aline siteneski natação de alta intensidade reduz
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aline siteneski natação de alta intensidade reduz
ALINE SITENESKI NATAÇÃO DE ALTA INTENSIDADE REDUZ NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA POR GLUTAMATO PELA ATIVAÇÃO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G / INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CINASE A PALHOÇA 2015 ALINE SITENESKI NATAÇÃO DE ALTA INTENSIDADE REDUZ NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA POR GLUTAMATO PELA ATIVAÇÃO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G / INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CINASE A Dissertação de Mestrado a ser apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Daniel Fernandes Martins, Dr. PALHOÇA 2015 S63 Siteneski, Aline, 1981Natação de alta intensidade reduz nocicepção somática induzida por glutamato pela ativação de receptores acoplados a proteína G / inibição da proteína cinase A / Aline Siteneski. – 2015. 238 f. : il. color. ; 30 cm Dissertação (Mestrado) – Universidade do Sul de Santa Catarina, Pósgraduação em Ciências da Saúde. Orientação: Prof. Dr. Daniel Fernandes Martins 1. Dor. 2. Neurobiologia. 3. Natação. 4. Exercícios físicos. 5. Canabinóides. 6. Opióides. 7. I. Martins, Daniel Fernandes. II. Universidade do Sul de Santa Catarina. III. Título. CDD (21. ed.) 616.0472 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária da Unisul ALINE SITENESKI NATAÇÃO DE ALTA INTENSIDADE REDUZ NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA PELO GLUTAMATO POR ATIVAÇÃO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G / INIBIÇÃO DA PROTEÍNA CINASE A Esta Dissertação foi julgada adequada pelo Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde - Mestrado, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Palhoça, 08/2015 Orientador: Prof. Daniel Fernandes Martins, Dr. Universidade do Sul de Santa Catarina- UNISUL Profa. Clarissa Martinelli Comim, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina- UNISUL Profa. Leidiane Mazzardo-Martins, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina- UFSC Dedico este trabalho as pessoas que inspiram a minha vida. Minha mãe, minha filha e meu amor. AGRADECIMENTOS Serei sempre grata: A Deus por permitir. A minha mãe meu exemplo de bondade, serenidade, amor, trabalho, disciplina e perseverança. Obrigado por ter segurado as pontas para a realização deste trabalho. Ao meu pai pelo apoio nos estudos, pelo exemplo de inteligência e integridade. A minha filha luz da minha vida, obrigado por me apoiar, por todo amor que você me faz sentir, ter você faz o mundo parecer melhor, teu sorriso alegra meus dias, tudo o que faço é por você. Ao meu marido Felipe grande amor da minha vida. Por estar do meu lado, meu companheiro, atencioso, carinhoso, obrigado por me dizer que tudo ia dar certo, por me amar. Sem ter você não seria possível. Aos meus irmãos Robin (que colabora com o inglês sempre) e Darlan (por todo apoio). Vocês são os melhores, meu orgulho!! Ao meu orientador, por ter sido um verdadeiro mestre. Obrigado por me aceitar no LaNex por todos os ensinamentos. Aos meus colegas do laboratório: Luiz, Dai, Fe, Ralf, Bru, Ale. Obrigada pelas discussões cientificas e pelas não-cientificas, mas sempre prazerosas conversas. Em especial a Dani obrigado pelas incontáveis horas de contagem de glutamato, pela companhia, pela amizade. Obrigado a Aline por todas as caronas a Tubarão. A todos que me auxiliaram em algum momento nos experimentos. Aos meus colegas de turma que tornaram tão agradáveis os dois semestres que estivemos juntos. Alexandre, Rodrigo, Jaime, Drielly, Naiana e em especial a Lidi amiga querida sempre me apoiando nos momentos difíceis. As meninas secretárias da pós-graduação Silvane, Francieli e Marcieli por serem sempre tão solicitas e nos tratarem com tanto carinho. A todos os professores que contribuíram com o aprendizado, em especial a Professora Clarissa. Ao Laboratório de Neurobiologia da Dor e Inflamação (LANDI) da UFSC por me receber com tanto carinho. Ao Dr. Adair Roberto Soares dos Santos por permitir a realização de parte deste trabalho no LANDI. Em especial a Dani, uma pessoa muito especial que tive o privilégio de conviver durante minha estada no LANDI, obrigado pelo Blot, pelo carinho por todo o aprendizado. Aos meus amigos queridos Filipe e Tanara que me ensinaram com paciência no começo de tudo, obrigado pelos muitos Blot, MTT, fatias e cia de acái. Aos camundongos, por serem instrumentos fundamentais para minha pesquisa. À UNISUL e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde por todo o apoio. À CAPES e a UNISUL por financiar minha bolsa de mestrado. A todos vocês... MUITO OBRIGADA! “Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, podemos começar agora e fazer um novo fim”. Chico Xavier. RESUMO Introdução: O neurotransmissor excitatório glutamato é amplamente distribuído pelo sistema nervoso de mamíferos. Vias glutamatérgicas tem sido associadas a diferentes tipos de dor. Analgesia induzida pelo exercício físico é um fenômeno observado em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, o mecanismo neurobiológico adjacente a esta analgesia ainda não foi totalmente elucidado. Objetivo: Avaliar o efeito da natação de alta intensidade na nocicepção somática e hiperalgesia induzida pelo glutamato, analisando o papel de diferentes receptores e vias envolvidas neste efeito. Métodos: O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/Unisul) sob o número 13.020.4.06.IV. Foram utilizados camundongos Swiss machos. Animais foram submetidos à uma ou duas semanas de natação de alta intensidade e comparados à camundongos não exercitados. A nocicepção e hiperalgesia mecânica somática foram induzida por uma injeção intraplantar (i.pl.) de glutamato (GLU). Testou-se a resposta da pata (tempo de licking) ou (frequência de retirada) frente a estímulos nocivos. Pelo fato da pata (periférico) e da medula espinal (central) serem sítios de modulação importantes no controle da dor, a participação dos receptores dos principais sistemas endógenos (opióde, adenosinérgico e canabinóide) e a expressão da proteína cinase A (PKA) fosforilada foram avaliados nestes locais, por meio de antagonistas específicos dos referidos sistemas e por Western Blotting, respectivamente. Resultados: Observou-se que receptores opióides e adenosinérgicos (A1) periféricos e espinais participam da analgesia induzida pela natação de alta intensidade. Além disso, receptores canabinóides CB1 espinais, mas não periféricos, também estão envolvidos neste efeito. Paralelo a estes resultados, também foi encontrado aumento na expressão de PKA fosforilada induzido pela injeção i.pl. de GLU, o qual foi reduzido significativamente pela natação, em ambos sítios, pata e medula espinal. Conclusão: Natação de alta intensidade reduz nocicepção somática e hiperalgesia induzida pelo glutamato. A inibição da fosforilação de PKA pela ativação de receptores opióides, adenosinérgicos e canabinóides parece, pelo menos em parte, mediar este efeito. Descritores: Dor. Exercício físico. Natação. PKA. ABSTRACT Introduction: The excitatory neurotransmitter glutamate is widely distributed throughout mammals' nervous system. Glutamatergic pathways have been associated with different kinds of pain. Analgesia induced by exercise is a phenomenon observed in preclinical and clinical studies. However, the analgesia associated with this neurobiological mechanism has not been fully elucidated. Goal: To evaluate the effect of high-intensity swimming in the somatic hyperalgesia and nociception induced by glutamate analyzing the role of different receptors and pathways involved in it. Methodology: This study was approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA /Unisul in the Portuguese acronym) under the number 13.020.4.06.IV. Swiss male mice were submited to one or two weeks of high-intensity swimming and compared to mice that did not exercise. The somatic nociception and hyperalgesia was induced by intraplantar injection (i.pl.) of glutamate (GLU). The paw response (licking time or removal frequency) against noxious stimuli was tested. Because paw (peripheral) and spinal cord (central) modulation are important sites for pain control, the involment of receptors of the main endogenous systems (opioid adenosinergic and cannabinoid) and the expression of protein kinase A (PKA) phosphorylated were evaluated by, respectively, specific antagonists of these systems and by Western blotting. Results: It was concluded that central and peripheral opioid and adenosinergic (A1) receptors are part of the spinal analgesia induced by high intensity swimming. In addition, spinal but not peripheral cannabinoid receptors CB1 are involved in this effect. An increased expression of phosphorylated PKA was induced by i.pl. injection of GLU, that was significantly reduced by swimming, was also found on both sites (paw and spinal cord). Coclusion: High intensity swimming reduces somatic nociception and hyperalgesia induced by glutamate. Inhibition of PKA phosphorylation by the activation of opioid, cannabinoid and adenosinergic receptors seem at least partially, to mediate this effect. Key words: Pain. Physical exercise. Swimming. PKA. LISTA DE ABREVIATURAS AMPA - Ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico; AMP - Monofosfato de adenosina-5'; AMPc - Monofosfato de adenosina cíclico; AP - Aferente primário; ATP - Trifosfato de adenosina-5'; BDNF - Fator neurotrófico derivado do encéfalo; CB - Canabinóide; CCI - Constrição do nervo isquiático; DAG - Diacilglicerol; DRG - Gânglio sensorial do nervo espinal; EATTs - Transportadores de aminoácidos excitatórios; EC - Endocanabinóide; FCmax - Frequência cardíaca máxima; GABA - Ácido γ- aminobutírico; G i - Proteína G inibitória; GTP- Guanosina trifosfato; GLU- Glutamato; IASP - Associação Internacional para o Estudo da Dor; i.pl. – Intraplantar; i.t. – Intratecal; KA – Cainato; NMDA - Ácido N-metil-D-aspartato; PKA - proteína-cinase A; PKC - proteína-cinase C; RsGLUi - Receptores para glutamato ionotrópicos; RsGLUm - Receptores para glutamato metabotrópico; SCP - Substância cinzenta periaquedutal; SNC - Sistema nervoso central; SNP - Sistema nervoso periférico; SP - Substância P; VO2 - Consumo de oxigênio; VO2max - Consumo máximo de oxigênio; Lista de figuras Figura 1 - Receptores canabinóides .......................................................................... 23 Figura 2 - Receptores opióides ................................................................................. 25 Figura 3 - Receptores adenosinérgicos ..................................................................... 27 Figura 4 - Proteína cinase A . ................................................................................... 32 Figura 5 - Esquema representando a execução do protocolo de natação e o dia do teste nociceptivo.. ..................................................................................................... 38 Figura 6 - Esquema de tratamento utilizado para avaliar o mecanismo de neurobiólogos ............................................................................................................ 39 Figura 7 - Concentrações de lactato sanguíneo ........................................................ 44 Figura 8 - Efeito da natação na nocicepção induzida pelo glutamato. ...................... 45 Figura 9 - Efeito da natação na hiperalgesia mecânica induzida pelo glutamato. ..... 46 Figura 10 - Envolvimento de receptores acoplados a proteína G espinais na redução da nocicepção induzida pela natação. ...................................................................... 48 Figura 11 - Envolvimento de receptores acoplados a proteína G periféricos na redução da nocicepção induzida pela natação.......................................................... 49 Figura 12 - Atividade da PKA em camundongos. ...................................................... 51 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14 1.1 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................. 16 1.1.1 Neurobiologia da dor .................................................................................... 16 1.1.2 Neurotransmissão glutamatérgica .............................................................. 18 1.1.3 Sistemas endógenos que participam do controle da dor .......................... 20 1.1.3.1 Sistema canabinóide ..................................................................................... 20 1.1.3.2 Sistema opióidergico ..................................................................................... 23 1.1.3.3 Sistema adenosinérgico ................................................................................ 25 1.1.4 Exercício físico .............................................................................................. 28 1.1.4.1 Exercício físico na dor e na nocicepção ........................................................ 29 1.1.5 Sinalização proteína G i / o /AMPC/PKA e dor .............................................. 