seleção de consórcios microbianos de sedimentos de

0
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE GEOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GEOQUÍMICA:
PETRÓLEO E MEIO AMBIENTE
KETLYN LUIZE FIORAVANTI
SELEÇÃO DE CONSÓRCIOS MICROBIANOS DE
SEDIMENTOS DE MANGUEZAIS COM POTENCIAL DE
DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO
Salvador
2013
1
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KETLYN LUIZE FIORAVANTI
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SELEÇÃO DE CONSÓRCIOS MICROBIANOS DE
SEDIMENTOS DE MANGUEZAIS COM POTENCIAL DE
DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO
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Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação emo
Geoquímica: Petróleo e Meio Ambiente, na Universidade
c
Federal da Bahia, como requisito parcial para a obtenção do
título de Mestre em Geoquímica: Petróleo e Meio Ambiente.u
m
Orientador: Prof. Dr. Joil José Celino
e
Co-orientador: Prof. Dr. Juan Carlos Rossi Alva
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Salvador
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2013
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2
KETLYN LUIZE FIORAVANTI
SELEÇÃO DE CONSÓRCIOS MICROBIANOS DE SEDIMENTOS DE
MANGUEZAIS COM POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DE
HIDROCARBONETOS DE PETRÓLEO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Geoquímica: Petróleo e Meio
Ambiente, na Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Geoquímica: Petróleo e Meio Ambiente.
Aprovada em 26 de março de 2013.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Joil José Celino (orientador)
Doutor em Geologia Regional: Universidade de Brasília
Universidade Federal da Bahia (UFBA)
Prof. Dr. Juan Carlos Rossi-Alva (co-orientador)
Doutor em Bioquímica: Universidade Federal do Rio de Janeiro
Universidade Católica do Salvador (UCSAL)
Profª. Drª. Eliane Soares de Souza
Doutora em Engenharia de Reservatório e de Exploração: Universidade Estadual Norte
Fluminense Darcy Ribeiro (UENF)
Profª. Drª. Cristina Maria Assis Lopes Tavares da Mata Hermida Quintella
Doutora em Ciências Moleculares: University of Sussex (UK)
Universidade Federal da Bahia (UFBA)
3
Dedico este trabalho à minha vozinha querida (in memorian).
Um exemplo de pessoa, de garra, dedicação à família e luta pela vida.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus que sempre me iluminou e abriu os caminhos para novas conquistas, que me deu
sabedoria, paciência e força nesse longa jornada.
Ao meu esposo Jean (meu toy) por todo amor, carinho, companheirismo e muiiita, mas
muita paciência nos momentos em que não estive presente ao longo desses dois anos. Obrigada
por sempre me apoiar e por cuidar tão bem de mim.
Aos meus pais Milka e Julio e ao meu irmão pelo amor, por acreditarem e confiarem no
meu potencial. Mesmo estando distante fisicamente estamos conectados a todo o momento.
À minha nova família (Sonia; Antônio e Kauana) que me acolheram como uma filha e
sempre me apoiaram. Muito obrigada!
Ao professor Joil, que desde o início confiou em minha capacidade e acreditou no
projeto. Obrigada pela orientação, pelos ensinamentos, pelas novas idéias, pela paciência por
estar disponível em todos os momentos de dúvida e desespero rsrsrs.
Ao professor Juan Carlos que me acolheu como co-orientador, que acreditou na proposta
desse trabalho e abriu as portas do LEMA para que eu e minha equipe pudéssemos realizar esse
trabalho. Muito obrigada professor, seu apoio foi fundamental!
Aos professores do LEMA (Wilson e Vanice) e aos estagiários (Daiana, Ana Cláudia,
Antonio, Camila) pelo interesse e pela disposição.
Aos professores Antônio Fernando, Olivia, Triguis, e Paulo Mafalda pelos ensinamentos
e por todo o apoio oferecido.
À professora Karina por ter me apresentado a POSPETRO, pelos conselhos e confiança.
À professora Gisele, pela sabedoria, pelo brilhantismo, pela transmissão de conhecimento
e por ser um exemplo a ser seguido.
Às professoras Kêsia, Norma e Eliane pelo auxilio na complementação das análises. Ao
técnico Assis do Laboratório de Física Nuclear me mesmo não estando em plena saúde se propôs
me auxiliar no final do experimento.
Aos colegas de turma (Jaciara, Leila, Fabiany e João), pela amizade, companheirismo,
conversas e pelas boas risadas.
A todas as estagiárias (Mayara, Larissa, Jéssica e Ayslany) pela dedicação, por
acreditarem no projeto, por estarem disponível. Essas meninas trabalharam muito!!!
Às estagiárias do NEA (Nayjane, Ingrid, Ana Clara, Ana Paula) que também trabalharam
e me apoiaram nessa pesquisa.
5
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À Cláudia pelos ensinamentos em geoquímica, pela paciência em me ensinar várias vezes
g
a mesma coisa, pela preocupação e por todo apoio. Ainda te devo muitas farinhas de arepa!
i
Aos técnicos do laboratório, em especial a Sarah e Gisele que estiveram sempre presentes
t
e disponíveis para a retirada de dúvidas, sugestões, sempre fazendo as coisas parecerem mais
e
fáceis. Obrigada por sempre estarem disponíveis.
À Naná, ao Cicero e ao Sr. Itanajara, pela atenção, pelos sorrisos e pela simpatia.
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A todos muito obrigada!!!!!!
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6
Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes
coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível
Charles Chaplin
7
Di
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FIORAVANTI, Ketlyn. L. Seleção de Consórcios Microbianos de Sedimentos de Manguezais
e
com Potencial de Degradação de Hidrocarbonetos de Petróleo. 2013. 148f. Dissertação
(Mestrado em Geoquímica: Petróleo e Meio Ambiente). Universidade Federal da Bahia. 2013. u
ma
cit
RESUMO
aç
ão
No intuito de colaborar para a remediação de áreas impactadas por atividades petrolíferas
este estudo buscou isolar, selecionar e avaliar o potencial de microrganismos provenientes do
de
sedimentos de manguezais em degradar os diferentes compostos do petróleo em cultura líquida.
do
Foram coletadas em 06 pontos, 12 amostras de sedimentos superficiais de manguezais próximos
a setores da cadeia produtiva do petróleo (produção, transporte e refino) na Baía de Todos cu
os
Santos (BTS). Amostras referências provenientes do Sul da Bahia foram utilizadas a fim me
de
verificar o comportamento dos microrganismos em região não impactada por atividades
nt
petrolíferas. Em seguida foram enriquecidas em meio mineral Buschnell Haas e 1% de petróleo,
óleo diesel e gasolina como única fonte de carbono e energia. Bactérias, fungos filamentososoe
leveduras foram os principais isolados. As bactérias representaram o maior número quando o
ou
petróleo foi utilizado como fonte de carbono, sendo utilizadas na execução dos subsequentes
ensaios de seleção e degradação. Com o uso do indicador 2,6 diclorofenolindofenol, das 127
o
bactérias isoladas na BTS, 26 foram selecionadas no primeiro ensaio e 15 no segundo ensaio. As
res
amostras de petróleo degradadas pelas bactérias, dentre elas a Enterobacter gergoviae, avaliadas
por cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/FID) identificaramu7
cepas promissoras para a formação de dois consórcios denominados consórcio A e consórcio B.
Os ensaios de degradação dos consórcios foram realizados em cinco diferentes períodos m
de
tempo (2 horas, 24 horas, 7 dias, 15 dias e 30 dias) sob agitação em shaker rotativo, a fim ode
avaliar os níveis de degradação dos n-alcanos de cadeia longa (C18-C32) e dos hidrocarbonetos
de
policíclicos aromáticos de alto peso molecular (benzo(k)fluoranteno, benzo(b)fluoranteno,
benzo(a)pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(g,h,i)perileno e Indeno (1,2,3,c-d) pireno. A partir
u
de 7 dias o consórcio A foi capaz de degradar 100% dos compostos acima do C28, porém, para os
ma
demais, as melhores taxas de degradação foram presenciadas após 30 dias de experimento, sendo
acima de 90%. O consórcio B atuou de forma semelhante na degradação de compostos acima do
qu
C20 após 7 e 15 dias de experimento, com níveis de degradação superiores a 81%. O
est
Indeno(1,2,3,c-d)pireno foi o composto mais degradado (92%) com atuação do consórcio A após
7 dias de experimento. O consórcio B proporcionou rápidas reduções nas concentrações de todos
ão
os HPAs após 2 horas e 24 horas de experimento, colaborando com elevados níveis de
int
degradação após 30 dias. Os microrganismos isolados de sedimentos de manguezal foram
considerados promissores para a degradação de hidrocarbonetos de petróleo, tendo o consórcioere
A
obtido preferência para os n-alcanos de cadeia longa e o B para os HPAs de alto peso molecular
ssa
– representando, até o momento, um dos poucos ensaios para a completa degradação dos
contaminantes.
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Palavras chaves: Biorremediação, ensaios de degradação, consórcios bacterianos, petróleo, ncê
alcanos, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.
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sic
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8
ABSTRACT
In order to contribute to the remediation of areas impacted by oil activities this study aim
to isolate, select and evaluate the potential of microorganisms from mangrove sediments in the
degrade oil of differents groups in liquid culture. Were collected in 06 points, 12 samples of
surface sediments of mangroves near sectors of the oil production chain (production,
transportation and refining) in the Todos os Santos Bay (TSB). Samples references from South
of Bahia were used to verify the behavior of microorganisms in the region not affected by oil
activities. The samples were enriched in mineral medium and Haas Buschnell 1% oil, diesel and
petrol as sole source of carbon and energy. Bacteria, yeasts and molds were the main isolates.
Bacteria represented the largest number when the oil was used as carbon source being used for
the execution of screening assays and subsequent degradation. Using the indicator 2.6
dichlorophenolindophenol, from 127 isolates in BTS, 26 were selected in the first test and 15 in
the second test. Samples oil degraded by bacteria, among them Enterobacter gergoviae and
evaluated by gas chromatography with flame ionization (GC / FID) identified seven strains
promising for the formation of two consortium named consortia consortium A and B. The
degradation tests of the consortia were made at five different periods of time (2 hours, 24 hours,
7 days, 15 days and 30 days) under stirring in a rotary shaker, to assess the level of degradation
of n-alkanes long chain (C18-C32) and aromatic polycyclic hydrocarbons of high molecular
weight (benzo (k) fluoranthene, benzo (b) fluoranthene, benzo (a) pyrene, dibenzo (a, h)
anthracene, benzo (g, h, i) perylene and indeno (1,2,3, cd) pyrene. 7 days From The consortium
was able to degrade 100% of the compounds above C28, but for others, the best degradation
rates were witnessed after 30 days experiment, being above 90%. consortium B acted similarly
in the degradation of compounds above C20 after 7 and 15 days of experiment, with degradation
levels exceeding 81%. indene (1,2,3, cd ) pyrene was degraded more compound (92%) with the
performance of the consortium after 7 days of experiment. The consortium B provided rapid
reductions in the concentrations of all PAHs after 2 hours and 24 hours of experiment with high
levels of degradation after 30 days. microorganisms isolated from mangrove sediments were
considered promising for the degradation of petroleum hydrocarbons, having obtained the A
preference for n-alkanes and long chain B for the high molecular weight PAHs - representing up
to now, one of the few trials for the complete degradation of the contaminants.
Keywords: Bioremediation, degradation test, bacterial consortia, oil, n-alkanes, polycyclic
aromatic hydrocarbons
9
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 12
1.1
CARACTERIZAÇÃO DAS ÁREAS DE ESTUDO – SUL DA BAHIA E BAÍA DE
TODOS OS SANTOS .................................................................................................... 13
1.2
COMPONENTES DO PETRÓLEO E SEUS DERIVADOS ......................................... 15
1.3
IMPACTOS CAUSADOS PELOS DERRAMES DE ÓLEO EM MANGUEZAIS ...... 15
1.4
O USO DE MICRORGANISMOS NA DEGRADAÇÃO DE PETRODERIVADOS .. 16
2
MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 19
2.1
ATIVIDADES DE CAMPO ........................................................................................... 19
2.2
MATÉRIA ORGÂNICA E GRANULOMETRIA ......................................................... 20
2.3
ENRIQUECIMENTO E ISOLAMENTO DOS MICRORGANISMOS ........................ 21
2.4
ENSAIOS DE SELEÇÃO ............................................................................................... 22
2.5
OBTENÇÃO DOS CONSÓRCIOS HIDROCARBONOCLÁSTICOS ......................... 22
2.6
ENSAIOS DE DEGRADAÇÃO ..................................................................................... 23
2.7
ANÁLISES GEOQUÍMICAS......................................................................................... 23
2.8
ANÁLISES DOS RESULTADOS.................................................................................. 24
3
FÍSICO-QUÍMICA E MATÉRIA ORGÂNICA DE SEDIMENTOS DE
MANGUEZAIS E DE FUNDO DE RIO E SUA INFLUÊNCIA NO ISOLAMENTO E
SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS EM ÁREAS IMPACTADAS E NÃO
IMPACTADAS ............................................................................................................. 25
RESUMO ........................................................................................................................ 25
ABSTRACT ..................................................................................................................... 25
3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 26
3.2 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................. 27
3.2.1 Áreas de Estudo ............................................................................................................... 27
3.2.2 Atividades de Campo ....................................................................................................... 28
3.2.3 Análise de Sedimento ...................................................................................................... 29
3.2.4 Enriquecimento e Isolamento .......................................................................................... 30
3.2.5 Tratamento Estatístico .................................................................................................... 31
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 31
10
3.4 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 41
3.5 AGRADECIMENTOS..................................................................................................... 42
3.6 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 42
4
DEGRADAÇÃO DE ALCANOS NORMAIS DE CADEIA LONGA (C18-C32) POR
CONSÓRCIOS BACTERIANOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE
MANGUEZAIS DA BAÍA DE TODOS OS SANTOS, BAHIA, BRASIL .............. 46
RESUMO ........................................................................................................................ 46
ABSTRACT ..................................................................................................................... 46
4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 47
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................. 48
4.2.1 A área de estudo .............................................................................................................. 48
4.2.2 Amostragem ..................................................................................................................... 49
4.2.3 Meios de cultura, solventes e padrões ............................................................................ 49
4.2.4 Isolamento dos microrganismos...................................................................................... 49
4.2.5 Ensaios de seleção.......................................................................................................... 50
4.2.6 Formação dos consórcios hidrocarbonoclásticos .......................................................... 51
4.2.7 Caracterização bioquímica e morfotintorial das bactérias selecionadas ...................... 52
4.2.8 Ensaios de Degradação .................................................................................................. 53
4.2.9 Cromatografia líquida.................................................................................................... 53
4.2.10 Cromatografia gasosa ................................................................................................... 54
4.2.11 Tratamento estatístico ................................................................................................... 55
4.3
RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................. 55
4.4
CONCLUSÕES ............................................................................................................. 67
4.5
AGRADECIMENTOS .................................................................................................. 67
4.6
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 67
5
MICRORGANISMOS DE SEDIMENTOS DE MANGUEZAIS POTENCIAIS
DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS
(HPAS) DE ALTO PESO MOLECULAR ... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
RESUMO ....................................................................................................................... 71
ABSTRACT ................................................................................................................... 71
5.1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 72
5.2
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 73
5.2.1 Área de Estudo e Coleta .................................................................................................. 73
11
5.2.2 Enriquecimento, Isolamento e Seleção ........................................................................... 74
5.2.3 Formação dos Consórcios .............................................................................................. 75
5.2.4 Ensaios de Degradação .................................................................................................. 75
5.2.5 Cromatografia Líquida ................................................................................................... 76
5.2.6 Cromatografia Gasosa Acoplada ao espectrômetro de massas (CG/EM) ..................... 76
5.2.7 Análises Estatísticas ........................................................................................................ 77
5.3
RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................... 77
5.4 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 84
5.5 AGRADECIMENTOS..................................................................................................... 85
5.6 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 85
6
CONCLUSÃO ................................................................................................................ 89
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 92
APÊNDICES ................................................................................................................ 102
12
1 INTRODUÇÃO
O aumento da necessidade por produtos derivados do petróleo (SATOW, 2008; MELO,
2011), bem como a mobilização de grandes volumes de óleo, tem aumentado a incidência de
acidentes durante os processos de extração, transporte e refino com a contaminação dos
ambientes marinhos (LE DRÉAU et al., 1997).
O petróleo é um líquido viscoso composto por diferentes classes de hidrocarbonetos, o
que propicia o crescimento de vários grupos bacterianos especializados em compostos
preferenciais (HARAYAMA, 1999; YAKIMOV et al., 2005). Ao entrar em contato com o
petróleo algumas populações microbianas sofre um processo de adaptação, reconhecendo seus
componentes como fonte de carbono e energia, iniciando assim o processo de degradação
(CRAPEZ et al., 2002).
Em condições adequadas ao seu crescimento e desenvolvimento, os microrganismos
providenciam uma vasta gama de serviços ambientais, dentre eles a biorremediação, alternativa
promissora e eficaz para recuperação de áreas impactadas. Muitos gêneros bacterianos, tais como
Pseudomonas, Marinobacter, Alcanivorax, Microbulbifer, Sphingomonas, Micrococcus,
Gordonia entre outros, estão naturalmente presentes nos sedimentos de manguezais e são
capazes de degradar hidrocarbonetos de petróleo (BRITO et al., 2006; SANTOS et al., 2011).
Os municípios de São Francisco do Conde, Madre de Deus e Candeias representam
importantes componentes estuarinos situados ao norte da Baía de Todos os Santos (BTS). Nestas
regiões concentram-se desde o ano de 1950 atividades ligadas à indústria petrolífera (produção,
transporte e refino), responsáveis por um dos maiores focos de poluição da BTS desde a segunda
metade do século XX.
Diante da problemática acima exposta o presente estudo objetivou avaliar o potencial de
degradação de consórcios microbianos isolados a partir de sedimentos superficiais de
ecossistemas de manguezais adjacentes às áreas com atividades econômicas da cadeia produtiva
do petróleo na Baía de Todos os Santos, Bahia, Brasil.
Os objetivos específicos foram:
1) Avaliar diferentes fontes de carbono (1% de petróleo, óleo diesel e gasolina) por meio
do isolamento de microrganismos nativos de sedimento de fundo de rio e de sedimento
superficial de manguezal do município de Belmonte, Sul da Bahia (área referência) e de
sedimentos superficiais de manguezais próximos à um campo de produção à petróleo (campo de
Dom João em São Francisco do Conde), de um terminal de transporte de petróleo e derivados
13
(Terminal Almirante Alves Câmara - TEMADRE em Madre de Deus) e de uma refinaria
(Refinaria Landulpho Alves Mataripe – RLAM nas proximidades de Candeias);
3) selecionar e identificar as bactérias potenciais degradadoras de hidrocarbonetos de
petróleo em até 24 horas para a formação de consórcios.
5) avaliar a degradação dos n-alcanos de cadeia longa (C18-C32) em diferentes períodos
de tempo (2 horas, 1 dia, 7 dias, 15 dias e 30 dias) por meio dos consórcios bacterianos.
6) avaliar os níveis de degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos de alto
peso
molecular
benzo(k)fluoranteno,
benzo(b)fluoranteno,
benzo(a)pireno,
dibenzo(a,h)antraceno, benzo(g, h, i) perileno e indeno(1,2,3,c-d)pireno em ensaios de
degradação por meio dos consórcios bacterianos em diferentes períodos amostrais.
1.1 CARACTERIZAÇÃO DAS ÁREAS DE ESTUDO – SUL DA BAHIA E BAÍA DE
TODOS OS SANTOS
O município de Belmonte localiza-se no limite Sul da região cacaueira da Bahia, no baixo
curso do rio Jequitinhonha. Os manguezais de Belmonte bem como o rio Jequitinhonha são a
fonte de sobrevivência da maioria da população (GONÇALVES, 1997; SOUZA, 2011). Até o
presente momento não existem indícios de influência de atividades econômicas da indústria
petrolífera nos manguezais do município de Belmonte (SILVA, 2008).
Desde o ano de 1950 estão instalados nos municípios de São Francisco do Conde, Madre
de Deus e Candeias, ao norte da Baía de Todos os Santos – BTS, setores industriais ligados às
atividades de produção, transporte e refino e petróleo, sendo essas localidades alvos de impactos
ambientais relacionados ao constante derrame de petroderivados (VEIGA, 2003; MOREIRA,
2011). No quadro 1 estão evidenciados alguns dos principais acidentes ocorridos na BTS entre os
anos de 2000 e 2012 envolvendo derrame de petróleo e seus derivados em locais próximos aos
setores de produção, transporte e refino.
O campo de Dom João foi inaugurado nos anos 50, em uma área de 30 Km 2 a 40 km de
Salvador, nas proximidades de São Francisco do Conde, Madre de Deus e Candeias. É
considerado o primeiro campo de petróleo submarino brasileiro, pertencente aos arenitos da
Bacia de Sergi, na Bacia do Recôncavo (VEIGA, 2003).
14
Quadro 1 - Acidentes envolvendo derramamento de petróleo e seus derivados na BTS entre o período de 2000 a
2012.
Período
Abril de 2000
Ocorrência
Rompimento do duto da Petrobrás que liga o polo petroquímico de Camaçari à
RLAM atingindo o rio Joanes.
Julho de 2000
Vazamento de aproximadamente 10.000 litros de óleo dos dutos da RLAM
atingindo a região de Caípe.
Outubro de 2000
Destruição parcial da unidade 9 da RLAM após incêndio provocado por
vazamento.
Março de 2001
Rompimento dos dutos da RLAM culminando em vazamento de 10.000 litros
de resíduo de gasóleo em suas intermediações.
Outubro de 2001
Vazamento de óleo em manguezal de Coqueiro Grande, próximo a RLAM,
após realização de limpeza do sistema de dutos da Petrobrás.
Setembro de 2002
Explosão na planta de GLP da RLAM culminando com a morte de 3
funcionários.
Abril de 2009
Vazamento de óleo proveniente da RLAM, contaminando praias localizadas na
BTS.
Junho de 2010
Vazamento de óleo em estrutura da Petrobrás desativada em 2002 em área de
manguezal de São Francisco do Conde.
Novembro 2012
Vazamento de diluente de óleo combustível entre a TEMADRE e a RLAM,
atingindo praias de São Francisco do Conde.
Fonte: Veiga (2003); Décimo (2009); Maia-Nogueira (2010); Federação Única dos Petroleiros (2010).
O Terminal Almirante Alves Câmara - TEMADRE é tido como o segundo terminal
portuário mais importante da Empresa de Petróleo Brasileira S/A - PETROBRÁS. O TEMADRE
localiza-se ao Sul da Ilha de Madre de Deus, em uma região denominada Ponta do Mirim. É
responsável pelo recebimento de petróleo e pelo embarque de petroderivados provenientes da
Refinaria Landulpho Alves Mataripe – RLAM (VILLOTE, 2010).
A RLAM localiza-se dentro de uma região de manguezal, próximo ao município de
Candeias, a 56 km da capital Salvador. Inaugurada no dia 17 de setembro de 1950, é a refinaria
que está diretamente ligada à descoberta dos primeiros poços de petróleo brasileiros. Cerca de 40
petroderivados são produzidos pela RLAM, a exemplo de: GLP, nafta petroquímica, querosene,
óleo diesel, gasolina, parafina, asfaltos, entre outros (VEIGA, 2003; OLIVEIRA, 2009).
15
1.2 COMPONENTES DO PETRÓLEO E SEUS DERIVADOS
O grupo predominante no petróleo é dos hidrocarbonetos saturados, sendo composto
pelos alcanos de cadeia normal, isoalcanos de cadeia ramificada, também conhecidos como
parafínicos, e os cicloalcanos ou naftênicos. As resinas e asfaltenos são constituídas por átomos
de enxofre, oxigênio e nitrogênio, sendo compostos de alto peso molecular (ZÍLIO; PINTO,
2002; VEIGA, 2003; THOMAS, 2004).
Dentre os derivados do petróleo, o óleo diesel trata-se de uma mistura complexa de
hidrocarbonetos, constituído principalmente por hidrocarbonetos de cadeia simples entre 6 a 30
átomos, hidrocarbonetos aromáticos e compostos contendo enxofre e nitrogênio. É um
combustível menos volátil e menos solúvel do que a gasolina (MARIANO, 2006; GAZZONI,
2007; ANDRADE, 2009).
A gasolina é formada principalmente por compostos orgânicos voláteis, sendo uma
mistura constituída por aproximadamente 200 tipos de componentes distintos, a exemplo dos
compostos alifáticos e aromáticos, dentre eles o BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno)
que são compostos tóxicos, parcialmente solúveis em água e que representam elevado grau de
poluição (PENNER, 2000; RIBEIRO et al., 2003; MARIANO, 2006).
Dentre os compostos orgânicos que apresentam principal interesse ambiental devido aos
seus efeitos mutagênicos e carcinogênicos estão os HPAs (Hidrocarbonetos Policíclicos
Aromáticos). São compostos formados por átomos de carbono e hidrogênio, constituídos por
dois ou mais anéis aromáticos. Devido a sua ubiquidade, são considerados ameaças para a saúde
das populações, principalmente para aquelas que trabalham e habitam ambientes diretamente
influenciados pelas fontes de emissão (NETTO et al., 2000; CAVALCANTE et al., 2007;
JACQUES et al., 2007).
1.3 IMPACTOS CAUSADOS PELOS DERRAMES DE ÓLEO EM MANGUEZAIS
A presença de petróleo e seus derivados nos manguezais causam impactos físicos e seus
efeitos toxicológicos podem ser agudos ou crônicos (NATIONAL OCEANIC AND
ATMOSPHERIC ADMINISTRATION, 2002). A exposição crônica ao petróleo pode ameaçar
algumas espécies marinhas que possuem baixa taxa de reprodução, além de afetar o ser humano
ao se alimentar de peixes e outros animais contaminados. Os peixes em contato com o petróleo
ficam presos na camada de óleo, podendo ser levados á morte devido a dificuldades respiratórias
16
e de locomoção. Quando ingerido, o petróleo provoca falhas hepáticas, desordens neurológicas e
bioacumulação dos HPAs (ZIOLLI, 2002).
