Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa Arruda

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
AMANDA LEITE GUIMARÃES
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO IN VITRO DE Spondias tuberosa
ARRUDA (ANACARDIACEAE)
PETROLINA
2015
AMANDA LEITE GUIMARÃES
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO IN VITRO DE Spondias tuberosa
ARRUDA (ANACARDIACEAE)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como
parte das exigências do Programa de
Pós-graduação em Recursos Naturais
do Semiárido, para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais.
Orientadora:
Prof.
Dra.
Cavalcante da Cruz Araújo
PETROLINA
2015
Edigênia
G963e
Guimarães, Amanda Leite
Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa
Arruda (Anacardiaceae) / Amanda Leite Guimarães—Petrolina,
2015.
XIX, 156 p.: 30 cm
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina,
Petrolina- PE, 2015.
Orientadora: Profa. Dra. Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo.
Ficha
1. Spondias tuberosa - Fitoquímica. 2. Atividade biológica in
vitro. 3. Anacardiaceae - Química vegetal. 4. Plantas medicinais. 5.
I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD: 581.634
catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da Univasf
Bibliotecário (a): Maria Betânia de Santana da Silva CRB4-1747.
“Acreditar sempre; desesperar jamais…quem acredita
em Deus não desanima nunca, nem se desespera porque
para Deus não há becos sem saída, não há problemas
sem solução”.
Cleto Coelho
“Tudo posso naquele que me fortalece’
Bíblia Sagrada
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido saúde, proteção e força para
chegar até aqui e por me mostrar os caminhos certos nas horas incertas.
Aos meus pais Domingos e Aparecida, pelo amor e carinho dedicado a nossa
família, por sempre acreditarem em mim, pelo exemplo de caráter e por me
ensinarem que mesmo em meio as dificuldades não devemos desanimar e nem tão
pouco perder a dignidade. Amo muito vocês.
Ao meu irmão, Danillo, por sempre acreditar no meu potencial e me incentivar
ir adiante e pelo seu jeito brincalhão de ser que por muitas vezes me distraiu nos
momentos de estudo com suas brincadeiras.
Aos meus avós Terezinha, Laurindo, Lídia pelas orações e o carinho imenso
e, em especial meu avô Joaquim (in memorian), agradeço por tudo que fez por mim
e pela minha família, por sempre incentivar nos estudos e por todos ensinamentos
dados que me fizeram ser a pessoa que sou hoje.
A todos meus tios e tias e, em especial titia Lourdes e tia Francinete por
sempre estarem presentes em todos os momentos de minha vida desde o meu
nascimento. E a todos os meus primos por todos os incentivos dados.
Ao meu namorado Murielton Allison, por estar sempre ao meu lado, além do
apoio e compreensão nas ocasiões em que me ausentei. Agradeço principalmente
por te me consolado nos momentos mais difíceis dessa caminhada. Obrigada por
tudo e saiba que você é o meu maior incentivador. Amo-te.
Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido pela
oportunidade de qualificação profissional;
À Profª. Dra. Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo, minha orientadora, pessoa
que aprendi a admirar cada vez mais. Agradeço pela orientação, apoio, dedicação,
transmissão de conhecimentos e amizade que contribuíram, e muito, para a minha
qualificação.
Ao Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, por ter me inserido no
mundo da pesquisa, e por sempre incentivar a qualificação profissional. Agradeço
também pela força dada na realização desse projeto, principalmente pelas análises
dos óleos fixos.
Ao Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), nas
pessoas de Alessandra Pacheco, Ana Paula de Oliveira, Grazielly Rocha e
v
Raimundo Oliveira Júnior, pela torcida e a ajuda em alguns experimentos deste
projeto.
À Profa. Débora Santos Carvalho dos Anjos do IF Sertão Pernambucano pela
inspiração e incentivos dados durante a graduação e, pela ajuda na realização do
experimento no infravermelho.
Aos professores do colegiado de Ciências Farmacêuticas da Univasf, em
especial, Arlan de Assis, Cleônia Roberta, Edilson Beserra, Gabriela Lemos e Xirley
Pereira, pelos incentivos dados e por compreender quando não foi possível dar o
suporte em algumas aulas práticas.
Aos meus colegas de profissão, os técnicos em química da Univasf, Ana
Paula de Oliveira e Cícero Corcino que me deram uma imensa ajuda para que eu
chegasse até o fim.
A Antônio Fernando e Clóvis pelo incentivo e a compreensão dos horários
que tive que me ausentar do trabalho para assistir às aulas do mestrado.
Aos funcionários terceirizados da UNIVASF Francisca, Maica, Maria
Margarida, Neide e Seu Fernandes pelas palavras de carinho e apoio.
Às minhas companheiras de turma: Ana Paula, Deize Raquel, Eriane Dantas,
Fernanda Granja, Georgia Sueley, Jackeline Ferreira, Kíscyla Oliveira, Naiane
Darklei, Paloma Clemetino, Sandra Kelle, pelas risadas, brincadeiras e o
companheirismo em sala de aula.
À Camila Araújo, Edja Elisa, Eliatania, Fernanda Ribeiro, Juliane, Suzana,
Larissa Macedo e Sarah por todas as palavras de estímulo que me deram.
Às minhas companheiras de laboratório Elizabeth, Geórgia e Inaiara nas
quais encontrei uma amizade sincera que irei levar comigo para sempre. Obrigada
pelos momentos de descontração que fizeram os últimos meses serem mais fáceis.
Ao Prof. Dr. Raimundo Braz Filho (UENF) pela obtenção e ajuda com alguns
espectros de RMN.
Ao Prof. Dr. Edilberto Rocha Silveira e suas alunas Karísia e Nayara pelos
espectros feitos no CENAUREMN/UFC.
À Profa. Larissa Rolim por toda atenção, ideias e pela imensa ajuda no
experimento realizado no HPLC.
Ao CNPq e à FACEPE pelo apoio financeiro para a realização da pesquisa.
Enfim, obrigada a todos que de certa forma contribuíram direta ou
indiretamente na realização deste trabalho.
vi
RESUMO
Este trabalho descreve os resultados obtidos do estudo fitoquímico e biológico
in vitro da espécie Spondias tuberosa Arruda, pertencente à família
Anacardiaceae. Esta espécie é nativa do semiárido brasileiro, ocorrendo desde
o Piauí até o norte de Minas Gerais, conhecida popularmente por umbuzeiro, é
comumente utilizada na medicina popular para o tratamento de algumas
patologias, entre estas diabetes, inflamações, cólicas uterinas, dores de
estômago como depurativo e para constipação. O material vegetal da espécie
foi coletado separadamente (cascas, folhas e talos) e após extração resultou nos
extratos hexânico bruto (St-Hex1) e etanólico bruto (St-EEB) de cada uma das
partes coletadas. Os extratos etanólicos foram particionados através de
cromatografia líquida a vácuo, obtendo-se as frações hexânica (St -Hex),
clorofórmica (St-CHCl3), acetato de etila (St-AcOEt) e metanólica (St-MeOH).
Realizou-se uma triagem fitoquímica com os extratos e frações, a qual revelou a
presença de flavonoides na maioria das amostras analisadas. Na análise dos
óleos fixos (cascas, folhas e talos) da espécie S. tuberosa foram identificados os
ésteres metílicos correspondentes aos seguintes ácidos graxos de cadeia longa:
palmítico, esteárico e triacontanoico. Durante a concentração do extrato
etanólico das folhas ocorreu a precipitação de um sólido amorfo de cor marrom
clara, que foi identificado como um derivado quinol denominado 2,4,6-trihidroxi4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ona. Durante a preparação da fração StMeOH das folhas, percebeu-se a formação de um precipitado de coloração
amarela, o mesmo foi purificado através de colunas cromatográficas, e
identificado como sendo o flavonoide denominado quercetina 3-O-α-Lraminopiranosil(1’’’→6’’)-β-glucopiranosídeo (Rutina). A fração St-AcOEt dos
talos também foi submetida a procedimentos cromatográficos que resultou na
identificação do Trans-p-cumarato de eicosanila. As estruturas das substâncias
isoladas foram determinadas através da análise dos espectros de RMN de 1H e
13C uni e bidimensionais e por comparação com dados da literatura. Na avaliação
da atividade antioxidante in vitro, St-AcOEt dos talos mostrou maior atividade
antioxidante no método do DPPH (CE50 4,38 ± 0,21) e a St-CHCl3 das folhas
apresentou melhor atividade no método de co-oxidação do β-caroteno (64,95%
± 15,29). Na determinação de fenóis totais, a fração que apresentou o maior teor
de fenóis foi a St-EtOH dos talos (459,20 ± 21,07 mg EqAG/g), enquanto que na
determinação de flavonoides totais, St-MeOH dos talos apresentou o maior teor
(129,00 ± 4,91 mgEqC/g). Na avaliação da atividade antibacteriana in vitro,
destacaram-se as amostras St-EtOH e a St-AcOEt das folhas contra a bactéria
Enterococcus faecalis. Desta forma, este estudo contribuiu para o conhecimento
quimiotaxonômico do gênero Spondias e da família Anacardiaceae.
Palavras-chave: Estudo fitoquímico e biológico in vitro. Anacardiaceae.
Spondias tuberosa.
vii
ABSTRACT
This work describes the results obtained from the phytochemical and biological
in vitro study of species Spondias tuberosa Arruda, belonging to the
Anacardiaceae family. This species is native to the Brazilian semiarid region,
occurring from Piauí to the north of Minas Gerais, known popularly as umbuzeiro
is commonly used in folk medicine for the treatment of some diseases, among
them diabetes, inflammation, uterine cramps, stomach pain and constipation as
cleanser. The plant material of the species was collected separately (barks,
leaves and stems) and obtained the hexane (St-Hex1) and ethanol (St-EEB)
extracts of each party collected. The ethanol extracts was partitioned by vacuum
liquid chromatography to give the fractions hexane (St-Hex), chloroform (StCHCl3), ethyl acetate (St-AcOEt) and methanol (St-MeOH). We performed a
phytochemical screening with all ethanol extracts and fractions, which showed
the presence of flavonoids in most samples. In the analysis of the fixed oils (barks,
leaves and stems) of the species S. tuberosa were identified methyl esters
corresponding the following long-chain fatty acids: palmitic, stearic and
triacontanoic. During the concentration of the ethanolic extract of the leaves
precipitated amorphous light brown solid which was identified as a quinoline
derivative named 2,4,6-trihydroxy-4-(hydroxymethyl)cyclohexa-2,5-dien-1-one.
During the preparation of St-MeOH fraction of the leaves, saw the formation of a
yellow color precipitate, it was purified by chromatography columns, and
identified as the flavonoid called quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1’’’→ 6’’) β-glucopyranoside (Rutin). St-AcOEt of the stems was submitted to
chromatographic procedures and isolated a substance which was identified as
Eicosanyl-trans-p-coumarate. The structures were determinate from the analysis
of NMR spectra (1H, 13C, 1D, 2D) and compared with literature data. In the
evaluation of the antioxidant activity in vitro St-AcOEt stems showed the highest
antioxidant potency method of DPPH (IC50 4.38 ± 0.21) and St-CHCl3 of the
leaves on co-oxidation of β-carotene method (64.95% ± 15.29). In the
determination of total phenols, the fraction that had the highest content of phenols
was the St-EtOH the stems (459.20 ± 21.07 mg EqAG/g), while in the
determination of total flavonoids, St-MeOH the stems showed the highest content
(129.00 ± 4.91 mgEqC/g). In evaluation the antibacterial activity in vitro, stood out
the St-EtOH and the St-AcOEt of the leaves against the bacterium Enterococcus
faecalis. Thus, this study contributes to the knowledge chemotaxonomic of the
genus Spondias and Anacardiaceae family.
Keywords: Phytochemical and biological studies in vitro. Anacardiaceae.
Spondias tuberosa.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema dos principais fatores que podem influenciar o acúmulo
de metabólitos secundários nas plantas........................................................... 22
Figura 2 - Spondias tuberosa Arruda.............................................................. 24
Figura 3 – Árvore do umbuzeiro na época de estiagem (A); umbuzeiro após
as primeiras chuvas (B); inflorescência (C) e fruto (D)....................................... 44
Figura 4 – Interconversão entre quinonas e os fenóis por oxirredução........... 46
Figura 5 – Estrutura química dos principais ácidos hidroxibenzoicos............... 47
Figura 6 – Estrutura química dos principais ácidos hidroxicinâmicos............... 47
Figura 7 – Esquema adaptado de SIMÕES e colaboradores (2010) da
biossíntese dos fenilpropanoides.....................................................................
48
Figura 8 – Esquema simplificado da origem biossintética dos flavonoides
adaptado de SIMÕES e colaboradores (2010)................................................. 49
Figura 9 – Núcleo fundamental dos flavonoides e sua numeração................... 50
Figura 10 – Esquema simplificado da formação da rutina a partir da
quercetina adaptado de PEDRIALI (2005)........................................................ 53
Figura 11 - Esquema da hidrólise da rutina a quercetina-3-glicose e, em
seguida a quercetina........................................................................................
55
Figura 12 – Esquema simplificado de um cromatógrafo CLAE (VILA, 2006).... 56
Figura 13 – Foto da exsicata de Spondias tuberosa de número 18319..........
64
Figura 14 – Cromatograma de íons totais do óleo fixo das cascas de
Spondias tuberosa............................................................................................ 84
Figura 15 – Cromatograma de íons totais do óleo fixo das folhas de Spondias
tuberosa............................................................................................................ 85
Figura 16 – Cromatograma de íons totais do óleo fixo dos talos de Spondias
tuberosa............................................................................................................ 85
Figura 17 – Estrutura química do 3-n-pentadecilfenol...................................... 87
Figura 18 – Reação de descarboxilação do ácido anacárdico.......................... 88
Figura 19 – Estrutura proposta para St-01........................................................ 90
Figura 20 – Espectro de RMN de 13C/DEPT Q de St-01 (DMSO, 125 MHz)...... 91
Figura 21 – Espectro de RMN de 1H de St-01 (DMSO, 500 MHz)..................... 91
ix
Figura 22 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 2,0-5,2 de St-01 (DMSO,
500 Hz).............................................................................................................
92
Figura 23 – Espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01 (DMSO, 500
MHz).................................................................................................................
92
Figura 24 – Expansão do espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01
(DMSO, 500 MHz)............................................................................................. 93
Figura 25 – Espectro de correlação 1H x
13C-
HSQC de St-01 (DMSO, 500
MHz, 125 MHz)................................................................................................. 93
13C-
HMBC de St-01 (DMSO, 500
MHz, 125 MHz)................................................................................................. 94
Figura 27 – Derivados do quinol isolados da espécie Ajuga parviflora.............. 95
Figura 28 – Gráfico com os picos de absorção da substância St-02 na região
do ultravioleta.................................................................................................... 97
Figura 29 – (A) Espectro na região do infravermelho (IV) de St-02 em
pastilha de KBr; (B) e (C) Expansões do espectro do IV...................................
97
Figura 30 – Estrutura química de St-02............................................................ 99
Figura 31 – Espectro de RMN de 1H de St-02 (MeOD, 300 MHz)..................... 101
Figura 32 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 4,5-7,8 de St-02 (MeOD,
300 MHz)..........................................................................................................
101
Figura 33 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 3,2-3,9 de St-02 (MeOD,
300 MHz)..........................................................................................................
102
Figura 34 – Espectro de RMN de 13C de St-02 (MeOD, 75 MHz)...................... 102
Figura 35 – Espectro de RMN DEPT 135 de St-02 (MeOD, 75 MHz).............
103
Figura 36 – Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-02 (MeOD, 300
MHz).................................................................................................................
103
Figura 37 – Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02 (MeOD, 300
MHz e 75 MHz.................................................................................................. 104
Figura 38 – Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02
(MeOD, 300 MHz e 75 MHz)...........................................................................
Figura 39 –. Espectro de correlação 1H x
13C-
104
HMBC de St-02 (MeOD, 300
MHz e 75 MHz)................................................................................................. 105
Figura 40 – Expansão do espectro de correlação 1H x
13C-
HMBC de St-02
(MeOD, 75 MHz e 50 MHz................................................................................. 105
Figura 41 – Espectro de massas de St-02........................................................ 108
x
Figura 42 – Estrutura proposta para a substância St-03................................... 109
Figura 43 – Espectro de RMN de 1H de St-03 (CDCl3, 500 MHz)..................... 111
Figura 44 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 6,1-7,5 de St-03 (CDCl3,
500 MHz)..........................................................................................................
111
Figura 45– Expansão do espectro de RMN de 1H δ 1,9-4,3 de St-03 (CDCl3,
500 MHz)..........................................................................................................
112
Figura 46 – Expansão do espectro de RMN de 1H δ 0,65-1,85 de St-03
(CDCl3, 500 MHz)............................................................................................. 112
Figura 47 – Espectro de RMN de 13C de St-03 (CDCl3, 125 MHz)..................... 113
Figura 48 – Expansão do espectro de RMN de
13C
δ 110-180 de St-03
(CDCl3, 125 MHz)............................................................................................. 113
Figura 49 – Espectro RMN de DEPT Q de St-03 (CDCl3, 125 MHz).................. 114
Figura 50 – Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-03 (CDCl3, 500
MHz).................................................................................................................
13C-
114
HSQC de St-03 (MeOD, 500
MHz e 125 MHz)............................................................................................... 115
Figura 52 – Expansão do espectro de correlação 1H x
13C
- HSQC de St-03
(MeOD, 500 MHz e 125 MHz)........................................................................... 115
13C
- HMBC de St-03 (CDCl3, 500
MHz e 125 MHz)............................................................................................... 116
Figura 54 – Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-03
(MeOD, 500 MHz e 125 MHz)........................................................................... 116
Figura 55 – Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-03
(MeOD, 500 MHz e 125 MHz)........................................................................... 117
Figura 56 – Reação do ácido gálico com molibdênio presente no regente
Folin-Ciocalteau................................................................................................ 120
Figura 57 – Complexo Flavonoide-Al3+............................................................. 121
Figura 58 – DPPH na forma radicalar (I) e na forma reduzida (II)...................... 123
Figura 59 – Relação estrutura-atividade de flavonol e flavona.......................... 125
Figura 60 – Estrutura do β-caroteno (I) e do ácido linoleico (II)......................... 126
Figura 61 – Espectro de UV com as bandas absorção da rutina obtido por
CLAE-DAD.......................................................................................................
131
Figura 62 – Cromatogramas dos extratos etanólicos das cascas, folhas e
talos e do padrão rutina..................................................................................... 131
xi
Figura 63 – Curva de calibração da rutina........................................................ 132
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Exemplos de flavonoides encontrados em diversas espécies da
família Anacardiaceae......................................................................................
29
Tabela 2 - Exemplos de atividades biológicas testadas com extratos e/ou
fases de algumas espécies do gênero Spondias............................................... 37
Tabela 3 - Exemplos de alguns metabólitos secundários encontrados no
gênero Spondias............................................................................................... 41
Tabela 4 - Exemplos de substâncias antioxidantes naturais e sintéticas
(Adaptada de ALVES e colaboradores, 2010)................................................... 59
Tabela 5 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais metabólitos secundários da espécie Spondias tuberosa (WAGNER;
BLADT, 1996)...................................................................................................
68
Tabela 6 - Fracionamento cromatográfico da fração metanólica das folhas...... 73
Tabela 7- Fracionamento cromatográfico da fração acetato de etila dos
talos..................................................................................................................
74
Tabela 8 - Gradientes de eluição utilizado na análise por CLAE....................... 80
Tabela 9 - Identificação das principais classes de constituintes do extrato
etanólico, extrato hexânico e as fases (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e StMeOH) das cascas...........................................................................................
82
etanólico, extrato hexânico e as fases (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e StMeOH) das folhas............................................................................................. 83
etanólico, extrato hexânico e as fases (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e StMeOH) dos talos............................................................................................... 83
Tabela 12 - Composição química dos óleos fixos das cascas (OFC), folhas
(OFF) e talos (OFT) de Spondias tuberosa......................................................
Tabela 13 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e
13C
(125 MHz) referentes à
substância St-01...............................................................................................
Tabela 14 - Dados de RMN de 1H (400 MHz) e
86
13C
94
(100 MHz) em CDCl3
referentes ao composto 2 (AKBAR; NAWAZ; MALIK, 2001)............................. 95
xiii
Tabela 15 - Comparação dos dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz)
referentes à substância St-02 com dados da literatura...................................... 106
Tabela 16 - Comparação dos dados de RMN de 1H (500 MHz) e
13C
(125
MHz) referentes à substância St-03 com dados da literatura............................ 118
Tabela 17 - Determinação de fenóis totais e flavonoides totais do extrato
etanólico (St-EtOH), hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, StAcOEt e St-MeOH) das cascas, folhas e talos................................................... 122
Tabela 18 - Atividade antioxidante in vitro do extrato etanólico (St-EtOH),
hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e St-MeOH)
das cascas, folha, talos e padrões (ácido ascórbico, BHA e BHT)..................... 127
Tabela 19 - Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH das
cascas de Spondias tuberosa e do padrão Gentamicina................................... 129
Tabela 20 - Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt, St-MeOH e St02 das folhas de Spondias tuberosa. ................................................................ 129
Tabela 21 - Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH dos
talos de Spondias tuberosa .............................................................................. 130
Tabela 22 - Quantidades de rutina em µg/mL encontradas nos extratos
etanólicos das cascas, folhas e talos................................................................. 132
xiv
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Exemplo de algumas subclasses de flavonoides........................... 51
xv
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das cascas
de Spondias tuberosa....................................................................................... 66
Fluxograma 2 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das folhas
de Spondias tuberosa....................................................................................... 66
Fluxograma 3 - Obtenção e fracionamento do extrato etanólico dos talos de
Spondias tuberosa.......................................................................................
67
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
CC: Cromatografia em Coluna
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
CCDA: Cromatografia em Camada Delgada Analítica
CG-EM: Cromatografia Gasosa acoplada à espectrometria de massas
COSY: Correlation Spectroscopy
d: dupleto
dd: duplo dupleto
δ: Deslocamento químico
DEPT Q: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Including the
Detection of Quaternary Nuclei
DEPT 135: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer, pulse with φ3
has flip angle of 135o
HMBC: Correlação heteronuclear de múltiplas ligações (multiple bond
correlation)
HSQC: Correlação heteronuclear quântica simples (heteronuclear single
quantum correlation)
Hz: Hertz
IV: Infravermelho
J: constante de acoplamento
KBr: Brometo de potássio
m: multipleto
mg EqAG/g: miligrama de equivalentes de ácido gálico por grama de amostra
mg EqC/g: miligrama de equivalentes de catequina por grama de amostra
NCCLS: National Commitee of Clinical Laboratory Standards
xvii
NEU: Solução metanólica a 1 % de difenilborinato de amino-2-etila
Rf: Retenction factor (Fator de retenção)
RMN de 1H: Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN de 13C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono Treze
s: simpleto
St-AcOEt: Fração acetato de etila
St-CHCl3: Fração clorofórmica
St-EtOH: Extrato etanólico
St-Hex1: Extrato hexânico
St-Hex: Fração hexânica
St-MeOH: Fração metanólica
St-01: Substância 1
t: tripleto
UFLC: Cromatografia Líquida Ultra Rápida
UV: Ultravioleta
OBS.: abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho que não constam nesta
relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas
universalmente.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................
20
2. OBJETIVOS....................................................................................................
25
2.1. Objetivo geral................................................................................................ 26
2.2. Objetivos específicos.................................................................................... 26
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA......................................................................
27
3.1. Considerações sobre a família Anacardiaceae............................................. 28
3.2. Considerações sobre o gênero Spondias....................................................
36
3.3. Considerações sobre a espécie Spondias tuberosa...................................
43
3.4. Considerações gerais sobre quinonas........................................................
46
3.5. Considerações gerais sobre os ácidos fenólicos.........................................
46
3.6. Considerações gerais sobre os flavonoides................................................
49
3.7. Considerações sobre a rutina e quercetina...............................................
53
3.8. Considerações sobre cromatografia líquida de alta eficiência com detector
de UV com arranjo de diodos (CLAE-DAD).......................................................... 55
3.9. Considerações sobre as atividades antioxidante e antibacteriana............
57
4. PARTE EXPERIMENTAL..............................................................................
63
4.1. Coleta do material botânico.........................................................................
64
4.2. Processamento do material vegetal............................................................
65
4.3. Triagem fitoquímica preliminar dos extratos e frações................................
67
4.4. Extração dos óleos fixos..............................................................................
69
4.5. Métodos de análise......................................................................................
70
4.5.1. Métodos cromatográficos........................................................................
70
4.5.2. Métodos espectrofotométricos.................................................................
70
4.5.3. Métodos espectrométricos........................................................................
71
4.5.4. Ponto de fusão..........................................................................................
72
4.5.5. Análise dos óleos fixos.............................................................................
72
4.5.6. Análise por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa
(CLAE-FR)........................................................................................................... 73
4.6. Isolamento e purificação das substâncias...................................................
73
4.7. Determinação do teor de fenóis totais.........................................................
75
4.8. Determinação do teor de flavonoides totais................................................
75
4.9. Avaliação da atividade antioxidante – sequestro do radical livre DPPH (2,2difenil-1- picrilhidrazil) e a co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido
linoleico................................................................................................................ 76
4.10. Avaliação da atividade antibacteriana........................................................
78
4.11. Quantificação por CLAE-FR do flavonoide quercetina 3-O-α-Lramnopiranosil(1’’’→6’’)-β-glucopiranosídeo (rutina) na espécie Spondias
tuberosa............................................................................................................... 79
4.12. Análise estatística....................................................................................... 80
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................
81
5.1. Perfil fitoquímico preliminar dos extratos e frações...................................... 82
5.2. Composição dos óleos fixos.........................................................................
84
5.3. Caracterização estrutural das substâncias St-01, St-02 e St-03.................. 89
5.4. Determinação de fenóis totais, flavonoides totais........................................
120
5.5. Atividade antioxidante – sequestro do radical DPPH (2,2-difenil-1picrilhidrazil) e a co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico.................
123
5.6. Atividade antibacteriana...............................................................................
128
5.7.
Quantificação
por
CLAE-FR
do
flavonoide
quercetina
3-O-α-L-
ramnopiranosil(1’’’→6’’)-β-glucopiranosídeo (Rutina) na espécie Spondias
tuberosa............................................................................................................... 130
6. CONCLUSÕES...............................................................................................
133
REFERÊNCIAS................................................................................................... 136
APÊNDICES........................................................................................................ 153
1. INTRODUÇÃO
Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae)
1. INTRODUÇÃO
Desde épocas remotas, as sociedades humanas acumulam informações e
experiência sobre o ambiente que as cercam, para com ele interagir e prover suas
necessidades de sobrevivência (RANGEL; BRAGANÇA, 2009). Ao longo do
processo evolutivo, o homem foi aprendendo a selecionar plantas para a sua
alimentação e para o alívio de seus males e doenças. O resultado desse processo é
que muitos povos passaram a dominar o conhecimento do uso de plantas e ervas
medicinais (FERREIRA; PINTO, 2010).
No Brasil, a história da utilização de plantas no tratamento de doenças
apresenta influências da cultura africana, indígena e europeia. A contribuição dos
escravos africanos com a tradição do uso de plantas medicinais em nosso país se
deu por meio das plantas que trouxeram consigo, que eram utilizadas em rituais
religiosos e também por suas propriedades farmacológicas, empiricamente
descobertas (TOMAZZONI et al., 2006).
Muitas destas propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela
população, as quais são confirmadas em sua maioria nos estudos farmacológicos,
comprovando assim a importância da pesquisa etnofarmacológica. Tais propriedades
propiciaram o desenvolvimento de vários medicamentos, entre eles está a procaína,
cloroquina ou ainda fármacos como vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) e o
taxol (Taxol®), os quais podem ser obtidos por síntese a partir de molécula protótipo
ou através de isolamento, algumas vezes, biomonitorado (MACIEL et al., 2002;
HOSTETTMANN et al., 2003). A maioria dos princípios ativos de importância
farmacológica encontrada nos extratos vegetais, de modo geral, é oriunda de uma
variedade de metabólitos secundários (FERREIRA; PINTO, 2010).
Os metabólitos secundários têm sido sumariamente definidos como
compostos pouco abundantes, com uma frequência inferior a 1% do carbono total,
ou pelo fato de sua estocagem ocorrer em órgãos ou células específicos
(FUMAGALI et al., 2008). A produção dos metabólitos secundários é de fundamental
importância para a adaptação das plantas aos seus ambientes; essas moléculas
contribuem para que as mesmas possam ter uma boa interação com os diferentes
ecossistemas (FUMAGALI et al., 2008). Os metabólitos secundários despertam
interesse não só pelas atividades biológicas (ex: antioxidante, antibióticos,
antifúngicos e antivirais) produzidas pelas plantas em resposta aos estímulos do
21
meio ambiente mas pela imensa atividade farmacológica desses compostos (ALVES,
2001). A síntese destas substâncias pelas plantas consiste em um processo de
várias etapas influenciadas por diferentes variáveis. Os metabólitos secundários
representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante,
portanto, fatores bióticos e abióticos podem interferir com a qualidade e a
quantidade de produtos secundários resultantes do metabolismo de uma planta em
determinado momento (Figura 1, p.22) (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Figura 1. Esquema dos principais fatores que podem influenciar o acúmulo de
metabólitos secundários nas plantas (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Os produtos naturais são responsáveis direta ou indiretamente por cerca de
40% de todos os fármacos disponíveis na terapêutica atual e, se for considerado
aqueles usados como antibióticos e antitumorais, esta porcentagem chega a
aproximadamente 70% (CAVALCANTE et al., 2013).
Apesar de todos os dados apresentados acima é importante ressaltar que a
quantidade de plantas existentes no planeta, reconhecidas sob o ponto de vista
científico, situa-se entre 250 a 550 mil espécies, sendo que somente 5% têm sido
22
estudadas fitoquimicamente e uma porcentagem menor avaliada sob os aspectos
biológicos. No Brasil, até 2009, apenas 8% das espécies nativas e menos de 2% das
espécies
exóticas,
foram
estudadas
em
busca
de
moléculas
bioativas
(CAVALCANTE et al., 2013).
O Brasil é o país com maior potencial para pesquisa com espécies vegetais,
pois detém a maior e mais rica biodiversidade do planeta, distribuída em seis biomas
distintos (NOLDIN; ISAIAS; FILHO, 2006). Estimativas da Convenção da Diversidade
Biológica (CDB) mostra que o Brasil hospeda entre 15 e 20% de toda a
biodiversidade mundial, sendo considerado o maior do planeta em número de
espécies endêmicas (BARREIRO; BOLZANI, 2009).
Dentre os biomas brasileiros está o bioma Caatinga, que ocupa uma área de
cerca de 844.453 quilômetros quadrados, o equivalente a 11% do território nacional
e que engloba os estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Pernambuco,
Paraíba, Rio Grande do Norte, Piauí, Sergipe e o norte de Minas Gerais (BRASIL,
2014). A Caatinga é também caracterizada por um sistema de chuvas extremamente
irregular de ano para ano, o que resulta em secas severas periódicas (LEAL et al.,
2005). Apesar de ser a única grande região natural brasileira cujos limites estão
inteiramente restritos ao território nacional, pouca atenção tem sido dada à
conservação da variada e marcante paisagem da Caatinga, e a contribuição da sua
biota à biodiversidade extremamente alta do Brasil tem sido subestimada (SILVA et
al., 2004).
Entre as inúmeras espécies vegetais do bioma Caatinga, encontra-se a
espécie Spondias tuberosa Arruda (Anacardiaceae) (Figura 2, p.24), conhecida
popularmente como umbuzeiro, imbuzeiro ou ambuzeiro, entre outros. É nativa do
semiárido brasileiro, e uma das espécies de grande importância socioeconômica
dentro de Anacardiaceae Lindl, pois além de fornecer frutos saborosos e nutritivos,
xilopódios ricos em água (NASCIMENTO-SILVA; CHINALIA; PAIVA, 2008),
representa uma importante fonte de renda através do extrativismo (ARAÚJO; NETO,
2002).
23
Figura 2. Spondias tuberosa Arruda. Foto: Amanda Leite Guimarães
Levando-se em consideração a influência de fatores externos, como índice
pluviométrico, altitude, entre outros, sob o metabolismo das plantas, acredita-se que
a região do semiárido seja uma área que influencie na produção de variados tipos de
metabólitos secundários com importantes atividades biológicas, como por exemplo
antioxidante e antibacteriana (GOBO-NETO & LOPES, 2007). Diante disto, este
trabalho descreve o estudo fitoquímico com a determinação estrutural de metabólitos
secundários isolados e a avaliação das atividades antioxidante e antibacteriana in
vitro da espécie Spondias tuberosa, contribuindo assim para o conhecimento
quimiotaxonômico e farmacológico da espécie, pois a partir do levantamento
bibliográfico foram encontrados poucos relatos sobre a composição química e
atividade farmacológica desta espécie.
24
2. OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
 Contribuir para o estudo fitoquímico do gênero Spondias bem como da família
Anacardiaceae.
2.2. Específicos

