequência de âncora de glicosil fosfatidilinositol (ZHAO,2003 E HOYER, 2001)
(Figura 1).
Figura 1 - Secreção e ancoramento na superfície celular de adesinas fúngicas (VERSTREPEN; KLIS, 2006).
Parede Celular
Meio Extracelular
Parede Celular
Experimentos de expressão heteróloga dos genes ALS de C. albicans em S.
cerevisiae proporcionaram um fenótipo de aderência a este organismo, confirmando que
9
proteínas Als estão envolvidas diretamente na adesão de C. albicans às superfícies
celulares (NOBBS; VICKERMAN; JENKINSON, 2010).
As proteínas Als possuem algumas funções diferenciadas. A expressão Als5p em S.
cerevisiae confere aderência a vários substratos, incluindo células endoteliais e gelatina,
enquanto que a expressão de Als6p resulta apenas na adesão a gelatina (SHEPPARD,
2004). Apesar desta diferença acentuada entre a função de Als5p e de Als6p estas
proteínas possuem identidade superior a 80% com relação aos aminoácidos. As
repetições in tandem e porções C-terminal destas proteínas são virtualmente idênticas, e
a maioria das diferenças de sequência estão concentradas nas porções N-terminais das
duas proteínas. Estes dados sugerem que a variabilidade da sequência N-terminal
confere especificidade ao substrato (SHEPPARD, 2004).
As proteínas Als não foram identificadas em todas as espécies de Candida e
provavelmente nestas outros polipeptídeos diferentes possam exercer a função de
aderência (NASCIMENTO, 2009; KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010; SILVA, S. et al.,
2011). Assim estudos ainda são necessários para revelar as diferenças fenotípicas e
moleculares da propriedade de aderência entre as espécies de Candida.
Outra importante adesina é encontrada nos tubos germinativos de C. albicans, mas
não em formas leveduriformes ou em pseudo-hifas. Hwp1 é uma manoproteína
semelhante às proteínas Als e é fortemente expressa também durante a formação de
biofilme. Hwp1 desempenha um papel importante na aderência às células epiteliais
(STAAB et al., 1999), onde serve como um substrato para a enzima transglutaminase
epitelial e pode ser estavelmente ligado à superfície das células epiteliais.
Provavelmente a aderência entre as espécies de Candida não obedeça ao mesmo
mecanismo gênico. Isso pode ser evidenciado no trabalho de Bendel (1993) onde foi
investigado o papel de análogos de integrina na adesão epitelial de C. albicans e C.
tropicalis. A integrina1 (Int1) é uma proteína de superfície de C. albicans que apresenta
alta similaridade com as integrinas de vertebrados. A expressão do gene INT1 em
Saccharomyces cerevisae foi suficiente para torná-lo aderente a células epiteliais
humanas apesar de normalmente essa espécie não apresentar tal característica. Além
disso, a mutação em INT1 em C. albicans suprime o desenvolvimento das hifas, a
10
adesão a células epiteliais e a virulência das amostras em camundongos (GALE et al.,
1998).
Experimentos investigando o papel de análogos de integrina na adesão epitelial de
C. albicans e C. tropicalis por citometria de fluxo com o anticorpo monoclonal (mAb)
OKM1 revelou que a fluorescência de superfície foi maior para C. albicans e
apresentou uma redução significativa em C. tropicalis (BENDEL; HOSTETTER,
1993). No entanto, a adesão à célula epitelial humana na linhagem HeLa não diferiu
para estas duas espécies de Candida . A disparidade entre a expressão da integrina
análoga e a adesão epitelial sugerem mecanismos distintos para este processo em C.
albicans versus C. tropicalis.
Com relação a C. glabrata, trabalhos recentes identificaram 23 adesinas de parede
celular que, provavelmente, estão envolvidas na adesão ao epitélio humano e na
formação de biofilme (DE GROOT et al., 2008). O principal grupo de adesinas de C.
glabrata, é codificada por genes da família EPA (epithelial adhesin), também
identificada em C. albicans. A capacidade de C. glabrata aderir a diferentes
biomateriais e a epitélio pode ser um reflexo da expressão da adesina epitelial (Epa)
sobre a superfície das células, que é induzida pela presença de ácido nicotínico
(DOMERGUE, 2005). Além disso, apesar do grande número de genes EPA,
demonstrou-se que a deleção do EPA1 sozinho reduz a adesão in vitro sugerindo que a
aderência à células epiteliais humanas é mediada em grande parte por uma adesina
única, Epa1p, codificada pelo gene EPA1, uma lecitina dependente de Ca2+ (LI, FANG
et al., 2007; IELASI; DECANNIERE; WILLAERT, 2012).
Epa1p é membro de uma grande classe de proteína da parede celular ancorada à
glicosil fosfatidilinositol (GPI) (GPI-CWPs) encontradas em diversas espécies de
fungos (BRUL et al., 1997; KAPTEYN; VAN DEN ENDE; KLIS, 1999; BRUNEAU
et al., 2001).
Estudos relacionados a genômica comparativa entre as espécies de Candida
revelaram que C. parapsilosis revelaram que esta espécie poderia apresentar proteínas
Als embora nem todos os membros encontrados em C. albicans sejam encontrados em
C. parapsilosis como é o caso de Als3 encontrada apenas em C. albicans e não em
11
outras espécies de Candida (BUTLER et al., 2009) Analisando a expressão gênica
durante a formação de biofilme em condições de hipóxia por 24 e 50h, outro
experimento identificou cinco membros da família ALS em C. parapsilosis por qRTPCR (ROSSIGNOL et al., 2009).
Estudos recentes comparam a atuação de alguns genes relacionados à adesão entre
C. albicans e C. parapsilosis (DING et al., 2011). O produto do gene BCR1 (biofilm
and wall cell regulator) é um fator de transcrição conservado requerido na formação
de biofilme tanto em C. albicans quanto em C. parapsilosis. Alguns dos principais
alvos de BCR1 em C. albicans incluem genes que codificam adesinas e proteínas de
parede celular (ALS1, ALS3, HWP1 e genes relacionados) sugerindo que BCR1 está
envolvido na fase inicial da adesão e desenvolvimento de biofilme.
Descrevendo uma análise do papel da BCR1 em C. parapsilosis, Ding et al (2011)
mostraram que C. parapsilosis gera biofilmes in vivo em modelo de cateter em ratos, e
que BCR1 é necessário para este processo, além disso demonstraram existir pouca
sobreposição entre os alvos de BCR1 nas duas espécies.
2.3 Adesão a células epiteliais
A adesão de Candida às células epiteliais é fator crítico inicial no processo de
infecção sendo essencial tanto para a colonização e indução da doença mucosa
subsequente. Além disso, colonização de superfícies mucosas é um fator de risco
conhecido para candidíase disseminada (MARR et al., 2000; TAKESUE et al., 2004)
porque a adesão é essencial para a Candida persistir na superfície mucosa. Desta forma,
não é surpreendente que este organismo expresse múltiplas estruturas distintas de
superfície que medeiam a adesão às células epiteliais. (CALDERONE et al., 2000;
SUNDSTROM, 2002; YANG, 2003; WHITEWAY; OBERHOLZER, 2004).
C. albicans provoca frequentemente infecções superficiais através da invasão e
destruição de células epiteliais, mas também pode causar infecções sistêmicas por
penetrar através das barreiras epiteliais e pode invadir células epiteliais. A invasão de
tecidos por C. albicans passa por várias etapas: adesão ao epitélio; penetração epitelial e
invasão pelas hifas; difusão vascular, o qual envolve a penetração de hifas nos vasos
sanguíneos e o depósito das células de levedura para a corrente sanguínea, e, finalmente
12
colonização, endotelial e penetração durante doença disseminada (Figura 2)
(WACHTLER et al., 2012).
Figura 2 - Etapas do processo de invasão tecidual por Candida (GOW et al., 2012)
Hifa
Célula de levedura
Adesão e
colonização
Penetração das
hifas e invasão
Disseminação
vascular
Colonização do
endotélio e penetração
Células epiteliais da mucosa não só fornecem uma barreira física, mas também
podem reconhecer fungos e responder através da produção de citocinas (WEINDL et al.,
2007; LI, L.; DONGARI-BAGTZOGLOU, 2009). C. albicans interage estreitamente
com estas células, tanto como um comensal como durante as fases ativas de invasão.
Superfícies mucosas em indivíduos saudáveis são frequentemente colonizados por C.
albicans. Um número relativamente pequeno de células de levedura presentes não induz
danos em células epiteliais e, assim, não desencadeia uma resposta de citocinas em
células epiteliais das mucosas ou em macrófagos. A doença invasiva ocorre quando C.
albicans atravessa a superfícies do tecido. Um mecanismo pelo qual células de
leveduras podem atravessar a superfície epitelial é endocitose, em que o fungo é
internalizado pelas células epiteliais e pode ocorrer através de dois mecanismos
13
distintos: endocitose induzida, que é análoga ao que ocorre em bactérias
enteropatogênicas intracelulares facultativas, e penetração ativa, semelhantes a fungos
fitopatogênicos (MORENO-RUIZ et al., 2009; DALLE et al., 2010; MARTIN et al.,
2011; WACHTLER et al., 2012). Trabalhos recentes demonstraram que a endocitose
induzida contribui consideravelmente para os momentos iniciais da invasão, enquanto
que a penetração ativa representa a via dominante de invasão epitelial (WACHTLER et
al., 2012).
Embora tanto a levedura como as hifas sejam capazes de induzir a endocitose,
acredita-se que hifas de C. albicans sejam mais eficazes para estimular o processo. Este
ponto de vista é suportado pela observação de que mutantes que não apresentam a
capacidade de formar hifas são muito menos eficazes na indução de endocitose em
comparação com células do tipo selvagem (PARK et al., 2005). Isso sugere que hifas
podem apresentar moléculas em sua parede celular que ligam-se a receptores de células
epiteliais conduzindo à indução da endocitose. Uma dessas moléculas pode ser Als3,
uma proteína de superfície celular que se liga a E-caderina e N-caderina e induz
endocitose.
2.4 Adesão a materiais inertes
Espécies de Candida podem aderir a uma grande variedade de superfícies diferentes
no corpo humano, o que facilita a colonização em diversos órgãos ou tecidos e até
mesmo superfícies abióticas que, eventualmente, pode ser utilizada com finalidade
terapêutica tais como metais, silicone, plásticos, entre outras. Tais locais podem
fornecer ambientes muito diferentes para crescimento e colonização de Candida e esta
tem desenvolvido mecanismos específicos de adaptação às respectivas condições.
Consequência disso é o fato de Candida ser capaz de crescer em vários tipos de
superfícies, levando a formação de biofilme em cateteres, por exemplo, o que representa
um grande problema especialmente em unidades de terapia intensiva (KUMAMOTO,
2002; DOUGLAS, L. J., 2003).
Espécies como C. parapsilosis e C. albicans têm sido constantemente identificadas
como causadoras de candidemia. A elevada frequência, principalmente de C.
parapsilosis pode ser explicada pela alta capacidade desta espécie em aderir a
14
superfícies plásticas tais como o cateter (DAGDEVIREN; CERIKCIOGLU;
KARAVUS, 2005).