31 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 34 2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 34 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 34 3 MÉTODOS ............................................................................................................. 35 3.1 ASPECTOS ÉTICOS .......................................................................................... 35 3.2 ANIMAIS.............................................................................................................. 35 3.3 FÁRMACOS E REAGENTES.............................................................................. 35 3.4 NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE GLUTAMATO ............................................................................................................ 36 3.5 MENSURAÇÃO DA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO DE GLUTAMATO ............................................................................................................ 36 3.6 NATAÇÃO ........................................................................................................... 37 3.7 MENSURAÇÃO DA INTENSIDADE DO EXERCÍCIO DE NATAÇÃO ................ 38 3.8 ANÁLISE DO MECANISMO BIOLÓGICO DO EFEITO DA NATACÃO .............. 39 3.8.1 Análise da participação dos receptores canabinóides 1 (CB1) na redução da nocicepção induzida pela natação ................................................................... 40 3.8.2 Análise da participação dos receptores opióides na redução da nocicepção induzida pela natação ........................................................................ 40 3.8.3 Análise da participação dos receptores adenosinérgicos 1 (A1) na redução da nocicepção induzida pela natação .................................................... 41 3.9 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA CINASE A (PKA) .............. 41 3.9.1 Preparação dos homogenatos ...................................................................... 41 3.9.2 Ensaio de Western blotting ........................................................................... 42 3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 42 4 RESULTADOS ....................................................................................................... 44 4.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRACÃO DE LACTATO SANGUÍNEO (INTENSIDADE DA NATAÇÃO)................................................................................ 44 4.2 EFEITO DA NATAÇÃO NA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO GLU ................... 45 4.3 EFEITO DA NATAÇÃO NA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELO GLU .................................................................................................................................. 46 4.4 ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G ESPINAIS NA REDUÇÃO DA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA NATAÇÃO ............................ 47 4.5 ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G PERIFÉRICOS NA REDUÇÃO DA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA NATAÇÃO .... 48 4.6 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE DIFERENTES ISOFORMAS DE PROTEÍNA CINASE A FOSFORILADA ....................................................................................... 50 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 52 6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 61 REFERÊNCIAS......................................................................................................... 62 ANEXO ..................................................................................................................... 76 ANEXO A- Parecer Aprovação do Comissão de Ética ......................................... 77 14 1 INTRODUÇÃO ''Uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal dano'' é como a dor é defina pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)1. Assim, apesar de existir uma base anatômica e fisiológica discreta para a detecção e transmissão das mensagens que são interpretadas como dolorosas, o que torna a experiência de dor tão especial é o envolvimento emocional associado à esta experiência2. No sentido fisiológico, o processamento da informação de dor envolve um sistema que transmite uma informação sensorial adaptativa importante sobre o ambiente e necessária para a sobrevivência do organismo. Este tipo de informação/sinalização é conhecida como nocicepção. O processamento da informação dolorosa envolve vários componentes, incluindo a ativação neuronal do aferente primário sensorial, transmissão aferente à medula espinal, integração espinal e modulação, processamento supra-espinal, e regulação descendente3. O glutamato (GLU) é um neurotransmissor excitatório amplamente distribuído pelo sistema nervoso de mamíferos. Ele participa de todas as funções do sistema nervoso afetando o desenvolvimento do sistema nervoso em todas as fases, desde a migração neuronal, diferenciação e morte na formação e eliminação de sinapses4. Receptores glutamatérgicos (RsGlu) são divididos em duas classes principais, ionotrópico e metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos (RsGlui) são canais iônicos que são permeáveis a cátions e estão subdivididos em três subgrupos: ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA), Cainato e receptores do tipo ácido N-metil-D-aspartato (NMDA)5. Os receptores metabotrópicos (RsGlum) são acoplados a proteínas de ligação ao GTP (proteínas G), e operam tanto por liberação de mensageiros secundários no citoplasma ou por influenciar a atividade de canais iônicos por meio de interações com as subunidades da proteína G na membrana celular6. O papel das vias glutamatérgicas em processos nociceptivos tem sido associado a diferentes tipos de dor7. Concentrações de glutamato elevadas na medula espinal de ratos são observadas durante a inflamação8. O aumento do cálcio intra-celular mediado por receptores NMDA em neurônios do corno posterior da medula espinal provoca ativação de cinases, incluindo a proteína cinase A (PKA)9. As cascatas de ativação de cinases conduzem 15 a uma maior excitabilidade neuronal mediada pela fosforilação de receptores NMDA, AMPA e canais de cálcio dependentes da voltagem, bem como pela inibição de canais de potássio dependentes da voltagem10,11. A fosforilação de receptores NMDA ainda contribui para potenciais pós-sinápticos excitatórios12, e também para aumentar o período em que os receptores permanecem abertos após a despolarização neuronal13. O AMPc foi o primeiro segundo mensageiro celular a ser descoberto, e também foi o primeiro ser sugerido estar implicado na dor e sensibilização do nociceptor. A sinalização do AMPc é resulta em fosforilação da PKA uma proteína dependente de AMPc, que pode ser ativada ou inibida. A inibição farmacológica, bem como genética da PKA resulta em uma redução no comportamento de hiperalgesia induzida por mediadores inflamatórios14, em reduzidas descargas dos nociceptores15, bem como, na atenuação da liberação de peptídeos induzida por estímulos16. A analgesia induzida pelo exercício físico é um fenômeno bem estabelecido na literatura e que há muito tempo vem sendo estudada. Vários sistemas endógenos de controle estão implicados neste fenômeno, entre eles, o sistema opióide, o sistema adenosinérgico e mais recentemente tem sido postulado o envolvimento do sistema canabinóide17,18,19,20,21. Além disso, tem sido demonstrado que as concentrações intracelulares de AMPc podem ser reduzidas pela ativação de receptores opióides (µ, ou ), adenosinérgicos (A1) ou canabinóide (CB1)14,22,23,24. Estudos também sugerem a possibilidade do exercício físico em modular a transmissão glutamatérgica. Chen et al., (2013)25 mostrou em animais (ratos) com dor pós-operatória que o exercício físico reduziu a hipersensibilidade mecânica até 35 dias após cirurgia. Paralelo a este efeito, os autores observaram menores quantidades nas concentrações de TNF-alfa e interleucina 6, bem como menor expressão da subunidade NR1 do receptor NMDA na medula espinal. Além disso, Sluka et al. (2012)26 comparou animais não exercitados e exercitados por 8 semanas em um modelo de dor crônica. Os autores também avaliaram as mudanças na fosforilação da subunidade NR1 do receptor NMDA no bulbo ventromedial rostral (RVM). Assim os autores demostraram que o exercício físico previne a dor crônica por reduzir a fosforilação da subunidade NR1 do receptor NMDA no sistema nervoso central (SNC). 16 Neste estudo pretendeu-se responder algumas questões sobre a analgesia induzida pelo exercício físico que ainda não foram esclarecidas, como a verificação do efeito da natação de alta intensidade na nocicepção somática e hiperalgesia mecânica induzida pelo GLU. Além da análise do papel da ativação de receptores chaves (canabinoidérgico, opioidérgico e adenosinérgico) do controle da dor que são acionados por mediadores endógenos liberados durante ou após o exercício físico. Finalmente, a avaliação da participação de uma proteína cinase (PKA) fundamental na gênese da dor e que sua inibição faz parte de uma cascata (downstream) da ativação de receptores acoplados a proteína G que induzem analgesia. 1.1 REFERENCIAL TEÓRICO 1.1.1 Neurofisiologia da dor A dor pode ser definida como “uma experiência sensorial desagradável associada com lesão tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal lesão”27. A dor atua como mecanismo de defesa do organismo, um alerta induzido por estímulos nocivos28. A percepção da dor é um fenômeno complexo porque envolve aspectos sensório-discriminativos, emocionais, cognitivos, motivacionais e afetivos29. Normalmente a sensação dolorosa é acompanhada por alterações sensoriais como hipernocicepção (ou hiperalgesia) definida como o prolongamento ou aumento exagerado da dor a partir de estímulos nocivos que normalmente provocam dor (por exemplo, uma picada de alfinete)28. E por alodinia que denota a dor provocada por estímulos que normalmente não causariam dor (por exemplo, dor causada por movimentos das articulações interfalangeanas em pacientes com artrite reumatóide)30. Nocicepção, por outro lado, expressa a percepção sensorial no sistema nervoso central (SNC), produzido pela ativação do nociceptor. A transmissão neuronal que codifica a informação dolorosa se inicia pela detecção, na periferia pelos neurônios aferentes primários (AP) ou neurônios de primeira ordem que transmitem a informação por meio de vias nociceptivas específicas31. Um nociceptor é um receptor sensorial com a capacidade de transdução e codificação dos estímulos nocivos. Existem receptores não-nociceptivos (por 17 exemplo, receptores táteis e receptores de calor), que podem responder a estímulos nocivos (mecânicos ou térmicos respectivamente) quando estes estímulos estão acima de seus respectivos limiares. Mas, somente os nociceptores são capazes de codificar propriedades pertinentes a estes estímulos (por exemplo, nitidez, intensidade do calor). O nociceptor é proteína localizada na terminação nervosa periférica que age como um receptor sensorial, realizando a transdução de estímulos nocivos de diferentes naturezas em potenciais geradores e/ou codificação de sucessivos potenciais de ação27. Os neurônios AP possuem dois ramos axonais, o ramo periférico mais longo detecta na periferia o estímulo nocivo e consequentemente deflagra um potencial de ação pelo axônio, em seguida, este potencial é conduzido ao longo da fibra nervosa até o gânglio sensorial do nervo espinal (DRG), onde é transmitido para a medula espinal pelo o ramo axonal mais curto do neurônio, alcançando assim o corno posterior da medula espinal32. Os corpos celulares desses neurônios AP estão localizados dentro do DRG, enquanto seus ramos mais curtos estão localizados nas camadas superficiais (lâminas I e II) do corno posterior da medula espinal2. As fibras axonais dos neurônios AP podem ser de dois tipos: fibras do tipo “Aδ”, os quais possuem corpos celulares de médio diâmetro e axônios com velocidade de condução rápida, são neurônios que medeiam a sensação de dor aguda localizada servindo como um sinal de alerta à lesão eminente, e fibras do tipo C que possuem corpos celulares de pequeno diâmetro e axônios de condução lenta, transmitem informação dolorosa mais lentamente e pouco localizada, oferecem suporte ao reparo tecidual, induzindo comportamentos de defesa32. Algumas fibras do tipo C são polimodais porque elas compartilham a capacidade de reconhecer estímulos nocivos de diferentes naturezas tais como: térmica, química ou mecânica27. A origem desta capacidade de detectar estímulos nocivos de naturezas diferentes, é a existência de um repertório distinto de canais iônicos de membrana, receptores e proteínas de sinalização intracelular nos neurônios AP33. No corno posterior da medula espinal os neurônios AP liberam mediadores como o neurotransmissor GLU e o neuropeptídeo substância P, este evento permite a transmissão do sinal nociceptivo a neurônios de segunda ordem,34 formando uma via ascendente que se projeta para o tálamo, posteriormente para 18 neurônios de terceira e quarta ordem alcançando diferentes regiões corticais, onde ocorre a percepção dolorosa (primariamente no córtex somatossensorial)35. Em todos os níveis do sistema nervoso existe um mecanismo endógeno de controle modulador da dor que pode exercer ações tanto estimulatórias quanto inibitórias36. As vias descendentes inibitórias da dor são originadas no tronco encefálico e tornam-se ativas liberando neurotransmissores tais como serotonina e noradrenalina que reduzem a atividades de neurônios do corno posterior da medula espinal (segunda ordem) e dos neurônios AP37. A ativação destas vias descendentes é precedida pela ativação dos neurônios da substância cinzenta periaquedutal (SCP), eles projetam-se para o núcleo magno da rafe ou para o Lócus Coeruleus, onde em seguida projetam-se ao longo do funículo dorso lateral e para a medula espinal36. Na medula espinal a inibição é mediada por neurotransmissores como o ácido γ-aminobutírico (GABA) ou glicina liberados por interneurônios inibitórios e também pela ação de neuropeptídios como os opióides que interagem com receptores específicos e reduzem a excitação dos neurônios AP no corno posterior da medula espinal38. No tecido lesionado ocorre uma interação entre derivados de leucócitos e peptídeos opióides que podem atuar em seus respectivos receptores na terminação periférica do neurônio AP inibindo sua atividade39. Como consequência de uma lesão o tecido libera muitas substâncias químicas como macrófagos, mastócitos e também células lesionadas que podem agir de forma direta ou indireta, alterando a sensibilidade de canais iônicos e receptores metabotrópicos dos terminais periféricos. Simultaneamente os receptores liberam mensageiros secundários que ativam proteínas cinases como a PKA e a proteína cinase C (PKC), capazes de ativar outros receptores acoplados à membrana e/ou desencadear a transcrição gênica40. 