Coletar e identificar taxonomicamente a espécie S. tuberosa;

Preparar extratos hexânicos e etanólicos com as partes aéreas (folhas e
talos) e da casca do tronco da espécie;

Particionar o extrato etanólico das partes da planta estudadas;

Extrair os constituintes presentes no óleo fixo e identificá-los através da
técnica hifenada CG-EM;

Isolar os constituintes químicos através de métodos cromatográficos
usuais;

Identificar a estrutura química dos constituintes isolados através de
técnicas espectrométricas adequadas;

Determinar o teor de fenóis e flavonoides totais nos extratos e frações
obtidos;

Realizar ensaios de atividade antioxidante e antibacteriana in vitro dos
extratos, frações e das substâncias isoladas;
26
3. FUNDAMENTAÇÃO
TÉORICA
28
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Considerações sobre a família Anacardiaceae
A família Anacardiaceae pertence à ordem Sapindales, que compreende
aproximadamente 81 gêneros e 800 espécies, presentes em ambientes secos a
úmidos, principalmente em terras baixas nas regiões tropicais e subtropicais em todo
o mundo, estendendo-se até regiões temperadas (LUZ, 2011). Os gêneros desta
família são subdivididos em cinco tribos (Anacardieae, Dobineae, Rhoeae,
Semecarpeae e Spondiadeae) (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006). No continente
americano existem aproximadamente 32 gêneros nativos, sendo que 77% das
espécies são endêmicas do continente americano e apenas os gêneros Antrocaryon,
Campnosperma, Cotinus, Pistacia, Rhus, Spondias e Toxicodendron possuem
representantes também em outros continentes (LUZ, 2011). No Brasil estão
catalogados 14 gêneros com 57 espécies de Anacardiaceae, sendo que 14 delas
são restritas ao país (SILVA-LUZ; PIRANI, 2010).
As espécies desta família são arbustos ou árvores, raramente lianas ou ervas
aromáticas. Diversas delas apresentam frutos ou pseudofrutos comestíveis,
podendo também ser utilizadas na ornamentação de ruas e praças (SANTOS, 2010).
Do fruto do cajueiro (Anacardium occidentale L.) obtém-se a castanha de caju,
enquanto
o
pedicelo
floral
espessado
(hipocarpo
ou
fruto
acessório)
é
comercializado in natura. Outros frutos de importância comercial ou regional incluem
a manga (Mangifera indica L.), os cajás (Spondias spp.), o umbu (Spondias tuberosa
Arruda) e a seriguela (Spondias purpurea L.). Schinus terebinthifolius Raddi, Schinus
molle L. e Rhus succedanea L. são exemplos de plantas utilizadas na ornamentação
de ruas e praças (LUZ, 2011).
Aproximadamente 25% dos gêneros dessa família são conhecidos como
tóxicos e causadores de dermatite de contato severa. De modo geral, as espécies
venenosas desta família estão restritas às tribos Anacardieae, Rhoeae e
Semecarpeae. A dermatite de contato provocada por essas plantas é atribuída
principalmente a compostos fenólicos e catecólicos ou à mistura destas substâncias,
denominados lipídios fenólicos. Estas substâncias podem estar presentes em
diferentes partes do material vegetal, ocorrendo principalmente em espécies do
gênero Rhus. Nos últimos anos, a origem dos lipídios fenólicos e derivados também
foi objeto de investigação; além disso, espécies da família Anacardiaceae têm se
mostrado bastante promissoras na busca de substâncias bioativas. Do ponto de
vista químico, os gêneros mais estudados nesta família são Mangifera, Rhus
(Toxicodendron), Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia,
Lithraea, Tapirira e Melanorrhoea. Mangifera, Rhus e Anacardium, as quais
destacam-se pelo número de investigações relativas à composição química de suas
espécies e atividades biológicas de seus extratos e metabólitos. Os estudos destas
espécies possibilitaram verificar a ocorrência de flavonoides, terpenos, esteroides,
xantonas e, principalmente, dos lipídios fenólicos e derivados. Destaca-se que entre
os flavonoides, os biflavonoides são os mais frequentes (CORREIA; DAVID; DAVID,
2006), alguns exemplos de flavonoides encontrados em espécies da família
Anacardiaceae estão listados na tabela 1, p.29-35.
Tabela 1 - Exemplos de flavonoides encontrados em diversas espécies da família
Anacardiaceae
Espécie
Referência
Estrutura química
bibliográfica
OR1
OH
HO
O
OH
Buchanania
lazan
OR
OH
ARYA et al, 1992
O
R = β-D-galactosil
R1 = α -L-ramnosil
Miricetina 3-O-α-ramnosil-3’-β-galactosil
Continua
29
Tabela 1 (Continuação)
OH
Campnosperma
WENIGER et al.,
O
O
panamense
OH
HO
2004
O
HO
OH
OH
O
Lanaroflavona
OH
Cotinus
HO
WESTENBURG
O
OH
coggygria
et al., 2000
Sulferitina
OH
OCH 3
O
O
OH
OH
OH
Lannea alata
O
OKOTH;
Lanneaflavonol
CHENIA;
(Engl.) Engl.
KOORBANALLY,
OH
2013
OCH 3
O
O
OH
OH
OH
O
Dihidrolanneaflavonol
Continua
30
OH
OH
HO
Lannea
O
SUBRAMANIAN;
coromandelica
NAIR, 1971
OR
OH
O
R = arabinosil
Quercetin-3-O-arabinosil
OH
HO
O
PARVEEN;
O
Rhus alata
HO
O
OH
OH
KHAN, 1987
O
O
Hinokiflavona
OH
OH
HO
O
O
VAN LOO; DE
O
OH
O
OH
HO
BRUYN;
Agathisflavona
Rhus corlaria
VERZELE, 1988
OH
OH
O
HO
O
HO
OH
O
OH
O
Amentoflavona
Continua
31
OH
HO
O
O
O
HO
OH
O
O
OH
Hinokiflavona
VAN LOO; DE
BRUYN;
Rhus corlaria
VERZELE, 1988
OH
HO
O
OH
HO
O
O
HO
HO
OH
O
Sumaflavona
OH
OCH3
H3CO
NAIR; KOTIYAL;
O
Rhus lancea
OH
OH
OH
BHARDWAJ,
1983
O
7,4’ – di-O-metilmiricetina
Continua
32
O
HO
OH
OH
O
Rhus
succedanea
LIN et al., 1997
O
HO
OH
OH
O
Rhusflavanona
OCH3
OH
Rhus
AHAMED et al.,
O
H3CO
retinorrhoea
2001
OH
OH
O
Rhamnazina
OH
OH
HO
O
Schinus
OR
lentiscifolius
OH
GEHRKE et al.,
2013
O
R
Quercetina
H
Quercetrina
ramnosil
Continua
33
R'
OH
O
HO
OH
OR
OH
Schinus
O
CERUKS et al.,
terebinthifolius
2007
R
R’
Miricetrina
Ramnose
OH
Quercitrina
Ramnose
H
H
OH
Miricetina
OH
O
HO
Sclerocarya
BRACA et al.,
OR
birrea
OH
2003
O
R = ramnosil
Kaempferol 3-O-α-L- ramnosil
Continua
34
R2
OH
O
HO
OH
R3
OR1
MADIKIZELA;
O
Searsia
ADEROGBA;
chirindensis L.
R1
R2 R3
Miricetina-3-O-arabinopiranosídeo arabinopiranosil OH OH
Miricetrina-3-O-ramnosídeo
ramnosil
OH H
Kaempferol-3-O-ramnosideo
ramnosil
OH OH
Quercetin-3-O-arabinofuranosídeo arabinofuranosil OH
VAN STADEN,
2013
H
OH
HO
O
OH
Semecarpus
OH
O
HO
O
prainii
AHAMAD et
al.,1981
OH
O
I3’, II8- Binaringenina
Além dos flavonoides foram encontradas também outras classes de
metabólitos secundários nas espécies da família, dentre elas estão os terpenoides,
esteroides, lipídios fenólicos e os benzenoides. Muitos destes metabólitos são
responsáveis por diversas atividades biológicas apresentadas pelos extratos de
espécies da família Anacardiaceae, entre as atividades testadas com as espécies da
família destacam-se os testes realizados com o extrato aquoso das cascas de uma
variedade de M. indica (manga) que resultou em uma formulação farmacêutica com
nome fantasia de Vimang®. Este extrato apresenta atividades imunoestimulante
35
(MAKARE; BODHANKAR; RANGARI, 2001), anti-inflamatória (GARRIDO et al.,
2004), antioxidante (SANCHEZ et al., 2000; SELLES et al., 2002), citotóxica e
antineoplásica (BELTRÁN et al., 2004). Destaca-se também os biflavonoides
hinokiflavona,
agathisflavona
e
robustaflavona,
isolados
da
espécie
Rhus
succedanea. Eles apresentaram a propriedade de inibir a replicação do vírus HIV
pela inibição da enzima transcriptase reversa HIV-1-RT (LIN et al., 1997); e ainda
quando comparada com outros 65 flavonoides, a hinokiflavona mostrou-se mais
ativa na inibição da atividade pró-coagulante de monócitos humanos aderentes,
estimulada por endotoxina e interleucina-1β (MESESANE et al., 2000). Outros
biflavonoides do gênero Rhus apresentaram atividades biológicas importantes, como
antimalárica (AHAMED et al., 2001), antiviral (ZEMBOWER et al., 1998) e citotóxica
(LIN, 1989). Os poucos exemplos de atividades biológicas dos extratos de espécies
da família Anacardiaceae citadas acima demonstram o quanto estas espécies são
promissoras na busca de novos medicamentos.
3.2 Considerações sobre o gênero Spondias
Spondias é um gênero tropical da família Anacardiaceae que abrange de 14 a
20 espécies que são distribuídas mundialmente, e dentre estas, 4 a 7 espécies são
encontradas nas Américas. Na Ásia ocorrem cultivos comerciais de S. mombin e S.
purpurea, dentre outras 10 espécies nativas (SILVA et al., 2014).
Dentro deste gênero destacam-se as espécies Spondias mombin L. (Cajá),
conhecida em certas regiões brasileiras como cajá, cajá-mirim ou taperebá; S.
purpurea L. (Siriguela), S. tuberosa Arr. Câmara (Umbu ou imbu); S. dulcis ou S.
cytherea Parkinson (Cajarana ou cajá-manga) e duas espécies taxonomicamente
indefinidas, mas consideradas híbridos naturais, cajá-umbu ou umbu-cajá (S.
mombin × S. tuberosa) e umbuguela (S. tuberosa × S. purpurea) (SILVA, 2009).
No Brasil, dentre as espécies do gênero Spondias, podemos destacar a
importância comercial do cajá (S. mombin), umbu (S. tuberosa) e cajá-umbu (S.
mombin x S. tuberosa). Seus frutos são comercializados in natura ou processados
na forma de polpas, sucos e outros produtos alimentícios. Devido à utilização
comercial destes frutos, estudos vêm abordando as suas características de cultivo,
assim como as características físico-químicas, maturação e estabilidade, e os
36
constituintes químicos. Além do uso comercial, está descrito na literatura também a
utilização de espécies deste gênero na medicina tradicional em diversas regiões do
mundo. Espécies deste gênero são utilizadas para o tratamento de desordens
infecciosas, e como abortivo ou tônico (SILVA et al., 2014).
A tabela 2, p.37-39 mostra exemplos de atividades biológicas testadas com
extratos de algumas espécies do gênero.
Tabela 2. Exemplos de atividades biológicas testadas com extratos e/ou fases de
algumas espécies do gênero Spondias.
Espécie
Spondias
dulcis
Spondias
mangifera
Atividade
biológica
Antimicrobiana
Antioxidante
Citotóxica
Parte do
Solvente
vegetal
utilizado na
utilizada
extração
Folhas e
frutos
Referência
Metanol
ISLAM et al., 2014
Metanol
ARIF et al., 2008
Etanol: Água
CHUKWUKA; ISEK,
(7:3)
2008
Antibacteriana
Antidiarreica
Cascas
Antiulcerogência
Abortiva
e
Folhas
Anticoncepcional
Folhas
Antibacteriana
Água e
Etanol
Acetona,
S. mombin
Antibacteriana
Antibacteriana e
Antifúngica
Antibacteriana in
vivo
Folhas
água, etanol
e metanol
Folhas e
cascas do
Metanol
caule
Folhas
Metanol
AJAO; SHONUKAN;
FEMI-ONADEKO,
1985
AROMOLARAN;
BADEJO, 2014
ABO; OGUNLEYE;
ASHIDI, 1999
OLADUNMOYE,
2007
Continua
37
Antiviral
Anti-helmíntica
in vitro e in vivo
Folhas e
caules
Folhas
Etanol
Água e
Etanol
S. mombin
Anti-inflamatória
Casca do
caule
Etanol
CORTHOUT et al.,
1991
ADEMOLA;
FAGBEMI; IDOWU,
2005
ABAD et al.,
1996
Metanol:
AKINMOLADUN et
Água (4:1)
al., 2010
Cardioprotetora
Folhas
Leishmanicida
Folhas
Antimicrobiana
Folhas
Metanol
SILVA et al., 2012
Analgésica
Cascas
Etanol
PANDA et al., 2009
Metanol:
Água (4:1)
ACCIOLY et al., 2012
Spondias
mombin
aff.
tuberosa
Casca do
caule
Cascas
S. pinnata
Antibacteriana
Resina da
casca
Etanol
Etanol
Clorofórmio
Etanol,
metanol,
acetato de
etila,
clorofórmio,
benzeno, éter
de petróleo e
hexano
VALSARAJ et al.,
1997
DAS et al., 2011
GUPTA et al., 2010
Continua
38
Antibacteriana
Folhas
Água
SHARMEEN et al.,
2012
Folhas
Água
FOYSAL; RAHMAN;
ALAM, 2011
Etanol: Água
DADUANG et al.,
(7:3)
2011
Folhas
Anticâncer in
vitro
Casca do
caule
Antidiabética
Casca do
caule
Metanol:
Água
GHATE et al., 2014
(7:3)
Água
ATTANAYAKE et al.,
2014
MAISUTHISAKUL;
Polpa do
S. pinnata
Antioxidante in
fruto
Etanol
SUTTAJIT;
PONGSAWATMANIT,
2007
vitro
Metanol:
Cascas
Água
(7:3)
HAZRA; BISWAS;
MANDAL, 2008
Água,
Antiplasmodial
Raízes
diclorometano
HOUT et al., 2006
e metanol
Antiviral
Folhas
Hexano
Anti-helmíntica
Cascas
Metanol
Leishmanicida
Cascas
Metanol
SILPRASIT et al.,
2011
GANGARAO;
JAYARAJU, 2009
TAKAHASHI et al.,
2004
As atividades biológicas demonstradas por algumas espécies do gênero
Spondias (tabela 2) podem estar relacionadas com alguns constituintes químicos
presentes neste gênero. A espécie Spondias mombim (sinônimo Spondias lutea)
39
destaca-se pelo número relevante de substâncias identificadas e isoladas, o que
leva aos mais variados usos populares desta planta. Nos frutos desta espécie
observou-se a presença de carotenoides e vitamina A, contendo como principal
carotenoide a β-criptoxantina, seguido da luteína (HAMANO; MERCADANTE, 2001).
Estudo fitoquímico realizado com as folhas de S. mombim indicou a presença das
seguintes classes de metabólito secundários: taninos, saponinas, antraquinonas e
alcaloides (ABO; OGUNLEYE; ASHIDI, 1999). Foram isolados desta espécie dois
elagiotaninos
a
Geraniina,
o
constituinte
principal,
e
galiolgeraniina
que
apresentaram atividade antiviral pronunciada contra os vírus Coxsachie e Herpes
simplex (CORTHOUT et. al., 1991), essas substâncias podem ser os principais
responsáveis pela atividade antiviral atribuída aos extratos das folhas e cascas do
caule de S. mombim. Outros metabólitos secundários foram isolados das folhas e
cascas desta espécie, identificados como ácido 2-O-cafeicol-(+)-alohidroxicítrico e
butil éster de ácido clorogênico, que também mostraram considerável atividade
antiviral (CORTHOUT et al., 1992), bem como, o ácido elágico e a quercetina
isolados das folhas, apresentaram atividade antiviral contra o vírus da dengue tipo 2
(SILVA et al., 2011).
Na espécie S. pinnata foram identificados vitamina C, compostos fenólicos e
flavonoides, relacionando estes compostos com a atividade antioxidante. Na triagem
fitoquímica preliminar do extrato metanólico revelou a presença de taninos,
saponinas, terpenoides fitosteróis (SILVA et al., 2014).
Na espécie Spondias cytherea Sonn., também conhecida como S. dulcis
foram analisados os compostos voláteis dos extratos de frutos maduros e verdes
através das seguintes técnicas CG/FID, CG/EM e olfatometria. Os principais
compostos identificados foram 1,8-cineol, α-pineno, β-pineno, terpinoleno, limoneno,
α-terpineol, acetato de butila, γ-terpineno e terpinen-4-ol, dentre os mais de 50
componentes identificados. A característica do odor desses extratos pode ser
correlacionada com os álcoois e ésteres, monoterpenos menores e derivados
hexânicos e graxos (JIROVETZ; BUCHBAUER; NGASSOUM, 1999).
Na tabela 3, p.41-43 estão descritos outros metabólitos secundários
encontrados no gênero Spondias.
40
Tabela 3: Exemplos de alguns metabólitos secundários encontrados no gênero
Spondias.
Espécie
Referência
Terpenoides e esteroides
COOH
HO
Spondias
Ácido oleanólico
Mangifera
SINGH;
SAXENA, 1976
HO
β-Amirina
Spondias
TANDON;
pinnata
RASTOGI, 1976
O
24-Metileno cicloartanona
Continua
41
Espécie
Referência
Spondias
TANDON;
pinnata
RASTOGI, 1976
Terpenoides e esteroides
H
H
H
H
O
Stigmast-4-en-3-ona
O
HO
Ácido lignocérico
H
H
H
H
HO
β-sitosterol
Continua
42
Lipídio fenólico
OH
COOH
Spondias
COATES et al,
mombin
1994
Spondias
CORTHOUT et
mombin
al., 1992
Ácido 2-hidroxi-6-(heptadeca-8,11,14-trieno)
benzoico
Benzenóide
HO
COOH
HO
O
O HOOO
H
OH
COOH
Ácido 2-O-cafeicol-(+)-alohidroxicítrico
3.3 Considerações sobre a espécie Spondias tuberosa
Spondias tuberosa é uma espécie nativa do semiárido brasileiro, bioma
Caatinga, ocorrendo desde o Piauí até o norte de Minas Gerais. Esta espécie
apresenta muitas utilidades econômicas, sendo seu fruto comercializado in natura ou
em forma de polpa. Pode ser cultivada em larga escala, tanto para a alimentação
humana, quanto para suplementação alimentar de animais. Suas raízes e folhas
também podem ser utilizadas como alimento, e a água armazenada nas raízes é
utilizada na medicina popular (NADIA; MACHADO; LOPES, 2007).
43
A espécie Spondias tuberosa é facilmente reconhecida na Caatinga, pois
apresenta uma copa característica, baixa e ampla, de galhos cinzentos e
emaranhados. O umbuzeiro perde totalmente as folhas durante o estio anual, mas
logo após as primeiras chuvas reveste-se rapidamente de folhas. A floração tem
início quase sempre um pouco antes das primeiras chuvas, quando a planta
apresenta-se ainda desfolhada. A frutificação ocorre no período chuvoso e é
abundantíssima, durando aproximadamente dois meses (Figura 3, p.44). Como as
chuvas da Caatinga não iniciam na mesma época, a floração e a produção de frutos
varia de local para local (MAIA, 2004). Deste modo o umbuzeiro apresenta grande
importância para os sertanejos, pois em tempos de seca o umbuzeiro mostra-se
como uma fonte de renda, pois o mesmo floresce em meio da Caatinga cinzenta
fornecendo frutos dos quais muitas famílias tiram seu sustento com venda dos
mesmos, além de fornecer suas túberas as quais servem como reservatório de água
e ainda são comestíveis apresentando sabor doce e agradável. Além dos frutos, as
folhas desta planta também são utilizadas como uma fonte de alimento
principalmente pelos animais.
Figura 3. Árvore do umbuzeiro na época de estiagem (A); umbuzeiro após as
primeiras chuvas (B); inflorescência (C) e fruto (D). Fotos: Amanda Leite Guimarães
44
Sob o ponto de vista etnofarmacológico, a espécie Spondias tuberosa
apresenta diversos usos para o tratamento de algumas patologias, entre estas
diabetes, inflamações, cólicas uterinas e dores de estômago (LINS NETO; PERONI;
ALBUQUERQUE, 2010).
O uso desta planta para diversos fins terapêuticos pode estar relacionado
com os constituintes presentes nesta espécie. Os frutos do umbuzeiro apresentaram
pronunciada atividade antioxidante e sequestro de radicais livres, pela presença de
compostos fenólicos e vitamina C, bem como relatos da presença de flavonoides,
antocianinas e carotenoides. Quando avaliada a presença de compostos fenólicos
de baixo peso molecular, ou fenólicos simples por UFLC, constatou-se a presença
de ácido gálico, clorogênico, protocatecuico, p-cumárico, vanílico e ferúlico, bem
conhecidos por suas propriedades terapêuticas. O fenólico simples majoritário foi o
ácido clorogênico (SILVA et al., 2014).
O extrato das folhas do umbuzeiro (S. tuberosa) apresentou melhor atividade
antiviral contra o vírus da dengue tipo 2 do que o extrato das folhas da cajazeira (S.
mombin), devido à presença das seguintes substâncias: ácido elágico, quercetina e
rutina (SILVA et al., 2011). Ao ser avaliado os efeitos anticâncer dos extratos de 72
amostras de espécies do Nordeste brasileiro, dentre elas a S. tuberosa apresentou
atividade inibitória sobre as células malignas do tumor de Walker (SILVA et al.,
2014).
Em um estudo realizado com 23 polpas de frutas nativas do Nordeste foi
identificado, nas polpas de umbu, flavonoide (quercetina), ácido elágico e
hidroxicinâmicos, e foram avaliados os potenciais inibitórios das enzimas α-amilase
e α-glicosidase, e não apresentaram efeito antidiabético (GONÇALVES, LAJOLO;
GENOVESE, 2010).
O único trabalho encontrado na literatura que trata de isolamento de
substâncias da espécie Spondias tuberosa foi descrito por Silva e colaboradores
(2011). Este artigo relata o isolamento do ácido elágico, da quercetina e rutina.
Levando em consideração a presença de flavonoides e taninos nos frutos e
casca do caule do umbuzeiro, associado ao conhecimento popular dos seus efeitos
anti-inflamatórios
e
cicatrizantes
esta
espécie
mostra-se
promissora
bioprospecção e descoberta de novos fármacos (ARAÚJO et al., 2008).
para
45
3.4 Considerações gerais sobre quinonas
As quinonas são compostos orgânicos que podem ser considerados como
produtos de oxidação de fenóis; da mesma forma, a redução de quinonas pode
originar os correspondentes fenóis (Figura 4, p.46). Sua principal característica é a
presença de dois grupos carbonílicos que formam um sistema conjugado com pelo
menos duas ligações dupla C-C. As quinonas podem ser sintetizadas por meio de
várias rotas metabólicas, sendo as principais a via do ácido chiquímico e acetato ou
totalmente via acetato (SIMÕES et al., 2010).
Figura 4. Interconversão entre quinonas e os fenóis por oxirredução
O
OH
Oxidação
Redução
O
OH
Fenol
Quinona
As reações de oxirredução são responsáveis pelo papel importante das
quinonas como carregadores de elétrons nos processos metabólicos das células.
Assim, as atividades e propriedades das quinonas baseiam-se primariamente em
ambientes físico ou biológico (SIMÕES et al., 2010).
3.5 Considerações gerais sobre os ácidos fenólicos
Outra classe de metabólitos secundários é a dos ácidos fenólicos, estes estão
dentre os compostos fenólicos mais abundantes nos alimentos (OLIVEIRA;
BASTOS, 2011). Os ácidos fenólicos apresentam um grupo funcional carboxila e são
divididos em duas classes: os ácidos hidroxibenzoicos (Figura 5, p.47) e os
hidroxicinâmicos (Figura 6, p.47) (D’ARCHIVIO, 2007). Os ácidos hidroxibenzoicos
são componentes das complexas estruturas dos taninos hidrolisáveis e são menos
