fungichrom - Medica-Tec

25 tests (Ref. 44325)
ES-2006-09
1 - FINALIDAD
La galería FUNGICHROM permite la identificación de las principales levaduras halladas en patología humana utilizando substratos cromógenos (2,8).
2 - INTRODUCCIÓN
La frecuencia de las infecciones fúngicas y en particular las causadas por levaduras ha aumentado considerablemente a lo largo
de los 10 últimos años (6). Las levaduras son agentes oportunistas (5). La mayoría son saprofitos pero pueden convertirse en
patógenos cuando existen en el huésped condiciones favorables.
Estas condiciones son principalmente los factores psicológicos: recién nacidos, personas mayores, mujeres encintas; los factores locales: frotamientos, maceraciones; los factores patológicos: cáncer, insuficiencia inmunitaria, trastornos metabólicos...; los
factores terapia dependientes: antibioterapia, píldoras anticonceptivas, inmunosupresores, radiaciones ionizantes, cirugía...
Los cuadros clínicos provocados por estas levaduras son muy variados: afecciones cutáneas (intértrigo, onyxis) afecciones de
las mucosas (candidiasis oral, esofagitis, colitis, vaginitis....) afecciones viscerales y septicémicas.
Las levaduras son hongos unicelulares que se multiplican por desarrollo de las yemas. Los principales géneros encontrados en
patología son los siguientes: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces, Trichosporon.
El genero Geotrichum agrupa hongos filamentosos levuriformes cuyo micelio se fragmenta en artículos ovalados que parecen
levaduras.
- 1 frasco TC FUNGI
- 27 frascos SUSPENSION FUNGI
- 25 galerías FUNGICHROM
Description
TC FUNGI : Frasco de 4 ml de solución de sulfato de Bario para el control de turbidez.
SUSPENSION FUNGI : Frasco de 4 ml de solución agarosada que contiene Bacto Agar (0,5 g/L), colimicina (2,5 mg/L) y vancomicina (0,05 g/L).
Galería FUNGICHROM : Galería 20 pocillos, lista para su empleo, que incluye :
- pocillo 1 = T+ : pocillo testigo positivo conteniendo glucosa y BCP
- pocillo 2 = GAL: pocillo conteniendo un substrato cromógeno de la N- acetil-ß-D-galactosaminidasa
- pocillo 3 = PRO: pocillo conteniendo un substrato cromógeno de la L - prolina amidasa
- pocillo 4 = ACT: pocillo conteniendo actidiona, glucosa y BCP
- pocillo 5 = ONPG: pocillo conteniendo un substratro cromógeno de ortonitrofenil-ß-D-galactosidasa
- pocillo 6 = EPA: pocillo conteniendo un substrato cromógeno de una peptidasa
- pocillo 7 = SGL: pocillo conteniendo un substrato cromógeno de una peptidasa
- pocillo 8 = GLY: pocillo conteniendo un substrato cromógeno de la glicina-amidasa
- pocillo 9 = URE: pocillo conteniendo urea y RP
- pocillo 10 = POX: pocillo conteniendo un substrato de la fenoloxidasa
- pocillo 11 = GAL-SAC: pocillo conteniendo galactosa, sacarosa y BCP
- pocillo 12 = TRE: pocillo conteniendo trealosa y BCP
- pocillo 13 = MAL: pocillo conteniendo maltosa y BCP
- pocillo 14 = CEL: pocillo conteniendo celobiosa y BCP
- pocillo 15 = RAF: pocillo conteniendo rafinosa y BCP
- pocillo 16 = LAC: pocillo conteniendo lactosa y BCP
- pocillos 17 a 20 = pocillos vacíos
5 - PRECAUCIONES
• Los reactivos de este estuche son únicamente para uso in vitro por personas autorizadas.
• Las muestras y los reactivos sembrados son potencialmente infecciosos; deben ser manipulados con precauciones de uso y
desecharse a continuación respetando las reglas de higiene y la reglamentación vigente para este tipo de productos en el país
de utilización.
• La galería FUNGICHROM que contiene en algunos pocillos materias primas de origen animal deben ser manipulados con las
precauciones de uso correspondientes.
• No utilice los reactivos pasada la fecha de caducidad.
• No utilice los reactivos deteriorados o mal conservados antes de usar.
6 - RECOGIDA DE LAS MUESTRAS
La identificación de la levadura debe realizarse a partir de colonias jóvenes (24 horas a 48 horas) y perfectamente aisladas sobre
un medio agarosado preferentemente en placa de Petri. Se recomienda efectuar el aislamiento sobre medios específicos de
levaduras (3)
7 - CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los reactivos conservados a 2-8 º C en su estado de origen son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche.