Um estudo recente, avaliando a adesão de espécies de Candida não-Candida
albicans (CNCA) isoladas de urina, evidenciou que todas as estirpes de CNCA foram
aderentes a silicone, embora tenham sido observadas diferenças de acordo com as
espécies e as cepas estudadas. (SILVA, S. et al., 2010). Outro estudo de aderência,
dessa vez com C. parapsilosis (KUHN et al., 2004), neste mesmo material, mostrou
que essa propriedade também se constituiu como um fator comum entre os isolados
testados. Em outro estudo onde foi comparada a capacidade de adesão entre C.
parapsilosis e C. albicans, também em cateter de silicone e foi observado que a
capacidade de aderência foi a mesma para ambas as espécies (KOJIC; DAROUICHE,
2003).
2.5 Influência de carboidratos no processo de aderência
Devido a importância da propriedade de aderência na patogênese de Candida,
substâncias que possam interferir nesse processo devem ser cuidadosamente estudadas
no intuito de fornecer alvos terapêuticos alternativos novos e menos onerosos.
Carboidratos comumente consumidos na dieta como glicose e sacarose, podem ser de
importância na patogênese de C. albicans na cavidade oral, devido o efeito de tais
açúcares na aderência da levedura in vitro (OLSEN, 1990). C. albicans cresce em meio
definido com altas concentrações (500 mM) de carboidratos da dieta exibindo aderência
aumentada a superfícies acrílicas (SAMARANAYAKE, L. P.; MCCOURTIE;
MACFARLANE, 1980; SAMARANAYAKE, L. P.; MACFARLANE, 1982).
Estudos anteriores já haviam demonstrado que a aderência de C. albicans a
superfícies de acrílico e às células epiteliais foi intensificada após crescimento das
leveduras em meio contendo altas concentrações de vários açúcares como fonte de
carbono
(DOUGLAS,
J.;
HOUSTON;
MCCOURTIE,
1981).
Samaranayake,
MacFarlane (1982) mostraram que leveduras incubadas com sacarose e glicose
apresentaram melhor aderência a acrílicos que os controles crescidos em meios sem
açúcar. Estudo recente demonstrou que os hidratos de carbono na dieta podem modular
15
o desenvolvimento de biofilmes de C. albicans na superfície de dentadura (SANTANA
et al., 2013).
A aderência de Candida às superfícies epiteliais parece ser similarmente promovida,
mas poucas investigações após crescimento em diversas fontes de carbono têm sido
feitas (ABU-ELTEEN, 2005). Os efeitos de vários tipos de carboidratos tais como
frutose, lactose, maltose e xilitol no mecanismo de aderência, são também pobremente
entendidos, e não existem resultados com outras fontes de carbono. Além disso, a
maioria dos relatos referem-se a estudos com C. albicans, desse modo há pouca
informação em relação à adesão em espécies de CNCA tais como C. tropicalis, C.
glabrata e C. parapsilosis.
2.6 Aspectos moleculares da adesão
Existem vários genes que medeiam a aderência de Candida a células hospedeiras.
Esses genes codificam proteínas genericamente chamadas de adesinas por sua atuação
no processo adesão. Algumas dessas proteínas são conhecidas como invasinas, pois
atuam no início do processo como as proteínas Sap (aspartil proteases ácidas) e as
proteínas Als (sequências semelhantes a aglutininas). Essas proteínas são codificadas
pelos genes da família SAP e ALS, respectivamente (HOYER et al, 1998, NAGLIK,
2003).
Naglik et al. (2004) demonstraram a participação de genes da família SAP na
infecção de mucosas (SAP1, SAP2 e SAP3) e em infecções sistêmicas (SAP4, SAP5 e
SAP6). Em formas leveduriformes de C. albicans, a expressão dos genes SAP1 a SAP3 é
mais intensa que nas formas filamentosas onde a expressão dos genes SAP4 a SAP6 é
mais acentuada (Figura 3). Estudos identificaram genes SAP em outras espécies de
Candida incluindo C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. guilhermondii
(MONOD et al., 1994; GILFILLAN et al., 1998).
Estudos demonstram que a atuação de proteínas Sap pode facilitar no processo de
aderência uma vez que essas enzimas têm a capacidade de degradar proteínas da
membrana celular da célula hospedeira permitindo a adesão e invasão da célula fúngica
(BORG-VON ZEPELIN et al., 1999).
16
Figura 3 - Possível atuação dos genes da família SAP na patogênese de Candida (NAGLIK, J. et al.,
2004)
SAP1 – Invasão
da pele
SAP 1 e 3 –
Aderência a
epitélio bucal
SAP 1, 2 e 3 Invasão/dano
tecidual
SAP
SAP 4, 5 e 6 –
Infecção
sistêmica
SAP 5, 6 e 7 –
Biofilme
SAP 4, 5 e 6 –
Dimorfismo
hifal específico
SAP 2 Interação
sistema imune
As aspartil proteases (Sap) de C. albicans são codificadas por 10 genes. A família de
genes SAP favorece a atuação de um sistema proteolítico indispensável tanto no
comensalismo quanto no desenvolvimento de infecções, pois permitem a aquisição de
nutrientes pela proteólise de substratos do hospedeiro (HUBE; NAGLIK, 2001;
ZAUGG et al., 2001).
Todos os 10 genes da família SAP de C. albicans codificam pro-enzimas contendo
cerca de 60 aminoácidos a mais do que a enzima madura que são processadas durante o
transporte através da via secretora. As enzimas maduras contêm motivos de sequência
típica para todas as aspartil proteases, incluindo dois resíduos de aspartato conservados
em local ativo e de resíduos de cisteína conservados envolvidos na manutenção da
estrutura tri-dimensional (MONOD et
al., 1994; PICHOVA et
al., 2001;
STANISZEWSKA et al., 2012).
C. albicans também possui uma grande família de genes ALS (Agglutinin-like
sequences) (HOYER et al., 2001) composta por nove genes (HOYER et al., 1995;
HOYER; PAYNE; HECHT, 1998; GAUR; KLOTZ; HENDERSON, 1999; HOYER;
HECHT, 2001) responsáveis por codificar proteínas Als como as Als1p (FU et al.,
17
1998), Als3p (GAUR; KLOTZ, 1997) e Als5p (HOYER; PAYNE; HECHT, 1998),
adesinas envolvidas em vários outros processos além da adesão celular.
Muitas adesinas como Eap1 e Als3 foram identificadas e caracterizadas por sua
expressão em S. cerevisiae (GAUR; KLOTZ, 1997; LI, F.; PALECEK, 2003). No
intuito de entender mais a respeito das novas estratégias de interação patógenohospedeiro, foram identificadas proteínas adicionais com possíveis funções adesivas.
Sohn et al (2006) identificaram diversos candidatos pelo perfil transcricional de células
de C. albicans. Foram utilizados substratos abióticos como poliestireno além de células
epiteliais. A expressão de genes, PGA7, PGA23, PRA1 e AUF8 foi induzida em todos
os casos durante a adesão a diferentes substratos, mas não foram expressos sob idênticas
condições em cultura em suspensão.
De maneira similar ao que ocorre com os membros da família SAP (proteases ácidas
de aspartato), os genes ALS são expressos diferencialmente sob uma variedade de
condições em C. albicans; (HOYER et al., 1995; HOYER et al., 1998; HOYER;
PAYNE; HECHT, 1998).
Se essas famílias gênicas desempenham uma função importante na patogênese de C.
albicans, é possível que elas também contribuam para a patogenicidade de espécies de
CNCA clinicamente relevantes (HOYER et al., 2001).
Análises por Southern blot com sondas específicas para detecção de ALS tem
sugerido a presença de famílias gênicas ALS em C. dubliniensis e C. tropicalis, sendo
que três genes ALS já foram isolados para cada espécie (HOYER et al., 2001). Estes
resultados preliminares também sugeriram que há número similar de genes ALS em C.
albicans e C. dubliniensis.
Estudos a respeito de genes de aderência em espécies de CNCA ainda são poucos,
entretanto, a pesquisa em bioinformática por famílias de genes patógeno-específicos
de espécies de Candida revelou uma série de genes que codificam proteínas da parede
celular em C. parapsilosis. Este estudo incluiu cinco genes ALS e seis genes foram
previstos para proteína ancorada glicosil fosfatidilinositol 30 (Pga30).
No que diz respeito às proteínas da parede celular de C. tropicalis, pelo menos três
genes que codificam proteínas Als foram identificados utilizando primers degenerados
18
(Hoyer, 2001). Entretanto, ao avaliar a presença de ALS3 em C. albicans, C. tropicalis
e C. glabrata esse gene só foi encontrado em C. albicans (NASCIMENTO, 2009).
Outro estudo também verificou que a amplificação de genes relacionados à adesão
como ALS2 e ALS3 foi observada em todos os isolados de C. albicans e em nenhum de
C. tropicalis (COSTA, 2009). A nosso conhecimento, nenhum outro trabalho foi
realizado nesta área.
A integrina1 (Int1) é uma proteína de superfície de C. albicans que apresenta alta
similaridade com as integrinas de vertebrados. A expressão do gene INT1 em
Saccharomyces cerevisae foi suficiente para torná-lo aderente a células epiteliais
humanas apesar de normalmente essa espécie não apresentar tal característica. Além
disso, a mutação em INT1 em C. albicans suprime o desenvolvimento das hifas, a
adesão a células epiteliais e a virulência das amostras em camundongos (GALE et al.,
1998).
O gene INT1 de C. albicans foi originalmente clonado devido a sua similaridade
com integrinas de leucócitos de vertebrados, adesinas que se ligam a proteínas da matriz
extracelular e induzem mudanças morfológicas em resposta a sinais extracelulares
(KLOTZ, S. A.; PENDRAK; HEIN, 2001).
Outra importante adesina de C. albicans, a Hwp1, é encontrada na superfície dos
tubos germinativos e participa da regulação de ligações a células epiteliais (CHAFFIN
et al., 1998). Por ser um substrado para transglutaminases, está intimamente relacionada
com a patogênese em candidíase sistêmica.
Isolados que não apresentam o gene HWP1 não podem aderir de forma eficiente em
células epiteliais bucais e tem capacidade reduzida em causar candidíase sistêmica em
ratos (STAAB; SUNDSTROM, 1998; PADOVAN et al., 2009).
2.6.1 A família gênica ALS
A família de genes ALS (sequências semelhantes à aglutinina) codifica oito
glicoproteínas de superfície celular que exibem função de adesão a células hospedeiras
(GAUR; KLOTZ, 1997; FU et al., 1998; HOYER et al., 2001; ZHAO et al., 2004). A
19
organização básica desses genes (Figura 4) é semelhante entre os membros da família
consistindo em três domínios gerais.
Um domínio relativamente conservado existe na região 5’ com cerca de 1300 pb e
50-90% de identidade entre os membros (HOYER; HECHT, 2001), codificando uma
região da proteína que compreende 320 a 330 aminoácidos iniciais que é exibida na
superfície da célula pelo restante da proteína madura, a qual, devido à sua pesada
glicosilação, assume uma conformação alongada (JENTOFT, 1990; KAPTEYN et al.,
2000; HOYER et al., 2001). Acredita-se que para alguns genes ALS, a variabilidade de
sequência existente dentro do domínio 5’ esteja relacionada ao principal domínio
adesivo da proteína Als (HOYER; HECHT, 2000; ZHAO et al., 2003).
Figura 4 - Desenho esquemático da estrutura dos genes da família ALS (Fonte: Hoyer, 1998)
Domínio 5’
Domínio de tandem repeats
Domínio 3’
O domínio central é composto por sequências repetidas in tandem de 108 pb
variáveis em tamanho e sequência. Dentro de um gene ALS o tamanho da região varia
consideravelmente entre os alelos devido a diferença de números de cópias da sequência
de 108 pb presente. O domínio 3’ é relativamente variável em tamanho e sequência
(HOYER et al., 2001; ZHAO et al., 2007) e juntamente com a região de tandem repeats
codifica uma sequência de aminoácidos (aproximadamente 100) rica em serina e
treonina que é altamente glicosilada na proteína madura (ZHANG et al., 2003; ZHAO et
al., 2003).