Ao atingir a superfície do solo, um contaminante passa a sofrer uma série de
transformações, como, adsorção nas partículas sedimentares, fotodecomposição, além de
transformações químicas e biológicas. O contaminante pode também, por meio de um processo
de lixiviação, ser arrastado pelas águas, percolar nas camadas inferiores do solo e até mesmo
atingir o lençol freático (CORSEUIL, 1997; PEREIRA et al., 2009; SANTOS et al., 2011).
1.4 O USO DE MICRORGANISMOS NA DEGRADAÇÃO DE PETRODERIVADOS
Muitos microrganismos, a exemplo de bactérias, cianobactérias, fungos, leveduras além
de algumas algas verdes, são capazes de oxidar hidrocarbonetos, crescendo em sua superfície e
os utilizando como doadores de elétrons. Os hidrocarbonetos de petróleo são ricos em matéria
orgânica, servindo de fonte de carbono e energia aos microrganismos sob condições aeróbicas
(MADIGAN et al., 2004).
As bactérias são seres capazes de se adaptarem rapidamente as alterações dos
componentes bióticos e abióticos do meio. A variabilidade metabólica desse grupo de
organismos, sua rápida capacidade de multiplicação e variabilidade genética, são algumas das
características que as tornam conhecidas pelo seu potencial de degradação (RAMSAY et al.,
2000; GOMES, 2004; PUCCI et al., 2009).
Os fungos como agentes degradadores de petróleo e seus derivados em substratos, vêm
sendo estudados e utilizados nos processos de biorremediação desde o ano de 1973. São
microrganismos resistentes às condições de estresse ambiental, como insuficiência de nutrientes,
baixos teores de umidades e valores de pHs extremos (MACEDO et al., 2002; LIMA et al.,
2011). Durante esse processo bactérias utilizam o seu potencial fisiológico para remover
poluente do meio transformando o petróleo em biomassa, água e dióxido de carbono
(WATANABE, 2001; CRAPEZ, 2002).
No quadro 2 estão representados alguns microrganismos com capacidade de degradar
determinadas frações ou compostos de petróleo bem como o ambiente em que estes são
encontrados.
17
Quadro 2.
Alguns microrganismos degradadores de compostos do petróleo em diferentes
ambientes.
Microrganismo
Bactéria
Gênero/ Classe/ Filo
1
Alcanivorax
Composto
n-alcanos
Ambiente
Água do mar
Referências
HARAYAMA et al.,
1999
Bactéria
1
n-alcanos;
tolueno
Água do mar
HARAYAMA et al.,
1999; VAN HAMME
et al., 2003
Bactéria
1
Pseudomonas,
Pseudomonas,1Bulkholde
ria
Tolueno
Água do mar
HARAYAMA et al.,
1999
Bactéria
2
HTP
Sedimento
PEIXOTO et al.,
2011
Bactéria
2
Fenantreno
Sedimento
PEIXOTO et al.,
2011
Bactéria
3
Antraceno;
HPA
Sedimento
PEIXOTO et al.,
2011
Bactéria
1
Benzo(a)
pireno
Sedimento
YUN et al., 2008
Levedura
1
Naftaleno;
N-alcanos;
Petróleo
bruto
Água do mar,
sedimento,
solo
IJAH, 1998;
HARAYAMA et al.,
1999; FARAG;
SOLIMAN, 2011
Levedura
1
HPA
Solo
HESHAM et al.,
2006; DENG et al.,
2010
HPA
Solo
LEMOS;ARAÚJO,
2002; VASCO et al.,
2011
Chrysosporium,
Trichopyton,
1
Myceliophthora
HTP
Solo
ULFIG et al., 2003
1
Cunninghamella,
Penicillium
HPA
Não
especificado
SACK et al., 1997
Aspergillus
HPA
Solo
MOLLEA et al.,
2005
Pseudomonas
1
Betaproteobacteria
Alphaproteobacteria
Actinobacteria
Rhodoccocus; 1Bacillus
Candida
Pichia ,1Candida,
Sporidiobolus, 1Rhodotorula
1
Filamentoso
1
Aspergillus, 1Penicillium,
Paecilomyces, 1Fusarium
1
Filamentoso
1
1
Filamentoso
1
Filamentoso
1
– Gênero; 2 – Classe; 3 - Filo
O processo de biorremediação é estudado desde 1940. Suas técnicas vêm sendo
extensivamente aplicadas como uma maneira eficaz e de baixo custo para remediação de solos
18
contaminados por petróleo desde a década de 90 (ZOBEL, 1946; MACEDO et al., 2002;
MARIANO et al., 2007; RIZZO et al., 2008).
Durante a aplicação da biorremediação podem ser utilizadas técnicas ex situ, onde o
contaminante é retirado juntamente com a matriz e tratado em outro local ou in situ, sendo o
tratamento realizado no próprio local contaminado (COELHO, 2005).
Entre as técnicas ex situ podem ser citadas: bioaeração, injeção de peróxido de
hidrogênio, lagoas de estabilização, lodos ativados, filtros biológicos, compostagem,
landfarming e biobarreiras (MARTINS et al., 2003). São exemplos de técnicas de
biorremediação in situ: a biorremediação intrínseca ou natural, a bioestimulação por meio de
agentes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes ou o bioaumento por meio da inoculação de
consórcio microbianos enriquecidos (MARIANO et al., 2007).
O petróleo é constituído por diferentes classes de hidrocarbonetos. Por esse fato, a
degradação de seus compostos não pode ser realizada por uma única espécie microbiana, sendo
necessária a formação de consórcios formados por várias espécies distintas. Por
complementaridade metabólica, os consórcios degradam os compostos derivados do petróleo,
podendo até mesmo chegar à sua completa mineralização (LEAHY; COLWELL, 1999; VAN
HAMME et al., 2003; CRAPEZ et al., 2002; GHAZALI et al., 2004; JACQUES et al., 2007).
Alguns fatores ambientais apresentam influência direta na eficiência da biorremediação,
como: temperatura, pH, oxigênio, umidade, atividade de água, disponibilidade de nutrientes e
biodisponibilidade dos contaminantes. Esses podem inibir ou acelerar o crescimento dos
microrganismos potenciais degradadores de hidrocarbonetos de petróleo (BAMFORTH;
SINGLETON, 2005). Fatores físicos, químicos e biológicos, a exemplo da quantidade de
biomassa e diversidade microbiana, atividades enzimáticas, caracterização físico-química do
substrato, concentração e estrutura dos poluentes, determinam o grau de eficiência de cada
processo de biodegradação (WETLER-TONINI et al., 2010).
19
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Baseado em extensa revisão bibliográfica (complementações citadas no apêndice 1)
foram realizados procedimentos de campo bem como diversificados procedimentos laboratoriais.
Maiores detalhes acerca das metodologias empregadas estão relatadas nos artigos científicos
apresentados como resultados do trabalho.
2.1 ATIVIDADES DE CAMPO
As coletas da matriz de estudo foram realizadas em ecossistemas costeiros distintos
pertencentes ao extremo Sul do Estado da Bahia, região de Belmonte (referência) (figura 1A) e
aos municípios de São Francisco do Conde, Madre de Deus e Candeias, localizados na região
norte da Baía de Todos os Santos (figura 1B).
Em cada estação referência (sedimento de fundo do rio Jequitinhonha e sedimento
superficial de manguezal em Belmonte) foram coletadas duas amostras. Nas estações
pertencentes à BTS realizou-se amostragem dos sedimentos superficiais dos manguezais em dois
pontos distintos, totalizando doze pontos de amostra (figura 2A).
Todas as amostras foram coletadas em maré baixa e em período chuvoso. Os parâmetros
físico-químicos pH, Eh, temperatura, condutividade e salinidade foram mensurados in situ,
diretamente no rio Jequitinhonha ou em corpos d’água próximos aos pontos de coleta nas
amostras de manguezais (figura 2B).
Para as análises microbiológicas coletou-se cerca de 50 g de amostra de sedimento de
fundo de rio, a profundidade aproximada de 5 m e de sedimento superficial de manguezal entre
0,0 a 5,0 cm do substrato do manguezal em região de inter-maré (CELINO; QUEIROZ, 2006).
Para as análises de carbono orgânico e granulometria as amostras coletadas (50 g
aproximadamente) foram armazenadas em um saco plástico. Todas as amostras foram
armazenadas em caixa de isopor contendo gelo até a chegada ao laboratório (figura 2C).
20
Figura 1 - Localização das áreas de estudo. (A) - Município de Belmonte, (B) – Municípios da BTS pertencentes à
cadeia produtiva do petróleo (DJ) – Campo de produção em São Francisco do Conde, (MD) – Madre de Deus e
(CN) – Candeias próximo da região de refino.
Figura 2 - Atividades de campo. (A) – Coleta das amostras; (B) Medição dos parâmetros físico-químicos; (C) –
Armazenamento as amostras.
2.2 MATÉRIA ORGÂNICA E GRANULOMETRIA
Após as amostras serem liofilizadas, maceradas, desagregadas e peneiradas, foram
realizados procedimentos analíticos para a determinação da matéria orgânica (m.o) e dos teores
granulométricos. A determinação da matéria orgânica foi baseada na oxidação do Carbono
Orgânico Total (COT), através da metodologia de Walkley e Black (1934) e Embrapa (1997). A
21
análise granulométrica se deu por meio do analisador de partículas, modelo Silas 1064, segundo
metodologia da Embrapa (1997), com o uso do programa GRADSTAT para a leitura e
tratamento dos dados.
2.3 ENRIQUECIMENTO E ISOLAMENTO DOS MICRORGANISMOS
No Laboratório de Estudos em Meio Ambiente – LEMA, da Universidade Católica do
Salvador/UCSAL foram realizadas as análises microbiológicas. Cada amostra foi pesada três
vezes (10g) totalizando 18 subamostras provenientes da BTS, além de 06 subamostras da área
referência, sendo 03 do rio Jequitinhonha (RJ) e 03 do manguezal em Belmonte (BE). Uma
amostra controle foi escolhida para cada área de estudo, totalizando 27 amostras enriquecidas.
No esquema 1 estão ilustradas as metodologias e enriquecimento e isolamento empregadas para
os microrganismos.
Esquema 1 - Metodologias adotadas para o enriquecimento e isolamento dos microrganismos
Enriquecimento das amostras (10g) em 99 mL de
meio Buschnell Haas (BH) e 1% de petróleo, óleo
disel ou gasolina como fonte de carbono (SOUZA et
al., 2005)
Amostras agitadas a 180 RPM, 28ºC ± 2 durante 21
dias (CHAERUN et al., 2004; SOUZA et al., 2005;
WETLER, 2006)
Transferência de bactérias, leveduras e fungos para
placas de TSA e Sabouraund (SOUZA et al., 2005)
Semeadura das amostras enriquecidas em placa de
Agar Buschnell Haas (BH) com adição de 1% de um
dos petroderivados. Incubação em estufa a 30ºC
durante 4 dias (SOUZA et al., 2005).
22
2.4 ENSAIOS DE SELEÇÃO
Os procedimentos adotados durante a seleção primária (placas multipoços de 2,0 mL) e
secundária (frascos tipo Erlenmeyers de 125 mL) estão demonstrados no esquema 2.
Esquema 2. Sequência dos procedimentos executados nos ensaios de seleção
Reativação das cepas em caldo
Mueller Hinton e placas de TSA
de TSA
Seleção primária
10 µL do indicador 2,6 diclorofenolindofenol DCPIP
20 µL de
petróleo
118 cepas testadas
50 µL da
suspensão
bacteriana
8
(1,5x10 UFC)
500 µL de
Caldo BH
24
horas
Seleção secundária
50 mL de caldo
BH
Cepas promissoras no
ensaio primário
2 mL suspensão
bacteriana
8
(1,5x10 UFC)
Agitação a 180
± 2 rpm e 28ºC
±2/ 17 horas
520 µL
de petróleo
Adição de 1mL
do 2,6 DCPIP
24
horas
Fonte: Hanson (1993); Gomes (2004); Souza et al.(2005); Miranda et al.(2007); Afuwale e Modi (2012).
2.5 OBTENÇÃO DOS CONSÓRCIOS HIDROCARBONOCLÁSTICOS
No Laboratório de Estudos do Petróleo – LEPETRO, da Universidade Federal da Bahia
(UFBA) as amostras de óleo contidas nos frascos tipo Erlenmeyers dos ensaios de degradação
foram desidratadas e avaliadas em cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização de
chama (CG/ FID) para avaliação dos fingerprints pela metodologia do whole oil (óleo total).
Após a avaliação em CG/FID sete cepas bacterianas foram indicadas para a elaboração de
dois consórcios hidrocarbonoclásticos.
23
Tais bactérias foram encaminhadas para o Laboratório de Fármacos e Ensaios
Antimicrobiano pertencente ao Departamento de Antibióticos do Centro de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE para a realização de procedimentos de
identificação baseado metodologia de Koneman et al. (2008).
2.6 ENSAIOS DE DEGRADAÇÃO
Para a execução dos ensaios de degradação foram utilizados frascos tipo Erlenmeyers de
125 mL contendo 50 mL de caldo Buschnell Haas (BH), 400 µL de cada uma das cinco cepas
bacterianas padronizadas a 1,5x108 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) e 520 µL de
petróleo sob agitação em 180 RPM a 28ºC ± 2. Um controle abiótico, em duplicata, e dois
consórcios hidrocarbonoclásticos, em triplicata, compuseram os ensaios, totalizando 49
amostras.
Após 2 horas (t0), 24 horas (t1), 7 dias (t2), 15 dias (t3) e 30 dias (t4) retirou-se a água
contida nos frascos testados e os parâmetros pH, Eh, condutividade e salinidade foram
mensurados com o uso pHmetro (resolução 0,01) e condutivímetro (range 199,9 µS/cm;
resolução 0,1 µS/cm) ambos da marca WTW.
2.7 ANÁLISES GEOQUÍMICAS
As amostras de óleo presente nos frascos Erlenmeyers foram desidradatas para a
execução das análises geoquímicas, conforme demonstrado por meio do quadro 3. Maiores
informações acerca das condições dos equipamentos utilizados estão detalhadas nos
procedimentos metodológicos elucidados nos artigos científicos.
Quadro 3 – Análises e procedimentos geoquímicos
Análises
Procedimentos
Cromatografia Líquida
Fracionamento de 0,02g de amostra de óleo desidratada para separação das
frações SAT, ARO e NSO segundo metodologia adaptada pelo LEPETRO.
Avaliação dos fingerprints dos n-alcanos (C8-C40) por metodologia do
whole oil para a formação dos consórcios hidrocarbonoclásticos.
Avaliação dos fingerprints e concentração dos n-alcanos de cadeia longa
(C18-C32) e do C30 hopano após os ensaios de degradação. Avaliação da
concentração residual dos HPAs de alto peso molecular (m/z 252, 276 e
278) das amostras de óleo submetidas aos ensaios de degradação.
Cromatografia Gasosa
(CG/FID)
Cromatografia Gasosa
(CG/EM)
24
2.8 ANÁLISES DOS RESULTADOS
A fim de obter uma melhor compreensão em relação aos dados obtidos em cada etapa
analítica foram elaboradas tabelas e gráficos com o auxílio do programa Excel 2007.
Com o uso do software GraphPhad Instat foram avaliadas a normalidade dos dados (teste
de Kolmogorov e Smirnov (KS)), a significância (one-way ANOVA para os dados normais,
Kruskal Wallis e Mann Whitney para dados não normais) e a homogeneidade (teste de Bartllet).
Por meio do programa Estatística versão 7.0 realizou-se a Análise dos Componentes Principais
(ACP) das variáveis e dos casos envolvidos nos experimentos e avaliou-se a correlação entre os
dados por meio da matriz de Pearson.
Os resultados apresentados pelo estudo em questão estão contemplados na forma de
artigos científicos, sendo:
- Físico-química e teores de matéria orgânica em ecossistemas costeiros e sua influência
no isolamento de microrganismos em áreas impactadas e não impactadas;
- Degradação de alcanos normais de cadeia longa (C18-C32) por consórcios bacterianos
isolados de sedimentos de manguezais da Baía de Todos os Santos, Bahia, Brasil;
- Eficiência de microrganismos de sedimentos de manguezais potenciais degradadores de
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) de alto peso molecular.
25
3 FÍSICO-QUÍMICA E TEORES DE MATÉRIA ORGÂNICA EM
ECOSSISTEMAS COSTEIROS E SUA INFLUÊNCIA NO ISOLAMENTO
DE MICRORGANISMOS EM ÁREAS IMPACTADAS E NÃO
IMPACTADAS
RESUMO
Objetivou-se avaliar a relação dos fatores físico-químicos (pH, Eh, temperatura,
condutividade, salinidade e granulometria) e dos teores de matéria orgânica na distribuição de
microrganismos em sedimentos de ecossistemas impactados e não impactados por atividades da
indústria petrolífera. Para tal isolaram-se bactérias, leveduras e fungos filamentosos provenientes
de sedimento de fundo de rio e superficiais de manguezais das regiões de Belmonte e da Baía de
Todos os Santos no Estado da Bahia, com o uso de 1% de petróleo, óleo diesel e gasolina como
única fonte de carbono e energia. Os parâmetros físico-químicos foram mensurados in situ. Em
laboratório foram realizadas análises dos teores de matéria orgânica e do padrão granulométrico
de cada área de estudo. A Baía de Todos os Santos foi a região que obteve o maior número de
isolados (65%) sob influência da temperatura, condutividade e do teor da matéria orgânica na
região de refino. Belmonte obteve 25% do total de isolados determinados pela temperatura,
salinidade, silte e areia muito fina. A área referência do rio Jequitinhonha contou com 10% dos
isolados, influenciada pelos teores da matéria orgânica, Eh e areia fina.
Palavras chaves: Microrganismos, parâmetros físico-químicos, Baía de Todos os Santos,
ecossistemas costeiros
ABSTRACT
Aimed to evaluate the rate of physic-chemical (pH, Eh, temperature, conductivity,
salinity and grain size) and content of organic matter in the sediment distribution of
microorganisms in ecosystems impacted and not impacted by oil industry's activities. Were
isolated bacteria, yeasts and filamentous fungi from bottom sediment of river and shallow of
mangrove regions of Belmonte and the Todos os Santos Bay (TSB), in the state of Bahia, with
the use of 1% oil, diesel and gasoline as sole source of carbon and energy. The physic-chemical
parameters were measured in situ. In laboratory analyzes were carried out the levels of organic
matter and particle size standard for each study area. The Todos os Santos Bay was the region
that had the highest number of isolates (65%) with temperature influence, conductivity and
organic matter in the region of refining. Belmonte won 25% of the total isolates determined by
temperature, salinity, silt and very fine sand. The reference area of the river Jequitinhonha had
10% of the isolates, influenced by the levels of organic matter, Eh and fine sand.
Keywords: microorganisms, physical-chemical parameters, Todos os Santos Bay, coastal
ecosystems
26
3.1 INTRODUÇÃO
Atividades relacionadas aos setores da cadeia produtiva do petróleo são atualmente uma
das principais responsáveis pela contaminação dos ambientes marinhos (LE DRÉAU et al.,
1997; SATOW, 2008).
O petróleo é um líquido viscoso onde cerca de 90% dos seus componentes são
hidrocarbonetos (HARAYAMA et al., 1999; YAKIMOV et al., 2005). Alguns microrganismos
ao entrar em contato com o óleo derramado sofrem um processo de adaptação, reconhecendo
seus componentes como fonte de carbono e energia, iniciando assim o processo de degradação
(CRAPEZ et al., 2002).
Microrganismos com habilidade em degradar hidrocarbonetos estão amplamente
distribuídos na natureza (VAN HAMME et al., 2003). Os hidrocarbonetos de petróleo são
passiveis de oxidação por bactérias, cianobactérias, fungos e leveduras, os quais crescem em sua
superfície e utilizam-no como doadores de elétrons (MADIGAN et al., 2004).
O petróleo derramado nos oceanos é levado para os ecossistemas costeiros, como por
exemplo, os manguezais, típicos de regiões tropicais e subtropicais. Esse ecossistema destaca-se
pela sua função de berçário, refúgio e abrigo para diversas espécies marinhas e estuarinas em
busca de alimento e reprodução (ALONGI, 2002; QUEIROZ; CELINO, 2008).
Os sedimentos de manguezal apresentam diferentes níveis de contaminação a depender
do grau de intervenção humana ao qual estão expostos. A quantidade de óleo derramado, seu
tipo, padrão de deposição e tempo de retenção são fatores que irão auxiliar na determinação dos
impactos causados à fauna e à flora (NATIONAL OCEANIC AND ATMOSPHERIC
ADMINISTRATION, 2002; PEIXOTO et al., 2011; SANTOS et al., 2011).
A diversidade microbiana naturalmente presente nos manguezais é responsável pela sua
conservação e produtividade. Cerca de 90% da biomassa microbiana desse ecossistema é
composta de bactérias, archaeas e fungos. Nos sedimentos de manguezais, os diferentes
componentes do petróleo são degradados por microrganismos específicos, os quais podem atuar
como indicadores ambientais. Microrganismos aeróbicos estão distribuídos na superfície dos
sedimentos de manguezais e apresentam as vias metabólicas necessárias para a transformação do
carbono orgânico em CO2 (ALONGI, 2002; BRITO et al., 2006; PEIXOTO et al., 2011;
SANTOS et al., 2011).
Técnicas dependentes e independentes de cultura vêm sendo desenvolvidas com a
finalidade de catalogar a variedade e o funcionamento das comunidades microbianas. No entanto
27
o estudo das propriedades funcionais dos microrganismos pertencentes a uma população é
avaliada apenas com a obtenção de uma cultura pura (VAN HAMME et al., 2003; AFUWALE;
MODI, 2012).
Nos manguezais pertencentes aos municípios de São Francisco do Conde, Madre de Deus
e Candeias, situados ao Norte da Baía de Todos os Santos (BTS), Bahia, Brasil, são realizadas
atividades da indústria petrolífera desde a década de 50, sendo estes ramos responsáveis por um
dos maiores focos de poluição da BTS (MOREIRA, 2011).
Nesse sentido o principal objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento de
variáveis físico-químicas e dos teores da matéria orgânica na distribuição de microrganismos
isolados (bactérias, leveduras e fungos filamentosos) de sedimentos de ecossistemas costeiros
impactados e não impactados por atividades da indústria petrolífera.
3.2 MATERIAIS E MÉTODOS
São destacadas as metodologias empregadas nas etapas de campo e laboratoriais.
3.2.1 Areas de Estudo
O município de Belmonte (BE), localizado no extremo Sul da Bahia, surgiu no final do
século XIX em uma planície entre o rio Jequitinhonha e o oceano Atlântico (Belmonte News,
2012). Como vegetação de mangue, espécimes de Rizophora mangle, Avicennia spp e
Laguncularia racemosa estão presentes ao longo da região litorânea bem como nos estuários dos
rios (CENTRO DE RECURSOS AMBIENTAIS, 1996).
Até os dias atuais não existem relatos de atividades relacionadas com a indústria
petrolífera, no município de Belmonte, sendo este o fator decisivo para sua indicação como área
referência. As demais áreas de estudo são municípios localizados ao Norte da Baía de Todos os
Santos – BTS, Bahia, onde abrigam diferentes setores da cadeia produtiva do petróleo, como:
campo de produção de petróleo (campo de Dom João em São Francisco do Conde), terminal
portuário (Terminal Almirante Alves Câmara – TEMADRE, em Madre de Deus) e refinaria
(RLAM, situado próximo ao município de Candeias).
28
3.2.2 Atividades de Campo
Quatro amostras compuseram a área referência em período chuvoso. Duas consistiram de
sedimento de fundo do rio Jequitinhonha (RJ), coletada em profundidade aproximada de 5 m e
duas de sedimento superficial de manguezal (BE), entre 0,0 a 5,0 cm, em região de inter-maré
(figura 3A) (CELINO; QUEIROZ, 2006).
Na BTS, foram realizadas quatro amostragens em cada uma das três estações de estudo
(São Francisco do Conde (DJ), Madre de Deus (MD) e Candeias (CN)) totalizando doze pontos
de amostra também em período chuvoso (figura 3B).
Figura 3 – Localização: (A) - município de Belmonte (BE) e (B) - pontos de coleta da BTS, Bahia, Brasil. Onde:
(DJ) Campo de Dom João, no município de São Francisco do Conde, (MD) – Madre de Deus e (CN) – Candeias.
Os pontos de coleta foram selecionados mediante busca visual de indícios que inferiam a
existência de uma possível contaminação do manguezal, como por exemplo, manchas de óleo e
poços de exploração de petróleo desativados. A localização dos pontos foi determinada mediante
um GPS (Sistema de Posicionamento Global).
Com o auxílio de uma sonda multiparâmetros, HORIBA anteriormente calibrada e de um
salinômetro ATAGO, os parâmetros pH, Eh, temperatura, condutividade e salinidade foram
mensurados in situ, diretamente na água do rio Jequitinhonha e em corpos hídricos próximos aos
pontos de coleta nas demais estações de estudo.
29
Para a execução dos procedimentos de isolamento foram coletados cerca de 50 g de
sedimento, em frascos de vidro devidamente lavados e esterilizados. Para as análises dos teores
de matéria orgânica (m.o) e granulometria cerca de 50 g de amostra foram coletadas nos mesmos
pontos anteriores. Todas as amostras foram acondicionadas em caixa de isopor contendo gelo até
a chegada ao laboratório.
3.2.3 Análise de Sedimento
Anteriormente à execução das análises geoquímicas as amostras foram liofilizadas sob
alto vácuo e temperatura de - 45ºC em liofilizador LABCONGO. Posteriormente foram
maceradas, desagregadas, peneiradas em malha de 2 mm e armazenadas em temperatura de 4 ºC
para as análises de matéria orgânica (m.o) e granulometria (LIMA, 2010).
