pró-reitoria de pesquisa e pós-graduação mestrado em

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
CARACTERIZAÇÃO DO SÊMEN, DO PLASMA SEMINAL E CONCENTRAÇÃO
SÉRICA DE TESTOSTERONA EM CERVO SAMBAR (Cervus unicolor) EM
CATIVEIRO NA PRIMAVERA
ELLYN AMANDA FONSECA MARTINS
Presidente Prudente
2012
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
CARACTERIZAÇÃO DO SÊMEN, DO PLASMA SEMINAL E CONCENTRAÇÃO
SÉRICA DE TESTOSTERONA EM CERVO SAMBAR (Cervus unicolor) EM
CATIVEIRO NA PRIMAVERA
ELLYN AMANDA FONSECA MARTINS
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade
do Oeste Paulista, como requisito para
obtenção de título de Mestre em Ciência
Animal.
Área
de
Concentração:
Fisiopatologia Animal
Orientador:
Prof. Dr. Marcelo George Mungai Chacur
Presidente Prudente – SP
2012
636.294
M386a
Martins, Ellyn Amanda Fonseca
Caracterização do sêmen, do plasma seminal e
concentração sérica de testostenora em cervo sambar
(Cervus unicolor) em cativeiro na primavera / Ellyn
Amanda Fonseca Martins. – Presidente Prudente,
2012.
42 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) –
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE:
Presidente Prudente – SP, 2012.
Bibliografia.
1. Cervos. 2. Sêmen. 3. Testosterona. I. Título.
ELLYN AMANDA FONSECA MARTINS
CARACTERIZAÇÃO DO SÊMEN, DO PLASMA SEMINAL E CONCENTRAÇÃO
SÉRICA DE TESTOSTERONA EM CERVO SAMBAR (Cervus unicolor) EM
CATIVEIRO NA PRIMAVERA
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade
do Oeste Paulista, como requisito para
obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal.
Presidente Prudente, 20 de setembro de 2012.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Orientador: Prof. Dr. Marcelo George Mungai Chacur
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
Presidente Prudente - SP
____________________________________
Banca: Profª. Drª. Caliê Castilho
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
Presidente Prudente - SP
____________________________________
Banca: Profª. Drª. Sandra H. Gabaldi Wolf
Faculdades Adamantineses Integradas - FAI
Adamantina - SP
DEDICATÓRIA
A DEUS, por guiar meu caminho e estar sempre presente em minha vida me
fortalecendo nas minhas horas de fraqueza.
Aos Meus Pais Antônia e Faustino, que me proporcionaram uma vida digna
onde eu pudesse crescer e acreditar que tudo é possível, desde que sejamos
honestos, íntegros de caráter e tendo a convicção de que desistir nunca seja uma
ação continua em nossas vidas; que sonhar e caracterizar os sonhos só dependerá
de nossa vontade.
Ao meu irmão Rômulo, pela amizade que nos mantém unidos hoje e sempre.
Ao meu amado filho Miguel por ser a minha maior inspiração para lutar cada
vez mais pelos meus objetivos.
Ao meu Professor e Orientador Dr. Marcelo George Mungai Chacur pela
compreensão constante, pela confiança, pelo incentivo e generosidade de partilhar
sua sabedoria e conhecimento. Obrigado pela oportunidade e honra de ser sua
orientada.
AGRADECIMENTOS
A Universidade do Oeste Paulista – Unoeste, Programa de mestrado em
Ciência Animal e ao Curso de Medicina Veterinária.
Ao Zoológico de Presidente Prudente pelo apoio nesse trabalho.
Aos Professores Dra. Eunice Oba, Dr. Luciana Machado Guaberto, Dr.
Rogério Giuffrida e Dr. Osimar Sanches.
A colega de mestrado e amiga Aline Aparecida da Silva, obrigado pela
colaboração, incentivo e apoio para com o meu trabalho.
Ao funcionário do zoológico Jair Florentino pela colaboração através de sua
destreza dentro de sua prática em realizar as capturas dos cervos e a dedicação
para com os mesmos.