Embora as unidades dos tandem repeats em cada gene ALS seja de 108 pb, a
sequência básica das unidades repetidas é variável e pode ser usada para classificar os
genes ALS em três subfamílias consistindo em: i) ALS1 a ALS4; ii) ALS5 a ALS7; e iii)
ALS9 (HOYER et al., 2008). Deleção de genes individuais de ALS e ensaios fenotípicos
em linhagens mutantes de C. albicans demonstraram que ALS1, ALS2, ALS3, ALS4 e
ALS9 podem contribuir para adesão de C. albicans (FU et al., 2002; ZHAO et al., 2003;
20
ZHAO et al., 2005; ZHAO et al., 2007). A super expressão de genes ALS em S.
cerevisiae sugeriu um papel adesivo também para ALS5 e ALS6 (GAUR; KLOTZ,
1997; SHEPPARD et al., 2004) mas ainda há muito a ser esclarecido sobre a presença e
o papel desses genes nas demais espécies do gênero Candida .
No locus ALS3, C. albicans tende a manter os alelos heterozigotos com relação ao
número de cópias da sequência de repetição in tandem presentes no domínio central
(OH et al., 2005). Testes fenotípicos em C. albicans mostraram que o alelo ALS3 com
12 cópias repetidas in tandem apresentaram maior contribuição na adesão às superfícies
endotelial e epitelial, enquanto que o alelo ALS3 com nove repetições apresentaram uma
contribuição significativa, mas muito pequena no processo adesivo (OH et al., 2005).
A recombinação homóloga entre as sequências de repetições in tandem presentes em
genes ALS poderia explicar as diferentes histórias de genes co-localizados em um
organismo predominantemente clonal, como C. albicans.
21
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Analisar os aspectos celulares e moleculares da propriedade de aderência in vitro de
espécies de Candida a superfícies abióticas e bióticas.
3.2 Específicos

Verificar o nível de hidrofobicidade celular de espécies de Candida;

Verificar a capacidade de aderência de Candida a materiais inertes (lamínulas de
vidro, látex siliconado e inox);

Analisar a capacidade de aderência in vitro de Candida às células Hep-2;

Comparar a capacidade de aderência às diferentes superfícies entre as espécies
analisadas;

Correlacionar a capacidade de aderência das espécies com hidrofobicidade
celular;

Verificar a influência de diferentes carboidratos no processo de aderência de
Candida

Verificar a presença de genes ALS nos isolados de Candida albicans;

Associar a propriedade de aderência dos isolados de C. albicans com a presença
dos genes da família ALS.
22
4 METODOLOGIA
4.1 Isolamento das Amostras
No presente estudo foram utilizadas 79 amostras clínicas provenientes de diversos
sítios (sangue, ponta de cateter, secreção traqueal, secreção vaginal e urina) obtidas de
um laboratório particular da cidade de São Luís – MA, gentilmente cedidas e
depositadas na micoteca do Laboratório de Micologia do Núcleo de Doenças Endêmicas
e Parasitárias do UNICEUMA (Tabela 1).
Tabela 1 - Distribuição dos 79 isolados clínicos de Candida entre as diferentes espécies e sítios de origem
Espécies
Sítios anatômicos de origem da amostra
Urina Sangue Secreção Secreção Ponta de
Não
Total
Vaginal Traqueal Cateter definido
C. albicans
11
-
2
11
-
0
24
C. parapsilosis
5
10
-
-
4
1
20
C. tropicalis
8
3
-
5
-
2
18
C. glabrata
14
-
-
3
-
-
17
TOTAL
38
13
2
19
4
3
79
Todas as leveduras foram previamente identificadas pelo sistema automatizado
VITEK (bioMérieux).
As culturas estoque foram mantidas a -20ºC em caldo BHI (Brain Heart Infusion –
Acumedia Manufactures). Após recuperação, as linhagens foram mantidas em meio
SDA com Cloranfenicol, estocadas a 4ºC durante o período experimental sendo
renovadas de 10 em 10 dias para preservação de suas propriedades.
4.2 Determinação da hidrofobicidade celular
As amostras de Candida foram crescidas em meio SDA a 37°C por 24h. As culturas
foram suspensas em solução PBS (Tampão fosfato salina) (PBS, 0,01 M, pH 7,4) e
testadas para evidenciar isolados autoaglutinadores. Em caso de resultado negativo
neste teste, os isolados foram então suspensos com concentrações crescentes de sulfato
23
de amônio, de 0,5M, 1,0M, 1,5M, 2,0M, 2,5M e 3,0M. A formação de grumos em até
dois minutos após a suspensão indica resultado positivo (SCHMIDT et al., 1998). A
formação de grumos em concentrações até 1,5 M de sulfato de amônio indica
hidrofobicidade forte, a partir de 1,5 até 2,5M, moderada e acima de 2,5M fraca
(LOCATELLI et al., 2004).
4.3 Ensaio de adesão a material inerte
4.3.1 Adesão à lamínula
Para a análise da aderência, lamínulas de vidro redondas estéreis (Glasscyto) foram
colocadas em placas de microtitulação de 24 poços (TPP Zellkultur Testplatte 24F). Um
poço foi utilizado como controle recebendo apenas meio de cultura para garantir a
integridade do meio. Os demais poços receberam 40µL de inóculo (106 UFC/mL) + 960
µL de BHI suplementado com 6% de glicose. As placas de microtitulação foram
incubadas a 37°C durante 8h. Posteriormente, o meio de incubação foi removido e as
microplacas lavadas com água ultrapura para remover as células não aderidas. As
lamínulas foram coradas com 1% (v/v) de violeta cristal por cinco minutos,
posteriormente lavadas com água ultrapura estéril para remover o excesso de corante, e
colocadas sobre lâminas para visualização em microscopia óptica (NIKON Eclipse
E100). O experimento foi realizado em triplicata.
4.3.2 Classificação da aderência
A classificação da capacidade de aderência à lamínula foi estabelecida baseado no
trabalho de Emira et al (2011) de acordo com a quantidade de células aderidas nas
lamínulas por campo, em um microscópio óptico, com aumento de 1000 vezes
(BIASOLI; TOSELLO; MAGARO, 2002). Foram contadas as leveduras aderidas em
cada lamínula, em um máximo de 70 campos, escolhidos aleatoriamente e em sentido
unidirecional. Considerou-se negativo quando não foi observada qualquer célula de
levedura em 70 campos; fraco (+), quando havia entre 1 e 10 leveduras aderidas por
campo em 50 campos analisados; moderada (++) quando havia mais de 10 leveduras
aderidas por campo em 30 campos observados; e, forte quando foram contabilizadas 25
ou mais leveduras aderidas por campo em um total de 20 campos analisados. As
24
análises foram realizadas por dois observadores para melhor certificação dos resultados.
Não houve diferenças discrepantes dos resultados dos dois observadores.
Os padrões de arranjo celular de Candida às lamínulas de vidro são assim
classificadas: padrão difuso quando as células de levedura aderem a toda a superfície da
lamínula de vidro, sem formar grupos de células; adesão localizada que envolve grupos
de leveduras que aderem a regiões localizadas da lamínula; agregativa que é
caracterizada por grumos de leveduras que se arranjam como “tijolos empilhados” ou
“cachos de uva” que se ligam à superfície da lâmina de vidro. A formação de filamentos
ou pseudo-hifas ao longo da superfície da lamínula caracterizou o padrão filamentoso
ou pseudo-hifal (MENEZES et al., 2013).
4.3.3 Adesão ao silicone e inox
Este protocolo foi utilizado com algumas adaptações para os dois materiais citados.
Foram utilizados fragmentos de látex siliconizado (cateter urinário, Solidor®) medindo
0,5 mm de diâmetro e fragmentos de agulha medindo 1 cm. Os fragmentos de silicone,
inox foram lavados e esterilizados em tubos contendo 5 mL de meio BHI.
Amostras de Candida crescidas em SDA com Cloranfenicol (Acumedia) por 24h
foram ressuspendidas em solução salina a 0,85% e padronizadas para aproximadamente
106 UFC/mL de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland. Após a
padronização, 0,1 mL do inóculo fúngico foi adicionado ao meio contendo o fragmento
estudado por 8h a 37ºC.
Após este período, os fragmentos foram lavados com solução salina estéril e
cuidadosamente colocados em tubos contendo 5 mL com a mesma solução e, em
seguida, agitados em vórtex por 30s. Foram adicionadas alíquotas de 0,1mL desta
solução a placas contendo SDA e os inóculos espalhados com auxílio de alça de
Drigalski. Após 24h de incubação, foi determinado o número de unidades formadoras
de colônia (UFCs) por 0,1 mL de Candida recuperada de cada fragmento avaliado.
No presente estudo foi proposta uma classificação da aderência a esses materiais.
Foram classificadas como negativas as amostras que não apresentram UFCs ao final do
processo. Foram classificadas como aderentes fracas as amostras que apresentaram
25
crescimento entre uma e 199 UFCs, moderada de 200 a 499, fortemente aderentes
aquelas com 500 a 1000 UFCs e muito fortes aquelas com mais de 1000 UFCs.
4.4 Ensaio de adesão a células epiteliais
4.4.1 Cultivo e preparo das monocamadas celulares
As células humanas (HEp-2, provenientes de carcinoma de laringe) foram cultivadas
em frascos de 25 cm2, contendo meio DMEM (Dulbecco's modified Eagles's médium)
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), a 37ºC. O controle do pH foi
garantido pela adição de 3,0 g/L de N-(2-hidroxietil)-piperazina-N-(2-ácido
etanosulfônico) (HEPES) e 2,0 g/L de NaHCO3 na composição do meio, como
previamente descrito por Freshney (1994). Um inóculo inicial de 5 x 104 células/mL foi
utilizado e as culturas mantidas na fase logarítmica de crescimento.
As células epiteliais foram cultivadas sobre lamínulas distribuídas em placas de 24
poços. A cada poço contendo 5 x 104 células animais foi adicionada uma suspensão de
leveduras preparadas conforme descrito a seguir.
4.4.2 Preparação do Inóculo e Teste de Adesão
As leveduras foram cultivadas em meio BHI durante 24 horas e lavadas três vezes
em PBS sendo, posteriormente, ressuspendidas no mesmo tampão com o mesmo
volume inicial. Um inoculo de 40 µL de Candida foi adicionado às microplacas de 24
poços contendo monocamadas semi confluentes de células em meio MEM e soro fetal
bovino a 2%. Após 3h de incubação a 37 °C, as placas foram lavadas em PBS e fixadas
com metanol durante um mínimo de 12 horas. A coloração utilizada foi MayGrunwald/Giemsa e posteriormente as lamínulas foram analisadas para a adesão ao
microscópio óptico padrão (Nikon) (SCALETSKY; SILVA; TRABULSI, 1984).
4.4.3 Classificação da aderência
Para o padrão de aderência, considerou-se adesão do tipo difuso quando as colônias
de Candida encontravam-se aderidas de forma isoladas às células animais; localizado
quando encontravam-se agrupadas em pequenos grumos em torno da célula; agregativo
26
quando as colônias formavam uma massa ou emaranhado em torno das células; e,
pseudo-hifal, quando essas leveduras produziram pseudo-hifas (MENEZES et al.,
2013).