1.1.2 Neurotransmissão glutamatérgica O GLU é o principal neurotransmissor excitatório do SNC de mamíferos, é essencial para o desenvolvimento encefálico, comunicação celular e processos de aprendizagem e memória41. Exerce um papel fundamental na transmissão nociceptiva, sendo liberado tanto a nível periférico quanto a nível central após uma lesão tecidual42. 19 A modulação da neurotransmissão glutamatérgica ocorre assim que o GLU é liberado a partir de um terminal nervoso por exocitose, um processo ATP (trifostato de adenosina) Ca2+/dependente. O GLU é captado pelas células neurogliais (astrócitos) próximos da sinapse por meio de transportadores de aminoáciodos exitatórios (EAATs). Dentro do astrócito glutamina sintetase detoxifica GLU convertendo-o a glutamina (GLn), processo dependente de ATP. A GLn é liberada dos astrócitos e captada pelos neurônios por meio de transportadores diferentes para GLn43. Após a captação para dentro dos neurônios pré-sinápticos a enzima glutaminase transforma a GLn novamente a glutamato. As vesículas sinápticas são conduzidas com GLU através do citosol por meio de um transportador de GLU vesicular (GLUTv) deslocando-se até a membrana pré-sináptica, onde sofre exocitose e libera novamente o GLU na fenda sináptica43. A estimulação excessiva dos receptores glutamatérgicos decorrente de níveis elevados de GLU na fenda sináptica colabora com diversos distúrbios agudos (acidente vascular encefálico [AVE], convulsão, trauma) e crônicos (demência vascular, doenças neurodegenerativas e psiquiátricas) que acometem o SNC (CHAO; FEI, 2010). Na dor crônica, ocorre um estado clinico de hiperalgesia e alodinia onde a estimulação contínua e a liberação sustentada de GLU resultam no estado de hiperexcitabilidade de neurônios nociceptivos, fenômeno conhecido como sensibilização39. O GLU liberado pelo neurônio pré-sináptico pode interagir com o neurônio pós-sináptico através da ligação em diferentes tipos de receptores para o GLU, os ionotrópicos (RsGLUi) e metabotrópicos (RsGLUm) expressos em neurônios pré- e pós-sinápticos5. Os RsGLUi formam complexos tetraméricos de subunidades heteroméricas individuais; são canais permeáveis a cátions que podem ser subdivididos em três grandes famílias, receptores do tipo AMPA, receptores do tipo cainato e os receptores do tipo NMDA44. Mudanças conformacionais abrem o canal em resposta à ligação do agonista6. Assim, quando o NMDA é ativado, permite o influxo de Ca2+ e quando AMPA e cainato são ativados, ocorre principalmente o influxo de sódio (Na+) e potássio (K+)11. Os RsGLUm são receptores acoplados a proteína G membros da família heteromérica guanosina 5’ trifosfato, caracterizada por possuir uma proteína com 20 sete α hélices associadas com um domínio N-terminal extracelular e um domínio Cterminal intracelular. Possui três subunidades distintas α, β e γ que ativam ou inibem mensageiros secundários. Estão divididos em três grupos, o grupo I consistem dos R1Glum e R5Glum, do tipo II R2Glum e R3Glum e os do grupo III R4Glum e R8Glum6. O grupo I consiste em receptores acoplados a proteína Gq onde a proteína efetora é a fosfolipase C e possui duas rotas: uma ativa o diacilglicerol (DAG) que age como segundo mensageiro ativando a PKC; a outra rota ativa IP3 como segundo mensageiro e promove a liberação de Ca2+, sendo que ambas culminam no aumento da fosforilação e ativação de proteínas que se ligam ao Ca2+. Em contrapartida, os grupos II e III, encontram-se acoplados a proteínas Gi são vias inibitórias, sua ação diminui o monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) 6. Cada RGLUi, RGLUm com sua peculiaridade, participa da indução, modulação e manutenção da dor, tanto central como perifericamente37,45,46. Centralmente a liberação de glutamato e do neuropetídeo substância P (SP) é capaz de ativar os astrócitos promovendo a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina-1 beta (IL-1β), ambos mediadores nociceptivos47. 1.1.3 Sistemas endógenos que participam do controle da dor 1.1.3.1 Sistema canabinóide O sistema canabinóide participa do controle endógeno da dor ao longo de toda a via nociceptiva48. Constituído pelos receptores canabinóides (CB) CB1 (RsCB1)49, e CB2 (RsCB2)50 e GPR5551, também por seus ligantes endógenos, sendo os mais estudados o lipídeo transmissor N-aracdonoil etanolamina, (anandamida) e 2-araquidonoil glicerol (2-AG), chamados de endocanabinóides (EC)52. Os EC endógenos são moléculas de sinalização lipídica geradas na membrana celular a partir de precursores de fosfolipídeos. Constituídos por uma cadeia de ácido graxo poli-insaturado, derivado do ácido araquidônico e de um grupamento polar, etanolamina para anandamida e glicerol para 2-AG. São 21 produzidos sobre demanda, em resposta a um estímulo externo e são rapidamente degradados53. As enzimas responsáveis pela formação dos EC são sensíveis ao Ca2+, sendo que a atividade do Ca2+ intracelular age como estímulo fisiológico para a síntese dos EC54. A anandamida é formada por uma fosfolipase D seletiva para a Naraquidonil fosfatidil etanolamina (NAPE). Após uma série de reações para sua formação a enzima atinge os receptores CB. Posteriormente sofre recaptação pela célula sendo transportada intracelularmente por um transportador de membrana para anandamida. Uma vez dentro da célula, a anandamida é hidrolisada por uma amida hidrolase de ácidos graxos (FAAH) produzindo etanolamina e ácido araquidônico53. O 2-AG é produzido pela hidrólise de precursores derivados do metabolismo fosfolipídico (sn1-acil-2-araquidonil glicerol). Sendo que as enzimas chave são as diacil glicerol lipases (DAGLs), localizadas em axônios e terminações axônicas pré-sinápticas durante o desenvolvimento, e pós-sinapticamente encontradas nos dendritos e corpos celulares de neurônios adultos. Seguindo a sinalização dos receptores CB, o 2-AG é transportado para dentro da célula por um transportador para 2-AG e degradado pela mono acil glicerol lipase (MAGL) produzindo então ácido araquidônico e glicerol22. Estes compostos apresentam afinidades diferentes para os receptores de canabinóides. A anandamida tem uma afinidade preferencial para receptores CB1 e canais de receptor de potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1), enquanto que 2-AG apresenta afinidade funcional para ambos CB1 e CB255,56. A sinalização dos ECs ocorre através de um mecanismo retrógrado, onde a estimulação do neurônio pós-sináptico desencadeia a biossíntese dos ECs, que são liberados e transportados por mecanismos ainda não esclarecidos, para ativar os receptores CB1 expressos principalmente no terminal pré-sináptico57. A ativação de CB1 inicia uma cascata de sinalização através de proteínas Gi que regula os canais de Ca2+ e K+ inibindo a liberação de neurotransmissores58. Após a ativação de CB1 em membranas pré-sinápticas, os ECs são removidos do meio extracelular por hidrólise enzimática rápida54. Os receptores CB1 são abundantes no SNC e moderadamente expressos em tecidos periféricos49. Observam-se os receptores CB1 nos sítios de modulação da percepção da dor, centralmente, em interneurônios do corno posterior da medula 22 espinal, substância cinzenta periaquedutal48 e em neurônios sensoriais periféricos59. Em âmbito neuronal, os receptores CB1 estão localizados principalmente em axônios e terminais nervosos e estão em grande parte ausentes no soma neuronal ou dendritos60. Os receptores CB2 são expressos principalmente pelas células imunes61 descritos em tecidos periféricos50e em células microgliais no SNC62. Tanto os receptores CB1 quanto CB2 e seus ligantes endógenos, estão presentes nas principais vias de modulação da dor, central e perifericamente, são capazes de alterar a percepção da dor63. Perifericamente, exercem um grande controle inibitório no início da transmissão da dor. Quando os RsCB1 e RsCB2 são ativados perifericamente ocorre inibição de comportamentos relacionados à dor64. O mecanismo de transdução dos sinais dos RsCB1 e RsCB2 envolvem preferencialmente vias com a participação da proteína G i / o (Figura 1) exercendo sua ação através da inibição da adenilil ciclase, consequente redução da produção de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), inibição da PKA, inibindo a atividade dos canais de Ca2+ e ativando os canais de K+53,54. 23 AMPc Expressão gênica Proteína G Heteromérica Agonista do receptor Canabinóide Figura 1- Receptores canabinóides Legenda: Ativação de ambos RsCB1 e RsCB2, resulta em subsequente estimulação da proteína G i / o e inibição da adenilato-ciclase (AC) e inativação da proteína cinase A (PKA) (fosforilação) ou estimulação de proteína cinase ativada por mitogénio (MAPK). Estes eventos intracelulares levam entre outros efeitos, a regulação da expressão de vários genes. A estimulação de receptores acoplados a G i /0 estão diretamente relacionados a inibição de canais de Ca2+ dependente de voltagem e a estimulação de canais de K+ com subsequente inibição da liberação de neurotransmissores. Fonte: Adaptado de Di Marzo; Bifulco; Petrocellis, 200465. 1.1.3.2 Sistema opioidérgico O sistema opioidérgico é composto pelos peptídeos opióides e os seus respectivos receptores, eles são expressos em todo o SNC e periférico, em tecidos neuroendócrinos e células imunes63. Os subtipos de receptores opióides já identificados são: receptor do tipo µ, , δ, e OFQ/N51. Os receptores opióides estão localizados e podem ser ativados ao longo de todos os níveis da transmissão nociceptiva66, encontrados no SNC em estruturas relacionadas com a emoção e recompensa51. Além de células neuroendócrinas, imunológicas e ectodérmicas23. A modulação ocorre através de peptídeos opióides endógenos, que se ligam aos receptores mediante estímulos como, por exemplo, eventos inflamatórios e/ou neuropatias dolorosas. Os principais peptídeos são as endorfinas, dinorfinas e 24 encefalinas, cada um é produzido a partir da clivagem de proteínas precursoras diferentes67. Endorfinas originam-se a partir da clivagem da proteína precursora proopiomelanocortina (POMC) e apresentam maior afinidade pelos receptores opióides do tipo μ. Encefalinas são formadas a partir da proteína precursora proencefalina (PENK) e apresentam afinidade pelos receptores opióides dos tipos μ e δ. Já as dinorfinas, originam-se da clivagem da prodinorfina e mostram maior afinidade pelos receptores opióides do tipo κ68. Todos os receptores opióides são acoplados à proteína G51, principalmente à proteína G i / o, sendo que, a rota desencadeada envolve a inibição da adenilil ciclase (AC), diminuição da condutância dos canais Ca2+ dependente de voltagem e/ou abertura de canais de K+, resultando na diminuição da atividade neuronal. A prevenção do influxo Ca2+ inibe a liberação de neurotransmissores e consequentemente a excitação neuronal (Figura 2)23. Os receptores opióides e canabinóides compartilham as características de receptor metabotrópico, por este motivo existe uma interação entre eles na analgesia69. 25 Figura 2- Receptores opióides Legenda: Expressão de receptores opióides periféricos, sinalização intracelular após a ligação de um agonista promovendo o acoplamento da proteína G i /0, consequentemente ativando canais de k+ e inibindo canais de Ca2+, por sua vez inibindo a adenilato ciclase (AC). Os receptores opióides indiretamente ativam a fosfolipase C (PLC), e cinase ativada por mitógeno (MAPK). Fonte: Adaptado de Kapitzke, Vetter, Cabot, 200570. 