“[...]Ninguém se desanime, nem pela falta de prêmio,
nem pela baixeza do nascimento, cada um é capaz de
fazer-se nobre, este é o segundo nascimento que depende
do próprio valor, e em que se nasce, não para uma vida
breve, mas sim para a eternidade de um grande nome.[...]”.
Domingo Loreto Couto,1981, p. 140.
RESUMO
Caracterização do sêmen, do plasma seminal e concentração sérica de
testosterona em cervo sambar (Cervus unicolor) em cativeiro na primavera
O objetivo do trabalho foi avaliar o quadro espermático e protéico do plasma seminal
e o perfil endócrino, em cervos criados em cativeiro. Quatro machos com idades
entre 12 e 36 meses foram avaliados. Em quatro momentos com intervalos de sete
dias, obteve-se o peso (60,5 a 89,0 kg) e o índice de massa corporal (93,07 kg/m2 a
126,56 kg/m2). Foram realizadas quatro colheitas de sêmen por animal, com
intervalo de sete dias, por meio de eletroejaculador. Obteve-se os seguintes valores:
volume do ejaculado (0,50±0,35 mL a 0,75±0,28 mL), motilidade espermática
(87,75±4,78% a 90,00±7,07%), defeitos totais (17,25±5,81% a 47,72±17,55%) e
testosterona plasmática (6,43±4,33 ng/dL a 166,00±64,48 ng/dL). A eletroforese em
SDS-PAGE revelou bandas proteicas entre 7,6 kDa e 142 kDa. O plasma seminal
apresentou uma grande gama de proteínas entre 7,6 kDa e 142 kDa. A idade influi
na concentração de testosterona, sendo essa maior na faixa dos 36 meses.
Palavras-chave: Cervo. Morfometria corpórea. Sêmen. Proteinas do plasma
seminal. Testosterona.
ABSTRACT
Characterization semen, of seminal plasma and concentration serum
testosterone in sambar deer (Cervus unicolor) in captivity in the spring
The objective of this study was to evaluate the framework sperm and protein seminal
plasma and endocrine profile in deer bred in captivity. Four males aged between 12
and 36 months were evaluated. In four times at intervals of seven days, gave the
weight (60.5 to 89.0 kg) and body mass index (93.07 kg/m2 to 126.56 kg/m2). There
were four semen samples per animal, with an interval of seven days, by
electroejaculation. Gave the fallowing values: ejaculate volume (0.50 ± 0.35 ml to
0.75 ± 0.28 ml), motility (87.75 ± 4.78% to 90.00 ± 7.07%) total defects (17.25 ±
5.81% and 47.72 ± 17.55%) and plasma testosterone (6.43 ± 4.33 ng/dL at 166.00 ±
64.48 ng/dL). Electrophoresis on SDS-PAGE revealed protein bands between 7.6
kDa and 142 kDa. Seminal plasma showed a wide range of proteins between 7.6
kDa and 142 kDa. Age influences the testosterone concentration, being higher in the
range of 36 months.
Keywords: Deer.
Testosterone.
Body
morphometry.
Semen.
Seminal
plasma
proteins.
LISTA DE ABREVIATURAS
ABP – Proteína Carreadora de Andrógeno
DHT – Diidrotestosterona
FSH – Hormônio Folículo Estimulante
GAGs – Glicosaminoglicanas
HE – Hematoxilina-eosina
IEF – Focalização Isoelétrica
IMC – Indice de Massa Corpóreo
kDa – Kilodalton
Kg – quilograma
LH – Hormônio Luteinizante
NaCl – Cloreto de Sódio
RIA – Radioimunoensaio
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
TeBG – Globulina Ligada à Testosterona
TRIS HCl – Tris (hidroximetil) aminometano hidrocloreto
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 12
2.1 Fisiologia Reprodutiva dos Cervídeos ........................................................ 12
2.1.1 Idade à puberdade .................................................................................. 12
2.1.2 Características gerais dos testículos ....................................................... 13
2.1.3 Células de Sertoli .................................................................................... 13
2.1.4 Células de Leydig .................................................................................... 15
2.1.5 Testosterona ........................................................................................... 16
2.2 Proteínas do Plasma Seminal ..................................................................... 17
REFERÊNCIAS ................................................................................................. 20
3 ARTIGO CIENTÍFICO .................................................................................... 24
ANEXO ............................................................................................................. 38
11
1 INTRODUÇÃO
A família Cervídae, da qual fazem parte os veados, pertencem à ordem
Artiodactyla (MAIA, 1993) e se caracterizam por possuir quatro dedos, sendo o
terceiro e o quarto são funcionais, estando atrofiados o segundo e o quinto dedos e
recobertos por tecido queratinoso, dão origem ao casco (WALKER, 1991). São os
ruminantes selvagens mais disseminados no mundo, sendo encontrados em quase
todo o continente, exceto na Antártida (VAN SOEST, 1994). Existem 19 gêneros, 52
espécies distribuídas nas Américas, Europa, Ásia e África. Porém, o cervo sambar
vive nas encostas das florestas do Sri Lanka, Índia, Sul da China, Taiwan, Malásia,
Indonésia e Filipinas. Foi introduzido na Nova Zelândia, na Austrália e na Flórida
(WILSON; REEDER, 2005).