4.5 Influência de carboidratos no processo de aderência
Para verificar a capacidade de aderência na presença de carboidratos, isolados de
quatro espécies de Candida (C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata),
foram testados na presença de cinco carboidratos (glicose, manose, rafinose, galactose e
lactose) para avaliar a interferência de tais substâncias no processo.
4.5.1 Preparação dos carboidratos
Todos os carboidratos foram preparados na concentração de 1% e diluídos
diretamente em meio YNB (Yeast Nitrogen Base). Após a adição dos carboidratos as
soluções foram esterilizadas em filtros de seringa de 0,22 µM e utilizadas no mesmo dia
do preparo.
4.5.2 Teste de aderência
Isolados de Candida foram incubados a 37°C por 24h em SDA para obtenção de
culturas novas. Colônias isoladas foram transferidas para tubos contendo 3 ml de meio
YNB 1x com 50 mM de glicose e incubados por 18 a 20h a 37°C. Após esse período, as
amostras foram lavadas duas vezes em PBS 1x e, posteriormente, 3ml de solução de
cada carboidrato foram adicionados aos tubos contendo as células de Candida. No tubo
utilizado como controle, somente o meio puro foi adicionado.
O teste de adesão foi realizado utilizando-se 1 ml da solução de Candida +
carboidrato (ou Candida + meio no caso do controle) em uma placa de 24 poços
contendo lamínulas redondas estéreis e incubadas por 3h a 37°C. Em seguida a placa foi
lavada três vezes com PBS 1x, corada com cristal violeta e após nova lavagem, as
lamínulas foram retiradas e observadas ao microscópio ótico (aumento 1000x) para a
contagem das células aderidas. Considerou-se a média no número de células contadas
em 30 campos para a comparação dos resultados
27
4.6 Identificação molecular de genes da família ALS
4.6.1 Extração de DNA
Colônias isoladas foram retiradas diretamente de placas de cultivo (crescidas por 18
horas em placas em SDA) e colocadas em microtubos de 1,5 mL contendo 200 µL de
Tampão de Lise (TL). O TL é composto de 200mM TRIS pH 8,0, 25mM de EDTA,
100mM de NaCl e 1% SDS.
Posteriormente as células sofreram lise mecânica com auxílio de um agitador de
tubos por aproximadamente 3 minutos. Após acrescentar-se mais 400 µL de TL os
microtubos foram incubados por 65ºC durante 10 a 20 minutos.
A extração de proteínas-gorduras-polissacarídeos foi realizada com acréscimo de
500µL de CIA (24 Clorofórmio: 1 Álcool Isoamílico) aos tubos e centrifugados por 5
minutos a 9.167g em microcentrífuga a temperatura ambiente. Retirado o sobrenadante,
acrescentou-se álcool etílico absoluto gelado para precipitação dos ácidos nucléicos.
Este foi centrifugado imediatamente para coleta de DNA ou incubado a -20ºC durante 4
horas para que haja maior quantidade de DNA precipitado. O DNA recuperado foi
lavado em etanol 70% e ressuspendido em 40 µL de tampão TE (ALVES, 2010).
A qualidade e a quantidade de DNA obtido foram avaliadas visualmente em gel de
agarose a 0,8% (SAMBROOK; FRTSCH; MANIATIS, 2002).
4.6.2 Amplificação por PCR
A PCR amplifica as regiões específicas para cada primer e segue recomendações de
Mota (2007). Para uma reação de 25µL foi utilizado 1- 10 ng de DNA, 1x do tampão da
reação (fornecido pelo fabricante e contendo de 1,5 mM MgCl2), 0,2mM de dNTPs, 0,4
µM de cada iniciador, 0,2 µL de TaqDNA polimerase (5U/µL) e o restante do volume
foi completado com água ultrapura (MOTA, 2007). A visualização dos fragmentos
amplificados de DNA foi verificada em gel de agarose a 1,5% ou 2,0% (dependendo do
tamanho dos fragmentos amplificados) corado com brometo de etídio (10mg/mL). Um
marcador molecular de 100 pb foi utilizado na concentração de 50ng misturado ao
tampão de corrida. As amostras foram separadas por eletroforese com voltagem
aproximada de 5V/cm de gel (SAMBROOK et al., 2002).
28
Os primers utilizados nessa pesquisa estão relacionados na tabela a seguir.
Tabela 2 - Primers para amplificação por PCR utilizados na pesquisa
PRIMER
SEQUÊNCIA (5’-3’)
REFERÊNCIA
FRAGMENTO
(pb)
ALS1 – F
ALS1 – R
5’-GACTAGTGAACCAACAAATACCAGA-3’
5’-CCAGAAGAAACAGCAGGTGA-3’
318
ALS 2 – F
ALS2 – R
5- CCAAGTATTAACAAAGTTTCAATCACTTAT-3′
5′-TCTCAATCTTAAATTGAACGGCTTAC-3′
ALS3 – F
ALS3 – R
5’-CCACTTCACAATCCCCATC-3’
5’-CAGCAGTAGTAGTAACAGTAGTAGTTTCATC-3’
ALS4 – F
ALS4 – R
5’-CCCAGTCTTTCACAAGCAGTAAAT-3’
GTAAATGAGTCATCAACAGAAGCC-3’
ALS5 – F
ALS5 – R
5’- TGACTACTTCCAGATTTATGCCGAG-3’
5’- ATTGATACTGGTTATTATCTGAGGGAGAAA-3’
ALS5t – F
ALS5t – R
5’- GGT ACA GTT CCA CTG CCA AA – 3’
5’ – AAG ACA GTT CTT CCA ATG GAT CA – 3’
ALS6 – F
ALS6 – R
5’- GACTCCACAATCATCTAGTAGCTTGGTTT-3’
5’- CAATTGTCACATCATCTTTTGTTGC-3’
(PANIAGUACONTRERAS
et al., 2010)
(PANIAGUACONTRERAS
et al., 2010)
(PANIAGUACONTRERAS
et al., 2010)
(PANIAGUACONTRERAS
et al., 2010)
(PANIAGUACONTRERAS
et al., 2010)
(HOYER;
PAYNE;
HECHT, 1998)
(PANIAGUACONTRERAS
et al., 2010)
366
342
356
318
Variável
152
4.7 Análise estatística
Os dados foram analisados com o programa estatístico IBM SPSS Statistics 20.0
(2011). Inicialmente foram feitas as tabelas de frequências das variáveis.
Posteriormente, nos cruzamentos das variáveis classificatórias foi aplicado o teste do
qui-quadrado de independência (χ2). Depois aplicou-se o teste de correlação de
Spearman. Foi utilizado o ANOVA dois fatores para relacionar o número de células
com a espécie e meio e o teste de Tukey. Em todos os testes o nível de significância (α)
aplicado foi de 5%, ou seja, considerou-se significativo quando p < 0,05.
29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Determinação da hidrofobicidade celular
Estudos demonstram que a hidrofobicidade da superfície celular dos microorganismos pode estar relacionada com o mecanismo de adesão a superfícies
inanimadas e biológicas (CAPELLO; GUGLIELMINO, 2006) sugerindo que, quanto
mais hidrofóbico for a superfície do micro-organismo, mais facilmente ocorrerá o
processo de aderência pois, as propriedades físico-químicas da superfície podem exercer
uma forte influência sobre a adesão. O micro-organismo pode aderir mais facilmente às
superfícies hidrofóbicas (plásticas) do que às hidrofílicas (vidro ou metais).
A aglutinação em concentrações menores de sulfato de amônio demonstra maior
hidrofobicidade não sendo necessárias altas concentrações de sal para que as células se
agrupem. Baseado nisso, C. albicans foi a mais hidrofóbica entre as espécies testadas
(55,56%) apresentando aglutinação desde as menores concentrações de sulfato de
amônio, entretanto esse resultado não foi estatisticamente significante (p>0,05). As
demais espécies também apresentaram predominância de hidrofobicidade forte: 45,71%
dos isolados de C. glabrata, 46,67% dos de C. parapsilosis, 44,62% em C. tropicalis.
Além disso, isolados com hidrofobicidade moderada e fraca apresentaram proporções
bem semelhantes entre as espécies como pode ser observado na figura 5.
30
Figura 5 - Avaliação da hidrofobicidade de Candida em concentrações crescentes de sulfato de amônio.
Até 1,5 M: hidrofobicidade forte; entre 1,5 e 2,5M: moderada; acima de 2,5M: fraca
Forte
Moderado
Fraco
45,71
C. glabrata
40
14,29
46,67
C. parapsilosis
31,11
Espécie
22,22
44,62
C. tropicalis
35,38
20
55,56
C. albicans
31,11
13,33
0
10
20
30
40
Hidrofobicidade (%)
50
60
Na literatura há escassez de estudos que avaliem a hidrofobicidade em fungos. Em estudo
anterior realizado por Samaranayake (1995) com isolados orais de C. albicans e C.
krusei revelou que todos os isolados de C. krusei apresentaram hidrofobicidade
significativamente maior que os isolados de C. albicans o que difere dos nossos
resultados. Quando hidrofobicidade e aderência a superfícies foram comparados, os
autores verificaram uma correlação positiva entre a hidrofobicidade da superfície das
células de isolados de C. krusei e adesão a superfícies de células HeLa, mas não às
superfícies acrílicas (SAMARANAYAKE, Y. H. et al., 1995).
A determinação da hidrofobicidade de superfícies é uma medida importante, pois se
duas superfícies forem hidrofóbicas, a adesão pode ser termodinamicamente favorável,
visto que será mais fácil remover a água presente entre as duas superfícies para a adesão
ocorrer. A adesão de um micro-organismo a uma superfície sólida em solução aquosa só
se estabelece se o ﬁlme de água que reveste as duas superfícies for removido (ARAÚJO
et al., 2009).
31
Em nosso estudo, a capacidade de Candida de aglutinar-se na presença de sulfato de
amônio foi maior na concentração de até 1,5 M, hidrofobicidade considerada alta o que
poderia influenciar positivamente na capacidade de aderência de seus isolados.
5.2 Ensaio de adesão a material inerte
5.2.1 Aderência à lamínula
O teste de adesão à lamínula revelou que das 79 amostras avaliadas, 55 (69,62%)
foram positivas. A propriedade de aderência foi observada em 66,67% dos isolados de
C. albicans, número inferior aos resultados obtidos com C. parapsilosis (75%) e C.
tropicalis (83,33%). Entretanto, não foram observadas diferenças estatisticamente
significantes com relação à capacidade de aderência a lamínulas e as espécies estudadas
revelando que a aderência não varia de uma espécie para outra (p>0,05) (Figura 6). Esse
fato pode ser explicado pelo tamanho amostral. Se o tamanho amostral fosse maior,
essas diferenças, provavelmente, seriam mais acentuadas.
Figura 6–Frequência de isolados de Candida com capacidade de aderência a lamínula
Positivas
Frequência das amostras (%)
90
83,33
80
70
Negativas
75
66,67
60
52,94
47,06
50
40
33,33
30
25
16,67
20
10
0
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
Espécie
C. glabrata
Quando avaliada a intensidade de adesão entre os isolados verificou-se que 62,5%
dos isolados de C. albicans apresentaram aderência fraca, 25% mostraram adesão
moderada e 12,5% forte. A maioria dos isolados de C. tropicalis apresentou aderência
moderada com uma frequência de 53,33% enquanto 26,67% apresentaram aderência
32
fraca e 20% aderência forte. Nenhum isolado de C. glabrata apresentou aderência forte
sendo a maior parte dos resultados positivos classificados como aderentes fracos
(55,56%) (Figura 7).