1.1.3.3 Sistema adenosinérgico A adenosina é um nucleosídeo derivado da purina abundante em todas as células71. As concentrações basais de adenosina dependem de mecanismos que regulam o metabolismo, a produção, a liberação e a recaptação72. Ela é considerada um neuromodulador endógeno, pois influencia funções do SNC, como a liberação de neurotransmissores e a excitabilidade neuronal73. A adenosina pode ser formada tanto no meio intra quanto extracelular. No meio intracelular, a adenosina é formada pela hidrólise do AMP através da enzima 5′-nucleotidase (5′NTase) ou por uma via alternativa através da enzima S-adenosil homocisteína hidrolase (SAHáse), que converte a S-adenosil homocisteína em adenosina e homocisteína. A adenosina pode ser novamente convertida em AMP pela enzima adenosina cinase, podendo ser transportada para o meio extracelular por transportadores equilibrativos. O ATP também pode ser levado para o meio extracelular por transportadores, exocitose ou ainda pelo rompimento da membrana plasmática em situações de dano celular74. 26 No meio extracelular a adenosina é formada pela clivagem sequencial de nucleotídeos por ecto-enzimas, incluindo a NTPDase que converte ATP e ADP em AMP e a ecto 5′-nucleotidase que converte AMP em adenosina74. Ao atingir a fenda sináptica a adenosina se liga aos receptores para adenosina (RsA), A1, A2A, A2B e A3, todos acoplados à proteína G75. A principal via de sinalização dos receptores A1 e A3 está relacionada com o acoplamento à proteína G i / o exercendo sua ação negativa sobre a enzima AC o que diminui os níveis intracelulares de AMPc. E a principal via dos receptores A2A e A2B é o acoplamento a proteína Gs, que agem positivamente à enzima AC, promovendo um aumento dos níveis intracelulares de AMPc 76,77. A adenosina regula a transmissão nociceptiva por ativar sítios supraespinais, espinais e periféricos. Os efeitos inibitórios são mediados pelos receptores A1, enquanto os receptores A2A levam a facilitação da percepção nociceptiva73. A diminuição da nocicepção induzida pela adenosina ocorre devido a inibição da atividade neuronal, tanto pelo aumento da condutância ao K+ quanto pelo bloqueio de canais Ca2+, diminuindo a liberação do neurotransmissor glutamato e do neuropeptídeo substância P (Figura 3)78. 27 Adenosina Adenosina Inosina Inosina Proteína Cinase A Adenilato ciclase Figura 3- Receptores adenosinérgicos Legenda: Representação esquemática simplificada de formação de adenosina, o metabolismo, transporte e os receptores de adenosina acoplados à proteína G. (A) Neurônios, astrócitos e células microglias podem liberar adenosina e adenosina-trifosfato (ATP; seta cinza). Todos os tipos de células expressam receptores para a adenosina, transportadores de adenosina e ecto-nucleotidases que convertem ATP em adenosina. ADP adenosina-di fosfato; AMP adenosina-mono-fosfato; HAS, Sadenosil-homocisteína; 5'-N, 5'-nucleotidase; AK, de adenosina-cinase; ADA, adenosina-desaminase; SAHH, S -homocisteína hidrolase-adenosil. (B) A ativação de receptores de adenosina inibe (receptores A 1/3 flechas azuis) ou estimula (receptores A 2A / 2B flechas vermelhas) a adenilato-ciclase e AMP (via AMPc). Fonte: Adaptado de Landolt, Rétey, Adam, 201279. 28 1.1.4 Exercício físico O exercício físico foi definido por Caspersen et al. (1985)80 como “toda atividade física planejada, estruturada e repetitiva com o propósito de melhorar ou manter certo nível de aptidão física”. O exercício físico pode ser dividido em aeróbio e anaeróbio de acordo com os substratos energéticos empregados na realização da atividade. São exemplos de exercícios aeróbios caminhar, correr, andar, pedalar, nadar, dançar, entre outros. Os exercícios anaeróbios incluem treinamento de força ou treinamento resistido, frequentemente chamado de musculação81. Os princípios do treinamento: frequência, intensidade, tipo de exercício e tempo determinam a adaptação à prática de exercícios físicos. Considerações importantes são: o tipo do exercício (aeróbio ou anaeróbio), a frequência que se refere ao número de treinos (sessões), a intensidade (definida como o nível de esforço exigido pelo treino) e a duração (tempo pelo qual o treinamento foi mantido)82. A prática de exercícios aumenta o consumo de oxigênio pelos tecidos chamado de VO2 máximo, que é regulado pela capacidade máxima dos sistemas pulmonar e cardiovascular em captar e transportar oxigênio e também a capacidade dos tecidos de utilizar o VO2 na oxidação de substratos energéticos preferencialmente os lipídeos e carboidratos83. Existe uma relação importante entre a intensidade do exercício, VO2máx e a concentração de lactato. A capacidade máxima de executar exercícios tem um “limite” de quantidade de energia que os músculos são capazes de produzir pela oxidação de substratos energéticos. Isso corresponde ao metabolismo mitocondrial do piruvato. Assim, quando as mitocôndrias atingem o ponto máximo de conversão de lactato em piruvato, isto é, próximo ao limite do exercício (VO2máx), o lactato passa a acumular-se nos tecidos e no sangue83. Assim, tanto o limiar de lactato pode ser utilizado como uma medida indireta da intensidade de exercícios aeróbios, quanto o VO2 84,85. Segundo Gaesser Poole (1996)86, a cinética do VO2máx durante o exercício em carga constante pode classificar a intensidade do esforço em três domínios: moderado, pesado e severo. Moderado, atinge todas as intensidades de esforço que podem ser realizadas sem a modificação do lactato sanguíneo em relação aos valores de repouso, ou seja, abaixo do limiar de lactato. Pesado, inicia a 29 partir da intensidade de esforço onde o lactato se eleva e tem como limite superior a intensidade correspondente à máxima fase estável do lactato (aproximadamente 4mM). No domínio severo por sua vez, não existe fase estável de lactato sanguíneo, ele se eleva durante todo o tempo de esforço até a exaustão do praticante. A prática de exercícios físicos regular é associada à redução no risco de doenças cardiovasculares87, metabólicas88, obesidade89, osteoporose90, câncer91 e diabetes92. O exercício físico também é considerado uma intervenção não farmacológica no tratamento de encefalopatia associada à insuficiência hepática93, fibromialgia94, depressão95 e dor17. Após a inclusão de períodos de treinamento em esteira é possível observar um aumento significativo no desempenho neuromuscular e cardiovascular40. 1.1.4.1 Exercício físico na dor e na nocicepção Trabalhos clínicos demonstram que o exercício físico reduz dor crônica, em condições como: fibromialgia, dores lombares, osteoporose, dor miofascial, dor oncológica e dor cervical96. Uma meta-análise realizada por Naugle, Fillingim, Riley (2012) 97, analisou estudos sobre a analgesia induzida pelo exercício físico. Concluise que ambos os exercícios: aeróbios e de resistência, foram capazes de reduzir a dor experimental em adultos saudáveis. As variações podem ser observadas na população com dor crônica onde os exercícios de alta intensidade produzem maiores respostas na diminuição da sensibilidade à dor, quando comparados com exercícios de baixa intensidade98. Diferentes sistemas de sinalização podem contribuir para a analgesia induzida pelo exercício físico; ela pode ser mediada pela ativação de opióides endógenos, fatores de crescimento, ativação do mecanismo inibitório supraespinal controlado pelo SNC99 e por concentrações elevadas de endocanabinóides produzidos centralmente21. Trabalhos pré-clínicos demonstram que o exercício físico influencia o limiar sensorial, reduzindo a nocicepção. O exercício aeróbio impede o desenvolvimento de dor muscular crônica26, apresenta efeito neuroprotetor mostrando-se eficaz no restabelecimento da função motora após esmagamento ou constrição do nervo isquiático (CCI)100,101. 30 A natação é uma alternativa de exercícios aeróbios de alta intensidade para estudos de nocicepção; após períodos de treinamento observa-se um efeito de redução da nocicepção17, além de alívio nos quadros de dor neuropática após CCI102. Quando comparados o treinamento da natação com o treinamento em esteira, em ambos os casos verifica-se redução da nocicepção após CCI103. Pelo fato de que os efeitos analgésicos observados após sessões de exercício são de longa duração, especula-se que a ativação de receptores metabotrópicos esteja mediando estes efeitos. Por este motivo, os receptores acoplados à proteína G são amplamente estudados para verificar os efeitos benéficos do exercício físico 104,105,19,20,106,107. Os estudos tem demonstrados o envolvimento do sistema opióide na analgesia induzida pelo exercício físico observa-se; um aumento na expressão dos receptores opióides104,106, aumento de peptídeos opióides em regiões como o tronco encefálico, um importante sítio de modulação da dor107; ativação de receptores opoóides (após a pratica de treinamento resistido)19; glândulas supra-renais também liberam opióides endógenos e é possível que o exercício físico da natação tenha interação com este efeito17. Dentro da família dos opióides endógenos, a β-endorfina, um tipo de endorfina, tem um papel essencial na analgesia. O exercício provoca a liberação de β-endorfinas a partir da hipófise e hipotálamo o que permite o efeito analgésico pela ativação de receptores opióide do tipo μ, tanto periféricos como centrais108. A região hipotalâmica, por meio de suas projeções na substância cinzenta periaquedutal, ativam mecanismos inibitórios descendentes nociceptivos109. A participação do sistema canabinóide na analgesia induzida pelo exercício físico tem sido recentemente demonstrada. Galdino et al. (2010)20, observou que o exercício aeróbio reduz a nocicepção mecânica e térmica ao mesmo tempo em que aumenta as concentrações endógenas de anandamida e 2-AG e a expressão de RsCB1 nos neurônios da substância cinzenta periaquedutal. O treinamento resistido também é capaz de induzir hiponocicepção liberando EC após uma única sessão de treinamento19. A adenosina pode exercer um efeito significativo sobre a adaptação do organismo à prática de exercícios físicos, influencia a regulação dos mecanismos de angiogênese, a produção de eritropoietina, o fluxo de sangue, a pressão arterial sistólica, a respiração, os níveis plasmáticos de norepinefrina e epinefrina110. 31 Exercícios realizados em alta intensidade aumentam as concentrações de adenosina e inosina111. Também observa-se um aumento paralelo de ATP, o músculo esquelético utiliza mais ATP do que é capaz de regenerar levando ao acúmulo de ADP e AMP dentro da célula. Para evitar um grande acumulo de AMP dentro da célula, o AMP é desaminado em monofosfato de inosina (IMP) e amônia, através da enzima AMP desaminase112. Uma fração do IMP que é formado durante o exercício é degradado em inosina e hipoxantina esta, por sua vez atravessa a membrana celular 113 . Ainda, a relação de suprimento de oxigênio para demanda diminui durante as contrações musculares, sugerindo um limite da ressíntese de ATP aeróbia, provocando uma quebra líquida de ATP em adenosina114. Por outro lado, embora a adenosina contribua para a vasodilatação muscular esquelética durante hipoxia sistêmica115, a saída de adenosina é suprimida através da inibição da entrada de lactato na célula116. O sistema adenosinérgico também está envolvido no efeito de redução da nocicepção através da prática de exercícios como mostra um estudo recente de Martins et al. (2013) 117, onde o treinamento da natação reduz a alodinia mecânica, e que este efeito é mediado, pelo menos em parte, pela ativação de receptores para a adenosina A1. 