abundantes nos vegetais consumidos pelos humanos (MANACH, 2004). Já os
ácidos hidroxicinâmicos estão presentes em vários alimentos e bebidas de origem
vegetal, como o café, erva mate. São exemplos de ácido hidroxicinâmico os
seguintes ácidos: cafeico, p-cumárico, ferúlico e sinápico que, na maioria dos
46
alimentos, encontram-se esterificados ao ácido quínico, ácido tartárico ou
carboidratos e derivados (OLIVEIRA; BASTOS, 2011).
Figura 5. Estrutura química dos principais ácidos hidroxibenzoicos
HO
O
R1
R2
R4
R3
Ácido salicílico: R1 = OH; R2 = R3 = R4 = H
Ácido gentísico: R1 = R4 = OH; R2 = R3 = H
Ácido p-hidroxibenzóico: R1 = R2 = R4; R3 = OH
Ácido protocatequínico: R1 = R4 = H; R2 = R3 = OH
Ácido vanílico: R1 = R4 = H; R2 = OCH3; R3 = OH
Ácido gálico: R1 = H; R2 = R3 = R4 = OH
Ácido siríngico: R1 = H; R2 = R4 = OCH3; R3 = H
Figura 6. Estrutura química dos principais ácidos hidroxicinâmicos
HO
O
R1
R2
R4
R3
Ácido sinápico: R1 = H; R2 = R4 = OCH3; R3 = OH
Ácido cinâmico: R1 = R2 = R3 = R4 = H
Ácido o-cumárico: R1 = OH; R2 = R3 = R4 = H
Ácido m-cumárico: R1 = R3 = R4 = H; R2 = OH
Ácido p-cumárico: R1 = R2 = R4 = H; R3 = OH
Ácido caféico: R1 = R4 = H; R2 = R3 = OH
Ácido ferúlico: R1 = R4 = H; R2 = OCH3; R3 = OH
47
Os ácidos cinâmico e p-cumárico são formados a partir da rota biossintética
do ácido chiquímico, os quais sofrem reações de redução enzimática, oxidação com
degradação das cadeias laterais e ciclização enzimática intramolecular dando
origem aos fenilpropanoides (Figura 7, p.48). Os fenilpropanoides são menos
abundantes do que os terpenoides e possuem em suas estruturas um anel
benzênico com uma cadeia lateral composta de três carbonos, que apresentam uma
dupla ligação e podem ter um grupo funcional com oxigênio (ANDRADE, 2010).
Figura 7. Esquema adaptado de SIMÕES e colaboradores (2010) da biossíntese
dos fenilpropanoides
O
OH
O
Várias reações
HO
O
NH2
R
OH
-
OH
R=H
Fenilalanina
R = OH
Tirosina
Fenilalanina amonialiase
OH
O
Ácido cinâmico
R=H
R
redução
R = OH Ácido p-cumárico
redução
oxidação
ciclização
O
R
R
R
R=H
R = OH
R
O
O
48
3.6 Considerações gerais sobre os flavonoides
Os flavonoides. Os flavonoides são biossintetizados a partir da via dos
fenilpropanoides, constituem uma importante classe de polifenóis, presentes em
relativa abundância entre os metabólitos secundários de vegetais. Uma “substância
fenólica ou polifenólica” é aquela que possui um ou mais núcleos aromáticos
contendo substituintes hidroxilados e/ou seus derivados funcionais (ésteres, éteres,
glicosídeos e outros). Entretanto, uma definição levando em conta somente a
estrutura química não é apropriada, uma vez que existem compostos contendo
hidroxilas fenólicas, que fazem parte de outras classes de metabólitos. Dessa forma,
é mais conveniente empregar-se uma definição que leva em conta também a origem
biogenética (SIMÕES et al., 2010). Os flavonoides são formados pela combinação
de derivados sintetizados a partir da fenilalanina (via metabólica do ácido
chiquímico) e do acetato (via metabólica do acetato, acetil coenzima A), o esquema
simplificado da origem biossintética dos flavonoides está apresentada na figura 8,
p.49.
Figura 8. Esquema simplificado da origem biossintética dos flavonoides adaptado de
SIMÕES e colaboradores (2010).
49
Podem-se encontrar flavonoides em diversas formas estruturais. Entretanto, a
maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbonos em seu
núcleo fundamental, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três
carbonos entre elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são chamadas núcleos
A, B e C e os átomos de carbonos recebem a numeração com números ordinários
para os núcleos A e C e os mesmos números seguidos de uma linha (') para o
núcleo B (Figura 9, p.50) (SIMÕES et al., 2010).
Figura 9. Núcleo fundamental dos flavonoides e sua numeração
3'
2'
8
7
A
4'
B
O
C
6
5'
2
6'
3
5
O
Os flavonoides são subdividos de acordo com sua estrutura em diversas
classes, sendo que as principais são: flavonas, flavonóis, chalconas, auronas,
flavanonas, flavanas, antocianidinas, leucoantocianidinas, proantocianidinas e
isoflavonas (Quadro 1, p.51-52) (BRAVO, 1998). A diversidade estrutural dos
flavonoides pode ser atribuída ao nível de oxidação e às variações no esqueleto
carbônico básico, promovidas por reações de alquilação, glicosilação ou
oligomerização (COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009).
50
Quadro 1: Exemplo de algumas subclasses de flavonoides
O
O
Di-hidro-chalcona
Chalcona
O
O
OH
O
O
Flavonol
Flavona
O
O
OH
O
O
Di-hidro-flavonol
Flavanona
O
O
OH
OH
Flavanol
OH
Flavan-3,4-diol ou leucoantocianidina
+
O
O
O
OH
Antocianidina
O
O
Biflavonoide
Continua
51
Quadro 1 (Continuação)
Isoflavonoides
O
H3CO
O
O
O
O
O
Neoflavonoide
O
Proantocianidina ou Tanino condensado
Os
flavonoides
de
origem
natural
apresentam-se,
frequentemente,
oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares. Esta forma,
chamada conjugada, também é conhecida como heterosídeo. São denominados de
O-heterosídeos quando a ligação se dá por intermédio de uma hidroxila e de Cheterosídeos quando a ligação se dá com um átomo de carbono, quando estão na
sua forma livre são chamados de aglicona (SIMÕES et al., 2010).
Diante da grande diversidade de flavonoides existentes, diversas atividades
biológicas são atribuídas a essa classe de polifenóis o que lhe confere significativa
importância farmacológica (COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009). Diversos
ensaios in vivo e in vitro vêm comprovando e determinando a ampla variedade das
atividades biológicas dos compostos flavonoídicos. Destacam-se, dentre outros, os
seguintes efeitos dos flavonoides sobre os sistemas biológicos: capacidade
antioxidativa (esta constitui a atividade mais elucidada pelos estudos até agora
desenvolvidos); atividades anti-inflamatória e de efeito vasodilatador; ação
antialérgica; atividade contra o desenvolvimento de tumores, anti-hepatotóxica,
antiulcerogênica; atuação antiplaquetária, bem como ações antimicrobianas e
antivirais (LOPES et al., 2000). Dentre os 40 fármacos anti-inflamatórios aprovados
52
entre 1983 e 1994, 12 foram derivados ou baseados em polifenóis de origem natural
(COUTINHO; MUZITANO; COSTA, 2009). Na família Anacardiaceae esta classe de
metabólito secundário destaca-se entre os demais produtos naturais já encontrados
nesta família, principalmente a subclasse dos biflavonoides.
3.7 Considerações sobre a Rutina e Quercetina
Em meio aos flavonoides encontra-se a rutina, um flavonol O-glicosilado
(glicose + ramnose) na posição 3 do anel C da quercetina (Figura 10, p.53). Este
flavonoide é encontrado em várias fontes alimentares como cebola, uva, trigo
serraceno, feijão vermelho, maçãs, tomates e bebidas como vinho tinto e chá preto.
Entre os vegetais as principais fontes da rutina são: a árvore japonesa pagoda
(Sophora japônica L.) de seus botões e flores são extraídos de 15 a 20% de rutina,
trigo sarraceno (Faopyrum esculentum Moech, F. tataricum L. Gaenth) suas folhas
contêm 2-8% de rutina e os frutos (favas) do faveiro (Dimophandra mollis Benth) que
contém rutina na proporção de 8g para 100g de pericarpo (BECHO; MACHADO;
GUERRA, 2009).
Figura 10. Esquema simplificado da formação da rutina a partir da quercetina
adaptado de PEDRIALI, 2005.
OH
OH
O
HO
OH
OH
O
Quercetina
UDP-D-glicose
OH
OH
OH
OH
O
HO
O
HO
O
OH
OH
O
O
OH
OH
UDP-L-ramnose
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
Quercetina-3-O-glucosídeo
O
HO
HO
HO
Rutina
53
Os glicosídeos ligados a quercetina apresentaram afinidade pela membrana
das células epiteliais exercendo assim um importante papel na absorção dos
compostos lipofílicos. Já a absorção no intestino delgado é dificultada devido aos
açúcares ligados à sua molécula (MUROTA; TERAO, 2003).
Apesar da dificuldade na absorção no intestino delgado, a rutina tem se
destacado entre os flavonoides estudados em função das suas diversas atividades
farmacológicas. Entre as atividades terapêuticas da rutina, está a melhora nos
sintomas de insuficiência dos vasos linfáticos e venosos associados com algumas
doenças hemorrágicas ou de hipertensão, por promover a normalização da
resistência e permeabilidade da parede destes vasos (BECHO; MACHADO;
GUERRA, 2009). Além de várias outras atividades da rutina que vêm sendo
desvendadas, como por exemplo, a eficiência no tratamento da artrite por Candida
albicans e atividade anti-candida (HAN, 2009), a atividade antihiperlipidêmica
(SANTOS et al., 1999), o efeito anticonvulsivante em ratos (NASSIRI-ASL;
SHARIATI-RAD; ZAMANSOLTANI, 2008), a supressão da imunidade celular
(MIDDLETON et al., 2000), a atividade anticarcinogênica (MACHADO, 2005) e o
efeito anti-inflamatório (GUARDIA et al., 2001).
Em relação à aglicona da rutina, a quercetina, trata-se do flavonoide mais
difundido na natureza, presente em grandes quantidades em vegetais, frutas, chás e
vinho tinto. Representa um dos antioxidantes de origem vegetal com maior potencial
antioxidante, protegendo as células contra as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)
(BONA, 2010). Estima-se que são ingeridas 25 mg por dia de quercetina em uma
dieta normal humana (DAJAS et al., 2003). Trabalhos experimentais utilizando
quercetina obtiveram redução das lesões no tecido hepático e verificaram que sua
administração aumenta as defesas antioxidantes, diminui o dano oxidativo no fígado,
a proliferação do ducto biliar e a fibrose (BONA, 2010).
Diversos estudos relatam as propriedades biológicas da rutina, sendo que boa
parte dos seus efeitos benéficos são similares às propriedades farmacológicas da
quercetina (BECHO; MACHADO; GUERRA, 2009). A semelhança nas propriedades
farmacológicas é justificada pelo fato de que a rutina pode ser completamente
hidrolisada pelas enzimas glicosidades produzidas por enterobactérias, além de
sofrer hidrólise em pH estomacal, dando origem à quercetina-3-glicosídica e,
posteriormente, a quercetina, como pode ser observado na figura 11, p.55
(ARAÚJO, 2013).
54
Figura 11. Esquema da hidrólise da rutina a quercetina-3-glicose e, em seguida a
quercetina
OH
OH
OH
OH
O
HO
O
HO
O
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
pH ácido
OH
O
O
OH
OH
O
OH
HO
Quercetina-3-O-glucosídeo
HO
HO
pH ácido
Rutina
OH
OH
O
HO
OH
OH
O
Quercetina
3.8 Considerações sobre Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com
detector de UV com arranjo de diodos (CLAE-DAD)
Existem diversas formas de identificar e quantificar flavonoides em extratos
vegetais, porém, a técnica CLAE se destaca das demais por apresentar eficiência e
confiabilidade nos dados obtidos. A cromatografia líquida na análise de flavonoides é
uma técnica bastante eficiente na separação destas substâncias, mesmo em
misturas complexas (VILA, 2006).
O equipamento de CLAE consiste de uma bomba de alta pressão, injetor,
coluna, detector e um registrador de dados como está representado na figura 12,
p.56. Esta técnica emprega colunas relativamente pequenas (cerca de 2-5 mm de
diâmetro interno e comprimento de 3 a 25 cm), operando em temperaturas que
chegam até cerca de 75°C e pressões de até 400 atm. Um detector colocado na
55
saída da coluna permite o registro contínuo da composição do efluente, resultando
em um cromatograma, no qual torna-se possível identificar e quantificar os
flavonoides da amostra (VILA, 2006).
Figura 12. Esquema simplificado de um cromatógrafo CLAE (VILA, 2006)
O detector de UV-Visível é o mais empregado em CLAE para as análises de
flavonoides, principalmente porque estas substâncias apresentam duas bandas de
absorção bem características no UV (YAO et al. 2004; MARKHAM, 1982). Há três
tipos de detectores UV-Visível: o detector de comprimento fixo, o detector de
comprimento de onda variável e detector por arranjo de fotodiodos. O detector por
arranjo de diodos se sobressai dos demais, pois é um tipo de detector de
comprimento de onda variável que opera na região do ultravioleta, e torna possível
análises em diferentes comprimentos de onda simultaneamente, pois possibilitam
uma “varredura” na região UV-Vis em uma única corrida cromatográfica,
disponibilizando-o mesmo após ter sido realizada (VILA, 2006).
56
3.9 Considerações sobre as atividades antioxidante e antibacteriana
Sabe-se que diversas plantas da flora brasileira são utilizadas no tratamento
de vários tipos de enfermidades, uma forma de comprovar este uso é através da
realização de testes biológicos e ensaios químicos com os extratos destas espécies.
Estes experimentos podem ser realizados tanto in vitro (ocorre fora de um
organismo) quanto em in vivo (ocorre dentro de um organismo). Os ensaios in vitro
normalmente são realizados inicialmente, pois estes podem fornecer respostas
rápidas através de experimentos simples e seu resultado permite rejeitar um
possível ensaio biológico in vivo, pois um extrato que exibe um resultado não
satisfatório in vitro provavelmente não exibirá bons resultados em ensaios in vivo.
A avaliação da atividade antioxidante e antibacteriana in vitro são os
experimentos mais utilizados por apresentarem uma metodologia de fácil
reprodutibilidade, apesar da simplicidade do experimento, o mesmo pode justificar
algumas propriedades farmacológicas apresentadas pelo vegetal, como por
exemplo, ação anti-inflamatória ou antidiarreica e também determinar se é
necessário da sequência nos ensaios in vivo ou não.
Atividade antioxidante
Atualmente existe um grande interesse no estudo dos antioxidantes devido,
principalmente, às descobertas sobre o efeito dos radicais livres no organismo. A
oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do nosso metabolismo e, assim, os
radicais livres são produzidos naturalmente. Esses radicais livres cujo elétron
desemparelhado encontra-se centrado nos átomos de oxigênio ou nitrogênio são
denominados Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) ou Espécies Reativas de
Nitrogênio (ERN). (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
O organismo humano sofre ação constante de ERO e ERN geradas em
processos inflamatórios, por alguma disfunção biológica ou provenientes dos
alimentos. As principais ERO distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila
(HO•), superóxido (O2•−), peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•), e os não-radicalares:
oxigênio, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Dentre as ERN incluem-se o
óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2−), nitratos
(NO3−) e peroxinitritos (ONOO−). Enquanto alguns deles podem ser altamente
57
reativos no organismo atacando lipídios, proteínas e DNA, outros são reativos
apenas com os lipídios (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o
papel chave desses radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis
pelo envelhecimento e pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento,
como câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistema imune e
disfunções cerebrais (SOUSA et al., 2007).
Uma forma de evitar os danos causados pelos radicais livres e outros
oxidantes é eliminando o excesso dos mesmos do organismo. Esse excesso é
combatido por antioxidantes produzidos pelo corpo ou são absorvidos em uma dieta
que contenha substâncias que atuem como antioxidantes. De acordo com Halliwell
“Antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa concentração
comparada
à
do
substrato
oxidável,
regenera
o
substrato
ou
previne
significativamente a oxidação do mesmo” (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). O
nosso corpo é capaz de produzir antioxidantes e agem enzimaticamente, a exemplo
da se-glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD)
(FINKEL; HOLBROOK, 2000) ou, os que não agem enzimaticamente, como por
exemplo, glutationa (GSH), peptídeos de histidina, proteínas ligadas ao ferro
(transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e CoQH2 (BARREIROS; DAVID; DAVID,
2006). Além dos antioxidantes produzidos pelo corpo, o organismo utiliza aqueles
provenientes da dieta como o α-tocoferol (vitamina-E), β-caroteno (pró-vitamina-A),
ácido ascórbico (vitamina-C), e compostos fenólicos onde se destacam os
flavonoides e poliflavonoides (Tabela 4, p.59-60) (BARREIROS; DAVID; DAVID,
2006).
Outro interesse ligado aos antioxidantes é a sua aplicação na indústria, na
proteção de cosméticos, fármacos e alimentos, prevenindo a decomposição
oxidativa desses pela ação da luz, temperatura e umidade (BARREIROS; DAVID;
DAVID, 2006). Muitos dos antioxidantes utilizados na indústria são de origem
sintética, como por exemplo a mistura de dois o 2 e o 3-terc-butil-4-hidroxianisol
(BHA) e o di-terc-butil metil fenol (BHT) (Tabela 4, p.59-60).
58
Tabela 4. Exemplos de substâncias antioxidantes naturais e sintéticas (Adaptada de
ALVES e colaboradores, 2010)
Substância
antioxidante
Ácido
Estrutura
Origem
OH
Natural
HO
O
O
ascórbico
e
sintética
HO
O
OH
OH
Ácido gálico
Natural
HO
OH
OH
HO
α-tocoferol
Natural
O
β-caroteno
Natural
Continua
59
OCH3
BHA
Sintética
OH
OH
BHT
Sintética
OH
O
O
Galato de n-
Sintética
propila
HO
OH
OH
HO
O
Trolox®
Sintética
OH
O
OH
OH
Quercetina
Natural
O
HO
OH
OH
O
60
Existem diversos métodos para avaliar a atividade antioxidante in vitro de
substâncias biologicamente ativas, envolvendo desde ensaios químicos com
substratos lipídicos a ensaios mais complexos utilizando as mais diversas técnicas
instrumentais. Estes testes têm se tornado ferramentas usuais e extremamente
necessárias na seleção inicial de substâncias que possam ser utilizadas como
fármacos, auxiliando os pesquisadores na avaliação da atividade de substâncias
isoladas de produtos naturais, bem como obtidas de fontes sintéticas. Além disso,
estes métodos podem auxiliar na escolha das espécies de planta para estudos
químicos e farmacológicos (ALVES et al., 2010).
Atividade antibacteriana
O estudo de agentes antimicrobianos tem grande abrangência, sendo ponto
crucial em vários setores do campo farmacêutico e cosmético. Outro ponto a ser
ressaltado é a utilização desse estudo como primeiro screening na descoberta da
atividade farmacológica de novos agentes, sendo de extrema importância,
principalmente em um país como o Brasil, que oferece uma imensa biodiversidade
(OSTROSKY et al., 2008).
Existe outra questão que não pode deixar de ser mencionada, o uso
indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos. Esse tipo de
uso tem levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a
esses compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma
alternativa eficaz e econômica (VARGAS et al., 2004). O problema da resistência
microbiana é crescente e a perspectiva de uso de drogas antimicrobianas no futuro é
incerta e uma das soluções para este problema é o desenvolvimento de novas
drogas, tanto sintéticas como naturais (NASCIMENTO et al., 2000).
A atividade antibacteriana de extratos vegetais é avaliada através da
determinação de uma pequena quantidade da substância necessária para inibir o
crescimento da bactéria-teste. Esse valor é conhecido como Concentração Inibitória
Mínima (CIM). Um aspecto bastante relevante na determinação da CIM de extratos
vegetais é a preocupação em relação aos aspectos toxicológicos, microbiológicos e
legais pertinentes aos compostos naturais ou suas combinações. As variações
referentes à determinação da CIM de extratos de plantas podem ser atribuídas a
vários fatores, dentre eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e a
61
cepa utilizada no teste, à origem da planta, a época da coleta, se os extratos foram
preparados a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada.
Assim, não existe método padronizado para expressar os resultados de testes
antimicrobianos de produtos naturais (OSTROSKY et al., 2008).
62
4. PARTE EXPERIMENTAL
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. Coleta do material botânico
As folhas, talos e cascas de Spondias tuberosa Arr. foram coletadas em
janeiro e junho de 2013, no campus de ciências agrárias da Universidade Federal do
Vale do São Francisco localizado em Petrolina-PE (Coordenadas: 09°19'53,90" S;
040°32'47,60" W). A exsicata desta espécie (Figura 13, p.64) encontra-se depositada
no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) na Universidade Federal do Vale do
São Francisco (UNIVASF) sob o registro nº 18319.
Figura 13. Foto da exsicata de Spondias tuberosa de número 18319.
64
4.2. Processamento do material vegetal