Nesta pesquisa, todas as espécies de Candida estudadas foram capazes de aderir, fato
este corroborado por outros estudos que relatam a aderência de espécies de Candida a
materiais inertes (MORENO et al., 2009; SILVA, S. et al., 2010). Entretanto, é
importante notar que os isolados de espécies de Candida não C. albicans (CNCA)
foram mais aderentes. C. tropicalis destacou-se entre as espécies de CNCA com 83,33%
de amostras aderentes e, dentre estas, 14,55% foram fortemente aderentes (Figura 7).
Apesar de não terem sido observadas diferenças estatísticas significantes entre a
capacidade de adesão e a espécie, ao avaliar a intensidade de aderência, verificou-se que
esta varia de acordo com a espécie (p<0,05).
Figura 7 - Frequência da intensidade de aderência à lamínula entre as diferentes espécies de Candida.
Fraco
Moderado
Forte
70
62,5
60
55,56
53,33
46,67
50
44,44
40
30
33,33
26,67
25
20,00
20,00
20
12,50
10
0,00
0
C. albicans
C. tropicalis Espécie C. glabrata
C. parapsilosis
Um estudo recente comparando isolados de Candida provenientes de indivíduos com
AIDS e indivíduos imunocompetentes, revelou que 85,7% dos isolados oriundos de
pacientes com HIV e 100% dos isolados de Candida de indivíduos normais foram
aderentes a lamínulas de vidro (BRANCO, 2012). Embora não tenham sido observadas
diferenças significativas na capacidade de aderência entre as espécies, esses resultados
33
corroboram com os desta pesquisa no que se refere à alta capacidade de aderência de
isolados de Candida a lamínulas de vidro.
O estudo de Moreno et al. (2009), verificando a capacidade de aderência a resina
acrílica em isolados de Candida, mostrou que C. tropicalis, dentre as espécies
analisadas, apresentou maior capacidade de adesão, seguida de C. dubliniensis e C.
albicans. De fato, C. tropicalis tem emergido como o segundo ou terceiro agente mais
comum de candidemia, principalmente em pacientes com câncer (WEINBERGER et al.,
2005; NUCCI; COLOMBO, 2007). Além disso, uma incidência elevada de C. tropicalis
como agente causal de infecções nosocomiais do trato urinário tem sido relatado (RHO
et al., 2004).
Não houve associação estatística entre a hidrofobicidade das espécies e a capacidade
de aderência à lamínula.
As amostras também foram classificadas quanto aos padrões de aderência às
lamínulas. O padrão mais comum foi o agregativo observado em 34,55% dos isolados,
seguido dos padrões localizado (27,27%), difuso (23,64%) e pseudo-hifal (14,55%)
(Figura 8).
O padrão pseudo-hifal foi o mais comum em C. parapsilosis presente em 40% dos
isolados. Somente um isolado de C. albicans apresentou padrão de aderência pseudohifal que também foi observado somente em um isolado de C. tropicalis. Em C.
albicans houve predominância de padrão tipo agregativo (62,5%) enquanto os padrões
localizado e difuso (44,44%) foram os predominantes em isolados de C. glabrata, e os
agregativo e localizado (33,33%) mais presentes nos de C. tropicalis. Houve diferenças
estatisticamente significantes entre as espécies de Candida e o padrão de aderência
apresentados (p<0,05) sugerindo que o padrão de aderência varia de acordo com a
espécie.
34
Figura 8 - Frequência dos padrões de aderência a lamínulas observados nas diferentes espécies de
Candida
Pseudo-hifal
Agregativo
Localizado
Difuso
14,55
34,55
Total
27,27
23,64
40
20
20
20
Espécie
C. parapsilosis
0
11,11
C. glabrata
44,44
44,44
6,67
33,33
33,33
C. tropicalis
26,67
6,65
62,5
C. albicans
18,75
12,5
0
10
20
30
40
50
60
70
A grande quantidade de isolados mostrando um padrão tipo localizado ou agregativo
poderia ser explicado devido à presença de adesinas na parede celular de Candida que
seriam responsáveis pela capacidade de aderência intercelular mostrada pelas diferentes
linhagens. Estes tipos de padrões de aderência também facilitariam a formação de
biofilme por estas espécies.
Regiões estruturais específicas das proteínas Als em C. albicans parecem estar
envolvidas no fenômeno de agregação celular, como a região de repetições em tandem e
a região rica em resíduos de treonina (KLOTZ, S.A.; LIPKE, 2010). A região rica em
treonina na Als5p, que é composta por 127 aminoácidos, está envolvida na agregação
(RAUCEO et al., 2006), entretanto, Als7p e Als9p, com 128 aminoácidos, não
proporcionam agregação após a adesão (KLOTZ, 2007; ZHAO, 2007). Da mesma
forma, a propriedade de agregação de várias proteínas Als de C. albicans é proporcional
ao número de repetições em tandem na molécula (RAUCEO et al., 2006). Por exemplo,
35
Als1p com 20 repetições induz a formação de agregados maiores que aqueles induzidos
por Als5p com somente cinco sequências repetidas. Este fato, de certa forma, corrobora
com nossos achados onde evidenciamos escassez de um padrão de aderência tipo difuso
(23,64%) com a maioria das cepas evidenciando um padrão tipo localizado ou
agregativo (61,82%), onde ambos mostram formação de colônias por união de várias
células leveduriformes (KLOTZ, S. A. et al., 2007).
Somente dois isolados de C. albicans mostraram um padrão filamentoso ou pseudohifal de aderência, o que também foi observado em sete dos isolados das demais
espécies de CNCA. A capacidade de diferenciação de formas leveduriformes para
formas filamentosas tem sido descrita em muitos estudos e tem relação direta com a
invasão tecidual do hospedeiro, favorecendo a patogenicidade de Candida, permitindo a
penetração mais fácil ao tecido do hospedeiro (JACOBSEN et al., 2012), contudo não é
essencial para a patogênese (GOW, 2002). Provavelmente a forma filamentosa seja
mais virulenta devido à maior extensão de contato entre o micro-organismo e a área a
ser infectada, mas ambas as formas são frequentemente encontradas tanto em estados
comensais quanto em processos infecciosos e mesmo as demais espécies de Candida
não albicans que, mesmo não formando hifas verdadeiras, são potencialmente
patogênicas e estão envolvidas com a morbimortalidade por estes agentes (RIBEIRO et
al., 2004; GOW et al., 2012).
A possibilidade de mudar o seu próprio fenótipo tem sido descrita em alguns estudos
em relação a C. albicans (HAYNES, 2001; YANG, 2003; ÁLVARES et al., 2007;
RIBEIRO et al., 2004) e pode modular alguns fatores de virulência inclusive o
dimorfismo celular e a aderência (SOLL, 2002). Entretanto, o conhecimento a respeito
dos mecanismos que possibilitam esta mudança fenotípica ainda precisa ser esclarecido
(COSTA, 2009b), provavelmente está associado à riqueza de nutrientes e expressão de
genes que codificam adesinas.
Verificando os padrões de adesão levando em consideração os sítios de origem, a
maioria dos isolados de urina e de secreção traqueal apresentou aderência do tipo
agregativo (33.33% e 42,86%, respectivamente). O padrão pseudo-hifal foi o mais
frequente em isolados de ponta de cateter (50%) podendo ser verificado também nos
isolados de urina e sangue. Os dois isolados de secreção vaginal foram positivos para
aderência e apresentaram padrão tipo agregativo. Nenhum isolado de ponta de cateter
36
apresentou padrão tipo agregativo (Figura 9). Não houve correlação estatística
significante entre o sítio de origem e o padrão de aderência verificado (p>0,05).
A figura 10 ilustra os diferentes arranjos celulares encontrados nessa pesquisa.
Figura 9 - Distribuição dos padrões de aderência entre os isolados de Candida em relação ao sítio de
origem
Pseudo-hifa
Localizado
Difuso
Agregativo
50
25
25
Ponta de Catéter
0
27,27
27,27
Sítios de Origem
Sangue
18,18
27,27
0
0
0
Sec. Vaginal
100
0
35,71
Sec. Traqueal
21,43
42,86
12,5
29,17
Urina
25
33,33
0
20
40
60
80
100
120
O presente trabalho também avaliou a correlação entre os padrões de adesão
apresentados pelos isolados e a intensidade de aderência. Isolados com aderência fraca,
apresentaram predominantemente padrão do tipo difuso (34,62%). Na maioria dos
isolados com aderência moderada (52,38%) foi encontrado padrão do tipo agregativo. O
padrão localizado foi o mais comum em isolados com aderência forte, estando presente
em 62,5% dos isolados nessa categoria (Figura 11). É importante destacar que não
foram encontrados, dentre os isolados com aderência forte, nenhum que apresentasse
padrão do tipo difuso sendo este encontrado exclusivamente em isolados com aderência
fraca e moderada. O padrão pseudo-hifal foi mais comum em isolados com aderência
forte presente em 25% dos isolados nessa categoria. Estas diferenças observadas foram
37
estatisticamente significantes evidenciando uma variação do padrão de aderência de
acordo com a intensidade ou nível de adesão dos isolados (p<0,05).
Figura 10 - Padrões de aderência a lamínulas evidenciando arranjos celulares distintos encontrados nas amostras
de Candida. A) Difuso B) Agregativo C) Localizado D) Pseudo-hifa. Aumento: 1000x
B
A
C
D
38
Figura 11–Relação entre a intensidade de aderência e o padrão de aderência apresentado pelos isolados de
Candida
Pseudo-hifal
Agregativo
Difuso
Localizado
25,00
Intensidade de aderência
Forte
12,50
0,00
62,50
4,76
52,38
Moderado
19,05
23,81
19,23
26,92
Fraco
34,62
19,23
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
5.2.2 Adesão ao silicone e inox
O teste de aderência ao látex siliconado revelou que C. parapsilosis apresentou
melhor desempenho para essa propriedade com maior positividade (90%) de aderência
de seus isolados, seguida de C. glabrata com 88,24% de amostras aderentes positivas.
C. albicans foi a espécie com menor frequência de amostras aderentes positivas
(33,33%%), seguida de C. tropicalis (66,67%) (Figura 12). A variação da capacidade de
aderência ao silicone entre as espécies foi estatísticamente significante (p<0,05), ao
contrário do que foi observado na aderência a lamínulas.
39
Figura 12–Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de adesão ao
silicone.
Negativo
Positivo
100
90
88,24
90
80
70
66,67
66,67
60
50
40
33,33
33,33
30
20
10
11,76
10
0
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. glabrata
Espécie
Quando avaliada a intensidade de aderência ao silicone, constatou-se que amostras
aderentes fracas foram as mais comuns em todas as espécies. C. glabrata apresentou a
maior frequência de amostras classificadas como aderentes fracas (80%). Em C.
tropicalis essa frequência foi 66,67%, seguida de C. albicans (62,5%) e C. parapsilosis
(44,44%). C. tropicalis não apresentou isolados de aderência forte ou muito forte
enquanto que C. glabrata apresentou apenas um isolado classificado como aderente
muito forte (6,67%) e nenhum classificado como aderente forte. Já C. parapsilosis foi a
espécie com maior frequência de amostras classificadas como aderentes muito fortes
(16,67%) sendo que C. albicans não apresentou nenhum isolado nessa categoria.