Los reactivos están listos para su empleo.
Los medios SUSPENSION FUNGI y las galerías se utilizan inmediatamente tras su apertura.
FUNGICHROM®
C+ GAL PRO ACT ONPG EPA SGL GLY URE POX
IM
4 - REACTIVOS
Conditionnement
Estuche de 25 test conteniendo :
IM
3 - PRINCIPIO
La identificación de las levaduras se basa en la presencia o ausencia de diversas enzimas, visualizada por reacciones coloreadas. Las actividades enzimáticas se manifiestan por tres tipos de reacciones:
• La hidrólisis de substratos cromógenos (1,7): las actividades osidásicas y peptidásicas de las levaduras hidrolizan estos
substratos cromógenos y producen la liberación de paranitrofenol, paranitroanilina o de ortonitrofenol, coloreados en amarillo
(pocillos GAL, PRO, ONPG, EPA, SGL,GLY)
• La asimilación de substratos naturales:
- La utilización de azúcares se pone en evidencia por el viraje del bromocresol púrpura (BCP) del violeta al amarillo o incluso
al incoloro (pocillos GAL-SAC, TRE, MAL, CEL,RAF,LAC).
- La resistencia a la actidiona se revela según el mismo principio (pocillo ACT)
- La hidrólisis de la urea libera amoniaco que alcaliniza el medio y hace virar el rojo de fenol (RP) al rosa fucsia (pocillo URE)
• La oxidación de substratos sintéticos: la actividad de la fenoloxidasa en presencia de ácido cafeico produce una coloración
marrón (pocillo POX) (4) .
Cada galería FUNGICHROM incluye también un pocillo testigo positivo (pocillo T+) que pone en evidencia la asimilación de la
glucosa.
4 pocillos vacíos
TRE MAL CEL RAF LAC
Identificación de las principales levaduras de interés médico
9 - PROCEDIMIENTO
Llevar los reactivos a temperatura ambiente (18-25 ºC) antes de su empleo
9.1. Examen de las colonias aisladas
El examen macroscópico y microscópico de las colonias se efectúa antes de la inoculación de la galeria.
9.2. Preparación de la inoculacíon
Tomar 2 o 3 colonias aisladas idénticas con ayuda de una o de una pipeta Pasteur tapada. Después descargarlas en un frasco
SUSPENSION FUNGI. Homogeneizar.
La estandarización de la inoculación puede realizarse de diferentes formas:
• Comparando con el frasco TC FUNGI
Ajustar la opacidad del medio sembrado con la del control de turbidez TC FUNGI ayudándose de las rayas negras de las etiquetas del frasco.
Si el medio es mas claro (inoculación insuficiente), resembrar el frasco hasta la obtención de una opacidad igual a la del frasco
de control de turbidez.
Si el medio es mas turbio ( inoculación muy rica), diluir con ayuda de un nuevo frasco SUSPENSION FUNGI hasta la obtención
de una opacidad correcta.
• Con ayuda de un densitómetro
Verificar con ayuda de un densitómetro que la turbidez del medio sembrado es igual a 2 Mac Farland. Si es necesario, actuar
como se ha indicado precedentemente para ajustar la turbidez.
• Numeración en una célula de Malassez
Es posible estandarizar la inoculación efectuando una numeración de las levaduras en una célula de Malassez. Se debe obtener una suspensión de 106 a 107 levaduras por ml.
9.3. Inoculación de la galería
Levantar el adhesivo que recubre la galería. Inocular los 16 primeros pocillos con dos gotas (aproximadamente 100 µl) de SUSPENSION FUNGI sembrado. No hay que rellenar los últimos 4 pocillos vacíos. Volver a colocar el adhesivo sobre la galería.
SAC
GAL
FUNGICHROM®
8 - REACTIVO Y MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO
• NaOH 0,1 N.
• Estufa a 30 ºC
• Pipetas Pasteur
• Recipiente para desechos contaminados
9.4. Incubación
Poner en la estufa a 30 ºC máximo durante 24 a 48 horas.
Leer la galería cuando el pocillo testigo positivo ha virado del violeta al amarillo / incoloro.
Sin embargo las cepas que tras 24 horas solo presenten el carácter mayor prolina-amidasa positivo, se incubaran durante 24
horas suplementarias. Para las cepas urea positivo, la incubación podrá prolongarse hasta 72 horas.
