Microbiologia para Cosméticos

Transcrição

GUIA DOS MÉTODOS DE
REFERÊNCIA
MICROBIOLOGIA PARA COSMÉTICOS
*Disponíveis no Brasil os meios desidratados.
“BIOKAR Diagnóstico coloca o seu conhecimento à sua disposição para fornecer
soluções simples e rápidas para atender suas necessidades.
Os laboratórios de microbiologia devem obedecer os critérios regulamentares que estão
em constante evolução, e é por isso que nós oferecemos este guia de métodos de
referência para ajudá-lo diariamente na aplicação das normas aos seus produtos
cosméticos.”
SUMÁRIO:
Microrganismos totais:
Leveduras e fungos
Contagem
NF EN ISO 16212 T75-608
Página 4-5
Bactérias aeróbicas Contagem e detecção NF EN ISO 21149 T75-602
Página 6-7
Identificação dos Microrganismos:
Candida albicans
Detecção
NF EN ISO 16212 T75-608
Página 4-5
Escherichia coli
Detecção
NF EN ISO 16212 T75-608
Página 4-5
Pseudomonas aeruginosa Detecção
NF EN ISO 16212 T75-608
Página 4-5
Staphylococcus aureus
NF EN ISO 16212 T75-608
Página 4-5
Detecção
ANEXOS:
Anexo A: Protocolo de preparação dos meios de referência.
Anexo B: Outras normas de microbiologia dos produtos cosméticos.
NF EN ISO 18415: 2011-08. Detecção de microrganismos específicos e não específicos.
NF EN ISO 11930: 2012-06. Avaliação da proteção antimicrobiana de um produto cosmético.
Anexo C: Lista de produtos.
Para maiores informações, entre em contato com a gente.
NF EN ISO 16212
T75-608
(Agosto 2011)
Contagem de leveduras e fungos
Princípios: - Semeadura da amostra na superfície ou profundidade, ou filtração por
membrana e transferência para o meio de cultura (ágar).
- Incubação à 25,0 ± 2,5ºC por 3 à 5 dias. (1)
- Contagem do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) e do
número de leveduras e fungos por mL ou por g de produto.
Meio de Cultura
Diluente
neutralizante
Meio com peptona de caseína,
lecitina de soja e polissorbato 20
(caldo SCDLP20)
Caldo Eugon LT 100
BK068HA – frasco 500g
BM00608 – 50 tubos 9 mL
Caldo Eugon LT100
BM17508 – 50 tubos 9 mL + contas
de vidro
BM04308 – 10 flaconetes 100 mL
Diluente lecitina polissorbato (LP)
Diluentes
Meio de
Cultura
-
Líquido A
Água Peptonada
BM16408 - 3 embalagens de 3L
Solução peptona tamponada
(pH 7)
Caldo peptona tamponado NaCl
pH 7
Ágar Sabouraud Dextrose
Cloranfenicol (SDCA) (3)
Ágar Sabouraud Glicose com
Cloranfenicol
BM17608 – 20 unidades Ø 90 mm
Ágar Batata Dextrose com
antibiótico
Ágar Glicose-peptona (GP) com
antibiótico
Diluente para
a suspensão
de levedura Solução triptona cloreto de sódio
Ágar para
cultura de
cepa de
referência
BIOKAR Diagnóstico
Ágar Glicose Extrato de Batata
Suplemento Seletivo
Cloranfenicol 50 mg
BS02108 – 10 flaconetes
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
BM13508 – 3 embalagens de 3L
Conformidade
-
Total
Total
Parcial (2)
Total
Total
-
Total
Ágar Sabouraud Glicose
Ágar Sabouraud Dextrose (SDA)
BM17308 - 20 unidades Ø 90 mm
Total
(1) Em caso de utilização de ágar sem antibiótico, incubar à 22,5 ± 2,5ºC por 5 à 7 dias.
(2) Fórmula da Farmacopéia. Contém 1g de triptona ao invés de peptona de carne e pH 7,0 ± 0,2 ao
invés de 7,1 ± 0,2.
(3) Para produtos conhecidos e não contaminados o meio será utilizado sem cloranfenicol.
Protocolo
1g ou 1mL de amostra
diluída 1/10 (a) (b)
Caldo Eugon LT 100 (c)
0,1 mL em superfície
1 mL em profundidade
Por filtração em membrana
Ágar SABOURAUD
Cloranfenicol (e)
Incubar de 3 à 5 dias
à 25,0 ± 2,5ºC
Contagem de leveduras e
fungos (f)
(a) Quantidade mínima de amostra para análise.