Apenas C. albicans e C. parapsilosis apresentaram amostras classificadas como
aderentes fortes (12,5 e 11,11%, respectivamente) (Figura 13).
40
Figura 13 – Frequência da intensidade de aderência ao silicone entre as diferentes espécies de Candida.
Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a 499 UFCs;
Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs.
Fraco
Moderado
Forte
Muito forte
90
80
80
70
66,67
62,5
60
50
44,44
40
30
33,33
27,78
25
20
16,67
12,5
11,11
13,33
10
6,67
0
0
0
0
0
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
Espécies
C. glabrata
Espécies como C. parapsilosis e C. albicans têm sido constantemente relatadas como
causadoras de candidemia, acreditando-se que esta elevada frequência, principalmente
quando se refere a C. parapsilosis, pode ser explicada pela alta capacidade desta espécie
em aderir a superfícies plásticas tais como o cateter (DAGDEVIREN; CERIKCIOGLU;
KARAVUS, 2005).
C. parapsilosis foi a espécie com maior capacidade de adesão à silicone (90%), onde
100% de isolados provenientes de ponta de cateter foram aderentes (Figura 14). Embora
C. parapsilosis seja frequentemente considerada menos virulenta do que C. albicans, é
uma das causas mais frequentes de candidemia associada a hiperalimentação parenteral,
dispositivos intravasculares e soluções oftálmicas contaminadas (TROFA; GACSER;
NOSANCHUK, 2008). Vários fatores dão à C. parapsilosis uma vantagem seletiva,
incluindo a capacidade de proliferar-se em altas concentrações de glicose e de aderência
a materiais protéticos (TROFA; GACSER; NOSANCHUK, 2008; SILVA, S. et al.,
2010). Surtos nosocomiais de C. parapsilosis também têm sido descritos e atribuídos à
contaminação exógena, através das mãos de profissionais da saúde (BONASSOLI;
BERTOLI; SVIDZINSKI, 2005).
41
Quando avaliada a capacidade de adesão ao silicone em relação ao sítio de origem,
verificou-se que amostras aderentes forte foram presentes apenas em isolados de urina
(5,23%) e em amostras sem sítio definido (33,33%). A maioria dos isolados de urina foi
aderente fraco (42,11%) ou negativo (31,58%). Nenhum isolado de secreção vaginal foi
positivo. Isolados de ponta de cateter apresentaram apenas isolados fracos (75%) e
moderados (25%) (Figura 14). Há associação significativa entre os sítios e a intensidade
de aderência verificada nos isolados mostrando que a intensidade de aderência é
influenciada pelo sítio de origem das amostras (p<0,05%).
Figura 14 -Frequência da intensidade de aderência ao silicone entre os diferentes sítios de origem
analisados. Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a
499 UFCs; Forte: 500 a 999 UFCs; Muito forte: mais que 1000 UFCs.
Muito forte
Forte
0
0
Sítio de origem
Sec. Traqueal
Ponta Cateter
Fraco
0
0
0
0
0
0
100,0
5,3
31,6
0
0
63,2
25,0
75,0
0
Sangue
Negativo
33,3
33,3
33,3
Indefinido
Sec. Vaginal
Moderado
0
7,7
38,5
53,8
0
5,3
Urina
7,9
13,2
31,6
0,0
10,0
20,0
42,1
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
Frequência de aderência ao silicone (%)
90,0
100,0
Avaliando-se a aderência dos isolados de Candida ao inox, constatou-se alta
afinidade desses micro-organismos a esse material. Praticamente todas as espécies
foram aderentes positivas (Figura 15).
Isolados de C. albicans e C. glabrata apresentaram aderência em 100% dos isolados
testados seguidas de C. prapsilosis e C. tropicalis (95 e 94,44% respectivamente), não
havendo, portanto, diferenças significantes com relação à adesão ao inox nas espécies
42
estudadas e não sendo observadas diferenças estatísticas na proporção de positividade
entre as espécies (p>0,05).
Também não houve correlação estatística entre a hidrofobicidade e a aderência ao
silicone, entretanto, houve uma correlação positiva entre a capacidade de aderência a
inox e a aglutinação na concentração de 2,5M. Isso sugere que provavelmente isolados
com hidrofobicidade fraca podem ser mais aderentes ao inox.
Figura 15 - Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de adesão ao
inox
Negativo
Positivo
120
Frequência de amostras (%)
100
100
100
95
94,44
80
60
40
20
5,56
5
0
0
0
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
Espécies
C. glabrata
Analisando a intensidade da aderência, C. albicans foi a espécie que apresentou
maior frequência de amostras fortemente aderentes ao inox (forte,29,17% e muito forte,
45,83%). C. parapsilosis chama a atenção por apresentar, em sua maioria, isolados
fracamente aderentes (78,95%) resultado semelhante ao observado no látex siliconado,
onde aderentes fracos também foram a maioria, observados em 44,44% dos isolados.
Isolados de C. glabrata foram os mais frequentes (47,06%) com aderência forte entre as
quatro espécies de Candida. Os isolados de C. tropicalis tiveram a mesma frequência
(35,29%) de amostras com aderência forte e muito forte sendo, essas duas categorias,
predominantes na classificação (Figura 16).
43
Figura 16 - Frequência da intensidade de aderência ao inox entre as diferentes espécies de Candida .
Classificação: Negativo: 0 UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a 499 UFCs;
Muito forte
Forte
Moderado
Fraco
17,65
47,06
C. glabrata
17,65
17,65
0
10,53
C. parapsilosis
Espécie
10,53
78,95
35,29
35,29
C. tropicalis
17,65
11,76
45,83
29,17
C. albicans
16,67
8,33
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Relacionando-se a intensidade de aderência ao inox e o sítio de origem das amostras
estudadas, constatou-se que isolados de secreção traqueal foram os que apresentaram
maior frequência de amostras classificadas como aderentes muito fortes (47,37%)
enquanto que os isolados classificados como aderentes fortes que apresentaram maior
frequência foram os de secreção vaginal (50%), urina (34,21%) e secreção traqueal
(31,58%). Isolados de ponta de cateter e sangue predominaram amostras classificadas
como fracamente aderentes (75 e 61,54% respectivamente). Contudo, todos os isolados
(100%) de secreção vaginal, secreção traqueal, sangue e urina foram aderentes ao inox
(Figura 17).
Como observado na aderência ao silicone, os resultados da aderência ao inox
revelam que a intensidade da aderência varia de acordo com o sítio de origem, pois
foram observadas diferenças estatísticas significantes entre os sítios com relação à
intensidade da aderência.
44
Figura 17 - Frequência da intensidade de aderência ao inox entre os diferentes sítios de origem analisados.
Classificação: Negativo: 0UFCs; Fraco: entre 1 e 199 UFCs; Moderado: 200 a 499 UFCs;
Muito forte
Forte
Moderado
Fraco
Negativo
33,33
Indefinido
0,00
0,00
33,33
33,33
0,00
Sec. Vaginal
50,00
0,00
50,00
0,00
Sítio de origem
47,37
31,58
Sec. Traqueal
15,79
5,26
0,00
Ponta Cateter
0,00
0,00
0,00
75,00
25,00
7,69
23,08
Sangue
7,69
61,54
0,00
23,68
34,21
Urina
21,05
21,05
0,00
0,00
10,00
20,00 30,00 40,00 50,00 60,00
Frequência de aderência ao inox (%)
70,00
80,00
Recentemente muitos estudos estão sendo desenvolvidos no intuito de desvendar os
mecanismos utilizados por espécies do gênero Candida para aderir a superfícies
abióticas (KANG et al., 2013; SAMARANAYAKE, Y. H. et al., 2013). O estudo de
adesão a silicone e inox, materiais constantemente presentes nos ambientes hospitalares,
é de suma importância na clínica, pois a aderência de micro-organismos a essas
superfícies constitui um perigo potencial a pacientes internos especialmente aos que
apresentam algum tipo de redução ou deficiência grave nos mecanismos imunológicos
como pacientes com AIDS e os que fazem uso de medicações que afetam o sistema
imune (pacientes transplantados ou os que fazem uso de quimioterapia). Até o presente
momento não foram encontrados estudos que tratam da aderência de Candida ao aço
inox sendo este estudo pioneiro nessa temática.
45
Estudos revelam que o aço inox está entre os principais materiais utilizados em
bancadas de ambientes hospitalares especialmente em locais onde são realizados os
procedimentos de preparo de medicação pelas equipes de enfermagem (MOREIRA,
2002) bem como em perfuro cortantes. Foi encontrado apenas um trabalho avaliando a
capacidade de aderência de micro-organismos a superfícies de aço inox. Os autores
verificaram a aderência de Staphylococcus aureus a este material antes e após o uso se
substâncias desinfetantes. O estudo não revelou alterações na capacidade de aderência
dessa bactéria às superfícies de aço inox mesmo com a utilização de várias soluções
desinfetantes (SILVA, F. C. et al., 2008).
No presente trabalho contatou-se uma elevada frequência de isolados de Candida
aderentes ao inox. Devido a frequente utilização de materiais à base de inox em
ambientes hospitalares e o alto índice de infecções hospitalares por Candida (PFALLER
et al., 2011; ERDEM et al., 2012) é necessária uma atenção especial na utilização desse
material, seja em dispositivos intravenosos (como agulhas) ou mesmo a utilização de
próteses, especialmente no que diz respeito a correta manipulação pelos profissionais de
saúde.
5.3 Ensaio de adesão a células epiteliais
Fungos do gênero Candida podem interagir com células epiteliais do hospedeiro
humano, tanto como comensais, sem que isso se caracterize como patologia, como um
agente patogênico invasor. Sabe-se que os mecanismos complementares para favorecer
a adesão a células epiteliais têm evoluído com o passar do tempo. A adesão de C.
albicans às células epiteliais é uma etapa crítica no processo de infecção. É essencial
tanto para a colonização quanto na indução de doença da mucosa subsequente. Além
disso, colonização de superfícies mucosas é um fator de risco conhecido para a evolução
de candidíase disseminada (ZHU; FILLER, 2010).
Este trabalho mostrou que C. parapsilosis foi a espécie menos eficiente na
aderência a células HEp-2 com 55% de amostras positivas (Figura 18), ao contrário do
que foi observado quando testou-se materiais inertes como lamínula, silicone e inox.
46
C. glabrata e C. albicans apresentaram maior capacidade de aderência à célula
testada (76,47 e 70,83% respectivamente) seguidas de C. tropicalis (66,67%) (Figura
18).
Entretanto, não houve diferenças estatísticas significantes na proporção de adesão a
células HEp-2 em relação a espécie, ou seja, a aderência não se constitui como uma
característica influenciada pela espécie.
Figura 18 - Frequência de diferentes espécies de Candida positivas e negativas para o teste de adesão às
células HEp-2
Frequência de adesão a células HEp-2 (%)
Negativo
Positivo
90
76,47
80
70,83
66,67
70
60
55
50
45
40
30
33,33
29,17
23,53
20
10
0
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. glabrata
Espécie
O estudo de Branco (2012) avaliando amostras de Candida isoladas de pacientes
com AIDS e pacientes imunocompetentes com relação à capacidade de aderência a
células HEp-2, constatou que as espécies com maior taxa de aderência foram C.
albicans, C. glabrata e C. tropicalis tanto isolados de pacientes com AIDS quando os
isolados de pacientes imunocompetentes, corroborando com os nossos achados. Nesse
estudo, a frequência de aderência foi de 100% nos isolados de C. albicans, C. glabrata e
C. tropicalis nos isolados de pessoas imunocompetentes, resultado que se repetiu nos
isolados de pacientes com AIDS para as duas últimas espécies enquanto que C. albicans
apresentou 96,5% de positividade. Este resultado corrobora com os nossos achados pois
C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata também foram as mais aderentes, embora o
referido trabalho também não tenha observado diferenças estatísticas significantes.
