AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
Keidylania da Costa Santos
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae
SOBRE A CONTRATILIDADE DE CÉRVICE OVINA
PETROLINA - PE
2013
2
Keidylania da Costa Santos
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO DE Erythroxylum caatingae
SOBRE A CONTRATILIDADE DE CÉRVICE OVINA
Trabalho apresentado a Universidade Federal do
Vale do São Francisco - UNIVASF, Campus Centro
como requisito da obtenção do título de mestre.
Orientador: Raimundo Campos Palheta Jr.
PETROLINA - PE
2013
3
4
A minha família e Nina. Meu único
verso, meu uni verso, meu universo.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha família. Foi por amor que vocês permaneceram ao meu
lado e com amor eu agradeço a vocês e a Deus por tê-los em minha vida! A minha
mãe, pelas palavras de apoio e o colo que me deu durante toda a minha vida. Você
é o meu pilar e minha força. A meu pai, que sempre trabalhou muito para manter os
estudos dos filhos. Muitas vezes abdicando de seus desejos a fim de satisfazer os
nossos. Eu vejo o quanto vocês dois se esforçaram para nos dar uma vida longe
das dificuldades que vocês tiveram. Muito obrigada. A meus irmãos, cunhado,
sobrinha, avos, tios, primas. Saibam que vocês são extremamente importantes para
mim. Amo muito vocês! Aos meus animais, a amizade que eu preciso para me fazer
mais feliz e jamais poderia deixar de agradecer a estrelinha mais linda, brilhante,
companheira que eu tive em minha vida: Nina. Amo muito e amarei sempre!
A Altamir, meu príncipe, amigo e amor, por todo o apoio. À Leilianne, porque
a amizade desperta o desejo de cuidar e proteger, a minha amiga e enfermeira. À
Nayane, desde a infância e para sempre. À Vanessa, já passamos por muitos
momentos e eu aprendi que a amizade simplesmente surge, minha parte divertida. À
Valeria e Alane, porque a amizade nos ensina, nos apoia e ajuda, minha parte
calma. À Jusciene, porque a amizade surge mesmo com todas as grandes
semelhanças, até mesmo no temperamento, a parte que mais parece comigo. Ao
Thiago, porque a amizade surge dos mais inimagináveis lugares. À Thayanne,
Sabrina e Thais, minhas psicólogas. Sou abençoada por tê-los em minha vida.
Ao Prof. Dr. Raimundo Campos Palheta Junior, pela oportunidade e apoio
necessários para o meu amadurecimento científico. A professora Dr. Flaviane
Monteiro por sua indispensável ajuda no início de toda essa jornada. Agradeço a
cada educador que passou em minha vida. A educação é o único legado que
verdadeiramente tem valor. Por isso valorizo cada um deles e agradeço
imensamente a existência de cada um.
Ao grupo LAFABI. Obrigada pelo convívio, carinho e apoio. Camilla, Noelly,
Wagner, Anita, Vanessa, Viviane, Gilson, Suelen, Luciano, Rildo. A todos meu
imenso carinho, agradecimento e infinito desejo que sejam imensamente felizes.
A Capes pela concessão da bolsa e a toda equipe do Mestrado em Recursos
Naturais do Semiárido.
6
RESUMO
Considerando as propriedades do extrato etanólico bruto de Erythroxylum
caatingae (EBEc) e a anatomia da cérvice ovina, cuja distribuição irregular dos anéis
cervicais é um fator limitante para inseminação artificial,
avaliou-se o efeito do
extrato na contratilidade de cérvice ovina, bem como o possível mecanismo de
ação. Para tanto, os segmentos circulares de cérvice foram conectados ao sistema
isométrico de avaliação de contratilidade in vitro. Após o período basal, os
segmentos foram submetidos à adição de EBEc (1-729 g.mL-1). Outros grupos de
segmentos foram submetidos a contrações induzidas por KCl 90 mM ou CCh 30 µM
seguidos da adição cumulativa de EBEc (1-729 g/mL-1). Outros segmentos foram
pré-incubados com atosibana 10 µM, L-NAME 100 µM, L-NAME 100 µM + L-arginina
300 µM, TEA 0,3 mM, glibenclamida 1µM, ou verapamil 3µM seguidos da adição de
EBEc. Além disto, um conjunto de animais foi submetido à infusão cervical com
salina 0,15 M ou EBEc 2mg para análise da contração cervical in vivo após tais
tratamentos. Os dados foram expressos (média ± E.P.M), e analisados após “t”Student ou ANOVA seguido do teste de Newman-Keuls, com p<0.05. O EBEc
diminuiu a contratilidade cervical a partir da concentração 9 µg/mL (47,8 ± 6,5%)
com efeito máximo de 85,4 ± 5,1% e EC50 17,9 ± 3,7 µg.mL-1. O EBEc também
reduziu a contração induzida por K+ ou CCh na ordem de 17,7 ± 3,8% e 47,0 ± 8,9%,
respectivamente. O L-NAME e o ODQ reduziram significativamente o efeito
relaxante cervical induzido pelo EBEc (CE50 > 729). Já na presença de L-NAME + Larginina, o relaxamento induzido pelo EBEc foi parcialmente restaurado. Os
bloqueadores de canais para potássio 4-AP, TEA e Glibenclamida não preveniram
esta resposta desencadeada pelo EBEc. Na presença do verapamil, o EBEc reduziu
a contração inicial induzida por ACh.
Além disso, o EBEc 2 mg tópico por via
intracervical provocou um relaxamento cervical in vivo de 56,6 ± 8,7%, efeito que
perdurou por 20 min. Portanto, o EBEc possui efeito miorrelaxante frente a
contração de cérvice ovina, cujo mecanismo de ação envolve a via do óxido nítrico
mediada pela transdução celular via GMPc, culminando em uma redução do cálcio
intracelular.
Palavra Chave: Ovinocultura. Inseminação artificial. Extrato etanólico.
7
ABSTRACT
Considering the properties of the crude ethanol extract of Erythroxylum
caatingae (EBEc) and the anatomy of the ovine cervix, whose irregular distribution of
cervical rings is a limiting factor for artificial insemination, we assessed the effect of
the extract on contractility of ovine cervix as well as the possible mechanism of
action.the circular segments were connected to the isometric system to in vitro
contractility evaluation . After the basal period, the segments were subjected to
addition of EBEc (1-729 µg/mL). Other segment’s groups were subjected to
contractions induced by KCl 90 mM or CCh 30 mM followed by cumulative addition of
EBEc (1-729 µg/mL). Other segments were pre-incubated with of atosibana 10 µM,
L-NAME 100 µM, L -NAME 100 µM + L-arginine 300 µM, 4-AP 3mM, TEA 0.3 mM,
glibenclamide 1 µM, or verapamil 3μM followed by the addition of EBEc. Besides,
one group of animals was subjected to cervical infusion with 0.15M of saline or
EBEc 2mg for analysis of cervical contraction in vivo after such treatments. Data
were expressed (mean ± standard deviation) and analyzed after "t"-student test or
ANOVA followed by Newman-Keuls tests, p <0.05. The EBEc decreased cervical
contractility from concentration of 9 mg/ml (47.8 ± 6.5 %) with maximal effect of 85.4
± 5.1 % and 17.9 ± 3.7 μg.mL of EC5. The EBEc reduced the contraction induced by
K+ or CCh about 17.7 ± 3.8% e 47.0 ± 8.9%, respectively. The L-NAME and ODQ
significantly reduced the cervical relaxant effect induced EBEc (EC50 > 729). In the
presence of L -NAME + L-arginine the relaxation induced by EBEc was partially
restored. 4-AP, TEA and glibenclamide, blockers of potassium channel, did not
prevent this response triggered by EBEc. In the presence of verapamil, the EBEc to
reduced the contraction induced by acetylcholine. Besides this, intracervical EBEc 2
mg caused cervical relaxation in vivo (56.6 ± 8.7%), which persist for 20 min later.
Thus, EBEc has relaxant effect on ovine cervix contraction, whose mechanism of
action involved a oxid nitric pathway mediated by GMPc cellular transduction,
resulting in a reduction of intracellular calcium.
Key word: Ovine breeding. Artificial Insemination. Ethanol Extract
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo de eventos envolvidos na contração e
relaxamento das células musculares lisas.
28
Figura 2. Via de transdução do sinal intracelular responsável pelo relaxamento
da musculatura lisa, causado pelo mediador inibitório NANC, óxido nítrico (NO).
33
Figura 3. Representação de folhas (A) e frutos (B) da espécie Erythroxylum
caatingae.
42
Figura 4. Esquema dos equipamentos utilizados nos experimentos de avaliação
da contratilidade in vitro. 1) Transdutor de força (MLT 0202, Pan Lab); 2) Bomba
de aeração; 3) Amplificador “bridge system” (Insight®, Brasil); Sistema EFF321(Insight®, Brasil); 5) Cuba de 10 mL; 6) Haste fixa; 7)Coletor.
46
Figura 5. Representação de experimento in vivo. A: Animal em estação. BTração da cérvice com o auxílio de duas pinças de Allis e um espéculo. C- Com
a cérvice tracionada, a cânula foi inserida até 2º anel cervical D- Sonda
acoplada a um transdutor de força.
50
Figura 6. A. Representação quantitativa do efeito inibitório do EBEc sobre a
contração cervical de cérvice ovina avaliada in vitro. B. Traçado qualitativo do
efeito do EBEc sobre a contração cervical de cérvice ovina.
40
Figura 7. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl 90 mM em cérvice
ovina in vitro. A: Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido
por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice
ovina pré-contraídos com KCl 90 mM. B. Representação qualitativa do traçado
típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl em cérvice ovina.
41
Figura 8. Efeito do EBEc sobre a contração tônica induzida por CCh em cérvice
ovina in vitro. A: Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido
por EBEc em concentrações cumulativas em segmentos circulares de cérvice
ovina pré-contraídos com CCh 30 µM. B. Representação qualitativa do traçado
típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por CCh em cérvice ovina.
41
Figura 9. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por
EBEc em segmentos de cérvice ovina na presença e ausencia de atosibana 10
µM.
42
9
Figura 10. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido
por EBEc em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com L-NAME 100 µM,
associação L-NAME 100 µM + L-arginina 300 µM ou controle.
43
Figura 11. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido
por EBEc segmentos de cérvice ovina pré-incubados com ODQ 10 µM
43
Figura 12. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido
por EBEc em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com Tetraetilamônio
0,3mM, Glibenclamida 1µM ou 4-aminopiridina 3 mM.
44
Figura 13. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Acetilcolina em
cérvice ovina in vitro. A: Representação gráfica da contração induzida por
acetilcolina mediante efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações
cumulativas em segmentos circulares de cérvice ovina. B. Representação
qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc sobre a contração induzida por
KCl em cérvice ovina.
45
Figura 14. Representação quantitativa dose-resposta para o efeito
miorrelaxante induzido por EBEc na concentração de 2 mg/mL nos intervalos
de 10, 20 e 30 minutos após infusão.
46
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPc
5'-AMP, 5'-monofosfato de adenosina, monofosfato de adenosina,
fosfato de adenosina
CaM
cálcio-calmodulina, CaM, Ca2+ / calmodulina, Ca2+ / CaM
CaV
Canais para Ca2+ abertos por voltagem
CCh
Carbacol
CE50
Concentração efetiva para se obter 50% da resposta estimada em
100%
COX
Ciclooxigenase
DAG
D-1,2-Diacilglicerol
EBEc
Extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae
EDRF
Fator relaxante do endotélio
E.P.M.
Erro padrão da média
GCs
Enzima guanilato ciclase solúvel
GMPc
Monofosfato cíclico do guanosina
GPCR
Receptores acoplados a proteína G
IA
Inseminação artificial
IP3
Trifosfato de Inositol
IA
Inseminação artificial
IP3
Trifosfato de Inositol
KCl
Cloreto de potássio
MLCK
Cinase de cadeia leve da miosina
NaCl
Cloreto de sódio
NANC
Nervos não adrenérgicos
NOS
Óxido nítrico sintases
eNOS
Óxido nítrico sintase endotelial
nNOS
Óxido nítrico sintase neuronal
iNOS
Óxido nítrico sintase induzida
PIP2
Bifosfato de inositol
PKA
Proteína quinase A
TEA
Tetraetilamônio
UI
Unidades internacionais
4- AP
4-aminopiridina
11
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Produtos Naturais
16
2.2 Metabólitos secundários
18
2.3 Caatinga
19
2.4 Ovinocultura
21
2.5 Inseminação Artificial
22
2.6 Morfo-fisiologia da cérvice ovina
24
2.7 Músculo liso
26
2.8 Canais para cálcio
28
2.9 Óxido Nítrico
31
2.10 Canais para Potássio
33
2.11Tocolíticos
35
2.12 Dilatadores cervicais
37
2.13 Considerações sobre o gênero Erytroxylum
40
3 OBJETIVO
44
4 MATERIAL E MÉTODOS
45
4.1 Animais
45
4.2 Material Botânico
45
4.2.1 Preparação do extrato para os ensaios farmacológicos
45
4.3 Fármacos
45
4.4 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS IN VITRO
46
4.4.1 Preparo do tecido
4.4.2. Avaliação in vitro do efeito do EBEc sobre a contração em cérvice
46
ovina
4.4.3. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por potássio em cérvice
46
ovina
4.4.4. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Carbacol (CCh) em
47
cérvice ovina
4.4.5. Investigação do efeito do EBEc sobre a amplitude da contração de
cérvice ovina pré-incubada com ocitocina ou atosibana
47
13
4.4.6. Avaliação do possível envolvimento do óxido nítrico no relaxamento
48
cervical induzido por EBEc
4.4.7 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no
48
relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Via GMPc
4.4.8 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no
49
+
relaxamento cervical induzido pelo EBEc: canais para Potássio (K )
4.4.9 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no
49
relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Liberação de Ca2+ intracelular
mediado por ligante
4.5 PROTOCOLO EXPERIMENTAL IN VIVO
4.5.1.Avaliar a contração da cérvice ovina in vivo
49
4.6 Análise Estatística
51
5 RESULTADOS
52
6 DISCUSSÃO
59
7 CONCLUSÃO
68
8 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
69
14
1. INTRODUÇÃO
O Brasil possui um expressivo rebanho de ovinos, com um efetivo de 17,3
milhões de cabeças (IBGE, 2010) ocupando a 17º colocação mundial em número de
animais de acordo com a FAO (2012). Deste rebanho, 56,7% encontra-se na região
Nordeste (SOUZA et al., 2012). Destacando o expressivo consumo per capita anuais
em grandes cidades, a exemplo de Petrolina (11,7 kg) e Juazeiro (10,8 kg). Assim, a
ovinocultura é uma atividade de grande relevância econômica e social, por fornecer
carne a preços acessíveis às populações rurais e às periferias das grandes cidades
do Nordeste Brasileiro. Entretanto, nessa região o sistema de produção na maioria
das propriedades é extensivo caracterizando por baixos índices zootécnicos, abate
de animais tardios, qualidade de carne incompatível com a demanda, além da
constante irregularidade de oferta (NUNES et al., 2007).
Tal déficit na produtividade também é reflexo da baixa utilização e difusão das
biotécnicas da reprodução, que incorre em índices reprodutivos baixos, com uma
significativa redução no retorno financeiro ao produtor rural (LOPES-JUNIOR, 2006).