3.2.3.1 Matéria Orgânica (M.O)
A determinação da m.o foi baseada no princípio da oxidação do Carbono Orgânico Total
(COT). Por meio da metodologia de Walkley e Black (1934) tomou-se 0,5 g da amostra
liofilizada em um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Foram adicionados 10 mL de dicromato de
potássio a 1N e 20 mL da solução de ácido sulfúrico-sulfato de prata. A amostra permaneceu sob
agitação orbital durante 1 minuto, com posterior repouso por 30 minutos. Após o repouso foram
adicionados 0,2 g de fluoreto de sódio, 10 mL de ácido fosfórico concentrado, 200 mL de água e
0,5 mL do indicador difenilamina.
A amostra foi titulada com sulfato ferroso amoniacal a 0,5 N para a determinação de uma
coloração de verde brilhante a verde opaco antes do ponto final. Para a amostra RJ, devido ao
caráter arenoso, foram utilizados os mesmos reagentes, porém, com a metade dos volumes. Para
a comprovação da precisão do método foram feitas triplicatas para 20% das amostras, obtendo-se
uma média entre os valores que foram apresentados em % de carbono orgânico por peso seco.
Controles brancos foram executados para todas as amostras a fim de garantir a qualidade das
análises.
Para o cálculo do teor de m.o tomou-se o valor de C.O x 1,724. Tal fator é utilizado por
se admitir que o carbono constitua cerca de 60% da matéria orgânica do solo, sendo, portanto,
considerado termos de mesmo significado (BENTO, 2005).
30
3.2.3.2 Granulometria
A avaliação dos teores granulométricos (areia, silte e argila) foi realizada por meio de um
analisador de partículas com difração a laser, modelo Silas 1064. Primeiramente realizou-se um
pré-tratamento da amostra com peróxido de hidrogênio a fim de degradar a matéria orgânica nela
presente. Foi então adicionado hexametafosfato de sódio, permanecendo sob agitação durante 24
horas. Para o tratamento dos dados e obtenção do percentual existente para cada fração
granulométrica fez-se uso do programa GRADSTAT.
3.2.4 Enriquecimento e Isolamento
Todas as amostras foram pesadas três vezes (10g). Cada subamostra foi enriquecida para
o isolamento de bactérias, leveduras e fungos filamentosos com 1 % de petróleo, óleo diesel e
gasolina como fonte de carbono (SOUZA et al., 2005). Uma localidade da BTS (CN) e duas das
subamostras de Belmonte foram selecionadas para atuar como controle, sem adição de fontes de
carbono.
Cada subamostra foi enriquecida em frascos tipo Erlenmeyers de 250 mL, contendo 99
mL do meio mineral Buschnell Haas (BH), marca Difco, (composto de 1g de KH2PO4, 1 g de
NH4NO3, 0,20 g de MgSO4.7H2O, 0,05 g de FeCl3, 0,02 g de CaCl2.H2O, para 1 L de H2O, para
estado sólido acrescenta-se 20,0g de Agar agar, sob pH 7,0 ± 0,2) e 1 % de petróleo, óleo diesel
ou gasolina como única fonte de carbono. Não houve adição de fontes de carbono nos controles
(SOUZA et al., 2005).
A fim de garantir a oxigenação das amostras os frascos foram incubados em shaker
rotativo, marca TECNAL, a 180 RPM ± 2 e temperatura de 28 ºC ± 2 durante 21 dias.
(CHAERUN et al., 2004; SOUZA et al., 2005; WETLER, 2006).
Após o período de enriquecimento, os frascos foram homogeneizados e uma alíquota da
amostra (alçada abundante) foi semeada, em duplicata, na superfície da placa de ágar BH para a
realização dos isolamentos. A cada 7 dias do período de enriquecimento, coletou-se uma alíquota
das amostras enriquecidas para efetuação dos isolamentos. Com exceção dos controles, foi
adicionado por cima das amostras semeadas 1 % de um dos petroderivados anteriormente
utilizados. Devido a sua volatilidade a gasolina foi adicionada da tampa da placa (SOUZA et al.,
2005). Para o crescimento dos microrganismos as placas semeadas foram incubadas a 30ºC
durante 4 dias.
31
Tomando por base as características morfológicas de crescimento, os microrganismos
semelhantes às bactérias foram transferidos para placas de Petri com TSA – Tryptic Soy Ágar e
os semelhantes às leveduras e aos fungos filamentosos foram transferidos para placas de Ágar
Sabouraund. Ambos os meios de cultivo da marca Himedia, foram utilizados em repiques
consecutivos até a obtenção do isolado propriamente dito e posteriormente para a manutenção
destes a cada 30 dias. As placas foram incubadas por 48 horas, sendo as de TSA a 35ºC e as de
Ágar Sabouraund a 30ºC. (SOUZA et al., 2005). Após o término de todos os isolamentos as
cepas foram reativadas em tubos de ensaio com caldo Mueller Hinton, sendo posteriormente
armazenadas em tubos de reação de 2,0 mL, em duplicata, contendo 10% de glicerol estéril e
mantido em temperatura de – 85ºC.
3.2.5 Tratamento Estatístico
A normalidade das variáveis (pH, Eh, temperatura, condutividade, salinidade,
granulometria e dos teores de matéria orgânica) apresentados para as áreas de estudo foi
analisada por meio o teste estatístico de Kolmogorov e Smirnov (KS). A significância desses foi
verificada pelo teste one-way ANOVA e Mann Whitney já a homogeneidade pelo teste de
Barllet. Tais testes foram realizados com o auxílio do software GraphPad Instat.
A matriz de correlação de Pearson de todas as variáveis e a Análise dos Componentes
Principais (ACP) das variáveis e das estações investigadas foi realizada por meio do software
Statistica versão 7.0 da Stratsoft Inc.
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na BTS não foram localizadas manchas ou poças de óleo na superfície dos sedimentos,
sendo observada apenas a presença de matéria orgânica produzida pelo próprio manguezal.
Nas três áreas de estudo da BTS foram relatadas espécimes de vegetação de mangue
pertencente aos gêneros Laguncularia, Rizophora e Avicennia. O gênero Laguncularia foi
predominante nas áreas de refino e transporte, apresentando-se escassa, com tamanho reduzido e
com as folhas amareladas na área de transporte. Segundo Veiga (2003) a proximidade de áreas
industriais do setor petrolífero provoca a diminuição da vegetação de mangue na BTS, sendo
observadas alterações morfológicas nas folhagens das plantas devido à exposição ao óleo.
32
Os parâmetros físico-químicos e o percentual de matéria orgânica de cada área de estudo
com os respectivos números de microrganismos isolados estão representados na tabela 1.
A temperatura média entre todos os pontos amostrados foi 26,6 ºC (tabela 1). A atividade
dos microrganismos bem como a taxa de degradação dos compostos orgânicos são
Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos (pH, Eh, temperatura, condutividade, salinidade), areia grossa, areia média,
areia fina, areia muito fina, silte, argila e matéria orgânica das diferentes áreas de estudo (RJ – rio Jequitinhonha, BE
– Belmonte, DJ – Dom João, MD – Madre de Deus e CN – Candeias) e o número total de bactérias, leveduras e
fungos filamentosos isolados.
Parâmetros
pH
Eh (mV)
Temp (ºC)
Cond. (m/S)
Sal.
M.O (%)
Areia Grossa
Areia Média
Areia Fina
Areia M.Fina
Silte
Argila
Isolados
B
L
F
Total
Controle
BE
6,84
-19
30,4
1,08
15,0
4,54
1,26
0,0
0,0
26,38
70,90
1,45
RJ
BE
DJ1
DJ2
MD3
MD4
CN5
CN6
RJ
6,30
325
27,0
0,01
0,0
8,39
7,37
70,72
8,94
4,58
0,0
BTS
6,97
-19
26,2
8,55
5,0
6,51
45,81
0,0
0,0
4,35
48,75
1,19
6,30
325
27,0
0,01
0,0
8,39
7,37
70,72
8,94
4,58
0,0
6,84
- 19
30,4
1,08
15,0
4,54
1,26
0,0
0,0
26,38
70,90
1,45
6,88
-8
25,0
3,16
13,0
2,81
8,36
0,0
0,0
0,01
89,24
2,39
7,05
- 21
25,0
4,92
10,0
4,0
22,30
0,0
0,0
0,50
75,86
1,34
7,57
- 53
25,0
3,73
11,0
0,81
1,29
0,33
82,73
8,70
6,82
0,14
7,71
- 63
26,0
3,02
20,0
3,53
13,70
0,03
54,89
17,31
13,96
0,11
7,45
- 37
25,0
4,64
3,0
8,11
50,10
0,0
0,15
23,93
25,54
0,28
6,97
- 19
26,2
8,55
5,0
6,51
45,81
0,0
0,0
4,35
48,75
1,19
6
3
1
10
20
22
02
44
9
5
1
15
21
15
1
37
48
24
03
75
30
19
02
51
24
13
03
40
27
22
01
50
34
09
02
45
35
05
01
41
46
16
02
64
Legenda: B – bactérias, L – leveduras e F – fungos filamentosos.
influenciadas pela temperatura, podendo alterar a composição do petróleo e também a estrutura
da comunidade microbiana (LEAHY; COLWELL, 1990; BAPTISTA, 2003). A faixa de
temperatura situada entre 25 ºC e 30 ºC é considerada ótima para a metabolização dos
contaminantes pelos microrganismos (ANDRADE et al., 2010). Tal constatação contribui
positivamente para a realização de experimentos de biorremediação em ecossistemas da BTS
impactados por atividades petrolíferas, já que a temperatura nessa localidade condiz com a média
apresentada como ideal para a atividade dos microrganismos.
O pH em torno da neutralidade contribuiu com o número de microrganismos isolados em
todas as áreas de estudo. As localidades que apresentaram pH mais próximos do neutro
obtiveram um maior número de isolados (tabela 1). A temperatura e o pH são os fatores que mais
influenciam a atividade dos microrganismos no ambiente em que estão presentes (ANDRADE et
33
al., 2010). Valores de pH entre 6,0 e 8,0 propiciam o crescimento de um maior número de
microrganismos (LEAHY; COLWELL, 1990; ANDRADE et al., 2010). Os íons H+ afetam
diretamente a atividade dos microrganismos, atuando na permeabilidade celular, nas atividades
enzimáticas, exercendo também influencia indireta na disponibilidade de macro e
micronutrientes (JACQUES et al., 2007).
Os valores apresentados para o Eh variaram significativamente entre as áreas de estudo
(tabela 1). A região do rio Jequitinhonha (RJ) obteve o valor de Eh mais elevado e também o
menor número de microrganismos isolados, porém, por ser uma das áreas referências, com
características de sedimento de fundo de rio arenoso já era esperado um número reduzido de
isolados em relação às demais áreas de estudo.
A salinidade variou de 0,0 (RJ) a 20,0 (MD4) (tabela 1). Nos manguezais a salinidade
pode variar de 0,5 a 30,0, sendo considerado um dos parâmetros mais importantes para a
determinação da extensão da biodegradação de compostos orgânicos. Elevados teores osmóticos
alteram a solubilidade ou sorção dos contaminantes pelos microrganismos inibindo as taxas de
degradação (WETLER, 2006; QIN et al., 2012). São desconhecidos estudos sobre a
biodegradação de compostos tóxicos em ambientes hipersalinos (CRAPEZ et al., 2002). A
quantidade de sais dissolvidos é indicada pela condutividade elétrica e possui influência direta
nas funções dos microrganismos presentes no meio (ARIAS et al., 2005). Tal parâmetro
contribuiu principalmente para os resultados obtidos da estação CN6 (tabela 1).
A porcentagem de matéria orgânica variou de 0,81 (MD3) a 8,11(CN5), estando os
maiores teores relacionados com o maior número de isolados. A região de produção (DJ1 e DJ2)
apresentou equivalência com o resultado apresentado por Hadlich et al. (2007) (tabela 1). O teor
de matéria orgânica, indicado pela quantidade de carbono orgânico total do meio é uma variável
de grande importância no processo de biorremediação (ANDRADE et al., 2010), já que serve de
fonte de carbono aos microrganismos. O manguezal é um ecossistema que naturalmente
apresenta um elevado teor de matéria orgânica. Uma amostra utilizada como background por
Lima (2010) apresentou um elevado teor de matéria orgânica, devido ao sedimento do
manguezal já apresentar-se ligeiramente contaminado. Bento (2005) concluiu em seus
experimentos que amostras de solo contaminadas com diesel apresentaram uma maior
concentração de matéria orgânica quando comparado ao solo não contaminado.
Em relação à distribuição do padrão granulométrico, a região do rio Jequitinhonha foi
principalmente caracterizada pela presença de areia fina e Belmonte de silte (tabela 1). Entre as
estações de estudo da BTS, DJ1 e DJ2 são principalmente representados pelo silte, MD3 e MD4
pela areia fina e CN5 e CN6 pela areia grossa e silte respectivamente (tabela 1). Em derrames de
34
petróleo os contaminantes aderem-se principalmente nas partículas sedimentares finas. O acesso
dos microrganismos aos contaminantes, etapa inicial do processo de biodegradação, é
significativamente influenciado pelos mecanismos de transportes e pela interação sedimentocontaminante. (ATLAS, 1995; LIMA, 2010).
Como já era esperado, obteve-se um elevado número de microrganismos isolados com
diferentes padrões morfológicos. A variedade de isolados obtidos nas diferentes áreas de estudo
indica a abundância e versatilidade de microrganismos presentes em localidades com constantes
entradas de hidrocarbonetos (AFUWALE; MODI, 2012). A área de estudo que obteve o maior
número de isolados foi a BTS (65%) que também possuiu o maior número de amostras, seguido
de BE (25%) e RJ (10%) (figura 4A).
Figura 4 – Microrganismos isolados por área de estudo (A) – percentual e (B) – número total de isolados, onde:
(BTS) – Baía de Todos os Santos, (BE) – Belmonte e (RJ) – Rio Jequitinhonha.
(A)
(B)
Em relação aos controles, BE apresentou o maior número de microrganismos. Sugere-se
que tal diversidade seja uma condição natural dessa região, tendo sido posteriormente
confirmado pela análise multivariada dos parâmetros físico-químicos e dos teores
granulométricos.
Em relação ao total de microrganismos por área de estudo, no rio Jequitinhonha (RJ)
obteve-se um total de 47 microrganismos isolados, sendo 58% bactérias, 38% leveduras e 4%
fungos filamentosos (figura 4B).
A amostra BE proporcionalmente prevaleceu com o maior número de microrganismos
isolados (119) com 57% de bactérias, 39% de leveduras e 4% de fungos filamentosos (figura
35
4B). Tal resultado não condiz com o informado na literatura onde locais contaminados com
hidrocarbonetos de petróleo o número de cepas microbianas isoladas é maior do que em áreas
sem fontes de contaminação (ATLAS, 1995; WILD; JONES, 1996; LEAHY; COLWELL,
1990), porém os parâmetros físico-químicos em conjunto contribuíram positivamente com o
elevado número de microrganismos. Mesmo tendo sido detectado maiores quantificações no
manguezal de Belmonte esses não apresentaram potencial para a degradação de hidrocarbonetos
de petróleo pelo fato de não estarem adaptados à constante presença desse composto (dados não
publicados).
Na BTS foram isolados 306 microrganismos, destes 67% foram bactérias, 24% leveduras
e 4% fungos filamentosos (figura 4B). Em trabalhos realizados em diferentes regiões do Brasil e
do mundo nota-se um maior número de bactérias isoladas em relação às leveduras e aos fungos
filamentosos quando expostos às diversas fontes de carbono (CHAINEAU et al, 1999; ELMORSY, 2005; SOUZA et al., 2005; BATISTA et al., 2006).
Em sedimentos de manguezais da BTS o grupo de microrganismos predominantes foi de
bactérias, seguido das arqueobactérias e dos fungos filamentosos, independente do tipo de
poluente e das condições físico-químicas do meio (MELO, 2006, dados não publicados).
Com o uso das fontes de carbono todas as áreas apresentaram um maior número de
bactérias com adição do petróleo (figura 5). Isolamentos de microrganismos com o uso de
hidrocarbonetos como única fonte de carbono revelaram que os isolados apresentaram
preferências distintas quanto ao substrato utilizado (VAN-HAMME et al., 2003; WETLERTONINI, 2011). A diversidade de elementos que constituem o petróleo bruto ou refinado
influencia na degradação do óleo como um todo, bem como as de suas frações (LEAHY;
COLWELL, 1990).
O óleo diesel possui massa específica e cadeias maiores do que a gasolina, sendo,
portanto, menos tóxico e menos volátil (MARIANO, 2006) o que propiciou o crescimento de um
maior número de microrganismos em relação à gasolina (figura 5).
A gasolina é uma mistura composta principalmente por hidrocarbonetos voláteis, e em
grande parte por parafinas ramificadas, cicloparafinas, além de compostos aromáticos como
benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX) que são altamente tóxicos e solúveis em água
(MARIANO, 2006; ANDRADE, 2008). Por possuir um grande número de hidrocarbonetos
voláteis a gasolina é considerada um dos derivados de petróleo mais tóxicos aos microrganismos
do solo (FERREIRA et al., 2009).
A volatilidade da gasolina também diminui a sua
concentração no meio, indicando que baixas concentrações podem não sofrer degradação pelos
36
microrganismos pelo fato de não estarem disponíveis na forma em que estes podem assimilá-los
facilmente (MARTINS et al., 2003).
Figura 5 – Total de microrganismos isolados nas diferentes áreas de estudo com o uso das fontes de carbono, onde
BP – Bactérias crescidas em petróleo; BD – Bactérias crescidas em diesel; BG – Bactérias crescidas em gasolina;
BC – Bactérias controle; LP – Leveduras crescidas em petróleo; BD – Leveduras crescidas em diesel; LG –
Leveduras crescidas em gasolina; LC – Leveduras controle; FP – Filamentos crescidos em petróleo; FD –
Filamentosos crescidos em diesel; FG – Filamentosos crescidos em gasolina; FC – Filamentosos controle.
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
BP
BD BG
BC
LP
BTS
LD
BE
LG
LC
FP
FD FG
FC
RJ
O número de isolados por atividade da cadeia produtiva do petróleo indicou um maior
número de representantes na área de refino (CN) com 36% do total de isolados, principalmente
bactérias com o uso do petróleo como fonte de carbono (figura 6C). A área de transporte (MD)
apresentou 33% dos isolados (figura 6B) e a área de produção (DJ) 30% (figura 6A). A constante
presença do petróleo e seus derivados em uma mesma localidade aumenta a biomassa dos
microrganismos que podem servir como indicadores biológicos de ambientes impactados
cronicamente por esse composto (CRAPEZ, 2002; PEIXOTO et al., 2011). Em pesquisa
realizada nas adjacências da Refinaria Gabriel Passos – REGAP, Minas Gerais, na Refinaria
Duque de Caxias – REDUC, Rio de Janeiro e na garagem de manutenção de veículos da
Universidade Federal de Viçosa (UFV) com amostras enriquecidas durante 7 dias com caldo BH
e isoladas com o uso de petróleo ou gasolina como fonte de carbono, foram isoladas 185
bactérias, 3 fungos filamentosos e 4 leveduras (BATISTA et al., 2006). Visando isolar
microrganismos provenientes de áreas contaminadas por petroderivados próximos à lagoa da
Barra em Suape – Pernambuco, Souza e colaboradores (2005) utilizaram óleo diesel, gasolina,
bunker e querosene como fonte de carbono. Do total de 86 microrganismos isolados 46%
corresponderam às bactérias, 23% às leveduras e 23% aos fungos filamentosos.
37
Figura 6 – Número de microrganismos isolados por atividades do setor petrolífero. (A) – Produção, (B) – transporte
e (C) - refino.
Legenda: B – bactéria, L – levedura, F – fungo filamentoso
As análises estatísticas de KS revelaram que com exceção dos valores apresentados pelo
potencial de oxi-redução (Eh) e pelos teores de argila, todos os demais obtiveram distribuição
normal. O teste one-way ANOVA revelou que os dados normais foram considerados
extremamente significativos com o valor de p> 0,0001, já pelo teste de Barllet verificou-se a
heterogeneidade dos mesmos, ou seja, que as variáveis são independentes entre si. Devido ao
fato de os valores apresentados pelo Eh e pelos teores de argila não terem sido considerados
38
normais, o teste executado para a verificação da significância foi o de Mann-Whitney, tendo
revelado uma considerável significância para esses com o valor de p = 0,0104.
Anteriormente à execução da matriz de correlação e das ACPs, os dados com distribuição
não normal foram normalizados. Foram construídas duas matrizes de correlação de Pearson. A
primeira (tabela 2) relacionada com os parâmetros físico-químicos (pH, Eh, temperatura,
condutividade, salinidade) os teores de matéria orgânica (m.o) e os padrões granulométricos
(areia grossa, areia média, areia fina, areia muito fina, silte e argila) das três áreas de estudo: rio
Jequitinhonha, manguezal de Belmonte e manguezais da Baía de Todos os Santos. Já a segunda
matriz de correlação (tabela 3) relacionou as mesmas variáveis anteriormente citadas, porém,
apenas para as regiões contempladas para a Baía de Todos os Santos (Dom João, Madre de Deus
e Candeias).
Tabela 2 – Matriz de correlação de Pearson dos parâmetros físico-químicos, padrões granulométricos e do número
de microrganismos isolados no rio Jequitinhonha, manguezal de Belmonte e manguezais da Baía de Todos os Santos
(Dom João, Madre de Deus e Candeias). Onde: M.O – matéria orgânica; A.G – areia grossa; A.M – areia média; A.F
– areia fina; A.M.F – areia muito fina; S – silte; A – argila; B – bactéria; L – levedura; F – fungos filamentosos.
pH
Eh
Temp.
Cond.
Sal.
M.O
A.G
A.M
A.F
A.M.F
S
A
pH
Eh
1,00
-0,81
-0,40
0,42
0,55
-0,75
0,23
-0,73
-0,06
0,18
-0,06
-0,10
1,00
0,12
-0,56
-0,68
0,99
-0,25
0,99
0,55
-0,17
-0,49
-0,45
Temp.
Cond.
Sal.
M.O
A.G
A.M
A.F
A.M.F
S
A
1,00
-0,48
0,25
0,09
-0,44
0,08
-0,17
0,67
0,24
0,18
1,00
-0,09
-0,56
0,81
-0,58
-0,47
-0,42
0,22
0,26
1,00
-0,68
-0,43
-0,65
-0,19
0,31
0,43
0,38
1,00
-0,23
1,00
0,60
-0,13
-0,57
-0,54
1,00
-0,28
-0,46
-0,19
0,00
-0,01
1,00
0,65
-0,14
-0,59
-0,55
1,00
-0,10
-0,85
-0,79
1,00
-0,07
-0,19
1,00
0,97
1,00
A matriz de correlação das três áreas de estudo (tabela 2) revelou que o Eh juntamente
com os teores de m.o e a fração média de areia foram as variáveis mais intimamente
correlacionadas (0,99), seguido do silte e argila com 0,97 de correlação.
Diferentemente da primeira matriz, a realizada apenas para os setores da BTS as variáveis
mais correlacionadas foram os teores de m.o juntamente com a fração grossa da areia (0,98)
seguido do silte e da argila (0,96). Em ambas as matrizes de correlação o pH e o Eh foram as
variáveis menos correlacionadas.
39
Tabela 3 – Matriz de correlação de Pearson dos parâmetros físico-químicos, padrões granulométricos e do número
de microrganismos isolados dos sedimentos de manguezais da Baía de Todos os Santos (Dom João, Madre de Deus
e Candeias). Onde: M.O – matéria orgânica; A.G – areia grossa; A.M – areia média; A.F – areia fina; A.M.F – areia
muito fina; S – silte; A – argila; B – bactéria; L – levedura; F – fungos filamentosos.
pH
Eh
Temp.
Cond.
Sal.
M.O
A.G
A.M
A.F
A.M.F
S
A
pH
Eh
1,00
-0,98
-0,11
-0,55
0,43
-0,25
-0,30
0,51
0,78
0,78
-0,88
-0,90
1,00
-0,02
0,47
-0,49
0,31
0,34
-0,54
-0,84
-0,69
0,90
0,91
Temp.
Cond.
Sal.
M.O
A.G
A.M
A.F
A.M.F
S
1,00
0,66
-0,03
0,37
0,44
-0,32
-0,10
-0,03
-0,17
-0,09
1,00
-0,70
0,62
0,76
-0,32
-0,50
-0,28
0,14
0,17
1,00
-0,71
-0,79
0,18
0,57
-0,01
-0,11
-0,09
1,00
0,98
-0,68
-0,71
0,35
0,06
-0,02
1,00
-0,59
-0,67
0,25
0,03
-0,03
1,00
0,86
0,05
-0,58
-0,47
1,00
0,27
-0,74
-0,66
1,00
-0,74
-0,78
1,00
0,96
A
1,00
A ACP das variáveis e de todas as estações de estudo originou a formação de três
agrupamentos distintos, confirmando as correlações observadas por meio das matrizes de
Pearson. A associação de 2 fatores foi responsável por 65,28% de variância (figura 7A). Os
teores de m.o juntamente com o Eh foram os parâmetros que mais influenciaram a distribuição
obtida para o rio Jequitinhonha. Segundo dados anteriormente mencionados nessa região os
teores de m.o foram inferiores aos limites de detecção. A característica granulométrica arenosa
dificulta a adsorção da m.o. e consequentemente diminui a quantidade de carbono necessária
para a sobrevivência dos microrganismos. Tal constatação associado ao elevado Eh determinou o
menor número de microrganismos para essa região.
O agrupamento da região de BE foi principalmente influenciado pela temperatura,
salinidade, silte e areia muito fina (figura 7A). A temperatura de 30,4ºC juntamente com o
padrão granulométrico fino, proporcionaram um maior número de microrganismos, os quais
possivelmente podem estar adaptados a teores osmóticos um pouco mais elevados. As condições
ambientais apresentadas em BE proporcionam um elevado número de microrganismos
naturalmente presentes nessa região. Na BTS as variáveis de destaque foram condutividade, a
areia grossa e o pH próximo da neutralidade, representado pela região de refino (CN), a qual
obteve um maior número de isolados dentre as regiões da BTS (figura 7A).