47
A capacidade de adesão de Candida a células epiteliais tem sido frequentemente
testada com isolados de C. albicans em células HeLa, células epiteliais de rim de
embrião humano, fibroblastos e células HEp-2 (BEKTIC et al., 2001). Além disso,
estudos com células bucais (COTTER; KAVANAGH, 2000) relataram que adesão a
células epiteliais bucais é uma condição essencial à candidíase oral.
Estudos recentes (EMIRA et al., 2011) mostraram que as amostras de C. albicans
orais foram capazes de aderir a linhagens de células epiteliais de forma diferente onde
mais de 61% das cepas testadas foram aderentes para HEp-2 e 83% para células Caco-2.
Esse resultado corrobora com os nossos achados sendo possível encontrar uma
frequência de positividade muito semelhante na linhagem HEp-2.
Testes feitos com C. tropicalis em células HeLa (OKAWA;MIYAUCHI;
KOBAYASHI, 2008), demonstraram que todos os isolados dessa espécie foram
aderentes positivos demonstrando, que, a alta positividade dessa característica não se
constitui um evento isolado.
Outro estudo avaliou a correlação entre a adesão de 20 linhagens de C. albicans e 12
de C. parapsilosis a células epiteliais bucais humanas e a expressão de carboidratos
presentes na superfície das células fúngicas. Os resultados mostraram que a adesão foi
maior para C. albicans de que C. parapsilosis e que as diferenças individuais entre as
cepas estão correlacionadas com quantidade de resíduos α-L-fucose na superfície das
células fúngicas (LIMA-NETO et al., 2011). Este resultado também corrobora com
nossos achados onde foi observada em C. albicans uma frequência de amostras
aderentes superior (70,83%) às encontradas em C. parapsilosis (55%) (Figura18).
Foram verificados padrões distintos de aderência a células HEp-2 como pode ser
observado na figura 19.
A avaliação dos padrões de aderência revelou que o padrão difuso foi o mais comum
entre as amostras analisadas estando presente em 90,91% dos isolados de C.
parapsilosis, 41,18% dos isolados de C. albicans, 25% dos isolados de C. tropicalis e
23,08% dos de C. glabrata. Observou-se também que o padrão agregativo foi o mais
comum em isolados de C. tropicalis (58,33%). O padrão tipo localizado foi o mais
comum em amostras de C. glabrata (53,85%) (Figura 20).
48
Apesar da proporção de amostras positivas não ter apresentado variações com
relação à espécie, diferenças estatísticas foram observadas ao avaliar os padrões
distintos estre as espécies sendo essa característica variável conforme a espécie
analisada (p<0,05).
Embora tendo sido observado nas amostras, o padrão pseudo-hifal foi
desconsiderado nessa análise uma vez que o meio de cultura utilizado no cultivo da
linhagem celular apresentava soro fetal bovino, substância que induz a formação de
pseudo-hifas em isolados de Candida o que tornaria os resultados tendenciosos.
Figura 19 - Padrões distintos de agregação observados em isolados de C. glabrata. Aumento:
1000x ao microscópio ótico. A) Agregativa; B) Localizada; C) Difusa
B
A
C
49
Figura 20 - Frequência de padrões de aderência distintos observados em isolados de Candida a células HEp-2
Agregativo
Difuso
Localizado
100
90,91
Adesão a células HEp-2 (%)
90
80
70
58,33
60
53,85
50
41,18
40
30
29,41
29,41
25
23,08
23,08
16,67
20
9,09
10
0
0
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. glabrata
Espécie
O estudo de Branco (2012) também avaliou as amostras quanto ao padrão de adesão
e o tipo difuso também foi o mais encontrado em ambos os grupos analisados, seguido
do agregativo e localizado, corroborando com nossos achados.
Estudos acerca da adesão de Candida a células epiteliais ainda são pouco frequentes
na literatura, entretanto, um estudo realizado por Holmes et al. (2002), estudando efeito
de saliva na adesão de C. albicans a células epiteliais humanas, relataram que C.
albicans aderiu a monocamadas de todas as três linhagens de células epiteliais estudadas
(A549, HEp-2, e Het-1A) (HOLMES; BANDARA; CANNON, 2002).
Estudos confirmam que isolados de Candida, de fato, podem aderir a vários tipos de
células, tais como células epiteliais bucais (WILLIS et al., 2000) e linhagens de células
epiteliais cultivadas (UETA et al., 2000).
A aderência é o passo inicial para o desenvolvimento de infecções. Vários outros
fatores de virulência podem ser expressos por Candida para que a infecção seja
estabelecida. A maioria dos trabalhos sobre essa temática, especialmente os que se
referem à aderência, tratam de C. albicans, e estudos acerca da aderência de espécies
CNCA são pouco frequentes. Espécies como C. tropicalis e C. glabrata vem emergindo
como espécies com grande variedade de fatores de virulência incluindo aderência a
50
células epiteliais (SILVA, 2011). Nossos estudos revelaram a alta capacidade de
aderência dessas espécies não só a células HEp-2 como a materiais inertes (lamínula,
silicone e inox). Isso mostra a importância do estudo das CNCA e a relevância desde
trabalho.
5.4 Influência de carboidratos no processo de adesão
A influência dos carboidratos no processo de adesão demonstrou ser dependente da
espécie analisada (p<0,05%), ou seja, alguns carboidratos que exibiram influência
negativa em uma espécie exerceu efeito contrário em outra espécie como mostra a
figura 21. Observa-se que C. glabrata foi a espécie que mais sofreu influência de
carboidratos no processo de aderência (p<0,05%).
Figura 21 – Número de células aderidas na presença de carboidratos
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. glabrata
Média de n° de células
140,0
120,0
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
C. glabrata
C. parapsilosis
C. tropicalis
0,0
C. albicans
Meio
Os carboidratos que mais interferiram de forma positiva na aderência foram
galactose e rafinose enquanto que manose foi o mais eficiente na redução da aderência
(p<0,05%) (Figura 22).
51
Figura 22 - Influência dos carboidratos no processo de adesão
60,0
52,5
* p < 0,05
Média do n° de células
50,0
40,5
40,0
29,9
30,0
20,0
17,1
17,0
11,1
10,0
0,0
Controle
Glicose
Manose
Rafinose
Meio
Galactose
Lactose
A manose reduziu a aderência em C. tropicalis, C. albicans e C. parapsilosis
enquanto que C. glabrata apresentou um aumento de células aderentes na presença
desse carboidrato. C. glabrata apresentou aumento na capacidade de aderência na
presença de todos os carboidratos, entretanto galactose e rafinose exerceram influência
muito maior quando comparados com outros carboidratos. Rafinose também favoreceu
a aderência em C. tropicalis e C. albicans.
Já em C. parapsilosis todos os carboidratos testados interferiram de forma negativa
na aderência, ou seja, o numero de células obtidas após o processo de aderência na
presença desses carboidratos foi menor quando comparado com o controle.
As figuras a seguir revelam a influência de alguns carboidratos no processo de
adesão.
52
Figura 24 - Capacidade de aderência em C. albicans na presença de carboidratos: A) Controle B) Aderência na
presença de manose; C) Aderência na presença de galactose. Aumento: 1000x
A
B
C
Figura 25 - Capacidade de aderência em C. glabrata na presença de carboidratos: A) Controle; B) Aderência
na presença de galactose; C) Aderência na presença de rafinose. Aumento: 1000x
A
B
C
Figura 23 - Capacidade de aderência em C. parapsilosis na presença de carboidratos: A) Controle; B) Aderência na
presença de galactose; C) Aderência na presença de lactose. Aumento: 1000x
A
B
C
Um dos poucos estudos que avaliaram a capacidade de aderência na presença de
carboidratos revelou que frutose, galactose, glicose, maltose, sorbitol e sacarose
aumentaram significantemente a aderência de Candida spp a células de epitélio bucal
sendo que galactose foi o carboidrato mais eficiente entre todos testados (ABUELTEEN, 2005) Esse padrão foi semelhante em C. tropicalis, C. parapsilosis e C.
glabrata, diferindo dos nossos estudos onde a amostra de C. parapsilosis testada teve
sua aderência diminuída na presença desse carboidrato. Entretanto, no estudo em
53
questão, C. parapsilosis sofreu menor aumento na aderência na presença de galactose.
Além disso, o tipo de substrato utilizado na análise pode interferir na influência dos
carboidratos na aderência (JAYATILAKE, 2011).
Estudos revelam que, na presença de 500 mM de galactose ou glicose, esses hidratos
de carbono, adicionados durante a fase de crescimento, melhoram a capacidade de
adesão de isolados de Candida a BECso que pode ser explicado pela produção de uma
capa fibrilar adicional (ABU-ELTEEN, 2005)
A aderência de C. tropicalis e C. glabrata sofreu um aumento na presença de glicose.
Este resultado pode ser explicado considerando que quando as células de levedura estão
colonizando uma determinada superfície e são expostas a diferentes fontes de carbono,
preferencialmente utilizam monossacáridos, tais como glicose, antes de assimilar outras
fontes de carbono (JOHNSTON, 1999). Depois de alcançar um estágio mais avançado
de organização e metabolismo, provavelmente, células de levedura sejam capazes de
hidrolisar fontes de carbono mais complexas, tais como a sacarose, o que pode ser um
fator crítico durante a formação de biofilme (ASKEW et al., 2009). O fato de apenas
duas espécies de Candida terem apresentado aumento na capacidade de aderência na
presença de glicose pode ser explicado pelas diferenças existentes com relação à
composição e a organização da parede celular entre as espécies que poderia estar
influenciando na assimilação do carboidrato durante o processo (SILVA, S. et al.,
2011). Isso porque durante o processo de adesão, várias adesinas são expressas e dentre
os fatores determinantes nesse processo estão as condições do meio externo como a
oferta de fontes de carbono (ZAVREL, 2010; ENE et al., 2012). Além disso, a
expressão de proteínas Sap é de suma importância nesse processo uma vez que a
expressão dessas enzimas, através da sua capacidade em degradar proteínas, danifica
parte da membrana celular da célula hospedeira facilitando o processo de adesão e
invasão (ZAVREL, 2010).
5.5 Identificação molecular de genes da família ALS
A família ALS em C. albicans inclui oito genes (ALS1 a ALS7, e ALS9) que
codificam glicoproteínas de parede celular envolvidas na adesão e no reconhecimento
de receptores de superfície. Neste trabalho avaliou-se a presença de seis genes ALS por
54
PCR convencional (ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5 e ALS6), através de iniciadores
específicos, em 24 isolados de C. albicans (11 isolados de urina, 11 de secreção vaginal
e dois de secreção traqueal).
De um modo geral, o gene ALS6 foi o mais predominante, detectado em 82,61% dos
isolados. Os genes ALS3 e ALS5 foram detectados em 31,82% dos isolados. Os demais
genes foram detectados em frequência que não ultrapassou 30% (Figura 26)
Figura 26 - Distribuição dos resultados de PCR para verificar a presença dos genes ALS em isolados de
Candida albicans.