Preparação do extrato de S. tuberosa
As partes da planta coletadas no mês de janeiro permaneceram em estufa de
ar circulante à temperatura de 40ºC por 72 horas para retirada de umidade. Após a
secagem e completa estabilização (eliminação de água, inativação de enzimas, etc.)
o material foi pulverizado em moinho, obtendo-se um material vegetal seco e
pulverizado das cascas (320,4 g), folhas (126,5 g) e dos talos (174,3 g). O material
botânico foi devidamente acondicionado em um recipiente de aço inoxidável,
inicialmente foi realizada uma extração com o solvente n-hexano, a fim de retirar os
constituintes apolares presente no material botânico, para tanto realizou-se três
extrações num intervalo de 72 horas entre cada extração, os extratos obtidos desta
primeira maceração das partes utilizadas (folhas, talos e cascas) foram
denominadas de Hex-1. Em seguida o material contido no recipiente foi submetido à
maceração exaustiva com etanol 95%. Realizou-se várias extrações num intervalo
de 72 horas entre cada extração até completa extração dos metabólitos. As soluções
extrativas, hexânica e alcoólica, passaram por um processo de destilação do
solvente em evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura média de 50
°C.
Na solução extrativa etanólica das folhas foi evidenciada a presença de um
precipitado amorfo com a coloração marrom claro e solúvel em dimetilsulfóxido
(DMSO), o qual foi separado e identificado como substância 1 (St-01) (4,8 mg).

Partição do extrato etanólico de S. tuberosa
Uma pequena porção do extrato etanólico (EtOH) das partes estudadas foi
separada para ensaios químicos, biológicos e para a avaliação fitoquímica
preliminar. O restante foi particionado através de cromatografia líquida a vácuo com
solventes em gradiente crescente de polaridade (hexano, clorofórmio, acetato de
etila e metanol) e as frações obtidas foram submetidas à avaliação da atividade
antioxidante e do teor de fenóis e flavonoides. O estudo foi continuado com a fase
que mostrou melhores resultados nas atividades avaliadas com a finalidade do
isolamento dos constituintes químicos.
65
As quantidades de cada fração obtida no fracionamento do extrato etanólico
das cascas, folhas e talos estão descritas nos fluxogramas 1, 2 e 3, p. 66-67.
Fluxograma 1. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das cascas de
Spondias tuberosa.
Fluxograma 2. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico das folhas de
Spondias tuberosa.
66
Fluxograma 3. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico dos talos de
Spondias tuberosa.
4.3. Triagem fitoquímica preliminar dos extratos e frações
A triagem fitoquímica preliminar dos extratos e das frações foi avaliada por
meio de um método que consiste na aplicação das amostras sobre uma placa de
cromatografia em camada delgada analítica com auxílio de um capilar, e a eluição
da mesma foi realizada em sistemas de solventes específicos para cada classe de
metabólito secundário investigado. Essa metodologia identifica os principais grupos
de metabólitos secundários que compõem os extratos e fases estudados. A triagem
fitoquímica consiste em um exame rápido e superficial, realizado através de
reagentes de coloração que irão revelar ou não a presença de determinada classe
metabólitos secundários em um extrato (WAGNER; BLADT, 1996). As classes dos
constituintes químicos que foram investigados, bem como os sistemas de solvente e
reveladores
utilizados
estão
demonstrados
na
tabela
5,
p.68.
67
68
Tabela 5. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os principais metabólitos secundários da espécie
Spondias tuberosa (WAGNER; BLADT, 1996).
Classe química
Alcaloides
Cumarinas
Derivados antracênicos
Flavonoides e taninos
Mono e diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e esteroides
Saponinas
Sistema eluente
Tolueno:acetato de etila:dietilamina
(70:20:10)
Tolueno:éter etílico
(1:1, saturado com ácido acético 10%)
Acetato de etila:metanol:água
(100:13,5:10)
Acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético glacial:água
(100:11:11:26)
Tolueno:acetato de etila
(93:7)
Revelador
Dragendorff
KOH etanólico 10%
KOH etanólico 10%
NEU
Vanilina sulfúrica
Tolueno:ácido fórmico
(99:1)
Tolueno:clorofórmio:etanol
(40:40:10)
Clorofórmio:ácido acético:metanol:água
(64:32:12:8)
KOH etanólico 10%
Lieberman-Burchard
Anisaldeído-sulfúrico
4.4. Extração dos óleos fixos
As partes da planta (folhas, talos e cascas) foram coletadas em junho de
2013, e levadas para uma estufa de ar circulante a temperatura de 40ºC por 72
horas para retirada da umidade. Após a secagem e completa estabilização o
material foi pulverizado em moinho de facas, obtendo-se um material vegetal seco e
pulverizado das folhas (7,4 g), cascas (82,3 g) e dos talos (16,9 g). O material
botânico foi submetido a uma extração com éter de petróleo em um aparelho de
Soxhlet, durante duas horas. Após a destilação do solvente obteve-se os óleos fixos
das folhas (770,0 mg), cascas (126,1 mg) e dos talos (310,0 mg). Para a análise dos
óleos realizou-se uma reação de saponificação seguida de uma metilação dos
ácidos graxos presentes no óleo. Para tanto, utilizou-se a metodologia descrita por
MATOS e colaboradores (1992).

Saponificação
As amostras de 126 a 300 mg de cada óleo foram saponificadas em um
sistema de refluxo em 50 mL de metanol contendo 0,5-1,0g de KOH, durante 30
minutos. Em seguida, o metanol foi destilado até a redução do volume a 10 mL, o
qual foi completado para 50 mL por adição de água destilada. O material
insaponificável foi extraído da mistura alcalina com éter etílico.