1.1.5 Sinalização proteína G i / o /AMPC/PKA e dor No genoma humano a PKA faz parte do grupo da superfamília de cinases AGC, caracterizada por possuir uma dobra cinase bipodal com um pequeno lóbulo amino (N-lóbulo) além de um grande lóbulo carboxi-terminal (C-lóbulo) e uma molécula de ATP, que serve como doador de fosfato durante a fosforilação118. Proteínas cinases, como a PKA catalisam reações de fosforilação, (a fosforilação, é a adição de um radical fosfato -PO32 a uma proteína que resulta na alteração de sua conformação espacial) a carga eletronegativa promove a modificação da função da proteína, podendo, ativá-la ou desativá-la, para essa reação PKA é regulada pelo segundo mensageiro AMPc118. A PKA é uma holoenzima tetramérica constituída por duas subunidades catalíticas (C) contendo três isoformas Cα, Cβ, Cγ e duas subunidades reguladoras (R) contendo quatro isoformas, RIα, RIβ, RIIα, RIIβ. As subunidades R da PKA controlam sua atividade exclusivamente de acordo com os níveis do AMPc. Na 32 ausência de AMPc, as subunidades R se ligam às subunidades C e sua atividade é suprimida (Figura 4)120,121. Hormônio Membrana plasmática Adenilil Ciclase Mitocôndira Proteína G Heretomérica AMPc AMPc AMPc Citosol Transcrição Núcleo Quatro isoformas: Três isoformas: Substratos Figura 4- Proteína cinase A Legenda: A PKA inclui subunidades reguladoras (R) e (C) catalíticas e substratos alvo (tais como proteínas de ancoragem para cinase A (AKAPs) que direcionam a PKA para sítios específicos da célula em estreita proximidade com os substratos. Fonte: Adaptado de Taylor et a., 2012121. A enzima AC sintetiza o segundo mensageiro AMPc mediante ativação de receptores acoplados à proteína G. Ocorre a catálise de GDP por GTP, a subunidade α se dissocia da β e γ e ativa a AC, que converte o ATP em AMPc. O AMPc se liga as subunidades R da PKA, induzindo uma alteração conformacional. A mudança, por sua vez, libera as subunidades catalíticas da subunidade R permitindo 33 que elas fosforilem o substrato (Figura 4)120,121. A subunidade catalítica tem dois resíduos de fosforilação C-terminal, Serina (Ser338) e treonina (Thr197)122. A localização da PKA determina quais substratos serão fosforilados, e a localização depende das proteínas de ancoragem conhecidas como AKAPs, elas se ligam a subunidade R da PKA118. São as AKAP que fornecem estrutura molecular e orientam a extensão e duração da sinalização da PKA para regiões específicas próximas a substratos em diferentes tipos de células123. A maioria dos AKAPs tem afinidade específica para a subunidade reguladora RII, algumas têm dupla especificidade e podem se ligar a RI, RII ou outras, como SKIP (que funciona como uma AKAP), são específicos para a subunidade-RI. Ao ligar-se a diferentes subunidades reguladoras, as AKAPs montam complexos que regulam diversas funções (Figura 4)119,123. A rota de sinalização que ativa a PKA pode fosforilar CREB, que permite que ele se ligue a coativadores que estimulam a RNA-polimerase (ácido ribonucléico) e inicia a síntese de RNA, este é então processado e exportado ao citoplasma onde serve como RNA para a tradução de proteína124. O principal evento intracelular após a ligação do agonista em um receptor acoplado a proteínas G i / o é a inibição da proteína efetora adenilato ciclase, subsequentemente inibição do segundo mensageiro AMPc, que por sua vez inibe a atividade da PKA tendo como consequência a diminuição na fosforilação da proteína alvo. Os receptores canabinóide, CB1, opióides e para a adenosina A1, são receptores acoplados à proteína G i / o 22,23. O aumento dos níveis de AMPc em neurônios estão geralmente associados com o aumento da nocicepção, enquanto moléculas que diminuem a síntese de AMPc tem efeitos analgésicos126. O aumento da PKA está relacionado à sensibilização central, um evento que ocorre após a estimulação intensa ou persistente dos nociceptores. Neste evento através dos receptores ionotrópicos para o GLU do tipo NMDA ocorre um aumento do cálcio intracelular, desencadeando uma série de sinalizações dependentes de cálcio que ativam várias proteínas, entre elas a PKA. Esta cascata de eventos aumenta a excitabilidade do neurônio e facilita a transmissão de dor para o cérebro 2,32. 34 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar o efeito da natação de alta intensidade na nocicepção somática e hiperalgesia induzidas pelo GLU, analisando o papel de diferentes receptores e via envolvida neste efeito. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Verificar a influência de uma ou duas semanas de natação na nocicepção química somática induzida pelo GLU, em camundongos; - Observar a influência da natação na hiperalgesia mecânica induzida pelo glutamato, em camundongos; - Investigar o envolvimento de receptores canabinóides centrais (medula espinal) e periféricos (pata) no efeito da natação, em camundongos; - Verificar o envolvimento de receptores opióides centrais (medula espinal) e periféricos (pata) no efeito da natação, em camundongos; - Investigar o envolvimento dos receptores para adenosina centrais (medula espinal) e periféricos (pata) no efeito da natação, em camundongos; - Avaliar a expressão de diferentes isoformas de PKA central (medula espinal) e periférica (pata) no efeito da natação, em camundongos. 35 3 MÉTODOS 3.1 ASPECTOS ÉTICOS O número de animais utilizados e a intensidade do estímulo nocivo foram os mínimos necessários para demonstrar o efeito da possível redução da nocicepção induzida pela natação. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas éticas para o estudo de dor em animais de laboratório, após o termino dos experimentos os animais passaram pela morde indolor assistida (MIA). Os procedimentos experimentais realizados foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Unisul sob o número 13.020.4.06.IV. 3.2 ANIMAIS Na presente pesquisa foram utilizados camundongos Swiss machos, com idade entre 45-60 dias, (30-35 g) advindos do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) que permaneceram no biotério de manutenção do Laboratório de Neurociência Experimental (LaNEx) da UNISUL, até o término dos experimentos. Os animais tiveram livre acesso à ração e água potável, foram mantidos à temperatura de 22±2oC e ciclo 12h-claro/12h-escuro (claro a partir das 6h:00min). 3.3 FÁRMACOS E REAGENTES As seguintes substâncias foram utilizadas: Cloridrato de ácido L-glutâmico (Glutamato) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA), 1-2,4-Dichlorofenill-5-4iododenil-4-metill-N-4-morpofenil-1H-pirazole-3-carboxamida, (AM281), diluído em Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA), Naloxona hidrochlorida diidrato, (Naloxona), diluída em solução salina isotônica (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA) 1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina (DPCPX), diluído em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri EUA). Os reagentes 36 utilizados nos ensaios bioquímicos estão descritos no texto. Os antagonistas foram administrados por via intratecal (i.t.) ou intraplantar (i.pl). 3.4 NOCICEPÇÃO SOMÁTICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO INTRAPLANTAR DE GLUTAMATO O procedimento utilizado foi semelhante ao descrito previamente por Beirith et al. (2002)45. O aminoácido excitatório GLU (20 μl; 20 μmol/pata) preparado em solução salina isotônica, com pH ajustado para 7,4 foi injetado subcutaneamente na superfície ventral da pata direita dos camundongos (injeção i.pl.). Em seguida, os camundongos foram colocados individualmente em funis de vidro transparente, e o tempo em que os camundongos permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada foi considerado como indicativo de nocicepção cronometrado por um período de 15 minutos. 3.5 MENSURAÇÃO DA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELA INJEÇÃO DE GLUTAMATO A hiperalgesia mecânica foi avaliada utilizando monofilamento de Von Frey como previamente descrito por Martins et al. (2013)18. Os valores percentuais referentes à frequência de retirada da pata, frente a 10 estimulações da pata posterior direita com o monofilamento de Von Frey (0,4 g) (VFH, Stoelting, Chicago, USA), foram considerados como indicativo de hiperalgesia mecânica. No dia anterior à injeção, os camundongos foram submetidos ao teste de von Frey para caracterização da resposta basal. Foram selecionados apenas os animais que apresentaram porcentagens de resposta igual ou inferior 20%. Quinze minutos após à injeção intraplantar de glutamato os animais foram colocados individualmente, para ambientação, em um acrílico (9 x 7 x 11 cm), sem fundo e coberto com tampa, posicionado sobre uma plataforma com dimensões de 70 x 40 cm, que consistia em uma grade de arame (metal) com malha de 6 mm. O filamento foi aplicado na pata posterior direita (a mesma pata que recebeu a injeção de glutamato), atendendo a alguns critérios como: aplicação feita perpendicularmente à superfície plantar com pressão suficiente para proporcionar a curvatura do filamento, obtendo-se assim pressão total; os camundongos foram avaliados quando as quatro patas estavam 37 acomodadas sobre a tela; a resposta de retirada foi considerada positiva quando os animais removiam totalmente a pata da grade de apoio. Os testes foram realizados em 0,5, 1, 3 e 6 horas após a injeção i.pl. de GLU. 3.6 NATAÇÃO O protocolo de natação realizado foi uma versão adaptada do previamente descrito por Mazzardo-Martins et al. (2010)17. Neste protocolo, os camundongos nadaram por 2 semanas consecutivas. Inicialmente, os animais foram colocados em uma caixa plástica com capacidade máxima para 35 litros de água, medindo 540 x 390 x 325 mm, dividida por um acrílico, em oito compartimentos (raias) de 170 x 110 mm cada. A caixa plástica foi enchida com água até uma profundidade de 280 mm. A água foi mantida aquecida a 35ºC. Sabão líquido foi acrescentado (1 ml por compartimento, totalizando 8 ml - 229 μl/l) com o intuito de reduzir a tensão superficial da água e evitar o comportamento de flutuação. Após cada sessão de natação os camundongos foram cuidadosamente secos em maravalha limpa. No primeiro dia o grupo exercitado foi submetido a duas sessões de natação com duração de 30 segundos cada, intervaladas por 120 minutos de repouso (Figura 5). No segundo dia foram realizadas mais duas sessões de 2 minutos de duração com repouso de 120 minutos (Figura 5). No terceiro dia foram realizadas 3 sessões de natação com duração de 10 minutos, intervaladas por um período de 5 minutos de repouso (Figura 5). No quarto dia os camundongos foram submetidos a duas sessões de 15 minutos, intervaladas por 5 minutos de repouso (Figura 5). A partir do quinto dia até o nono dia de exercício eles nadaram por 30 minutos continuamente (sem repouso). Realizou-se uma pausa de dois dias e após a pausa mais 5 dias de natação com tempo total de natação de 30 minutos (Figura 5). No décimo sétimo dia (24 horas após a última sessão de natação) os camundongos foram submetidos aos testes comportamentais de nocicepção (Figura 5). Um outro grupo de animais passou pelo procedimento de adaptação (1-4 dias) seguido de 5 dias de natação, realizando somente uma semana de natação. 38 Figura 5 - Esquema representando a execução do protocolo de natação e o dia do teste nociceptivo. Legenda: NAT: Tempo da natação, REP: Tempo em repouso, NAT T: Tempo total de execução da natação. 3.7 MENSURAÇÃO DA INTENSIDADE DO EXERCÍCIO DE NATAÇÃO Com o objetivo de determinar a intensidade da natação os grupos de animais não-exercitados e exercitados (duas semanas de natação), na última sessão de exercício do grupo exercitado foi realizada coleta de lactato sanguíneo. Neste mesmo experimento o grupo de animais não-exercitado foi submetido a 30 minutos de natação e o sangue foi coletado. As coletas foram realizadas em dois momentos, no décimo e no trigésimo minuto de natação. Para as análises foi retirada uma gota de sangue da cauda dos camundongos até o preenchimento da fita de coleta do lactato126, assim por meio de um lactímentro portátil (Accutrend® Roche, Basel, Suiça), foi realizada a mensuração do nível sanguíneo de lactato. 39 3.8 ANÁLISE DO MECANISMO BIOLÓGICO DO EFEITO DA NATACÃO Conforme resultados positivos obtidos no modelo de nocicepção somática anteriormente descrito, a próxima etapa deste trabalho foi analisar o mecanismo que poderia estar envolvido na redução da nocicepção induzida pela natação. Para este fim, foi utilizado o modelo de nocicepção induzida pelo glutamato, sendo que o tempo de exercício escolhido foi de duas semanas de natação, finalizado 24 horas antes da realização dos experimentos. As doses das drogas utilizadas foram selecionadas com base em dados da literatura ou então baseadas em resultados prévios do laboratório. Os experimentos foram realizados seguindo o esquema de tratamentos ilustrado na figura 6. Figura 6: Esquema de tratamento utilizado para avaliar o mecanismo neurobiólogo. Legenda: Receptores a serem bloqueados: canabinóide, CB1, opióides e adenosinérgicos A1. Tratamento: exercitado ou não exercitado. Antagonista ou veículo, injeções: (i.t. volume 5 l. i.pl. volume 20 l, AM281 concentração 10 g/i.pl e 2 g/i.t, Naloxona concentração 5 µg/i.pl., 5 µg/i.t., DPCPX 10 nmol/i.pl., 10 nmol/i.t.), Glutamato: teste nociceptivo induzido pela injeção i.pl. de glutamato. i.t.: Intratecal; i.pl.: intraplantar. 40 3.8.1 Análise da participação dos receptores canabinóides 1 (CB1) na redução da nocicepção induzida pela natação No intuito de analisar o papel dos receptores CB1, tanto espinais quanto periféricos, sobre a redução da nocicepção causada pela natação, o AM281 (um antagonista seletivo para receptores CB1) foi administrado por via i.pl. (10 µg/i.pl.) ou i.t. (2 µg/i.t.)127, 15 minutos antes da última sessão de natação e 24 horas após a última sessão de natação (15 min antes do teste nociceptivo) (ver Figura 6). O procedimento utilizado para a injeção intratecal foi similar ao descrito previamente por Hylden e Wilcox (1980) 128. Após tricotomia da pele do dorso, os camundongos foram imobilizados manualmente e uma agulha conectada a uma microseringa de 25 μl foi inserida através da pele no espaço subaracnóideo entre as vértebras espinais L5-L6. A resposta nociceptiva ocasionada pela administração i.t. do volume de 5 μl dos antagonistas. Para avaliar a participação dos receptores CB1 periféricos os camundongos foram imobilizados dentro de um cone de 15 cm durante alguns segundos para a realização da administração do antagonista para receptores CB1. O volume de 20 μl foi administrado na superfície ventral da pata direita. 3.8.2 Análise da participação dos receptores opióides na redução da nocicepção induzida pela natação Com o objetivo de evidenciar a participação do receptores opióides, tanto espinais quanto periféricos sobre a redução da nocicepção causada pela natação, naloxona (um antagonista não seletivo para receptores opióides) foi administrada por via i.pl. (5 µg/i.pl.) ou i.t. (5 µg/i.t.)129, 15 minutos antes da última sessão de natação e 24 horas após a última sessão de natação (15 min antes do teste nociceptivo). Os procedimentos utilizados para as injeções i.t. e i.pl. foram similares aos descritos no item 3.8.1. 