10 - LECTURA E INTERPRETACION
10.1 Lectura de la galeria
Las coloraciones son estables 4 horas sobre la gradilla. Para la lectura se recomienda utilizar el cuadro de colores incluido en
el estuche.
Leer el pocillo C+, si permanece de color violeta prolongar el tiempo de incubación.
Si el pocillo C+ se ha vuelto amarillo o incoloro, añadir una gota de NaOH 0,1 en el pocillo GAL (2° pocillo) de la galeria y
leer según el cuadro siguente:
Pocillos
GAL
PRO
ACT
ONPG
EPA
SGL
GLY
URE
POX
GAL-SAC
TRE, MAL,
CEL, RAF, LAC
Lectura de la reacción
Reacción negativa
Reacción positiva
Incoloro
Amarillo
Violeta
Incoloro
Incoloro
Incoloro o
amarillo muy pálido*
Amarillo
Incoloro
Violeta
Interest
Identificación de C. albicans
Orientación de las especies
Amarillo a incoloro
Amarillo
Amarillo pálido
Orientación de las principales especies
Amarillo intenso
Rojo a fucsia
Marrón
Amarillo a incoloro
* En caso de duda, considerar el pocillo negativo
Orientatión hacia los géneres
Cryptococcus, Rhodotorula,
Trichosporon
Identificación de las especies
10.2 Identificación
La identificación de las cepas se realiza con la ayuda del FUNGICHROM paralelamente al estudio de los caracteres morfológicos habituales.
La interpretación de la galería FUNGICHROM se realiza por un sistema de códigos o por el cuadro de identificación. Si después
de 24 horas de incubación, el código obtenido no esta referenciado, continuar la incubación 24 horas suplementarias. Si después de estas 48 horas de incubación el código obtenido sigue sin estar referenciado referirse al cuadro de identificación. Para
una levadura, todos los caracteres mayores indicados en este cuadro tendrán que ser imperativamente positivos salvo en el
caso en el que un porcentaje de positividad se menciona.
Para establecer el código los caracteres se agrupan en tríos o en dúos
- GAL, PRO, ACT
- ONPG, EPA
- SGL, GLY
- URE, POX
- GAL-SAC, TRE, MAL
- CEL, RAF, LAC
A cada carácter se atribuye un valor cero si el elemento es negativo. Si el elemento es positivo su valor depende de su posición
en dúo o en trío .
- 1 para posición 1
- 2 para posición 2
- 4 para posición 3
En un mismo dúo o trío, los valores se suman, se obtiene así un numero de 6 cifras. Este código se buscara en la lista adjunta.
Ejemplo :
GAL PRO ACT ONPG EPA SGL GLY URE POX GAL-SAC TRE MAL CEL RAF LAC
+
+
+
+
+
+
1
2
4
0
0
0
0
0
0
1
2
4
0
0
0
7
0
0
0
7
0
Codigo 70 00 70 ; en la lista, este código corresponde a Candida albicans
10.3 Diagnóstico diferencial
Para diferenciar ciertas cepas entre ellas es necesario efectuar exámenes complementarios.
• Candida famata y Trichosporon cutaneum (codigo 00 01 73) :
En el examen morfológico sobre PCB se constata que Candida famata no filamenta mientras que Trichosporon cutaneum filamenta y presenta artrosporas.
• Candida krusei y Candida rugosa (codigo 00 10 00 y 00 10 10) :
Candida krusei da colonias de aspecto generalmente seco y mate contrariamente a Candida rugosa, sin embargo este carácter
no es constante
• Candida inconspicua y Candida zeylanoides (codigo 20 00 00) :
Candida inconspicua no filamenta nunca sobre PCB a diferencia de Candida zeylanoides
• Candida famata, Rhodotorula rubra y Cryptococcus albidus (codigo 20 01 73) :
A diferencia de Candida famata, Rhodotorula rubra tiene un pigmento rojo, y Cryptococcus albidus una capsula.
• Candida guilliermondi y Candida famata (codigo 20 00 73 y 60 20 73) :
Candida guilliermondi filamenta sobre PCB mientras que Candida famata no filamenta.
• Candida lipolytica y Geotrichum capitatum (codigo 60 31 00) :
El examen morfológico demuestra que Candida lipolytica es una levadura mientras que Geotrichum capitatum es un champiñon
filamentoso formando artrosporas.
11 - CONTROL DE CALIDAD
Con el fin de verificar la estandarización del método, se recomienda realizar un control de calidad en forma periódica utilizando
las cepas de referencia Candida albicans ATCC 9029 y Candida glabrata ATCC 90030.