Metilação dos ácidos graxos (Técnica semi-micro)
Após a saponificação, as soluções alcalinas foram aciduladas até pH = 2 com
uma solução aquosa de ácido clorídrico a 10% e os ácidos graxos extraídos com
éter etílico. Após a remoção da água restante através do tratamento com sulfato de
sódio anidro e do éter etílico por destilação em evaporador rotativo à pressão
reduzida, os ácidos graxos foram metilados de acordo com a técnica semi-micro. As
amostras contendo entre 20-30 mg foram colocadas em um sistema de refluxo
durante dois minutos com 2-3 gotas de ácido clorídrico concentrado e 5 mL de
metanol. Após a adição de 10 mL de água, os ésteres metílicos (EMAG) foram
extraídos com hexano, retirou-se a água residual da solução hexânica por
tratamento com sulfato de sódio anidro, seguido de filtração e da retirada do hexano
69
através da destilação. Após a metilação os ésteres metílicos das folhas, cascas e
talos foram enviados para análise.
4.5. Métodos de análise
4.5.1. Métodos cromatográficos
Para o fracionamento das amostras em cromatografia de adsorção em coluna
(CC) foi utilizada sílica gel 60 (70- 230 mesh, ASTM) de partículas com dimensões
entre 0,063-0,200 mm (MERCK) e na separação dos componentes por
peneiramento molecular utilizou-se o Sephadex LH-20 (SIGMA). Ambas as técnicas
utilizadas tiveram como suporte colunas de vidro cilíndricas cujas dimensões
variaram de acordo com a quantidade de amostra utilizada. As frações foram
monitoradas por Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) da Silicycle
TLC – Aluminum F254; as placas foram eluídas com solventes isolados ou em
misturas binárias, em gradiente crescente de polaridade. A pureza das amostras foi
determinada quando observou-se uma única mancha na placa. A revelação das
substâncias deu-se pela exposição das placas à lâmpada de irradiação ultravioleta
nos comprimentos de onda 254 e 365 nm e pela utilização de um revelador químico
(vanilina sulfúrica).
4.5.2. Métodos espectrofotométricos
Para os métodos espectrofotométricos utilizou-se o espectrofotômetro Nova
1600 UV de monofeixe, operando em uma faixa de trabalho de 190 a 1000 nm.
Através deste método determina-se a concentração de uma amostra utilizando a
técnica da espectrofotometria ou colorimetria. A mesma consiste na determinação da
concentração de uma solução a partir de sua coloração, uma vez que a intensidade
da cor é proporcional à quantidade da substância sobre a qual agiu o reativo
(ARAÚJO, 2013).
70
Análise das bandas de absorção na região do ultravioleta
Preparou-se uma solução da amostra a 0,05 mg/mL em metanol, e em
seguida realizou-se a leitura da absorbância da solução no intervalo de 220 a 400
nm. Neste experimento utilizou-se cubetas de quartzo e o metanol como branco. O
experimento foi realizado em triplicata.
4.5.3. Métodos espectrométricos
Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear
As análises foram realizadas pelo CENAUREMN na Universidade Federal do
Ceará utilizando o espectrômetro Bruker modelo Avance DPX-300, operando na
frequência do hidrogênio a 300 MHz e na frequência do carbono-13 a 75 MHz.
Também foram realizadas análises na Central Analítica da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), utilizando espectrômetro Bruker 500 MHz,
operando na frequência do Hidrogênio a 500 MHz e na do Carbono-13 a 125 MHz.
As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se uma pequena
quantidade das amostras nos solventes deuterados dimetilsulfóxido (DMSO-d6),
clorofórmio (CDCl3) e metanol (CD3OD). O deslocamento químico (δ) foi
referenciado para RMN de
1H
pelos picos característicos dos hidrogênios
pertencente à fração não deuterada deste solvente em relação ao TMS: DMSO (δH
= 2,49), clorofórmio (δH = 7,24) e metanol (δH = 4,84 e 3,30). Para os espectros de
RMN de
13C,
em relação ao TMS foi utilizado: DMSO (δC = 39,7), clorofórmio (δC =
77,0) e metanol (δC = 49,0).
As multiplicidades dos sinais de RMN de 1H foram indicadas segundo as
convenções: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m
(multipleto).
Espectrometria de Massas
As análises foram realizadas em cromatógrafo a gás acoplado a
espectrômetro de massas (CG-EM) modelo QP2010Plus (Shimadzu), com fonte de
ionização por impacto eletrônico de 70 eV. A coluna utilizada foi a Factor Four/VF 5ms (30mx25µmx0,25µm).
71
Espectroscopia de infravermelho
A análise de espectroscopia na região do infravermelho foi realizada na
Central Analítica do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão
Pernambucano. Os espectros no infravermelho foram obtidos após a preparação da
pastilha contendo 1 mg de amostra com 100 mg de KBr, sob varreduras num
aparelho PerkinElmer Spectrum Version 10.4.00, as absorções foram registradas
entre 4000 e 400 cm-1.
4.5.4. Ponto de fusão
O ponto de fusão foi determinado em um aparelho para ponto de fusão
(QUIMIS, modelo Q340S23), com temperatura variando entre 0 e 310 ºC. A análise
foi realizada em triplicata e o resultado expresso demonstra a média obtida entre as
leituras.
4.5.5. Análise dos óleos fixos
As substâncias presentes no óleo fixo das cascas, folhas e talos da espécie
Spondias tuberosa foram investigados no cromatógrafo a gás Shimadzu modelo QP2010 interface com um espectrômetro de massas (CG - EM ) com as seguintes
condições: coluna Phenomenex ZB - 5MS Zebron (30mx0,25 mm x 0,25 mm), o gás
hélio (99,999 %) transportado com um fluxo constante de 1,1 mL/min, volume de
injecção de 1 uL; razão de divisão de 1:40 injetor, temperatura do injetor 240° C;
modo de impacto de elétrons a 70 eV; temperatura da fonte de íons 280°C. A
temperatura do forno foi programada de 100°C (isotérmico durante 5 min), com um
aumento de 10°C/min até 250°C (isotérmico durante 5 min) e 10°C/min até 280°C
(isotérmica durante 15 min). Uma mistura de hidrocarbonetos lineares (C 9H20 C40H82) foi injetada sob as mesmas condições experimentais que as amostras, e as
identificações dos componentes foram efetuadas por comparação dos espectros
obtidos com as do banco de dados de equipamentos (Wiley 7 Lib e Nist 08 Lib).
72
4.5.6. Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa
(CLAE-FR)
As análises foram realizadas pela Central Analítica da Universidade Federal do
Vale do São Francisco, utilizando
a técnica de Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência com detector de arranjo de Diodos (CLAE-DAD) em equipamento
Shimadzu® equipado com um sistema quaternário de bombas modelo LC - 20ADVP,
degaseificador modelo DGU - 20A, detector PDA modelo SPD - 20AVP, forno modelo
CTO - 20ASVP, injetor automático modelo SIL - 20ADVP e controlador modelo SCL 20AVP, sendo os dados tratados através do software Shimadzu® LC solution 1.0
(Japão).
4.6. Isolamento e purificação das substâncias
Isolamento e purificação de St-02
Durante a concentração da fração metanólica das folhas no evaporador
rotativo, houve a formação de um precipitado de coloração amarela no fundo do
balão. Para a separação do precipitado, a fração metanólica (4,72 g) foi submetida à
coluna cromatográfica (CC) em sílica gel (91,6 g) que foi denominada de CFM-F.
Utilizou-se como eluentes clorofórmio (CHCl3) e metanol (MeOH), em gradiente
crescente de polaridade, conforme demostrado na tabela 6, p.73. No total foram
coletadas 55 frações de 50 mL cada.
Tabela 6: Fracionamento cromatográfico da fração metanólica as folhas
Frações
Sistema de solvente
Proporção
1-10
CHCl3
100
11-17
CHCl3: MeOH
95:5
18-23
CHCl3: MeOH
90:10
24-34
CHCl3: MeOH
80:20
35-44
CHCl3: MeOH
50:50
45-55
MeOH
100
73
Após
serem
reunidas
as
frações
que
apresentaram
as
mesmas
características na análise da cromatografia em camada delgada (CCDA), gerou-se
uma fração na qual continha o precipitado em maior quantidade (Fr. 39-41). A Fr. 3941 foi purificada em uma coluna cromatográfica contendo Sephadex LH-20 e eluída
apenas com metanol, resultando na substância 2 (St-02) (93,2 mg).
A identificação da substância foi realizada através da técnica espectroscópica
de RMN. Determinou-se ainda o ponto de fusão, as bandas de absorção da
substância no ultravioleta (UV) e infravermelho (IV) e ainda os picos de
fragmentação no espectro de massas.
Isolamento e purificação de St-03
A fração acetato de etila dos talos (0,6 g) foi submetida à coluna
cromatográfica (CC) em sílica gel (48,6 g) que foi denominada de CFAcOEt-T.
Utilizou-se como eluentes clorofórmio (CHCl3), acetato de etila (AcOEt) e metanol
(MeOH), em gradiente crescente de polaridade, conforme demostrado na tabela 7,
p.74. Foram coletadas no total 46 frações de 50 mL cada.
.
Tabela 7: Fracionamento cromatográfico da fração acetato de etila dos talos
Frações
Sistema de solvente
Proporção
1-13
CHCl3
100
14-20
CHCl3: AcOEt
90:10
21-25
CHCl3: AcOEt
70:30
26-31
CHCl3: AcOEt
50:50
32-36
CHCl3: AcOEt
30:70
37-41
AcOEt
100
42-44
AcOEt: MeOH
95:5
45-46
AcOEt: MeOH
90:10
As frações foram reunidas após serem comparadas através da cromatografia
em camada delgada analítica (CCDA). Observou-se também através da CCDA a
pureza de uma fração (Fr. 6). Tal fração apresentou-se na forma de um precipitado
com aspecto de resina de coloração amarela, resultando assim na substância 3 (St03) (14,6 mg).
74
A
identificação
da
substância
foi
realizada
através
das
técnicas
espectroscópicas de RMN uni e bidimensional.
4.7. Determinação de fenóis totais
O teor de fenóis totais foi mensurado por meio do método colorimétrico que
utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu e o ácido gálico foi utilizado como padrão
(ALMEIDA et al., 2011). Uma alíquota dos extratos e frações diluídas (40 µL) foi
adicionada a 3,16 mL de água destilada e 200 µL do reagente Folin-Ciocalteu, sendo
misturados logo em seguida. Logo após adicionou-se a mistura 600 µL de uma
solução aquosa estoque de Na2CO3 a 20% e agitou-se novamente. Após duas horas
a absorbância de cada solução foi determinada em espectrofotômetro em 756 nm
contra o branco (todos os reagentes, exceto a amostra em análise) e os resultados
foram plotados em um gráfico que correlaciona a absorbância da amostra com sua
concentração. O conteúdo de fenóis totais foi expresso em mg de equivalente de
ácido gálico por grama de amostra (mg EAG g-1), obtido por interpolação em uma
curva analítica construída com o padrão ácido gálico dissolvido em etanol e água
nas concentrações 50, 100, 150, 250, 500 e 1000 mg/L. A equação da curva foi
expressa por y = 0,0005x - 0,0076, com coeficiente de determinação igual a R² =
0,9989, onde “x” é a concentração de ácido gálico e “y” é absorbância resultante em
756 nm. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
4.8. Determinação de flavonoides totais
O teor de flavonoides totais foi determinado através do método
colorimétrico por complexação metálica descrito por (ZHISHEN et al., 1999), neste
experimento foi utilizado como padrão a (+)-Catequina. Inicialmente, preparou-se
soluções do padrão, extratos e frações nas seguintes concentrações: 50, 100, 150,
250, 500 e 1000 mg/L. Em seguida 300 µL da solução dos extratos, frações e do
padrão foi adicionada a 1,5 mL de água destilada. Posteriormente, foram
adicionados 90 µL de uma solução de NaNO2. Após 6 minutos de reação, 180 µL de
uma olução de AlCl3.H2O 10% foram adicionados à mistura. Após 5 minutos de
75
76
reação, 600 µL de uma solução de NaOH 1M foram adicionados à mistura anterior.
Finalmente, completou-se o volume com 330 µL de água destilada e o sistema foi
homogeneizado por completo. A absorbância foi mensurada contra o branco em 510
nm, em espectrofotômetro. O branco utilizado continha todos os reagentes e, no
lugar da amostra adicionou-se 300 µL de água destilada. Os resultados foram
expressos em mg de equivalentes de catequina por grama de amostra (mg EqC g-1)
por meio da interpolação dos dados obtidos das amostras na curva padrão com o
padrão catequina dissolvido em metanol e água nas concentrações 50, 100, 150,
250, 500 e 1000 mg/L. A equação da curva foi expressa por y=0,0015x+0,0618, com
coeficiente de determinação igual a R² = 0,9873. Todo o ensaio foi realizado em
triplicata.
4.9. Atividade Antioxidante – Sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1picrilhidrazil) e a Co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico
Há uma grande diversidade de radicais livres e de suas diferentes formas de
atuação nos organismos vivos. Diante disso se fez necessário a realização de mais
de uma técnica para a determinação da atividade antioxidante. A atividade
antioxidante in vitro dos extratos (hexânico e etanólico) e as fases das folhas, talos e
cascas foi determinada através dos métodos de sequestro do radical DPPH e da
inibição da co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico.
Sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1- picrilhidrazil)
Neste primeiro ensaio de atividade antioxidante utilizou-se a metodologia de
sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) descrita por Santana e
colaboradores (2012). As soluções estoques (1,0 mg/mL) das amostras e padrões
(ácido ascórbico, BHA e BHT) foram preparadas e diluídas até concentrações finais
de 243, 81, 27, 9, 3 e 1 μg/mL em etanol. A solução de DPPH na concentração de 50
μg/mL foi preparada em etanol. Em cada cubeta foi adicionado 1 mL da solução de
DPPH a 2,5 mL das soluções de diferentes concentrações das amostras e padrões,
e deixou-se reagir por 30 min à temperatura ambiente.
Em
seguida,
os
valores
de
absorbância
foram
medidos
em
um
espectrofotômetro de Ultravioleta UV-Vis a um comprimento de onda em 518 nm e
convertida em percentagem da atividade antioxidante (AA), utilizando a seguinte
fórmula:
% AA 
Acontrole  Aamostra
x100
Acontrole
Onde:
Acontrole
= indica a absorbância do controle negativo (1,0 mL DPPH + 2,5 mL EtOH)
Aamostra =
indica a absorbância para a amostra
Os controles positivos foram as soluções dos padrões: ácido ascórbico, butilhidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT). Os ensaios foram realizados em
triplicata e os resultados foram expressos em CE50, onde os valores foram
calculados por regressão linear.
Co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico
O segundo método utilizado foi o método da inibição da co-oxidação do
sistema β-caroteno/ácido linoleico. Esse método é baseado na perda da coloração
amarela do β-caroteno, devido à sua reação com os radicais formados pela oxidação
do ácido linoléico através da aeração do meio (SANTANA et al., 2012). A taxa de βcaroteno pode ser retardada na presença de antioxidantes. Deste modo preparou-se
o meio oxidante, no qual foram dissolvidos 2 mg de β-caroteno em 10 mL de
clorofórmio e foram adicionados a 2 mL desta solução 40 mg de ácido linoléico e 400
mg de Tween 40. O clorofórmio foi evaporado sob vácuo a 40 °C e 100 mL de água
destilada foram adicionados. Em seguida, a mistura foi agitada vigorosamente
durante 2 minutos, conferindo a oxidação do meio. As soluções dos padrões (ácido
ascórbico, BHA e BHT) e das amostras em estudo foram preparadas em etanol na
concentração de 1 mg/mL. Em seguida transferiu-se 0,120 mL da solução dos
padrões/extratos/frações para uma cubeta, logo após adicionou-se 3,0 mL do meio
oxidante. A absorbância foi medida imediatamente a 470 nm e, em seguida, as
amostras foram incubadas em banho-maria, a 50 °C, durante 2 horas, quando a
absorbância foi medida novamente.
77
O controle positivo deste teste foram os seguintes padrões: ácido ascórbico,
BHT e BHA. No controle negativo, os extratos foram substituídos por um volume
igual de etanol. A porcentagem de atividade antioxidante (%) foi avaliada em termos
de branqueamento do β-caroteno utilizando a seguinte fórmula:
𝐴𝐴 % = 100 𝑥 [1 −
(𝐴0 − 𝐴1 )
⁄(𝐴0 − 𝐴0 )]
0
1
AA % = será avaliada pelo efeito do aditivo em relação ao branco, onde:
A0= absorbância inicial da amostra e padrões
A1= absorbância final da amostra e padrões
A00= absorbância inicial do branco
A1 0= absorbância final do branco
Os dois ensaios de atividade antioxidante foram realizados em triplicata.
4.10. Avaliação da atividade antibacteriana
Os extratos e frações que apresentaram maior atividade antioxidante e maior
quantidade de fenóis e flavonoides totais foram submetidos à avaliação da atividade
antibacteriana. A atividade antibacteriana foi avaliada para as seguintes amostras:
extrato etanólico (EtOH) e as frações acetato de etila (St-AcOEt) e metanólica (StMeOH) das cascas, folhas e talos.
Para avaliação da atividade antibacteriana, utilizou-se as cepas bacterianas
de referência obtidas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
(INCQS/FIOCRUZ – Brasil). Os microrganismos utilizados foram: Bacillus cereus
(ATCC 11778), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Klebsiella pneumoniae (ATCC
13883), Salmonella enterica (ATCC 10708), Serratia marcescens (ATCC 13880),
Shigella flexneri (ATCC 12022) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
A avaliação da atividade antibacteriana foi determinada através de dois
métodos, o de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida
Mínima (CBM). O efeito antibacteriano foi avaliado pelo método de microdiluição
(SANTANA et al., 2012), como recomendado pelo The National Committee for
78
Clinical Laboratory Standards (CLSI, 2003). Primeiramente uma solução mãe de 25
mg/mL dos extratos foi preparada utilizando uma solução aquosa de DMSO a 20%
(v/v). Em seguida transferiu-se 200 μL desta diluição para a microplaca contendo
200 μL de Muller-Hinton. Em seguida, diluições seriadas foram realizadas,
resultando em concentrações de 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39 e 0,195 e 0,0975
mg/mL dos extratos etanólicos e das frações. Para a substância St-02, foi preparada
uma solução mãe de 2 mg/mL, que após diluições seriadas, resultou em
concentrações de 1,0; 0,5; 0,025. 0,0125; 0,0062; 0,0031; 0,0015 e 0,0007 mg/mL.
O inóculo contendo 5 x 105 UFC/mL (0,5 na escala de McFarland) foi adicionado a
cada poço. Foram reservados poços nas microplacas para controle de esterilidade
do caldo, de crescimento bacteriano e da ação do antimicrobiano de referência
(Gentamicina). Para a gentamicina foi usada uma concentração inicial de 1,6 mg/mL,
a qual foi diluída para concentrações de 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125
mg/mL. As microplacas foram incubadas sob condições de aerobiose durante 18-24
horas a 37 °C, quando 10 μL de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (CTT) a 2% foram
adicionados a cada poço para a detecção da mudança de cor do CTT (incolor) para
vermelho, que reflete o metabolismo bacteriano ativo. A CIM foi definida com a
concentração mais baixa do extrato que visivelmente inibiu o crescimento
bacteriano.
Para determinar a CBM, alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada um dos
poços do ensaio anterior contendo os extratos e transferidas para placas de Petri
contendo ágar Muller-Hinton. As placas foram incubadas durante 24 horas a 37 °C.
O surgimento de colônia de bactéria para uma dada concentração indica que essa
não foi capaz de matar 99,9% ou mais do inoculo bacteriano utilizado. Os ensaios
foram realizados em triplicata.
4.11.
Quantificação
por
CLAE-FR
do
flavonoide
quercetina
3-O-α-L-
tuberosa
O extrato etanólico das cascas, folhas e dos talos foram analisados através
da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa (CLAE-FR)
com objetivo de quantificar a rutina nas três partes da planta estudadas.
79
Preparação das amostras
Preparou-se soluções dos extratos etanólicos (Folhas, Talos e Cascas) em
metanol na concentração de 1 mg/mL.
O padrão da rutina foi utilizado para a obtenção da curva de calibração. O
mesmo foi solubilizado em metanol em diferentes concentrações (6,0; 12,0; 24,0;
36,0; 48,0; 60 µg/mL).
Todos os procedimentos de preparação de amostras foram realizados em
triplicata.
Condições da análise
As condições utilizadas na análise foram baseadas na metodologia descrita
por Silva e colaboradores (2012).
A análise por CLAE foi realizada utilizando uma coluna octadecilsilano (250 x
4,6 mm, 5 µm, Ascentis® C18, Marca Supelco®) na temperatura de 37°C, o sistema
de eluição utilizado foi uma proporção de uma mistura de solventes A:B (A: Solução
aquosa de ácido fosfórico a 3%, pH ≅ 3,0; B: Acetonitrila), os gradientes de eluição
estão descritos na tabela 8, p.80. O fluxo da coluna foi de 1,25 mL/min e o volume
injetado das amostras e do padrão foi de 20 µL e com detecção no comprimento de
onda 350 nm.
Tabela 8. Gradientes de eluição utilizado na análise por CLAE
Tempo (min)
A (%)
B (%)
0
80
20
12
80
20
17
60
40
23
60
40
25
20
80
4.12. Análise estatística
As análises foram realizadas em triplicata, e os resultados foram tratados no
programa GraphPad Prism® versão 5.0 e expressos como média ± desvio padrão
(DP). Valores foram considerados significativamente diferentes quando p <0,05.
80
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Perfil fitoquímico preliminar dos extratos e frações
A triagem fitoquímica preliminar teve como objetivo identificar a presença das
principais classes de metabólitos secundários nos extratos ou frações analisadas
(Tabela 9, 10 e 11, p.82-83). Em todas as amostras analisadas observou-se a
ausência de saponinas, entretanto os flavonoides apareceram na maioria das
amostras analisadas. A presença de flavonoides corrobora com informações
descritas na literatura de que os flavonoides, principalmente os biflavonoides, são
considerados a classe de metabólitos secundários mais frequente na família
Anacardiaceae.
Tabela 9. Identificação das principais classes de constituintes do extrato etanólico
(St-EtOH), extrato hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e
St-MeOH) das cascas.
Classe química
St-Hex1
Alcaloides
Cumarinas
Derivados
antracênicos
Flavonoides e
taninos
Mono e diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
+
StEtOH
-
-
Saponinas
St-Hex
St-CHCl3
St-AcOEt
St-MeOH
-
-
-
-
+
-
-
++
-
+
++
+
+
+++
+
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
(-): ausência do constituinte, (+) presença do constituinte, (++): presença moderada do constituinte,
(+++):presença elevada do constituinte.
82
St-MeOH) das folhas.
Classe química
St-Hex1
Alcaloides
Cumarinas
Derivados
antracênicos
Flavonoides e
taninos
Mono e
diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
-
StEtOH
-
-
Saponinas
St-Hex
St-CHCl3
St-AcOEt
St-MeOH
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
++
-
-
+
+++
-
-
+
-
-
+++
-
-
-
++
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
(+++): presença elevada do constituinte.
St-MeOH) dos talos.
Classe química
St-Hex1
Alcaloides
Cumarinas
+
-
StEtOH
-
Derivados
antracênicos
-
Flavonoides e
taninos
Mono e
diterpenos
Naftoquinonas
Triterpenos e
esteroides
Saponinas
St-Hex
St-CHCl3
St-AcOEt
St-MeOH
-
-
-
+
-
-
-
-
+++
-
-
-
-
-
+++
++
++
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
(+++): presença elevada do constituinte.
83
5.2. Composição dos óleos fixos
A tabela 12, p.86 mostra o tempo de retenção (min) e a área do pico (%) no
cromatograma de cada constituinte que foi identificado nos óleos fixos obtido a partir
da espécie S. tuberosa. A figura 14, p.84 mostra o cromatograma correspondente a
análise cromatográfica (CG-MS) do óleo fixo obtido das cascas, que permitiu à
identificação de 17 constituintes diferentes, dos quais o composto fenólico 3-npentadecilfenol (44,91%) foi o constituinte majoritário. O triterpeno espinaceno
(4,72%), os esteroides γ-sitosterol (4,95%), stigmast-4-en-3-ona (2,75%) e o 5αstigmastano-3,6-diona (1,54%) também foram identificados.
Figura 14. Cromatograma de íons totais do óleo fixo das cascas de Spondias
tuberosa
Na análise do óleo fixo obtido das folhas observou-se no cromatograma
(Figura 15, p.85) a presença de 18 constituintes diferentes. Os constituintes
majoritários foram o hidrocarboneto n-Tetratetracontano (38,17%) e 2,2-Dimetil-3Vinil-Biciclo [2.2.1] Heptano (13,53%). Também foram identificadas nesta amostra as
seguintes substâncias: 3-n-pentadecilfenol (10,1%), o triterpeno lupeol (4,25%) e os
triterpenoides β-amirina (1,00%), β-friedelanol (2,90%) e friedelina (1,95%).
84
Figura 15. Cromatograma de íons totais do óleo fixo das folhas de Spondias
tuberosa
O cromatograma obtido da análise do óleo fixo dos talos (Figura 16, p.85)
mostra a presença de 18 constituintes. Dentre eles estão o hidrocarboneto ntetratetracontano (28,57%) e o esteroide γ-sitosterol (11,35%), como os constituintes
majoritários, e os constituintes 3-n-pentadecilfenol (2,46%), lupeol (9,92%), β-amirina
(1,51%), β-friedelanol (1,06%) e friedelina (1,06%) também foram identificados.
Figura 16. Cromatograma de íons totais do óleo fixo dos talos de Spondias tuberosa
85
Tabela 12. Composição química dos óleos fixos das cascas (OFC), folhas (OFF) e
talos (OFT) de Spondias tuberosa.
Constituinte
Tempo de retenção
(min)
(%)
OFC
OFF
OFT
2,86
1,06
4,59
4,96
1,04
1,25
4,38
2,77
4,60
3,42
2,20
5,05
3,17
1,21
1,31
0,94
1,76
6,20
4,00
2,23
2,83
6,41
2,70
0,74
49,15
64,19
54,53
59,53
42,23
42,39
68,56
42,23
43,33
42,47
42,46
36,99
30,07
72,65
4,72
4,25
-
9,92
-
73,25
61,36
-
1,00
2,90
1,95
1,51
1,06
1,06
72,31
75,63
76,03
4,95
2,75
1,54
-
11,35
-
71,63
74,17
77,80
-
13,53
3,30
57,91
1,95
-
1,20
3,54
2,18
38,17
28,57
4,61
6,95
58,84
67,90
44,91
10,1
2,46
58,31
4,34
-
-
67,92
2,92
-
-
72,11
3,69
-
-
73,35
Benzeno-1,2,4-tricarboxilato de
tris(2-etil-hexila)
0,72
4,14
1,93
74,45
Hexanoato de hexila
-
-
9,71
17,10
Éster metílico do ácido
Eicosanoico
Hexacosanoico
Docosanoico
Tetracosanoico
Linoleico
α- Linolênico
Octacosanoico
Linoleico
Esteárico
11 - Octadecenoico
Oleico
Palmítico
Tetradecanoico
Triacontanóico
Triterpenos
Lupeol
Espinaceno
Triterpenoides
β-amirina
Friedelan-3β-ol
Friedelina
Esteroides
γ-sitosterol
Stigmast-4-en-3-ona
5α-Estigmasta-3,6 - diona
Hidrocarbonetos
2,2-Dimetil-3-Vinil-Biciclo
[2.2.1] Heptano
n-Decano
n-Tetradecano
n-Tetratriacontano
n-Tetratetracontano
Compostos fenólicos
3-n-pentadecilfenol
Outros constituintes
Pentafluoropropionato de
octatriacontila
1-Hexacosanol
Acetato de 4α,14-Dimetil9β,19-cyclo-5α-ergost-24(28)en-3β-ol
86
Nos três óleos fixos da espécie S. tuberosa foram identificados os ésteres
metílicos correspondentes aos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: palmítico
esteárico e triacontanoico. Os ácidos palmítico e esteárico foram identificados na
semente da fruta do umbuzeiro por BORGE e colaboradores (2007). Estes ácidos
podem estar relacionados com a origem das cadeias alquílicas longas presentes nos
lipídios fenólicos, tais como o 3-n-pentadecilfenol que foi identificado na espécie em
estudo e, anteriormente isolado da espécie Anacardium occidentale, espécie que
também pertence à família Anacardiaceae (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006). O 3-npentadecilfenol (Figura 17, p.87) é considerado um lipídio fenólico, um fenol ou ainda
um alquilfenol de cadeia longa, esse composto está presente no líquido da castanha
de caju (LCC) como um dos seus constituintes que é denominado de cardanol.
Figura 17. Estrutura química do 3-n-pentadecilfenol
HO
O LCC é um subproduto da agroindústria do caju e uma importante fonte
vegetal de compostos fenólicos alquil substituídos, cujo anel aromático possui uma
cadeia lateral na posição meta com 15 átomos de carbono. Essa cadeia lateral
alifática pode ser saturada, ou ainda com uma, duas ou três insaturações, não
apresentando nenhuma conjugação entre as mesmas. O LCC pode ser obtido
através de duas técnicas: na primeira utiliza-se um solvente orgânico para sua
extração, o produto obtido denomina-se LCC natural, enquanto na segunda, o
líquido é obtido através do cozimento da castanha no próprio LCC, originando o LCC
técnico. A principal diferença entre os dois tipos de LCC diz respeito ao constituinte
majoritário, no LCC natural o ácido anacárdico encontra-se em maior quantidade,
enquanto no LCC técnico, o cardanol é o principal constituinte. Este fato deve-se a
utilização de altas temperaturas (180 – 300°C) no processo de extração do LCC
técnico ocasionando a descarboxilação do ácido anacárdico transformando-o em
cardanol (Figura 18, p.88) (OLIVEIRA, 2007).
87
O cardanol apresenta-se como uma substância promissora, uma vez que
existem vários estudos relacionados com as suas múltiplas propriedades. Isto devese ao fato que uma vez funcionalizado, apresenta-se como uma excelente
alternativa sintética. Sob o ponto de vista químico, destaca-se a existência do grupo
fenol e a presença da cadeia lateral alifática com caráter lipofílico, o que confere a
seus derivados a solubilidade necessária no combustível diesel. Outra característica
relevante do cardanol é o fato dele privilegiar os processos ecologicamente corretos,
uma vez que é oriundo de fonte renovável (obtido da castanha de caju) e ser
biodegradável. O cardanol, um produto vegetal, degrada-se 96% em 28 dias,
apresenta solubilidade em água igual a 1,0 g/L e índice de toxicidade aguda (peixes)
menor que 11,0 g/L (OLIVEIRA, 2007).
Figura 18. Reação de descarboxilação do ácido anacárdico
OH
OH
COOH
R