40
Figura 7 – Análise dos Componentes Principais (ACP) das variáveis e das estações de estudo (A) – Todas as
estações de estudo; (B) – BTS. Onde: A.G – areia grossa, A.M – areia média, A.F – areia fina, A.M.F – areia muito
fina, S – silte, A – argila, B – bactéria, L – levedura, F – fungo filamentoso
(A)
(B)
A fim de obter a explicação dos dados apenas para a BTS, já que dentre as regiões de
estudo é mais influenciada pela indústria petrolífera, foi realizado um ACP das variáveis e dos
casos separadamente (figura 7B). Comparado à análise anterior 70,36% de variância foi obtida
por meio de dois fatores. Os agrupamentos para essa região foram correspondentes a cada setor
da cadeia produtiva de petróleo. Na área de produção (DJ1 e DJ2) as variáveis de maior
importância foram o Eh o os teores granulométricos mais finos (argila e silte) (figura 7B). Na
41
região de transporte (MD3 e MD4) as variáveis de maior significado foram o pH (7,57 e 7,71)
juntamente com a fração de areia fina e areia muito fina (figura 7B). Diferentemente do ACP
anterior na área de refino (CN5 e CN6) os teores de matéria orgânica juntamente com a fração
mais grossa da areia, foram os parâmetros mais relevantes (figura 7B). O fato da coleta na região
de refino ter sido realizada nas proximidades do estuário do rio São Paulo com a maré alta e em
período chuvoso culminou com a coleta de material grosseiro e a presença de um maior número
de sais dissolvidos determinado pela condutividade.
3.4 CONCLUSÃO
As áreas contempladas no presente estudo apresentam características físico-químicas e
teores de matéria orgânica diversificados. A avaliação isolada de cada variável não é suficiente
para a compreensão do número de microrganismos isolados por área de estudo sendo necessária
uma análise integrada entre todos os dados. O rio Jequitinhonha, com 47 microrganismos
isolados, foi principalmente influenciado pelos teores de matéria orgânica e pelo Eh. BE
proporcionalmente apresentou um maior número de isolados (119), sendo o silte e a salinidade as
variáveis de maior significância. Na BTS a região de refino foi predominante com 105
microrganismos, influenciado principalmente pela matéria orgânica e pela areia grossa. Mesmo
BE sendo uma das áreas referência nota-se que os microrganismos são capazes de se adaptarem
às fontes de carbono, crescendo em seu substrato.
Em relação às fontes de carbono o petróleo foi o que proporcionou o crescimento de um
maior número de microrganismos, principalmente bactérias. Tal fato pode ser explicado pela
variedade de arranjos existentes entre seus hidrocarbonetos, aos padrões de toxicidade quando
comparado ao óleo diesel e à gasolina, em função do elevado teor de compostos aromáticos, e
pelas bactérias normalmente corresponderem à massa microbiana mais abundante nos
ecossistemas de manguezais.
Concluiu-se que a quantidade e diversidade de microrganismos isolados foram
determinadas principalmente pelas características das áreas de estudo e pelo uso das diferentes
fontes de carbono culminando em padrões distintos.
Para estudos subsequentes sugere-se a avaliação dos teores nutricionais (nitrogênio e
fósforo) das diferentes áreas de estudo a fim de verificar se esses apresentam relações com a
quantidade de microrganismos, principalmente nos controles.
42
3.5 AGRADECIMENTOS
À PROAMB pelo auxílio financeiro para a aquisição dos materiais necessários e à
FAPESB (termo de outorga nº BOL0469/2011) pela concessão da bolsa de mestrado.
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46
4 DEGRADAÇÃO DE ALCANOS NORMAIS DE CADEIA LONGA (C18C32) POR CONSÓRCIOS BACTERIANOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS
DE MANGUEZAIS DA BAÍA DE TODOS OS SANTOS, BAHIA, BRASIL
RESUMO
Por meio de consórcios formados por bactérias isoladas e selecionadas de sedimentos de
manguezais da Baía de Todos os Santos, Bahia, Brasil, avaliou-se a degradação de
hidrocarbonetos de petróleo de cadeia longa (C18-C32) em ensaios laboratoriais submetidos a
cinco diferentes períodos de tempo (t0 – 2 horas, t1 – 24 horas, t2 – 7 dias, t3 – 15 dias e t4 – 30
dias). Foram utilizados como microcosmos frascos tipo Erlenmeyers de 125 mL com 50 mL de
meio mineral Buschnell Haas, 2 mL da suspensão bacteriana padronizada para cada cepa
formadora do consórcio e 1% de petróleo como única fonte de carbono e energia. A
cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG/EM) revelou reduções na
abundância molecular dos n-alcanos em comparação aos controles. Ambos os consórcios
contribuíram com a redução dos compostos a depender do período de experimento. A partir do t2
o consórcio A foi capaz de degradar 100% dos compostos acima do C28. O consórcio B
contribuiu com níveis de degradação superiores a 81% para os compostos acima do C20 após 7 e
15 dias de experimento. O consórcio B degradou principalmente compostos entre C18 a C22. O
consórcio A obteve preferência na degradação dos n-alcanos a partir do C23. , no t0, t1 e t4 tendo
sido considerado o mais promissor para a degradação dos n-alcanos de cadeia longa.
Palavras chaves: Consórcios, biorremediação, n-alcanos, hopano, cadeia longa.
ABSTRACT
Through consortia formed by bacteria isolated and selected of mangrove sediments of
Todos os Santos Bay (TSB), Bahia, Brazil, evaluated the degradation of petroleum hydrocarbons
of long chain (C18-C32) in laboratory trials submitted to five different periods of time (t0 - 2
hours, t1 - 24 hours, t2 - 7 days, t3 - t4 and 15 days - 30 days). Were used 125 mL Erlenmeyer
flasks as microcosms with 50 mL of mineral medium Buschnell Haas, 2 mL of the standardized
bacterial suspension for each strain of the the consortium and 1% of oil as the sole source of
carbon and energy. The gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC / MS) revealed
reductions in the molecular abundance of n-alkanes compared to controls. Both consortia have
contributed to the reduction of compounds depending on the experiment period. From t2 the
consortium A was capable of degrading 100% of the compounds above C 28. The consortium B
contributed with degradation levels exceeding 81% for compounds above C20 after 7 and 15 days
of experiment. The consortium B degraded mainly compounds between C18 to C22. The
consortium A degrades preferably n-alkanes from C23. At t0, t1 and t4 are considered the most
promising for the degradation of n-alkanes long chain.
Keywords: Consortia, bioremediation, n-alkanes, hopane, long chain.
47
4.1 INTRODUÇÃO
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos formada por processos
biogeoquímicos. É constituído por pequenas quantidades de compostos sulfurados, oxigenados,
nitrogenados e organometálicos, como o níquel e o vanádio (PEDROZO et al., 2002). Os
hidrocarbonetos saturados, também denominados alcanos, constituem o grupo predominante do
petróleo. São compostos com baixa solubilidade em água dispostos em arranjos lineares (nalcanos ou alcanos normais), ramificados (isoalcanos) ou cíclicos (cicloalcanos) (PEDROZO et
al., 2002; ZÍLIO; PINTO, 2002; VEIGA, 2003; THOMAS, 2004; WENTZEL et al., 2007;
ALKHATIB et al., 2011).
O derramamento de petróleo em ambientes marinhos proporciona consideráveis fontes de
alcanos aos organismos (HEAD, 2006). Pesquisas envolvendo a degradação de alcanos pela ação
microbiana tiveram início em 1913 (VAN BEILEN; FUNHOFF, 2007). Após esse período
aplicações biotecnológicas tem sido realizadas por meio da biodegradação de alcanos no
tratamento de ambientes contaminados (LI et al., 2008).
Os hidrocarbonetos de petróleo podem ser degradados por várias espécies de
microrganismos, identificados como atuantes na metabolização desde o C1 (metano) até
compostos pesados com mais de 40 átomos de carbono (ZIOLLI, 2002).
Microrganismos vêm sendo constantemente relatados como capazes de degradar nalcanos de cadeia longa, inclusive os maiores do que C18, que são sólidos em temperatura
ambiente (WENTZEL et al., 2007). Alcanos normais entre C10-C24 são mais facilmente
degradados pelos microrganismos enquanto que os menores do que C10 são considerados tóxicos
(PETERS et al., 2005).
O presente estudo objetivou avaliar em escala laboratorial a degradação de n- alcanos de
cadeia longa (C18 – C32) por meio de consórcios bacterianos provenientes de sedimentos de
manguezais situados ao norte da Baía de Todos os Santos – BTS, Bahia, Brasil, após 2 horas, 24
horas, 7 dias, 15 dias e 30 dias de experimento.
48
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Estão destacadas as metodologias empregadas nas etapas de campo e laboratoriais.
4.2.1 A área de estudo
Diretamente influenciada por atividades da indústria petrolífera desde o ano de 1950,
ecossistemas da BTS são alvos de impactos ambientais relacionados aos constantes derrames de
petroderivados (VEIGA, 2003; MOREIRA, 2011).
As regiões de destaque tratam-se de localidades ao norte da BTS onde são praticadas
atividades de produção de petróleo - DJ (campo de Dom João no município de São Francisco do
Conde), transporte de petróleo e seus derivados – MD (terminal portuário TEMADRE em Madre
de Deus) e refino - CN (Refinaria Landulpho Alves Mataripe – RLAM, próximo à Candeias)
(figura 8).
Figura 8 – Localização da Baía de Todos os Santos com as três regiões de estudo: (DJ) campo de Dom João em São
Francisco do Conde, (MD) Madre de Deus e (CN) Candeias
49
4.2.2 Amostragem
Com o uso de frascos de vidro estéreis coletou-se cerca de 50 g de sedimento superficial
de manguezal (0,0 a 5,0 cm) em região de inter-maré em 02 pontos de cada um dos três
manguezais da BTS. As amostras foram armazenadas em caixa de isopor contendo gelo até a
execução dos ensaios laboratoriais. A escolha dos pontos de amostragem baseou-se em busca
visual de indícios que poderiam indicar possíveis contaminações por hidrocarbonetos, como por
exemplo, manchas de óleo, proximidade de dutos de transporte e maquinários utilizados para
exploração de petróleo ou poços de exploração desativados.
4.2.3 Meios de cultura, solventes e padrões
Dentre os meios de cultura utilizados o meio mineral Buschnell Haas (BH) foi adquirido
pela Difco laboratories. O TSA (Tryptic Soy Agar) e o caldo Mueller Hinton pertenceram à
marca Himedia. O Ágar agar utilizado para a solidificação do meio BH foi adquirido pela Merck
chemicals.
Os solventes diclorometano e n-hexano pertenceram à marca Merck com grau P.A ACS
ISO, enquanto que o metanol, marca J.TBaker, apresentou grau P.A ACS.
4.2.4 Isolamento dos microrganismos
O petróleo utilizado durante todas as etapas laboratoriais foi cedido pela refinaria
Landunpho Alves Mataripe - RLAM. Trata-se de um óleo parafínico, proveniente da Bacia do
Recôncavo. Segundo informações da RLAM o grau API a 16ºC varia de 28,0 (óleo mediano) a
36,0 (óleo leve) (TISSOT; WELTE, 1978; BARRAGAN, 2012).
As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Estudos em Meio
Ambiente – LEMA, da Universidade Católica do Salvador (UCSAL). Para tal pesou-se 10 g das
amostras de sedimento fresco para o enriquecimento e isolamento dos microrganismos. Este
procedimento foi realizado em frascos tipo Erlenmeryes de 250 mL contendo 99 mL do meio
mineral Buschnell Haas (BH), composição descrita em Fioravanti e colaboradores (2012)
(apêndice 4) e 1% de petróleo como única fonte de carbono (SOUZA et al., 2005). Em sua
composição o meio BH possui os principais nutrientes necessários para o crescimento de
microrganismos degradadores de hidrocarbonetos, com exceção da fonte de carbono. Os frascos
50
foram acondicionados em shaker rotativo Tecnal, permanecendo em agitação (180 rpm), sem
luz, durante 21 dias à temperatura de 28ºC ± 2ºC (CHAERUN et al., 2004; SOUZA et al., 2005;
WETLER, 2006). Uma subamostra foi aleatoriamente indicada para compor o controle, sem a
adição da fonte de carbono.
Os isolamentos dos microrganismos foram executados em duplicata a cada 7 dias em
placas contendo o meio BH no estado sólido com 1% de petróleo por cima das amostras
semeadas. As placas permaneceram incubadas a 30 ºC durante 4 dias para o crescimento dos
microrganismos. Colônias esbranquiçadas, amarelas e marrons claro foram consideradas como
microrganismos, sendo transferidas para placas de TSA para a confirmação do crescimento
bacteriano (SOUZA et al., 2005). Foram realizados repiques consecutivos até a obtenção dos
isolados e posteriormente a cada 30 dias para a manutenção das colônias.
4.2.5 Ensaios de Seleção
Foram realizados dois ensaios de seleção. O primeiro em placas multipoços de 2,0 mL e o
segundo adaptado para frascos tipo Erlenmeyers de 125 mL com as cepas selecionadas no
primeiro ensaio.
4.2.5.1 Seleção primária
As 127 cepas bacterianas isoladas com o uso do petróleo como fonte de carbono
(FIORAVANTI et al., 2012) foram reativadas em tubos de ensaios com 10 mL de caldo Mueller
Hinton e mantidas em incubação à 35ºC durante 48 horas para o restabelecimento do
metabolismo microbiano. Posteriormente foram inoculadas em triplicata em placas de TSA sob
as mesmas condições de incubação em caldo para a garantia de um crescimento satisfatório.
Após as reativações, as cepas foram diluídas em solução salina a 0,9 % para padronização
da suspensão bacteriana em 1,5x108 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) com ajuste da
turbidez até apresentar semelhança com tubo 0,5 da escala de MacFarland.
Apenas 118 isolados foram utilizados no primeiro ensaio de seleção por crescerem
melhor após as reativações. Os ensaios foram executados com a finalidade de verificar o
potencial das referidas bactérias em degradar hidrocarbonetos de petróleo em 24 horas, com o
uso do indicador 2,6 diclorofenolildopenol – DCPIP. Tal técnica inicialmente desenvolvida por
Hanson et al. (1993) vem sendo executada por outros autores. O indicador 2,6 - DCPIP atua
como aceptor de elétrons, indicando o potencial dos microrganismos em degradar os
51
hidrocarbonetos de petróleo. Tal ocorrência pode ser constatada por meio da alteração da
coloração do meio de cultura inicialmente azul (oxidado) para incolor (reduzido) (GOMES,
2004; SOUZA et al., 2005; MARIANO, 2006; MIRANDA et al., 2007; AFUWALE; MODI,
2012).
Anteriormente à realização dos ensaios todas as vidrarias foram lavadas e deixadas em
banho de Extran a 5% durante 24 horas. Após esse período foram enxaguadas três vezes com
água destilada e mantidas em temperatura ambiente até a sua completa secagem. Após secas as
vidrarias foram embaladas e esterilizadas em autoclave a 121 ºC durante 20 minutos.
O primeiro ensaio de seleção foi executado em duplicata em placas multipoços de 2,0
mL, contendo: 500 µL do meio BH, 50 µL da suspensão bacteriana padronizada, 20 µL de
petróleo como fonte de carbono e 10 µL do indicador 2,6 DCPIP. Foi utilizado um controle
abiótico para a comparação dos resultados (HANSON et al., 1993; SOUZA et al., 2005). As
cepas foram incubadas estaticamente durante 24 horas à 30 ºC.
4.2.5.2 Seleção secundária
O segundo ensaio de seleção foi executado apenas com as cepas promissoras do primeiro
ensaio. Utilizaram-se frascos tipo Erlenmeyers de 125 mL com 50 mL do meio BH, 2 mL da
suspensão bacteriana padronizada e 1 % do petróleo como fonte de carbono e energia. Os frascos
permaneceram sob agitação de 180 rpm em shaker rotativo, a 28 ºC ± 2 ºC, no escuro, durante 17
horas. Após esse período de adaptação dos microrganismos à fonte de carbono adicionou-se 1
mL do indicador 2,6-DCPIP, permanecendo em agitação por mais 24 horas. Neste ensaio
utilizou-se um controle biótico (sem a adição da fonte de carbono) e um controle abiótico (sem a
adição da suspensão bacteriana) para a garantia dos resultados obtidos (SOUZA et al., 2005;
GOMES, 2004).
4.2.6 Formação dos consórcios hidrocarbonoclásticos
Anteriormente à avaliação das amostras de óleo degradadas pelas quinze cepas
selecionadas no segundo ensaio, foram realizadas desidratações em pipetas de Pasteur com
sulfato de sódio anidro (figuras 23 e 24 do apêndice 2).
Após a evaporação do solvente utilizado durante o procedimento de desidratação, obtevese a massa de todas as amostra de óleo desidratadas para a padronização da concentração em
0,05 mg µL-1 de óleo de diclorometano. Em um cromatógrafo a gás acoplado a um detector de
52
ionização de chama (CG/FID) marca Varian, modelo CP- 3800, foi injetada manualmente 2 µL
da amostra de óleo desidratada e padronizada. As condições operacionais do cromatógrafo estão
representadas no quadro 4.
Para a verificação de possíveis contaminações no equipamento e para a confirmação dos
picos dos n-alcanos foram injetados diclorometano, como branco e o padrão único de n-alcanos
(C8-C40), marca Acustandard. O padrão foi preparado em concentração de 10 mg/L, a partir de
um padrão inicial de 2000 mg/L diluído com diclorometano.
Por meio da técnica de whole oil foram avaliados os perfis dos n-alcanos das amostras de
óleo através da abundância molecular dos compostos e a da presença da MCNR (Mistura
Complexa Não Resolvida). As cepas que contribuíram com os melhores índices de degradação
nas amostras de óleo foram selecionadas para a formação de dois consórcios bacterianos.
Quadro 4 – Condições gerais do cromatógrafo a gás acoplado a um ionizador de chamas (CG/FID), utilizado para a
avaliação dos perfis de n-alcanos das amostras de óleo contendo as quinze bactérias selecionadas no segundo ensaio
de seleção.
Variáveis
Rampa de temperatura
Temperatura do injetor
Temperatura do detector
Modelo e dimensões da coluna
Gás de arraste
Tempo de análise
Condições
Temperatura inicial de 40ºC/2 min. Aquecimento até
300ºC. Taxa de aquecimento de 10ºC/min durante 12
minutos.
250ºC
300ºC
DB5 (5% de fenil), 15 metros x 0,25mm x 0,25µm
Hélio com fluxo de 1mL/min
40 minutos
4.2.7 Caracterização bioquímica e morfotintorial das bactérias selecionadas
As quinze cepas selecionadas no segundo ensaio foram armazenadas em duplicata em
tubos criogênicos com meio TSA em plano inclinado e encaminhadas para o Laboratório de
Fármacos e Ensaios Antimicrobianos do Departamento de Antibióticos do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE para a caracterização bioquímica e
morfotintorial segundo metodologia de Koneman et al. (2008).
Foram observadas as características de crescimento em ágar EMB (Eosina Azul de
Metileno), ágar tioglicolato, coloração de Gram e provas bioquímicas: TSI, citrato, motilidade,
uréia, indol, citrato oxidase, sacarose, sorbitol, trealose, maltose, arabnose, catalase e produção
de H2S.
53
4.2.8 Ensaios de Degradação
As cepas bacterianas selecionadas para a formação dos consórcios foram reativadas em
placas de TSA e a suspensão foi novamente padronizada em 1,5x108 UFC. Os ensaios de
degradação foram realizados em frascos tipo Erlenmeryes de 125 mL contendo 50 mL de meio
BH, 2 mL da suspensão bacteriana (400 µL de cada cepa) e 1% de petróleo como fonte de
carbono. Um controle abiótico foi executado para a comparação dos resultados por meio da
atenuação natural.
Nos períodos t0 (2 horas), t1 (24 horas), t2 (7 dias), t3 (15 dias) e t4 (30 dias) os frascos
foram recolhidos do shaker para a medição dos parâmetros físico-químicos. O conteúdo hídrico
referente à cultura líquida foi cuidadosamente retirado com o auxílio de uma pipeta graduada
estéril e transferido para frascos Erlenmeyers de 50 mL. Os parâmetros físico-químicos foram
mensurados em triplicada. O pH e o Eh foram mensurados com um pHmetro WTW (resolução
0,01), e a condutividade e salinidade com um condutivímetro (range 199,9 µS/cm; resolução 0,1
µS/cm) da mesma marca. Os equipamentos foram devidamente calibrados a cada período
amostral.
Os frascos com as amostras de óleo concentradas foram acondicionados em caixas de
isopor com gelo e encaminhadas Laboratório de Estudos do Petróleo - LEPETRO da
Universidade Federal da Bahia - UFBA para a realização da cromatografia líquida.
4.2.9 Cromatografia líquida
Baseado em metodologia otimizada pelo LEPETRO/ UFBA, utilizou-se uma coluna de
vidro para o fracionamento das frações SAT (hidrocarbonetos saturados), ARO (hidrocarbonetos
aromáticos) e NSO (compostos heteroatômicos nitrogênio, oxigênio e enxofre) das amostras de
óleo desidratadas. Para tal pesou-se 0,02 g do extrato desidratado e evaporado. Durante o
preparo da coluna foi adicionado lã de vidro em sua base, seguido de 4g de silicagel Merck, para
cromatografia líquida, previamente ativada em forno mufla por 2 horas a 500 ºC. Foi utilizado
n-hexano para ambientação da coluna, umidificação da sílica e transferência da amostra.
As amostras correspondentes a cada fração foram coletadas em balões de fundo redondo
de 250 mL. Para a eluição da primeira fração (SAT) foram adicionados 30 mL de n-hexano. Para
a eluição da fração (ARO) utilizou-se 20 mL de n-hexano juntamente com 10 mL de DCM e
para eluição da fração NSO foram adicionados 32 mL de DCM e 8 mL de metanol. Os solventes
presentes nos balões foram evaporados e transferidos para os respectivos vials nomeados, SAT,
54
ARO e NSO. Os vials foram pesados antes e após a obtenção das massas das frações e foi
verificado o percentual de cada componente.
4.2.10 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
As amostras de óleo desidratadas foram encaminhadas para o Laboratório de Engenharia
e Exploração do Petróleo (LENEP), do Centro de Ciências e Tecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) para avaliação dos perfis dos n-alcanos
por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM).
As amostras foram analisadas em um cromatógrafo em fase gasosa Agilent 6890N,
equipado com uma coluna D-B5 MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura do filme),
acoplado a um detector seletivo de massas Agilent 5973 MSD. A programação de temperatura
utilizada foi de 60°C (2 minutos), 22°C (1 minuto) até atingir 200°C (3 minutos). Uma nova
rampa de aquecimento foi estabelecida, partindo de 200°C, com taxa de aquecimento de 3°C por
minuto, chegando a 320°C (25 minutos). A temperatura do injetor do cromatógrafo e da linha de
transferência foi de 280°C. Utilizou-se o método de monitoramento de íons selecionados para
m/z 85 e m/z 191. A identificação dos compostos em todas as amostras foi baseada em seus
tempos de retenção. Os resultados qualitativos das análises gerados por esse método foram
processados pelo sistema Agilent Chemstation.
O cálculo da degradação dos compostos foi baseado na altura do pico das duplicatas e os
valores foram quantificados pela integração entre os dados. A fim de monitorar a eficiência de
degradação dos n-alcanos m/z 85 (C18-C32) ao longo do tempo foi realizada a normalização dos
dados por meio biomarcador 17α(H)21β(h) C30 hopano m/z 191. Para tal efetuou-se o cálculo da
razão da altura do pico de cada composto de uma determinada amostra pelo valor do pico do
hopano da mesma amostra. As taxas de degradação de cada composto em comparação à amostra
controle foram calculadas por meio da fórmula: ((Concentração Alcano controle /Concentração
C30 Hopano controle) – (Concentração Alcano consórcio/ Concentração C30 Hopano
consórcio)/ (Concentração Alcano controle /Concentração C30 Hopano controle) *100).
Devido à sua resistência biológica inata o hopano é o biomarcador conservativo
atualmente utilizado como normalizador na avaliação temporal da biodegradação dos compostos
de petróleo (PRINCE et al., 1994; VENOSA et al., 1997). Desta forma é possível evitar a
variabilidade de resultados relacionados à outros fatores que não estão relacionados
propriamente com a degradação pelos microrganismos
55
4.2.11 Tratamento estatístico
A normalização das razões das concentrações de cada composto (C18-C32)/ C30hopano,
nos diferentes intervalos de tempo foi avaliada pelo software GraphPad Instat no teste de
Kolmogorov e Smirnov (KS), a significância foi determinada pelo one-way ANOVA e KruskalWallis e a homogeneidade pelo teste de Bartlett. A distribuição dos parâmetros físico-químicos
juntamente com as razões entre as concentrações dos compostos ao longo dos diferentes
intervalos de tempo foram determinadas pelas análises multivariada das componentes principais
(ACP) com o auxílio do software Statística versão 7.0.
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Em ambientes contaminados os microrganismos com a capacidade de consumir ou tolerar
compostos orgânicos tóxicos estão presentes em maior quantidade do que em locais sem indícios
de contaminação (ATLAS, 1995; YAKIMOV et al., 2005). No primeiro ensaio de seleção 26
cepas foram indicadas como promissoras para a degradação de hidrocarbonetos de petróleo após
24 horas. A seleção de microrganismos adequados é uma das etapas do processo de
biorremediação. Várias pesquisas são relatadas com a finalidade de verificar o potencial de
degradação de hidrocarbonetos de petróleo e seus derivados por bactérias nativas isoladas e
selecionadas (SOUZA et al., 2005; BRITO et al., 2010; AFUWALE; MODI, 2012).