41 3.8.3 Análise da participação dos receptores adenosinérgicos 1 (A1) na redução da nocicepção induzida pela natação E, finalmente, para avaliar o envolvimento dos receptores para adenosina, tanto espinais quanto periféricos sobre a redução da nociepção causada pela natação, 1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina DPCPX (um antagonista seletivo de receptores para adenosina A1) foi administrado por via i.pl. (10 nmol/i.pl.) ou i.t. (10 nmol/i.t.)18, 15 minutos antes da última sessão de natação e 24 horas após a última sessão de natação (15 min antes do teste nociceptivo). Os procedimentos utilizados para as injeções i.t. e i.pl. foram similares aos descritos no item 3.8.1. 3.9 AVALIAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA CINASE A (PKA) Com o objetivo de avaliar o envolvimento da PKA fosforilada (p-PKA) na redução da nocicepção causada pela natação. Novos grupos de camundongos foram submetidos a duas semanas de natação e 24 horas após a última sessão de natação receberam uma injeção i.pl. de GLU. Quinze minutos após os camundongos foram eutanasiados e os tecidos da medula espinal (lombar) e da pele da pata foram coletados para quantificação da expressão de PKA fosforilada. Para análise dessas amostras foi utilizada a técnica de Western blotting, descrita previamente por Leal et al. (2002)130. 3.9.1 Preparação dos homogenatos As amostras de tecido (medula espinhal e pata) foram individualmente homogeneizadas em tampão de lise (CLB, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, EUA) e centrifugadas a 1.000xg durante 15 minutos a 4° C. O sobrenadante foi coletado e o teor de proteínas determinado por método colorimétrico (Reagente de Bradford, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, com a finalidade de igualar a concentração de proteínas nas amostras, estas foram individualmente diluídas em água ultrapura (MilliQ) e imediatamente estabilizadas pela adição de 20% de tampão de amostra (Tris 200 mM, glicerol 0%, SDS 2%, β-mercaptoethanol 42 2,75 mM e bromofenol blue 0.04%) e fervura durante 5 minutos. Uma vez estabilizadas, as amostras foram mantidas a -80° C até o momento do uso. 3.9.2 Ensaio de Western blotting O ensaio de Western blotting realizado foi uma versão adaptada de Leal et al.(2002). Cada amostra foi utilizada em um volume de 40 µg de proteínas, as quais foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%. Em seguida, as proteínas separadas no gel foram transferidas, também por eletroforese, para membranas de nitrocelulose, as quais foram incubadas durante duas horas com solução de bloqueio TBS-T (Tris 2 mM; NaCl 1 M; Tween-20 0.2% - pH 7.4) contendo 5% de albumina bovina, de modo a bloquear sítios de ligação inespecífica do anticorpo. Na sequência, as membranas foram lavadas com TBS-T e incubadas durante toda a noite (overnight), sob refrigeração (4° C) e agitação, com o anticorpo primário (anticorpo de camundongo) para as subunidades catalíticas fosforiladas da PKA (anticorpo de coelho) para p-PKAα/β/γ; (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA) ou com o anticorpo primário de camundongo anti-α-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA), utilizado como controle, ambos diluídos a 1:1000 em solução de TBS-T contendo 1.0 % de albumina bovina. Após a incubação as membranas foram novamente lavadas com TBS-T e, em seguida incubadas durante duas horas com os respectivos anticorpos secundários específicos (anticorpo de coelho e camundongo pPKA, α-tubulina, respectivamente), Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EUA) ambos diluídos 1:5000 em solução de TBS-T contendo 1.0 % de albumina bovina a temperatura ambiente. A visualização das bandas imunorreativas foi realizada utilizando o método de quimioluminescência (ECL; Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA) através do aparelho Chemidoc BioRad de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad, Hercules, Califórnia, EUA). A análise semi-quantitativa das bandas foi avaliada pelo programa “Image Lab” software 4.1 (Bio-Rad, Hercules, Califórnia, EUA). Os resultados são expressos como p-PKA/tubulina em unidades arbitrárias (UA). 3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA Inicialmente foi realizado o teste de normalidade dos dados através de Shapiro-Wilk. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média 43 (E.P.M.). Nos experimentos onde se avaliaram o efeito da natação nas concentrações de lactato, na nocicepção e hiperalgesia mecânica induzida pelo glutamato foram utilizadas análises de variância – ANOVA de duas vias. Quando significativa, a ANOVA foi seguida pelo teste de Bonferroni (Fator 1: Natação e Fator 2: Tempo). Na avaliação do mecanismo neurobiológico do efeito da natação na redução da nocicepção induzida pelo glutamato também foi utilizada ANOVA de duas vias (Fator 1: tratamento com fármaco e fator 2: Natação). Para análise da expressão de diferentes isoformas de PKA foi empregada a ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Student-Newmann-Keuls. Em todas as análises, os valores de P menores que 0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Para o cálculo estatístico, de todos os experimentos foi utilizado o software GraphPad Prism 6.0 versão para MAC (GraphPad Software, Inc., San Diego, California, EUA). 44 4 RESULTADOS 4.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRACÃO DE LACTATO SANGUÍNEO (INTENSIDADE DA NATAÇÃO) Conforme resultados mostrados na Figura 7, observa-se que as concentrações de lactato sanguíneo foram de 3,30 0,53 e 1,9 0,39 mmol/l no décimo minuto dos animais não-exercitado e exercitado, respectivamente. No trigésimo minuto, notou-se que os animais não-exercitados e exercitados apresentaram concentrações de lactato sanguíneo de 9,47 0,47 e 4,52 0,93 mmol/l, respectivamente. Assim os animais não exercitados e exercitados apresentaram aumentos de 150 e 250 % das concentrações de lactato sanguíneo. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para o tratamento (natação) (F(1,24) = 25.95; p < 0,0001), tempo (F(1,24) = 49.94; p < 0,0001) e para a interação tratamento × tempo (F(1,24) = 8.186; p < 0,0086). Além disso, o teste de Post hoc indicou uma significativa diferença entre os grupos nas concentrações de lactato sanguíneo no trigésimo minuto (p < 0,0001). Figura 7- Concentrações de lactato sanguíneo Legenda: Determinação das concentrações de lactato sanguíneo. Cada ponto representa a média de 8 animais. # p < 0,05, quando comparado o mesmo grupo com o tempo de 10 minutos de natação. * p < 0,05, quando comparados com o grupo exercitado no tempo de 30 minutos de natação. ANOVA de duas vias, seguida pelo teste de Bonferroni. Min: minutos. 45 4.2 EFEITO DA NATAÇÃO NA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELO GLU Os resultados apresentados na Figura 8 demonstram que a natação diminuiu de maneira significativa a nocicepção induzida pelo GLU. A natação quando realizada somente por uma semana reduziu a nocicepção somática em 22 ± 4%. No entanto, foi observada uma redução de 42 ± 5% quando a natação foi realizada por duas semanas. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para o tratamento (natação) (F(1,28) = 40.15; p < 0,0001), tempo (F(1,28) = 7.51; p < 0,0106), no entanto, não houve interação tratamento × tempo (F(1,28) = 3.296; p < 0,0802). Além disso, o teste de Post hoc indicou significativa diferenças entre os grupos de animais exercitados tanto por uma (p < 0,05) quanto duas (p < 0,001) semanas de natação, quando comparados com seus respectivos controles. Figura 8 – Efeito da natação na nocicepção induzida pelo GLU. Legenda: Efeito de 1 ou 2 semanas de natação na nocicepção induzida pelo GLU. Cada coluna representa a média de 8 camundongos. *P<0,05 e ***P<0,001, quando comparado com o grupo nãoexercitado. ANOVA de duas vias, seguida pelo teste de Bonferroni. 1 sem: uma semana de natação; 2 sem: duas semanas de natação. 46 4.3 EFEITO DA NATAÇÃO NA HIPERALGESIA MECÂNICA INDUZIDA PELO GLU Os resultados apresentados na Figura 9 demonstram o decurso temporal da hiperalgesia mecânica induzida pela injeção i.pl. de GLU, e o efeito de 2 semanas de natação. Observou-se que a natação também reduziu a hiperalgesia mecânica induzida pelo GLU em 0,5, 1, 3 e 6 horas após a injeção, com inibições de 13±5%, 29±9%, 42±8%, 81±6%, os valores ficam incoerentes como o professor sugeriu fazer também devemos retirar do gráfico os horários não analizados, respectivamente. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para o tratamento (natação) (F(2,84) = 97.44; p < 0,0001), tempo (F(3,84) = 16.49; p < 0,0001) e para a interação tratamento × tempo (F(6,84) = 5.44; p < 0,0001). Além disso, o teste de Post hoc mostrou uma significativa diferença entre os grupos de animais exercitados e não exercitados em 0,5 (p < 0,05), 1 (p < 0,01), 3 (p < 0,01) e 6 horas (p < 0,05) após a injeção de GLU. Figura 9- Efeito da natação na hiperalgesia mecânica induzida pelo GLU. Legenda: Efeito da hiperalgesia mecânica induzida pela injeção de GLU. Cada ponto representa a média dos valores obtidos em 8 animais. *P<0,05, quando comparado com o grupo não-exercitado). #P<0,05, diferenças significativas entre os grupos não exercitado + glutamato quando comparado com o grupo não exercitado + salina. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni. 47 4.4 ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G ESPINAIS NA REDUÇÃO DA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA NATAÇÃO Os resultados mostrados na Figura 10, painel A, indicam que o prétratamento dos animais com AM281 (2 µg/i.t.) preveniu completamente a redução da nocicepção induzida pela natação. A A NOVA de duas vias revelou diferença significativa para a natação (F(1,22) = 15.74; p < 0,0007) e para a interação natação × AM281 (F(1,22) = 9.205; p < 0,0061), mas não para o tratamento com AM281 (F(1,22) = 1.166; p < 0,2920). A análise post-hoc indicou que o pré-tratamento dos animais com AM281 preveniu (p < 0,01) o efeito da natação. A figura 10, painel B, ilustra o efeito da administração espinal de naloxona no efeito da natação. Assim nota-se que o pré-tratamento dos animais com naloxona (5 µg/i.t.) também preveniu completamente a redução da nocicepção induzida pela natação. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para a natação (F(1,25) = 16.45; p < 0,0004) e para a interação natação × naloxona (F(1,25) = 12.43; p < 0,0017), mas não para o tratamento com naloxona (F(1,25) = 0.5707; p < 0,4570). A análise post-hoc indicou que o pré-tratamento dos animais com naloxona preveniu (p < 0,01) o efeito da natação. No painel C da figura 10, observa-se o efeito da administração espinal de DPCPX no efeito da natação. O pré-tratamento dos animais com DPCPX (10 nmol/i.t.) também foi capaz de prevenir completamente a redução da nocicepção induzida pela natação. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para a natação (F(1,26) = 20.86; p < 0,0001) e para a interação natação × DPCPX (F(1,26) = 16.38; p < 0,0004), mas não para o tratamento com DPCPX (F(1,26) = 0.02275; p < 0,8813). A análise post-hoc indicou que o pré-tratamento dos animais com DPCPX preveniu (p < 0,001) o efeito da natação. 48 Figura 10. Envolvimento de receptores acoplados a proteína G espinais na redução da nocicepção induzida pela natação. Legenda: Efeito do pré-tratamento espinal dos animais com AM281, naloxona ou DPCPX na redução da nocicepção induzida pela natação no modelo de nocicepção somática causada pelo GLU. A primeira coluna indica os animais não-exercitados; a segunda representa os animais não-exercitados e tratados com os respectivos antagonistas; a terceira indica os animais exercitados; a quarta coluna é representativa das prevenções dos tratamentos com os respectivos antagonistas e que realizaram exercício. Cada coluna representa a média de 8 animais e as linhas verticais indicam o Erro Padrão da Média (S.E.M.). Os símbolos denotam os níveis de significância *P < 0,05 quando comparados ao grupo não-exercitado e pré-tratados com salina; # P < 0,05 quando comparados ao grupo exercitado e pré-tratados com salina. ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni. 4.5 ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G PERIFÉRICOS NA REDUÇÃO DA NOCICEPÇÃO INDUZIDA PELA NATAÇÃO Figura 11, painel A, nota-se que o pré-tratamento dos animais com AM281 (2 µg/i.pl.) não preveniu completamente a redução da nocicepção induzida pela natação. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para a natação (F(1,26) = 8.783; p < 0,0064), mas não para a interação natação × AM281 (F(1,26) = 0.02857; p < 0,8671) e para o tratamento com AM281 (F(1,26) = 2.115; p < 0,1579). Os dados da figura 11, painel B, mostram o efeito da administração periférica de naloxona no efeito da natação. O pré-tratamento dos animais com naloxona (5 µg/i.pl.) preveniu completamente a redução da nocicepção induzida pela natação. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para a natação (F(1,25) = 10.06; p < 0,0040) e para a interação natação × naloxona (F(1,25) = 6.957; p < 0,0142), mas não para o tratamento com naloxona (F(1,25) = 2.817; p < 0,1058). A análise post-hoc indicou que o pré-tratamento dos animais com naloxona preveniu (p < 0,01) o efeito da natação. 49 E finalmente, na figura 11, painel C, observa-se o efeito da administração periférica de DPCPX no efeito da natação. O pré-tratamento dos animais com DPCPX (10 nmol/i.pl.), também foi capaz de prevenir completamente a redução da nocicepção induzida pela natação. A ANOVA de duas vias revelou diferença significativa para a natação (F(1,25) = 7.356; p < 0,0119) e para a interação natação × DPCPX (F(1,25) = 9.536; p < 0,0049), mas não para o tratamento com DPCPX (F(1,25) = 4.060; p < 0,0548). A análise post-hoc indicou que o pré-tratamento dos animais com AM281 preveniu (p < 0,05) o efeito da natação. Figura 11. Envolvimento de receptores acoplados a proteína G periféricos na redução da nocicepção induzida pela natação. Legenda: Efeito do pré-tratamento periférico dos animais com AM281, naloxona ou DPCPX na redução da nocicepção induzida pela natação no modelo de nocicepção somática causada pelo glutamato. A primeira coluna indica os animais não-exercitados; a segunda representa os animais não-exercitados e tratados com os respectivos antagonistas; a terceira indica os animais exercitados; a quarta coluna é representativa das reversões dos tratamentos com os respectivos antagonistas e que realizaram exercício. Cada coluna representa a média de 8 animais e as linhas verticais indicam o Erro Padrão da Média (S.E.M.). Os símbolos denotam os níveis de significância *P < 0,05 quando comparados ao grupo não-exercitado e pré-tratados com salina; # P < 0,05 quando comparados ao grupo exercitado e pré-tratados com salina. ANOVA de duas via seguida pelo teste de Bonferroni. 50 4.6 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE DIFERENTES ISOFORMAS DE PROTEÍNA CINASE A FOSFORILADA Os resultados apresentados na figura 12 (painéis A, C e E) mostram que a injeção i.pl. de glutamato em animais não exercitados aumentou a expressão das isoformas / (fração) (p < 0,05) e totais (p < 0,05), da proteína cinase A (PKA), mas não da isoforma (p > 0,05), na medula espinal, quando comparados com os animais não-exercitados que receberam apenas injeção i.pl. de salina. Interessantemente, foram observadas expressões significativamente menores das isoformas / (fração) (p < 0,05) e totais (p < 0,05) de PKA na medula espinal de animais exercitados, quando comparados com os animais não-exercitados que receberam injeção i.pl. de glutamato (Figura 12, painéis A, C e E). Na figura 12 (painéis B, D e F) evidencia-se que a injeção i.pl. de glutamato em animais não exercitados, além de aumentar a expressões das isoformas / (fração) (p < 0,05) e totais (p < 0,05), da PKA, também aumentou a expressão da isoforma (p < 0,05), na pata, quando comparados com os animais não-exercitados que receberam apenas injeção i.pl. de salina. Notadamente, foram observadas expressões significativamente menores das isoformas / (fração) (p < 0,01), isoforma (p < 0,01) e totais (p < 0,05) de PKA na pata de animais exercitados, quando comparados com os animais não-exercitados que receberam injeção i.pl. de glutamato (Figura 12, painéis A, C e E). 51 Não-exercitado (Sal., 20 ml/i.pl.) Não-Exercitado (Glu/i.pl.) Medula espinal 15 15 12 9 6 3 0 Pata B pPKA b/Tubulina (UA) p-PKA b/Tubulina (UA) A Salina Glu Exercitado (Glu/i.pl.) # 12 9 * 6 3 0 Glu Salina Glu Glu a Tubulina p-PKA a/g/Tubulina (UA) C D 15 12 # 9 6 ** 3 0 pPKA a/g/Tubulina (UA) p- PKA b 15 # 12 9 ** 6 3 0 Salina Glu Glu Salina Glu Glu a Tubulina p- PKA a/d E 25 # 20 15 ** 10 5 0 Salina Glu Glu pPKA total/Tubulina (UA) p-PKA total/Tubulina (UA) F 30 30 # 25 20 15 * 10 5 0 Salina Glu Glu a Tubulina p- PKA Total Figura 12 - Atividade da PKA em camundongos. Legenda: Efeito da natação na expressão de diferentes isoformas de PKA. A primeira coluna indica o grupo de animais não-exercitados que recebeu injeção i.pl. de salina; a segunda representa o grupo de animais não-exercitados que recebeu injeção i.pl. de glutamato e a terceira coluna indica o grupo de animais exercitados que recebeu injeção i.pl. de glutamato. Cada coluna representa a média de 8 animais e as linhas verticais indicam o Erro Padrão da Média (S.E.M.). # p < 0,05 quando comparado com o grupo não-exercitado + salina; *p < 0,05 ou **p < 0,05 quando comparados ao grupo nãoexercitado + glutamato. ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls. Sal: Salina; Glu: Glutamato; i.pl.: intraplantar; i.t.: intratecal. 52 5 DISCUSSÃO Os resultados do presente estudo demonstram que sessões diárias de natação reduz a nocicepção somática induzida pelo agente flogístico GLU em camundongos. Este efeito neurobiológico do exercício parece ser mediado pelo menos em parte pela ativação de receptores opióides e A1 periféricos e receptores CB1, opióides e A1 e espinais, os quais culminam em uma ação intracelular comum, a inibição da PKA. Está bem estabelecido na literatura que a prática de exercícios aeróbios como a natação promove adaptações fisiológicas como, por exemplo, alteração na máxima fase estável de lactato (MFEL), considerada um importante marcador do condicionamento induzido pela prática de exercícios físicos126,131,132. A MFEL pode ser definida como a concentração de lactato sanguíneo mais alta e carga de trabalho que se mantém ao longo do tempo, sem acúmulo de lactato132. Dentro dos métodos utilizados para o desenvolvimento de adaptações aeróbias e prescrição de treinamento, a determinação da MFEL é um dos mais adequados 132,133. Diante disso, a determinação da MFEL foi utilizada neste estudo com dois propósitos; inicialmente, para determinar o domínio fisiológico dos animais submetidos há 2 semanas de natação; e por fim, para verificar se o protocolo de natação utilizado foi eficiente em promover mudanças fisiológicas em relação ao treinamento. Como encontrou-se um aumento superior a 1 mmol/L do lactato sanguíneo entre o décimo e o trigésimo minuto de natação, verificou-se mesmo realizando duas semanas de natação, no último dia (16º) os animais ainda se exercitavam acima da MFEL133 em um domínio de exercício severo. Os dados referentes a determinação da MFEL realizada na primeira semana, corroboram com os achados de Mazzardo-Martins et al., (2010)17 que também observaram uma grande elevação nas concentrações de lactato sanguíneo em animais que nadaram por 5 dias consecutivos, nas mesmas condições do presente estudo. O treinamento de natação está classificado dentro do domínio severo, onde não existe máxima fase estável de lactato, ele se eleva por todo o tempo até a exaustão86. Interessante, são os resultados que mostraram diferença significativa nas concentrações de lactato sanguíneo entre os grupos não exercitados e exercitados, quando comparados tanto no décimo como no trigésimo 53 minuto, no 16º dia de natação. Os valores menores nas concentrações de lactato no grupo exercitado sugerem que a natação induziu mudanças metabólicas suficientes para alterar o metabolismo do lactato (produção e remoção). O que é consistente com achados de que os efeitos neurobiológicos do exercício também são dependentes de intensidade134,135. Alguns estudos demonstraram o importante efeito do exercício físico em reduzir a nocicepção em modelos experimentais17,101,20. O aminoácido excitatório GLU, contribui para o desenvolvimento e/ou manutenção da dor envolvendo sítios de ação periférica, espinal e supraespinal4. A injeção intraplantar de GLU em camundongos resulta em nocicepção significativa, com início rápido e curta duração45. O GLU ativa receptores glutamatérgicos do tipo ionotrópicos (NMDA, AMPA, Cainato) e metabotrópicos (RsGlum) 5. Assim, surgiu a pergunta, a natação poderia reduzir a nocicepção induzida pela injeção intraplantar de GLU? Os resultados observados no presente estudo demonstraram pela primeira vez na literatura, que a realização de sessões diárias de natação inibe significativamente a nocicepção somática causada pela injeção intraplantar de GLU. Além disso, foi verificado que: duas semanas é mais eficaz do que uma semana de natação. É importante destacar que os testes nociceptivos foram realizados com um intervalo de 24 horas entre a última sessão de exercício e o teste nociceptivo. Este cuidado foi tomado para poder descartar a influência da liberação aguda de corticosterona136,137. É importante mencionar o papel da ativação de receptores glutamatérgicos na indução e manutenção da dor crônica. Por exemplo, a dor neuropática está associada a uma redução (downregulation) dos transportadores para glutamato (GLT1) em astrócitos espinais, que causa um déficit na remoção do GLU na fenda sináptica e espaço extracelular, levando a um aumento na transmissão glutamatérgica 138, 139. Na inflamação, a hiperatividade dos neurônios aferentes primários (AP), seguida de inflamação periférica aumenta a liberação de glutamato e de neuromoduladores (por exemplo a SP) nos terminais centrais dos neurônios AP na medula espinal e núcleos trigeminais, causando hiperatividade dos neurônios nociceptivos pós-sinápticos (sensibilização central) 140 . A ativação de receptores 54 NMDA e de MAPKs tem um papel importante na hipersensibilidade e sensibilização central 141. Os resultados observados aqui vêm de encontro com recentes estudos realizados que demostraram o efeito do exercício aeróbio na redução da nocicepção26, 102. Chen et al., (2013)25 mostraram, em ratos, que quatro semanas de treinamento em esteira, realizado 5 dias por semana, foi capaz de reduzir a dor pósoperatória e que esse efeito está associado à uma menor expressão da subunidade NR1 de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA; além da redução da produção de citocinas pró inflamatórias como o TNF-α e a IL-6 na medula espinal. Quando comparados, os treinamentos da esteira e natação, ambos realizados durante 3 semanas (21 dias contínuos), também em ratos, após a constrição crônica do nervo esquiático (dor crônica - neuropática), observou-se diminuição da hiperalgesia térmica e alodinia mecânica, além de redução das concentrações de TNF-α e IL-6 no nervo esquiático103. A natação parece influenciar positivamente na redução da nocicepção, este efeito foi observado em ratos, após a injeção de formalina, que causa dor de origem inflamatória; o protocolo de 90 minutos de treinamento por 9 dias, foi capaz de reduzir a alodinia ao frio e a hiperalgesia térmica96. Mazzardo-Martins et al., (2010)17, em um estudo semelhante ao presente trabalho, realizado em camundongos, avaliou o efeito da natação na nocicepção aguda induzida pelo ácido acético. O protocolo de natação consistiu em 5 dias de treinamento, com duração de 30 minutos diários. Os autores observaram que a natação é um exercício aeróbio de alta intensidade (domínio severo), capaz de reduzir o comportamento nociceptivo induzido pelo ácido acético. Outro estudo realizado por Martins et al., (2013)18 mostrou que a natação de alta intensidade reduz a alodinia mecânica e concluiu que a natação pode ser uma terapia auxiliar na síndrome da dor complexa regional do tipo I (SDCR-I). Visto a importância da sinalização glutamatérgica e os efeitos positivos da natação na nocicepção, buscou-se avaliar a influência da natação na hiperalgesia mecânica no modelo de nocicepção induzida pelo agente flogístico GLU. Em estudos pré-clínicos observa-se que a injeção intraplantar de GLU gera nocicepção e edema45. Os receptores glutamatérgicos presentes na membrana pré-sináptica de nociceptores indicam que o GLU liberado na fenda sináptica pode também ativar receptores expressos nos terminais centrais dos neurônios AP142. O presente estudo 55 mostra, pela primeira vez, que a injeção i.pl. de GLU também induz hiperalgesia mecânica, e que além disso, a natação reduz a hiperalgesia até 6 horas após a injeção de GLU. O fenômeno conhecido como sensibilização é indiretamente suportado pela despolarização neuronal induzida por GLU143 e pela ativação de receptores inonotrópicos do tipo NMDA expressos em nociceptores (terminações periféricas, centrais e no soma DRG)144. Após o impulso nociceptivo ser gerado por um evento inflamatório no tecido periférico pode ocorrer a chamada sensibilização retrograda dos neurônios AP, sendo considerada o mecanismo pelo qual é ocorre a indução e manutenção da hiperalgesia. Este fenômeno acontece porque o GLU liberado na medula espinal age retrogradamente nos receptores NMDA presentes nos terminais pré-sinápticos dos neurônios AP145. Outro fator determinante na manutenção da hiperalgesia mecânica são as células satélite (no DRG). Um estudo recente sugere que a sensibilização mecânica do nociceptor é dependente da liberação de GLU pelo neurônio AP no DRG e subsequente ativação de receptores do tipo NMDA nas células satélite, apoiando a ideia de que a hiperalgesia periférica gerada por um evento inflamatório é modulada pelo sistema glutamatérgico no DRG146. As células satélite parecem importantes porque no estado de repouso, os receptores NMDA neuronais parecem estar bloqueados pelo íon magnésio (Mg2+), sensível à voltagem. Um estímulo despolarizante remove o Mg2+ do poro permitindo a entrada de cálcio através do canal147,148. No entanto os receptores NMDA expressos em células satélite não são sensíveis ao bloqueio de Mg2+, assim podem ser prontamente ativados independentemente do potencial de membrana em repouso negativo destas células146. O aumento do cálcio intracelular mediado por receptores NMDA em neurônios do corno posterior da medula espinal provoca a ativação de cinases, incluindo a PKA, PKC e ERK9. As cascatas de cinases conduzem a uma maior excitabilidade neuronal mediada pela fosforilação de receptores NMDA, AMPA e canais de cálcio dependentes da voltagem, bem como pela inibição de canais de potássio dependentes da voltagem10,149. A fosforilação de receptores NMDA ainda contribui para potenciais pós-sinapticos excitatórios12, e também para aumentar o período em que os receptores permanecem abertos após a despolarização neuronal13. 