Por outro lado, quando devidamente utilizadas, as biotécnicas da reprodução,
constituem fortes aliadas e resultam em significativas melhorias na produtividade e
rentabilidade dos rebanhos (SIMPLÍCIO et al., 2007). Dentre essas técnicas de
manejo reprodutivo, destacam-se a estação de monta, inseminação artificial (IA),
sincronização/indução do estro, superovulação, produção in vivo e in vitro de
embriões, transferência de embriões, diagnóstico precoce de gestação e, quando
necessário, a indução do parto (KRUIP; REENEN, 2000).
Ressalta-se que a IA é uma técnica que apresenta grande impacto em um
programa de melhoramento genético, desde que bem conduzida. No entanto, no
Brasil e no mundo, a IA ainda não é tão difundida em ovinos tanto quanto é em
outros animais como os bovinos. Alguns fatores contribuem para isso, dentre os
quais se destaca a anatomia da cérvice ovina, cuja distribuição irregular e
interposição dos anéis resultam em uma luz cervical reduzida, dificultando a
realização da IA pelo método transcervical (HAFEZ, 2004; LUZ et al., 2000; NAQVI
et al., 1998).
Na tentativa de atenuar as dificuldades em realizar a IA pela via transcervical
em ovinos, alguns trabalhos vêm sendo desenvolvidos para induzir a dilatação
15
cervical (FALCHI et al., 2012; LEETHONGDEE et al., 2007; PERRY et al., 2010).
Entretanto, as substâncias, alvos dessas pesquisas, além de caras, são de difícil
acesso aos pequenos produtores em regiões mais distantes das grandes
metrópoles.
Neste contexto, devido à diversidade química estrutural de compostos
bioativos obtidos de plantas, pesquisas são conduzidas para a elucidação de
eventual aplicabilidade clínica das substâncias provenientes de produtos naturais.
Inclusive tais estudos contribuem para a compreensão de eventos fisiológicos, como
a contratilidade da musculatura lisa uterina (CHIWORORO; OJEWOLE, 2009).
De fato, recentemente extratos obtidos de plantas do gênero Erythroxylum,
cuja distribuição territorial abrange florestas úmidas da Mata Atlântica, nos Brejos de
Altitude, nas Matas Serranas, nas Restingas e em áreas mais secas da Caatinga
(LOIOLA, 2007), demonstraram efeito miorrelaxante sobre a musculatura lisa uterina
e na traqueia de roedores (SANTOS et al., 2013; SILVA et al., 2010). Tais resultados
corroboram os relatos da utilização medicinal de extratos obtidos deste gênero para
o combate de afecções no sistema respiratório e genito-urinário (SILVA et al., 2001).
Baseado nisso e considerando a necessidade de investigações de
alternativas viáveis para dilatação cervical a fim de otimizar a IA transcervical em
ovinos, este estudo avaliou o efeito do extrato de Erythroxylum caatingae sobre a
contratilidade de cérvice ovina, bem como investigou o possível mecanismo de ação
desencadeado por este extrato. Com a execução deste trabalho, almeja-se agregar
valor a este produto natural obtido no Semiárido Nordestino ao suscitar a hipótese
sobre sua eventual aplicabilidade no suporte a IA transcervical em ovinos.
16
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Produtos Naturais
O conhecimento histórico do uso de plantas medicinais remonta às
civilizações primitivas que perceberam a existência de plantas comestíveis dotadas
de maior ou menor toxicidade, que, ao serem utilizadas no combate das
enfermidades, revelavam potenciais preventivos e/ou terapêuticos (CAMARGO,
2006). Estima-se que no período anterior aos fármacos sintéticos, 80% dos
medicamentos eram manipulados a partir de cascas, raízes e folhas vegetais
(McCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007).
Nesse contexto surgiu a fitoterapia (do grego phyton = vegetal e therapeia =
tratamento), baseada no estudo das plantas medicinais e suas aplicações na cura
das doenças. Assim, planta medicinal é aquela que contém um ou mais princípios
ativos com atividade terapêutica potencial. Estes princípios ativos, em sua maioria,
são sintetizados a partir do metabolismo secundário dos vegetais (BRASIL, 2006).
Cerca de 60% da população mundial depende dos produtos de origem
vegetal, devido ao reconhecido efeito terapêutico dos fitoterápicos (HARVEY, 2000).
Vale salientar que o Brasil, cuja biodiversidade abrange cerca de 25% das espécies
vegetais encontradas no mundo, é considerado um país com grande potencial de
plantas medicinais, exóticas e representa um vasto campo comercial, científico e
tecnológico para ser explorado (MALUENDAS; PEITZ, 2004). Entretanto a
exploração e validação de plantas medicinais em medicamentos eficazes e seguros
não são feitos somente com base no conhecimento popular. É necessária a
fundamentação científica demonstrando os benefícios e os possíveis riscos após
sua administração em animais e/ou seres humanos (YUNES et al., 2001).
Nesse sentido, a partir do interesse da indústria farmacêutica pelo uso da
biodiversidade vegetal como fonte de novos medicamentos, iniciou-se uma nova
fase para o isolamento dos constituintes vegetais dotados de atividade
farmacológica, a fim de substituir o vegetal e/ou seus extratos pelos compostos
bioativos com maior especificidade farmacológica da substância isolada (CORDELL,
2000; MOREIRA et al., 2010). Para isso, são levadas em consideração as
17
exigências de segurança, eficácia e qualidade das agências regulamentadoras para
a utilização de produtos terapêuticos (HARVEY, 2007; PUPO; GALLO, 2007).
Entretanto, devido ao custo elevado para que sejam desenvolvidas tais
investigações aprofundadas sobre a composição química dos produtos naturais com
potencial farmacológico, são considerados a composição química da espécie em
questão ou de outras espécies do mesmo gênero ou família, o uso popular e os
dados experimentais anteriores com animais de experimentação ou seres humanos.
Em sua maioria os estudos pioneiros são conduzidos mediante a utilização de
extratos brutos ou suas frações, ou simplesmente o chá obtido do vegetal
(CHIWORORO; OJEWOLE, 2009; OLIVEIRA et al., 2011; ZHENG et al., 2010).
Inclusive há o empenho no desenvolvimento de pesquisas utilizando extratos
vegetais com atividade na musculatura lisa, estrutura responsável pelo controle da
contratilidade de diferentes órgãos, a exemplo dos vasos sanguíneos, estômago,
bexiga, vias aéreas, intestino e útero (AGUIAR et al., 2012; INTERAMINENSE et al.,
2010; JUCÁ et al., 2011; SIQUEIRA et al., 2012). Considerando que a fisiopatologia
de diversas enfermidades como hipertensão, cólica, asma brônquica e aborto têm
sua gênese em alguns destes órgãos, é relevante a pesquisa sobre o
desenvolvimento de medicamentos acessíveis e efetivos para prevenção ou
tratamento destas e de outras alterações funcionais da musculatura lisa (WEBB,
2003).
Uma das mais recentes conquistas da medicina alternativa é a portaria
Interministerial (2.960/2008) assinada pelo Ministério da Saúde que instituiu o
Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que tem como objetivo
garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas
medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade e
desenvolvimento da cadeia produtiva e indústria farmacêutica nacional. Tendo em
vista que o uso de plantas é prática prevalente em ampla faixa populacional
brasileira, várias plantas poderão vir a ser incluídas na RENISUS (Relação Nacional
de Plantas medicinais de interesse ao Sistema Único de Saúde) ratificando a
necessidade de pesquisas que avaliem o potencial farmacológico das plantas
(BRASIL, 2009).
Apesar deste incentivo para utilização de substâncias advindas de produtos
naturais em seres humanos, na medicina veterinária, apenas 1% do mercado de
fitoterápicos no país é voltado ao segmento, apesar de estar em constante
18
crescimento, 25% ao ano, representando cerca de 6,7% do mercado total de
medicamentos (QUINTELA, 2004). O fácil acesso, baixo custo, efeito terapêutico e
profilático são fatores que contribuem para o uso frequente destes produtos, sendo
assim uma alternativa viável para a saúde humana e animal (OZAKI; DUARTE
2006).
2.2 Metabólitos secundários
Entende-se por metabolismo primário o conjunto de processos metabólicos
que desempenham uma função essencial no vegetal, tais como a fotossíntese,
respiração e o transporte de solutos. Os compostos envolvidos no metabolismo
primário possuem uma distribuição universal nas plantas, a exemplo dos
aminoácidos, nucleotídeos, lipídios, carboidratos e da clorofila. O metabolismo
secundário origina compostos que não possuem uma distribuição universal, pois não
são necessários para todas as plantas. Existem três grandes grupos de metabólitos
secundários: terpenos, compostos fenólicos e alcaloides (PEREZ, 2004).
A espécie vegetal, partes estruturais, condições de crescimento, solo, água,
temperatura, estação do ano e idade influenciam na variedade dos componentes
químicos das plantas (PAGE et al., 2006). Além disso, estudos comprovam que a
composição
dos
metabólitos
secundários
de
uma
planta
pode
variar
consideravelmente durante o ciclo dia/noite. Tal conhecimento inclusive é utilizado
desde a antiguidade, uma vez que a colheita de plantas como a Conium maculatum
era realizada pela manhã, pois os níveis de coniina (substância neurotóxica,
conhecida popularmente como cicuta, utilizada para a execução de prisioneiros na
Grécia antiga) são maiores durante este período do dia (NETO; LOPES, 2007). De
fato, os metabólitos secundários representam uma conexão química entre as plantas
e o ambiente circundante, sendo sua síntese comumente influenciada por condições
ambientais (KUTCHAN, 2001).
Portanto, como os metabólitos sofrem influência da sazonalidade, a natureza
do constituinte ativo pode variar ao longo do ano (JENKS et al., 1996). Sabe-se
também que a fotossíntese, a mobilização de reservas e o crescimento podem ser
alterados por estresse hídrico e consequentemente, levar a alterações no
19
metabolismo secundário (WALLAART, 2000). Isto é um fator preocupante quando
ocorrem períodos longos de estiagem em regiões como o Semiárido nordestino. Por
outro lado, os estímulos causados por chuvas ou os ferimentos advindos do granizo,
invasão por patógenos e pastagem de herbívoros também podem influenciar a
expressão do metabolismo secundário (BOWERS,1993).
2.3 Caatinga
O Semiárido nordestino ocupa uma área equivalente a aproximadamente 10%
do território brasileiro, tendo cerca de 800.000 km² (AB’SABER, 1974). Deste
espaço, a Caatinga abrange 735.000 km2 e compreende áreas dos estados do Piauí,
Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e a
parte nordeste de Minas Gerais (AB’SABER, 1977).
De origem tupi o termo Caatinga significa mata branca, alusão ao aspecto
desta vegetação durante a estiagem, quando as árvores perdem as folhas e os
arbustos dominam a paisagem semiárida (PRADO, 2003). Características comuns
às espécies dos gêneros Tabebuia (Bignoniaceae), Cavallinesia (Bombacaceae),
Schinopsis e Myracrodruon (Anacardiaceae) e Aspidosperma (Apocynaceae),
dominantes nos tempos pré-colombianos (COIMBRA-FILHO; CÂMARA, 1996).
Apesar de há algum tempo a Caatinga ter sido classificada como um bioma
de baixa biodiversidade (PRANCE, 1987; VANZOLINI et al., 1980), atualmente se
sabe que o nível de distribuição de espécies vegetais é bastante alto. De fato,
Giulietti et al. (2004) afirma que o bioma Caatinga detém 18 gêneros e 318 espécies
endêmicas, pertencentes a 42 famílias, incluindo tanto plantas de áreas arenosas
como rochosas. Fernandes (2006) afirma que tamanha biodiversidade está
diretamente relacionada a um conjunto de influências tais como fatores
paleoclimáticos, estrutura geológica e a natureza litológica do substrato, que levaram
ao surgimento da vegetação peculiar com a respectiva caracterização florística.
Deste modo, a Caatinga é um dos espaços semiáridos da América do Sul detentor
de uma organização natural única, embasando a afirmação: a Caatinga é um bioma
exclusivamente brasileiro.
20
Em virtude desta biodiversidade e de suas características particulares, a
Caatinga é considerada um importante laboratório para estudos de plantas (LEAL et
al., 2003). Apesar disso, a Caatinga ainda é o bioma menos estudado do Brasil
(ALBUQUERQUE; ANDRADE, 2002).
Todavia este bioma tem sido dominado por um cenário de degradação
ambiental decorrente do binômio gado-algodão que trouxe riqueza para os
proprietários sertanejos e pobreza para o cenário das Caatingas (LEAL, 2003). De
acordo com Casteletti et al. (2004) estima-se que cerca de 30,4% a 51,7% da área
da Caatinga foi alterada por atividade antrópica, tais como estradas, pastagens,
terras agricultáveis e outros tipos de uso intensivo do solo.
Além disso, o uso
insustentável dos seus recursos naturais está levando à rápida perda de espécies
endêmicas, eliminação de processos ecológicos chaves e formação de extensos
núcleos de desertificação em vários setores da região (LEAL et al., 2003).
Portanto, estudos voltados para biodiversidade vegetal e animal neste bioma
são bastante animadores, pois através dessas investigações novos produtos com
potencial econômico poderão ser desenvolvidos, contribuindo para a qualidade de
vida das mais de 25 milhões de pessoas que vivem na Caatinga (MITTERMEIER et
al., 2002), dentre as quais, a população rural que vive em situação de pobreza em
decorrência das fortes estiagens, falta de investimento público e vontade política que
em conjunto depreciam a produtividade da região, dentre outros fatores como a má
distribuição de renda que também aflige outras regiões do Brasil (SAMPAIO;
BATISTA, 2004).
2.4 Ovinocultura
Do ponto de vista do potencial produtivo, a criação de ovinos é uma das
primeiras atividades silvipastoris de que se tem relato. Teve sua criação baseada na
possibilidade de fornecer alimento através da carne e leite, e prover proteção frente
às intempéries pelo uso da lã (VIANA, 2008). Desde então a ovinocultura passou por
muitas transformações, em especial nas últimas décadas, com a abertura do
comércio internacional e estabilidade monetária que permitiram um cenário favorável
para o seu desenvolvimento no Brasil. Inclusive, hoje se sabe que a ovinocultura
21
quando bem explorada é uma alternativa viável para diferentes ecossistemas
(SIMPLICIO, 2001).
Segundo o IBGE (2010), o Brasil possui 17,3 milhões de cabeças ovinas
distribuídas por todo o país, porém, concentradas em grande número no estado do
Rio Grande do Sul e na região Nordeste, particularmente na Bahia e Pernambuco,
que contribuem com 58% dos ovinos do país (CNA, 2007). Em Pernambuco há
elevada concentração de animais no Sertão, que detém 89,73% do total de animais,
já o Agreste tem 8,50%, e a região litorânea 1,77%. Esta distribuição reflete a
potencialidade da ovinocultura no sertão semiárido (CARVALHO; SOUSA, 2008).
Segundo Sampaio et al. (2006) as três principais microrregiões pernambucanas que
concentram quase dois terços do rebanho são Itaparica, Petrolina e Sertão do
Moxotó.
Há uma grande diferença nos dois polos principais de produção ovina no
Brasil. No Rio Grande do Sul a criação é baseada em ovinos de raças de carne,
lanadas e mistas, adaptadas ao clima subtropical, onde se obtém o produto lã e
carne, já na região nordeste prevalece os ovinos de raças mestiças deslanadas,
adaptadas ao clima tropical, com alta rusticidade e produtoras de carne e peles
(IBGE, 2005).