Os cervídeos possuem várias glândulas odoríferas que desempenham
importante papel na comunicação entre exemplares da mesma espécie. Estão
localizadas na região nasal, pré-orbitais, metatarsais, tarsais e interdigitais. Todos os
cervídeos apresentam olfato, audição e visão muito desenvolvidos (DUARTE;
MERINO, 1997).
O período de gestação é de aproximadamente oito meses, as fêmeas
são uníparas e suas crias nascem com a mesma pelagem dos exemplares adultos
que chegam a pesar entre 100 e 130 kg (GARDNER, 1971). Durante o Inverno,
machos e fêmeas vivem completamente separados. As manadas de machos não
têm, nesta altura, quaisquer laços com o seu território, sendo este mais um local de
refúgio contra o mau tempo. A partir do princípio de Setembro, com o início da época
do estro (conhecida como Brama), as manadas de machos iniciam o deslocamento
para os territórios de Inverno das fêmeas ou para um local vizinho, escolhido pelas
suas comodidades e que o veado julga necessárias para proteger o seu harém,
atacando as fêmeas com o seu chamamento característico, um bramido estridente,
que varia com a idade do animal e o seu estado de excitação e que significa que o
macho está na fase de delimitação do território. As fêmeas não só se deixam atrair,
como procuram elas mesmas os locais de estro. Mesmo neste período, as fêmeas
mantêm a sua organização social, não estabelecendo qualquer ligação especial com
o macho. Assim em caso de necessidade de fuga, as fêmeas fogem
ordenadamente, enquanto os machos tentam escapar individualmente. Constituemse, então, manadas mistas, de composição variável e à volta das quais qualquer
12
veado que se aproxima é imediatamente afastado pelo macho dominante. Os
combates são raros, mas por vezes muito violentos, podendo provocar a morte dos
intervenientes por não conseguirem ‘desenganchar’ as hastes (COUCELO, 1986)
Características
secundárias
como
a
troca
de
chifres
e
o
desenvolvimento da musculatura do pescoço acompanham as variações endócrinas
sazonais, ocorrendo o mesmo com a circunferência escrotal (CABRERA; YEPES,
1960). Segundo Sttalings (1986), parece haver um padrão individual de troca de
galhadas, sem contudo estar associado às variações do fotoperíodo e é provável
que a ausência de um padrão reprodutivo sazonal esteja relacionada às
particularidades ambientais da região.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Fisiologia Reprodutiva dos Cervídeos
2.1.1 Idade à puberdade
Pocay et al. (2001) relataram que as características fisiológicas
(crescimento testicular, secreção de hormônio luteinizante e testosterona) sofrem
efeitos, que a idade a puberdade é influenciada pelo ambiente físico, fotoperiodismo,
idade a partir dos doze meses e que os fatores ambientais são estressantes para o
animal, alterando as características fisiológicas. Essa fase na reprodução
caracteriza-se como a idade em que ocorre rápido crescimento testicular, mudanças
no modelo de secreção do hormônio luteinizante, que acarreta gradual incremento
da testosterona sangüínea e, como conseqüência, a iniciação da espermatogênese.
A puberdade é um processo lábil, que se sujeita a numerosos fatores ambientes,
externos e internos, que interagem e influenciam o sistema nervoso central a
modular o sistema endócrino e, por conseguinte, alterar a idade cronológica na qual
o animal a manifesta (AMANN; SCHAMBACHER, 1983).