Cepa
Resultados esperados
GAL PRO ACT ONPG EPA SGL GLY URE POX GAL-SAC TRE MAL CEL RAF LAC
C.albicans
+
+
+
+
+
+
(ATCC 9029)
C.glabrata
+
+
+
(ATCC 90030)
12 - CAUSA DE ERRORES
• Manipulación en atmósfera no estéril.
• Preparación del inóculo a partir de una mezcla de cultivos.
• Evaporación del contenido de los pocillos debido a que la película adhesiva de la galería no queda bien adherida durante la
incubación.
• Galería incubada a 37 °C en lugar de 30°C.
• Galería leída antes del viraje del testigo de crecimiento.
• Galería no leída después de 24 ó 48 horas de incubación cuando el testigo de crecimiento era positivo.
Y, en forma general, el incumplimiento de las recomendaciones de las presentes instrucciones de uso.
13 - LÍMITES DEL MÉTODO
• El método FUNGICHROM sólo permite identificar las especies presentes en la base de datos.
• Para ciertas cepas, le lectura de las características morfológicas en medio gelosado específico de las levaduras permite afirmar el diagnóstico (§10.3).
14 - PERFORMANCES
La evaluación de las performances se ha realizado utilizando 18 cepas de referencia, 227 cepas de colección y 241 cepas
recientemente aisladas de muestras micológicas. El estudio comparativo ha sido efectuado en forma paralela a las galerías
Auxacolor y API 20C (8).
Con el método FUNGICHROM (n=486) :
- 85% de las cepas fueron identificadas tras 24 horas de incubación a 30°C;
- la sensibilidad fue del 97,7% después de 48 horas de incubación;
- la especificidad fue de 99,8% después de 48 horas de incubación, junto con un examen morfológico.
15 - ELIMINACIÓN DE LOS DESECHOS
Los desechos deben ser eliminados respetando las reglas de higiene y la reglamentación en vigor para este tipo de productos
en el país de utilización.
16 - BIBLIOGRAFIA
1.CASAL M. and M.J. LINARES. 1983. Contribution to the study of the enzymatic profiles of yeast organisms with medical
interest. Mycopathol. 81: 155-159.
2. CONTANT G., C. CROUZIER and M. DEBRUYNE. 1993. A new colorimetric system: FUNGICHROM® for medical yeast
identification. In “C.E.M.M.”, Paris, 26th november.
3. GRILLOT R., B. LEBEAU et I. SELBMANN. 1989. Isolement et identification des levures, données récentes et perspectives.
Rev. Fr. Lab. 197:24-32.
4. HEALY M.E., C.L. DILLAVOU and G.E. TAYLOR. 1977. Diagnostic medium containing inositol, urea, and caffeic acid for
selective growth Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol. 6: 387-391.
5. HURLEY R., J. DE LOUVOIS and A. MULHALL. 1987. Yeasts as human and animal pathogens, p 207-228. In A.H. ROSE
and J.S. HARRISON, (ed), The yeasts, Vol. 1, 2nd edition. Academic Press, London.
6. KOENIG H., J. WALLER et M. KREMER. 1989. Diagnostic et aspects épidémiologiques de 70 000 levures isolées en 8 ans.
Rev. Fr. Lab. 197: 34-38.
7. PERRY J.L. and G.R. MILLER. 1987. Umbelliferyl-labeled galactosaminide as an aid in identification of Candida albicans.
J. Clin. Microbiol. 25: 2424-2425.
8. WALLER J., G. CONTANT, C. CROUZIER, M. DEBRUYNE and H. KOENIG. 1995. Evaluation of a new yeast identification
system FUNGICHROM® based on chromogenic substrate hydrolysis and a carbohydrate assimilation. J. Mycol. Med. 5: 92-97.
FUNGICHROM® es una marca registrada de ELITech France SAS
Sitio de fabricación :
ELITech France
Parc d’activités
Allée d’Athènes
83870 SIGNES
(FRANCE)
ELIT ECH France SAS
305, allée de Craponne
13300 SALON DE PROVENCE
(FRANCE)
Tél. : 33 (0)4 90 17 54 50
Fax : 33 (0)4 90 17 54 51
PT-2006-09
4 poços vazios
IM
FUNGICHROM®
C+
GAL PRO ACT ONPG EPA SGL GLY URE POX
IM
l – UTILIZAÇÃO PREVISTA
A galeria FUNGICHROM permite a identificação das principais leveduras que encontramos em patologias humanas,
nomeadamente através da utilização de substratos cromogénicos (2, 8).