Segundo Nogueira Filho e Kasprzykowski (2006), na região Nordeste o
consumo per capita é mais que o dobro do registrado no Brasil, chegando a um
índice de 1,5 kg/hab/ano. Destacam-se as cidades de Juazeiro (BA) e Petrolina (PE)
que apresentam consumo de 10,8 kg e 11,7 kg per capita anuais, respectivamente.
Além da oferta na região e da característica cultural, um dos fatores que contribuem
para o consumo da carne ovina é sua textura fina, gordura branca e compacta, cujo
valor nutritivo é resultado principalmente de sua riqueza em proteínas, minerais,
vitaminas e boa digestibilidade (GARCIA, 2004).
Dessa forma a ovinocultura é uma atividade econômica em contínua
expansão no Brasil. Dados do IBGE permitem observar que entre os anos de 1975 e
2003, o rebanho ovino brasileiro chegou a crescer até 455% em algumas regiões
brasileiras. Isto mostra aumento da importância da atividade e sua contribuição para
o produto interno bruto do agronegócio brasileiro, com expressivo impacto sócioeconômico na região (VASCONCELOS; VIEIRA, 2005).
22
2.5 Inseminação Artificial
Assim, para que haja uma maior produtividade da ovinocultura, além do
controle nutricional e sanitário, há necessidade de difusão da utilização de
biotécnicas da reprodução que permitam o melhoramento genético de espécies,
dentre estas biotécnicas destaca-se a Inseminação artificial (IA) devido a seu baixo
custo quando comparado aos demais procedimentos (WULSTER-RADCLIFFE et al.,
2004). A IA consiste na deposição do sêmen fresco ou congelado-descongelado no
trato genital da fêmea (AX et al., 2000). O seu uso possibilita a utilização de sêmen
de animais melhorados geneticamente ou dos que já vieram a óbito, também diminui
a transmissão de doenças venéreas e facilita a realização de testes de progênie,
inclusive permitindo que machos subférteis produzam proles (MIES FILHO, 1987),
além de otimizar a obtenção de crias sem a necessidade de transportar os
reprodutores, fato que minimiza o estresse (HAFEZ, 2004).
Novas técnicas de inseminação artificial foram desenvolvidas haja vista a
necessidade de adaptação da técnica para as diferentes espécies associadas ao
melhor custo-benefício. Neste sentido, o método de deposição do sêmen no trato
genital da fêmea ovina pode ser vaginal, cervical, transcervical e intra-uterina
(DONOVAN et al., 2001; AX et al., 2000).
Dentre os métodos de deposição intrauterina, destaca-se a inseminação
laparoscópica, procedimento cirúrgico no qual o sêmen é depositado no lúmen dos
dois cornos uterinos, permitindo assim a utilização de uma menor concentração
espermática. Entretanto, esta técnica demanda equipamentos de elevado valor e
mão-de-obra especializada (KING et al., 2004), dificultando o seu uso rotineiro em
criações de pequenos produtores (BICUDO et al., 2003; KERSHAW et al., 2005).
Com isso, os métodos não cirúrgicos (vaginal, cervical e transcervical) para
deposição do sêmen são os mais usados, pois não demandam todo o aparato
tecnológico e a mão de obra especializada utilizadas na laparoscopia. Em ovinos, a
IA por via vaginal é a mais simples, deposita-se o sêmen na vagina com auxílio de
uma pipeta sem nenhuma tentativa de localizar a cérvice, sendo por isso conhecida
como “tiro no escuro” (AISEN, 2004). Entretanto, nessa técnica a fertilidade é
altamente variável e este método é inadequado quando se faz uso de sêmen
congelado (DONOVAN et al., 2001).
23
Outro método conhecido é a IA via cervical, onde o sêmen é depositado
dentro da cérvice, o mais profundo possível (CHEMINEAU et al., 1991). A IA cervical
com sêmen líquido é o método mais utilizado em ovelhas por quatro razões básicas:
aplicação fácil, rápida, custos relativamente baixos e obtenção de resultados
satisfatórios de fertilidade, desde que seja utilizado sêmen fresco (BODIN et al.,
1997), visto que os índices médios de fertilidade obtidos com sêmen congelado são
em geral insatisfatórios, variando de 6% a 45% (DONOVAN et al., 2004; CRUZ et
al., 2006).
Na tentativa de viabilizar o uso do sêmen congelado com custo reduzido na
espécie ovina, foi desenvolvida a técnica de IA intrauterina transcervical que teria
maior aplicabilidade por ser um método não-cirúrgico (RABASSA et al., 2007).
Entretanto, apesar da crescente utilização da técnica de IA em ovinos, a maior
difusão entre os produtores é dificultada pelas baixas taxas de fertilidade ovina
quando comparadas à espécie bovina. Dentre outros fatores, a anatomia cervical
ovina é caracterizada pelo formato irregular, o tamanho variável do canal cervical,
além de diversos tipos de óstio cervical que dificultam a acessibilidade do local de
deposição do sêmen. Baseado nesses fatores Wulster-Radcliffe et al. (2004)
estabeleceram 3 métodos para atenuar tal dificuldade:
- Método físico: com o auxílio de uma pinça hemostática a cérvice é
tracionada e fixada com objetivo de alinhar o canal cervical, diminuindo as
obstruções ao acesso do lúmen uterino.
- Método químico: fármacos de diferentes classes são utilizados para relaxar
a musculatura lisa cervical, conhecidos como dilatadores cervicais.
- Método mecânico: utilizando um equipamento para inseminação artificial e
transferência de embrião transcervical método apropriado para vencer as
dificuldades físicas relacionadas com a cérvice ovina.
2.6 Morfo-fisiologia da cérvice ovina
Diante dos fatores descritos anteriormente, a seguir foi feita uma breve
abordagem das características morfofisiológicas da cérvice ovina. É um órgão
tubular, longo, fibroso de natureza predominantemente conjuntiva, com uma camada
24
de serosa exterior e epitélio luminal interno medindo entre 4-7 cm que é responsável
por conectar o útero à vagina (KERSHAW et al., 2005; CRUZ et al., 2006). Vale
salientar que o comprimento da cérvice da ovelha é influenciado pela raça, idade,
número de partos e estado fisiológico (KAABI et al., 2006).
Na ovelha, a cérvice é composta por uma espessa parede e uma luz constrita,
caracterizada pela presença de proeminências, denominadas anéis cervicais. Estes
anéis interpõem-se uns aos outros, ocluindo a cérvice e tal disposição evita a
ocorrência de infecções (EVANS; MAXWELL, 1990). Apenas durante o estro ou
trabalho de parto a musculatura cervical relaxa o suficiente permitindo a entrada dos
espermatozóides no útero ou a passagem do concepto (HAFEZ, 2004).
Dentre as funções da cérvice, Hafez (2004) destaca o transporte espermático
através do muco cervical para o interior do útero, uma vez que o muco cervical
auxilia na condução do gameta masculino até o oócito. Outra função comum à
cérvice é atuar tal qual um reservatório, além de selecionar espermatozóides viáveis,
posto que após a cobertura uma quantidade maciça destes fica alojada nos anéis
cervicais.
Portanto,
a
cérvice
pode
atuar
regulando
a
quantidade
de
espermatozóides que chegam ao local de fertilização, selecionando os mais viáveis,
uma vez que a penetração destes gametas depende da viabilidade e da estrutura
espermática (HAFEZ, 2004).
O tecido conjuntivo do estroma cervical é composto por substância básica,
constituintes fibrosos e elementos celulares. Basicamente, os padrões de
organização e dissociação dos constituintes fibrosos intermedeiam o afrouxamento
dos tecidos cervicais aumentando os espaços entre os feixes de colágenos
promovendo a dilatação da cérvice (HAFEZ, 2004). Constatou-se ainda que o influxo
de neutrófilos, pela produção de colagenases, para o interior da cérvice parece ser
um importante componente para o amolecimento cervical (WESTERHAUSENLARSON et al., 1996).
Outro
constituinte
da
cérvice
é
o
muco
cervical,
composto
por
macromoléculas de mucina de origem epitelial, carboidratos (galactose, a
glicosamina, a fucose e o ácido siálico) e proteínas (pré-albumina, a lipoproteína, a
albumina e as y-globulinas). O muco cervical contém ainda várias enzimas incluindo
glucoronidase, amilase, fosforilase, estearase e fosfatases. A secreção de muco
cervical é estimulada pelos estrógenos ovarianos e inibida pela progesterona. Estas
diferentes respostas aos hormônios sexuais contribuem para as alterações nas
25
propriedades do muco cervical, como aumento na quantidade, viscosidade,
cristalização e pH, assim como diminuição da viscosidade e do conteúdo celular
que ocorrem durante o estro e a ovulação; já o inverso ocorre durante a fase
luteínica (GONZALEZ, 2002).
Quanto ao óstio cervical externo, existe uma classificação anatômica em 4
tipos: “flap” ou aba, bico de pato, espiral e roseta (HALBERT et al., 1990). Anos mais
tarde, Kershaw et al. (2005) identificou mais um formato, o qual foi designado liso
(fenda). Por fim, como já descrito, a distribuição irregular dos anéis cervicais atrelado
ao tônus da musculatura lisa, resulta em uma luz cervical restrita à realização da IA
pelo método transcervical.
2.7 Músculo liso
De acordo com Guyton (2006) fisiologicamente o músculo liso é dividido em
dois tipos principais: músculo liso multiunitário e músculo liso de uma unidade só. O
primeiro é formado por fibras independentes de músculo liso e inervado por
terminação nervosa única, o que permite a contração independente de cada fibra
muscular, sendo encontrado no músculo ciliar do olho, íris do olho, membrana
nictitante e músculos piloeretores. O segundo tipo muscular tem como característica
a habilidade de contrair suas fibras juntas, como uma só unidade. Logo, conhecido
como “unidade só” ou músculo sincial. Para tanto, suas fibras possuem membranas
celulares interconectas por junções abertas, o que permite o fluxo de íons de uma
célula a outra, de modo que o potencial de ação seja propagado entre as fibras e
assim a força gerada por uma fibra muscular possa ser transmitida à seguinte. Este
tipo de músculo é encontrado em órgãos como o intestino, vias biliares, ureteres,
útero e muitos vasos sanguíneos e por isto é conhecido por músculo liso visceral.
A base química para a contração do músculo liso reside nos filamentos de
actina e miosina. Entretanto, diferentemente dos músculos esqueléticos, o músculo
liso não contém troponina. E isto configura um dos motivos pelo qual o seu
mecanismo para o controle da contração é diferenciado. De fato, o tempo em que as
26
pontes cruzadas permanecem presas aos filamentos de actina é maior na
musculatura lisa e isto implica na intensidade da força de contração. Uma provável
razão para esses ciclos lentos é a de que as cabeças de miosina conteriam menor
atividade de ATPase, de modo que a degradação do ATP, energia necessária para
realizar os movimentos das cabeças, ficaria muito reduzida, com diminuição
correspondente da frequência dos ciclos. A musculatura lisa das vísceras ocas
permite que seus diâmetros luminais variem desde valores muito grandes até quase
zero (WIDMAIER et al., 2006).
Para tanto, a contração do músculo liso é um evento um tanto complexo e
pode ser estimulado ou inibido a se contrair por múltiplos tipos de sinais: neural,
hormonal e por vários outros meios. Sendo que a membrana do músculo liso contém
muitos tipos distintos de proteínas receptoras, capazes de desencadear o processo
contrátil, através da conexão entre os eventos da membrana e o aumento da
concentração intracelular de Ca2+ (GOODMAN; GILMAN, 2006).
De fato, para que ocorra a contração muscular são necessárias várias etapas
que envolvem, quase sempre, aumento da concentração de Ca2+ no citosol. Este
aumento pode ser proveniente da liberação dos estoques presentes no retículo
sarcoplasmático ou ainda da entrada de Ca2+ a partir do meio extracelular através de
canais presentes no sarcolema advindos da despolarização da membrana. Essa
despolarização promove alteração da conformação espacial de determinadas
proteínas presentes na membrana que funcionam como poros e, uma vez abertos,
permitem a passagem seletiva de Ca2+ pelos chamados canais para Ca2+ abertos
por voltagem (CaV) (SOMLYO, 2003).
Na célula muscular lisa, a partir de um aumento na concentração citosólica de
Ca2+, forma-se um complexo entre quatro átomos de Ca2+ e uma proteína
citoplasmática chamada calmodulina (CaM), em combinação com a cinase de
cadeia leve da miosina (MLCK, Myosin Light Chain Kinase), formarão um complexo
responsável pela fosforilação da cadeia leve de miosina. A ligação do Ca2+ com a
calmodulina aumenta a habilidade da actina em ativar a ação ATPásica da miosina,
promovendo a quebra de trifosfato de adenosina (ATP) ligado à cabeça da miosina.
Com a hidrólise do ATP, a cabeça de miosina, que teve conformação alterada se
associa à actina e assim é capaz de gerar a contração através da efetivação destes
ciclos (fig. 1) (AKATA, 2007; FRY et al., 2009). Em situação inversa, o relaxamento
do músculo liso é resultado de vários mecanismos que promovem a redução da
27
concentração Ca2+ citosólico. Incluem-se os mecanismos relacionados ao sequestro
de Ca2+ de volta para seus estoques intracelulares ou o seu bombeamento para o
meio extracelular através de transportadores de membrana (WEBB, 2003).
O sinal para o início da contração do músculo liso também pode ser gerado
independentemente das alterações do potencial transmembrana, mediante ativação
de receptores acoplados à proteína G (GPCR). A proteína G consiste em 3
subunidades α, β e γ que, em repouso, permanecem ligadas umas a outras e com
um nucleotídeo de guanina (GDP) ligado a subunidade α. Na presença de um
agonista, ocorre a mudança na conformação destas subunidades, provocando a
dissociação do GDP e sua substituição por GTP, que leva a separação da
subunidade α das subunidades β e γ, assumindo a forma ativa da proteína G. Desse
modo à proteína G é o vínculo entre os receptores de membrana e a primeira etapa
na cascata de transdução de sinais intracelulares mediada por segundos
mensageiros que podem inclusive desencadear a abertura dos chamados canais
para Ca2+ (RANG DALE, 2003; SOMLYO, 2003).
Também existe a possibilidade de abertura de canais para Ca2+ abertos por
estímulo mecânico, quando ocorre, por exemplo, estiramento do tecido visceral por
presença de conteúdo no lúmen do órgão envolvido. Além desses, ainda existem os
canais para Ca2+ abertos por estoques que parecem ser envolvidos com a regulação
da concentração intracelular de Ca2+ após a depleção dos estoques reticulares
desse íon (BERRIDGE, 2009).
Figura 2. Esquema representativo de eventos envolvidos na contração e relaxamento das
células musculares lisas (Adaptado de LIMA JR, 2010).
28
2.8 Canais para cálcio
Vale destacar que o íon Ca2+ é um importante mensageiro intracelular,
fundamental em outros processos metabólicos, como a atividade cardíaca,
coagulação sanguínea, manutenção das membranas celulares e sinapses nervosas.
Tais processos são desencadeados pelo fluxo de Ca 2+ celular (OIGMAN; FRITSCH,
1998).
Visto que as concentrações de Ca2+ extracelular variam em torno de 5mM
enquanto sua concentração no meio intracelular está entre 0,1 e 10 µM quantitativo,
o que gera um gradiente eletroquímico favorável para a entrada de Ca2+ ao
citoplasma, através de transportadores ou canais iônicos específicos presentes na
membrana plasmática. Vale salientar que as mudanças na concentração de Ca2+
intracelular não ocorrem somente pela entrada e saída de cálcio através da
membrana, mas também se dá através das constantes oscilações dos estoques de
Ca2+ intracelular (ALBERTS et al., 2002).