R
Os lipídios fenólicos apresentam muitas atividades biológicas comprovadas,
tais atividades podem estar relacionadas com a estrutura dessas substâncias, pois
apresentam regiões hidrofílicas e hidrofóbicas que geralmente confere um caráter
anfipático. Esta característica permite que os lipídios fenólicos sejam facilmente
incorporados em membranas celulares, causando mudanças em sua estrutura e
propriedades. O efeito estabilizador dos lipídios fenólicos e derivados em
membranas também é o resultado da interação dos grupos hidroxílicos do anel
aromático com fosfolipídios por meio de ligações de hidrogênio. As cadeias
alquílicas também exercem influência significativa na atividade biológica, esta
influência pode estar relacionada com o aumento da solubilidade das porções
fenólicas nas regiões lipídicas, nas quais é requerida proteção contra degradação
biológica ou oxidação química (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006).
Além do lipídio fenólico identificado dentre os compostos presentes nos óleos
fixos, destacam-se também outros constituintes que apresentam atividades
88
biológicas importantes, entre eles estão o esteroide γ-sitosterol que apresenta
atividade anti-hiperglicêmica (BALAMURUGAN; DURAIPANDIYAN; IGNACIMUTHU,
2011), o triterpeno lupeol que possui diversas atividades farmacológicas dentre elas
estão as atividades anti-inflamatória e antimicrobiana (SIDDIQUE; SALEEM, 2011).
Destacam-se também os terpenoides β-amirina e friedelina que apresentaram efeito
antinociceptivo no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético
(FILHO, 2000 e NOLDIN; ISAIAS; FILHO, 2006).
5.3. Caracterização estrutural das substâncias St-01, St-02 e St-03
Caracterização parcial da substância St-01
A substância St-01 (4,8 mg) apresentou-se como um precipitado amorfo com
a coloração marrom claro e solúvel em dimetilsulfóxido (DMSO). A partir dos dados
obtidos de RMN
13C
e 1H (Tabela 13, p.94) foi possível propor a estrutura (Figura 19,
p.90) denominada 2,4,6-trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ona.
O espectro de RMN de
13C/DEPT
Q (125 MHz, DMSO) (Figura 20, p.91)
revelou a presença de seis sinais, sendo que um destes sinais corresponde a dois
carbonos, totalizando assim sete carbonos. Dentre estes sinais, quatro são
referentes a carbonos não hidrogenados, dois a carbonos metínicos (CH) e um a
carbono metilênico (CH2). Os C-2 (δ 168,08) e C-6 (δ 172,38) apesar de estarem no
mesmo ambiente químico apresentam valores de deslocamentos diferentes, tal
diferença pode estar relacionada com dois efeitos, o primeiro é a provável quelação
entre a hidroxila do C-6 e a carbonila, o que iria conferir ao C-6 um efeito de
desproteção, aumentando assim o valor do deslocamento; já o segundo efeito seria
o equilíbrio tautomérico entre a cetona e o grupo enol, esse efeito explicaria o fato
dos valores de deslocamento dos C-1 (δ 174,65), C-2 (δ 168,08) e C-3 (δ172,38)
estarem próximos um do outro.
O espectro de RMN de 1H de St-01 (Figuras 21 e 22, p. 91 e 92) apresentou
um sinal para dois hidrogênios ligados a carbonos metínicos em δH 4,90 (s, H-3 e H5); três sinais para hidrogênios de hidroxila δH 7,14 (s, H-2 e H-6), δH 3,70 (s, H-7) e
δH 3,17 (s, H-4); e dois hidrogênios ligados a um carbono metilênico δ H 3,01 (d, J =
17,4 Hz, H-7) e δH 2,42 (d, J = 17,4 Hz, H-7). Os sinais dos hidrogênios (δH 3,01 e
89
2,42) ligados ao C-7 possuem valores de deslocamento diferentes, tal diferença
pode ser justificada pela posição destes hidrogênios no espaço e, por serem
considerados enantiotópicos, ou seja, estão ligados a um carbono pró-quiral, pois
ele se tornará centro de quiralidade (um carbono assimétrico) caso um desses
hidrogênios seja substituído por qualquer outro átomo ou grupo de átomos.
Figura 19. Estrutura proposta para St-01
H
7
HO
H
OH
3
HO
2
4
5
1
6
OH
O
A correlação entre os hidrogênios observada no espectro COSY (Figura 23 e
24, p. 92 e 93) confirmou o acoplamento entre os sinais em δH 3,01 (H-7) com δH
2,42 (H-7), conforme mostra a tabela 13, p.94.
Através do experimento de HSQC (Figura 25, p. 93) foi possível fazer as
seguintes correlações entre o δH 4,90 (H-3 e H-5) com δC 82,31 (C-3 e C-5); δH 2,42
(H-7) e δH 3,03 com δC 41,87.
No espectro de HMBC (Figura 26, p.94) observou-se as seguintes correlações
δH 2,42 (H-7) com δC 82,31 (C-3 e C-5) e δC 79,28 (C-4), e do δH 3,01 (H-7) com o δC
79,28 (C-4) (Figura 22, p.90).
90
Figura 20. Espectro de RMN de 13C/DEPT Q de St-01 (DMSO, 125 MHz)
Figura 21. Espectro de RMN de 1H de St-01 (DMSO, 500 MHz)
91
Figura 22. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 2,0-5,2 de St-01 (DMSO, 500
MHz)
Figura 23. Espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01 (DMSO, 500 MHz);
92
Figura 24. Expansão do espectro de correlação 1H x1H- COSY de St-01 (DMSO,
500 MHz)
Figura 25. Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-01 (DMSO, 500 MHz, 125
MHz)
93
Figura 26. Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-01 (DMSO, 500 MHz, 125
MHz.
Tabela 13. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) referentes à substância
St-01
H x 1H –
1
H x 13C – HMQC
1
Posição
H x 13C – HMBC
1
COSY
C
C
H
1
174,65
-
-
-
-
2
168,08
-
-
-
-
4
79,28
6
172,38
-
-
-
-
3
82,31
4,90
-
Ha-7
-
5
82,31
4,90
-
-
-
-
-
2
JCH
3
JCH
Ha-7
Hb-7
CH
CH2
7
41,87
H: 2,42 (d, J = 17,4 Hz)
H: 3,03 (d, J = 17,4 Hz)
H7
H7
94
Com base nos dados espectrais propõe-se que St-01 trata-se da 2,4,6trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ona, não foram encontrados relatos de
isolamento para a substância proposta. No entanto, foi encontrado dados na
literatura do isolamento de derivados do quinol da espécie Ajuga parviflora (AKBAR;
NAWAZ; MALIK, 2001) que apresenta algumas semelhanças estruturais com a
substância St-03 (Figura 27, p.95), a estrutura do composto 2 apresenta uma
estrutura que mais aproxima-se da estrutura proposta para St-01, porém seus dados
de RMN 13C e 1H não são iguais aos dados de RMN de St-01 (Tabela 14, p.95).
Figura 27. Derivados do quinol isolados da espécie Ajuga parviflora.
O
O
1
6
5
4
R3
2
5
3
3
4
OR2
R1
1
6
2
CH 2COOH
HO
2
1
Composto 1: R1 = CH3; R2 = β-D-glucopiranosídeo; R3 = OH
Composto 1a: R1 = CH3; R2 = H; R3 = OH
Tabela 14. Dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) em CDCl3 referentes
ao composto 2 (AKBAR; NAWAZ; MALIK, 2001).
H x 13C – HMQC
1
Posição
C
C
H
1
186,5
-
4
73,2
-
1’
179,2
-
2
128,3
6,41 (d, J = 10,5 Hz)
3
148,1
6,94 (d, J = 10,5 Hz)
5
148,1
6,94 (d, J = 10,5 Hz)
6
128,3
6,41 (d, J = 10,5 Hz)
43,2
2,71 (s)
CH
CH2
2’
95
Os quinóis e seus derivados são compostos que apresentam poucos estudos
relatados na literatura, porém os poucos estudos demonstram que trata-se de uma
classe de substância promissora na busca de novas moléculas bioativas. Os quinóis
estão se desenvolvendo como uma classe de compostos com potencial anticâncer e
também têm mostrado atividade contra o parasita Trypanosoma brucei, o organismo
causador da doença do sono ou tripanossomíase africana (CAPES et al., 2012).
Caracterização estrutural da substância St-02
A substância St-02 (93,2 mg) foi isolada com aparência de pó amarelo,
solúvel em metanol. O ponto de fusão foi medido, apresentando 177 – 179 ºC. A
substância apresentou fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda de
254 e 365 nm e Rf: 0,58 no sistema de eluição acetato de etila: metanol (75:25).
A análise das bandas de absorção na região do ultravioleta da substância St02 em solução metanólica foi realizada a partir das leituras das absorbâncias obtidas
nos comprimentos de onda 220 a 400 nm. A partir dos dados obtidos plotou-se um
gráfico da absorbância versus o comprimento de onda (Figura 28, p.97). O perfil UVvis da substância apresentou absorções em 258 e 358 nm, indicativo da presença
de flavonoide. Estudos sobre flavonoides por espectrofotometria UV revelaram que a
maioria das flavonas e flavonóis exibem duas grandes bandas de absorção: Banda I
(320-385 nm) que representa a absorção anel B, enquanto Banda II (250-285 nm)
correspondente à absorção do anel A (YAO et al., 2004). Com esses resultados e
através da comparação com os dados da literatura foi possível supor que a
substância tratava-se do flavonol denominado rutina, pois este flavonoide possui os
seguintes valores nas bandas de absorção 258 e 354 nm (MOURA; VILEGAS;
SANTOS, 2011).
96
Figura 28. Gráfico com os picos de absorção da substância St-02 na região do
ultravioleta.
O espectro obtido na região do infravermelho da substância St-02 (Figura
29, p.97 e 98) exibiu bandas de absorção que sugeriram a presença dos seguintes
grupos funcionais que são característicos das estruturas dos flavonoides: hidroxila
(3428 cm-1), ligações carbono-hidrogênio (2937 cm-1), carbonila quelada (1654 cm-1),
ligação simples carbono-oxigênio (1204 cm-1) e a presença de anel aromático (1598
e 1457 cm-1). Os dados obtidos no experimento foram comparados com os dados da
literatura (MOURA; VILEGAS; SANTOS, 2011).
Figura 29. (A) Espectro na região do infravermelho (IV) de St-02 em pastilha de KBr;
(B) e (C) Expansões do espectro do IV.
A
97
B
C
98
Os dados obtidos através dos espectros de RMN foram comparados com os
dados da literatura (OLIVEIRA et al., 2013), como pode ser observado na tabela 15,
p. 106-107. Diante dos dados obtidos no RMN, no UV e no IV foi possível identificar
que a substância St-02 tratava-se de um flavonol denominado de rutina (quercetina
3-O-α-L-ramnopiranosil(1’’’→ 6’’)-β-glucopiranosídeo) (Figura 30, p.99).
Figura 30. Estrutura química de St-02.
A análise do espectro de RMN de 1H (Figuras 31, 32 e 33, p.101-102) da
substância mostrou cinco sinais para hidrogênios aromáticos. Os dois dupletos em
δH 6,21 (J=1,95 Hz, 1H) e 6,39 (J=1,92 Hz, 1H) foram atribuídos aos hidrogênios H-6
e H-8, do anel A, respectivamente. Os dupletos em δH 7,67 (J=1,98 Hz, 1H) e 6,87
(J=8,43 Hz, 1H) e o duplo dubleto δH 7,61 (J=8,43 e 2,04 Hz, 1H) correspondem aos
hidrogênios H-2’, H-5’ e H-6’, do anel B, respectivamente. Observou-se ainda sinais
múltiplos na região entre δH 3,25 a 3,81 que sugerem a presença de duas unidades
glicosídicas. O dupletos em δH 5,10 (J=7,4 Hz, d) e 4,52 (J=1,0 Hz, d) foram
assinalados para hidrogênios anoméricos H-1’’ e H-1’’’. A primeira unidade
glicosídica foi identificada como glicose devido a presença de um dupleto referente
99
aos hidrogênios metilênicos em δH 3,81 e 3,40. E o dupleto em δH 1,12 (J=6,2 Hz,
3H) assinalado para hidrogênios metílicos indicam a ramnose como segunda
unidade glicosídica.
13C
(Figura 34, p.102) apresentou vinte e sete sinais.
Através do experimento DEPT 135 (Figura 35, p.103) identificou-se quinze carbonos
metínicos e um carbono metilênico. O espectro apresentou também sinais
característicos para os carbonos anoméricos das duas unidades glicosídicas (δC
104,88 e 102,57), verificou-se ainda um sinal de carbono metilíco em δC 18,02 (C6’’’) confirmando a presença da unidade glicosídica da ramnose.
No espectro COSY (Figura 36, p.103) confirmaram-se os acoplamentos orto
entre o δH 6,87 (H-5’) com δH 7,61 (H-6’). Foi possível também observar as várias
correlações referentes a acoplamentos vicinais entre os hidrogênios da porção
osídica.
No HSQC (Figuras 37 e 38, p.104) mostrou correlações diretas do δH 5,10 (H1’’) com δC 104,88 e δH 4,52 (H-1’’’) com δC 102,57 justificando a presença de duas
unidades glicosídicas. Foi possível também identificar outras correlações diretas de
δH 7,61 (H-6’) com δC 123,71; δH 7,67 (H-2’) com δC 117,85; δH 6,87 (H-5’) com δC
116,22; δH 6,21 (H-6) com δC 100,19; δH 6,39 (H-8) com δC 95,08.
Com as correlações apresentadas no espectro de HMBC (Figuras 39 e 40,
p.105) entre δH 5,10 (H-1’’) com δC 135,77 (C-3) e δH 4,52 (H-1’’’) com δC 68,72 (H6’’) foi possível identificar a posição das unidades glicosídicas e ainda outros grupos
como por exemplo δH 6,39 (H-8) com δC 158,68 (C-9). As correlações entre δH 7,61 e
7,67 (H-6’ e H 2’) com δC 159,47 (C-2), sendo esta última correlação a única que não
foi condizente com o da literatura consultada (OLIVEIRA, 2013). A figura 40, p.105,
mostra as principais correlações na estrutura que ajudaram identificar a posição das
unidades glicosídicas e de outros grupos.
100
Figura 31. Espectro de RMN de 1H de St-02 (MeOD, 300 MHz).
Figura 32. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 4,5-7,8 de St-02 (MeOD, 300
MHz).
101
Figura 33. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 3,2-3,9 de St-02 (MeOD, 300
MHz)
Figura 34. Espectro de RMN de 13C de St-02 (MeOD, 75 MHz).
102
Figura 35. Espectro de RMN DEPT 135 de St-02 (MeOD, 75 MHz).
Figura 36. Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-02 (MeOD, 300 MHz).
103
104
Figura 37. Espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02 (MeOD, 300 MHz e
75 MHz).
Figura 38. Expansão do espectro de correlação 1H x 13C- HSQC de St-02 (MeOD,
300 MHz e75 MHz).
105
Figura 39. Espectro de correlação 1H x 13C- HMBC de St-02 (MeOD, 75 MHz e
50 MHz).
Figura 40. Expansão do espectro de correlação 1H x
75 MHz e 50 MHz).
13C-
HMBC de St-02 (MeOD,
(Anacardiaceae)
106
106
Tabela 15. Comparação dos dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) referentes à substância St-02 com dados da
literatura.
1H x 1H –
1H x 13C – HMQC
1H x 13C – HMQC
1H x 13C – HMBC
Posição
COSY
Rutina*
C
C
H
C
H
2
159,47
-
-
-
158,69
-
3
135,77
-
-
H-1’’
-
136,72
-
4
179,54
-
-
-
-
179,61
-
5
163,11
-
H-6
-
-
162,17
-
7
166,40
-
H-8, H-6
-
-
167,19
-
9
158,68
-
H8
-
-
159,51
-
10
105,73
-
-
H-6, H-8
-
106,06
-
1’
123,29
-
H-2’, H-6’
H-5’
-
123,30
-
3’
145,99
-
H-2’
H-5’
-
146,02
-
4’
149,96
-
H-5’
-
150,45
-
6
100,19
6,21 (d, J = 1,95)
-
H-8
-
100,10
6,22 (d, J=2,0 Hz)
8
95,08
6,39 (d, J = 1,92)
-
H-6
-
95,01
6,41 (d, J=2,0 Hz)
2’
117,85
7,67 (d, J = 1,98)
-
H-6’
-
117,84
7,67 (d, J=2,0 Hz)
2J
CH
3J
CH
H-2’, H6’
H-2’, H6’
CH
Continua
107
Continuação (Tabela 15)
5’
116,22
6,87 (d, J = 8,43)
-
-
-
116,22
6,88 (d, J=8,5 Hz)
6’
123,71
7,61 (dd, J = 2,04; 8,43)
H-5’
H-2’
-
123,70
7,63 (dd, J=2,0 e 8,5 Hz)
1’’
104,88
5,10 (d, J = 7,41)
-
-
-
104,85
5,11 (d, J=7,8 Hz)
2’’
75,88
3,25-3,64 (m)
-
-
-
75,90
3,26-3,48 (m)
3’’
77,37
3,25-3,64 (m)
-
-
-
77,41
3,26-3,48 (m)
4’’
71,56
3,25-3,64 (m)
-
-
-
71,57
3,26-3,48 (m)
5’’
78,35
3,25-3,64 (m)
-
-
-
78,36
3,26-3,48 (m)
1’’’
102,57
4,52 (d, J = 0,99)
-
-
-
102,58
4,52 (d, J = 1,8 Hz)
2’’’
72,25
3,64 (dd, J = 1,5; 3,15)
H-1’’’
-
-
72,27
3,63 (dd, J = 1,8; 3,5)
3’’’
72,41
3,53 (dd, J = 3,36; 9,42)
-
H-1’’’
-
72,41
3,54 (dd, J = 3,5; 9,5 Hz)
4’’’
74,10
3,27 (m)
H-5’’’
H-2’’’
-
74,10
3,27 (m)
5’’’
69,86
3,40 (m)
H-4’’’, H-6’’’, H-3’’’
H-1’’’
-
70,59
3,44 (m)
-
H-1’’’
-
68,72
CH2
6’’
68,72
α: 3,36 (m)
β: 3,81 (d, J = 10,32)
CH3
6’’’
α: 3,39 (m)
β: 3,81 (dt, J = 10,9)
18,02
1,12 (3H, d, J = 6,18)
-
-
-
18,02
1,12 (3H, d, J = 6,1 Hz)
(Anacardiaceae)
O espectro de massas (Figura 41, p.108) da substância obtido por impacto
eletrônico foi analisado com objetivo de confirmar a massa da substância St-02. No
entanto, não foi possível observar o pico do íon molecular com razão massa/carga
(m/z) de 610, mas observou-se o pico do íon molecular em 302, confirmando assim
a aglicona do flavonoide proposto, como sendo a quercetina.
Figura 41. Espectro de massas da St-02
Relatos na literatura descrevem o isolamento da quercetina e de seus
derivados nos seguintes gêneros da família Anacardiaceae: Lanea, Schinus,
Sclerocaya, Pistacia, e Schinus. A rutina já foi identificada na espécie Rhus corlaria
(LOO; BRUYN; VERZELE, 1988), nas espécies Spondias tuberosa e Spondias
mombin a rutina foi identificada e isolada (SILVA et al., 2011).
O isolamento da rutina da fração metanólica justifica as atividades
antibacteriana e antioxidante, e os altos teores de fenóis e flavonoides apresentados
por esta fração.
108
(Anacardiaceae)
Caracterização estrutural da substância St-03
A substância St-03 (14,6 mg) foi isolada com aparência de resina de cor
amarela, solúvel em clorofórmio. A substância apresentou fluorescência sob luz
ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm e Rf: 0,64 no sistema de eluição
clorofórmio: acetato de etila (75:25). A partir dos dados obtidos de RMN de
13C
e 1H
foi possível propor a estrutura (Figura 42, p.109) denominada Trans-p-cumarato de
eicosanila. Os dados (Tabela 16, p.118) foram comparados com os dados da
literatura (MAHMOOD et al., 2003).
Figura 42. Estrutura proposta para a substância St-03
H
H
6
5
O
H
7
1
9
8
2
HO
4
3
1'
2' - 19'
20'
O-CH 2-(CH 2)18 -CH 3
H
H
H
Na análise do espectro de RMN de 1H (Figuras 43, 44, 45 e 46, p. 111-112) da
substância observou-se um duplo dupleto em δH 7,41 e 6,82 sugerindo a presença
de um anel aromático 1,4-dissubstituído. O dupleto δH (7,41; J=5,0 Hz) foi atribuído
aos hidrogênios H-2 e H-6; já o dupleto em δH (6,82; J=5,0 Hz) atribuiu-se aos
hidrogênios H-3 e H-5. Os dois dupletos em δH (7,64 e 6,28) correspondem aos
hidrogênios olefínicos H-7 e H-8, a constante de acoplamento de 15,0 Hz entre os H7 e H-8 confirmou a geometria trans da molécula. O próton H-7, ligado ao carbono
que carrega o anel fenila, apresenta maior deslocamento químico (δ 7,64), uma vez
que este reside no carbono-β mais pobre de elétrons do sistema α, β-insaturado,
além de estar em uma área desblindada no campo anisotrópico gerado pelos
elétrons 𝜋 do anel aromático Foi observada ainda a presença de um tripleto
correspondente a um carbono metilênico ligado a um átomo de oxigênio (-OCH2) em
δ 4,18 (J=5,0 Hz), um tripleto em δ 0,86 (J=5,0 Hz) que sugeriu a presença de uma
109
metila ligada a um carbono metilênico e sinais de prótons ligados a carbonos
metilênicos na região entre δH 2,38-1,24 Hz.
13C
(Figuras 47 e 48, p.113) apresentou vinte e nove
sinais dentre eles um sinal em δ 167,55 correspondente a uma carbonila de éster.
Através do experimento DEPT Q (Figura 49, p.114) foi possível identificar cinco
carbonos metínicos, sendo um sinal duplicado, dezenove carbonos metilênicos e um
carbono metílico.
No espectro COSY (Figura 50, p.114) confirmou-se os acoplamentos entre o
δH 6,82 (H-3) com δH 7,41 (H-2) e δH 6,28 (H-8) com δH 7,64 (H-7). Foi possível
também observar as várias correlações referentes a acoplamentos vicinais entre os
hidrogênios metilênicos.
O espectro de HSQC (Figuras 51 e 52, p.115) apresentou correlações diretas
entre o δH 7,64 e δC 144,95; δH 7,41 e δC 129,92; δH 6,82 e δC 115,86; e por fim o δH
6,28 correlacionando com o δC 114,95.
Com as correlações apresentadas no espectro de HMBC (Figuras 53, 54 e 55
p.116-117) entre os hidrogênios δH 4,16 (H-1’), 7,64 (H-7) e 6,28 (H-8) com o
carbono δC 167,55 (C-9) foi possível confirmar a posição da carbonila; já os
hidrogênios δH 7,41 (H-2 e H-6) e δH 6,82 (H-3 e H-5) correlacionaram com o
carbono δC 157,78 (C-4), sendo assim possível confirmar os valores de
deslocamento dos átomos de carbono e hidrogênio do anel aromático. Foi possível
também confirmar os deslocamentos dos últimos carbonos da cadeia alquílica
através da correlação do hidrogênio δH 0,82 (H-20) com o carbono δC 22,70 (C-29) e
δH 1,24 (C-19) com o δC 14,13 (C-20).
110
(Anacardiaceae)
Figura 43. Espectro de RMN de 1H de St-03 (CDCl3, 500 MHz).
Figura 44. Expansão do espectro de RMN de 1H δ 6,1-7,5 de St-03 (CDCl3, 500
MHz).
111
MHz).
MHz).
112
(Anacardiaceae)
Figura 47. Espectro de RMN de 13C de St-03 (CDCl3, 125 MHz).
Figura 48. Expansão do espectro de RMN de
MHz).
13C
δ 110-180 de St-03 (CDCl3, 125
113
(Anacardiaceae)
Figura 49. Espectro RMN de DEPT Q de St-03 (CDCl3, 125 MHz).
Figura 50. Espectro de correlação 1H x 1H - COSY de St-03 (CDCl3, 500 MHz).
114
Figura 51. Espectro de correlação 1H x 13C - HSQC de St-03 (MeOD, 500 MHz e
125 MHz).
500 MHz e 125 MHz).
13C
- HSQC de St-03 (MeOD,
115
Figura 53. Espectro de correlação 1H x 13C - HMBC de St-03 (CDCl3, 500 MHz e
125 MHz).
500 MHz e 125 MHz).
13C-
116
500 MHz e 125 MHz).
13C-
117
Tabela 16. Comparação dos dados de RMN de 1H (500 MHz) e
literatura.
13C
(125 MHz) referentes à substância St-03 com dados da
H x 1H –
H x 13C – HMQC
1
H x C – HMQC
1
Posição
H x C – HMBC
13
1
13
C
C
H
1
127,73
-
-
H-3, H-5 e H-8
4
157,78
-
H-3 e H-5
9
167,55
-
2
129,92
3
COSY
1
Eicosanil trans-p-cumarato *
C
H
-
125,84
-
H-2 e H-4
-
157,72
-
H-8
H-7 e H-1’
-
167,44
-
7,41 (d, J = 5,0 Hz)
-
H-6 e H-7
H-3
130,68
7,42 (d, J = 8,2 Hz)
115,70
6,82 (d, J = 5,0 Hz)
-
H-5
H-2
115,70
6,83 (d, J = 8,2 Hz)
5
115,70
6,82 (d, J = 5,0 Hz)
-
H-3
H-6
115,70
6,83 (d, J = 8,2 Hz)
6
129,92
7,41 (d, J = 5,0 Hz)
-
H-2 e H-7
H-5
130,68
7,42 (d, J = 8,2 Hz)
7
144,95
7,64 (d, J = 15,0 Hz)
-
H-2 e H-6
H-8
144,24
7,62 (d, J = 17,0 Hz)
8
114,95
6,28 (d, J = 15,0 Hz)
-
-
H-7
114,83
6,30 (d, J = 17,0 Hz)
1’
64,65
4,16 (t, J = 5,0 Hz)
-
-
-
64,65
4,18 (t, J = 6,5 Hz)
2’
28,77
1,6 (m)
-
-
-
28,75
1,68 (m)
3’ – 17’
29,08 – 29,71
1, 23 (m)
-
-
-
29,35 -29,69
1,25 (m)
18’
31,94
1,23 (m)
H-19
H-20
-
31,92
1,25 (m)
19’
22,70
1,23 (m)
H-18 e H-20
-
-
22,68
1,25 (m)
20’
14,13
0,86 (t, J = 5,0 Hz)
H-19
-
-
14,11
0,87 (t, J = 6,5 Hz)
2
JCH
3
JCH
CH
CH2
Trans-p-cumarato de eicosanila *: Valores da literatura (MAHMOOD et al.,2003)
118
Diante dos dados de RMN uni e bidimensionais e da comparação com os
dados da literatura foi possível propor que a substância st-03 tratava-se de um éster