Após a análise dos fingerprints das quinze cepas potenciais obtidas no segundo ensaio de
seleção (figuras 26 e 27 do apêndice 3 ) sete foram indicadas para a formação de 2 consócios
bacterianos (figuras 28 a 30 do apêndice 3). Os dois consórcios obtidos foram denominados de
consórcio A (cepas MD04p (81), DJ02p (102), CN06p (128), DJ02p (47) e CN06p (67) e
consórcio B (cepas MD04p (81), DJ02p (100), CN06p (116), DJ02p (47) e CN06p (67)). As
cepas foram denominadas a depender do região da BTS onde as amostras de sedimentos foram
coletados (MD – Madre de Deus, DJ – Dom João e CN – Candeias), do ponto de coleta (04, 02 e
06), da fonte de carbono utilizada ao longo do experimento (p – petróleo) e da ordem de
obtenção dos isolados. Devido às dificuldades apresentadas para a identificação de bactérias
ambientais por meio de provas bioquímicas tradicionais apenas a cepa CN06p (67) foi
identificada como Enterobacter gergoviae (tabelas 12 e 13 e figura 25 do apêndice 3). Não
56
foram localizados trabalhos científicos relacionados com a degradação de hidrocarbonetos de
petróleo por meio desta espécie bacteriana.
A cada período amostral (t0 – 2 horas, t1 – 24 horas, t2 – 7 dias, t3 – 15 dias e t4 – 30
dias) foram observadas alterações no aspecto visual nos frascos Erlenmeyers contendo as
amostras de óleo. Em todas as amostras controles e para as amostras com a presença dos
consórcios no t0, o óleo apresentou-se homogêneo e não ocorreu turvação no meio líquido,
indicando que não teve crescimento bacteriano (figura 31 A(I), A(II), A(III), B(I),C(I) e D(I) do
apêndice 3). Nas amostras cujos consórcios foram adicionados notou-se a partir do t1 um
aumento da turbidez do meio e solubilização do óleo ao longo do tempo, indicado pelo
crescimento dos microrganismos. Nestas amostras o petróleo apresentou aparência de pó, com
uma única fase quando cessada a agitação (figura 31 B(II), B(III), C(II), C(III), D(II) e D(III) do
apêndice 3). Em experimento realizado por Chaillan et al. (2004) as cepas que promoveram o
aumento da turbidez nos tubos foram capazes de degradar hidrocarbonetos a partir do C15. Em
nosso trabalho tal fato pode ser explicado pela redução na tensão superficial do óleo, mesmo sem
a realização de experimentos para esse fim, com provável produção de biossurfactantes ou
enzimas degradadoras de hidrocarbonetos. Algumas espécies de microrganismos são capazes de
secretar biossurfactantes que emulsificam os hidrocarbonetos, facilitando o transporte através da
membrana celular. Outras produzem enzimas que reagem com os compostos do petróleo
tornando-os solúveis em água, possibilitando o transporte por difusão para o interior do
indivíduo (PETERS et al., 2005).
As massas dos componentes SAR (saturados, aromáticos e NSO) do óleo, amostras
controle, consórcio A e consórcio B desidratadas (figura 32 B, D e F do apêndice 3) obtidas pela
cromatografia líquida revelaram que em todas as amostras a fração SAT correspondeu a mais de
50% dos componentes, já as frações ARO e NSO representaram aproximadamente 20% sem
diferenças significativas entre si (tabelas 14 a 19 do apêndice 3) .
Comparado ao seu respectivo controle a fração SAT foi a mais degradada. O consórcio A
foi responsável pela redução nos valores da fração SAT principalmente no t4 (8 %) (figura 9). O
consórcio B contribuiu com a redução dos valores da fração ARO no t1 (13,6 %) e t2 (4 %)
(figura 9). Já a fração NSO apresentou valores ligeiramente reduzidos nas amostras submetidas
ao consórcio B no t0 e t2 e ao consórcio A no t4 (5% nas três amostras) (figura 9). Mesmo
sendo considerada a fração do petróleo mais facilmente degradada, a remoção da fração saturada
é um dos processos mais importantes na remediação de ambientes impactados por derrames de
petróleo por serem os compostos mais abundantes no petróleo bruto (HEAD, 2006; WENTZEL
et al., 2007; BRITO et al., 2010).
57
Figura 9 - Percentuais dos hidrocarbonetos saturados (SAT), aromáticos (ARO) e dos compostos heteroatomicos
(NSO) do óleo e das amostras submetidas aos ensaios de degradação (controle, consórcio A e consórcio B) nos
diferentes períodos de tempo (A) – t0, (B) – t1, (C) – t2, (D) – t3 e (E) t4.
Para este estudo a cromatografia líquida não foi suficiente para avaliar o grau de
degradação das amostras de óleo, já que segundo classificação de Tissot e Welte (1978) todas as
amostras foram consideradas como óleo normal, sem indícios importantes de biodegradação
(figura 33 do apêndice 3).
A análise das amostras por meio da cromatografia gasosa (CG/EM) permitiu a
visualização de perfis cromatográficos distintos para cada consórcio com o aumento do tempo de
experimento, indicando diferentes níveis de degradação a depender do consórcio e do tempo de
experimento. Verificou-se redução da abundância molecular dos n-alcanos entre o C18 e C32 nas
58
amostras submetidas à ação dos consórcios em relação ao óleo original (figura 10A) e ao seu
respectivo controle (figura 10B).
Figura 10 - Cromatograma da distribuição dos n-alcanos m/z 85 (C18-C32). (A) – Óleo original, (B) – Controle (t2)
Os perfis cromatográficos (figura 33 do apêndice 3) revelaram uma acentuada redução da
abundância molecular dos n-alcanos a partir do t2 para ambos os consórcios (figura 11A(I) e
B(I)). Ao atingir o período (t4) (figura 11A(II) e B(II), os níveis de degradação permaneceram
acentuados, com elevada redução na abundância molecular dos picos dos n-alcanos nas amostras
submetidas à presença dos dois consórcios bacterianos.
A partir dos cromatogramas executados para a visualização dos íons m/z 191, verificou-se
que o biomarcador 17α(H)21β(H) C30 hopano foi o composto mais resistente ao processo de
degradação (PRINCE et al., 2004; LÉ DREAU et al., 1997; VENOSA et al., 1997) (figura 34 do
apêndice 3), característica que confirma a escolha deste para a normalização das concentrações
dos n-alcanos.
Baseado na normalização com o hopano (figura 12), a as análises estatísticas revelaram
que os valores apresentados para todas as amostras controle são normais, extremamente
significativos (p = 0,0006) e heterogêneos (p< 0,0001), ou seja, são diferentes a depender do
período de experimento. Para o consórcio A os valores obtidos no t2 não foram considerados
normais, porém por meio do teste de Kruskal-Wallis foram considerados extremamente
significativos (p<0,0001). Os valores dos compostos no t2 e t3 foram não normais para o
consórcio B, sendo também considerados extremamente significativos (p<0,0001) para o ensaio
de degradação.
59
Figura 11 - Cromatogramas da distribuição dos n-alcanos m/z 85 (C18-C32) do consórcio A e do consórcio B após 7
dias e 30 dias de experimento.
Figura 12 - Cromatograma de distribuição dos Hopanos m/z 191, com destaque para o C30 Hopano.
60
A quantificação dos compostos após a normalização permitiu estimar a extensão da
biodegradação dos n-alcanos entre C18-C32 por meio da ação dois consórcios a depender do
período de tempo do experimento (figura 13).
Figura 13 - Razões entre n-alcanos (C18 – C32)/hopano do óleo, amostras controle, consórcio A e consórcio B
submetidas aos ensaios de degradação após 2 horas, 24 horas, 7 dias, 15 dias e 30 dias.
Os dados obtidos para cada consórcio foram baseados na comparação com as respectivas
amostras controles. Os valores médios e os desvios padrões de cada composto por amostra e
período de experimento estão representados nas tabelas 4 a 8.
61
Os compostos com maiores perdas apresentaram menores valores para as razões dos nalcanos/C30 hopano. No t0 apenas C22 obteve concentrações com perdas de 20,5% sob atuação do
consórcio A e de 12,9% com o consórcio B (figura 13 e tabela 4).
Tabela 4 - Valores dos n-alcanos (C18-C32) submetidos à normalização com o C30 Hopano e seus respectivos desvios
padrão das amostras controle, consórcio A e consórcio B após 2 horas de experimento (t0).
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27
C28
C29
C30
C31
C32
Controle
16,7 ± 3,5
16,5 ± 3,9
14,7 ± 3,3
14,2 ± 2,8
17,1 ± 1,8
12,3 ± 1,7
10,7 ± 1,2
10,0 ± 0,2
7,9 ± 0,0
6,7 ± 0,4
4,6 ± 0,7
3,2 ± 0,6
1,8 ± 0,4
1,1 ± 0,2
0,6 ± 0,0
Consórcio A
18,6 ± 5,2
17,9 ± 4,6
16,0 ± 4,6
14,9 ± 2,9
13,6 ± 2,7
13,0 ± 2,0
11,2 ± 1,2
10,1 ± 0,5
8,5 ± 0,1
7,3 ± 0,4
5,2 ± 0,4
3,8 ± 0,5
2,2 ± 0,4
1,4 ± 0,2
0,7 ± 0,0
Consórcio B
19,4 ± 8,1
20,5 ± 4,8
18,2 ± 4,3
16,0 ± 3,2
14,9 ± 2,8
13,7 ± 2,3
11,6 ± 1,5
10,5 ± 0,8
8,7 ± 0,6
7,2 ± 0,1
5,1 ± 0,1
3,7 ± 0,1
2,1 ± 0,1
1,3 ± 0,1
0,6 ± 0,0
A partir do t1, com exceção do C18 no t3, todos os compostos apresentaram menores
concentrações quando comparado aos controles, indicando que a partir de 24 horas os
microrganismos já estavam aclimatados, com capacidade em degradar os hidrocarbonetos de
petróleo de cadeia longa (figura 13 e tabela 5). Os microrganismos integrantes do consórcio A
foram os principais responsáveis pela redução das concentrações do C18 ao C31, com taxas de
degradação superiores a 90% para os compostos acima do C30 (figura 13 e tabela 5). A
capacidade dos microrganismos em degradar o petróleo rapidamente sugere que estes já estejam
pré-adaptados aos seus compostos (LEAHY; COLWELL, 1990)
62
Tabela 5 - Valores dos n-alcanos (C18-C32) submetidos à normalização com o C30 Hopano e seus respectivos desvios
padrão das amostras controle, consórcio A e consórcio B após 24 horas de experimento (t1).
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27
C28
C29
C30
C31
C32
Controle
23,5 ± 7,6
23,1 ± 8,2
8,3 ± 10,5
17,2 ± 3,9
15,4 ± 3,2
14,9 ± 2,2
12,1 ± 1,4
11,0 ± 0,8
9,0 ± 0,5
7,6 ± 0,1
5,3 ± 0,2
3,7 ± 0,1
2,1 ± 0,1
1,3 ± 0,1
0,7 ± 0,1
Consórcio A
2,6 ± 1,9
2,8 ± 2,1
2,8 ± 2,0
2,9 ± 2,1
2,9 ± 2,0
2,9 ± ,8
2,6 ± 1,6
2,4 ± 1,4
2,2 ± 1,1
2,1 ± 0,9
1,6 ± 0,7
1,2 ± 0,4
0,9 ± 0,2
0,6 ± 0,1
0,4 ± 0,1
Consórcio B
4,4 ± 4,6
4,6 ± 4,6
4,1 ± 3,9
4,1 ± 4,7
4,0 ± 3,5
4,0 ± 3,3
3,7 ± 2,6
3,4 ± 2,4
3,0 ± 2,0
2,7 ± 1,5
2,0 ± 0,9
1,0 ± 0,2
1,0 ± 0,2
0,7 ± 0,1
0,4 ± 0,1
No t2, com exceção do C30 que foi 100 % degradado pelo consórcio A, todos os demais
foram reduzidos com níveis superiores a 70 % pelo consórcio A e 81 % pelo consórcio B (figura
13 e tabela 6)
Tabela 6 - Valores dos n-alcanos (C18-C32) submetidos à normalização com o C30 Hopano e seus respectivos desvios
padrão das amostras controle, consórcio A e consórcio B após 7 dias de experimento (t2).
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27
C28
C29
C30
C31
C32
Controle
16,5 ± 5,0
16,2 ± 4,5
15,0 ± 4,0
17,3 ± 2,6
12,7 ± 2,4
12,3 ± 2,1
10,6 ± 1,6
10,0 ± 1,8
7,5 ± 2,1
5,9 ± 2,3
3,8 ± 2,0
2,5 ± 1,6
2,1 ± 0,0
1,3 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Consórcio A
31,1± 27,2
4,8 ± 1,5
1,9 ± 1,5
2,8 ± 2,5
2,9 ± 3,7
1,9 ± 1,5
2,0 ± 2,1
1,5 ± 1,5
1,2 ± 1,0
1,7 ± 1,8
0,0 ± 0,0
0,0 ± 00
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Consórcio B
15,2 ± 4,7
4,8 ± 1,8
1,1 ± 0,4
2,0 ± 0,4
1,3 ± 1,3
1,1 ± 0,8
0,6 ± 0,0
0,4 ± 0,0
0,5 ± 0,0
0,5 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
1,1 ± 0,6
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
63
No t3 nota-se que os compostos presentes nos controles apresentam valores
significativamente inferiores em relação ao t1, t2 e t3 (figura 13 e tabela 7). Comparado aos
demais períodos, os níveis de degradação entre o C18 e C21 foram ligeiramente inferiores para
ambos consórcios. A partir do C26 os dois consórcios atuaram de maneira semelhante com
reduções acima de 89,5% e de 100% a partir do C28 pelo consórcio A (figura 13 e tabela 7).
Tabela 7 - Valores dos n-alcanos (C18-C32) submetidos à normalização com o C30 Hopano e seus respectivos desvios
padrão das amostras controle, consórcio A e consórcio B após 15 dias de experimento (t3).
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27
C28
C29
C30
C31
C32
Controle
7,7 ± 8,8
7,0 ± 7,8
5,2 ± 6,8
4,7 ± 5,8
4,3 ± 4,6
4,6 ± 4,0
4,4 ± 2,9
4,3 ± 2,6
3,8 ± 2,3
3,4 ± 2,0
2,5 ± 1,3
1,8 ± 2,0
1,1 ± 0,6
0,7 ± 0,4
0,4 ± 0,2
Consórcio A
8,7 ± 4,9
2,7 ± 1,5
0,5 ± 0,3
1,2 ± 0,6
0,9 ± 0,4
0,5 ± 0,1
0,5 ± 0,4
0,4 ± 0,1
0,4 ± 0,2
0,3 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Consórcio B
5,6 ± 0,4
1,9 ± 0,1
0,4 ± 0,0
0,6 ± 0,4
0,4 ± 0,1
0,6 ± 0,2
0,5 ± 0,1
0,3 ± 0,0
0,4 ± 0,1
0,3 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
No t4, com exceção do C18, o consórcio A proporcionou níveis de degradação acima de
91%, enquanto que o B colaborou com valores superiores a 58,3% (figura 13 e tabela 8)
O consórcio A colaborou com melhores taxas de redução dos compostos com 30 dias de
experimento obtendo preferência para os n-alcanos a partir do C23. O consórcio B degradou
principalmente os n-alcanos entre C18 a C22, atuando de forma semelhante tanto em 7 quanto em
15 dias de experimento para os compostos acima do C20. Os compostos com maior número de
átomos de carbono foram os que apresentaram as maiores reduções também são os compostos
presentes em menores quantidades, mesmo nas amostras controle.
64
Tabela 8 - Valores dos n-alcanos (C18-C32) submetidos à normalização com o C30 Hopano e seus respectivos desvios
padrão das amostras controle, consórcio A e consórcio B após 30 dias de experimento (t4).
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27
C28
C29
C30
C31
C32
Controle
27,7 ± 0,0
25,7 ± 0,0
21,2 ± 0,0
18,4 ± 0,0
16,8 ± 0,0
15,8 ± 0,0
13,0 ± 0,0
11,7 ± 0,0
8,9 ± 0,0
7,6 ± 0,0
0,0 ± 0,0
3,5 ± 0,0
2,0 ± 0,0
1,2 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Consórcio A Consórcio B
7,8 ± 9,8
3,0 ± 2,7
2,5 ± 2,4
3,4 ± 3,0
1,1 ± 0,3
3,7 ± 2,8
1,3 ± 1,0
3,4 ± 3,0
0,9 ± 0,4
3,5 ± 2,3
1,0 ± 0,1
3,2 ± 2,2
0,6 ± 0,0
2,5 ± 2,3
0,5 ± 0,0
2,2 ± 2,0
0,8 ± 0,0
1,8 ± 1,4
0,4 ± 0,0
1,4 ± 1,3
0,0 ± 0,0
0,2 ± 0,6
0,0 ± 0,0
0,9 ± 0,6
0,0 ± 0,0
0,5 ± 0,1
0,0 ± 0,0
0,5 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,3 ± 0,0
Devido à capacidade de reduzir os compostos no início do experimento (t0 e t1), eliminálos completamente a partir no C28 no t2, t3 e t4, e por contribuir com melhores resultados após 30
dias (t4), nesse experimento o consórcio A foi considerado o mais promissor para degradação de
n-alcanos de cadeia longa principalmente a partir do C23. O contato estabelecido com
determinado contaminante altera a capacidade metabólica dos microrganismos, os quais muitas
vezes não são capazes de degradá-lo em uma exposição inicial, mas sim após exposições
duradouras por estarem mais adaptados aos compostos (MARTINS et al., 2003).
Os mecanismos relacionados com a biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo não
são bem esclarecidos. Sabe-se por meio de pesquisas que determinadas espécies microbianas
degradam preferencialmente determinados compostos (PETERS et al., 2005). Nos resultados
acima expostos o fato de vários microrganismos estarem co-metabolicamente envolvidos no
experimento pode estar relacionado com o consumo de substratos preferenciais por meio de cada
um dos consórcios.
As espécies bacterianas são capazes de crescer e degradar um composto ou uma mistura
de compostos específicos dentre as diversas classes de hidrocarbonetos presentes no petróleo. A
comunidade microbiana presente em amostras de sedimentos do porto Millazo na Itália,
contribuiu com a degradação de 41,3 ± 2,2% dos n-alcanos entre C10 e C35 após 20 dias de
experimento (YAKIMOV et al., 2005). Em experimento realizado por Chaillan et al. 2004,
65
microrganismos foram capazes de degradar n-alcanos acima de 18 átomos de carbono. Um cepa
de Acinetobacter isolada proporcionou a degradação de parafinas até C35 após 7 dias de
experimento laboratorial em cultura líquida (BIHARI et al., 2007).
A capacidade dos microrganismos em consumir alcanos como fonte de carbono envolve
a ação de sistema enzimático e vias metabólicas especializadas em transformá-los em compostos
mais simples. Os passos iniciais de degradação estão relacionados com a ação de enzimas
oxidativas, a exemplo das monooxigenases, que convertem o substrato em álcool primário após o
contato celular com os compostos hidrófobos. Para os n-alcanos de cadeia longa bactérias podem
acessar os compostos do petróleo através do contato celular direto ou mediado pela ação de
biossurfactantes por meio do petróleo solubilizado (WENTZEL et al., 2007; ROJO, 2009).
A fim de compreender de forma mais clara os processos envolvidos na degradação dos
compostos abordados faz-se necessário a realização de estudos relacionados com a viabilidade
das colônias a cada período amostral para a verificação da correlação entre os valores com o
aumento das células microbianas. Além disso, a caracterização do complexo enzimático e dos
genes das bactérias envolvidas facilita a compreensão do metabolismo dos n-alcanos de cadeia
longa (WENTZEL, 2007) indicando os mecanismos que envolvem a degradação de cada
composto pelos microrganismos.
A análise dos componentes principais (ACP) da distribuição dos parâmetros físicoquímicos (pH, Eh, condutividade e salinidade) e das razões das concentrações dos n-alcanos
(C18-C32) (variáveis) nos diferentes intervalos de tempo (casos) foi explicada por 78,4 % de
variância entre os dois fatores (figuras 14A e 14B).
O pH foi a única variável que determinou a distribuição dos compostos de C18 a C28 nas
amostras controle no t0, t1, t2 e t4. Tal resultado relaciona-se com o valor das variáveis que não
sofreram degradações significativas nesses períodos bem como com a não alteração do pH, o
qual manteve-se próximo da neutralidade nesses períodos de tempo. A salinidade e a
condutividade foram responsáveis pela distribuição do C32, composto mais degradado, sob ação
dos consórcios A e B no t1 e pelo consórcio A no t3. A distribuição das demais amostras foram
determinadas pelos valores de Eh, parâmetro que mais sofreu variação com o aumento de tempo
do experimento, onde os tempos com maiores taxas de degradação apresentaram maiores valores
de Eh.
66
Figura 14 - Análise dos Componentes Principais (ACP). Onde: (A) – Variáveis (pH, Eh, condutividade, salinidade e
n-alcanos (C18-C32) e (B) – Casos (controle, consórcio A e consórcio B submetidos aos tempos amostrais t0, t1, t2,
t3 e t4.
(A)
(B)
A amostra controle no t3 não foi influenciada por nenhum parâmetro específico e o
composto C31 determinou a distribuição do consórcio A no t1 e t2. O Eh foi o parâmetro que
determinou o agrupamento da amostra de óleo submetida ao consórcio B no t1, e aos dois
consórcios no t3 e t4 (figura 14), sendo o principal determinante dos níveis de degradação, já que
os maiores valores foram observados na presença de um dos consórcios.
Os valores médios dos parâmetros físico-químicos para cada intervalo de tempo do
ensaio de degradação estão representados na tabela 9.
Tabela 9 - Valores médios das réplicas dos parâmetros físico-químicos (pH, Eh, condutividade e salinidade) das
amostras submetidas aos ensaios de degradação nos diferentes tempos amostrais (t0, t1, t2, t3 e t4).
AMOSTRA
t0 cont.
t0 cons.A
t0 cons.B
t1 cont.
t1 cons.A
t1 cons.B
t2 cont.
t2 cons.A
t2 cons.B
t3 cont.
t3 cons.A
t3 cons.B
t4 cont.
t4 cons.A
t4 cons.B
Ph
6,9
6,9
6,6
7,5
6,2
5,7
6,9
5,6
5,6
7,0
5,8
5,8
6,4
5,1
5,6
Eh
14,3
13,8
14,2
13,7
62,4
60,3
15,5
90,4
88,1
13,3
74,6
75,5
44,5
114,4
88,3
Cond.
3,5
4,6
4,9
3,8
4,4
4,2
2,5
2,8
2,4
2,6
4,7
3,7
2,6
3,8
2,6
Sal.
2,0
2,5
2,5
1,9
2,3
2,2
1,4
1,4
1,2
1,3
2,5
1,9
1,4
2,0
1,2
67
4.4 CONCLUSÕES
Microrganismos apresentam preferência metabólica por determinados compostos do
petróleo. Tal fato pode ser constatado pelos diferentes níveis de degradação de um mesmo
composto com a presença dos diferentes consórcios.
A partir do t2 o consórcio A foi capaz de degradar completamente todos os compostos
acima do C28, porém, para os demais compostos, as melhores taxas de degradação foram
presenciadas após 30 dias de experimento indicando que os microrganismos apresentaram um
ótimo metabólico após um longo período de exposição ao contaminante. O consórcio B atuou de
forma semelhante na degradação de compostos acima do C20 após 7 e 15 dias de experimento,
com níveis de degradação superiores a 81%.
O consórcio B degradou principalmente compostos entre C18 a C22. O consórcio A obteve
preferência na degradação dos n-alcanos a partir do C23. , sendo considerado o mais promissor
para a degradação dos n-alcanos de cadeia longa.
Os perfis cromatográficos dos íons m/z 85, n-alcanos (C18-C32), revelaram uma acentuada
redução da abundância molecular dos compostos nas amostras submetidas à ação dos consórcios.
A normalização dos compostos por meio do C30 hopano, associada à avaliação qualitativa,
demonstrou que os dois consórcios contemplados no estudo foram eficazes na degradação dos
hidrocarbonetos de cadeia longa.
As amostras de óleo que foram submetidas à ação dos consórcios tiveram concentrações
reduzidas em relação aos controles, tendo a normalização pelo hopano indicado que tais valores
foram determinados pelo processo de biodegradação ao longo do tempo de experimento.
4.5 AGRADECIMENTOS
À Fapesb pela concessão da bolsa de mestrado. À PROAMB e CNPQ pelo auxílio
financeiro.
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71
5 EFICIÊNCIA DE MICRORGANISMOS DE SEDIMENTOS DE
MANGUEZAIS POTENCIAIS DEGRADADORES DE
HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAS) DE
ALTO PESO MOLECULAR
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento de consórcios bacterianos na
degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) de alto peso molecular. Para tal
realizou-se experimento laboratorial em diferentes tempos amostrais (t0 – 2 horas, t1 – 24 horas,
t2 – 7 dias, t3 – 15 dias, t4 - 30 dias) com dois consórcios inicialmente isolados de sedimentos de
manguezais contaminados. Foram utilizados frascos Erlenmeyers com 50 mL de meio mineral
Buschnell Hass e 1% de petróleo como única fonte de carbono e energia. O benzo (a) pireno foi
o HPA responsável por maiores diferenças dos níveis de degradação entre os consórcios. O
indeno (1,2,3-c,d) foi o HPA mais degradado em relação à amostra controle, com níveis de
degradação de 92% após 7 dias de experimento sob ação do consórcio A e de 89,6% após 30 dias
sob ação do consórcio B. O consórcio A contribuiu positivamente com os níveis de degradação
apresentados após 7 e 15 dias de experimento e o consórcio B no início do experimento e ao
final dos 30 dias. A avaliação por cromatografia gasosa (CG/EM) indicou que ao final de 30 dias
todos os HPAs apresentaram concentrações reduzidas em relação aos seus controles indicando
que ambos os consórcios foram eficazes na degradação dos HPAs de alto peso molecular.