Os canais iônicos abertos por voltagem tem essa definição por serem na
maioria dos casos proteínas de canal que permitem ou bloqueiam o fluxo de íons a
depender da voltagem ou diferença de potencial de membrana da célula. Entre os
canais iônicos abertos por voltagem estão os canais para K+, Na+ e Ca2+. Os canais
para Ca2+ abertos por voltagem (CaV) são proteínas de membrana que conduzem
Ca2+ e são ativados pela despolarização da mesma, promovendo o influxo do íon
que serve como um segundo mensageiro intracelular, transformando sinais elétricos
em químicos. Esse processo controla diversos eventos intracelulares, como
exocitose, endocitose, contração muscular, transmissão sináptica e metabolismo
(TREVESIAN, 2010).
Os canais para Ca2+ dependentes de voltagem podem ser divididos em
função de sua voltagem em L, N, P, Q, R e T. Os canais para Ca2+ do tipo L (canais
de longa duração ou lentos) são canais localizados no músculo cardíaco,
esquelético, retina e cérebro. A ativação deste canal se dá pela mudança abrupta na
diferença de potencial (despolarização), porém o efeito sobre a inativação é
pequeno; são também sensíveis aos antagonistas da dihidropirina – DHP
29
(nimodipina, nifedipina e nicardipina) e ao agonista BayK S-8644. Os canais para
Ca2+ do tipo N, P, Q e R são canais que se localizam nos terminais pré-sinápticos,
da mesma forma que os canais para Ca2+ do tipo L a ativação desses canais (N, P,
Q e R) é mediada pela despolarização, porém essa despolarização surte pouco
efeito na inativação e tem como função principal a liberação de neurotransmissores.
Os canais para Ca2+ do tipo T estão localizados nos músculos cardíaco e liso
vascular e no sistema nervoso. A ativação desses canais se dá quando a
despolarização da célula está próxima do potencial de repouso e sua reativação
requer uma intensa hiperpolarização, e tem como papel principal a propagação dos
potenciais de ação dos neurônios e das células musculares cardíacas e vasculares
(BOOTMAN et al., 2001; CATTERALL; PEREZ-REYES; SNUTCH et al., 2005).
Em 2000 uma nomenclatura foi adotada baseada nos bem definidos canais
para potássio. Assim, os canais para cálcio foram nomeados utilizando o símbolo do
íon em questão “Ca” com a forma de controle “voltagem”. Deste modo os canais
foram nomeados de Cav. A indicação numérica corresponde as subunidades. Assim
Cav 1, subfamília (Cav 1.1 - Cav 1.4) é mediados pelo tipo de corrente L. O Ca v 2,
subfamília (Cav 2.1 - Cav 2.3) é mediado por correntes do tipo P, Q, N e R. O Cav 3,
subfamília (Cav 3.1 - Cav 3.3) é mediado por correntes do tipo T (CATTERALL;
PEREZ-REYES; SNUTCH et al., 2005).
Nas células musculares há uma proteína ligadora de Ca2+, a calmodulina. A
ligação do Ca2+ à calmodulina permite a ativação ou inativação de uma variedade de
enzimas, como por exemplo, a adenilato ciclase e/ou a fosfolípase C. A ativação da
proteína ligadora de Ca2+ tem dois grandes efeitos: a inibição da adenilato ciclase e
consequente diminuição do [AMPc]i ou a ativação da fosfolípase C, que conduz à
formação dos mensageiros secundários diacilglicerol (DAG) e Trifosfoato de Inositol
(IP3), a partir da hidrólise do fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) na membrana celular
(PIMENTEL, 2003).
Dentro do grupo de canais para Ca2+ abertos por mensageiros existem os
canais para Ca2+ dependentes de nucleotídeos cíclicos (CNGs) que transportam ións
Ca2+ assim que são ativados por três moléculas de ATP e os canais para Ca2+
dependentes do Ca2+ que funcionam como ATPases transportadoras de Ca2+, que
são ativadas pela ligação de uma molécula de Ca2+ Ainda dentro do grupo de
receptores dependentes de ligantes, existem os canais para Ca2+ sensíveis a
rianodina e os canais para Ca2+ sensíveis ao IP3, estes canais atuam na liberação
30
das reservas de Ca2+ intracelular estocados no retículo sarcoplasmático, sendo
importantes reguladores de vários processos fisiológicos dependentes do Ca2+
(PIMENTEL, 2003).
Os receptores rianodínicos têm como função amplificar os sinais de Ca2+; sua
ativação se dá pela atividade dos canais para Ca2+ sensíveis à dihidropiridina (DHP)
utilizando como via de segundos mensageiros o ADPRibose cíclico (ADPRc) e a
calmodulina. São moléculas grandes e complexas, e como tal possuem vários sítios
e domínios de ligação para diversos receptores que controlam a atividade do canal,
as funções do canal são possivelmente mediadas através das interações entre os
domínios citosólicos e membranosos. Os receptores rianodínicos estão presentes
em uma vasta quantidade de células, atuando nos mais diversos fenômenos, cujo
ponto em comum é a mediação da sinalização feita pelo Ca2+ (OPPELT, 2002).
2.9 Óxido Nítrico
Dentre os sinalizadores endógenos responsáveis pela modulação da
contratilidade de músculos lisos no organismo, o óxido nítrico (NO), que foi
inicialmente conhecido como fator relaxante derivado do endotélio (EDRF), é um gás
incolor, relativamente instável, com hidrossolubilidade reduzida e meia-vida curta
(em torno de 4 segundos) (BRIAN; GRISHAM, 2007). Devido a estas características,
desempenha efeito parácrino em eventos como o relaxamento da musculatura lisa,
no processo inflamatório e também como neurotransmissor. Entretanto, não age
como os demais neurotransmissores, uma vez que não é armazenado em vesículas,
sendo produzido onde e quando se faz necessário, sendo capaz de difundir-se
livremente até sítios intracelulares em células vizinhas (DIAS et al., 2011).
Vários fatores podem estimular a produção de NO, tais como 5hidroxitriptamina, acetilcolina, trombina, íons Ca2+, ácido aracdônico, alterações na
pressão arterial ou estímulo elétrico (MONCADA et al., 1991; JIN; LOCALZO, 2010).
A partir destes estímulos, o NO será sintetizado, a partir de seu precursor a larginina, em uma grande variedade de células mediante a atividade de uma família
de enzimas chamadas de óxido nítrico sintases (NOS) que inclui a NOS endotelial
31
(eNOS ou NOS3), a NOS neuronal (nNOS ou NOS1) e a NOS induzida (iNOS ou
NOS2) (LEONE et al., 1991; MONCADA et al., 1989).
Duas destas enzimas são constitutivas, eNOS e nNOS. Elas produzem e
liberam NO em quantidade nanomolar por um curto período de tempo em resposta a
ligação de agonistas (ex: acetilcolina, bradicinina ou histamina) com receptores
acoplados à proteína G na membrana plasmática ou em resposta a estímulos físicos
(estresse de cisalhamento). Então, a partir da ativação desta proteína G, com gasto
de energia na forma de GTP, a fosfolipase C é ativada e cliva os fosfolipídios de
membrana em Diacilglicerol (DAG) e IP3. O DAG, porção apolar é mantido na
membrana plasmática, entretanto a porção polar (IP3) se ligará a receptores ativados
por IP3 na membrana do retículo sarcoplasmático liberando cálcio, este por sua vez
se ligará a receptores rianodínicos ativados por Ca2+ induzindo ao aumento de cálcio
citosólico. Este cálcio intracelular, juntamente com o DAG fosforila canais para cálcio
abertos por voltagem presente na membrana plasmática da célula, permitindo o
influxo de cálcio extracelular. Assim o Ca2+ intracelular se associa a calmodulina,
ativando as isoformas constitutivas de NOS (figura 2). Por outro lado, a iNOS é
induzida por estímulos imunológicos ou inflamatórios, ocorrendo em resposta ao
estresse causado nos músculos lisos vascular ou uterino e tipos celulares, tais como
o fibroblasto, macrófago, neutrófilo, endotélio, hepatócitos, neurônios e astrócitos. A
ativação da iNOS requer concentrações nanomolares de cálcio equivalente ao nível
basal intracelular, classificando-a como independente de cálcio e persiste por mais
de 24 horas ativa (COSTA, 2012).
Vale ressaltar que o NO participa como neurotransmissor dos nervos não
adrenérgicos e não colinérgicos (NANC), responsável por mediar o processo de
relaxamento do trato gastrointestinal, respiratório, musculatura cardiovascular e
sistema urogenital (COELHO et al., 2003).
Estudos
demonstram
que
o
mecanismo
intracelular
envolvido
no
relaxamento e na hiperpolarização da musculatura lisa mediado pelo NO envolve
desde a ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) e consecutivo aumento
do monofosfato cíclico do guanosina (GMPc), a ativação de um canal para K+ de alta
condutância dependente de Ca2+ ou ativação de canal para K+ dependentes de ATP
(VANNESTE et al., 2007; MATSUDA et al., 2009).
O GMPc é um nucleotídeo sintetizado no interior da célula pela ação de uma
enzima conhecida como guanilato ciclase. Esta enzima pode ser ativada pelo NO,
32
formando GMPc a partir do GTP (BEAVO, 1995). A produção do GMPc é o principal
mecanismo pelo qual o NO produz muitos dos seus efeitos biológicos. Há evidências
de que o NO e o GMPc podem atuar sobre diversos alvos como as proteínas
quinases GMPc-dependentes, fosfodiesterases reguladas por GMPc e diferentes
tipos de canais para K+ (BOLOTINA et al., 1994).
Figura
2.
Via
de
transdução
intracelular
responsável pelo relaxamento da musculatura lisa
mediado pelo óxido nítrico (NO) (Adaptado de
Palheta, 2011).
2.10 Canais para Potássio
Os canais iônicos que permitem o efluxo de K+ através da membrana celular
desempenham um papel importante na regulação do potencial da membrana celular,
sendo fundamental para contratilidade (WRAY, 1993; KAWARABAYASHI, 1994).
Canais para K+ é a classe mais abundante de canais iônicos, sendo descritos mais
de 16 tipos e subtipos, de modo que as suas funções fisiológicas estão ainda longe
de serem plenamente compreendidas (KAŽIC´ et al., 1999). Sabe-se, todavia, que
os canais para K+ estão distribuídos pelo músculo liso, inclusive miométrio e
desempenham uma função fundamental no controle do potencial de membrana e
consequente excitabilidade celular, através do aumento da condutância do íon K+,
caracterizando a hiperpolarização e diminuição da condutância ao íon, que induz a
despolarização (KNOT et al., 1996). Deste modo, o tônus basal do músculo liso
pode ser regulado por canais para K+, destacando-se: canais para K+ abertos por
voltagem (Kv); canais para potássio de grande condutância ativados por Ca2+
(BKCa); canais para K+ de pequena condutância ativados por Ca (SKCa); canais para
K+ retificadores de entrada (Kir) e canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP)
33
(THORNELOE; NELSON, 2005). No miométrio diferentes tipos de canais para K+
têm sido identificados, sendo o mais comum os canais para K+ de grande
condutância ativados por Ca2+ (CHANRACHAKUL et al., 2004).
Ainda a respeito de miométrio, estudos indicam que a expressão dos canais
para KATP depende tanto da fase de gestação quanto no trabalho de parto (LONGO
et al., 2003; BRAINARD, 2007). No final da gravidez, os canais para KATP são
reprimidos, o que poderia facilitar o aumento da atividade miometrial necessária para
as contrações. Estes dados indicam que, em humanos, a downregulation dos canais
para KATP pode contribuir para o aumento da excitabilidade uterina e indução do
trabalho de parto (BRAINARD et al., 2007). Brainard (2007) ainda afirma que os
canais BKCa podem estar relacionado a atividade miometrial, uma vez que precisam
ser ativados para produzir relaxamento uterino. Este canal é ativado por
despolarização da membrana e também por um aumento na concentração de Ca2+
intracelular, assim desempenhando um papel central na modulação da contratilidade
uterina e manutenção do Ca2+ no miométrio (KHAN, 2001; BRAINARD et al., 2007).
A contribuição deste tipo de canal, assim como os canais para KATP dependente está
relacionada com a fase gestacional. Segundo Okawa et al. (2000) os canais BKCa
mediam o relaxamento uterino apenas na primeira metade do período gestacional,
mas não no final da gravidez ou durante o parto de ratas.
Com relação à musculatura lisa vascular, sabe-se que o aumento da
condutância do íon K+, que ocorre a partir da abertura dos canais na musculatura
lisa vascular, promove a vasodilatação, causando diminuição da pressão sanguínea.
Por outro lado, uma vez desativado e com consequente diminuição da condutância
do íon, a musculatura é levada a um estado de vasoconstrição. Assim como na
musculatura lisa dos órgãos gastrointestinais e reprodutivos, quatro tipos de canais
de potássio foram identificados na musculatura vascular: canais Kv, BKCa, Kir e KATP
(BRAINARD et al., 2007).
A
repolarização
ou
hiperpolarização
de
membrana
ocorre
devido,
2+
principalmente, a ativação dos BKCa, que são ativados quando a [Ca ]c se eleva na
ordem de µM, e a ativação dos Kv, em decorrência à despolarização de membrana
(LEDOUX et al., 2006). Os canais Kv são ativados pela despolarização da
membrana e atuam regulando o potencial de membrana. Os canais BKCa respondem
a alterações dos níveis de Ca2+ intracelular para regularem o potencial de
membrana. Os canais BKCa são essenciais na regulação do tônus das artérias de
34
maior resistência, auxiliando na regulação da resposta arterial à pressão e
substâncias vasoconstritoras. Os canais Kir estão envolvidos na vasodilatação
induzida pelo K+ extracelular. Os canais para K+ sensíveis ao ATP são ativados pela
ligação ao ATP e constituem o alvo de alguns vasodilatadores (SOBEY, 2001).
Diante do exposto, compostos como os ativadores de canais para K + podem
hiperpolarizar a membrana e, indiretamente, fechar os Ca v, inibir o influxo de Ca2+ e,
consequentemente, diminuírem a [Ca2+]c (LEDOUX et al., 2006; LIN et al., 2006). Por
outro lado, o aumento da [Ca2+]c favorece a ligação do Ca2+ à calmodulina (CaM) e
este complexo ativa a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK) para fosforilar a
cadeia leve da miosina (MLC) e promover a interação de miosina com actina,
culminando com a contração muscular (SOMLYO; SOMLYO, 2003).
2.11 Tocolíticos
Apesar da evolução nas estratégias de prevenção durante o pré-natal e da
assistência neonatal, o nascimento prematuro continua com uma elevada incidência,
morbidade e suas complicações estão entre as principais causas de mortalidade
neonatal, principalmente nos países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento
(CUNNINGHAM et al., 2005; IAMS et al., 2004; PARK et al., 2005).
Sabe-se que a redução temporária das contrações uterinas possibilita a
ocorrência do parto em centros especializados em atendimento de recém-nascido
pré-termo (KING et al., 2007). Além disso, a inibição das contrações uterinas é o
último recurso que a obstetrícia dispõe para completar um ciclo de corticosteroides
antenatal (CABAR et al., 2008). Bittar et al., (2005) afirmam que a tocólise mostra
comprovado benefício clínico por curto período de tempo (48-72 horas). E, salvo as
indicações, os tocolíticos, em maior ou menor grau, apresentam segurança
discutível em relação aos efeitos colaterais maternos e fetais.