(b) Outras diluições podem ser feitas a partir da suspensão-mãe (utilizando o mesmo
solvente), dependendo do nível de contaminação da amostra.
(c) Outros solventes podem ser utilizados de acordo com o Parágrafo 5.4.
(d) Transferir para a membrana uma quantidade adequada de amostra (correspondente à
1g ou 1mL de produto) e colocá-la sobre o ágar.
(e) Outros meios de cultura podem ser utilizados de acordo com o Parágrafo 5.4.
(f) A contagem é geralmente realizada utilizando ao menos 2 unidades por diluição.
NF EN ISO 21149
T75-602
(Setembro 2009)
Contagem e detecção de bactérias aeróbicas mesófilas
Princípios:
Para a contagem
- Semeadura da amostra na superfície ou profundidade, ou filtração por
membrana e transferência para o meio de cultura (ágar).
- Incubação à 32,5 ± 2,5ºC por 72 ± 6h.
- Contagem do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) e do
número de bactérias aeróbicas mesófilas por mL ou por g de produto.
Para a detecção
- Enriquecimento em meio líquido não seletivo à 32,5 ± 2,5ºC por 20 horas.
- Semeadura em ágar não seletivo.
- Incubação à 32,5 ± 2,5ºC por 48 a 72h.
Meio de Cultura
Diluente
neutralizante
Meio com peptona de caseína,
lecitina de soja e polissorbato 20
(caldo SCDLP20)
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
Caldo Eugon LT100
de vidro
Diluente lecitina polissorbato (LP)
Caldo Letheen modificado
-
Líquido A
Água Peptonada
BM16408 - 3 embalagens de 3L
Solução peptona tamponada
(pH 7)
Caldo peptona tamponado NaCl
pH 7
Diluentes
Meio de
Cultura para
Contagem
BIOKAR Diagnóstico
Ágar de peptona e caseína de soja Ágar Tripto-caseína de Soja
(SCDA) ou ágar tripto-caseína de
soja (TSA)
Ágar Eugon LT 100
Ágar Eugon LT 100
Conformidade
-
Total
-
Total
Parcial (1)
Total
Total
Ágar LT 100
-
-
-
-
Meio de peptona e caseína de soja
adicionado de ágar
Caldos de
enriquecimento
Caldo Eugon LT100
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Total
Meio líquido de peptona de
caseína de soja-lecitinapolissorbato 80 (Caldo SCDLP 80)
Caldo neutralizante D/E
neutralizante Dey/Engley)
-
-
-
-
-
-
(caldo
Ágar Eugon LT 100
Meios para a
detecção por
enriqueciMeio líquido de peptona de
mento
caseína de soja-lecitina-
Ágar Eugon LT 100
Total
-
-
polissorbato 80 (Caldo SCDLP 80)
Diluente para
a suspensão Solução triptona cloreto de sódio
bacteriana
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
Total
Ágar para
cultura de
cepa de
referência
soja (TSA)
Total
(1) Fórmula da Farmacopéia. Contém 1g de triptona ao invés de peptona de carne e pH 7,0 ± 0,2 ao invés
de 7,1 ± 0,2.
Protocolo
1 mL em profundidade
Por filtração em membrana
Ágar Tripto-caseína de soja (c)
Incubar de 72 ± 6h
à 32,5 ± 2,5ºC
Contagem (e)
Caldo Eugon LT100 (c)
Incubar de 48 à 72h
à 32,5 ± 2,5ºC
Presença/Ausência (e)
(c) Outros solventes podem ser utilizados de acordo com o Parágrafo 5.4.
(d) Transferir para a membrana uma quantidade adequada de amostra (correspondente à
1g ou 1mL de produto) e colocá-la sobre o ágar.
(e) A contagem é geralmente realizada utilizando ao menos 2 unidades por diluição.
NF EN ISO 18416
T75-607
(Setembro 2009)
Princípios:
Detecção de Candida albicans
- Enriquecimento em meio líquido à 32,5 ± 2,5ºC de 20 à 72 horas.
- Isolamento em ágar à 32,5 ± 2,5ºC por 24 a 48h.
- Identificação por ensaios apropriados.