Palavras chaves: Biodegradação, petróleo, consórcios bacterianos, hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the behavior of bacterial consortia in the
degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) of high molecular weigth. The
laboratory experiment was conduct at different times of sampling (t0 – two hours, t1 – 24 hours,
t2 – 7 days, t3 – 15 days and t4 – 30 days) with two consortia initially isolated from
contaminated mangrove sediments. Erlenmeyers flasks were used with 50 ml of mineral medium
Buchnell Hass and 1% of oil as the source of carbon and energy. Benzo (a) pyrene was the PAH
responsible for the major differences in the levels of degradation between consortia. The indene
(1,2,3-c,d) was the PAH further degraded compared with control sample, with levels of
breakdown than 92% after 7 days of the experiment under action of the consortium B. The
consortium B contributed positively to the levels of degradation after 7 and 15 days of
experiment at baseline and at the end of 30 days. Evaluation by gas chromatography (CG/MS)
showed that after 30 days all PAH concentrations were reduce compared to the control indicating
that both consortia were effective in the degradation of high molecular weigth PAHs.
Keywords: Biodegradation, oil, bacteria consortia, polycyclic aromatic hydrocarbons
72
5.1 INTRODUÇÃO
Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) de alto peso molecular são
compostos tóxicos com elevado potencial mutagênico aos seres vivos (quadro 6 do apêndice 1)
(CERNIGLIA, 1992). A baixa solubilidade em água associada à hidrofobicidade e tendência de
sorção nas partículas orgânicas dos sedimentos, fazem dos HPAs compostos persistentes no meio
ambiente e pouco disponível para os microrganismos (PENG et al., 2008; SEO et al., 2009). A
recalcitrância dos HPAs de alto peso molecular é diretamente proporcional ao aumento do
número de anéis e a disposição angular (figura 22 do apêndice 1). (SHUTTLEWORTH;
CERNIGLIA, 1995; KANALY; HARAYAMA, 2000).
A limpeza de ambientes contaminados com HPAs de alto peso molecular tem sido
realizada por microrganismos com capacidade de degradar esses compostos em produtos menos
tóxicos (YE et al., 1996).
O primeiro microrganismo relatado com capacidade de degradar hidrocarbonetos de alto
peso molecular foi isolado de amostras de sedimento, atuando em co-metabolismo na degradação
de fluoranteno, pireno, 1-nitropireno, 3-metilcolantreno, 6 nitrocriseno e benzo (a) pireno, em
concentração de 0,5 mg/L, suplementado com nutrientes durante 2 semanas de crescimento
(HEITKAMP; CERNIGLIA, 1988).
No processo de biorremediação, microrganismos adaptados aos poluentes são capazes de
imobilizá-los, transformá-los ou mineralizá-los em H2O e CO2 pela ação de enzimas
dioxigenases (CHAINEAU et al., 1999; DÍAZ, 2004; JACQUES et al., 2007; HARITASH;
KAUSHIK, 2009; SEO et al., 2009). Em laboratório cepas nativas isoladas podem ser utilizadas
como ferramentas para a formação de consórcios com potencial degradador de compostos
tóxicos (GARCÍA-RIVERO; PERALTA-PÉREZ, 2008).
Os manguezais são importantes zonas úmidas estuarinas intimamente relacionadas com
atividades humanas, sendo alvo frequente de contaminação por HPAs (TAM et al., 2002;
HARITASH; KAUSHIK, 2009). Em sedimentos de manguezais contaminados com petróleo,
microrganismos com potencial degradador de compostos aromáticos estão presentes em elevadas
quantidades (106 células/ g-1 de sedimento), tendo sua concentração aumentada após exposições
adicionais a esse composto (RAMSAY et al., 2000).
Bactérias isoladas de sedimentos contaminados são extensivamente utilizadas na
remediação de ambientes contaminados por compostos orgânicos. Vários gêneros bacterianos
vêm sendo descritos como potenciais degradadores de HPAs de alto peso molecular como:
73
Bacillus, Nocardia, Rhodococcus, Gordona, Mycobacterium (KASTNER, 1996; GUO et al.,
2005; HARITASH; KAUSHIK, 2009; ZHENG et al., 2010; MAITI et al., 2012).
Vários são os estudos relacionados com a degradação microbiana de HPAs de baixo peso
molecular, como fluoranteno, antraceno, fenantreno (ROMERO et al., 1998; YUAN et al., 2000;
YUAN et al., 2001; TAM et al., 2002; TANG et al., 2006; YU et al., 2005; JACQUES et al.,
2007; JACQUES et al., 2010). Um número inferior de pesquisas está voltado à degradação
microbiana de HPAs de alto peso molecular contendo cinco ou mais anéis aromáticos (YE et al.,
1996; KANALY; HARAYAMA, 2000).
A degradação de HPAs com três a sete anéis aromáticos por meio do bioaumento, tem se
mostrado uma ferramenta eficaz para a limpeza de solos contaminados com resíduos
petroquímicos, porém os mecanismos relacionados com a degradação de HPAs com mais de
cinco anéis não são bem esclarecidos (JUASZ, 1998; PENG et al., 2008).
O objetivo deste estudo é avaliar a capacidade de dois consórcios bacterianos em
degradar os HPAs de alto peso molecular benzo (k) fluoranteno, benzo (b) fluoranteno, benzo (a)
pireno, dibenzo (a,h) antraceno benzo (g,h,i) perileno e indeno (1,2,3-c,d) pireno em ensaios de
degradação em cultura líquida em diferentes períodos de tempo.
5.2 MATERIAIS E MÉTODOS
5.2.1 Área de Estudo
As coletas foram realizadas em três manguezais da Baía de Todos os Santos - BTS,
Bahia, Brasil, pertencentes a municípios que atendem atividades distintas da cadeia produtiva do
petróleo: São Francisco do Conde, município caracterizado pela exploração de petróleo pela
PETROBRÁS no Campo de Dom João (DJ); Madre de Deus (MD) que abriga o Terminal
Portuário Almirante Alves Câmara – TEMADRE responsável pelo transporte de petroderivados
para a capital e interior baiano e Candeias (CN) situada nas proximidades as Refinaria
Landulpho Alves Mataripe – RLAM (figura 15).
Coletou-se assepticamente aproximadamente 50g de sedimento superficial de manguezal
(0,0 a 5,0 cm) em região de intermaré. As amostras foram armazenadas em caixa de isopor
contendo gelo até a chegada ao laboratório para a conservação dos microrganismos.
74
Figura 15 – Localização da Baía de Todos os Santos com as três regiões de estudo: (DJ) campo de Dom João em
São Francisco do Conde, (MD) Madre de Deus e (CN) Candeias
5.2.2 Enriquecimento, Isolamento e Seleção
Primeiramente 10 g das amostras de sedimento fresco foram enriquecidas em frascos tipo
Erlenmeyers contendo 99 mL de meio mineral Buschneel Haas (BH) e 1 % de petróleo como
única fonte de carbono e energia. Os frascos foram mantidos sob agitação em shaker (180 rpm)
no escuro e em temperatura de 28 ºC ± 2, durante 21 dias (CHAERUN et al., 2004; SOUZA et
al., 2005; WETLER, 2006). Após o período de enriquecimento as amostras foram semeadas em
duplicada em placas de Petri com meio BH e 1 % de petróleo adicionado em sua superfície. As
placas foram incubadas à 30ºC durante 4 dias para o crescimento dos microrganismos.
Visando indicar as bactérias isoladas potenciais degradadoras de hidrocarbonetos de
petróleo após 24 horas foram realizados dois ensaios de seleção com o uso do indicador de oxiredução 2,6 diclorofenolindofenol (HANSON et al., 1993). O primeiro ensaio foi conduzido em
placas multipoços de 2,0 mL, incubadas estaticamente à 30ºC, durante 24 horas. A fim de
confirmar o resultado obtido o segundo foi executado em frascos Erlenmeyers submetidos à
agitação nas mesmas condições do enriquecimento. Após 17 horas de enriquecimento dos
microrganismos adicionou-se 1mL do indicador 2,6 DCPIP (GOMES et al., 2004; MIRANDA et
75
al., 2007; AFUWALE; MODI, 2012). Maiores detalhes podem ser encontrados no apêndice 4
(FIORAVANTI et al., 2012).
5.2.3 Formação dos Consórcios
Foram elaborados dois consórcios bacterianos, denominados consórcio A e consórcio B,
com as bactérias selecionadas no segundo ensaio de seleção. A indicação das cepas bacterianas
para a composição dos consórcios baseou-se em avaliação dos fingerprints dos n-alcanos das
amostras de óleo pelo método de whole oil. As amostras foram previamente desidratadas em
pipetas de Pasteur (metodologia para desidratação após os ensaios de seleção descrita no
apêndice 2), em cromatógrafo à gás, Varian CP-3800 com detector de ionização de chama
(CG/FID). Tal equipamento apresentava-se equipado com coluna capilar modelo DB5 (15m x
0,25mm x 0,25 µm), utilizando hélio como gás para o fluxo de arraste.
Sete cepas foram selecionadas para a formação de dois consórcios contendo cinco
bactérias cada.
5.2.4 Ensaios de Degradação
Os ensaios de degradação foram realizados em laboratório, com o uso de shaker rotativo.
Para tal utilizaram-se frascos tipo Erlenmeryers de 125 mL contendo 50 mL do meio BH, 400
µL de cada cepa padronizada em 1,5x108 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) com o
auxílio do tubo 0,5 da escala de MacFarland (totalizando 2 mL) e 520 µL do petróleo como fonte
de carbono. Os frascos permaneceram em agitação (180 RPM ± 2) e 28ºC ± 2, no escuro.
Devido à capacidade do shaker a cada período amostral todo o procedimento foi
novamente repetido.
Após o término do ensaio estabelecido para cada tempo amostral, retirou-se cerca de 40
mL do conteúdo hídrico proveniente da cultura, transferindo-o para frascos Erlenmeyers de 50
mL. Com o uso de um pHmetro de bancada WTW (resolução 0,01), calibrado a cada período,
foram mensurados em triplicata os parâmetros pH e Eh e com o uso de um condutivímetro WTW
(range 199,9 µS/cm; resolução 0,1 µS/cm) mensurou-se a condutividade e salinidade também em
triplicata.
76
5.2.5 Cromatografia Líquida
Adotou-se metodologia padronizada pelo Laboratório de Estudos do Petróleo
LEPETRO, da Universidade Federal da Bahia/UFBA, onde a obtenção das frações SAT
(hidrocarbonetos saturados) e ARO foi executada em uma coluna cromatográfica de vidro (60cm
x 1cm d.i). Na base da coluna foi acondicionada lã de vidro, tendo sido o seu interior recheado
com 4g de sílica gel Merck (0,063-0,200mm) previamente ativada em forno mufla a 500ºC/ 2h.
A sílica foi umedecida com n-hexano e adicionada cuidadosamente no interior da coluna para
evitar a formação de bolhas e rachaduras.
Foram pesados cerca de 0,02 g do extrato desidratado e evaporado. A amostra diluída
com n-hexano foi então transferida para o topo da coluna ambientada com esse mesmo solvente.
Para a eluição da fração SAT adicionou-se 30 mL de n-hexano. Já para a fração ARO utilizou-se
mistura de 30 mL de n-hexano/diclorometano (2:1, v/v). As frações foram capturadas em balões
de fundo redondo e submetidas à evaporação natural. Após a evaporação do solvente as amostras
foram transferidas para vials previamente pesados e identificados.
Ambos os solventes utilizados pertenceram do grau P.A ACS ISO, tendo sido adquiridos
da Merck (Darmstadt, Alemanha).
5.2.6 Cromatografia Gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM)
As amostras contendo as frações ARO foram encaminhadas para o Laboratório de Física
Nuclear Aplicada para a avaliação quali-quantitativa da concentração dos 6 HPAs contemplados
nesta pesquisa.
Utilizou-se padrão contendo os 16 HPAs prioritários da Agência de Proteção Ambiental
dos Estados Unidos – US. EPA, marca Supelco, grau de pureza 99,9%, 99,5% e 99,1%). Foram
realizadas diluições da solução (10 mg/L-1) para o preparo de padrões em concentrações de
0.010, 0.050, 0.100, 0.500, 2.000 e 5.000 mg/L-1, em diclorometano.
As análises cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo gasoso Shimadzu
GC2010 acoplado a um espectrômetro de massas Shimadzu QP 2010 Plus. Tal equipamento é
composto por uma coluna capilar DB-5 (5% fenil, 95% metilsiloxano) com 30 m de
comprimento x 0.25 mm de diâmetro interno x 0.25 µm de espessura. A temperatura do injetor
manteve-se em 250oC. A programação da temperatura foi de 45oC com taxa de aquecimento de
45oC/min até 130oC. Ao alcançar 180oC a taxa de aquecimento foi de 10oC/min, posteriormente
de 6oC, 240oC e finalmente de 310oC com taxa de 10oC/min, permanecendo assim por 5 minutos.
77
O tempo total de cada análise foi de 29,39 minutos. Foram injetados 2 µL da amostra
concentrada (0,05mg µL-1 de DCM) no modo splitless. O Hélio foi utilizado como gás de arraste
com fluxo de 1.91 mL/min. A interface foi mantida a 250oC com o detector operando no modo
SIM (select ion monitoring). Os dados foram integrados por meio do software GCMSSolution.
Os HPAs foram identificados mediante comparação dos tempos de retenção dos padrões
autênticos e dos padrões de trabalho. Anteriormente à execução das análises foram injetados
solventes brancos e a mistura padrão a fim de verificar a possibilidade de contaminações, bem
como a checagem dos picos e dos tempos de retenção (CELINO et al., 2012).
O percentual de degradação de cada consórcio comparado ao seu respectivo controle foi
efetuado para a média entre as duplicadas por meio da fórmula: % de degradação =
(concentração residual do HPA na amostra controle – concentração residual do HPA na amostra
com o consórcio)/(concentração residual do HPA na amostra controle)*100
5.2.7 Análises Estatísticas
Com o uso do software Statistica, versão 7.0 efetuou-se análise multivariada dos
componentes principais (ACP) para a compreensão do padrão de distribuição das amostras
degradadas para o consórcio A e para o consórcio B em relação às variáveis (HPAs, pH, Eh,
salinidade e condutividade).
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Foram isoladas dos manguezais da BTS, 127 cepas bacterianas. Por apresentarem
melhores condições de crescimento após as reativações 118 foram usadas no primeiro ensaio de
seleção, destas, se selecionaram 26 no primeiro e 15 no segundo ensaio. Dentre as 15 cepas
selecionadas cujo fingerprints e perfis dos n-alcanos foram avaliados pela cromatografia gasosa
(CG/FID) (figura 27 do apêndice 3), 7 apresentaram características necessárias para a formação
de dois consórcios bacterianos (figuras 28 a 30 do apêndice 3), sendo estes: Consórcio A MD04p (81), DJ02p (102), CN06p (128), DJ02p (47) e CN06p (67) e Consórcio B - MD04p
(81), DJ02p (100), CN06p (116), DJ02p (47) e CN06p (67). A denominação adotada para cada
consórcio baseou-se na localidade onde a amostra de sedimento para o isolamento das cepas foi
coletado (MD – Madre de Deus, DJ – Dom João e CN – Candeias; no ponto de coleta da amostra
78
(04, 02 e 06), na fonte de carbono utilizada para o enriquecimento e isolamento das bactérias
(petróleo) e na ordem que os isolados foram obtidos (números entre parênteses).
A avaliação dos tempos de retenção (CG/EM) das amostras aromáticas submetidas aos
ensaios de degradação revelou que para alguns HPAs a amostra de óleo estava mais degradada,
mesmo quando comparado aos controles (tabela 10) (tabela 20 do apêndice 3). Volatilização,
foto-oxidação e oxidação químicas são alguns dos fatores intempéricos que contribuem com a
degradação de HPAs no meio ambiente (YUAN et al., 2001; TAM et al., 2002). Por esse motivo
a comparação dos dados foi realizada apenas entre as amostras contendo os consórcios A ou B e
os seus respectivos controles abióticos.
Tabela 10 – Concentração (µg/L) dos HPAs de alto peso molecular benzo (k) fluoranteno - B(k)Fluo; benzo (b)
fluoranteno – B(b)Fluo; benzo (a) pireno - B(a)P; dibenzo (a,h) antraceno – DibahA; benzo (g,h,i) perileno - B(g)P
e indeno (1,2,3-c,d) pireno – IndP, nas amostras de óleo e nos controles dos tempos t0, t1, t2, t3 e t4.
Amostras
Óleo
t0 Cont.
t1 Cont.
t2 Cont.
t3 Cont.
t4 Cont.
HPAs (µg/L)
B(k)Fluo
176,0
159,3
220,6
324,9
328,3
313,5
B(b)Fluo
223,9
175,0
324,0
290,7
352,7
318,2
B(a)P
744,5
489,0
1091,2
412,2
723,0
552,1
DibahA
173,3
148,8
158,1
353,8
362,2
354,7
B(g)P
196,5
184,6
187,2
403,7
407,6
402,8
IndP
177,1
94,8
93,0
563,7
567,3
557,7
Com exceção do B(a)P submetido à ação do consórcio A após 15 dias de experimento,
todos os HPAs apresentaram concentrações residuais inferiores em relação à amostra controle
(figura 16). O consórcio B foi mais eficiente na redução da concentração dos HPAs
principalmente após 30 dias de experimento (figura 16).
Tal resultado juntamente com o aumento nos níveis de degradação ao longo dos tempos
amostrais foi interpretado como biorremediação, já que os valores foram significativamente
reduzidos em relação aos controles abióticos (tabela 20 do apêndice 3). Assim como no trabalho
realizado por Boonchan et al. (2000) os dois consórcios foram capazes de degradar, em taxas
diferenciadas, os HPAs de alto peso molecular. Em condições laboratoriais a degradação de
hidrocarbonetos por co-metabolismo microbiano torna-se essencial, já que compostos
considerados tóxicos para um determinado microrganismo podem servir como fonte de carbono
para outro (WETLER-TONINI et al., 2011).
79
Figura 16 - Concentrações residuais dos HPAs (µg/L): B(k)Fluo – benzo (k) fluoranteno, B(b)Fluo – benzo (b)
fluoranteno, B(a)P – benzo (a) pireno, DibahA – dibenzo (a,h) antraceno B(g)P – benzo (g,h,i) perileno e IndP–
indeno (1,2,3-c,d) pireno nas amostras controle, consórcio A e consórcio B nos tempos amostrais t0(cerca de 2
horas), t1(24horas), t2(7 dias), t3(15 dias) e t4(30 dias).
A maioria dos estudos voltados à biodegradação de HPAs, tanto de baixo quanto de alto
peso molecular utilizam algum HPA ou a mistura de HPAs como fonte de carbono e energia
(STRINGFELLOW; AITKEN, 1995; JANBANDHU; FULEKAR, 2011; MAITI et al., 2012).
Em nosso estudo a não utilização de HPAs como fonte de carbono e energia durante o período de
enriquecimento e isolamento não inviabilizou a degradação dos compostos de alto peso
molecular tendo sido considerada satisfatória a adaptação dos microrganismos apenas com o uso
do petróleo como fonte de carbono durante o experimento de degradação.
80
Em estudos voltados à degradação de compostos orgânicos torna-se necessário a
compreensão do período necessário à adaptação do microrganismo a um determinado composto,
sendo este o tempo de indução das enzimas responsáveis pelo consumo dos contaminantes
(NIGAM et al., 2012). Durante o experimento a capacidade de degradação dos compostos a
depender do período amostral foi evidenciada pelo aumento da turbidez no meio líquido presente
nos frascos, decorrente do aumento da biomassa microbiana (figura 31 B(II), B(II), C(I), C(II),
D(I) e D(II) do apêndice 3).
Cepas isoladas de ambientes contaminados apresentam maior potencial de degradação em
relação às isoladas de ambientes sem indícios de contaminação pelo fato de estarem adaptadas
aos compostos presentes no ambiente contaminado (CHAINEAU et al., 1999).
O consórcio B foi responsável por taxas de degradação superiores nos períodos t0, t1 e t4,
já o consórcio A contribuiu com melhores resultados nos períodos t2 e t3 (tabela 11).
Tabela 11 – Percentual de degradação dos HPAs benzo (k) fluoranteno - B(k)Fluo, benzo (b) fluoranteno B(b)Fluo, benzo (a) pireno - B(a)P, dibenzo (a,h) antraceno – DibahA, benzo (g,h,i) perileno - B(g)P e indeno
(1,2,3-c,d) pireno – IndP nas amostras controle, consórcio A e consórcio B nos tempos t0, t1, t2, t3 e t4.
Amostra
t0 Cons.A
t0 Cons.B
t1 Cons.A
t1 Cons.B
t2 Cons.A
t2 Cons. B
t3 Cons. A
t3 Cons. B
t4 Cons. A
t4 Cons. B
B(k)Fluo
0,1
9,7
28,9
35,0
56,6
53,5
54,8
53,4
47,4
53,2
B(b)Fluo
2,1
23,9
49,5
59,4
61,8
50,3
60,5
54,2
40,4
56,6
% Degradação HPAs
B(a)P
DibahA
15,5
3,8
49,4
11,1
65,4
10,7
77,6
15,1
60,0
62,5
29,2
61,8
59,6
62,9
45,1
61,1
3,7
60,4
51,9
62,1
B(g)P
3,5
4,7
4,3
5,8
56,1
56,0
56,7
56,0
55,3
56,0
IndP
18,3
43,6
23,8
48,5
92,0
88,6
89,7
86,2
89,0
89,6
Os microrganismos foram capazes de degradar os diferentes compostos de alto peso
molecular presentes no petróleo. Estudos revelam que em baixas taxas de diluição os
microrganismos são capazes de utilizar simultaneamente substratos de preferência (NIGAM et
al., 2012). Os compostos mais degradados pelos microrganismos foram os que possuem maior
relação massa/ carga (m/z), como o B(a)P (m/z 252), DibahA (m/z 278) e IndP (m/z 276).
Geralmente microrganismos isolados apresentam um potencial de degradação reduzido para
HPAs, sendo complexo os padrões de degradação de compostos simultaneamente (PENG et al.,
2008).
O consórcio A atingiu níveis ótimos na degradação do HPA IndP (18,3%) no t0, do
B(a)P (65,4%) no t1, e do IndP no t2 (92,0%), t3 (89,7%) e t4 (89,0%). O consórcio B
81
proporcionou melhores taxas de degradação para do B(a)P no t0 (49,4%) e t1 (77,6%) e do IndP
no t2 (88,6%), t3 (86,2) e t4 (89,6%) (tabela 11; figura 17). Mesmo sendo considerado o HPA
mais tóxico e com elevado potencial mutagênico e carcinogênico (CERNIGLIA, 1992;
JUHASZ; NAIDU, 2000; HARITASH; KAUSHIK, 2009) o B(a)P foi HPA que apresentou mais
rapidamente elevado nível de degradação. A degradação do B(a)P pelos microrganismos é
resultante do crescimento em substratos diferenciados como fonte de carbono que podem induzir
os microrganismos a produzirem enzimas com capacidade de degradar esse composto (PENG et
al., 2008).
Figura 17 - Cromatogramas evidenciando os picos dos HPAs Benzo(k)Fluo - Benzo(k)Fluoranteno, Benzo(b)FluoBenzo(b) Fluoranteno e B(a)P - Benzo(a)Pireno, por meio dos tempos de retenção (22.50, 22,75 e 23.23), das
amostras controle, consórcio A e consórcio B após 24 horas de experimento.
Os HPAs B(k)Fluo, B(b)Fluo e IndP foram mais degradados após 7 dias de experimento
(56,6% e 61,8%, 92,0%) sob atuação do consórcio A. O DibahA e o B(g)P foram mais
degradados após 15 dias (62,9% e 56,7%) com a presença do mesmo consórcio (tabela 11).
Para ambos os consórcios, um período maior de exposição não resultou em maiores taxas
de degradação, ao contrário, culminou em redução nos valores do B(k)Fluo, B(b)Fluo e B(a)P e
permaneceu inalterado para o DibahA, B(g)P e IndP (tabela 11). Assim como proposto por
Nigam e colaboradores (2012) os microrganismos rapidamente adaptados possuem alta
elasticidade metabólica, porém com limites de capacidade de degradação após um determinado
período de exposição ao contaminante.
Esperava-se um padrão de degradação semelhante para os HPAs B(k)Fluo, B(b)Fluo,
B(a)P e DibahA com cinco anéis benzênicos e entre o B(g)P e IndP com seis anéis. Segundo a
literatura quanto maior é o número de anéis, menor é a solubilidade, a volatilidade e maior é a
hidrofobicidade dos HPAs (JUHASZ; NAIDU, 2000). Nesse estudo tal padrão de resposta foi
82
constatado apenas para o B(k)Fluo e para o B(b)Fluo e para o B(b)Fluo e B(a)P após 15 dias do
ensaio de degradação. Para os demais HPA´s foram observadas diferentes taxas de degradação, a
depender do consórcio ao qual fora submetido e do período de tempo do experimento. Ye et al
(1996) obteve constatações semelhantes revelando que após 16 horas de experimento o B(a)P
foi mais degradado pela bactéria Sphingomonas paucimobilis, enriquecida inicialmente com
fluoranteno, em relação ao DibahA, mesmo ambos possuindo cinco anéis benzênicos.
Cerniglia (1992) afirma que a recalcitrância dos HPAs para os microrganismos aumenta
proporcionalmente com o aumento do peso molecular e com o coeficiente de partição octanolágua (log Kow). Em relação ao peso molecular, o IndP é o HPA que apresenta peso molecular
mais elevado e foi o que mais degradou em comparação à amostra controle.
Os parâmetros físico-químicos que mais contribuíram com os níveis de degradação foram
o pH e o Eh. Em todas as amostras t0 e nos controles t1, t2 e t3 o pH manteve-se em torno da
neutralidade, alcançando valores entre 5,1 e 5,6 após 30 dias (figura 18 A(I), A(II) e A(III),
resultados similares foram observados em experimento realizado por Janbandhu e Fulekar
(2011). Tal fato pode ser explicado pelo acúmulo de íons H+ ou outros metabólitos ácidos
resultantes do processo de degradação de alguns HPAs.