2 - INTRODUÇÃO
Nos últimos dez anos, verificou-se um aumento considerável da frequência das infecções fúngicas e, mais especificamente, das
infecções causadas por leveduras(5). As leveduras são agentes oportunistas. A maior parte são saprófitas, mas transformamse em agentes patogénicos, se o hospedeiro apresentar condições favoráveis. Estas condições são, essencialmente as
seguintes: factores fisiológicos: recém-nascidos, idosos, grávidas; factores locais: abrasões, macerações; factores patológicos:
cancro, imunodeficiência, perturbações metabólicas...; factores iatrogénicos: antibioterapia, anticoncepcionais,
imunosupressores, radiações ionizantes, cirurgias...Os quadros clínicos provocados pelas leveduras são extremamente
variados: doenças cutâneas (intertrigo, onixia...), doenças das mucocutâneas (candidíase oral, esofagites, colites, vaginites...),
infecções viscerais e septicémia.
As leveduras são fungos unicelulares que se multiplicam por germinação. Os principais géneros patológicos são os seguintes:
Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces e Trichosporon. O género Geotrichum agrupa fungos filamentosos, cujo
micélio produz hifas que se segmentam em artroconídias rectangulares, variando de tamanho e na forma circular do ponto distal
3 - PRINCÍPIO
A identificação das leveduras baseia-se na presença ou ausência de diversas enzimas, visualizada por alterações de coloração.
As actividades enzimáticas são evidenciadas por meio de três tipos de reacções:
• H id r ó li se d e s u b st r a t o s c ro m o g é n ic o s (1, 7): as actividades osidásicas e peptidásicas das leveduras hidrolisam substratos
cromogénicos e levam à libertação de para-nitroanilina, de para-nitrofenol ou de orto-nitrofenol coradas a amarelo (poços GAL,
PRO, ONPG, EPA, SGL, GLY);
• A s s i m i l a ç ã o d e s u b s t r a to s n at u r ai s :
- A utilização dos açúcares é demonstrada pela transformação do bromocresol púrpura (BCP), de violeta para amarelo ou, até
mesmo, pela ausência de cor (poços GAL-SAC, TRE, MAL, CEL, RAF, LAC)
- A resistência à actidiona é revelada de acordo com o mesmo princípio (poço ACT)
- A hidrólise da ureia liberta amónia que alcaliniza o meio e leva à transformação do vermelho de fenol (VF) em rosa fuschia
(poço URE)
• O xid a çã o d e su b st ra t o s sin t é t ico s: a actividade da fenoloxidase na presença de ácido cafeico produz uma coloração castanha (poço POX) (4).
Cada galeria FUNGICHROM também inclui , um poço controlo positivo (poço T+), que evidencia a assimilação da glicose.
4 - REAGENTES
Ac ond ic i ona men to
Emb al ag em de 2 5 tes t es q ue c on tém :
- 1 frasco TC FUNGI
- 27 frascos SUSPENSION FUNGI
- 25 galerias FUNGICHROM
De s c r i ç ã o
TC FUNGI: Frasco de 4 ml de solução de sulfato de bário para o controlo da turvação
SUSPENSION FUNGI : Frasco de 4 ml de solução gelificada que contém Bacto Agar (0,5 g/l), colimicina (2,5 mg/l) e vancomicina (0,05 g/l).
Galeria FUNGICHROM : Galeria de 20 poços, pronta a utilizar, contendo :
- poço 1 = T+: poço controlo positivo que inclui glicose e BCP
- poço 2 = GAL: poço que inclui um substrato cromogénico da N-acetilo-ß-D-galactosaminidase
- poço 3 = PRO: poço que inclui um substrato cromogénico da L-prolineamidase
- poço 4 = ACT: poço que inclui actidiona, glicose e BCP
- poço 5 = ONPG: poço que inclui um substrato cromogénico da orto-nitrofenilo-ß-D-galactosidase
- poço 6 = EPA: poço que inclui um substrato cromogénico de uma peptidase
- poço 7 = SGL: poço que inclui um substrato cromogénico de uma peptidase
- poço 8 = GLY: poço que inclui um substrato cromogénico da glicina-amidase
- poço 9 = URE: poço que inclui ureia e RP
- poço 10 = POX: poço que inclui um substrato da fenoloxidase
- poço 11 = GAL-SAC: poço que inclui galactose, sacarose e BCP
- poço 12 = TRE: poço que inclui trealose BCP
- poço 13 = MAL: poço que inclui maltose e BCP
- poço 14 = CEL: poço que inclui celobiose e BCP
- poço 15 = RAF: poço que inclui rafinose e BCP
- poço 16 = LAC: poço que inclui lactose e BCP.