Meio de Cultura
BIOKAR Diagnóstico
Caldo Eugon LT100
Meios
líquidos de
enriquecimento
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Meio líquido digerido de caseína- Caldo Triptona Soja (TSB)
soja
BM03008 – 50 tubos 10 mL
Meio lecitina polissorbato
adicionado de dextrose e
peptona (Caldo GPLP80)
Ágar seletivo
para o
isolamento
C. albicans
Ágar
Sabouraud
Cloranfenicol
Diluente para
de levedura
Ágar Batata Dextrose
-
Ágar Sabouraud Glicose com
Dextrose Cloranfenicol
Ágar Batata Dextrose com
antibiótico
Ágar para
validação
80
de
Suplemento Seletivo
Cloranfenicol 50 mg
BS02108 – 10 flaconetes
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
soja (TSA)
Conformidade
Total
Total
-
Total
Total
Total
Total
Total
Total
Protocolo
Incubar de 20 à 72 h
à 32,5 ± 2,5ºC
Ágar SABOURAUD
Cloranfenicol (d)
à 32,5 ± 2,5ºC
- Coloração de Gram
- Teste de produção de filamentos e
clamidosporos
- Cultura em ágar de farinha de
mandioca com 1% de polissorbato
80
(c) Outros solventes podem ser utilizados de acordo com o Parágrafo 5.3.3.
(d) Outros meios de cultura podem ser utilizados de acordo com o Parágrafo 5.3.4.
NF EN ISO 21150
T75-604
(Setembro 2009)
Princípios:
Detecção de Escherichia coli
- Enriquecimento em meio não seletivo à 32,5 ± 2,5ºC de 20 à 72 horas.
- Identificação por meio de ensaios apropriados.
Meio de Cultura
BIOKAR Diagnóstico
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Caldo Eugon LT100
Meios
líquidos de
enriquecimento
Meio líquido de lactose, contendo
neutralizantes
e
agentes
dispersantes
Meio líquido lactose
Caldo Nutritivo Lactose
Meio líquido de triptona-sojalecitina-polissorbato 80 (Caldo
SCDLP 80)
-
Total
Total
-
-
-
-
-
-
(caldo
Ágar seletivo
para o
Ágar MacConkey
isolamento
E.coli
Ágar MacCONKEY
Ágar seletivo
Ágar de Levine eosina e azul de
para
metileno (EMB)
confirmação
Ágar EMB (Levine)
BK046HA – frasco de 500g
Diluente para
Bacteriana
Ágar para
validação
Conformidade
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
soja (TSA)
Total
Total
Total
Total
Protocolo
à 32,5 ± 2,5ºC
Ágar MacCONKEY
à 32,5 ± 2,5ºC
- Cultura em Ágar de Levine eosina e
azul de metileno (EMB)
NF EN ISO 22717
T75-603
(Setembro 2009)
Princípios:
Detecção de Pseudomonas aeruginosa
Meio de Cultura
BIOKAR Diagnóstico
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Caldo Eugon LT100
Meios
líquidos de
enriquecimento
Meio líquido de triptona-sojalecitina-polissorbato 80 (Caldo
SCDLP 80)
Conformidad
e
Total
-
-
-
-
-
-
(caldo
Ágar seletivo
para o
Ágar Cetrimida
isolamento
Ágar seletivo
Ágar de Pseudomonas para a
para
pesquisa de piocianina (Ágar
confirmação Pseudomonas P)
Diluente para
Bacteriana
Ágar para
validação
Ágar Cetrimida
-
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
soja (TSA)
Total
-
Total
Total
Protocolo
à 32,5 ± 2,5ºC
Ágar Cetrimida
à 32,5 ± 2,5ºC
- Pesquisa de oxidase
- Cultura em Ágar de Pseudomonas
para pesquisa de piocianina
NF EN ISO 22718
T75-605
(Setembro 2009)
Princípios:
Detecção de Staphylococcus aureus
Meio de Cultura
BIOKAR Diagnóstico
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Caldo Eugon LT100
Meios
líquidos de
enriquecimento
Meio líquido hidrolisado de
caseína-soja
Conformidade
Total
-
-
-
-
-
-
(caldo
Ágar Baird Parker
Solução de telurito de potássio
Ágar seletivo Emulsão de gema de ovo
para o
isolamento
Ágar Manitol (Ágar Chapman)
Ágar Vogel-Johnson
Diluente para
bacteriana
Ágar para
validação
Ágar Baird Parker
Ágar de CHAPMAN Manitol
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
soja (TSA)
Total
Total
-
Total
Total
Protocolo
à 32,5 ± 2,5ºC
Ágar BAIRD-PARKER (d)
à 32,5 ± 2,5ºC
- Pesquisa de catalase
- Pesquisa de oxidase
Anexo A: Protocolo de preparação para cepa de referência.