Drogas como os bloqueadores do canal para Ca 2+, prostaglandinas,
antagonista para ocitocina (atosibana) e doadores de óxido nítrico são consideradas
tocolíticos. Entretanto apenas a ritodrina, um agente beta (β)-agonista, e a atosibana
foram sintetizadas para esta finalidade, as demais foram adaptadas para este fim,
35
uma vez que direta ou indiretamente, estes medicamentos modificam as
concentrações do Ca2+ intracelular nas células do miométrio (CABAR, 2008).
Dentre os beta (β)-agonistas utilizados terapeuticamente
tem-se a
terbutalina, sabultamol, fenoterol e ritodrina. Esta classe tem como principais alvos
os receptores β2 presentes no miométrio, vasos sanguíneos e via respiratória e
ainda, com menor especificidade, atuam em receptores β 1. Tais receptores estão
acoplados a proteína Gs, cujo mecanismo de transdução intracelular consiste na
ativação da enzima adenilciclase, responsável pela catalisação da conversão do
ATP no segundo mensageiro monofosfato cíclico de adenosina (AMP c) que por sua
vez ativa a enzima proteínoquinase, responsável pela diminuição do Ca2+ citosólico,
resultando em relaxamento da musculatura uterina, explicando a redução no número
de partos prematuros após a utilização destes agentes (ANOTAYANONTH et al.,
2007). Entretanto, estes agentes podem atravessar a placenta e desencadear os
efeitos colaterais no feto, entre os quais taquicardia, hiperinsulinismo, hipoglicemia,
hipocalemia e hipotensão arterial (ACOG, 1995).
Outra classe farmacológica importante como tocolítico é o antagonista para
ocitocina (atosibana), peptídeo sintético que compete com a ocitocina pelos
receptores ocitocinérgicos distribuídos pelo organismo, e uma vez ligado ao receptor
localizado na célula miometrial reduz os efeitos contráteis mediados pela ocitocina.
Segundo Moutquin et al. (2000) as propriedades tocolíticas da atosibana são
semelhantes aos β agonistas, porém com o benefício da redução de efeitos
colaterais maternos e perinatais. De fato, um ensaio clínico randomizado incluindo
63 mulheres em trabalho de parto prematuro mostrou semelhança quanto à eficácia
e à efetividade para tocólise entre nifedipina e atosibana, entretanto houve maiores
efeitos colaterais nas pacientes que utilizaram o antagonista de canais para Ca 2+
(AL-OMARI et al., 2006).
Vale salientar que dos bloqueadores de canais para Ca 2+, a nifedipina é a
melhor opção de agente tocolítico quando comparada aos demais agentes
farmacológicos presente no mercado, inclusive é a mais utilizada (SOUZA et al.,
2008). Entretanto, Bittar et al. (2005) relatam que alguns estudos em animais
sugerem que os bloqueadores de canais para Ca2+ reduzem o fluxo sanguíneo
uterino e a oxigenação fetal. Portanto, ainda há necessidade da elucidação quanto à
aplicabilidade e segurança destas drogas no trabalho de parto pré-maturo.
36
Os inibidores de prostaglandinas atuam inibindo a enzima ciclooxigenase
(COX) necessária à conversão de ácido araquidônico em prostaglandinas, e
aparentemente são eficazes como tocolíticos (MELO, 2007). No entanto, são pouco
utilizados pelos efeitos colaterais perinatais (BITTAR, 2005).
Por esses motivos há a busca de um agente tocolítico, responsável pela
inibição do trabalho de parto prematuro, com a menor dose possível e com ausência
ou mínimos efeitos colaterais, proporcionando segurança para o binômio maternofetal (PAPATSONIS et al., 2007; ANOTAYANONTH, 2007; KING et al., 2007).
Neste sentido algumas pesquisas utilizando doadores do óxido nítrico foram
conduzidas, uma vez que o NO inibe contrações espontâneas de útero humano e de
animais (MIRABILE et al., 2000; RIZZO et al., 2011). Entretanto, outros trabalhos
mostraram que o miométrio é pouco sensível ao segundo mensageiro GMPc
formado a partir do NO (COSTA, 2006).
2.12 Dilatadores cervicais
Apesar da interconexão anatômica entre o útero e a cérvice, estas porções
do trato genital feminino parecem, pelo menos em parte, diferir quanto à resposta
fisiológica e/ou farmacológica aos diversos agentes bioativos (FERNANDES et al.,
2002). Vale salientar que esta diferença pode contribuir para eventos como o parto,
onde há uma demanda extra para contração uterina seguida de relaxamento cervical
(SHISEI et al., 2010). Do ponto de vista farmacológico, podemos citar a
aplicabilidade da atosibana, um antagonista de receptores ocitocinérgicos, utilizado
para induzir relaxamento uterino (KUĆ
et al., 2011), por outro lado
a própria
ocitocina parece estar envolvida no efeito de relaxamento cervical juntamente com o
17β-estradiol (SAYRE; LEWIS, 1996).
A ocitocina é um peptídeo sintetizado no hipotálamo e armazenado na
neuro-hipófise (SHYKEN et al., 1995), cuja liberação ocorre de forma pulsátil e
mediada por estímulos neuro-sensoriais como a amamentação, estímulos em
órgãos genitais e durante a dilatação cervical (GRAVES, 1996).Tais conhecimentos
são aplicados as biotécnicas da reprodução, uma vez que a dilatação provocada
pela ocitocina permite uma maior profundidade de penetração da pipeta de
inseminação, sendo encontradas taxas de fertilidade 0% para ovelhas não tratadas,
37
e 60% em ovelhas tratadas com 50 e 100 unidades internacionais (UI) de ocitocina,
e de até 100% para as que receberam de 200 e 400 UI (SAYRE; LEWIS,1996).
Em um grupo de ovelhas inseminadas 30 minutos após a administração de
200 UI de ocitocina, pelo método transcervical, foi observado que no grupo controle
80% dos animais não permitiram passagem transcervical, sendo feita deposição do
sêmen somente no orifício externo da cérvice e 20% permitiram transposição
cervical, enquanto que no grupo tratado com esse hormônio houve sucesso na
passagem transcervical bem superior (SAYRE; LEWIS, 1997). Segundo Devonish et
al. (2003) com a utilização de ocitocina são observadas maiores taxas de
concepção, número de ovelhas paridas e número de bezerros nascidos.
Apesar de ser apontada como um bom dilatador cervical a utilização da
ocitocina pode levar a uma diminuição drástica das taxas de fertilidade devido a
indução de contrações tetânicas no útero, cujas durações são proporcionais às
doses administradas (SAYRE; LEWIS, 1997). Dessa forma, faz-se necessário
pesquisar as possíveis doses e vias de administração de ocitocina que viabilizem a
inseminação artificial por tração cervical.
Há relatos que a ocitocina desempenha efeito dual no útero, regula a
atividade contrátil do miométrio e estimula a liberação de prostaglandinas pelas
células endometriais (BOSSMAR et al., 1994). Esse aumento nos níveis de
prostaglandina no momento do parto coincide com o amolecimento cervical de
grande importância neste processo (ELLWOOD, 1980; OWINY; FITZPATRICK,
1992). Existem ainda diferentes prostaglandinas que podem ser mais específicas
neste sentido como a do tipo E em comparação com as do tipo F (O’BRIEN,1995).
Em mulheres, a administração de prostaglandinas como PGE 1, PGE2, PGF2,
PGI2 e PGF1-α, por via intracervical, antes do parto induz a dilatação cervical
(BRYMAN et al., 1986; LAVOIR ; BETTERIDGE, 1996; NUNES et al., 1999). Essas
prostaglandinas promovem a diminuição da contratilidade da musculatura cervical,
sendo a PGE2 a mais potente (BRYMAN et al.,1986).
Já em ovelhas, a administração local de PGE2, no final da gestação, provoca
um aumento da dilatação cervical, quatro vezes maior que em ovelhas não tratadas,
no entanto, não há indução de contrações uterinas (LEDGER et al., 1983; OWINY;
FITZPATRICK, 1990).
Sabe-se que as prostaglandinas em parte auxiliam a dilatação cervical pela
indução da liberação de colagenases que por sua vez provocam o amolecimento do
38
colágeno, apesar disso, estudos quanto ao efeito da PGE 2 na atividade muscular da
cérvice são escassos (ELLWOOD, 1980; OSMERS et al., 1991; SAYRE; LEWIS,
1997).
Um análogo sintético da PGE1, o misoprostol, tem sido apontado na literatura
como um medicamento eficiente tanto na abertura cervical, como no estímulo da
atividade contrátil do miométrio (NUNES et al., 1999; KARTZ et al., 2000). Esse
fármaco tem sido utilizado na obstetrícia pela ação útero tônica e amolecimento do
colo uterino e cérvice, além de casos de indução do aborto legal, promovendo
abertura cervical para procedimentos de curetagem, indução do trabalho de parto e
no tratamento e prevenção de hemorragias pós-parto (SOUZA et al., 2010). Como
descrito anteriormente, outros fármacos como agonistas β2-adrenérgicos, o
clenbuterol, além de induzirem o relaxamento do miométrio promovem o estiramento
in vitro das tiras cervicais (OWINY; FITZPATRICK, 1992; RAMOS; NORONHA,
2000), assim como a terbutalina que diminui a contratilidade da musculatura cervical
(BRYMAN et al., 1986).
A terbutalina associado ao misoprostol foi utilizado para promoção de
dilatação cervical em IA transcervical, com sêmen fresco em ovelhas, entretanto,
não foram encontradas diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo
tratado com esta associação de fármacos e foi sugerido que o tempo entre a
aplicação dos dilatadores e a IA, de 15 minutos, é insuficiente para a promoção do
relaxamento da cérvice (BARBAS et al., 2001).
Monte et al. (2011) utilizando ovelhas da raça Dorper mostraram que o grau
de flexibilidade da cérvice foi superior nos animais tratados com ocitocina quando
comparado ao grupo controle. Já nos animais tratados com associação de sulfato de
terbutalina e misoprostol administrados por via vaginal 60 minutos antes da IA, o
sucesso da tração cervical e consequentemente da IA intrauterina por via
transcervical foi superior ao grupo tratado apenas com ocitocina 200 UI, I.V
administrado 5 minutos antes da inseminação (100% vs 47,4%). Além disso, os
mesmos autores observaram uma redução no tempo de inseminação artificial
quando utilizou essa associação (terbutalina e misoprostol) em comparação aos
demais grupos citados.
A importância da maior flexibilidade cervical e um menor tempo de
inseminação tem grande repercussão do ponto de vista do bem estar animal ao
39
promover menores traumas no ato da tração cervical, o que, inclusive, pode
influenciar positivamente na fertilidade (REBASSA et al., 2007).
Diante disto, inúmeros são os trabalhos que estão sendo desenvolvidos para
aperfeiçoar a acessibilidade uterina pela via transcervical, e assim otimizar a técnica
de IA transcervical. Entretanto, como foi abordado, as substâncias sintéticas
disponíveis atualmente não são isentas de efeitos adversos. Assim, faz-se
necessária a busca por novas substâncias com atividade sobre a contratilidade
cervical, que sejam de baixo custo, fácil aquisição e seguras para serem utilizadas
em animais. Neste cenário, as possíveis substâncias bioativas obtidas de produtos
de origem natural, dentre estes os vegetais, são fontes de novos possíveis fármacos
com atividade no sistema reprodutivo.
2.13 Considerações sobre o gênero Erytroxylum
A família Erythroxylaceae compreende quatro gêneros: Erythroxylum P.
Browne Aneulophus Benth, Nectaropetalum Engl e Pinacopodium Exell;Mendonça
englobando cerca de 240 espécies e com endemismo na Venezuela, Brasil e
Madagascar (DALY, 2004). A maioria das espécies pertence ao gênero
Erythroxylum, que com cerca de 230 espécies é o maior gênero e o único
representante da família na região Neotropical, (PLOWMAN; HENSOLD, 2004) com
ampla distribuição nas regiões tropicais da Austrália, Ásia, África e Américas
(LOIOLA, 2007).
No Brasil há espécie do gênero Erythroxylum P. Browne nos mais diversos
tipos de vegetação; desde as florestas úmidas da Amazônia e Mata Atlântica, até as
matas secas do Cerrado e da Caatinga, reflexo da versatilidade ecológica do grupo
(PLOWMAN; HENSOLD, 2004; DALY, 2004).
O interesse pelo gênero intensificou-se no século XIX, após a descoberta das
atividades farmacológicas apresentadas pelas folhas de Erythroxylum coca Lam.,
que, quimicamente, são caracterizadas pela presença de alcaloides do tipo tropano,
dentre os quais destaca-se a cocaína, empregado como anestésico local em
pequenas cirurgias durante muito tempo (BOHM et al., 1982; GRIFFIN; LIN 2000)
40
que posteriormente transformou-se em um grande problema de saúde pública por
suas propriedades psicoativas (ALAGILLE et al., 2005; CHIN et al., 2006; QUEIROZ
et al., 2009).
Diversas espécies do gênero também foram investigadas quanto as possíveis
atividades farmacológicas, dentre as quais: E. vacciniifolium, que detém os
alcaloides tropânicos da série catuabina (A, B e C), mostrou efeito anti-HIV e contra
infecções oportunas em pacientes com HIV (ZANOLARI et al., 2003); Já as
Pervilleinas A e B, isoladas de E. pervillei, inibiram o crescimento de carcinoma de
pele (MI et al., 2002), e outros tipos de alcaloides extraídos de E. rotundifolium
também apresentaram atividade antitumoral (CHÁVEZ et al., 2002). A E. moonii
apresentou atividade antimicrobiana frente as cepas de bactérias, fungos e
leveduras, além de fornecer os alcaloides tropânicos mooniina A e B (RAHMAN et
al., 1998).
Os alcaloides tropânicos encontrados em algumas espécies vegetais
destacam-se por desempenhar atividades farmacológicas como efeito analgésico,
anestésico, anticolinérgico, antiemético, e anti-hipertensivo, entre outras atividades
farmacológicas (GRYNKIEWICZ; GRADZIKOWSKA, 2008).
De
fato,
alguns
vegetais
deste
gênero
apresentam
propriedades
antiinflamatória, antibacteriana, tônica e estimulante, atuando como um poderoso
diurético, tratamento de afecções renais, vesiculares, doenças venéreas e distúrbios
musculares (PLOWMAN; HENSOLD, 2004).
Pertencente a este gênero a espécie Erythroxylum caatingae (Fig.3)
(Quadro.1) tem como características botânicas arbusto ou arvoretas com até 3,0 m
de altura e ramos não patentes, castanho-avermelhados e poucas lenticelas quando
jovens. Seus catafilos são menores que as estípulas, adensados na base dos ramos
jovens. As estípulas em média medem 3-4 mm comprimento, nérveas, estreitamente
triangulares (LOIOLA et al., 2007). Tais características morfológicas são importantes
para a identificação minuciosa da espécie, e a partir disso, as possíveis
investigações bioquímicas e farmacológicas são conduzidas.
41
A
B
Figura 3. Representação das folhas (A) e flores (B) da espécie Erythroxylum caatingae.
Fonte: http://www.univasf.edu.br/~hvasf/.
Quadro 1: classificação botânica das espécies Erythroxylum caatingae
CRONQUIST (1988).