- pocos 17-20 : poços vazios
5 - PRECAUÇÕES
• Os reagentes desta embalagem foram concebidos apenas para utilização in vitro, só devendo ser manipulados por técnicos
especializados.
• As amostras e os reagentes inoculados são potencialmente infecciosos; logo, devem ser manipulados de acordo com as
precauções de utilização implementadas, respeitando as normas em termos de higiene bem como a legislação em vigor no país
de utilização para este tipo de produto.
• A galeria FUNGICHROM que inclui, em determinados poços, matérias-primas de origem animal, deve ser manuseada de
acordo com precauções de utilização.
• Não utilize os reagentes fora do prazo de validade.
• Não utilize os reagentes danificados ou indevidamente conservados antes do respectivo uso.
6 - RECOLHA E TRATAMENTO DAS COLHEITA S
As colónias utilizadas para a identificação da levedura devem ser recentes (com 24 horas a 48 horas) e totalmente isoladas num
meio de agar, numa placa de Petri. É aconselhável que se proceda ao isolamento em meios específicos para leveduras (3).
7 - CONSERVAÇÃO E PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
Os reagentes conservados a 2-8 °C no estado original permanecem estáveis até ao fim do prazo de validade indicado na embalagem. Os reagentes estão prontos a ser utilizados.
Os frascos SUSPENSION FUNGI e as galerias têm de ser utilizados logo após a sua abertura.
8 - REAGENTE E MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
• NaOH 0,1 N.
• Estufa a 30 °C.
• Pipetas Pasteur.
• Recipiente para resíduos contaminados.
TRE MAL CEL RAF LAC
Id en tif ic aç ão d as pri nc ip ais le ved ur as pat og én ic as
25 t estes (Ref. 44325)
SAC
GAL
FUNGICHROM®
9 - MÉTODO
E s t a b i li ze o s r e a g e n t e s à t e m p e r a t u r a a m b i e n t e ( 1 8 - 2 5 ° C ) a n t e s d a u t i li za çã o .
9.1. E xam e da s coló n ias iso la da s
O exame macroscópico e microscópico das colónias é realizado antes da inoculação da galeria.
9.2. P re p ar aç ão d o inó cu lo
Com a ajuda de uma ansa ou de uma pipeta Pasteur com a extremidade fundida, pique duas a três colónias isoladas idênticas.
De seguida, inocule num frasco SUSPENSION FUNGI. Misture bem.
A padronização do inóculo pode ser efectuada de diferentes maneiras:
• R e l a t i v a m e n t e a o f r a s c o T C F U NG I
Ajuste a opacidade do meio inoculado de acordo com a do controlo da turvação TC FUNGI, com a ajuda das linhas pretas na
etiqueta do frasco.
Caso o meio seja mais claro (inóculo insuficiente), proceda à re-inoculação do frasco até obter uma opacidade igual à do controlo
da turvação.
Se o meio se apresentar mais turvo (inóculo demasiado rico), proceda à sua diluição com um frasco SUSPENSION FUNGI
aberto de novo, até conseguir uma opacidade correcta.
• Co m a a j uda de u m de ns i tó me tr o
Com a ajuda de um densitómetro, certifique-se de que a turvação do meio inoculado corresponde a 2 Mac Farland. Caso se
mostre necessário, proceda conforme previamente indicado de modo a ajustar a turvação.
• Nu m e r a ç ã o e m c é l u l a M a l a s s e z
É possível padronizar o inóculo procedendo a uma contagem das leveduras em células de Malassez. Deve obter-se uma
solução de 106 a 107 leveduras por ml.
9.3. In ocu lação da g ale ria
Retire o revestimento adesivo que tapa a galeria. Inocule os 16 primeiros poços com 2 gotas (cerca de 100 µI) de meio SUSPENSION FUNGI inoculado. Não é necessário inocular os 4 últimos poços. Volte a colocar o revestimento adesivo na galeria.
9.4. I nc ub a çã o
Coloque na estufa a 30 °C, no máximo, entre 24 a 48 horas.
Leia a galeria quando o poço controlo positivo passar de violeta a amarelo ou incolor.
No entanto, as estirpes que apresentam apenas predominantemente prolina-amidase positiva, às 24 horas terão de ser
incubadas durante 24 horas suplementares. No caso das estirpes ureia-positivas, a incubação poderá ser prolongada até 72
horas.
