QUANTA LiteTM dsDNA

NOVA GelTM Sm/RNP “T”
708415
Para Diagnóstico In Vitro
Aplicação Diagnóstica
NOVA GelTM Sm/RNP é um sistema de teste de dupla difusão para a titulagem e a determinação semiquantitativa de auto-anticorpos para Sm/RNP, um antigénio nuclear extraível (ENA), no soro humano. A
presença de anticorpos para Sm/RNP pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e
descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) e de outras doenças
do tecido conjuntivo.
Resumo e Explicação do teste
O termo "Anticorpos antinucleares" (ANA) descreve uma diversidade de auto-anticorpos que reagem com
constituintes do núcleo de células, incluindo DNA, RNA e várias proteínas e ribonucleoproteínas.1 Estes
auto-anticorpos ocorrem com elevada frequência em doentes com doenças do tecido conjuntivo ou
reumáticas, especialmente SLE. Virtualmente todos os doentes de SLE são ANA positivos. Esta
sensibilidade do diagnóstico conduziu à incorporação dos testes de ANA nos Critérios Revistos de 1982
para a Classificação do Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão da Associação de Artrite e
Reumatismo.2 Enquanto o teste ANA é um teste de rastreio excelente para SLE (um resultado negativo
exclui virtualmente o SLE activo3) não é de modo algum um teste específico.
A tendência actual para diagnosticar e gerir doenças do tecido conjuntivo é combinar um teste de rastreio
sensível de ANA com testes de seguimento mais específicos tais como dsDNA e/ou ENA. Os testes de ENA
são especialmente importantes visto que eles fornecem tanto informações de diagnóstico como de
prognóstico.
Os auto-anticorpos para o antigénio Sm são altamente específicos para SLE e, tal como os anticorpos para
dsDNA, são considerados um anticorpo marcador. Os anticorpos para Sm foram incluídos nos critérios da
subcomissão de Artrite e Reumatismo para a classificação de SLE.2 Os auto-anticorpos para RNP são
encontrados em doentes com SLE e também em algumas outras doenças do tecido conjuntivo.1,2,4 Os autoanticorpos para RNP estão associados com o desenvolvimento de uma doença relativamente benigna, com
menor incidência de doença renal, enquanto que os pacientes com anticorpos Sm possuem uma maior
incidência de doença renal e de envolvimento do sistema nervoso central.5-7
Princípio do Procedimento
O teste de dupla difusão, descrito por Ouchterlony,8 permite que uma solução de antigénio se difunda
passivamente através de uma matriz de suporte de gel em direcção a uma amostra e/ou controlo contendo
anticorpo. Os poços, com forma especial, fixados na matriz de gel, funcionam como reservatórios a partir
dos quais as soluções de antigénio e de anticorpo difundem em direcção uma da outra. No ponto de
equivalência antigénio-anticorpo, forma-se no gel uma linha visível de precipitação . O estado imunológico
de um doente pode então ser determinado através da observação de padrões de linhas de precipitação
adjacentes formadas no gel por uma amostra controlo, de especificidade conhecida, e por um soro
desconhecido de um doente.
A técnica de dupla difusão pode ser usada com uma preparação purificada de Sm/RNP, uma amostra
controlo de auto-anticorpos Sm ou RNP conhecida e um soro de um doente suspeito de conter autoanticorpos Sm e/ou RNP para mostrar identidade imunológica, não identidade ou identidade parcial. A
confirmação de actividade de auto-anticorpos Sm e/ou RNP no soro do doente pode ser feita se a sua linha
de precipitação combinar caracteristicamente com a linha formada por uma amostra controlo conhecida.
Em certos casos, uma determinação semi-quantitativa da quantidade de auto-anticorpos de Sm e/ou RNP
num soro do doente é desejada. Nestes casos, a placa NOVA Gel “T” pode ser utilizada para ensaiar uma
amostra do doente diluída em série. O recíproco da diluição mais elevada que forma uma linha de
precipitação pode então ser relatada como o título do auto-anticorpo de Sm e/ou RNP para o doente. O
procedimento de teste de dupla difusão correcta requer o ensaio de razões de concentração de antigénios anticorpos múltiplos de forma a impedir o excesso de antigéniso ou de anticorpos. A formação de linha de
1
precipitação incorrecta ou ilusória pode ocorrer devido ao excesso de antigénio ou de anticorpo. Para
impedir isto, as diluições do soro do doente deverão ser ensaiadas em comparação com a mesma
preparação de antigénio. Isto é conseguido simultaneamente enquanto faz a titulagem da amostra do
doente na placa de NOVA Gel “T”.