do ácido p-cumárico denominado Trans-p-cumarato de eicosanila, porém ainda há
dúvida em relação ao tamanho real da cadeia alquílica, para a confirmação do
tamanho da cadeia faz-se necessária a realização do experimento de espectrometria
de massas.
Há relatos na literatura que já foram isolados da espécie Tapirira guianensis
(Anacardiaceae) outros ésteres derivados do ácido p-cumárico (CORREIA; DAVID;
DAVID, 2003), porém não foi encontrado nenhum relato do isolamento desse éster
na espécie Spondias tuberosa.
119
5.4. Determinação de fenóis e flavonoides totais
A determinação do teor de fenóis totais foi realizado utilizando o reagente de
Folin-Ciocalteau, este reagente consiste na mistura dos ácidos fosfomolíbdico e
fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de
oxidação 6+ (cor amarela), porém na presença de certos agentes redutores, como os
compostos fenólicos, formam-se os chamados molibdênio azul e tungstênio azul,
nos quais a média do estado de oxidação dos metais está entre 5 + e 6+, e cuja
coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras, que
não necessariamente precisam ter natureza fenólica. O ácido gálico, por exemplo,
um composto fenólico, sofre desprotonação em meio básico, gerando os ânions
fenolatos (Figura 56, p.120). A partir daí, ocorre uma reação de oxirredução entre o
ânion fenolato e o reagente de Folin-Ciocalteau, na qual o molibdênio, componente
do reagente, sofre redução e o meio reacional muda de coloração amarela para azul
(ARAÚJO, 2013). O resultado deste experimento foi expresso em miligramas de
equivalente de ácido gálico por grama da amostra (mg EqAG/g).
Figura 56. Reação do ácido gálico com molibdênio presente no regente FolinCiocalteau
COO-
COOH
Na2CO3
HO
OH
HO
OH
OH
OH
COO-
COO-
+
HO
OH
OH
2 Mo
+
6+
O
OH
OH
2 Mo5+
+
2H +
120
Dentre os compostos fenólicos destacam-se os flavonoides por apresentarem
diversas atividades biológicas importantes, diante disto fez-se necessária uma
quantificação específica para esta classe. Para tanto utilizou-se um método
colorimétrico com cloreto de alumínio (AlCl3) para tratamento das amostras a serem
analisadas. Isto porque o cátion Al3+ forma complexos estáveis com as hidroxilas
livres dos flavonoides (Figura 57, p.121), ocasionando extensão do sistema
conjugado e, consequentemente, um desvio batocrômico, ou seja, um deslocamento
dos seus máximos de absorção para regiões de maior comprimento de onda
(MARQUES et al., 2012). O resultado deste ensaio foi expresso em miligramas de
equivalentes de catequina por grama da amostra (mg EqC/g).
Figura 57. Complexo Flavonoide-Al3+
H
O
Al
3+
O
O
H
OH
O
O
Al
3+
Al
3+
O teor de fenóis e flavonoides totais das amostras estudadas está descrito na
tabela 17, p.122. Nos resultados da determinação do teor de fenóis totais pode-se
observar que o extrato etanólico dos talos apresentou maior quantidade de
compostos fenólicos (459,2 ± 21,07 mg EqAG/g), já na quantificação de flavonoides
totais destacou-se a fração St-MeOH dos talos com 129,00 ± 4,91 mg EqC/g.
O isolamento do éster do ácido p-cumárico da fração acetato de etila dos
talos justifica o alto teor de fenóis também apresentado por essa fração (314,50 ±
3,06 mg EqAG/g).
121
Tabela 17. Determinação de fenóis totais e flavonoides totais do extrato etanólico
(St-EtOH), hexânico (St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e StMeOH) das cascas, folhas e talos.
Fenóis totais
(mg EqAG/g)
Flavonoides totais
(mg EqC/g)
St-Hex1
34,53 ± 11,02
nd
St-EtOH
281,20 ± 10,58
82,35 ± 2,04
St-Hex
33,87 ± 1,16
nd
St-CHCl3
27,20 ± 8,00
nd
St-AcOEt
191,90 ± 6,43
23,02 ± 1,02
St-MeOH
355,2 ± 19,08
71,91 ± 4,54
Folhas
St-Hex1
37,87 ± 3,06
nd
70,36 ± 1,39
St-Hex
100,50 ± 12,06
18,53 ± 4,16
St-CHCl3
33,87 ± 6,43
nd
St-AcOEt
67,87 ± 16,17
37,24 ± 2,52
St-MeOH
181,2 ± 10,58
64,35 ± 1,68
Talos
St-Hex1
20,53 ± 2,31
33,25 ± 17,52
97,69 ±1,92
St-Hex
459,20 ± 21,07
33,20 ± 4,00
St-CHCl3
17,20 ±0,00
0,80 ±3,46
St-AcOEt
314,50 ± 3,06
445,90 ± 103,2
66,36 ± 3,42
Amostra
Cascas
St-EtOH
St-EtOH
St-MeOH
*nd:
não determinado
11,25 ± 4,02
nd
129,00 ± 4,91
122
5.5. Atividade Antioxidante – Sequestro do radical DPPH (2,2-difenil-1picrilhidrazil) e a Co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico
A molécula de DPPH é caracterizada como um radical livre estável em virtude
da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula. Esta
deslocalização confere a esta molécula uma coloração violeta, caracterizada por
uma banda de absorção em etanol em cerca de 520 nm. Este ensaio se baseia na
medida da capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o
radical DPPH, reduzindo-o a hidrazina (Figura 58, p.123). Quando uma determinada
substância que age como doador de átomos de hidrogênio é adicionada a uma
solução de DPPH, a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de
violeta a amarelo pálido (ALVES et al., 2010), essa reação pode monitorada por
decréscimo de absorbância em espectrofotômetro.
Figura 58. DPPH na forma radicalar (I) e na forma reduzida (II).
NO 2
O 2N
NO 2
NO 2
O 2N
NO 2
N
N
N
N
I
H
II
A partir dos resultados obtidos no espectrofotômetro determina-se a
porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de radicais livres e/ou
porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional. A porcentagem de
atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH consumida pelo
antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a
concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50),
123
também chamada de concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de
DPPH por uma amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante
(SOUSA et al., 2007).
No método do sequestro do radical DPPH, a fase St-AcOEt dos talos
apresentou o menor valor de CE50 (4,38 ± 0,21) em relação aos demais extratos,
frações e padrões testados (Tabela 18, p. 127). Este resultado pode estar
correlacionado com a quantidade significativa de fenóis (314,50 ± 3,06 mg EqAG/g)
e flavonoides (66,36 ± 3,42 mg EqC/g) encontrados nesta fração, tal atividade
também pode estar relacionada com o isolamento da substância Trans-p-cumarato
de eicosanila. A literatura descreve que este éster apresenta uma atividade
moderada no sequestro do radical DPPH, no qual 100 µg desta substância
apresenta uma atividade de 88,46% (SHAHEEN, 2011). Os compostos fenólicos
apresentam excelente atividade frente a este ensaio, tal atividade desses compostos
fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura
química. Estas características desempenham um papel importante na neutralização
ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de transição, agindo tanto na
etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo. Os intermediários
formados pela ação de antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis, devido à
ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias (SILVA et
al., 2007). Outra fração que também destacou-se no sequestro do radical livre
(DPPH) foi a fração metanólica das folhas (CE50 27,83 ± 1,12) tal atividade pode ser
justificada pelo flavonoide que foi isolado desta fração. A rutina apresentou um valor
de CE50 (7,95 ± 0,83) menor que o padrão BHT (CE50 9,56 ± 1,09). A atividade
antioxidante dos flavonoides está altamente relacionada à capacidade de doação de
elétrons. A etapa de transferência do hidrogênio tem se destacado, mas a atividade
antioxidante não depende apenas da força de energia da ligação O-H (SCOTTI et
al., 2007).
Estudos cinéticos avaliaram a capacidade antioxidante de substâncias de
derivados de flavonoides e observaram que a atividade antioxidante é potencializada
quando há grupos hidroxilas adjacentes no anel B (posições 3‘e 4‘), dupla ligação
C2-C3, conjugada ao grupo 4-oxo (C4), no anel C e presença de grupo hidroxila no
C3 do anel C. As hidroxilas em C5 e C7 do anel A são menos importantes para a
atividade antioxidante (Figura 59, p.125) (PANNALA et al., 2007). Sendo assim, essa
relação estrutura-atividade justifica a atividade da rutina, uma vez que a rutina
124
125
possui os substituintes importantes para a apresentar atividade antioxidante.
Figura 59. Relação estrutura-atividade de flavonol e flavona. Legenda: Em verde substituintes menos importantes à atividade antioxidante; Em vermelho
-
substituintes importantes à atividade antioxidante.
R1
R2
HO
O
R3
OH
R1, R2, R3 = H ou OH
O
Fonte: SCOTTI et al., 2007.
O método de co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico (Figura 60, p.
126) permite avaliar a capacidade de uma determinada substância prevenir a
oxidação do β-caroteno, protegendo-o dos radicais livres gerados durante a
peroxidação do ácido linoleico. A reação pode ser monitorada por espectrofotômetro
pela perda da coloração do β-caroteno em 470 nm. O β-caroteno é o mais
abundante dos carotenoides e largamente utilizado em terapias. É quase
completamente insolúvel em água, mas facilmente solúvel em ambientes
hidrofóbicos e solventes pouco polares. Tem sido reportado nos últimos 30 anos que
o β-caroteno exibe alta reatividade com eletrófilos e oxidantes. Muitos estudos têm
demonstrado que ele inibe a auto-oxidação de lipídios em tecidos biológicos e
produtos alimentícios, porém poucos detalhes da cinética e mecanismo destas
reações têm sido revelados.
No método da inibição da co-oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico,
a fração St-CHCl3 das folhas exibiu expressiva atividade (64,95% ± 15,29)
comparada ao padrão ácido ascórbico (10,61 ± 2,28). Este resultado pode ser
justificado por se tratar de uma fração que apresenta caráter lipofílico, e ainda pelo
resultado positivo na triagem fitoquímica para mono e diterpenos, triterpenos e
esteroides, uma vez que esse método de avaliação da atividade antioxidante é mais
sensível a amostras de alta lipofilicidade, conforme descrito na literatura (WANNES
et al., 2010).
Figura 60. Estrutura do β-caroteno (I) e do ácido linoleico (II)
I
COOH
II
126
Tabela 18. Atividade antioxidante in vitro do extrato etanólico (St-EtOH), hexânico
(St-Hex1) e as frações (St-Hex, St-CHCl3, St-AcOEt e St-MeOH) das cascas, folha,
talos e padrões (ácido ascórbico, BHA e BHT).
DPPH
β-caroteno
(CE50, µg/mL)
(% AA)
St-Hex1
Nd
nd
St-EtOH
9,37 ± 0,20
0,18 ± 2,01
St-Hex
Nd
nd
St-CHCl3
Nd
nd
St-AcOEt
9,16 ± 0,12
nd
St-MeOH
7,81 ± 0,52
6,50 ± 3,68
St-Hex1
St-EtOH
461,4 ± 318,2
50,22 ± 0,78
nd
52,52 ± 5,27
St-Hex
Nd
2,18 ± 3,39
St-CHCl3
40,01 ± 1,85
64,95 ± 15,29
St-AcOEt
71,59 ± 3,51
62,28 ± 9,51
St-MeOH
27,83 ± 1,12
14,88 ± 3,77
Substância St – 02
7,95 ± 0,83
17,35 ± 8,54
St-Hex1
102,20 ± 1,60
nd
St-EtOH
4,85 ± 0,07
1,59 ± 3,30
St-Hex
Nd
nd
St-CHCl3
Nd
nd
St-AcOEt
4,38 ± 0,21
10,40 ± 0,58
St-MeOH
5,54 ± 0,12
nd
Ácido ascórbico
5,08 ± 1,02
10,61 ± 2,28
BHA
5,55 ± 1,02
75,27 ± 9,25
BHT
9,56 ± 1,09
70,68 ± 2,49
Amostra
Cascas
Folhas
Talos
Padrões
*nd:
não determinado
127
5.6. Atividade antibacteriana
Na atividade antibacteriana o extrato etanólico e a fração acetato de etila das
folhas apresentaram menores valores em relação aos demais extratos e frações
testadas. A concentração inibitória mínima foi de 0,195 mg/mL para a bactéria
Enterococcus faecalis, e a concentração bactericida mínima da fração acetato de
etila das folhas destacou-se entre as demais com a concentração de 0,78 mg/mL
também para a bactéria Enterococcus faecalis. Os baixos valores das concentrações
obtidos nos testes representam um ótimo resultado visto que corrobora com o uso
popular das folhas para combater a diarreia e disenteria, já que entre as espécies de
bactérias, uma das principais causadoras de infecção no homem é a Enterococcus
faecalis, representando cerca de 85% a 90% dos enterococos isolados na clínica. O
E. faecalis, além de ser o mais frequente, apresenta resistência natural a diversos
antimicrobianos (COSTA et al., 2010) (Tabelas 19, 20 e 21, p. 129-130).
O flavonoide isolado (rutina), mostrou-se mais eficiente frente as bactérias
Gram-negativas, como por exemplo, contra a bactéria Escherichia coli com
concentração inibitória mínima igual a 1mg/mL, este valor foi maior que o encontrado
na literatura para a rutina - CIM igual a 0,064 mg/mL (BASILE et al., 2000), no
entanto aproximou-se do valor obtido pela quercetina - CIM 0,5 mg/mL (TALEBCONTINI et al., 2003). A relação estrutura-atividade dos flavonoides foi descrita por
TALEB-CONTINI e colaboradores (2003), na qual observou-se que os flavonoides
que apresentaram atividade possuem na sua estrutura um grupo hidroxila nas
posições C7, C3 'e C4' e que apenas a quercetina que apresentou atividade contra
bactérias Gram-negativas possui na sua estrutura uma hidroxila na posição C3. No
entanto, é necessário estudo mais específico, a fim de compreender melhor o
mecanismo de ação da substância avaliada.
128
129
Tabela 19. Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH das cascas de
Spondias tuberosa e do padrão Gentamicina.
Bactéria
St-EtOH
St-AcOEt
St-MeOH
Gentamicina
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
Bacillus cereus
1,56
12,5
12,5
12,5
3,12
*
0,40
0,40
Enterococcus
12,5
*
6,25
*
12,5
*
0,40
0,40
Escherichia coli
12,5
12,5
3,12
*
12,5
*
0,025
0,025
Klebsiella
12,5
12,5
*
12,5
12,5
*
6,25
12,5
12,5
*
3,12
3,12
*
0,40
6,25
12,5
6,25
12,5
12,5
12,5
0,05
0,05
Shigella flexneri
6,25
6,25
6,25
12,5
3,12
12,5
0,05
0,05
Staphylococcus
12,5
12,5
12,5
12,5
6,25
12,5
*
0,025
faecalis
pneumonia
Salmonela
choleraesuis
Serratia
marcescens
aureus
Tabela 20. Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt, St-MeOH e St-2 das
folhas de Spondias tuberosa.
St-EtOH
St-AcOEt
St-MeOH
Substância
St-2
Bactéria
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
Bacillus cereus
6,25
*
6,25
12,5
12,5
*
*
*
Enterococcus faecalis
0,195
3,12
0,195
0,78
6,25
*
1,0
*
Escherichia coli
0,195
6,25
0,78
0,78
6,25
*
*
*
Klebsiella pneumonia
12,5
12,5
12,5
*
*
*
1,0
*
12,5
*
6,25
12,5
12,5
12,5
*
*
Serratia marcescens
12,5
*
12,5
12,5
12,5
*
1,0
1,0
Shigella flexneri
12,5
12,5
12,5
12,5
12,5
12,5
1,0
*
6,25
12,5
3,12
12,5
3,12
12,5
1,0
1,0
Salmonela
choleraesuis
Staphylococcus
aureus
CIM: concentração inibitória mínima. CBM: concentração bactericida mínima. Os valores estão
expressos em mg/mL e indicam até qual concentração a amostra foi efetiva. (*): crescimento
bacteriano em todas as concentrações testadas.
Tabela 21. Atividade antibacteriana de St-EtOH, St-AcOEt e St-MeOH dos talos de
Spondias tuberosa.
St-EtOH
Bactéria
St-AcOEt
St-MeOH
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
Bacillus cereus
6,25
12,5
3,12
12,5
1,56
12,5
Enterococcus faecalis
3,12
12,5
1,56
1,56
12,5
*
Escherichia coli
1,56
12,5
3,12
3,12
12,5
12,5
Klebsiella pneumonia
*
*
12,5
12,5
3,12
12,5
Salmonela choleraesuis
12,5
*
3,12
12,5
1,56
*
Serratia marcescens
*
*
6,25
12,5
6,25
12,5
Shigella flexneri
6,25
*
6,25
12,5
1,56
12,5
Staphylococcus aureus
1,56
*
12,5
*
12,5
*
CIM: concentração inibitória mínima. CBM: concentração bactericida mínima. Os valores estão
expressos em mg/mL e indicam até qual concentração a amostra foi efetiva. (*): crescimento
bacteriano em todas as concentrações testadas.
5.7.
Quantificação
por
CLAE-FR
do
flavonoide
quercetina
3-O-α-L-
tuberosa
Uma vez isolada uma quantidade expressiva de rutina da fração metanólica
das folhas, fez-se necessário a identificação e quantificação deste flavonoide nas
outras partes da planta estudadas. A identificação do flavonoide nas três partes da
espécie Spondias tuberosa (cascas, folhas e talos) foi realizada através da
comparação com o tempo de retenção e o espectro de absorção na região de 350
nm do padrão (Figura 61, p.131). No espectro de UV do padrão, foi possível verificar
a presença de dois máximos de absorção característicos dos flavonóis, uma banda
de absorção em 256 nm referente ao anel A e outra banda em 353 nm atribuída ao
anel B do flavonoide. Na figura 62, p.131, mostra os cromatogramas dos extratos
analisados, os quais mostram que as amostras apresentaram o mesmo pico com o
mesmo tempo de retenção do padrão utilizado, confirmando assim a presença da
rutina nos três extratos etanólicos analisados.
130
Figura 61. Espectro de UV com as bandas absorção da rutina obtido por CLAEDAD.
Figura 62. Cromatogramas dos extratos etanólicos das cascas, folhas e talos e do
padrão rutina.
131
Para a quantificação da rutina nas amostras utilizou-se os dados obtidos da
curva de calibração construída com a rutina (Figura 63, p. 132), as quantidades
foram expressas em µg/mL (Tabela 22, p. 132).
Figura 63. Curva de calibração da rutina
Tabela 22. Quantidades de rutina em µg/mL encontradas nos extratos etanólicos das
cascas, folhas e talos
Amostra
Concentração da Rutina
(µg/mL)
Extrato etanólico – Cascas
19,28 ± 9,75
Extrato etanólico – Folhas
76,72 ± 19,33
Extrato etanólico – Talos
9,27 ± 1,94
Os resultados obtidos através da análise em CLAE-DAD, confirmam a
presença da rutina nas três partes da Spondias tuberosa, sendo que encontrou-se o
flavonoide em maior quantidade nas folhas, informação já esperada, pois foi desta
parte da planta que foram isoladas 93,2 mg de Rutina.
132
6. CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
Nos óleos fixos obtidos das cascas, folhas e talos (OFC, OFF e OFT) de
Spondias tuberosa, analisados por CG-MS foram identificados os ésteres metílicos
correspondentes aos seguintes ácidos graxos de cadeia longa: palmítico, esteárico e
triacontanóico. Como constituintes majoritários foram identificadas as seguintes
substâncias: 3-n-pentadecilfenol (cascas) e o n-Tetratetracontano (folhas e talos)
Durante a preparação do extrato etanólico das folhas foi isolado um
precipitado que foi denominado como 2,4,6-trihidroxi-4-(hidroximetil)ciclohexa-2,5dien-1-ona, esta substância trata-se de um derivado do quinol, não há relatos de
isolamento desta classe de substâncias na família Anacardiaceae assim como
também no gênero Spondias.
O estudo fitoquímico das folhas de Spondias tuberosa resultou no isolamento
e identificação da rutina, oriunda da fração metanólica. Já o estudo fitoquímico dos
talos resultou no isolamento do Trans-p-cumarato de eicosanila, proveniente da
fração acetato de etila e relatado pela primeira vez no gênero Spondias, contribuindo
assim para o enriquecimento quimiotaxônomico deste gênero.
No ensaio de quantificação de fenóis totais, verificou-se que extrato etanólico
dos talos apresentou maior quantidade de compostos fenólicos (459,2 ± 21,07 mg
EqAG/g), já na quantificação de flavonoides totais destacou-se a fase St-MeOH dos
talos com 129,00 ± 4,91 mg EqC/g.
Na avaliação da atividade antioxidante in vitro, foi possível verificar que de
todos os extratos e frações testados, a fração St-AcOEt dos talos apresentou o
menor valor de CE50 (4,38 ± 0,21), seguido da substância St-02 (rutina) com CE50
7,95 ± 0,83 valor semelhante aos padrões. No método da inibição da co-oxidação do
sistema β-caroteno/ácido linoleico, a fração St-CHCl3 das folhas exibiu expressiva
atividade (64,95% ± 15,29) quando comparada ao padrão ácido ascórbico, um
antioxidante natural (10,61 ± 2,28), sendo assim a fração clorofórmica demonstrou
melhor eficiência em prevenir a oxidação do β-caroteno na presença do ácido
linoleico (agente oxidante).
Na atividade antibacteriana o extrato etanólico e a fase acetato de etila das
folhas apresentaram menores valores em relação aos demais extratos e fases
testados com concentração inibitória mínima de 0,195 mg/mL para a bactéria
Enterococcus faecalis, já para a concentração bactericida mínima a fase acetato de
134
etila das folhas destacou-se entre as demais com a concentração de 0,78 mg/mL
para a mesma cepa.
O estudo fitoquímico da espécie Spondias tuberosa levou à identificação de
três substâncias, dentre as quais se tem um derivado do quinol (2,4,6-trihidroxi-4(hidroximetil)ciclohexa-2,5-dien-1-ons), um flavonoide glicolisado (rutina) e um éster
do ácido p-cumárico (Trans-p-cumarato de eicosanila).
Diante do estudo realizado foi possível observar que os extratos e frações
estudados de Spondias tuberosa apresentaram resultados relevantes nas atividades
antioxidante e antibacteriana. As atividades demonstradas pelos extratos e frações
podem estar diretamente correlacionadas com a cicatrização de feridas e a
propriedade anti-inflamatória das plantas, sendo assim este estudo confirma o uso
etnofarmacológico desta espécie, além de contribuir para o conhecimento
quimiotaxonômico do gênero Spondias e da família Anacardiaceae.
135
REFERÊNCIAS
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mombin, Croton zambesicus and Zygotritonia crocea. Phytotherapy Research, v.
13, p. 494–497, 1999.
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152
APÊNDICE
154
155
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO - UNIVASF
IV Simpósio de Plantas Medicinais do Vale do São Francisco – PLAMEVASF
18 a 21 de Setembro de 2013, Juazeiro-BA
QUANTIFICAÇÃO FENÓLICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE
Spondias tuberosa.
AMANDA LEITE GUIMARÃES1; ANA PAULA DE OLIVEIRA1; RAIRA F. DOS
SANTOS2; EDIGÊNIA C. DA C. ARAÚJO1; JACKSON R. G. DA S. ALMEIDA1.
1
2
Universidade Federal do Vale do São Francisco;
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano.