Negativas
Positivas
17,39
ALS6
82,61
68,18
ALS5
31,82
80,95
ALS4
Gene
19,05
68,18
ALS3
31,82
80,95
ALS2
19,05
71,43
ALS1
28,57
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
As amostras foram classificadas em relação à presença de genes ALS e desta forma
foram observados oito genótipos distintos, conforme mostra a tabela 3.
55
Tabela 3 - Frequência de genes da família ALS em isolados clínicos de Candida
1
2
3
4
5
6
7
8
Genótipo
ALS1/ALS2/ALS4/ALS6
ALS1/ALS3/ALS5
ALS1/ALS2/ALS6
ALS3/ALS5/ALS6
ALS1/ALS6
ALS3/ALS5
ALS4/ALS6
ALS6
N
3
1
1
3
1
2
1
9
(%)
14.29
4.76
4.76
14.29
4.76
9.52
4.76
42.86
Observou-se que o genótipo mais comum foi o que apresenta apenas o gene ALS6
encontrado em nove isolados (42,86%).
Os genes ALS partilham uma organização de base semelhante constituída por uma
região relativamente conservada no domínio 5', um domínio central de repetições in
tandem e um domínio 3' de comprimento e sequência relativamente variáveis (Hoyer,
2001; Hoyer et al, 2007).
Um estudo avaliando a expressão de genes da família ALS em epitélio humano
reconstituído (RHE) revelou que ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5 e ALS9 foram
expressos com maior frequência durante a infecção e destruição do epitélio (GREEN et
al., 2004) mostrando que esses genes tem participação direta no processo de adesão e
subsequente invasão.
Paniagua-Contreras et al. (2010) avaliaram a presença dos oito genes da família ALS
em 50 isolados de C. albicans de dois sítios diferentes por PCR convencional, mucosa
oral e vaginal. Os resultados revelaram que os genes ALS6, ALS4, ALS3 e ALS9 foram
os mais frequentes em isolados provenientes de mucosa oral e ALS1, ALS2 e ALS3,
ALS4 e ALS9 foram encontrados em todos os isolados provenientes de mucosa vaginal.
Além disso, isolados de mucosa oral apresentaram 20 genótipos distintos enquanto que
amostras vaginais apresentaram apenas quatro. Esse estudo destaca a alta variabilidade
nos genótipos de ALS nos isolados de C. albicans o que também pode ser observado no
presente estudo.
Quando avaliada apenas a presença de ALS1 (İNCİ et al., 2013), pouco mais da
metade dos isolados (53,9%) foram positivos revelando que a presença desse gene não é
56
necessária em todos os isolados. Além disso, no estudo de Paniagua-Contreras et al.
(2010) os genes ALS1 e ALS2 foram os menos frequentes, identificados em 67,5% e
60% dos isolados analisados, respectivamente.
O estudo de Nascimento (2009) avaliou apenas a presença do gene ALS3 em isolados
de Candida sp e verificou uma alta frequência desse gene em isolados de C. albicans
onde dos 23 isolados dessa espécie testados, 19 foram amplificados em pelo menos um
dos primers utilizados o que difere dos nossos resultados uma vez que nas amostras
testadas nesse estudo, apenas 31,82% das amostras foram positivas para o gene em
questão.
Além dos já citados, outro iniciador que amplifica regiões de tandem repeats em
ALS5, também foi utilizado nesse estudo no intuito de identificar tais regiões. Os
resultados revelam que 66,67% dos isolados não sofreram amplificação pelo primer em
questão (Figura 27).
Figura 27 - Distribuição dos resultados de PCR para verificar a presença do gene ALS5 (tandem repeats)
em isolados de Candida albicans.
Positivas
Negativas
33,33%
66,67%
A figura a seguir, revela o resultado de uma reação de PCR para esse primer.
57
Figura 28 - Reação de PCR amostras de C. albicans isoladas de urina. L – DNA ladder de 100
pb; 1 – controle negativo; 2 a 7 – produtos de PCR dos isolados de Candida
abicans.
L
1
2
420 pb
3
4
5
6
7
380 pb
280 pb
Foi possível notar que os isolados apresentaram produtos de PCR de tamanhos
distintos. Isso acontece devido às diferenças de tamanho entre alelos, ocasionadas pelas
repetições in tandem que variam de isolado para isolado. Com isso os comprimentos da
região gênica delimitada pelo primer são alterados e consequentemente os fragmentos
gerados por PCR (HOYER, 2001).
Muitos isolados não apresentaram produtos amplificados de PCR para ALS5.
Segundo a literatura (ZHAO, OH et al., 2007), algumas cepas não apresentam
amplicons do gene dessa família possivelmente por conta do alto polimorfismo no sítio
do primer ou ausência do locus. Portanto, no presente estudo, amostras em que não
foram verificados produtos gênicos de ALS5 não necessariamente se caracterizam como
amostras nulas para esse gene.
Além disso, devido à diferença de tamanho entre alelos ALS5, em caso de deleção
espontânea desse gene, o comprimento da região eliminada também varia. Entretanto
amplificações por PCR usando primers que abrangem a região deletada, produzem
produtos do mesmo tamanho em cada amostra negativa de ALS5 independente do sítio
58
sugerindo que a deleção ocorre na mesma localização em todos os isolados negativos de
ALS5 (HOYER, et al., 2008)
A habilidade de C. albicans em perder espontaneamente o gene ALS5 pode sugerir
que a função de Als5p é pelo menos parcialmente redundante, ou seja, o fato de um
isolado não apresentar o gene ALS5 não implica em prejuízo na capacidade de aderência
uma vez que essa propriedade envolve diversos outros genes não havendo, portanto,
consequências importantes.
Outro fator importante apontado no estudo de Zhao (2007) é que em 38% das
amostras de C. albicans analisadas o gene ALS5 ocorreu em hemizigose, entretanto há
uma pressão seletiva para que esse alelo ocorra em pelo menos um dos cromossomos.
O presente estudo avaliou também a correlação da presença dos genes com os
aspectos celulares da adesão. Não foram observadas relações estatisticamente
significantes entre a presença dos genes ALS e a capacidade de aderência a inox e a
silicone. Entretanto, a presença do gene ALS1 apresentou correlação positiva com
padrão de aderência exibido por Candida albicans em células HEp-2 como mostra a
figura a 29.
Figura 29 - Correlação entre a presença do gene ALS1 e os padrões de aderência exibidos por Candida
albicans.
Ausência
* p < 0,05
Presença
60,0
50,0
50,0
50,0
40,0
37,5
31,3
30,0
25,0
20,0
10,0
6,3
0
0
0,0
Negativo
Localizado
Difuso
Padrão de aderência a células HEp2
Agregativo
59
Foi possível observar que a presença do gene ALS1 foi significantemente maior em
isolados que apresentaram padrões de aderência difuso e agregativo em células HEp-2 o
que sugere uma participação do produto desse gene no tipo de arranjo celular expresso
por Candida albicans durante o processo de aderência.
Contudo, foi observada correlação negativa entre a presença dos genes ALS3 e ALS5 e
a aderência a lamínula (p<0,05%), onde nesse substrato a capacidade de aderência não
foi favorecida pela presença do gene, como mostra a figura 30.
Figura 30 - Correlação entre a presença dos genes ALS3 e ALS5 e a aderência à lamínula
Ausência
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
* p < 0,05
Presença
83,3
56,3
18,8 16,7
12,5
0,0
Negativo
Fraco
Moderado
Padrão de adesão a lamínulas
12,5
0,0
Forte
Sabe-se que a proteína Als tem intensa participação no processo de aderência,
entretanto, observa-se que o tipo de substrato pode interferir na participação das
adesinas. O trabalho de Sheppard (2004) revelou que a expressão Als5p em S.
cerevisiae confere aderência a vários substratos, incluindo células endoteliais e gelatina,
enquanto que a expressão de Als6p resulta apenas na adesão a gelatina. Isso sugere que
as proteínas Als podem apresentar algumas funções diferenciadas. Este fato poderia
explicar os resultados aqui obtidos.
Correlacionando a presença de genes ALS com a hidrofobicidade celular, os genes
ALS1, ALS3 e ALS5 apresentaram correlação com hidrofobicidade, entretanto, ao
contrário de ALS1 que apresentou uma correção positiva (Figura 31), ALS3 e ALS5
apresentaram correlação negativa sugerindo que a presença desses genes não estariam
favorecendo a capacidade hidrofóbica dos isolados (Figuras 32 e 33)
60
Figura 31 - Correlação entre a presença do gene ALS1 e a hidrofobicidade em concentração de 0,5M em
sulfato de amônio
Ausência
Presença
* p < 0,05
120,0
100,0
100,0
80,0
56,3
60,0
43,8
40,0
20,0
0,0
0,0
Negativo
Positivo
Aglutinação em 0,5 M de sulfato de amônio
sulfato de amônio
Ausência
* p < 0,05
Presença
90,0
81,3
80,0
66,7
70,0
60,0
50,0
40,0
33,3
30,0
20,0
18,8
10,0
0,0
Negativo
Positivo
61
sulfato de amônio
Negativo
* p < 0,05
Positivo
90,0
81,2
80,0
66,7
70,0
60,0
50,0
40,0
33,3
30,0
20,0
18,8
10,0
0,0
Ausência
Presença
O fato que é que a presença de genes da família ALS tem grande importância na
capacidade de aderência em isolados de Candida, contudo, não se constitui como um
fator determinante, pois, observa-se que mesmo na ausência de alguns desses genes a
capacidade de aderir não é prejudicada uma vez que essa propriedade envolve múltiplos
fatores além da participação de vários outros genes que não foram avaliados nesse
trabalho como os genes da família SAP, HWP1, entre outros.
62
6 CONCLUSÕES
 C. albicans foi a mais hidrofóbica entre as espécies testadas apresentando
aglutinação desde as menores concentrações de sulfato de amônio;
 C. tropicalis e C. parapsilosis apresentaram melhor capacidade de aderência a
lamínulas;
 C. parapsilosis apresentou melhor desempenho para aderência ao silicone com
maior positividade e maior número de isolados classificados como aderentes
muito fortes (15%);
 C. albicans e C. glabrata apresentaram aderência a inox em 100% dos isolados;
 Não houve correlação estatística entre hidrofobicidade e a propriedade de
aderência a lamínulas e ao silicone;
 Houve uma correlação positiva entre a hidrofobicidade fraca e a capacidade de
aderência ao inox;
 C. glabrata e C. albicans foram as espécies com maior capacidade de aderência
às células HEp-2;
 Na aderência à HEp-2, o padrão tipo difuso foi o mais frequente em C.
parapsilosis e C. albicans enquanto que o padrão agregativo predominou em C.
tropicalis;
 C. glabrata foi a espécie que mais sofreu influência de carboidratos no processo
de aderência;
 Galactose e rafinose atuaram favorecendo a adesão enquanto que manose foi o
carboidrato mais eficiente na redução da aderência.
 O gene ALS6 foi o mais frequente, seguido de ALS3 e ALS5 em isolados de C.
albicans;
 A maioria das amostras de C. albicans (66,67%) não apresentou amplificação
por PCR do ALS5t;
 Os tamanhos variáveis dos amplicons obtidos por PCR da região de tandem
repeat de ALS5 sugerem polimorfismo para o gene;
 O gene ALS1 apresentou correlação estatística com os padrões de aderência
difuso e agregativo a células HEp-2;
 ALS3 e ALS5 apresentaram correlação negativa com a aderência a lamínula;
63
 ALS1 apresentou correlação positiva com a hidrofobicidade forte ao contrário do
que foi verificado com os genes ALS3 e ALS5.
64
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