Figura 18 - Parâmetros físico-químicos pH acima e Eh abaixo das amostras: (I) – controle, (II) – consórcio A e (III)
– consórcio B, nos intervalos de tempo t0 (2 horas), t1(24 horas), t2(7 dias), t3(15 dias) e t4(30 dias).
O potencial redox (Eh) é o parâmetro utilizado para a mensuração dos teores de oxigênio.
Valores elevados do Eh indicam maiores concentrações de oxigênio (MARIANO, 2006). O Eh
foi o parâmetro que mais variou ao longo do experimento (figura 18 B(I), B(II) e B(III). Assim
como no experimento de Delaune e colaboradores (1981) os maiores valores de Eh foram
observados para as maiores taxas de degradação de HPAs.
83
A Análise dos Componentes Principais (ACP) foi explicada por 97,14% de variância
entre os fatores para o consórcio A (figura 19A(I) e B(I)) e de 94,5% para o consórcio B (figura
19A(II) e B(II). Por meio desta análise os valores apresentados anteriormente foram confirmados
e puderam ser compreendidos de forma mais ampla.
Figura 19 - Análise dos Componentes Principais (ACP), onde A (I) - parâmetros físico-químicos (pH, Eh,
temperatura, condutividade e salinidade) e concentrações dos HPAs B(k)Fluo, B(b)Fluo, B(a)P, B(g)P, IndP e
DibahA) para o consórcio A, A(II) – intervalos de tempo (t0 ,t1, t2, t3 e t4) para o consórcio A, B(I) – parâmetros
físico-químicos e concentração dos HPAs para o consórcio B, e B(II) – intervalos de tempo para o consórcio B.
B(II).
A(I)
B(I)
A(II)
B(II)
Em ambos os consórcios os níveis de degradação apresentados para todos os HPAs não
foram influenciados por nenhum parâmetro físico-químico específico. Com exceção do IndP, sob
84
atuação do consórcio B, que está agrupado no t2, todos os demais compostos foram igualmente
agrupados no t3 (após 15 dias de experimento), existindo outros fatores que não estão abordados,
influenciando tal relação. Tal constatação reforça os dados anteriormente expostos, estando os
tempos relacionados aos agrupamentos correspondentes aos períodos onde maiores taxas de
degradação foram observados. A capacidade dos microrganismos em degradar HPAs de alto
peso molecular não é resultado apenas de sua biodisponibilidade, associada aos parâmetros
físico-químicos, mas principalmente ao sinergismo metabólico existente entre os diferentes
microrganismos (BOUCHEZ et al., 1999; VAN HERWIJNEN et al., 2003).
Nos dois ACPs semelhanças relacionadas com o agrupamento das amostras nos
diferentes períodos de tempo e os parâmetros influenciadores foram observadas. Os principais
fatores que influenciaram o agrupamento dos casos e das variáveis estão representados nas
tabelas 21 a 24 do apêndice 3.
5.4 CONCLUSÕES
O IndP foi o HPA que obteve os maiores níveis de degradação (92,0%) com atuação do
consórcio A após 7 dias de experimento. Nesse mesmo período esse consórcio proporcionou
uma redução de 56,6% para o B(k)Fluo, 61,8% para o B(b)Fluo, 60,0% para o B(a)P, 62,5% para
o DibahA e de 56,0% para o B(g)P. O Eh foi o parâmetro de destaque durante os ensaios de
degradação, influenciando o agrupamento das amostras submetidas ao t2 (após 7 dias) e no t4
(após 30 dias).
O consórcio B proporcionou rápidas reduções nas concentrações de todos os HPAs após
2 horas e 24 horas de experimento, colaborando com elevados níveis de degradação após 30 dias.
Ao final do experimento o consórcio B foi responsável pela degradação de 53,2% do B(k)Fluo,
56,5% do B(b)Fluo, 51,9% do B(a)P, 62,1% do DibahA e 56% do B(g)P. O IndP foi o composto
também sofreu consideráveis taxas de degradação pelo consórcio B (89,7%).
Após 7 dias de experimento, intervalos de tempos superiores não proporcionaram
aumento significativo nos níveis de degradação, sugerindo que após esse período de exposição
ao contaminante o metabolismo dos microrganismos manteve-se constante.
Considerando a rápida capacidade de adaptação e pela maior potencial de degradação
após 30 dias de experimento o consórcio B foi considerado o mais promissor na biorremediação
de HPAs de alto peso molecular.
85
5.5 AGRADECIMENTOS
Aos integrantes do LEMA, do LEPETRO e do LFNA pelo auxílio nas análises
geoquímicas. A FAPESB pela concessão da bolsa de mestrado.
5.6 REFERÊNCIAS
AFUWALE, C; MODI, H. A. Study of bacterial diversity of crude oil degrading bacteria isolated
from crude oil contaminated sites. Life sciences leaflets, v. 6, p.13-23, 2012.
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89
6 CONCLUSÃO
Com o uso de fontes de carbono a 1% de petróleo, óleo diesel ou gasolina um número
significativo de microrganismos foi isolado dos sedimentos de manguezais próximos aos setores
da cadeia produtiva do petróleo na Baía de Todos os Santos (BTS); e em menor número de área
sem atividade relacionada no extremo Sul do Estado, nas margens do rio Jequitinhinha (RJ) . A
região de refino obteve um maior número de isolados (105), seguido da de transporte (95) e de
produção (89). A temperatura, a salinidade e os teores de matéria orgânica foram os parâmetros
que mais influenciaram a distribuição apresentada para a BTS, sendo as bactérias os
microrganismos predominantes, principalmente quando o petróleo foi adicionado como única
fonte de carbono e energia. Esse resultado associado aos ensaios de seleção demostraram o
potencial dos microrganismos da BTS em degradar hidrocarbonetos em 24 horas, indicando a
versatilidade metabólica e uma pré-adaptação ao uso de componentes do petróleo decorrentes de
derrames acidentais inerentes às atividades do setor petrolífero.
Os ensaios de degradação com os dois consórcios pré-selecionados juntamente com as
análises cromatográficas com espectrômetro de massas (CG/EM) das amostras de óleo
degradadas, revelaram que os microrganismos possuem potencial para a degradação dos nalcanos de cadeia longa (C18 a C32) e dos HPAs de alto peso molecular em experimentos de
biorremediação.
Cada consórcio apresentou preferência na degradação de compostos diferenciados a
depender do período de experimento. Os n-alcanos foram preferencialmente degradados pelo
consórcio A (cepas MD04p (81), DJ02p (102), C06p (128), DJ02p (47) e C06p (67)) com
capacidade de degradação de 100% dos compostos acima do C28 após 7 dias de experimento (t2).
Esse consórcio proporcinou maiores taxas de degradação em um curto período de tempo (t0 – 2
horas e t1 – 24 horas), atingindo níveis acima de 90,3% para compostos a partir do C19 após 30
dias de experimento.
Em relação aos HPAs de alto peso molecular, o consórcio com maiores níveis de
degradação foi o B (cepas MD04p (81), DJ02p (100), C06p (116), DJ02p (47) e C06p (67)),
contribuindo com reduções de 35,0%, 59,4% e 61,8% para os HPAs B(k)Fluo, B(b)Fluo e B(a)P
após 24 horas e de 53,2%, 56,6%, 51,9%, 62,1%, 56,0% e 89,7% para o B(k)Fluo, B(b)Fluo,
B(a)P, DibahA, B(g)P e IndP após 30 dias.
Tanto para os n-alcanos quanto para os HPAs a partir de 7 dias de experimento os
compostos foram significativamente reduzidos sob a ação dos dois consórcios. Intervalos de
90
tempo maiores contribuíram com acentuadas reduções nos picos nos n-alcanos em relação aos
controles. Para os HPAs, tempos superiores a 7 dias não determinaram aumentos significantes na
degradação dos compostos.
Os resultados demostraram que tanto o consórcio A quanto o consórcio B podem ser
utilizados em experimentos voltados à remediação de áreas impactadas por atividades
petrolíferas tanto isoladamente quanto de forma conjunta até a completa degradação dos
contaminantes.
Os resultados apresentados por esse trabalho tratam-se de dados iniciais para pesquisas
voltadas à biorremediação de áreas da Baía de Todos os Santos impactadas por atividades da
cadeia produtiva do petróleo.
São necessários estudos mais aprofundados a fim de compreender de forma mais ampla
os processos envolvidos da degradação dos n-alcanos de cadeia longa e dos HPAs de alto peso
molecular, como por exemplo: a) Identificação dos microrganismos pertencentes aos dois
consórcios bacterianos por frações do petróleo; b) Estudo das vias e transformações metabólicas
envolvidas na degradação de compostos específicos por técnicas de biologia molecular; c)
Comparação da degradação dos compostos de petróleo por uma única espécie de microrganismo
e pelos consórcios; d) Estudo da presença de biossurfactantes envolvidos no processo de
degradação de petróleo; e) Aplicação do experimento de biodegradação de petróleo em campo a
fim de comparar a eficiência atingida em laboratório.
Estes são apenas alguns dos exemplos de pesquisas que poderão ser desenvolvidas
tomando como base os microrganismos que foram isolados. Ainda podem ser utilizados estudos
específicos de outras fontes de carbono ou mesmo os demais microrganismos (bactérias e
leveduras) que não compõem os consórcios, mas que estão armazenados.
Espera-se ampliar o estudo em questão e que demais pesquisadores tenham o interesse
em utilizar os dados ou os microrganismos para pesquisas relacionadas com a referida temática.
Os resultados apresentados por esse trabalho tratam-se de dados iniciais para pesquisas
voltadas à biorremediação de áreas da Baía de Todos os Santos impactadas por atividades da
cadeia produtiva do petróleo.
São necessários estudos mais aprofundados a fim de compreender de forma mais ampla
os processos envolvidos da degradação dos n-alcanos de cadeia longa e dos HPAs de alto peso
molecular, como por exemplo: a) Identificação dos microrganismos pertencentes aos dois
consórcios bacterianos por frações do petróleo; b) Estudo das vias e transformações metabólicas
envolvidas na degradação de compostos específicos por técnicas de biologia molecular; c)
Comparação da degradação dos compostos de petróleo por uma única espécie de microrganismo
91
e pelos consórcios; d) Estudo da presença de biossurfactantes envolvidos no processo de
degradação de petróleo; e) Aplicação do experimento de biodegradação de petróleo em campo a
fim de comparar a eficiência atingida em laboratório.
Estes são apenas alguns dos exemplos de pesquisas que poderão ser desenvolvidas
tomando como base os microrganismos que foram isolados. Ainda podem ser utilizados estudos
específicos de outras fontes de carbono ou mesmo os demais microrganismos (bactérias e
leveduras) que não compõem os consórcios, mas que estão armazenados.
Espera-se ampliar o estudo em questão e que demais pesquisadores tenham o interesse
em utilizar os dados ou os microrganismos para pesquisas relacionadas com a referida temática.
92
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102
APÊNDICE 1
REVISÃO DE LITERATURA
Esta revisão visa ampliar a discussão sobre aspectos relevantes ao trabalho exposto e que
não foram contempladas devido aos limites estabelecidos para este.
1.1 Derrames acidentais de petróleo e seus derivados
Desde a década de 70 são relatados diversos acidentes envolvendo derrame de petróleo e
seus derivados no Brasil e no mundo (quadro 5). Os derrames acidentais decorrentes das
atividades da indústria petrolífera podem ocorrer desde a fase de exploração até a
comercialização dos petroderivados, podendo culminar com a contaminação de solos, rios e
demais ambientes costeiros (SILVA, 2009; ANDRADE et al., 2010).
Quadro 5 - Local e data dos dez principais acidentes envolvendo derramamento de petróleo no mundo e no Brasil
Acidente
Mundo
Argo Merchant
Massachusetts
1976
Amoco Cádiz
França
1978
Ixtoc I
Burmagah Ágata
Exxon Valdez
Megaborg
Barge Cibro Savannah
Guerra do Golfo
Barge Bouchard 55
Horizon Deepwater
México
Golfo do México
Alasca
Texas
New Jersey
Golfo Pérsico
Flórida
Golfo do México
1979
1979
1989
1990
1990
1991
1993
2010
7,7 milhões de litros de óleo
combustível
68,7 milhões de galões de
petróleo
140 milhões de litros óleo
7,8 milhões de litros de óleo
270.00 barris de petróleo
5,1 milhões de litros de petróleo
170 mil litros de óleo
6-8 milhões de barris de petróleo
336 mil litros de óleo combustível
8.000 barris de petróleo/dia
Baía de Guanabara
Tramandaí
Rio Barigui e
Iguaçu
São Sebastião
Bacia de Campos
Bacia de Campos
Baía de Paranaguá
São Sebastião
2000
2000
2000
1.300 m3 de óleo
18 m3 de óleo
4.000 m3 de óleo
2000
2001
2001
2001
2004
86 m3 de óleo
1.300 m3 de óleo
124 m3 de óleo
5.000 m3 de óleo
235 m3 de óleo
Baía de Paranaguá
2004
Bacia de Campos
2011
1000 m3 de metanol/ 5.000 m3 de
óleo
200 a 330 barris de petróleo/dia
Brasil
Oleoduto REDUC
Transporte marítimo
Rompimento de
oleoduto
N/T Vergina
Plataforma P36
Plataforma P7
Navio Norma
Oleoduto São
Sebastião
Navio Vicuña
Plataforma SEDCO
2006
Local
Ano
Quantidade derramada
Fonte: CETESB, 2008 apud PARREIRA 2008; ANP, 2012; NOAA, 2012
103
O impacto causado pelos petroderivados nos ecossistemas depende do tipo de poluente,
da quantidade derramada, toxicidade, padrão de deposição e tempo de retenção. Os
contaminantes presentes são classificados de acordo com o seu potencial de biodegradabilidade,
recalcitrância e comportamento no meio ambiente (ANTIZAR-LADISLAO, 2010).
Em um acidente ou na ocorrência de um derramamento de óleo, as primeiras medidas a
serem adotadas são a remoção física, como remoção mecânica ou química, como o uso de
surfactantes. A biorremediação normalmente é realizada em uma fase posterior transformando o
contaminante em compostos menos tóxicos ou até mesmo mineralizando completamente em
água e CO2 (PEREIRA et al., 2009).
O processo de biorremediação é uma tecnologia que utiliza microrganismos autóctones
(nativos) ou introduzidos para remover, reduzir ou mineralizar os contaminantes recalcitrantes
presentes no meio ambiente. Pesquisadores atuais têm estudado intensamente o procedimento de
biorremediação indicando-o como uma alternativa viável e eficaz para a descontaminação de
ambientes contaminados (CRAPEZ et al., 2002)
Durante a biodegradação os microrganismos estabelecem um contato entre a superfície
celular e o óleo para em seguida metaboliza-lo em seu interior (figura 20) (WETLER-TONINI et
al., 2010).
Figura 20 – Degradação de petróleo por microrganismos
Fonte: Adaptado de Head et al.(2006).
No ambiente natural a população microbiana capaz de degradar compostos tóxicos é
reduzida. Devido a este fato a taxa de degradação dos poluentes torna-se lenta já que a população
de microrganismos não aumenta proporcionalmente em relação à introdução dos contaminantes
ao meio ambiente (GARCÍA-RIVERO; PERALTA-PÉREZ, 2008).
104
A diversidade de substratos existentes em ambientes impactados por petróleo faz com
que os microrganismos possuam diferentes vias metabólicas possíveis para a assimilação dos
hidrocarbonetos (WETLER-TONINI et al., 2011).
Na degradação aeróbica de hidrocarbonetos, a exemplo dos alcanos, o oxigênio é
utilizado como um reagente para a ativação da molécula, com o auxílio das enzimas
monooxigenases. Normalmente o processo de biodegradação dos n-alcanos inicia com a
oxidação do grupo metil terminal, transformando-o em um álcool primário, posteriormente em
um aldeído e por fim em um ácido graxo. Os ácidos graxos são então convertidos à CoA e por
um processo de β – oxidação passam a gerar acetil-CoA (figura 21) (VAN HAMME et al., 2003;
ROJO, 2009).
Figura 21– Vias de degradação aeróbica de alcanos
Legenda: AH – alcano hidroxilase; AD – álcool desidrogenase; ALD – aldeído desidrogenase; ACS – acetil CoA
sintetase; ω –H – ω – hidroxilase; BVM – Baeyer Villiger monooxigenase; E – esterase; TCA – ácido tri
carboxílico. Fonte: Modificado de Rojo (2009).
1.2 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs)
Atualmente existem mais de 100 HPAs reconhecidos pela IUPAC (International Union of
Pure and Applied Chemistry), porém, devido ao seu interesse industrial, toxicológico e ambiental
somente 16 considerados são considerados prioritários pela Agência de Proteção Ambiental dos
Estados Unidos (USEPA), sendo possíveis causadores de câncer em seres humanos (quadro 6 e
figura 22) (POTIN et al., 2004; COSTA, 2006).
105
A introdução dos HPAs no meio ambiente se dá por meio de fenômenos naturais, como
queimadas de florestas e erupções vulcânicas; pirólise de matéria orgânica proveniente de
atividades antropogênicas, além da combustão incompleta de combustíveis fósseis. A
distribuição dos HPAs no meio ambiente bem como seus efeitos nos organismos vivos, é
determinada pelo número de anéis e pelo peso molecular. A solubilidade, volatilidade e
reatividade química dos HPAs são inversamente proporcionais ao aumento do peso molecular
(SEO et al., 2009; SISMARRO et al., 2010; CELINO et al., 2012). Volatilização, foto-oxidação,
oxidação química, sedimentação, bioacumulação e biodegradação são alguns dos destinos
ambientais dos HPAs (CERNIGLIA, 1992).
Quadro 6 - 16 HPA’s prioritários da USEPA e seus respectivos potenciais carcinogênicos, genotoxicos e
mutagênicos.
HPA
Naftaleno (Naf)
Acenatfileno (Ac)
Acenafteno (Ace)
Fluoreno (Fl)
Antraceno (A)
Fenantreno (Fe)
Fluoranteno (Fluo)
Pireno (Pi)
Benzo(a)antraceno (BaA)
Criseno (Cri)
Benzo(k)fluoranteno (BkFluo)
Benzo(b)fluoranteno
(BbFluo)
Benzo(a)pireno(BaP)
Benzo(g,h,i)perileno (BgP)
Indeno(1,2,3-c,d)pireno (IndP)
Dibenzo(a,h)antraceno (DiBahA)
Carcinogenicidade
I
NC
I
NC
NC
Suf
L
Suf
Suf
Genotoxicidade
L
NC
L
L
L
Suf
L
I
I
Mutagenicidade
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
Suf
I
Suf
Suf
Suf
I
I
Suf
(+)
(+)
(+)
(+)
Legenda: Suf – suficiente; I – insuficiente; L – limitado; NC – não caracterizado; (+) mutagenicidade positiva; (-) –
mutagenicidade negativa. Fonte: Adaptado de Costa (2006)
106
Figura 22 – Estrutura química e peso molecular (m/z) dos 16 HPA’s prioritários pela USEPA por ordem crescente
de recalcitrância.
Fonte: Cerniglia (1999); Costa (2006).
Nos sedimentos de manguezais, vários são os fatores influenciadores do grau de
contaminação por compostos tóxicos, como: fonte e tipo de poluição, propriedades físicoquímicas e proximidade com atividades antropogênicas (GUO et al., 2005).
Comparado aos demais compostos orgânicos presentes em solos e sedimentos, os HPAs
são mais recalcitrantes e mais difíceis de serem removidos por técnicas de limpeza
convencionais. A remoção do contaminante por meio de escavação, isolamento ou incineração
são medidas normalmente adotadas para a remoção de HPAs de sedimento, porem além de não
apresentarem custo benefício satisfatórios podem acabar por transferir o poluente para outro
compartimento ambiental (HARITASH; KAUSHIK, 2009).
Referências
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<http://www.anp.gov.br/?pg=58635&m=acidente&t1=&t2=acidente&t3=&t4=&ar=0&ps=1&ca
chebust=1330781875618>. Acesso em: 03 mar.2012.
ANDRADE, J. A; AUGUSTO, F; JARDIM, I. C. S. F. Biorremediação de solos contaminados
por petróleo e seus derivados. Eclética química, v. 35, n. 3, p. 17-43, 2010.
107
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CELINO, J. J; CORSEUIL, H. X; FERNANDES, M; HADLICH, G. M. Persistent toxic
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n.4, p. 141-149, 2012.
CERNIGLIA, C. E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation, v.3,
p. 351-368, 1992.
COSTA, A. B. Caracterização molecular e isotópica de material orgânico em sedimentos da
Baía de Todos os Santos – BA. 2006, 124f. Tese (doutorado em geofísica). Universidade
Federal da Bahia, Salvador – BA, 2006.
CRAPEZ, M. C; BORGES, A. L. N; Bispo, M. G. S; PEREIRA, D. C. Tratamento para
derrames de petróleo: biorremediação. Ciência hoje, v. 30, n. 179, p. 33-37. 2002.
GARCÍA-RIVERO, M; PERALTA-PÉREZ, M. R. Cometabolismo em la biodegradación de
hidrocarburos. Revista mexicana de ingeniería química, v. 7, n. 1, p.1-12, 2008.
GUO, C. L; ZHOU, H. W; WONG, Y. S; TAM, N. F. Y. Isolation of PAH-degrading bacteria
from mangrove sediments and their biodegradation potential. Marine pollution bulletin, v. 51,
p. 1054-1061, 2005.
HARITASH, A. K; KAUSHIK, C. P. Biodegradation aspects of Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons (PAHs): A review. Journal of hazardous materials, v. 169, p. 1-15, 2009.
HEAD, I.M; JONES, D. M; RÖLING, W. F. M. Marine microorganisms make a meal of oil.
Nature reviews, v. 4, p. 173-182, 2006.
NATIONAL OCEANIC AND ATMOSPHERIC ADMINISTRATION . National Ocean
Service. Incident news. Office of response and restoration. National ocean servisse. Disponível
em: <http://www.incidentnews.gov/famous>. Acesso em: 04 mar. 2012.
PARREIRA, V. X. Modelagem da trajetória da pluma de óleo para derramamentos da
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Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, 2008.
PEREIRA, N. J; GOMES, E. B de; SORIANO, A. U. Biodegradação de hidrocarbonetos.
Séries em biotecnologia.1ª ed. v.03. Rio de Janeiro, 76p. 2009.
POTIN, O; RAFIN, C; VEIGNIE, E. Bioremediation of na aged polycyclic aromatic
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ROJO, F. Degradation of alkanes by bacteria. Enrironmental microbiology, v. 11, n.10, pg.
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108
SILVA, L. J. Processo de landfarming para o tratamento de resíduos oleosos. 2009. 91f.
Dissertação (mestrado em Ciências), Escola de Química da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro – RJ, 2009.
SISMARRO, R. GONZÁLEZ, N; BAUTISTA, L. F; SANZ, R; MOLINA, M. C. Optimisation
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WETTLER-TONINI, R. M. C; REZENDE, C. E de; GRAVITOL, A. D. Biodegradação
bacteriana de petróleo e seus derivados. Revista virtual de química, v.3, n.2, p. 78-87, 2011.
109
APÊNDICE 2
MATERIAIS E MÉTODOS
Estão exclusivamente contemplados os procedimentos adotados para a desidratação das
amostras, realizado anteriormente às análises geoquímicas.
2.1Desidratação
Os procedimentos de desidratação das amostras foram realizados primeiramente para
cessar o metabolismo bacteriano, já que as bactérias sobrevivem na interface óleo água (ATLAS,
2011; PETERS et al., 2005) bem como para não criar resultados duvidosos em relação à
degradação, já que alguns compostos são solúveis em água, podendo gerar um resultado falso
positivo e também para não danificar o sistema de funcionamento do cromatógrafo a gás
posteriormente utilizado para a avaliação dos resultados.
2.1.1 Preparação das amostras
Com o auxílio de uma pipeta graduada estéril retirou-se o excesso do conteúdo hídrico
presente nos frascos Erlenmeyers. Os frascos contendo as amostras com o óleo mais concentrado
e resquícios de água foram acondicionados em caixas de isopor contendo gelo e destinados ao
Laboratório de Estudos do Petróleo – LEPETRO, da Universidade Federal da Bahia (UFBA)
para a realização das desidratações.
Todas as vidrarias utilizadas foram lavadas e permaneceram em banho de extran a 5%
durante 24 horas. Posteriormente foram enxaguadas com água destilada e secas em estufa a
100ºC até a garantia de estarem completamente secas. Em seguida as vidrarias foram limpas com
diclorometano (DCM), Merck.
2.1.2 Desidratação antes da formação dos consórcios bacterianos
As amostras de óleo contendo as cepas selecionadas foram desidratadas em pipetas de
Pasteur. Na base da pipeta foi acondicionada uma pequena quantidade de lã de vidro e o restante
do interior foi preenchido com 6cm de sulfato de sódio anidro, previamente ativado em forno
Mufla a 500ºC durante 1 hora. Em um vial limpo e descontaminado com diclorometano pesou-se
110
cerca de 10mg da amostra de óleo a ser desidratada. Calculou-se a quantidade de diclorometano
necessária para a obtenção da concentração de 0,05mg de amostra/ µL de diclorometano e
padronizou-se todas as amostras na mesma concentração. Com o uso do diclorometano (DCM),
Merck P.A. As amostras foram então eluídas ao longo da pipeta e após serem desidratadas foram
coletadas em um vial anteriormente pesado (figura 23).
Figura 23 – Amostras de óleo desidratadas em pipetas de Pasteur
2.1.3 Desidratação após os ensaios de degradação
Após a retirada do excesso de água presente nos frascos Erlenmeyers submetidos aos
ensaios de degradação em cultura líquida, as amostras de óleo foram transferidas para tubos de
centrífuga com diclorometano e centrifugadas a 2000 rpm durante 15 minutos (figura 24A).
Duas fases foram formadas, a fase orgânica que permaneceu no fundo do frasco e inorgânica
(água) a qual foi descartada (figura 24B).