Introdução: O gênero Spondias (Anacardiaceae) é constituído de 8-12 espécies
distribuídas em todas as regiões tropicais do mundo. Spondias tuberosa Arr. Cam.,
conhecida como umbuzeiro, tem suas folhas utilizadas na medicina popular como antiinflamatório, para combater a diarreia, disenteria e vermes. Objetivos: Determinar o teor
de fenóis e flavonoides totais e avaliar o potencial antioxidante in vitro dos extratos das
folhas de S. tuberosa. Métodos: As folhas foram secas, moídas e submetidas à
extração com etanol (EtOH) seguida de fracionamento em sílica resultando nas fases
Hex, CHCl3, AcOEt e MeOH. O conteúdo de fenóis totais foi determinado pelo método
de Folin-Ciocalteu. O teor de flavonoides totais foi determinado através do método
colorimétrico por complexação metálica. A atividade antioxidante dos extratos foi
avaliada pelos modelos de sequestro do radical DPPH e da inibição da auto oxidação do
β-caroteno. Os padrões usados foram ácido ascórbico, BHA e BHT e as análises foram
feitas em triplicata. Resultados: O EtOH e a fase MeOH demonstraram excelente
atividade antioxidante no método do DPPH, destacando-se a fase MeOH (IC50 27,83 ±
1,12 μg/mL) que demonstrou melhor atividade dentre as fases estudadas. No método da
inibição da auto oxidação do β-caroteno, por ser um método de lipoperoxidação, a fase
CHCl3 apresentou melhor atividade (64,95% ± 15,29). A quantificação de fenóis e de
flavonoides totais confirma os resultados observados na atividade antioxidante através
do modelo DPPH, pois os resultados mostram valores consideráveis tanto para o EtOH
(100,53 ± 12,06 e 70,37 ± 1,40 mg/g, respectivamente) quanto para a fase MeOH
(181,20 ± 10,58 e 64,33 ± 1,66 mg/g, respectivamente). Conclusões: O gênero
spondias já é conhecido pela presença de compostos fenólicos e os testes realizados
confirmam esta presença em S. tuberosa. Sugerimos que o uso popular pode estar
relacionado com a presença destes metabólitos. Procedimentos químicos posteriores
serão realizados a fim de isolar e determinar as micromoléculas responsáveis pela
atividade.
Palavras-chave: atividade antioxidante; fenóis; Spondias tuberosa.
Apoio Financeiro: CNPq/BNB/FACEPE
156
157
QUANTIFICAÇÃO FENÓLICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS
TALOS DE Spondias tuberosa
Amanda Leite Guimarães1, Ana Paula de Oliveira1, Raira F. dos Santos2, Edigênia C. da C.
Araújo1 e Jackson R. G. da S. Almeida1
1
Programa de Pós Graduação em Recursos Naturais do Semiárido
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, Campus Petrolina, BR
407 Km 08 Jardim São Paulo – Petrolina – PE
2
Introdução
Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel
chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo
envelhecimento e pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento, como
câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistema imune e disfunções
cerebrais (ATOUI et al., 2005; BARREIROS et al., 2006).
Muitos vegetais apresentam ação antioxidante, ou seja, são capazes de captar
radicais livres. O excesso ou o acúmulo de radicais livres no organismo podem ser
combatidos de forma bastante eficaz; os responsáveis por tal função são os agentes
antioxidantes (BARREIROS,2006).
Sendo assim, a espécie selecionada como objeto de estudo foi Spondias tuberosa,
conhecida popularmente como umbuzeiro, pertence ao gênero Spondias (Anacardiaceae)
que é constituído de 8-12 espécies distribuídas em todas as regiões tropicais do mundo. O
Umbuzeiro é uma árvore endêmica da Caatinga, conhecida localmente como "umbu" e
utilizada para diversos fins, especialmente alimento e medicinal (Lins Neto et al.,
2010).Estudos anteriores das espécies da família Anacardiaceae possibilitaram verificar a
ocorrência flavonoides, terpenos, esteroides, xantonas e, principalmente, dos lipídios
fenólicos e derivados. Destaca-se que entre os flavonoides, os biflavonóides são os mais
frequentes (Correia et al., 2006). Neste trabalho, os talos de S. tuberosa foram avaliados
quanto ao teor de fenóis e flavonoides totais e o potencial antioxidante in vitro.
Materiais e Métodos
A planta foi coletada no campus de ciências agrárias da UNIVASF em janeiro de
2013, em seguida o material vegetal seco e pulverizado foi submetido a extração utilizando
inicialmente o n- hexano a fim de retirar a graxa presente no material botânico e em seguida
o material foi submetido à maceração exaustiva com etanol 95 %. As soluções extrativas,
hexânica e alcoólica obtidas foram concentradas em evaporador rotatório sob pressão
reduzida a uma temperatura média de 50 °C, obtendo-se o extrato hexânico (Hexano-1) e o
extrato etanólico (EtOH). O EtOH foi particionado com solventes em ordem crescente de
polaridade gerando a fases hexânica (HEX), clorofórmica (CHCl3), acetato de etila (AcOEt) e
metanólica (MeOH).
O conteúdo de fenóis totais foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteu. O teor
de flavonoides totais foi determinado através do método colorimétrico por complexação
metálica. A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelos modelos de sequestro do
radical DPPH e da inibição da auto-oxidação do β-caroteno, utilizando como padrões o ácido
ascórbico, butil-hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT).
Todas as análises foram realizadas em triplicata e seguindo a metodologia descrita
por Oliveira-Jr et al. (2012).
Resultados e Discussão
Os resultados da atividade antioxidante para o modelo de sequestro do radical DPPH
foram expressos através de valores de CE50 e estão apresentados na Tabela 1. O EtOH e as
fases AcOEt e MeOH demonstraram excelente atividade antioxidante no método do DPPH
quando comparadas com os padrões, destacando-se a fase AcOEt (CE50 4,38 ± 0,21
158
µg/mL).No método da inibição da auto oxidação do β-caroteno, por ser um método de
lipoperoxidação, a fase AcOEt também apresentou a melhor atividade (10,40% ± 0,58)
quando comparada com as outras fases. A quantificação de fenóis e de flavonoides totais
confirma os resultados observados na atividade antioxidante através do modelo DPPH, pois
os resultados mostram valores consideráveis tanto para o EtOH quanto para as fases AcOEt
e MeOH como pode ser observado na Tabela 1.
Tabela 1 – Estimativa da atividade antioxidante e quantificação de fenois e flavonoides
totais dos extratos e demais frações obtidos dos talos de Spondias tuberosa
(Anacardiaceae)
DPPH
(CI50, µg/ml)
β-caroteno
(% AA)
Fenóis totais
(mg EqAG/g)
Flavonoides
totais
(mg EqC/g)
Hexano - 1
102,20 ± 1,60
EtOH
4,85 ± 0,07
Hex
nd
CHCl3
nd
AcOEt
4,38 ± 0,21
MeOH
5,54 ± 0,12
Ácido
5,08 ± 1,03
ascórbico
BHA
5,55 ± 1,02
BHT
9,56 ± 1,09
*
nd: não determinado
nd
1,59 ± 3,30
nd
nd
10,40 ± 0,58
-
20,53 ± 2,31
459,20 ± 21,07
33,20 ± 4,00
17,20 ± 0,00
314,50 ± 3,06
445,90 ± 103,2
33,25 ± 17,52
97,69 ± 1,92
0,80 ± 3,46
66,36 ± 3,42
129,00 ± 4,91
7,56 ± 1,80
-
-
53,78 ± 14,38
51,53 ± 4,19
-
-
Amostra
Conclusões
De acordo com os resultados obtidos dos testes realizados, pode-se perceber que as
espécies possuem atividade antioxidante no método do DPPH, e que essa atividade pode
estar relacionada com a presença de compostos fenólicos como, por exemplo, os
flavonoides os quais são reconhecidos pela sua atividade antioxidante.
Assim, novos estudos serão realizados para o isolamento dos constituintes químicos
responsáveis pela atividade antioxidante das fases.
Agradecimentos
CNPq/BNB/FACEPE
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159
160
Antibacterial and antioxidant activities of flavonoid isolated from Spondias
tuberosa Arruda (Anacardiaceae)
A. L. Guimarãesa, G. S. Bezerraa, I. Sousaa, E. C. V. Nascimentoa, A. P.
Oliveiraa, A. G. M. Pachecob, J. R. G. S. Almeidaa, D. S. C. Anjosc, E. C. C.
Araújoa*
a
b
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, Pernambuco, Brazil
Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de
Santana, 44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil
c
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, - Petrolina,
Brazil
*
Corresponding author: Edigênia Cavalcante da Cruz Araújo, Universidade Federal do Vale do São
Francisco
–
UNIVASF
Postal
Code:
56.304-205
Petrolina,
PE,
Brazil,
[email protected]/ [email protected]; Phone/Fax: +55-87-21016863.
e-mail:
161
Antibacterial and antioxidant activities of Flavonoid isolated from Spondias
tuberosa Arruda (Anacardiaceae)
A. L. Guimarãesa, G. S. Bezerraa, I. Sousaa, E. C. V. Nascimentoa, A. P.
Oliveiraa, A. G. M. Pachecob, J. R. G. S. Almeidaa, D. S. C. Anjosc, E. C. C.
Araújoa*
a
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, Pernambuco, Brazil
b
Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de
Santana, 44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil
c
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, - Petrolina,
Brazil
(Received Month Day, 201X; accepted Month Day, 201X)
The methanolic fraction, obtained from ethanol extract, was submitted to the
chromatography procedures which led to the isolation of the flavonoid Quercetin-3O-rutinoside (Rutin), which had the structures elucidated by spectroscopy analysis,
including RMN (1D and 2D) and comparison with literature data. Antioxidant and
antibacterial activity of flavonoid isolated as well as ethanol extract and fractions
were evaluated. Rutin showed both antioxidant activity and antibacterial. The
methanolic fraction exhibit the best antioxidant activity in the method the
scavenging of radical DPPH (IC50 27.83 ± 1.12 μg/ml), already by the co-oxidation
of β-carotene method stood out the ethyl acetate fraction (62.28 ± 9.51). The
ethanol extract and ethyl acetate fraction showed activity against bacteria
Enterococcus faecalis.
Keywords:
Anacardiaceae,
Spondias
tuberosa,
antioxidant,
antibacterial,
flavonoid.
1. Introduction
The Anacardiaceae family belongs to the order Sapindales comprising about 81 genera
and 800 species, present in dry to moist environments, especially in lowlands in tropical and
subtropical regions around the world, extending to temperate regions (Luz, 2011). From the
162
chemical point of view, the most studied genera in this family are Mangifera, Rhus
(Toxicodendron), Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia, Lithraea,
Tapirira and Melanorrhoea. Mangifera, Rhus and Anacardium noteworthy for the number of
investigations concerning the chemical composition of species and their biological activities
of its extracts and metabolites. The studies of these species possible to verify the occurrence
of flavonoids, terpenes, steroids, xanthones, and especially of lipids and phenolic derivatives.
It is noteworthy that among flavonoids, the biflavonoids are the most frequent (Correia et al.
2006).
Among the species of this family is Spondias tuberosa Arr. Cam., popularly known as
“umbuzeiro”. The “umbuzeiro” is a species of great socioeconomic importance within the
family, as well as providing tasty and nutritious fruits, rich in water xylopodium (NascimentoSilva et al. 2008), represents an important source of income through the extraction to the
hinterland (Araújo and Neto, 2002). The leaves of S. tuberosa are popularly used as an
antiinflammatory, to combat diarrhea, dysentery and worms (Silva et al. 2012).
Phenolic compounds such as flavonoids, tannins, and anthocyanins are considered
important antioxidants and antimicrobial agents (Silva et al. 2012). Based on the information
that the class of metabolites frequently in the Anacardiaceae family are flavonoids, the
objectives of this study were to evaluate the antioxidant and antimicrobial activity of the
ethanol extract and fractions of Spondias tuberosa and isolate and identify the compound,
evaluating the possibility of the contribution of this substance in the investigated activities.
2. Results and Discussion
The substance 1 was isolated appearance of yellow powder, soluble in methanol,
showed melting point 185 - 187°C. In ultraviolet light at wavelengths of 254 and 366 nm
fluorescence substance showed and Rf: 0.58 in elution system ethyl acetate: methanol (75:25).
The UV spectrum of the substance 1 in methanol solution (0.05 mg / ml) was evaluated in the
range of 220-400 nm using a spectrophotometer model Nova 1600 UV, in this experiment we
observed two absorption bands one at 258 nm which is the absorption A ring and another
absorption at 358 nm corresponding ring B. The IR spectrum exhibited absorption bands
suggesting the presence of hydroxyl (3428 cm-1), chelated carbonyl (1654cm-1), carbonhydrogen bonds (2937 cm-1), carbon-oxygen bonds simple (1204 cm-1) and aromatic rings
(1598 and 1457 cm-1).
The flavonoid isolated from the methanolic fraction was identified by analysis of
spectra NMR of 1H and 13C, including the techniques DEPT, COSY, HMQC and HMBC and
163
comparing spectral data with those reported in the literature (Oliveira et al. 2013). The Table 1
makes comparisons of chemical shifts of the carbons of rutin with literature. This comparison
facilitated the assignment of the values of displacements of sugar units present in the
structure.
The analysis of the 1H NMR spectrum of the substance showed five signals for
aromatic hydrogens. The two doublets at δH (6.21, J = 1.95 Hz), and (6.39, J = 1.92 Hz)
hydrogens were assigned to H-6 and H-8 of A ring, respectively; the δH doublets in (7.67, J =
1.98 Hz), and (6.87, J = 8.43 Hz), and double doublet δH (7.61, J = 8.43 and 2.04 Hz)
corresponding to hydrogens H-2 ', H-5' and H-6 ', ring B, respectively. The presence of signals
that suggested the presence of two glycosidic units was observed, as presented multiple
signals in the range between δH 3.25 to 3.81 combined the two anomeric hydrogens at δH
5.10 and 4.52, the first unit was identified as glucose, by the presence of methylene hydrogens
in δH 3.81 and 3.40, the signal for methyl hydrogen δH 1.12 justifies the presence of
rhamnose. The
13
C NMR spectrum showed signals 27 which fifteen correspond to carbons
methinic. The spectrum also showed distinctive signals to two carbons anomeric glycosidic
units (δC 104,88 e 102,57), there was also a sign of methyl carbon δC 18.02 (C-6 "') which
explains the presence of the glycoside unit rhamnose. In 2D NMR spectra (COSY-1Hx1H)
confirmed the couplings between the δH 6.87 (H-5'), with δH 7.61 (H-6'). In the HMQC
correlations between δH 5.10 (H-1'') with δC 104.88 (C-1''), and δH 4.52 (H-1''') with δC
102.57 (C-1''') the presence justified two glycosidic units. From the correlations shown in the
spectrum of HMBC between δH 5.10 (H-1'') with δC 135.77 (C-3) and δH 4.52 (H-1''') with
δC 68.72 (H-6'') it was possible to identify the position of the glycosidic units and other
groups such as δH 6.39 (H-8) with δC 158.68 (C-9) and δH 7.61 and 7.67 (H-6 'and H 2') with
δC 159.47 (C-2) the only values that were not consistent with the literature. The structure of
substance 1 (Figure 1) was elucidated by a combination of spectroscopic methods and by
comparison of their spectral data with that in the literature.
The results of the evaluation of antioxidant activity (Table 2) indicates that the
methanol fraction showed better antioxidant activity (27.83 ± 1.12) in the method of
scavenging of the DPPH, this result may be related to the flavonoid which was subsequently
isolated from this fraction, which showed significant activity (7.95 ± 0.83) of this method
compared with other fractions studied and the standards used, e.g. BHT (9.56 ± 1.09). The
rutin showed good antioxidant activity by DPPH method, but the method of co-oxidation of
system β-carotene/linoleic acid showed a lower percentage (17.35 ± 8.54%) compared to the
ethyl acetate fraction (62,28 ± 9,51%) and the standard BHA (75.27 ± 9.25%). The difference
164
in results of the two methods can be explained by the fact that flavonoids present phenolic
hydroxyls that act as a proton donor more easily, stabilizing the DPPH radical reducing it
hydrazine while the intermediate formed are relatively stable due to the resonance of the
aromatic ring present in such structures.
In the evaluation of the antibacterial activity results in Table 3 show that the ethanol
extract, fractions and the substance tested showed good activity in assays used against
bacteria Enterococcus faecalis, highlighting the ethanol extract (MIC 0.195 mg/ml; MBC 3.12
mg/ml ) and the ethyl acetate fraction (MIC 0.195 mg/ml; MBC 0.78 mg/ml ) with a value of
less than the standard Gentamicin inhibitory concentration (MIC 0.40 mg/ml; MBC 0.40
mg/ml). Enterococcus faecalis are microorganisms which can grow in a variety of media,
including soil, food, water and in many animals and cause disease when appropriate,
including endocarditis and urinary tract infections. More than 90% of human enterococcal
infections are caused by E. faecalis. (Silva 1999). The results showed that the ethanol extract,
fractions ethyl acetate and methanol were more effective against Gram-positive than Gramnegative bacteria. The isolated flavonoid that it is a derivative of quercetin (rutin) was more
efficient against Gram-negative bacteria, e.g. against the Escherichia coli bacteria the MIC
result was equal to 1 mg/ml greater than the concentration found in the literature, with MIC
value equal to 0.064 mg/ml (Basile et al. 2000), however approached the MIC value of 0.5
mg/ml for quercetin (Taleb-Contini et al. 2003). The structure-activity relationship of
flavonoids was described in the literature (Taleb-Contini et al. 2003), in which it was
observed that were active flavonoids have in their structure a hydroxyl group at positions C7,
C3' and C4' and only quercetin which showed activity against Gram-negative bacteria have in
their structure one hydroxyl at position C3, this may explain the activity of rutin against Grannegative bacteria. However, it is necessary to make more specific study to better understand
the mechanism of action of the evaluated substance.
Through this research, it was possible to show the presence of a glycosylated
flavonoid leaves Spondias tuberosa Arruda, thus contributing to the phytochemical
knowledge of the “umbuzeiro” phytochemical, known primarily for its fruit plant in
northeastern Brazil. The isolation of rutin justified activities tested in this study, and popular
usage of the leaves as anti-inflammatory, to combat diarrhea, dysentery and worms. The
species S. tuberosa is a promising source of antioxidant phyto for future application in herbal
medicines that can fight free radicals and associated diseases.
Acknowledgments
165
The authors thanks to CRAD/HVASF by the botanical identification of the plant and the DS.c
Edilberto R. Silveira in the CENAUREMN that contributed with NMR analysis.
References
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167
OH
OH
O
HO
R1
OH
O
R1 = O-rutinosyl
Figure 1. The structures of Quercetin-3-O-rutinoside (Rutin)
168
Table 1. Comparison of the
13
C NMR data rutin with values described in the literature
(Oliveira et al. 2013).
Rutin
C
Rutin
(Literature)
2
159.47
158.69
3
135.77
136.72
4
179.54
179.61
5
163.11
162.17
6
100.19
100.10
7
166.40
167.19
8
95.08
95.01
9
158.68
159.51
10
105.73
106.06
1’
123.29
123.30
2’
117.85
117.84
3’
145.99
146.02
4’
149.96
150.45
5’
116.22
116.22
6’
123.71
123.70
1’’
104.88
104.85
2’’
75.88
75.90
3’’
77.37
77.41
4’’
71.56
71.57
5’’
78.35
78.36
6’’
68.72
68.72
1’’’
102.57
102.58
2’’’
72.25
72.27
3’’’
72.41
72.41
4’’’
74.10
74.10
5’’’
69.86
70.59
6’’’
18,02
18.03
169
Table 2. Antioxidant activity of ethanol extract, fractions methanol and ethyl acetate, rutin
and standards.
DPPH
β-carotene
(IC50, µg/mL)
(% AA)
Ethanol extract
50.22 ± 0.78
52.52 ± 5.27
Ethyl acetate fraction
71.59 ± 3.51
62.28 ± 9.51
Methanol fraction
27.83 ± 1.12
14.88 ± 3.77
Rutin
7.95 ± 0.83
17.35 ± 8.54
Ascorbic acid
5.08 ± 1.02
10.61 ± 2.28
BHA
5.55 ± 1.02
75.27 ± 9.25
BHT
9.56 ± 1.09
70.68 ± 2.49
Sample
Notes: The IC50 values were obtained by interpolation from linear regression analysis with
95% of confidence level. IC50 is defined as the concentration sufficient to obtain 50% of a
maximum effect. Values are given as mean ± SD (n=3).
170
Table 3. Antibacterial activity of extracts of ethanol extract, fractions methanol and ethyl
acetate, rutin and standards.
Bacteria
MIC (mg/ml)
EtOH AcOEt MeOH
MBC (mg/ml)
Ru
Gen
EtOH AcOEt MeOH
Ru
Gen
Gram-positive
Bacillus cereus
Enterococcus
faecalis
Staphylococcus
aureus
6,25
6,25
12,5
*
0,40
*
12,5
*
*
0,40
0,195
0,195
6,25
1,0
0,40
3,12
0,78
*
*
0,40
6,25
3,12
3,12
*
0,025
12,5
12,5
12,5
*
0,025
0,195
0,78
6,25
1,0
*
6,25
0,78
*
*
0,40
12,5
12,5
*
*
0,05
12,5
*
*
*
0,05
12,5
6,25
12,5
1,0
0,05
*
12,5
12,5
1,0
0,05
12,5
12,5
12,5
1,0
*
*
12,5
*
*
0,025
12,5
12,5
12,5
1,0
*
12,5
12,5
12,5
1,0
0,025
Gram-negative
Escherichia coli
Klebsiella
pneumoniae
Salmonela
choleraesuis
Serratia
marcescens
Shigella flexneri
Notes: MIC: minimal inhibitory concentration. MBC: minimum bactericidal concentration. (*)
absence of bacterial increase at all concentrations tested (n=3). EtOH= ethanolic extract; AcOEt= ethyl
acetate fraction; MeOH= methanol fraction;Ru= rutin; Gen= gentamicin.
171
172
173
174
175

Estudo fitoquímico e biológico in vitro de Spondias tuberosa Arruda

Transcrição

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