Composição do Dispositivo
1.
2.
3.
4.
Placas de gel de rastreio Nova Gel “T” com 7 poços cada, contendo estabilizadores e 0,09% de
azida de sódio
0,4 ml de antigénio Sm/RNP (de timo de vitelo), liofilizado em tampão, contendo estabilizadores e
0,09% de azida de sódio
0,7 ml de controlo Sm, soro humano contendo auto-anticorpos para Sm em tampão contendo 0,09%
de azida de sódio
0,7 ml de controlo RNP, soro humano contendo auto-anticorpos para RNP em tampão contendo
0,09% de azida de sódio
Advertências
1.
2.
3.
4.
Todo o material de origem humana usado na preparação de controlos para este produto foi testado e
considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA.
No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV
ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo Sm e o Controlo RNP deverão ser manuseados
como material potencialmente infeccioso.9
A Azida de Sódio é usada como um conservante. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica
se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo
ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as
bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a
formação de azida.
Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos.
Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos
ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos.
Precauções
1.
2.
3.
4.
5.
Este produto é para Uso de Diagnóstico In Vitro.
A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste
sistema pode conduzir a resultados inconsistentes.
É recomendado que água estéril destilada ou desionizada seja usada para re-hidratar o antigénio.
Uma variedade de factores influencia o desempenho do ensaio. Estes incluem a temperatura de
início dos reagentes, prevenir o enchimento excessivo dos poços com reagentes ou amostras dos
doentes e a qualidade da água usada para re-hidratar o antigénio. Deverá ser prestada uma atenção
cuidadosa à consistência para obter resultados precisos e reprodutíveis.
É recomendado um cumprimento rigoroso do protocolo.
Condições de Armazenamento
Armazene todos os reagentes a 2-8°C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à data de validade
quando armazenados e manuseados conforme indicado. Após re-hidratado, o antigénio é estável durante 2
semanas a 2-8°C. Se for desejado, alíquotas de 100 μL de antigénio podem ser preparadas e armazenadas
a < -70oC. O antigénio armazenado nesta forma é estável durante pelo menos 1 ano.
Colheita de Amostras
Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros
conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação
microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de
soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas.
2
Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A2 da NCCLS recomenda as
seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura
ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8
horas, guarde a amostra a 2-8°C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da
amostra , congele a -20°C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas
após descongelação e antes do teste.
Procedimento
Material fornecido
8
2
1
1
placas de rastreio NOVA Gel "T"
0,4 ml de antigénio Sm/RNP, liofilizado
0,7 ml de controlo Sm
0,7 ml de controlo RNP
Material Necessário Não Fornecido
Micropipetas de 15-100 μL de volume
Pontas descartáveis para micropipetas
Solução salina 0,85%
Água destilada ou desionizada (preferencialmente estéril)
Fonte de luz ou caixa de visualização de gel
Método
Antes de começar
1.
Re-hidratar o Antigénio Sm/RNP
Abra cuidadosamente um frasco de antigénio e adicione 0,4 ml de água destilada ou desionizada
para o antigénio liofilizado. A água estéril destilada ou desionizada é recomendada para um
desempenho óptimo do produto. Deixe que o antigénio re-hidratado descanse durante 5 minutos,
depois agite para misturar completamente antes de usar.
2.
Encher a Placa de Gel
.
Prepare uma dupla diluição em série da amostra
do doente em 0,85% de salina. Carregue os
poços da placa de gel com antigénio
(aproximadamente
80μL),
com
controlo
(aproximadamente 80μL), e com diluições de
amostra do doente (aproximadamente 80μL)
conforme mostrado. As quantidades exactas de
enchimento não são críticas; no entanto, NÃO
ENCHA EXCESSIVAMENTE OS POÇOS. O
controlo pode ser enchido directamente a partir
dos frascos de pressão de plástico ou das
micropipetas. Se usar os frascos de pressão,
coloque uma ponta distribuidora no poço e aperte
suavemente até o nível de controlo se aproximar
do cimo do poço. Cubra a placa imediatamente
após encher.
3.
Incubação
Deixe que a(s) placa(s) coberta(s) faça(m) incubação à temperatura ambiente numa superfície
estável, plana durante 24 horas. Inspeccione a(s) placa(s) e anote quaisquer linhas de precipitação
que se formem entre a amostra do doente e o antigénio. Examine a relação desta linha com
qualquer linha de precipitação do controlo. Reinspeccione a(s) placa(s) novamente às 48 horas para
verificar a existência de quaisquer linhas desenvolvidas recentemente antes da interpretação final
dos resultados.