Reino
Planta e Divisão Magnoliophyta
Classe
Magnoliopsida
Ordem
Malpighiales
Família
Erythroxylaceae
Gênero
Erythroxylum
Espécies
Erythroxylum caatingae
Neste sentido, quanto a sua atividade bioativa, recentemente foi observado
que o extrato bruto da folha de Erythroxylum caatingae, assim como o alcaloide
obtido deste vegetal apresentou atividade antimicrobiana e antitumoral (AGUIAR et
al., 2012). Além disso, o extrato bruto de Erythroxylum caatingae desencadeou
relaxamento da musculatura lisa de útero e traqueia de roedores (SANTOS et al.,
2013; SILVA et al., 2010). Tais resultados ratificaram a potencial aplicabilidade de
vegetais do gênero Erythroxylum no tratamento de doenças venéreas, amenorreia e
hemorragias genitais e afecções respiratórias (GONZÁLEZ-GUEVARA et al., 2006;
SILVA et al., 2001).
Entretanto para validação de plantas potencialmente terapêuticas são
necessárias diversas investigações que vão desde a relação medicina tradicional e
popular; isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos; observação da
estrutura/atividade e investigação farmacológica de extratos e/ou seus constituintes
42
químicos isolados e finalmente a operação de formulações para a produção de
fitoterápicos (SANTOS et al., 2013).
43
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a ação do Extrato Etanólico Bruto de folhas de Erythroxylum caatingae
(EBEc) sobre a contratilidade da cérvice ovina.
3.2 Objetivos específicos
- Avaliar a contratilidade in vitro de cérvice ovina exposta a concentrações
crescentes de EBEc.
- Verificar o efeito do EBEc sobre a contração in vitro de cérvice ovina induzida por
cloreto de potássio (KCl).
- Verificar o efeito do EBEc sobre a contração in vitro de cérvice ovina induzida por
carbacol (CCh).
- Verificar o efeito do EBEc sobre a amplitude da contração in vitro de cérvice ovina
pré-incubada com atosibana.
- Verificar a participação do óxido nítrico no relaxamento cervical induzido por EBEc.
- Verificar o mecanismo de transdução intracelular através da utilização de
bloqueadores da guanilato ciclase ou de canais para potássio ou cálcio no
relaxamento cervical induzido pelo EBEc.
- Avaliar o padrão de contração da cérvice de ovinos in vivo.
- Avaliar o efeito do EBEc sobre a contração de cérvice de ovinos in vivo.
4. METODOLOGIA
44
4.1 Animais
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal,
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Petrolina, Brasil (número
0008/261011). As cérvices ovinas foram cedidas pelo abatedouro localizado no
município de Juazeiro (ABATAL Abatedouro Almeida Ltda, Inscrição Estadual:
72.756.197 NO). Decorrido o abate do animal, as cérvices foram imersas em solução
nutritiva de Krebs (Em mM: NaCl – 118,0; KCl – 4,55; MgSO4 – 5,70; NaHCO3 - 11;
CaCl2 – 2, 52; KH2PO4 – 1,10; Glicose 11, pH: 7,38 -7,42) e transportada em caixa
térmica guarnecidas com gelo ao Laboratório de Pesquisas do Vale do São
Francisco (LAPEVALE) da Universidade Federal do Vale do São Francisco. Foram
utilizadas outras substâncias nutritivas, a exemplo da solução de Tyrode e de Jalon.
Entretanto a que demonstrou o melhor resultado para a manutenção do tecido foi a
solução de Krebs utilizada durante todo o experimento.
4.2 Material Botânico
Foi utilizado extrato etanólico bruto obtido das folhas de Erythroxylum
caatingae, fornecido por pesquisadores do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
(LTF) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB).
As folhas de Erythroxylum caatingae Plowman foram coletadas na cidade de
Souza, Paraíba, Brasil. As folhas secas e pulverizadas (500 g) foram maceradas
com etanol a 95% à temperatura ambiente durante 72 h. A solução foi filtrada e
concentrada sob pressão reduzida em um evaporador ratativo a 50°C, produzindo
53 g de extrato etanólico (EBEc).
4.2.1 Preparação do extrato para os ensaios farmacológicos
45
O extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae (EBEc) foi solubilizado
em cremofor (3% v/v) e diluído em água destilada até a concentração de 10 mg/mL
(solução estoque).
4.3 Fármacos
Para a execução dos protocolos experimentais foram utilizadas as seguintes
drogas e reagentes: carbacol (Sigma-Aldrich®), cloreto de potássio (Vetec®), l-name
(Sigma-Aldrich®), ODQ (Sigma-Aldrich®), atosibana (Sigma-Aldrich®), l-arginina
(Sigma-Aldrich®) 4-aminopiridina (Fluka®), tetraetilamônium (Fluka®), glibenclamida
(Sigma-Aldrich®), acetilcolina (Sigma-Aldrich®) e verapamil (Sigma-Aldrich®).
4.4 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS in vitro
4.4.1 Preparo do tecido
As cérvices foram transferidas para placa de petri onde foram dissecadas
para confecção dos segmentos da musculatura circular com cerca de 10 mm de
comprimento. Em seguida os tecidos foram imersos em cubas (10 mL) contendo
solução nutritiva de Krebs a 37°C, aerados e submetidos à tensão longitudinal de 1,5
g através de fios de algodão conectados a transdutores de força, MLT 0202 Pan Lab
(PEREIRA et al., 2007). Os sinais das respostas isométricas dos tecidos foram
condicionados e registrados em um sistema de aquisição computadorizado
EFF321(Insight®, Brasil), representado na figura 4.
46
Figura 4. Esquema simplificado dos equipamentos utilizados nos experimentos de avaliação da
contratilidade in vitro. 1) Transdutor de força (MLT 0202, Pan Lab); 2) Bomba de aeração; 3)
Amplificador “bridge system” (Insight®, Brasil); 4) Sistema EFF-321(Insight®, Brasil); 5) Cuba de 10
mL; 6) Haste fixa; 7) Coletor (Adaptado de Jucá, 2011).
4.4.2. Avaliação in vitro do efeito do EBEc sobre a contração em cérvice ovina
Após o período de estabilização, que variou entre 50-90 min., para análise da
integridade do tecido foram obtidas contrações tônicas induzidas por 90 mM de KCl.
A seguir o tecido foi lavado com solução de Krebs e, após estabilização do tônus
basal, o tecido foi exposto a adição de Erythroxylum caatingae nas concentrações
crescentes de 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.L-1, a intervalos de 5 minutos.
47
4.4.3. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Cloreto de Potássio em
cérvice ovina
Após o período de estabilização, para análise da integridade do tecido e do
padrão de contração da cérvice ovina foram obtidas contrações tônicas induzidas
por KCl (15-120 mM). A seguir o tecido foi lavado com solução de Krebs e após
estabilização do tônus basal, foi induzida a contração com KCl 90 mM e após 5
minutos foram adicionadas a cuba, concentrações crescentes de EBEc 1, 3, 9, 27,
81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos.
4.4.4. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por Carbacol em cérvice
ovina
Após o período de estabilização, para análise da integridade do tecido e do
padrão de contração da cérvice ovina, foram obtidas contrações tônicas induzidas
por CCh (0,1-100 µM). A seguir o tecido foi lavado com solução de Krebs e após
estabilização do tônus basal, foi induzida uma nova contração com CCh 30 µM e
após 5 minutos foram adicionadas a cuba concentrações crescentes de EBEc 1, 3,
9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos.
4.4.5. Investigação do efeito do EBEc sobre a amplitude da contração de
cérvice ovina pré-incubada com atosibana
Após período de estabilização e em tônus basal os segmentos foram préincubados com atosibana (10 µM), um inibidor de receptores para ocitocina.
Decorridos 10 minutos. e ainda na presença deste antagonista ocitocinérgico
adicionou-se concentrações cumulativas do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1,
a intervalos de 5 minutos.
4.4.6. Avaliação do possível envolvimento do óxido nítrico no relaxamento
cervical induzido por EBEc
48
Passado o período de estabilização e em tônus basal os tecidos foram préincubados com 100 µM de L-NAME, um inibidor não seletivo da enzima óxido nítrico
sintase (NOS), e após 10 minutos foram adicionadas as concentrações cumulativas
do EBEc. Outro conjunto de segmentos foi pré-incubado com 100 µM de L-NAME e
após 10 minutos foi adicionado 300 µM de l-arginina, um substrato para enzima
NOS. Decorridos 10 minutos, foram adicionadas concentrações cumulativas do
EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos.
4.4.7 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no
relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Via GMPc
Visando investigar o envolvimento do segundo mensageiro GMPc no efeito
relaxante do EBEc em cérvice de ovelha foi utilizado um bloqueador da guanilato
ciclase, o 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3,-a]quinoxalin-1-one (ODQ). Após intervalo de
estabilização e em tônus basal, as preparações foram pré-incubadas com 5µM de
ODQ por 10 minutos e na presença deste bloqueador foi adicionado concentrações
cumulativas do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos.
4.4.8 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no
relaxamento cervical induzido pelo EBEc: canais para Potássio (K+)
Após período de estabilização e em tônus basal foi adicionado 1µM de
glibenclamida, bloqueador seletivo para os canais para K ATP dependentes. Além
disso, em outro grupo de amostras foram adicionadas 3mM de 4-aminopiridina (4AP), um bloqueador não seletivo dos canais Kv ou 0,3mM de Tetraetilamônio (TEA),
um bloqueador de canais para K+ ativados por Ca2+ (BKCa). A seguir, na presença de
um destes bloqueadores de canais para K+, foi adicionado concentrações crescentes
do EBEc 1, 3, 9, 27, 81, 243 e 729 μg.mL-1, a intervalos de 5 minutos.
4.4.9 Investigação do mecanismo de transdução intracelular envolvido no
relaxamento cervical induzido pelo EBEc: Liberação de Ca2+ intracelular
mediado por ligante
49
Após período de estabilização foi realizada uma contração com acetilcolina
(ACh) (60 µM), considerada o controle, o tecido foi lavado. A seguir, e uma vez
estabelecida a contração inicial, 3µM de verapamil foi adicionado a cuba e,
decorridos 5 minutos, o tecido foi novamente estimulado com 60 µM de ACh. Por
fim, após lavagem e período de estabilização foi adicionado na cuba de verapamil
seguido de EBEc 729 μg.mL-1, para em seguida, a cérvice ser novamente
estimulada com 60 µM de ACh.
4.5 PROTOCOLO EXPERIMENTAL in vivo
4.5.1. Avaliação da contração da cérvice ovina in vivo
Foram utilizadas 05 ovelhas da raça Santa Inês, pluríparas, hígidas, com faixa
etária entre dois a cinco anos, mantidas em regime intensivo de manejo,
alimentadas diariamente com pasto de capim-elefante e concentrado a base de
farelo de soja, milho e torta de algodão, fornecidos segundo recomendações para
manutenção de animais do National Research Council (NRC,1985).
Para análise da contração cervical, as fêmeas foram mantidas em estação,
numa plataforma de contenção (Figura 5A). A seguir, foi realizada antissepsia com
solução de iodopovidona 0,2%, para infiltração de 5 mL de lidocaína a 1,0% sem
vasoconstrictor, com auxílio de agulha 22 G na região epidural entre as vértebras L 5S1. Após a promoção da anestesia epidural, realizou-se a higienização da região
perineal com solução de NaCl 0,15 M, e a seguir, com auxílio de um espéculo
vaginal visualizou-se a cérvice, e com o auxílio de duas pinças de Allis foi tracionada
até o ponto mais próximo possível do vestíbulo vaginal (Figura 5B) segundo LopesJunior (2006). Com o auxílio de um mandril, uma sonda nasogástrica (BRASMED) n°
10 a qual foi acoplada em sua extremidade distal um balão de látex com diâmetro de
~2 cm foi introduzida no interior da cérvice (Figura 5C), o balão ficou acomodado ~3
cm adiante no canal cervical. Esta sonda foi a seguir conectada ao transdutor de
pressão (MLT 1050) que foi acoplado ao sistema de aquisição de sinais biológicos
(PowerLab®) e este integrado a um computador contendo um software específico
(LabChart v4) que registrou todas as atividades de contração e relaxamento cervical
ao longo de 60 minutos.
50
Figura 5: Representação de experimento para avaliação da contração cervical em ovinos in vivo. A.
Animal em estação no sistema de contenção para inseminação artificial. B. Tração cervical com o
auxílio de duas pinças de Allis e um espéculo vaginal. C. Inserção da cânula até 2º anel cervical D.
Conexão da sonda contendo um balão posicionado na cérvice com o transdutor de força acoplado.
Após registro do período basal durante 30 minutos, com auxílio de bomba de
infusão contínua (Modelo EFF-311, Insight®) foi instilada 1 ml (taxa de infusão
0,1mL/min) de solução NaCl 0,15M (controle) através de uma sonda de polietileno
(PE 10, DE 0.64mm e DI 0.28 mm) que foi posicionada a 0,5 cm do balão cervical.
Decorridos 30 minutos foi instilado, mediante bomba de infusão, 1 ml da solução do
EBEc na dose de 2 mg e a atividade cervical foi registrada ao longo dos 30 minutos
seguintes.
4.6 Análise Estatística
Foi utilizado o programa graphpad prism para a análise dos dados que foram
expressos em percentagem relativa aos valores obtidos no período basal (contração
inicial), de acordo com os diversos protocolos instituídos. Os resultados referentes à
51
CE50 (concentração efetiva para se obter 50% da resposta estimada em 100%)
foram obtidos através da interpolação semi-logarítmica e expressos como média ±
erro padrão da média. Para comparação dos dados intragrupos foi utilizado o
método de análise de variância (ANOVA) seguido do teste post-roc Newman-Keuls,
já as comparações intergrupos utilizou-se o teste “t” de student. Diferenças com p<
0.05 foram consideradas significativas.
52
5. RESULTADOS
A figura 6 representa o efeito miorrelaxante concentração-dependente do
EBEc sobre a cérvice ovina a partir da concentração 9 µg.mL-1, cujo relaxamento foi
de 47,8 ± 6,5%, chegando aos 85,4 ± 5,1% quando o tecido foi incubado com 729
µg.mL-1, com obtenção final de uma EC50 17,9 ± 3,7 µg.mL-1.
Figura 6. A. Representação quantitativa do efeito inibitório do EBEc sobre a contração cervical da
cérvice ovina avaliada in vitro. B. Traçado qualitativo do efeito do EBEc sobre a contração cervical da
cérvice ovina. Colunas indicam as médias e as linhas verticais representam o E.P.M. *p<0,05 vs.
Contração inicial, após ANOVA seguido de Newman-Keuls.
53
Com a finalidade de avaliar a ação do EBEc sobre a contração induzida pelo
agente despolarizante e contrátil KCl 90 mM, uma contração tônica foi induzida,
como representada na figura 7B, em seguida foram adicionadas as concentrações
cumulativas de EBEc, percebendo-se que a partir da concentração de 9 µg.mL-1
houve redução desta contração tônica em 16,4 ± 3,9%, com efeito máximo obtido
com a concentração de 729 µg.mL-1 (17,7 ± 3,8%, ver figura 7A).
Figura 7. Efeito do EBEc sobre a contração induzida por KCl 90 mM em cérvice ovina in vitro. A.
Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas
em segmentos circulares de cérvice ovina pré-contraídos com KCl 90 mM. Colunas indicam as
médias e as linhas verticais representam o E.P.M. *p<0,05 vs. Contração induzida por KCl, após
ANOVA seguido de Newman-Keuls. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc
sobre a contração induzida por KCl em cérvice ovina.
Quando foi induzida uma contração pelo agonista colinérgico carbacol 30 µM
(Figura 8B), o EBEc na concentração 9 µg.mL-1 reduziu a contração em 23,1 ±
54
3,0%, tal efeito chegou a ordem de 47,0 ± 8,9% quando os segmentos foram
incubados com 729 µg.mL-1, ver figura Figura 8A.