10 - LEITURA E INTERPRETAÇÃ O
10.1 Le itura da g aleria
As colorações permanecem estáveis durante 4 horas na bancada. No caso da leitura, é aconselhável utilizar a “tabela de cores»
incluída na embalagem.
Leia o poço T+: se continuar a apresentar uma cor violeta, prolongue o tempo de incubação.
Se o poço T+ for amarelo ou incolor, ad icione uma gota de NaOH 0,1 N ao p oço GA L (2.º poço) e proceda à leitura da galeria
de acordo com o quadro abaixo apresentado:
Po ç o
GAL
PRO
L e i t u r a d a re a c ç ã
Reac ç ão neg at iv a Reac ç ão p o s i t i v a
Incolor
Amarela
ACT
Violeta
Amarela a incolor
ONPG
Incolor
Amarela
EPA
Incolor
Amarela clara
SGL
GLY
Incolor ou amarela
muito pálida*
Amarela
URE
Amarela
F u n ç ão
Identificação de C. albicans
Orientação das espécies
Orientação das espécies principals
POX
Incolor
Vermelha a fùsciau Orientação em termos dos géneros
Cryptococcus, Rhodotorula,
Trichosporon
Castanha
GAL-SAC
TRE, MAL,
CEL, RAF, LAC
Violeta
Amarela a incolor
Identificação das espécies
*No caso de dúvida, considere o poço como negativo.
10.2 I d en t if ica çã o
A identificação das estirpes é efectuada com o FUNGICHROM, em paralelo com o estudo de rotina das características
morfológicas.
A interpretação da galeria FUNGICHROM é efectuada quer através de um sistema de código, quer através da tabela de
identificação. No caso de, ao fim de 24 horas de incubação, o código obtido não for referenciado, prossiga com a incubação
durante 24 horas suplementares. Se, ao fim de 48 horas de incubação, o código obtido continuar a não fazer parte do repertório,
consulte a tabela de identificação. No caso de uma determinada levedura, todas as características principais indicadas nesta
tabela terão de ser, obrigatoriamente, positivas, excepto no caso de ser mencionada uma percentagem de positividade.
Para determinar o código, as características são reagrupadas em grupos de três ou de duas:
- GAL, PRO, ACT
- ONPG, EPA
- SGL, GLY
- URE, POX
- GAL-SAC, TRE, MAL
- CEL,RAF,LAC.
A cada característica é atribuído um valor zero no caso de o elemento ser negativo.
Se o elemento for positivo, o seu valor depende da respectiva posição nos grupos de duas ou de três :
- 1 para a posição 1
- 2 para a posição 2
- 4 para a posição 3.
Num mesmo grupo de duas ou de três, os valores são adicionados. Deste modo, obtém-se um número com 6 algarismos. Este
código pode ser encontrado na lista em anexo.
Exemplo:
G A L PRO ACT ONPG EPA SGL GLY URE POX GAL-S AC TRE M A L CEL RAF L A C
+
+
+
+
+
+
1
2
4
0
0
0
0
0
0
1
2
4
0
0
0
7
0
0
0
7
0
Código: 70 00 70; na lista, este código corresponde à Candida albicans.
10.3 D ia g n ó st ic o d if e re n c ia l
Para diferenciar determinadas estirpes entre elas, pode ser necessário proceder-se à realização de exames complementares:
• Ca ndida fa mata e Tr ic h o sp o ro n cu t a n e u m (código 00 0 1 73) :
Com o exame morfológico em PCB, é possível constatar-se que Candida famata não se filamenta, ao passo que Trichosporon
forma filamentos e apresenta artrósporos.
• C an d id a kr use i e C an d id a ru g o sa (códigos 00 10 00 e 00 10 10) :
A Candida krusei geralmente produz colónias com um aspecto seco e mate, ao contrário da Candida rugosa; no entanto, nem
sempre é assim.
• C a n d id a i nc o n sp ic ua e C an did a zeyla no id es (códigos 20 00 00) :
Ao contrário de Candida zeylanoides, Candida inconspicua nunca forma filamentos em PCB.
• Ca ndida fa mata , R h o d o t o ru l a r u b ra e C r y p t o c o c c u s a l b i d u s (códigos 200173) :
Ao contrário de Candida famata, Rhodotorula rubra possui um pigmento vermelho e Cryptococcus albidus uma cápsula.
• C a n d id a g u il lie r m o n d ii e Ca ndida fam ata (códigos 20 00 73 et 60 20 73) :
Candida guilliermondii forma filamentos em PCB, ao passo que Candida famata não se filamenta.
