Métodos para hacer estudios de sensibilidad a levaduras y hongos

Métodos para hacer estudios de
sensibilidad a levaduras y hongos
filamentoso por EUCAST
Bogotá, 2012
Marcia S.C.Melhem
[email protected]
Pesquisadora-Científica VI do Instituto Adolfo Lutz
Docente do Programa de Pós-Graduaçao em Ciências
Coordenadoria de Controle de Doenças
Secretaria de Estado de São Paulo
Método Referência Levaduras M27
1992 (proposal standard)
1995 (tentative standard)
1997 (approved standard)
2002 (M27-A2, 2ª edición)
2008 (M27-A3, 3ª edición)
Candida spp.
Cryptococcus spp.
EUCAST
AFST
Subcomite
AntiFungal Susceptibility Testing
ESCMID- 1983
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
93 países
1996
EUCAST-European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
Proposed EUCAST susceptibility testing
method for fermentative yeasts
http://www.eucast.org
2002 www.eucast.org: Documento Discusión E. Dis. 7.1
más glucosa em el medio de cultivo (RPMI)
> [inóculo]
uso espectrofotómetro para lectura de las placas de testes
Método EUCAST actual para
levaduras
Marzo 2012
Propósito de las Directrices
•
Ofrecer un método válido para determinar la sensibilidad de
levaduras a los antifúngicos
•
Facilitar un aceptable grado de conformidad entre
laboratorios
•
Desarrollar un método fácil, rápido, económico y adecuado
para ser leído mediante espectrofotómetro lo que permite
una transferencia directa a un ordenador que es capaz de
almacenar y manipular los datos
•
Conseguir que los resultados sean concordantes con los que
se obtienen tras el empleo de las técnicas recomendadas por
el CLSI
ESCOPO
-Fluconazol, itraconazol, voriconazol,
posaconazol
-Equinocandinas: caspo, mica e anidulafungina
-Anfotericina B
-5-fluorcitosina
Diferencias entre M27-A (CLSI) y
propuesta AFST EUCAST
10 veces
Glucosa
Forma del pocillo
100mL
veces
Inóculo (UFC/
)
Incubación (h)
Lectura
CIM
más!
CLSI M27-A
EUCAST-AFST
0,2 %
Fondo redondo
2%
Fondo plano
0,5
superior!
– 2,5 x 103
Más rápido!
24-48
(Candida)
visual
Más baja concentración que
inhibe sustancialmente el
crecimiento
0,5 – 2,5 x 105
24 (Candida)
espectrofotÓmetrO
Más baja concentración que
inhibe el crecimiento al menos
un 50%
¿Por qué leer con un
espectrofotómetro?
Leitura da inibição do crescimento = turbidez
O= ópticamente claro (lectura para anfotericina B)
1= ligeramente turbio
2= disminución prominente de la turbidez (~50% inibición)
3= ligera disminución de la turbidez
4= sin disminución de la turbidez
Lectura visual para azoles: punto 2
Prominent
disminución de
la turbidez
CIM
Ligeramente
turbio
CC
CE
0 0 0 0 0 0 1 2
3
3
Ligera disminució
disminución
de la turbidez
4 0
Lectura con espectrofotómetro
0.6
100%
0.55
0.5
Optical Density
0.45
0.4
0.35
0.3
50%
0.25
0.2
0.15
0.1
MIC
0.05
0
GC
0.12
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
Placas de Fondo redondo
↑ Densidad óptica
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2008
Placas de Fondo plano
Densidad óptica real
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2008
Preparación de las placas
Medio
100 µl
RPMI + Antifúngico
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
Control
Crecimiento
Blanco
SBC, 2008
Preparación del inóculo
•Subcultivo en SAB 18-24 h, 35+2°C
•5 colonias aisladas ≥1 mm diámetro en 5 mL, ADE
•Mezclar
•Diluir con agua para conseguir una turbidez
similar a del tubo 0.5 de la escala de Mac Farland
•~ 1-5 x 106 UFC/mL
•Diluir 1: 10 en agua
•~ 1-5 x 105 UFC/mL
•Dispensar 100 µL por pocillo
•~ 0,5-2,5 x 105 UFC/mL
Inoculación de las placas
100 µl
inóculo
Medio
+
100 µl
RPMI + Antifúngico
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
Control
Crecimiento
Blanco
SBC, 2008
Incubación
•Aire normal
•35+2°C
•Estáticas
•Tapadas pero selladas con película plástica o
sin sellar - no hay preferencia
•Cámara húmeda o no - no hay preferencia
•24 h
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2008
Lectura
Espectrofotómetro a 530 nm (405 o 450 nm )
Restar el blanco (columna 12) del resto de pocillos
La DO del CC debe estar por encima de ≥ 0,2
Si no reincubar otras 24 h
CIM es la inhibición del 50% ó más comparada con
el control de crecimiento para los azoles
CIM es la inhibición del 90% ó más para la
anfotericina B
Cepas Control de Cualidad
Candida krusei
ATCC 6258
Para caspofungina
C. albicans ATCC 64548 ou
C. albicans ATCC 64550
Pontos de corte Candida (EUCAST, 2011)
E. Def 9.1 (EUCAST)
para miceliales
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Miceliales
Hongos hialinos y demáceos
(melanina)
Penicillium spp
Curvularia
Aspergillus spp.
Composición y tamaño del inóculo
Fusarium spp.
•Macroconidios de 11 a 80 µm
•Microconidios de 4 a 8 µm
Esporas
Aspergillus spp.
e
•Conidios de 2-7 µm
hifas
mezcladas
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Preparación del inóculo
Cultivo 2-5 dias o más (esporas) en temperatura de 35oC
5 mL
5 mL
ADE
+
0,1%
Tween 20
15’ vortex
2000 rpm
Preparación del inóculo
Filtro 11 µm
Si > 5% de hifas
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
2-5 x 106 esporas /mL ADE
1: 10
2-5 x 105 esporas /mL ADE
Control del inóculo
inóculo
1:10
10 µL
Incubar a 28-30ºC / 24 h – 7 días
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Pruebas de susceptibilidad para hongos
miceliales
Siembra de las microplacas
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Inoculación de la placa
Inóculo
100 µL
32
16
8
4
2
1
64
32
16
8
4
2
0,5 0,25 0,12 0,06 CC
1
CE
0,5 0,25 0,12
100 µL RPMI + antifúngico
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Incubación
35+2ºC 24-48 h
•24 h Mucorales
•48 h otros hongos
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Determinación de la CIM
Lectura VISUAL
Las placas se colocan en un espejo
para lectura
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Determinación de la CIM
Lectura de CIM = 100% inhibición
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Determinación de la MEC
Equinocandina:
anidulafungina, caspofungina, micafungina
MEC: mejor reproducibilidad
MEC: la menor concentración que permite
crecimiento de agregados miceliales redondos y
pequeños
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010
Puntos de corte
•
• Todavía no están establecidos.
No hay consenso de correlación clínica.
Hay propuestas de puntos para análisis con
ITZ, POSA, VCZ, AMB y CASPO.
•
•
Hay que ver la distribución de CIMs de
distintos fármacos x especies.
Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C Malbrán
SBC, 2010