3
Controlo de Qualidade
Os Controlos Sm e RNP deverão ser corridos em todas as placas para assegurar que todos os reagentes e
procedimentos foram efectuados correctamente. Outros soros de controlo adequados adicionais podem ser
preparados aliquotando amostras de soro humano combinado e armazenando a < -70oC. De forma a que os
resultados do teste sejam considerados válidos, uma linha de precipitação deve estar visível entre os
Controlos Sm e RNP e os poços de antigénio de Sm/RNP.
Interpretação de Resultados
Para uma observação óptima das linhas de precipitação são recomendados os seguintes procedimentos:
1.
Remova a tampa da placa.
2.
Segure a placa numa posição que minimize o reflexo na superfície do gel.
3.
Ilumine a placa do gel lateralmente (i.e. paralela à superfície do gel). Nota: Certifique-se de que a
fonte de luz está protegida da vista directa.
4.
As linhas de precipitação vêem-se melhor quando existe contraste com um fundo escuro e vistas de
um ângulo.
5.
Um amplificador pode ajudar na observação de linhas ténues ou para distinguir a não identidade de
amostras.
Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se não se formarem linhas de precipitação
visíveis entre os poços do doente e o poço do antigénio após 48 horas.
Interpretação de Especificidade. Na dupla difusão, a especificidade é determinada anotando a relação das
linhas de precipitação da amostra com as linhas de controlo conhecidas. Podem ocorrer as seguintes
possibilidades com o teste NOVA GelTM Sm/RNP:
Fig. 1: Não Identidade
Fig. 2: Identidade Sm
A linha de precipitacção do doente 1 combina
ou apresenta identidade com a linha de
controlo Sm. Neste caso o doente tem autoanticorpos para Sm. O título da amostra é
equivalente ao recíproco da diluição mais
elevada que forma uma linha de precipitacção
com o antigénio. Neste caso pode dizer-se que
o doente tem um anticorpo para Sm e um título
de 8.
A linha de precipitacção do doente 1 atravessa
ou apresenta não identidade com ambos os
controlos Sm e RNP. Isto indica que o doente
reage com um antigénio ENA diferente do Sm
ou do RNP.
4
Fig. 3: Identidade RNP
Fig. 4: Identidade Sm e RNP
O doente tem duas linhas de precipitacção.
Uma das linhas apresenta identidade com o
Controlo Sm e a outra com o Controlo RNP.
Este doente tem auto-anticorpos tanto para Sm
como para RNP e um Sm título de 2 e um RNP
título de 4.
A linha de precipitacção do doente une ou
apresenta identidade com a linha de controlo
RNP. Neste caso pode dizer-se que o doente
tem um anticorpo para RNP e um título de 4.
Note o esporão com o controlo Sm. Isto é não
identidade para Sm. Apresenta uma identidade
parcial com a porção RNP do controlo Sm.
Limitações do Procedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Embora não seja provável com este teste devido à geometria única do poço, o prozoneamento é
uma possibilidade. O prozoneamento ocorre quando uma enorme quantidade de auto-anticorpos do
doente está presente em relação ao antigénio (excesso de anticorpo), fazendo com que a linha de
precipitação se forme na face do poço de antigénio. Nestes casos, são recomendados novos testes
de possíveis amostras positivas numa diluição de 1:2 ou de 1:4 em solução salina para impedir uma
interpretação falsa negativa do teste.
Se for usada água não estéril ou contaminada para re-hidratar o antigénio, o antigénio pode sofrer
degradação imediata ou progressiva. Neste caso pode resultar uma linha de precipitação muito leve
ou nenhuma linha.
O Controlo Sm não é monoespecífico e pode conter algum RNP. O Controlo Sm apresentará
identidade parcial com um doente RNP ou controlo RNP.
Pode ser possível observar um esporão que aponta na direcção do poço de controlo RNP com um
soro que mostra identidade com o controlo Sm. Isto pode indicar a presença de anticorpos RNP no
soro do doente anti-Sm.
Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros
testes serológicos.
As características de desempenho do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes das
do soro.
Valores Esperados
O teste de dupla difusão NOVA GelTM Sm/RNP foi usado para avaliar doentes com várias doenças do
tecido conjuntivo bem como 200 dadores aleatórios de sangue. Os resultados são os seguintes:
Grupo de Doente
SLE
Lúpus Induzido por Medicamento
Artrite Reumatóide
Escleroderma
Dermatomiosite
Síndroma de Sjogren
Normais
Número
105
24
40
24
14
14
200
Número Positivo Teste NOVA Gel™ ENA
Sm Positivo
RNP Positivo
15
20
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
0
0
5
Referências
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease
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