Figura 8. Efeito do EBEc sobre a contração tônica induzida por CCh em cérvice ovina in vitro. A:
Representação quantitativa do efeito miorrelaxante induzido por EBEc em concentrações cumulativas
em segmentos circulares de cérvice ovina pré-contraídos com CCh 30 µM. Colunas indicam as
médias e as linhas verticais representam o E.P.M. *p<0,05 vs. Contração induzida por CCh, após
ANOVA, seguido de Newman-Keuls. B. Representação qualitativa do traçado típico do efeito do EBEc
sobre a contração induzida por CCh em cérvice ovina.
Considerando que a ocitocina é um hormônio largamente utilizado para
dilatação cervical em medicina veterinária, partiu-se para avaliar o possível efeito do
EBEc em receptores para ocitocina. Para isso os segmentos foram pré-incubados
com atosibana na concentração 10 µM. Com isso, foi observado que não houve
55
diferença significativa do relaxamento induzido pelo EBEc nessas tiras préincubadas com atosibana, cujo relaxamento final com a concentração de 729 µg.mL1
foi de 73,3 ± 6,7 % em relação aos 85,4 ± 5,1% do grupo controle, além disso a
CE50 foi de 11,8 ± 5,9 µg.mL-1, nesse grupo pré-incubado com atosibana (figura 9).
Figura 9. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, 9, 27, 81,
-1
243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com
atosibana 10 µM () ou não (, controle). Os valores foram expressos como percentual da contração
controle. As barras verticais indicam o erro padrão da média (E.P.M.).
Continuando a investigação do possível mecanismo envolvido no relaxamento
induzido por EBEc, e considerando a atividade do NO em musculatura lisa de
diversas porções do organismo, buscou-se avaliar se o EBEc interage em algum
ponto da via de sinalização deste mediador biológico. Desta forma, foi observado na
figura 10 que o L-NAME 100 µM reduziu significativamente o efeito relaxante cervical
induzido pelo EBEc nas concentrações utilizadas, sendo que o efeito máximo
relaxante produzido por EBEc 729 µg.mL-1 foi de apenas 32,3 ± 7,8%. Vale ressaltar
que neste grupo, com as concentrações utilizadas neste trabalho, não foi possível
determinar com precisão a CE50 (>729 µg/mL). Por outro lado, ao adicionarmos Larginina (300 µM) nas cubas contendo o L-NAME 100 µM, o relaxamento induzido
pelo EBEc foi parcialmente restaurado (74,9 ± 3,1%), CE50 24,6 ± 11,5 µg.mL-1.
56
Figura 10. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, 9, 27,
-1
81, 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com
L-NAME 100 µM (), associação L-NAME 100 µM + L-arginina 300 µM () ou controle (, controle).
Os valores foram expressos como percentual da contração controle. As barras verticais indicam o
erro padrão da média (E.P.M.). * p< 0,05 vs. EBEc (controle), após teste “t” student.
Deste modo foi iniciada a avaliação da possível via de transdução do sinal
intracelular mediado pelo segundo mensageiro GMPc. Para tal as cubas foram préincubadas com ODQ 5 µM, inibidor da guanilato ciclase. Com isso a Figura 11
demonstra que o segmento cervical na presença de ODQ apresentou um menor
padrão
de
miorrelaxamento
quando
comparado
ao
grupo
controle
nas
concentrações 9, 81, 243 e 729 µg/mL (26,0 ± 5,9 vs. 47,8 ± 6,5%; 39,9 ± 8,1 vs.
57
75,7 ± 6,2%; 48,0 ± 6,3 vs. 76,8 ± 7,4%; 47,0 ± 7,6 vs. 85,4 ± 5,1%,
respectivamente). Inclusive, a CE50 obtida nas cubas pré-incubadas com ODQ foi
> 729 µg.mL-1.
Figura 11. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3,
-1
9, 27, 81, 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina préincubados com ODQ 10 µM () ou não (, controle). Os valores foram expressos como percentual
da contração controle. As barras verticais indicam o erro padrão da média (E.P.M.). *p< 0,05 vs.
EBEc (controle), após teste “t” student.
58
Prosseguindo o estudo com a avaliação da participação dos canais para K +
voltagem dependente nas cubas contendo 4-AP, houve um relaxamento cervical
induzido por EBEc similar (relaxamento máximo 73,0 ± 3,1% e CE50 21,3 ± 8,6
µg.mL-1) ao observado nos segmentos incubados apenas com EBEc. Do mesmo
modo, nas cubas em que foram adicionados as concentrações do EBEc na presença
do TEA, o relaxamento cervical atingiu os 77,2 ± 10,0% na maior concentração do
extrato, com CE50 de 13,5 ± 7,3 µg.mL-1. Ainda com relação ao bloqueio de canais
para K+, a glibenclamida também não preveniu o efeito miorrelaxante induzido pelo
EBEc, com relaxamento máximo de 79,6 ± 9,7% na concentração de 729 µg/mL, e
CE50 9,8 ± 2,1 µg.mL-1.
Figura 12. Curva concentração-resposta para o efeito miorrelaxante induzido por EBEc 1, 3, 9, 27,
-1
81, 243 e 729 μg.L (representada em logaritmo) em segmentos de cérvice ovina pré-incubados com
Tetraetilamônio 0,3 mM (TEA, ), Glibenclamida 1 µM () ou 4-aminopiridina 3 mM (4-AP, ). Os
valores foram expressos como percentual da contração controle. As barras verticais indicam o erro
padrão da média (E.P.M.).
59
Para avaliar o efeito do EBEc sobre a liberação de cálcio dos estoques
intracelulares mediados por ligante, foram instituídos experimentos em cubas
contendo o verapamil 3 µM. A contração induzida por Ach 60 µM causou uma
contração fásica. Na presença do verapamil a contração foi de 41.3 ± 6.3% da
contração inicial induzida por este agonista colinérgico. Quando o EBEc foi
adicionado a cuba contendo verapamil, essa contração foi reduzida a 88.5 ± 2.2% da
contração inicial induzida por ACh, ver figura 13.
Figura 13. Efeito do EBEc sobre a contração in vitro induzida por Acetilcolina (ACh) em cérvice ovina.
A. Representação qualitativa do efeito do verapamil, ou verapamil + EBEc sobre a contração induzida
por ACh. Colunas indicam as médias e as linhas verticais representam o E.P.M. B. Representação
gráfica quantitativa do efeito do verapamil (), ou verapamil + EBEc ( ) sobre a contração induzida
por ACh. *p<0,05 vs. somente verapamil (controle) após teste “t” student.
60
Desta forma, obtidos bons resultados com relação à atividade miorrelaxante,
iniciou-se a avaliação in vivo do efeito do EBEc em cérvice ovina. Com isso
observou-se na figura 14 que a resposta contrátil da cérvice após o tratamento com
solução salina 0,15M foi de 90,8 ± 6,6% da amplitude de contração basal. Entretanto
a infusão de EBEc 2mg provocou um relaxamento da musculatura da cérvice uterina
de 56,6 ± 8,7%, que perdurou ao longo dos 20 minutos seguintes (43,5 ± 9,0 % e
45,6 ± 7,3%, respectivamente 10 e 20 min.). Entretanto, decorridos 30 minutos da
infusão, o efeito do EBEc foi dissipado e a amplitude da contração cervical voltou
aos valores próximos aos iniciais (87,7 ± 9,4% da amplitude basal).
61
Figura 14. Avaliação do efeito do EBEc sobre a contratilidade cervical de ovinos in vivo (A) registro
típico do traçado mostrando a diminuição da pressão intracervical de ovinos induzida pelo EBEc 2 mg
(B) Gráfico mostrando os valores médios do efeito miorrelaxante do EBEc 2 mg sobre as contrações
espontâneas da cérvice ovina. Os valores foram expressos como a percentagem da amplitude da
contração basal do período controle. As colunas mostram a média e as linhas verticais mostram o
desvio padrão dos dados (C) Esquema de avaliação da pressão intracervical de ovinos. (1) Balão
cervical (2) Tubo de polietileno (PE 10). *p<0,05 vs. controle, após ANOVA seguido do teste de
Newman-Keuls.
6. DISCUSSÃO
62
O presente estudo demonstrou que o EBEc possui efeito miorrelaxante
concentração-dependente sobre a contratilidade de cérvice ovina. Nesse sentido, o
extrato reduziu a resposta contrátil fásica e tônica aos agonistas colinérgicos,
acetilcolina e carbacol, respectivamente, bem como ao agente despolarizante KCl.
Já os bloqueadores de canais para K+ 4-AP, TEA e glibenclamida não preveniram
esta resposta desencadeada pelo EBEc, podendo inferir que não há participação de
canais Kv, BKCa e KATP para este efeito miorrelaxante. Entretanto, mesmo na
presença de verapamil, a contração induzida pela ACh foi atenuada pelo EBEc,
indicando que o efeito miorrelaxante promovido pelo EBEc envolva a redução da
liberação de Ca2+ intracelular. De fato, como o L-NAME e o ODQ atenuaram tal
resposta miorrelaxante induzida pelo EBEc, este efeito tem mediação da via NO com
transdução intracelular pelo GMPc, reconhecido segundo mensageiro responsável
pelo sequestro de Ca2+ do interior de células da musculatura lisa.
Estes achados fortalecem os relatos na literatura acerca do potencial
relaxante do EBEc em modelos experimentais de avaliação da contratilidade in vitro
em musculatura lisa (AGUIAR, 2012;
OLIVEIRA, 2011; REIS et al., 2010;
OLIVEIRA, 2012; SANTOS et al., 2013). Entretanto, neste trabalho, além das
evidências farmacológicas de que o EBEc apresenta efeito relaxante sobre a
contratilidade in vitro da cérvice ovina, foi demonstrado também que este efeito pode
ser reproduzido em modelo experimental de avaliação da contratilidade in vivo.
Nesse contexto, vale destacar que a partir de trabalhos destinados a avaliação da
contração uterina em ovinos, seres humanos e animais de experimentação
(BENOUSSAIDH et al., 2005; CHUA et al., 1998; MIRABILE et al., 2000; MUELLER
et al., 2006), foi adaptado um modelo para a avaliação da atividade cervical de
fêmeas ovina adultas mediante a utilização de um balão acoplado a uma cânula,
ambos preenchidos com líquido e conectados aos transdutores de pressão
pertencentes ao sistema de aquisição de sinais biológicos. Tal metodologia foi capaz
de captar variações na amplitude da contração cervical similares aos dados
referentes ao tônus uterino para a espécie (MIRABILE et al., 2000). Portanto, esse
estudo parece ser pioneiro quanto aos dados na literatura que tivemos acesso a
respeito da avaliação in vivo de cérvice ovina, e da obtenção de resultados
animadores quanto ao efeito de uma substância oriunda do sertão semiárido
nordestino com propriedade miorrelaxante, o que abre novas perspectivas para a
busca de novas substâncias que atuem como dilatador cervical ou tocolítico em
63
ovinos. Entretanto, esta metodologia de avaliação in vivo ainda é uma alternativa
pouco viável para condições experimentais limitadas. Uma vez que o processo de
pesquisa e desenvolvimento de fármacos é complexo, longo e de alto custo (LIMA et
al., 2003), para uma investigação mais minuciosa acerca do possível mecanismo de
ação de uma substância como o EBEc seriam necessários um quantitativo bastante
expressivo de animais.
Baseado nisso, nesta pesquisa foi utilizada uma metodologia que minimizasse
o uso de animais para experimentação e ao mesmo tempo mantivesse a veracidade
dos resultados, portanto optou-se pela avaliação da contratilidade cervical in vitro
que, inclusive, constitui a base para estudos farmacológicos e desenvolvimento de
fármacos, e já foi utilizada por outros autores nesta espécie (PARKINGTON, 1985;
PEREIRA et al., 2007). Existem vantagens em utilizar as metodologias in vitro, as
quais se destacam: a diminuição de intervenções dolorosas aos animais, a
considerável praticidade, menor tempo para condução e baixo custo por não
demandar um grande número de animais para sua realização, assim obedecendo ao
princípio dos três “Rs” (reduction, refinement, replacement) (CAZARIN et al., 2004).
Portanto, considerando estudos prévios quanto ao biopotencial do EBEc (OLIVEIRA
et al., 2011; SILVA et al., 2010; SANTOS et al., 2013), foram feitos ensaios in vitro
para avaliação das propriedades biológicas deste extrato em cérvice ovina.
Entretanto, não pode deixar de serem mencionados alguns contratempos referentes
à manutenção da viabilidade do tecido cervical durante o transporte, para isto o
tecido foi armazenado em solução nutritiva de Krebs à temperatura ± 20°C.
Não é de hoje que produtos naturais ocupam lugar de destaque como fonte
de novos medicamentos. Inclusive, a ação desses produtos em órgãos compostos
por músculo liso é extremamente importante, uma vez que podem atuar em
processos fisiopatológicos de alguns órgãos e sistemas dos animais e seres
humanos (GALVÃO et al., 2012; PEREIRA et al., 2004; TAKAHASHI, 1988). De fato,
muitas pesquisas comprovam o efeito de produtos naturais sobre músculo liso, a
exemplo de Soares (2008) que avaliou a ação miorrelaxante do extrato
hidroalcóolico de Polygala paniculata L. em aorta isolada de rato através de ensaios
in vitro e in vivo, assim como Murtala e Salahdeen (2012) que revelaram efeito
miorrelaxante do extrato de T. procumbens em aorta.
Com relação ao tecido uterino, em roedores, Martinez et al. (2010)
demonstraram o efeito espasmolítico do extrato de folhas de Aloysia triphylla e
64
Chiwororo e Ojehole (2009) avaliaram efeito espasmolítico de Psidium guajava.Tais
investigações científicas corroboraram o uso popular destes vegetais no combate às
cólicas menstruais. Do mesmo modo, e baseado em evidências do potencial
farmacológico dos produtos naturais na musculatura lisa, foram realizados
protocolos experimentais com o EBEc e verificou-se que este extrato possui efeito
miorrelaxante em traqueia, vaso e útero de roedores, dados que o incluíram no hall
de produtos naturais com bioatividade antiespasmódica e/ou espasmolítica
(SANTOS et al., 2013; SILVA et al., 2010).
No intuito de expandir a utilidade farmacológica deste extrato e verificar o
possível efeito em outra espécie, no presente trabalho verificou-se o efeito do extrato
etanólico de EBEc no músculo cervical ovino e foi constatado que este extrato
possui efeito miorrelaxante em segmentos de cérvice ovina a partir da concentração
9 µg/mL, relaxando 47,8% em comparação a variação da amplitude basal (p<0,05),
sendo que até a concentração avaliada, 729 µg/mL, este relaxamento chegou a
ordem de 85,4%. É de conhecimento comum que o efeito miorrelaxante de um
extrato está relacionado à composição fitoquímica do extrato, à espécie animal de
experimentação utilizado, bem como ao tecido envolvido na pesquisa. De fato, o
extrato hidroalcoólico das folhas de Erythroxylum argentinum na concentração 0,25
a 2 mg/mL também diminuiu a contração máxima induzida por
acetilcolina e
ocitocina em útero de ratas (TAKAHASHI et al., 1988). Além disso, este mesmo
extrato bruto das folhas de E. argentinum teve um efeito dose-dependente sobre a
contração induzida por acetilcolina no músculo reto abdominal de sapo, indicando
seu potencial antagonista para receptores nicotínicos (TAKAHASHI, 1988). Sabe-se
que o útero possui uma rica inervação do sistema nervoso autonômico com origem
no núcleo dorsal motor do vago (COLLINS et al., 1999; ORTEGA-VILLALOBOS et
al., 1990) na coluna intermédia lateral da medula espinhal toracolombar e no núcleo
sacral parassimpático (TRAURIG; PAPKA, 1993). Esse núcleo motor autonômico
recebe informações das estruturas supraespinhais e periféricas. Os neurônios préganglionares de tais núcleos autonômicos estabelecem diversas sinapses nervosas
com neurônios pós-ganglionares em uma gama de gânglios autonômicos pré e
paravertebrais. As sinapses ganglionares são colinérgicas nicotínicas (PAPKA et
al.,1995). Baseado nisso e considerando a presença de inervação adrenérgica e
colinérgica no miométrio e no endométrio (TRAURING; PAPKA, 1993; TETSURO et
al., 1994), foram desenvolvidos protocolos de avaliação do efeito do EBEc sobre a
65
contração cervical induzida pelo agonista colinérgico carbacol (CCh).