Suspensão bacteriana
TSA
(Repique da cultura em
tubos inclinados ou placas)
SDA
tubos inclinados ou placas)
PDA
placas)
à 32,5 ± 2,5ºC
Segunda subcultura (3º possível)
7 à 11 dias à
32,5 ± 2,5ºC
Triptona Cloreto de Sódio Triptona Cloreto de Sódio Triptona Cloreto de Sódio
Suspensão titulada
107 à 108 ufc/mL (a)
Suspensão titulada
107 à 108 ufc/mL (a)
Suspensão titulada
107 à 108 ufc/mL (a)
Controle de titulação da suspensão
TSA
SDA
à 32,5 ± 2,5ºC
Contagem de
bactérias totais (b)
Contagem de
Candida albicans (b)
(a) Utilizar a suspensão até duas horas após seu preparo.
(b) Para cada suspensão, dobrar a contagem por mL repicado.
PDA
placas)
7 à 11 dias à
32,5 ± 2,5ºC
Contagem de
Aspergillus brasiliensis (b)
Anexo B: outras normas para a Microbiologia de Produtos Cosméticos.
Diretrizes para a avaliação de riscos e identificação microbiológica de baixo risco – NF EN
ISO 29621 – T75-609
Avaliação da proteção antimicrobiana de um produto cosmético – NF EN ISO 11930 –
T75-600
Instruções gerais para as análises microbiológicas – NF EN ISO 21148 – T75-601
Detecção dos microorganismos específicos e não específicos – NF EN ISO 18415 – T75606
NF EN ISO 18415
T75-606
(Agosto 2011)
Detecção de microrganismos específicos e não específicos
Princípios:
- 1ª etapa: enriquecimento em meio líquido não específico.
- 2ª etapa: isolamento e identificação em função das necessidades e
seguindo as instruções das normas correspondentes.
Meio de Cultura
Diluente
BIOKAR Diagnóstico
Solução triptona cloreto de sódio
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Caldo Eugon LT100
Meio líquido
de enriqueciMeio líquido de caseína-sojamento
Conformidade
Total
Total
lecitina-polissorbato 20 (FCDLP 20)
-
-
Meio líquido de caseína-sojalecitina-polissorbato 80 (FCDLP 80)
-
-
-
-
-
-
(caldo
Ágar não
específico
Ágar Triptona Soja (TSA)
Ágar de peptona e caseína de soja BM05008 – 20 unidades Ø 90 mm
soja (TSA)
Caldo Triptona Soja (TSB)
Meio de peptona e caseína de soja BM03008 – 50 tubos 10 mL
adicionado de ágar (Caldo SCD
adicionado de ágar)
Ágar Bacteriológico tipo A
A1010HA – Flaconete 500g
A1010GC – Balde 5kg
Ágar Bacteriológico tipo E
A1012HA – Flaconete 500g
A1010GC – Balde 5kg
Total
Total
Protocolo
à 32,5 ± 2,5ºC
Ágar TSA (d)
à 32,5 ± 2,5ºC
Identificação dos microorganismos (e):
- Escherichia coli
- Pseudomonas aeruginosa
- Staphylococcus aureus
- Candida albicans
- Microrganismos não específicos
(e) Estabelecer os testes de identificação necessários para cada microrganismo.
NF EN ISO 11930
T75-600
(Junho 2012)
Avaliação da proteção antimicrobiana de um produto cosmético
Princípios: - Inoculação da formulação com inócuo calibrado.
- Determinação do número de microorganismos sobreviventes aos intervalos
de tempo pré definidos durante 28 dias.
Meio de Cultura
Diluente
Neutralizante
Solução triptona cloreto de sódio
Caldo Eugon LT100
Meios de
cultura
Ágar Batata Dextrose
BIOKAR Diagnóstico
Conformidade
Caldo Triptona Soja
BM00808 – 50 tubos 9 mL
Total
Caldo Eugon LT 100
BM00608 – 50 tubos 9 mL
de vidro
Total
BK095HA – flaconete 500g
Total
Equivalente (1)
Ágar de peptona e caseína de soja Ágar Tripto-caseína de soja
soja (TSA)
(1) o meio contém 4g de extrato de batata ao invés de 200g de infusão de batata preconizada.