Cerca de 100mg da amostra de óleo foi pesada em um vial de vidro. Posteriormente foi
adicionado DCM P.A ISO ACS, marca Merck, em volume suficiente para atingir uma
concentração de 0,05 mg de amostra por µL de DCM. A amostra foi então sonicada em banho
ultrassônico, marca UNIQUE durante 10 minutos, para forçar o rompimento das borbulhas de
água e obter uma desidratação mais eficaz. Os demais procedimentos foram executados da
mesma forma acima relatada.
A fim de confirmar a eficiência do processo de desidratação foram escolhidas
aleatoriamente 20% das amostras para a realização de duplicatas. Foram também retiradas
microfotografias das amostras de óleo controle, consórcio A e consórcio B após 30 dias do
111
ensaio de degradação, por meio do microscópio OLYMPUS, modelo ACH com aumento da
objetiva de 5 vezes.
Figura 24 – Procedimentos de desidratação. (A) Centrífugação a 2000 rpm durante 15 minutos, (B) – Separação das
frações orgânicas e inorgânicas, destaque para a água na parte superior da amostra após a centrifugação.
REFERÊNCIAS
ATLAS, R. Oil biodegradation and bioremediation: A tale of the two worst spills in U.S history.
Environmental science and technology, v. 45, p. 6709-6715, 2011.
PETERS, K. E; WALTERS, C. C; MOLDOWAN, J. M. The biomarker guide: biomarkers
and isotopes in petroleum exploration and earth history. 2. Ed. Cambridge: Cambridge
University press, 2005.
112
APÊNDICE 3
RESULTADOS
Estão relatados os resultados provenientes das etapas de caracterização dos
microrganismos contemplados no estudo bem como tabelas contendo dados brutos e fotografias
que não foram citadas.
3.1 Caracterização bioquímica e morfotintorial dos microrganismos selecionados
A caracterização bioquímica e morfotintorial de cada colônia selecionada estão
representadas nas tabelas 12 e 13. Ao chegarem à UFPE notou-se que três cepas MD04p (111),
DJ02p (47) e CN06p (116) apresentavam 2 colônias distintas em uma mesma placa. Mesmo após
vários repiques consecutivos não foi possível realizar o isolamento. Devido à forte associação
apresentada, acredita-se tratar de um caso de associação entre as cepas. Nenhuma prova
bioquímica foi executada para as cepas tidas como contaminadas.
A coloração de Gram revelou a existência de 05 bactérias caracterizadas como bacilos
Gram positivos, 05 cocos Gram positivos e apenas 01 bacilo Gram negativo. Pesquisas revelam
que os bacilos Gram negativos, como por exemplo, os pertencentes ao gênero Pseudomonas são
os que mais contribuem com a degradação de hidrocarbonetos de petroderivados, porém outros
estudos também revelam um considerável número de cocos ou bacilos Gram positivos
participantes do processo de biorremediação (AFUWALE; MODI, 2012).
Devido
às
dificuldades apresentadas para a identificação de bactérias ambientais por meio de técnicas
bioquímicas tradicionais apenas a cepa CN06p (67) foi identificada como Enterobacter
gergoviae (figura 25). Em um derrame de óleo alguns dos principais gêneros bacterianos
encontrados como degradadores das diferentes frações são Acidovorans, Acinetobacter,
Aeromonas, Bacillus, Miccococcus, Nocardia, Pseudomonas, entre outros (CRAPEZ et al.,
2002).
113
Tabela 12 – Características morfotintoriais e de crescimento apresentadas pelas bactérias selecionadas
Cepa
DJ01p (09)
Agar Tioglicolato
Crescimento na
superfície e
microaerófilo
Crescimento na
superfície
Agar EMB
-
Gram
Bacilos Gram (+)
-
Cocos Gram (+)
DJ02p (107)
Crescimento na
superfície
-
Bacilos Gram (+)
CN06p (115)
Crescimento na
superfície
-
Bacilos Gram (+)
CN06p (118)
Crescimento abaixo da
superfície
-
Bacilos Gram (+)
MD04p (136)
Crescimento na
superfície
-
Cocos Gram (+)
DJ02p (100)
Crescimento na
superfície
-
Cocos em tétrade
Gram (+)
DJ02p (102)
Crescimento na
superfície
-
Bacilos Gram (+)
MD04p (81)
Crescimento abaixo da
superfície
-
Cocos em tétrade
Gram (+)
CN06p (67)
Crescimento em toda a
extensão
Crescimento
seco, escuro e
sem brilho
metálico
Bacilos Gram (-)
CN05p (128)
Crescimento na
superfície
-
Cocos Gram (+)
DJ02p (46)
Características
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Colônias incolores
Colônias alaranjadas
com pouco
crescimento
Legenda: n.r – não realizado; DJ – Dom João; MD – Madre de Deus; CN – Candeias; 01,02,04,05 e 06 – pontos de
coleta de onde as cepas foram isoladas; p - petróleo
114
Tabela 13 – Características bioquímicas apresentadas pelas bactérias selecionadas
Cepa
TSI
C
M
U
I
C.O
SA
SO
TR
AR
n.r
M
A
n.r
H2S
n.r
CAT
.
+
DJ01p
(09)
DJ02p
(46)
DJ02p
(107)
CN06p
(115)
CN06p
(118)
MD04p
(136)
DJ02p
(100)
DJ02p
(102)
MD04p
(81)
CN06p
(67)
C05p
(128)
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
+
-
+
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
-
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
al/al
+
-
-
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
v
+
-
ac/ac
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
-
Alc/al
c
+
-
+
-
-
n.r
n.r
n.r
n.r
n.r
+
-
-
Legenda: al/al – pico alcalino e fundo alcalino; ac/ ac – pico ácido e fundo ácido; C – citrato; M – motilidade; U –
uréia; I – indol; C.O – citrato oxidase; SA – sacarose; SO– sorbitol; TR – trealose; AR – arabnose; CAT – catalase;
n.r – não realizado
Figura 25 - Microfotografia da cepa bacteriana (C06p(67)) identificada como Enterobacter gergoviae (aumento de
40x).
115
3.2 Cromatografia gasosa das amostras de óleo submetidas aos ensaios de seleção
Por meio da cromatografia gasosa (CG/ FID), visualizou-se no fingerprints do óleo
original (figura 26A) uma leve degradação em relação ao controle abiótico (figura 26B). Nota-se
no controle um leve aumento na abundância molecular dos n-alcanos (C8-C40) e uma ligeira
elevação da MCNR (Mistura complexa não resolvida).
Figura 26 - Fingerprints das amostras de óleo original (A) e do controle abiótico(B)
Das 15 cepas selecionadas apenas 14 foram tiveram as amostras de óleo correspondentes
avaliadas por meio da cromatografia gasosa (CG). A análise das amostras por meio do whole oil
permitiu a visualização de fingerprints distintos para cada cepa avaliada, indicando diferentes
graus de degradação. Mesmo tendo sido identificada a existência de associações bacterianas nas
três cepas anteriormente citadas resolveu-se utilizá-las para a avaliação dos fingerprints devido
ao potencial de degradação apresentado, considerando, pois a denominação de apenas um
isolado.
A seleção das cepas para a composição dos consórcios foi realizada através do estudo
qualitativo dos graus de degradação por meio dos perfis cromatográficos. Os fatores que
corroboraram para tal decisão foram: abundância molecular de n-alcanos, disposição dos picos
de n-alcanos degradados e tamanho da MCNR. Das cepas avaliadas 50% não apresentaram os
parâmetros suficientes para a formação dos consórcios, porém, devido ao potencial de
degradação anteriormente indicado e pelas características dos seus perfis cromatográficos, são
passíveis de serem utilizadas em demais estudos relacionados com biorremediação de áreas
impactadas por atividades petrolíferas.
Na figura 27 estão representados os fingerprints das amostras de óleo cujas cepas não
foram utilizadas para a formação dos consórcios. A denominação das cepas bacterianas foi
baseada na localidade onde foi isolada (DJ- Dom João, MD – Madre de Deus e CN – Candeias),
116
no ponto onde a amostra para o isolamento foi inicialmente coletada (02, 04, 05 e 06) e p
(petróleo utilizado como fonte de carbono).
Figura 27 - Perfil de n-alcanos e fingerprints das amostras selecionadas que não foram utilizadas para a formação
dos consórcios hidrocarbonoclásticos. A – DJ01p(09); B – DJ02p(46); C – DJ02p(107); D – MD04p(111); E –
CN06p(115); F – CN06P (118) e G – MD04P (136).
117
Sete cepas bacterianas foram indicadas para a formação dos consórcios (figuras 28 a 30).
A escolha das cepas para a formação de cada consórcio baseou-se na abrangência dos picos ao
longo do fingerprint, visando uma degradação mais eficiente ou mesmo uma completa
mineralização do petróleo. Nas figuras 28 a 30 os fingerprints das cepas estão representados de
acordo com a área de estudo onde foram inicialmente isoladas, sendo: DJ – área de produção de
petróleo; MD – região caracterizado pelo transporte de petroderivados; CN – localidade
influenciada por atividades de refino.
Figura 28 – Fingerprints das amostras de óleo contendo as cepas (A) - DJ02p(47), (B) - DJ02p(100) e (C) DJ02p(102), isoladas do campo de Dom João em São Francisco do Conde.
Figura 29 – Fingerprint da amostra contendo a cepa MD04p(81) isolada do terminal porturário TEMADRE em
Madre de Deus.
118
Figura 30 – Fingerprints das amostras (A) - CN06p(67),(B) - C06p(116) e (C) - C06p(128) isoladas nas
proximidades da RLAM, em Candeias.
Após a execução de todos os procedimentos laboratoriais, todas as bactérias isoladas
foram armazenadas em duplicata em tubos de reação de 2,0mL, com 10% de glicerol estéril para
a utilização em ensaios futuros caso seja necessário.
3.3 Ensaios de Degradação
Na figura 31 estão representados os aspectos visuais dos frascos Erlenmeyers das
amostras de óleo submetidas aos ensaios de degradação. As amostras correspondentes ao t4 não
estão representadas, porém não houve diferença em relação ao t3.
119
Figura 31 – Aspecto visual dos frascos Erlenmeyers das amostras controle (I), consórcio A (II) e consórcio B (III)
em cultura líquida nos diferentes períodos de tempo de experimento. (A) - t0, (B) - t1, (C) - t2 e (D) – t3
3.4 Desidratação das amostras de óleo submetidas à ação dos consórcios
Por meio das microfotografias nota-se a presença de várias gotas de água nas amostras de
óleo após os ensaios de degradação, formando emulsões óleo-água ou óleo – água- óleo (figura
32E).
As microfotografias das amostras de óleo revelaram que o procedimento de desidratação
foi satisfatório, não sendo visualizada a presença de água nas amostras que foram desidratadas
(figuras 32B, D e F).
120
Figura 32 - Microfotografias as amostras de óleo t4 controle, t4 consórcio A e t4 consórcio B. (A), (C) e (E) – antes
das desidratações e (B), (D) e (F) após as desidratações.
3.5 Cromatografia líquida
Conforme mencionado no artigo 2, em todas as amostras a fração dos hidrocarbonetos
saturados correspondeu a mais de 50% dos componentes do petróleo (figura 33). Nas tabelas 14
a 19 estão mencionadas as massas de óleo inicialmente pesadas, a massa total recuperada, a
média entre os percentuais das frações SAT, ARO e NSO e erro percentual para as amostras de
121
óleo, controle, consórcio A e consórcio B nos tempos t0, t1, t2, t3 e t4. Os cromatogramas de
distribuição dos n-alcanos (C18-C32) e dos hopanos, presentes nas amostras de óleo estão
representados nas figuras 33 e 34.
Figura 33 - Diagrama ternário das massas das frações SAT, ARO e NSO do óleo original e dos controles (atenuação
natural) das amostras de óleo submetidas aos ensaios de degradação em duplicata e dos consórcios bacterianos A e
B (bioaumento) em triplicata nos tempos amostrais t0, t1, t2, t3 e t4.
(B)
(A)
Óleo
Tabela 14 - Massa inicial, recuperada e percentual das frações SAT, ARO e NSO das amostras de óleo original.
AMOSTRA
Massa
Óleo(g)
Massa total
recuperada (g)
Óleo (1)
0,0203
Óleo (1.1)
0,0201
Massa
SAT
recuperada (%) (%)
ARO
(%)
NSO
(%)
Massa
Total
0,0183
90,15
57,38
19,67
22,95
100,00
0,0185
92,04
55,14
22,16
22,70
100,00
Média
56,26
20,92
22,83
100,00
(%) erro
3,99
-11,90
1,09
122
Tabela 15 - Massa inicial, recuperada e percentual das frações SAT, ARO e NSO das amostras de óleo controle,
consórcio A e consórcio B submetidas aos ensaios de degradação no tempo t0 (2 horas)
AMOSTRA
Massa Massa total
Óleo (g) recuperada (g)
Massa
recuperada (%)
SAT
(%)
ARO
(%)
NSO
(%)
Massa
Total
t0 Controle (1)
0,0203
t0 Controle (2)
0,0200
0,0166
81,8
60,24
18,07
21,69
100,00
0,0147
73,4
60,67
18,88
20,45
100,00
Média
60,45
18,48
21,07
100,00
(%) erro
-0,71
-4,38
5,87
100,00
t0 Consórcio A (1) 0,0203
t0 Consórcio A (2) 0,0202
0,0167
82,3
58,08
19,16
22,75
100,00
0,0160
79,2
60,62
19,37
20,00
100,00
t0 Consórcio A (3) 0,0200
0,0161
80,5
57,76
21,74
20,50
100,00
Média
58,82
20,09
21,08
100,00
(%) erro
0,37
-8,40
6,96
100,00
t0 Consórcio B (1) 0,0203
t0 Consórcio B (2) 0,0203
0,0163
80,3
61,35
18,40
20,25
100,00
0,0193
95,2
60,56
18,22
21,22
100,00
t0 Consórcio B (3) 0,0204
0,0187
91,4
58,45
21,72
19,84
100,00
Média
60,12
19,45
20,44
100,00
(%) erro
3,23
-11,00
1,35
100,00
Tabela 16 - Massa inicial, recuperada e percentual das frações SAT, ARO e NSO das amostras de óleo controle,
consórcio A e consórcio B submetidas aos ensaios de degradação no tempo t1 (24 horas).
AMOSTRA
Massa
Óleo (g)
Massa total
recuperada (g)
t1 Controle (1)
0,0200
0,0188
t1 Controle (2)
0,0200
0,0179
Massa
recuperada (%)
SAT
(%)
ARO
(%)
NSO
(%)
Massa
Total
94,0
57,45
21,81
20,74
100,00
89,5
56,98
22,35
20,67
100,00
Média
57,22
22,08
20,71
100,00
(%) erro
0,81
-2,44
0,36
t1 Consórcio A(1)
0,0200
0,0188
94,0
51,06
24,47
24,47
100,00
t1 Consórcio A(2)
0,0201
0,0208
103,5
51,92
25,48
22,60
100,00
t1 Consórcio A (3)
0,0200
0,019
145
56,22
23,16
20,53
100,00
Média
53,10
24,37
22,53
100,00
(%) erro
-6,52
3,67
11,70
t1 Consórcio B(1)
0,0200
0,0179
89,5
53,63
20,11
26,26
100,00
t1 Consórcio B (3)
0,0200
0,0171
85,5
58,48
18,71
22,81
100,00
Média
56,06
19,41
24,53
100,00
(%) erro
-8,65
7,20
14,06
123
Tabela 17 - Massa inicial, recuperada e percentual das frações SAT, ARO e NSO das amostras de óleo controle,
consórcio A e consórcio B submetidas aos ensaios de degradação no tempo t2 (7 dias).
AMOSTRA
Massa
Óleo (g)
Massa total
recuperada (g)
Massa
recuperada
SAT
(%)
ARO
(%)
NSO
(%)
Massa
Total
t2 Controle (1)
0,0204
0,0200
98,04
56,50
21,00
22,50
100,00
t2 Controle (2)
0,0200
0,0178
89,00
53,37
21,91
24,72
100,00
Média
54,94
21,46
23,61
100,00
(%) erro
5,70
-4,24
-9,40
t2 Consórcio A(1) 0,0202
0,0202
100,05
54,43
23,80
21,77
100,00
t2 Consórcio A(2) 0,0127
0,0116
91,42
49,10
20,76
30,15
100,00
t2 Consórcio A(3) 0,0202
0,0190
93,96
51,63
24,66
23,71
100,00
Média
51,72
23,07
25,21
100,00
(%) erro
3,51
-2,35
-5,60
t2 Consórcio B(1)
0,0202
0,0181
89,60
51,38
25,97
22,65
t2 Consórcio B(2)
0,0203
0,0183
90,15
54,64
22,40
22,95
t2 Consórcio B(3)
0,0202
0,0169
83,66
52,66
24,85
22,49
100,00
Média
52,90
24,41
22,70
100,00
(%) erro
-1,64
2,92
0,49
100,00
Tabela 18 - Massa inicial, recuperada e percentual das frações SAT, ARO e NSO das amostras de óleo controle,
consórcio A e consórcio B submetidas aos ensaios de degradação no tempo t3 (15 dias).
AMOSTRA
Massa
Óleo (g)
Massa total
recuperada (g)
Massa
recuperada
SAT
(%)
ARO
(%)
NSO
(%)
Massa
Total
T3 Controle (1)
0,0205
0,0199
97,07
55,78
23,12
21,11
100,00
T3 Controle (1.1)
0,0200
0,0190
94,95
54,24
25,22
20,54
100,00
T3 Controle (2)
0,0201
0,0186
92,44
57,59
20,88
21,53
100,00
Média
55,01
24,17
20,82
100,00
(%)erro
-3,29
9,24
-2,03
T3 Consórcio A(1)
0,0201
0,0185
92,04
53,51
24,86
21,62
100,00
T3 Consórcio A(2)
0,0200
0,0191
95,50
55,50
21,47
23,04
100,00
T3 Consórcio A(3)
0,0200
0,0181
90,50
56,91
22,10
20,99
100,00
Média
55,31
22,81
21,88
100,00
(%)erro
-4,10
7,84
1,96
T3 Consórcio B(1)
0,0200
0,0193
96,50
52,33
23,83
23,83
100,00
T3 Consórcio B(2)
0,0201
0,0186
92,64
55,32
21,05
23,63
100,00
T3 Consórcio B(3)
0,0208
0,0192
92,31
55,21
22,92
21,88
0,0189
91,75
55,56
22,22
22,22
100,00
Média
54,40
22,37
23,23
100,00
(%)erro
-3,57
2,61
5,72
124
Tabela 19 - Massa inicial, recuperada e percentual das frações SAT, ARO e NSO das amostras de óleo controle,
consórcio A e consórcio B submetidas aos ensaios de degradação no tempo t4 (30 dias).
AMOSTRA
Massa
Óleo(g)
T4 Controle (1)
0,0201
0,0175
T4 Controle (1.1)
0,0201
T4 Controle (2)
0,0215
Massa total
recuperada (g)
Massa
recuperada (%)
SAT
(%)
ARO
(%)
NSO
(%)
Massa Total
87,06
57,71
16,00
26,29
100
0,0228
113,43
59,21
20,61
20,18
100
0,0184
85,63
62,47
15,26
22,27
100
Média
59,80
17,29
22,91
100
(%) erro
-5,27
3,10
10,97
T4 Consórcio A(1)
0,2050
0,0217
10,59
52,53
23,50
23,96
T4 Consórcio A(2)
0,0201
0,0196
97,51
58,16
22,45
19,39
100
T4 Consórcio A(3)
0,0151
0,0158
104,64
55,06
22,78
22,15
100
Média
55,25
22,91
21,83
100
(%) erro
-3,13
2,07
5,21
T4 Consórcio B(1)
0,0201
0,0195
97,01
58,97
17,95
23,08
100
T4 Consórcio B(2)
0,0205
0,0192
93,46
58,46
18,06
23,49
100
T4 Consórcio B(3)
0,0216
0,0197
91,16
55,87
19,76
24,38
100
Média
57,77
18,59
23,65
100
(%) erro
2,85
-4,90
-3,04
Figura 33 - Cromatogramas da distribuição dos n-alcanos m/z 85 das amostras controle, consórcio A e consórcio B
e suas respectivas réplicas, submetidas aos ensaios de degradação nos tempos amostrais t0 (2 horas), t1(24 horas), t2
(7 dias), t3(15 dias) e t4 (45 dias).
125
126
127
128
129
Figura 34 - Cromatogramas de distribuição dos Hopanos m/z 191 das amostras controle, consórcio A e consórcio B
e suas respectivas réplicas, submetidas aos ensaios de degradação nos tempos amostrais t0 (2 horas), t1(24 horas),
t2(7 dias), t3(15 dias) e t4 (45 dias).
130
131
132
Os valores das concentrações dos HPAs após a execução dos ensaios de degradação estão
representados por meio da tabela 20.
133
Tabela 20 - Concentrações médias dos HPAs de alto peso molecular B(k)Fluo – Benzo(k)Fluoranteno, B(b)Fluo –
Benzo(b)Fluoranteno, B(a)P – Benzo(a)Pireno, DibahA – Dibenzo(a,h)Antraceno, B(g)P – Benzo(g,h,i)Perileno e
IndP – Indeno (1,2,3-c,d)Pireno, nas amostras de óleo, controle, consórcio A e consórcio B, submetidas aos ensaios
de degradação nos tempos t0 (imediatamente) t1(24 horas), t2 (48 horas), t3 (15 dias) e t4 (30 dias).
AMOSTRA
Óleo
T0 Cont.
T0 Cons. A
T0 Cons. (B)
T1 Cont.
T1 Cons.A
T1 Cons. (A)
T1 Cons. (B)
T2 Cont.
T2 Cons.A
T2 Cons. B
T3 Cont.
T3 Cons. (A)
T3 Cons. (B)
T4 Cont.
T4 Cons. A
T4 Cons. (B)
BkFluo
176,0
159,3
159,2
143,9
220,6
156,9
162,0
143,4
324,9
141,1
151,1
328,3
224,7
152,9
313,5
164,8
146,5
BbFluo.
223,9
175,0
171,3
133,2
324,0
163,7
176,4
131,4
290,7
111,2
144,6
352,7
298,8
161,7
318,2
189,5
138,1
BaP
744,5
489,0
413,1
247,6
1091,2
377,5
455,3
244,5
412,2
164,7
291,8
723,0
977,4
382,3
552,1
531,5
265,6
BgP
196,5
184,6
178,2
176,0
187,2
179,1
180,5
176,4
403,7
177,2
177,7
407,6
189,0
179,3
402,8
180,2
177,0
IndP
177,1
94,8
77,4
53,5
93,0
70,8
84,0
47,9
563,7
44,9
64,4
567,3
99,5
78,0
557,7
61,4
58,2
DiBahA
173,3
148,8
143,2
132,3
158,1
141,2
146,2
134,2
353,8
132,8
135,1
362,2
156,8
141,0
354,7
140,5
134,5
Os principais fatores determinantes na distribuição das amostras de óleo submetidas à
ação dos consórcio A e consórcio B na degradação dos HPAs de alto peso molecular estão
demonstrados nas tabelas 21 a 24.
Tabela 21 - Fatores determinantes na distribuição dos casos na ACP das amostras contendo o consórcio A.
t0 cons.A
t1 cons.A
t2 cons.A
t3 cons.A
t4 cons.A
Fator 1
-0,44306
0,27860
3,37315
-3,98088
0,77219
Fator 2
2,44265
0,86257
-0,66257
-1,07667
-1,56597
Fator 3
-0,070924
0,415540
-0,608469
-0,357983
0,621837
Fator 4
0,137141
-0,213297
-0,021710
-0,024794
0,122660
134
Tabela 22 - Fatores determinantes na distribuição das variáveis na ACP das amostras contendo o consórcio A.
B(k)Fluo
B(b)Fluo.
B(a)P
DibahA
B(g)P
IndP
Ph
Eh
Cond.
Sal.
Fator 1
-0,932710
-0,954807
-0,939452
-0,994057
-0,885428
-0,990801
-0,244888
0,271226
-0,868252
-0,847670
Fator 2
-0,328229
-0,292744
-0,333192
-0,091779
-0,427592
0,129270
0,950863
-0,942552
0,418175
0,458725
Fator 3
-0,149364
-0,006429
0,012814
-0,058450
-0,167519
-0,019919
-0,187477
0,186639
0,265130
0,266507
Fator 4
-0,002935
0,051029
0,079042
-0,003236
-0,071549
-0,034725
-0,027221
-0,056548
-0,031200
-0,001002
Tabela 23 - Fatores determinantes na distribuição dos casos na ACP das amostras contendo o consórcio B.
t0 cons.B
t1 cons.B
t2 cons.B
t3 cons.B
t4 cons.B
Factor 1
-3,50681
-1,84657
1,73079
2,84463
0,77795
Factor 2
1,08724
-0,44315
-1,07381
2,18645
-1,75674
Factor 3
-0,672658
1,081259
-0,508682
0,213048
-0,112967
Factor 4
-0,032794
0,118686
0,342593
-0,075220
-0,353265
Tabela 24 - Fatores determinantes na distribuição das variáveis na ACP das amostras contendo o consórcio B.
B(k)Fluo
B(b)Fluo.
B(a)P
DibahA
B(g)P
Indp
Ph
Eh
Cond.
Sal.
Factor 1
0,917751
0,842069
0,805741
0,806946
0,909636
0,931776
-0,689873
0,852785
-0,741825
-0,741096
Factor 2
0,276117
0,535203
0,591513
0,532902
0,412556
-0,255614
0,551115
-0,483529
0,643956
0,644406
Factor 3
-0,217025
-0,065315
0,005236
0,243936
0,043640
-0,212746
-0,466063
0,197377
0,186855
0,188346
Factor 4
0,185453
-0,014560
-0,029443
-0,073140
0,021312
-0,145581
-0,055976
-0,000222
-0,010080
0,006528
Referências
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APÊNDICE 4
Artigo publicado em revista CAPES qualis B4 – Cadernos de Geociências.
FIORAVANTI, K.L; CELINO, J. J; ROSSI-ALVA, J. C. Isolamento, seleção e identificação de
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