Após a
realização destes protocolos observou-se que o EBEc reduziu 46,1% da contração
induzida pelo CCh. A partir deste resultado, surgiu um novo questionamento: será
que o EBEc age bloqueando receptores muscarínicos para promover seu efeito
espasmolítico em cérvice de ovelha? De fato, visto que os alcaloides tropanos
apresentam potencial em bloquear receptores muscarínicos (SCHMELLER et al.,
1995) e estes compostos já foram isolados de vegetais do gênero Erythroxylum
(AGUIAR, 2012; OLIVEIRA, 2011) não descartamos a possibilidade destes
compostos químicos serem responsáveis pelo efeito miorrelaxante na cérvice ovina.
Vale salientar que no presente trabalho o EBEc 729 µg/mL também reduziu a
contração induzida por K+ 90 mM em 17,75%. O K+ despolariza a membrana devido
ao alto influxo de íons K+ resultando na abertura dos canais para K+ nas células da
musculatura lisa, este influxo de íons K+ é seguido pelo fechamento dos canais para
potássio voltagem dependentes Ca2+, o que resulta em um menor influxo de íons
Ca2+ e o efeito de relaxamento. Em contrapartida, a inibição dos canais para
potássio K+ leva a despolarização da membrana e o efeito de contração muscular
(NELSON e QUAYLE, 1995). Neste contexto, avaliou-se o efeito relaxante do EBEc
na presença e na ausência da 4-AP, um bloqueador seletivo dos Kv, e foi constatado
que o EBEc não age via canais para potássio voltagem dependente. Uma vez que a
4-AP não antagonizou o efeito relaxante do EBEc, quando comparado ao grupo
controle. Os canais Kv são abertos mediante a despolarização da membrana
plasmática na musculatura lisa das células vasculares. O fluxo de íons K + através
dos canais induz a repolarização da membrana para seu estado de repouso
(KURIYAMA, 2007). Estes canais contribuem também para a regulação do potencial
de membrana em células eletricamente excitáveis, entre elas as encontradas na
musculatura lisa. Do mesmo modo, foram avaliados os canais para KATP, que estão
presentes em diferentes tipos de músculo liso, sendo característica primordial a sua
abertura ser inibida por concentrações basais de ATP intracelular, sulfoniluréias (ex.
Gliblenclamida) e baixas concentrações de Ba (STANDEN et al., 1989; SANBORN,
2000). Sabe-se ainda que as correntes através dos KATP estão implicadas na
função miometrial. Os ativadores dos KATP, como o pinacidil, diminuem as
contrações uterinas, sendo mais potentes em miométrio não gravídico (SANBORN,
2000; NOVAKOVIC et al., 2007). Entretanto, no presente trabalho, o uso de
Glibenclamida, bloqueador de canais para KATP dependente também não
66
demonstrou alteração no miorrelaxamento do extrato EBEc frente a cérvice ovina.
Considerando que poucos canais BKCa precisam ser ativados para produzir
relaxamento uterino, principalmente em úteros gravídicos, onde há uma maior
expressão desses canais (BRAINARD; KOROVKINA; ENGLAND, 2007), foi avaliado
a possível participação dos canais BKCa no miorrelaxamento induzido pelo extrato
EBEc. Entretanto o bloqueador TEA não preveniu o relaxamento cervical induzido
pelo EBEc. Diante disto, ressaltamos que utilizamos tiras de cérvice de animais não
prenhes, e sabendo que existem mudanças morfofisiológicas de acordo com o
estado reprodutivo do animal, isto pode ter interferido na bioatividade da substância
teste (AUGHEY et al., 1983; PEREIRA et al., 2007). A presença de bloqueadores de
canais para K+ estudados não interferiu no efeito do EBEc sobre a contração
cervical, sugerindo que o EBEc desencadeia mecanismo de ação diferente da
ativação de canais para K+. Neste sentido, assim como o NO vários outros agentes
promovem seus efeitos relaxantes em musculatura lisa por meio do aumento da
atividade da guanilato ciclase solúvel, que por sua vez induz a produção de GMPc
(FORSTERMAN et al., 1986; IGNARRO et al., 1986). Considerando esta sequencia
de eventos na sinalização mediada pelo NO em musculatura lisa, como a cérvice
(TEIXEIRA, 2006), foram realizados protocolos mediante a incubação com L-NAME
ou ODQ, inibidores da enzima óxido nítrico sintase e guanilato ciclase solúvel,
respectivamente, seguidos da adição do EBEc. Nesse sentido foi observado que
ambos os fármacos diminuíram significativamente o efeito relaxante mediado pelo
EBEc em cérvice
ovina, resultados que sugerem que o mecanismo deste
relaxamento no canal reprodutivo de ovinos é provavelmente mediado pela ativação
da enzima NOS, seguidos da sinalização intracelular advindo do aumento do GMPc
intracelular, que dentre outros efeitos coordena o aumento da captação de Ca2+
citosólico para o retículo sarcoplasmático e isto promove o relaxamento muscular
(EMILIANO, 2002).
Além da participação do NO, a motilidade uterina é controlada por hormônios
esteroides
e
peptídicos,
a
exemplo,
da
ocitocina,
prostaglandinas
e
neurotransmissores liberados pelo sistema nervoso autonômico (HARPER, 1994).
Dessa forma, o sistema nervoso autonômico controla a motilidade uterina através de
várias vias. Sabe-se ainda que as vias colinérgicas desenvolvem um papel
importante no controle da motilidade uterina (SATO et al., 1996). Os neurônios
parassimpáticos pós-ganglionares não sintetizam e liberam apenas acetilcolina
67
(PAXINOS ; WATSON, 1998), mas também outros importantes mediadores como o
NO2, dessa forma conclui-se que o sistema nervoso central pode usar um ou vários
mecanismos no controle da motilidade uterina, ativação neuroendócrina libera
ocitocina, ativando as várias vias autonômicas.
Em adição, a resposta tecidual de
extratos pode ser influenciada por diferenças fisiológicas e anatômicas, tal como
presença de receptores diversos a depender do órgão alvo, além disso, é possível
que as fases estrais influenciem no padrão de resposta contrátil advinda da
exposição do miométrio ao extrato. De fato a indução de estro em ratas induz um
aumento no número de receptores para ocitocina no miométrio, assim como em
outros músculos lisos do trato gastrointestinal (RAMSEY, 2011).
A ocitocina que é liberada na corrente sanguínea pelos terminais neuronais
(RUSSEL et al., 2003) alcança o útero e se liga aos receptores ocitocinérgicos,
acoplados a proteína G e ativa a via do fosfatidilinositol intracelular responsável pela
liberação do Ca2+ intracelular responsável por desencadear a contração muscular
(WHITEAKER et al., 1995; FRANCZAK et al., 2005; HIRST et al., 2005).
Já é bem documentado na literatura o uso de ocitocina como estimulante para
contrações uterinas, que apresentam uma alta resposta contrátil na presença de
baixas concentrações de ocitocina (KINSLER et al., 1996). No miométrio a afinidade
dos receptores ocitocinérgicos aumenta no decorrer da gestação (ANOUAR et
al.,1996). Por outro lado, os inibidores de ocitocina parecem reduzir a atividade da
contração uterina tanto in vivo quanto in vitro (BERKLEY, 1993). Essa redução na
atividade se exemplifica quando observada a administração do peptídeo
ocitocina/V1a, atosibana, um peptídeo que age como antagonista da ocitocina, e é
administrado em mulheres durante o trabalho de parto (DALLE et al., 2000). Já foi
demonstrado na literatura que o atosibana reduz as contrações espontâneas do
miométrio in vitro. Sabe-se ainda que a inibição da produção de prostaglandina está
associada a uma pequena incidência de junções gap, resultando em uma queda nos
receptores para ocitocina no miométrio e endométrio de ovelhas (GARFIELD et al.,
1980; WU et al., 1999).
Deste modo e considerando a utilização da ocitocina na medicina veterinária
como agente relaxante cervical (STELLFLUG et al., 2001) e contracturante uterino
(KINSLER et al., 1996), surgiu a possibilidade do EBEc estar agindo através de
receptores ocitocinérgicos. Deste modo os segmentos foram pré-incubados com
atosibana, antagonista do receptor para ocitocina que age indiretamente ao prevenir
68
o aumento do cálcio intracelular em resposta ao aumento de trifosfato de inositol
induzido pela ocitocina, entretanto na presença de atosibana não foi constatado
inibição do relaxamento cervical induzido pelo EBEc.
A contração no músculo liso é composta por duas fases: um componente
fásico rápido seguido por um lento mais sustentado, o componente tônico (BOLTON,
1979). Esta resposta bifásica acontece devido à fonte dupla de Ca2+ no músculo liso
(meio extra e intracelular). Os agonistas colinérgicos com atividade contrátil sobre a
musculatura lisa podem se ligar aos receptores acoplados à proteína Gq ativando
uma cascata de fosfoinositídios através da produção de IP3 que, ao se ligarem aos
receptores para rianodina, desencadeiam a liberação de Ca2+ pelo retículo
sarcoplasmático (FUKATA; AMANO; KAIBUCHI, 2001). A elevação da [Ca2+]c,
também pode ocorrer através de receptores para rianodina e estimular a entrada de
Ca2+ através dos múltiplos tipos de canais, incluindo canais de membrana para Ca2+
operados por estoque, por receptor ou por voltagem (SANDERS, 2001;
McFADZEAN; GIBSON, 2002). Segundo Jim et al. (1981), o influxo de Ca2+
acontece principalmente através dos canais para Ca2+ voltagem dependente, uma
vez que a contração tônica é suprimida pelo bloqueador de canais para Ca2+
dependente de voltagem do tipo L, o verapamil. Considerando o possível
envolvimento da variação da concentração intracelular de Ca2+ no relaxamento
cervical ovino induzido pelo EBEc e na tentativa de excluir o influxo de cálcio Ca 2+
advindos do meio extracelular, utilizou-se o verapamil neste trabalho (GOULART,
2003). Após pré incubarmos o segmento cervical com verapamil, houve redução da
resposta contrátil a acetilcolina em 41,3% e, ao ser adicionado o extrato na cuba,
esta contração foi reduzida para 88,5%. Esta mudança de resposta tecidual na
presença do EBEc sugere que o mecanismo de ação envolva redução dos níveis de
cálcio advindo do meio citosólico, provavelmente, mediado pelo GMPc. Segundo
Santos (2013) o mecanismo de ação pelo qual os extratos de Erythroxylum spp.
exercem efeito em traqueia isolada de cobaia em parte pode envolver alteração do
influxo de Ca2+, levando assim a uma diminuição das concentrações intracelulares
desse íon e, consequentemente o relaxamento muscular. Entretanto, como descrito
anteriormente, não descartamos a possibilidade do EBEc desempenhar um
antagonismo com receptores colinérgicos, uma vez que outros extratos oriundos do
gênero Erythroxylum desempenham tal efeito farmacológico (CHIN et al., 2007).
69
Alguns estudos foram realizados para avaliar a contratilidade cervical ovina in
vitro (PARKINGTON, 1985; PEREIRA et al., 2007) ou in vivo (AYAD et al., 2004),
mas a maioria da pesquisas in vivo que utilizam diversos tratamentos farmacológicos
tomam como referência da dilatação cervical a distância que o aparelho de
inseminação consegue progredir além do óstio cervical (FALCHI et al., 2012;
LEETHONGDEE et al., 2007; NAQVI et al., 1998; PERRY et al., 2010). No presente
estudo foram avaliados os possíveis efeitos locais in vivo do EBEc 2 mg sobre a
contratilidade cervical de ovinos através da monitoração das variações da pressão
cervical. A aplicabilidade deste método foi satisfatório, mas duas ovelhas foram
excluídas do estudo, porque aparentemente, ambas tinham o trato reprodutivo
infantis, e o balão cervical não pode ser introduzido adequadamente no canal
cervical.
Com a realização destes protocolos, corroboramos os ensaios in vitro, uma
vez que o EBEc induziu o relaxamento da musculatura da cérvice uterina, efeito que
perdurou ao longo dos 20 minutos subsequentes. Entretanto, o efeito do EBEc foi
dissipado aos 30 minutos do término da infusão, isto pode ser reflexo da absorção
da substância após este período e/ou metabolização do extrato. Considerando o
tempo necessário para realização de uma possível inseminação artificial em torno de
10-20 minutos, o EBEc possui potencial para ser utilizado como ferramenta
farmacológica para tal biotécnica em ovinos.
Apesar de ter sido relatada a intoxicação em ovinos por folhas de
Erythroxylum deciduum pela via digestiva (BORELLI et al., 2011), nenhum sinal foi
detectado na presente pesquisa e o seu efeito miorrelaxante in vivo, de fato
corroborou os achados in vitro deste trabalho, e com o potencial miorrelaxante do
gênero observados em roedores (OLIVEIRA et al., 2012; SANTOS, 2013).
Diante do observado neste trabalho, a utilização do EBEc pode ser
promissora na rotina da inseminação artificial transcervical em ovinos. Entretanto,
estudos devem ser realizados para determinar a dose mínima eficaz para a dilatação
cervical e os efeitos deste extrato sobre a motilidade uterina, o transporte de
espermatozóides e a fertilidade dos animais.
Vale salientar que em virtude do material analisado ser um extrato etanólico
de um vegetal, e, portanto composto por várias substâncias diferentes, ainda não
podemos determinar qual o composto responsável por este efeito miorrelaxante.
70
Uma vez que a ciência está em constante desenvolvimento, a busca do princípio
ativo presente neste extrato é alvo de futuros estudos com tal espécie.
7. CONCLUSÃO
No estudo do efeito do extrato etanólico bruto de folhas de Erythroxylum
caatingae em cérvice ovina, bem como do mecanismo de ação, pode-se concluir
que:
- O extrato etanólico inibiu as contrações isométricas basais de segmentos de
cérvice ovina;
- O extrato etanólico reduziu a contração tônica induzida tanto pelo potássio quanto
pelo carbacol, sendo que tal efeito foi mais intenso na contração induzida pelo
carbacol, indicando o envolvimento de um processo fármaco-mecânico.
- Este efeito miorrelaxante é mediado pelo óxido nítrico, através da via de
transdução orquestrada pelo GMPc.
- O extrato etanólico reduziu a contração cervical de ovino induzida pela acetilcolina,
na presença de verapamil, indicando o envolvimento de um sequestro de cálcio
intracelular.
- O extrato etanólico tem efeito local ao reduzir a pressão intracervical de ovinos.
71
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