Total
Protocolo
1) Demonstração da eficácia do neutralizante:
1g ou 1 mL da formulação em 9 mL de Caldo Eugon LT 100
30 ± 15 min à temperatura ambiente
Adicionar 1 mL de solução calibrada de micro-organismos (b) (c)
TSA
SDA
PDA
à 32,5 ± 2,5ºC
Contagem de
bactérias totais (a)
3 à 5 dias à
32,5 ± 2,5ºC
Contagem de
Candida albicans (a)
Contagem de
Aspergillus brasiliensis (a)
2) Demonstração da eficácia da proteção antimicrobiana da formulação:
20g ou 20 mL da formulação + 0,2 mL de inócuo calibrado (b)
Em um intervalo de tempo regular, retirar 1 mL ou 1g da formulação inoculada
7 dias: T7
14 dias: T14
28 dias: T28
Para cada amostragem, fazer a contagem dos microrganimos (seguindo o protocolo
descritivo da etapa “Demonstração da eficácia da etapa de neutralização”).
(a) Contar em dobro, 1 mL de cada mistura inoculada.
(b) O inócuo calibrado contém entre 10 5 e 106 UFC/mL para Candida albicans e
Aspergillus brasiliensis.
(c) Fazer um tubo controle, com 1 mL de inócuo em 10 mL de diluente.
Anexo C: Lista dos principais produtos da Microbiologia Cosmética
PRODUTO
APRESENTAÇÃO
Ágar BAIRD-PARKER
BM01808 – 20 placas de Ø 90 mm
Ágar Cetrimida
Ágar Sal Manitol
Caldo peptona tamponado com NaCl pH BK128HA – frasco 500g
7,0
Ágar EMB (LEVINE)
BM00608 – 50 tubos 9 mL
BM17508 – 50 tubos 9 mL + contas de vidro
BM04308 – 10 frascos 100 mL
Caldo Eugon LT 100
Ágar Eugon LT 100
BM17008 - 20 placas de Ø 90 mm
Ágar Batata Dextrose (com antibiótico)
Suplemento Seletivo Cloranfenicol 50 mg
BS02108 – 10 frascos
Ágar MacCONKEY
Caldo Lactose
Ágar SABOURAUD Glicose
Ágar
SABOURAUD
Cloranfenicol
Glicose
Caldo Triptona Soja (TSB)
Ágar Triptona Soja (TSA)
Ágar Glicose Oxitetraciclina (OGA)
com BK025HA – frasco 500g
BM03008 – 50 tubos 10 mL
BM00908 – 10 embalagens 100 mL
BK053GC – embalagem 5 Kg
Suplemento Seletivo Oxitetraciclina 50 mg
BS00808 – embalagem com 10 frascos
Suplemento Seletivo Gentamicina 25 mg
Suplemento Seletivo Cloranfenicol 50 mg
Ágar Schaedler
Caldo Tetrationato
Ágar Verde Brilhante
Caldo Müller-Kauffmann
Ágar Contagem de Placas (PCA)
Suplemeto Seletivo Novobiocina 10 mg
Suplemeto Seletivo Novobiocina 40 mg
BK144GC – embalagem 5 Kg
Caldo Lecitina Polissorbato Triton X
BM00608 – 50 tubos 9 mL
Ágar Lecitina Polissorbato Triton X
Apresentações
A) Ágar:
PRONTO:
Placas de Petri (ainda não
disponíveis no Brasil):
- Pacote com 120 unidades de
Ø 90 mm;
- Pacote com 20 unidades de
Ø 90 mm.
PRONTO PARA SOLUBILIZAR:
Flaconetes (ainda não
- 10 flaconetes de 100 mL;
- 10 flaconetes de 200 mL.
DESIDRATADO:
Frascos:
- Embalagem de 500g;
- Embalagem de 5 Kg.
Apresentações
B) Caldos:
PRONTO PARA USO:
Frascos (ainda não
- 10 frascos de 90 mL;
- 10 frascos de 100 mL;
- 10 frascos de 200 mL.
Tubos (ainda não
Embalagens flexíveis
- 50 tubos de 9 mL;
- 50 tubos de 10 mL.
(ainda não disponíveis no
Brasil):
- 3 embalagens de 3L;
- 2 embalagens de 5L.
DESIDRATADO:
Frascos:
- Embalagem de 500g;
- Embalagem de 5 Kg.
BIOKAR Diagnostics Qualidade
O Controle de Qualidade da Biokar Diagnostics certifica o desempenho de seus
produtos em conformidade com os padrões ISO:
–
–
–
–
–
Testes de desempenho;
Condições de transporte;
Testes de esterilidade;
Testes de neutralização;
Análises das características físico-químicas (pH, aspecto...).
BIOKAR Diagnostics é certificada
de acordo com as normas padrão
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Microbiologia para Cosméticos

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