• C a n d id a li po l yt ica e G e o t ric h u m ca p i t a tu m (códigos 60 31 00) :
O exame morfológico vem demonstrar que Candida lipolytica é uma levedura, ao passo que Geotrichum capitatum é um fungo
filamentoso que forma artrósporos.
11 - CONTROLO DE QUALIDADE
Para verificar a padronização do método, recomenda-se a realização periódica de um controlo de qualidade, utilizando as estirpes de referência, Candida albicans ATCC 9029 e Candida glabrata ATCC 90030.
Estir pe
Re s u l ta d os es p e r a do s
GAL PRO ACT ONPG EPA SGL GLY URE POX GAL-SAC TRE MAL CEL RAF LAC
+
+
+
+
+
+
C.albicans
(ATCC 9029)
+
+
+
C.glabrata
(ATCC 90030)
12 - CAUSAS DE ERRO
• Manipulação numa atmosfera não-estéril.
• Preparação do inóculo a partir de uma mistura de culturas.
• Evaporação do conteúdo do poço devido ao revestimento adesivo não aderente à galeria não ser adequadamente selado.
• Galeria incubada a 37 °C em vez de a 30°C.
• Galeria lida antes da transformação do indicador de crescimento.
• Galeria não lida ao fim de 24 ou 48 horas de incubação quando o indicador de crescimento já era positivo.
E, de um modo geral, a inobservância das recomendações incluídas no presente folheto informativo.
13 - LIMITAÇÕES
• O método FUNGICHROM permite apenas, a identificação das espécies presentes na lista incluída
• Para determinadas estirpes, pode ser necessária a análise das características morfológicas presentes nas colónias cultivadas
em meios de agar específicos para leveduras (§10.3).
14 - DESEMPENHO
A avaliação do desempenho foi efectuada com a ajuda de 18 estirpes de referência, 227 estirpes de colheita e 241 estirpes
recentemente isoladas a partir de amostras micológicas. O estudo comparativo foi efectuado em paralelo com as galerias
Auxacolor e API 20C (8).
Com o método FUNGICHROM (n=486):
- 85% das estirpes foram identificadas no espaço de 24 horas de incubação a 30°C;
- a sensibilidade é de 97,7% ao fim de 48 horas de incubação;
- a especificidade é de 99,8% ao fim de 48 horas de incubação, com exame morfológico.
15 - ELIMINAÇÃO DOS RESÍDUOS
Os resíduos têm de ser eliminados, respeitando as normas de higiene bem como a legislação em vigor para este tipo de
reagentes no país de utilização.
16 - BIBLIOGRAFIA
1.CASAL M. and M.J. LINARES. 1983. Contribution to the study of the enzymatic profiles of yeast organisms with medical
interest. Mycopathol. 81: 155-159.
2. CONTANT G., C. CROUZIER and M. DEBRUYNE. 1993. A new colorimetric system: FUNGICHROM® for medical yeast
identification. In “C.E.M.M.”, Paris, 26th november.
3. GRILLOT R., B. LEBEAU et I. SELBMANN. 1989. Isolement et identification des levures, données récentes et perspectives.
Rev. Fr. Lab. 197:24-32.
4. HEALY M.E., C.L. DILLAVOU and G.E. TAYLOR. 1977. Diagnostic medium containing inositol, urea, and caffeic acid for
selective growth Cryptococcus neoformans. J. Clin. Microbiol. 6: 387-391.
5. HURLEY R., J. DE LOUVOIS and A. MULHA LL. 1987. Yeasts as human and animal pathogens, p 207-228. In A.H. ROSE
and J.S. HARRISON, (ed), The yeasts, Vol. 1, 2nd edition. Academic Press, London.
6. KOENIG H., J. WALLER et M. KREMER. 1989. Diagnostic et aspects épidémiologiques de 70 000 levures isolées en 8 ans.
Rev. Fr. Lab. 197: 34-38.
7. PERRY J.L. and G.R. MILLER. 1987. Umbelliferyl-labeled galactosaminide as an aid in identification of Candida albicans.
J. Clin. Microbiol. 25: 2424-2425.
8. WALLER J., G. CONTANT, C. CROUZIER, M. DEBRUYNE and H. KOENIG. 1995. Evaluation of a new yeast identification
system FUNGICHROM® based on chromogenic substrate hydrolysis and a carbohydrate assimilation. J. Mycol. Med. 5: 92-97.
FUNGICHROM® é uma marca registada da ELITech France SAS
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