56 Após verificar-se que a natação, realizada diariamente por 2 semanas consecutivas, foi capaz de reduzir a nocicepção somática e a hiperalgesia mecânica induzida pela GLU; foi dada sequência ao próximo passo que foi analisar o papel da ativação de receptores chave dos três principais sistemas endógenos (canabinoidérgico, opioidérgico e adenosinérgico) de controle da dor que são acionados pela natação de alta intensidade; bem como a participação de PKA é fundamental na gênese da dor e que sua inibição faz parte de uma cascata (downstream) da ativação de receptores acoplados a proteína G que induzem analgesia. O sistema canabinoidérgico está envolvido no controle da nocicepção. Estudos indicam que os receptores CB1 são mais expressos no SNC, incluindo estruturas que participam no controle descendente da dor, tais como a substância cinzenta periaquedutal (SCP), bulbo ventromedial rostral e no corno posterior da medula espinal150. Em nível central espinal os receptores, CB1 são encontrados em interneurônios e astrócitos no corno posterior da medula espinal151,152. Na periferia tem sido observada a expressão de receptores CB1 nas terminações nervosas periféricas e no DRG do neurônio AP153,154. No presente estudo investigou-se o envolvimento dos receptores canabinóides CB1 na redução da nocicepção induzida pela natação no modelo de nocicepção induzida pelo GLU. Aqui, verificou-se que a administração espinal do antagonista para o receptor CB1, mas não periférica, preveniu a redução da nocicepção induzida pelo GLU. Recentemente Galdino et al (2014)19 demonstaram que uma única sessão de exercício físico de intensidade moderada, reduziu a nocicepção e que este efeito envolve o sistema canabinóide, requerendo a ativação de receptores CB1 e CB2 espinais e supra-espinais. Os resultados reportados aqui, corroboram com os achados de Galdino et al (2014)20 e ao mesmo tempo os estende por demonstrar sessões diárias de natação (2 semanas) e que não há o envolvimento de receptores CB1 periféricos. Além disso, os achados do presente estudo tornam-se ainda mais relevantes, uma vez que foram feitos no modelo do GLU, um neurotransmissor muito importante na fisiopatologia de muitas condições dolorosas (como descrito anteriormente), enquanto que no estudo de Galdino et al (2014)20 foram analisados mecanismos periféricos verificando apenas as latências de retirada de pata frente a estímulos mecânicos e térmicos nocivos em animais naives. 57 Estudos que investigam a influência de exercícios físicos na nocicepção e o envolvimento do sistema canabinoidérgico divergem, e as diferenças podem relacionar-se com a intensidade, frequência e tipo de exercício praticado. Os resultados apresentados aqui são consistentes com estudos que mostram efeitos dependentes da intensidade do exercício na resposta à nocicepção, como recentes achados que afirmam que exercícios intensos aumentam as concentrações circulantes de EC no plasma em seres humanos155,156. No entanto, estudo clínico como de Raichlen et al., (2013)21 examinou as concentrações de EC em diferentes intensidades de exercício. Os autores encontraram elevações significativas nas concentrações de AEA em intensidade moderada (esteira), o que não foi observado com intensidades mais baixas ou mais altas de exercício. No entanto, em um estudo anterior Raichlen et al., (2012)157 mostrou que exercícios intensos podem aumentar as concentrações de EC circulantes após corridas de resistência. Além disso, é observada hiperalgesia após o bloqueio farmacológico de receptores CB1 em ensaios clínicos158. Contudo, é possível afirmar que receptores CB1 espinais são responsáveis, pelo menos em parte, pela redução da nocicepção induzida pelos exercícios físicos. Estudos envolvendo exercícios físicos e analgesia mostram o envolvimento do sistema opioidérgico em importantes áreas de modulação da dor. Durante e após o exercício físico ocorre a liberação de opióides endógenos, em nível periférico e central (espinal e supra-espinal)159,160. Na literatura, já está bem estabelecido que o exercício físico libera opióides endógenos como: encefalinas, endorfinas ou outros opióides que são responsáveis pela redução da nocicepção161,17. As endorfinas são primariamente sintetizadas no hipotálamo, glândula hipófise anterior e nervos espinais. As β-endorfinas um tipo de endorfina, podem ser liberadas para a circulação pela glândula hipófise ou ser projetadas em várias áreas do cérebro através das fibras nervosas162. O exercício de intensidade > 60% do VO2max aumenta as concentrações circulantes de βendorfina163. As concentrações de β-endorfina no fluído cérebroespinal permanecem aumentadas por até 48 horas após finalizada a sessão de treinamento, mostrando uma rápida diminuição nas concentrações de opióides endógenos após o fim dos treinamentos159. Ainda, Mazzardo-Martins et al., (2010)17 verificaram que a redução da nocicepção induzida pela natação foi inibida por adrenalectomia bilateral em camundongos submetidos à nocicepção gerada por ácido acético, indicando que os 58 opióides endógenos periféricos liberados pelas glândulas adrenais podem estar contribuindo para o efeito inibitório do exercício físico. Os resultados do presente estudo confirmam e ampliam as informações sobre o envolvimento do sistema opioidérgico da analgesia induzida pelo exercício físico. Aqui, foi observada redução significativa da nocicepção causada pelo glutamato que foi prevenida pela administração central (espinal) e periférica (pata) de naloxona (um antagonista para receptores opióides). Vinte quatro horas após a última sessão de treinamento mostra uma redução da nocicepção dependente de opióides endógenos no SNC (medula espinal) e SN periférico. Por fim, o último sistema endógeno de controle da dor avaliado foi o sistema adenosinérgico. Na literatura, tem sido encontrado que receptores A1 estão envolvidos na redução da nocicepção em sítios periféricos, espinais e supraespinais71. Em modelos animais de dor neuropática e de dor inflamatória a ativação de receptores A1 promove redução significativa da nocicepção73. Também tem sido mostrado que animais que não expressam receptores A1 apresentaram maior respostas nociceptivas, além de não apresentarem efeitos antinociceptivos na presença de um agonista A1, confirmando assim, a importância de receptores A1 na redução da nocicepção164. Estudos in vitro indicam que receptores A1 reduzem a entrada de Ca2+165, diminuem a geração de AMPc e reduzem a liberação de peptídeos em neurônios sensoriais166. A atividade antinociceptiva induzida pelos agonistas para receptores A1 estão implicadas em mudanças na atividade de proteínas G, AMPc e de PKA167. Os resultados do presente estudo mostram o envolvimento de receptores A1 periféricos e centrais, na redução da nocicepção induzida pela natação no modelo de nocicepção induzida pelo GLU. Estes resultados corroboram com o estudo de Martins et al., (2013) 117 que utilizaram um protocolo semelhante de natação, mas em um modelo animal de SDCR-I. O estudo mostrou que administrações diárias de cafeína (antagonista não seletivo para receptores adenosinérgicos) e DPCPX (antagonista seletivo para receptores A1), preveniu a redução da hiperalgesia induzida pelo exercício, sugerindo o envolvimento de receptores A1 neste efeito. O estudo ainda mostrou que o tratamento com o inibidor da enzima adenosina desaminase (EHNA) prolonga o efeito de redução da hiperalgesia, indicando que este efeito depende da adenosina e não do seu metabólito, a inosina. Além disso, 59 também tem sido demonstrado que a natação realizada de forma moderada também promove o aumento da produção de adenosina168. Na nocicepção e dor o GLU é responsável pela hiperexcitabilidade neuronal no corno posterior da medula espinal, principalmente pela ação nos receptores NMDA. O aumento do Ca2+ intracelular como resultado da despolarização neuronal promove a ativação de proteínas cinases, entre elas, a PKA, a PKC e ERK. As cinases, por sua vez, são responsáveis pela fosforilação e aumento da atividade de receptores do tipo NMDA, AMPA e de canais de Ca2+ dependentes de voltagem, além da inibição de canais de K+ dependentes de voltagem, inibindo comportamentos relacionados à dor6. A ação da PKA é bem estabelecida, sabe-se que resíduos C terminal do receptor de AMPA e de subunidades do receptor de NMDA são sítios sensíveis que podem ser fosforilados por PKA. A fosforilação de sítios específicos depende da natureza do receptor e de uma atividade dinâmica, sendo a modificação reversível. Por regular níveis de fosforilação, as proteínas cinases controlam a bioquímica, biofísica e fisiologia dos RsGLUi e são mecanismos mais comuns, através dos quais os RsGLUi regulam e sinapses excitatórias169. O influxo do Ca2+ intracelular através dos receptores NMDA, AMPA, é responsável pela ativação da AC resultando em aumento das concentracões de AMPc e consequentemente da atividade de PKA170. Da mesma forma, a ativação do mecanismo endógeno responsável pela inibição da nocicepção envolve a via da PKA. Os receptores canabionóides CB1, por exemplo, inibem a via AC/AMPc/PKA, que inibe canais de Ca2+ dependentes de voltagem dos tipos L, N, P, Q e que paralelamente ativam os canais de K+ do tipo A22. Do mesmo modo agem os receptores opioidérgicos, eles são considerados potentes analgésicos na presença dos agonistas, porque diminuem a despolarização neuronal pela inibição da via AC/AMPc/PKA23. Esta via é igualmente compartilhada por receptores adenosinérgicos A1, que, quando ativados, desencadeiam uma cascata de sinalização que culmina na inibição da via AC/AMPc/PKA24. Contudo, é possível afirmar que o controle inibitório exercido pelo exercício físico é mediado, pelo menos em parte, pelos receptores canabinóides CB120, opióides17 e adenosinérgico A118 e que esta inibição é devida a característica dos receptores. Os resultados da presente pesquisa são o primeiro relato na literatura mostrando a atividade da PKA após um protocolo de exercícios em modelo de nocicepção. Encontrou-se um aumento significativo das isoformas / de PKA 60 fosforilada e total na medula espinal de animais não exercitados quando comparados com animais exercitados após a injeção i.pl de glutamato o mesmo efeito não foi observado na isoforma . Já na pata (periferia) ocorreu um aumento nas expressões das três isoformas e total. A redução significativa da expressão de PKA tanto na medula espinal (central) quanto na pata (periférico) sugere que a redução da nocicepção induzido pela natação envolve a via da PKA. 61 6 CONCLUSÃO Os resultados apresentados aqui sugerem que: 1) A natação de alta intensidade diminui a nocicepção induzida pelo glutamato, e duas semanas de natação produz redução maior da nocicepção quando comparado com uma semana; 2) A natação de alta intensidade também é capaz de diminui a hiperalgesia mecânica induzida pelo GLU; 3) O efeito da natação na nocicepção parece ser mediado pela ativação de receptores para opióides e adenosina (A1), periféricos e espinais, bem como a ativação de receptores canabinóides (CB1) espinais; 4) Os receptores canabinóides (CB1) periféricos provavelmente não estão envolvido na redução da nocicepção induzida pela natação; 5) O GLU administrado intraplantarmente induziu um aumento na expressão de diferentes isoformas de PKA fosforilada em ambos os sítios, pata e medula espinal, o qual foi reduzido pela natação de alta intensidade. Finalmente, conclui-se que o exercício físico aeróbio na modalidade de natação é efetivo na redução da nocicepção (dor) e que este efeito é mediado, pelo menos em parte, pela ativação de receptores para opióides, adenosina e canabióides. Além disso, a inibição da PKA parece ser um fenômeno importante para a ação da natação. Assim, estes resultados fortalecem a literatura, que sugere a natação, uma abordagem não-farmacológica, como uma ferramenta integrativa, segura e efetiva no tratamento da dor. 62 REFERÊNCIAS 1. International Association for the study of Pain. IASP; 2012 [acesso em: 15 maio2013]. Disponível em: http//:www.iasp-pain.org. 2. Basbaum AI, Bautista DM, Scherrer G, Julius D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 2009 Oct 16;139(2):267-84. 3. Sawinok J, Cairns B. E. Adenosine receptors. Peripheral receptor targets for analgesia novel approaches to pain management. 1th ed Wiley. British Columbia; 2009. 4. Osikowicz M, Mika J, Przewlocka B. 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