13
2.1.2 Características gerais dos testículos
Muito embora no embrião os testículos se desenvolvam a partir das
gônadas indiferenciadas, situadas no abdômen, eles migram a fim de se localizar
durante a vida extra-uterina, no escroto. Da mesma forma que os ovários, os
testículos têm dupla função: produzem células germinativas e secretam hormônio
sexual.
As
células
espermatozóides
germinativas
(sperma
=
ou
gametas
semente;
masculinos
zoon
=
animal).
são
chamados
Denominam-se
genericamente androgênios (aner = homen; gennao = produto) essas substâncias
possuem atividade de hormônios sexuais masculinos (DUKES, 1993).
O tamanho relativo dos testículos pode oferecer informações
importantes quanto ao sistema de acasalamento e até mesmo quanto à fisiologia
reprodutiva
(KENAGY;
TROMBULAK,
1986;
PAULA,
1999).
Parâmetros
quantitativos diretamente relacionados com o túbulo seminífero, com o diâmetro
tubular, espessura do epitélio seminífero e o comprimento total de túbulos
seminíferos, apresentam uma relação positiva com a atividade espermatogênica,
fornecendo informações para o estabelecimento da mesma em uma dada espécie
(FRANÇA; RUSSELL, 1998; PAULA, 1999). As mensurações tubulares são
abordagens utilizadas como indicadores da atividade da espermatogênica em
investigação envolvendo a função testicular (FRANÇA; RUSSELL, 1998).
2.1.3 Células de Sertoli
O epitélio seminífero compõe-se de várias camadas de gerações
distintas de células germinativas, sustentadas morfológicamente por um tipo de
célula somática denominada de célula de Sertoli. Na camada basal do epitélio
seminífero observam-se as espermatogônias e espermatócitos primários iniciais. Na
camada adluminal observam-se as gerações de espermatócitos mais desenvolvidos,
espermatócitos secundários e as espermátides (RUSSEL et al., 1990). As
espermatogônias
podem
ser
classificadas
em
duas
categorias
básicas,
espermatogônias diferenciadas e indiferenciadas. As espermatogônias isoladas (Ais),
pareadas (Apr), alinhadas (Aal) pertencem à primeira categoria. As espermatogônias
do tipo A, espermatogônias internemediárias (In) e espermatogônias do tipo B
pertencem à segunda categoria e estão relacionadas com a formação de
14
espermatozóides (DE ROOIJ, 1998). As espermatogônias podem ser identificadas
com base na morfologia, dinâmica e volume do núcleo, número de nucléolos,
posição topográfica em relação a outras células e à lâmina basal, e a disposição do
cromossomo durante a divisão (CLERMONT; ANTAR, 1973).
Esta série de divisões celulares, incluindo a proliferação das
espermatogônias e das divisões meióticas, é conhecida por espermatocitogênese,
na qual, durante o desenvolvimento embrionário, células germinativas primordiais
especiais migram da região do saco vitelínico do embrião para as gônadas
indiferenciadas (HAFEZ; GARNER, 2004). A meiose compreende em duas divisões:
células de primeira divisão que são os espermatócitos primários (I) e os de segunda
divisão, que são os espermatócitos secundários (II). Os espermatócitos (I) são as
maiores células da linhagem espermatogênica e caracterizam-se prela presença de
cromossomos em diferentes fases de condensação. Os espermatócitos (II) ficam
mais próximos da luz dos túbulos seminíferos, sendo difícil observá-los em corte
histológico, pois entram logo na segunda divisão meiótica (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2008; KIERSZENBAUM, 2008). As células haplóides resultantes deste
processo são chamadas de espermátides. As espermátides, então, sofrem uma
série progressiva de modificações estruturais e de desenvolvimento, dando origem
aos espermatozóides. Estas modificações metamórficas são conhecidas por
espermiogênese, as modificações incluem condensação da cromatina nuclear,
formação da cauda do espermatozóide ou aparelho flagelar e desenvolvimento do
capuchão acrossomático (HAFEZ; GARNER, 2004). No entanto, fica bastante
evidente a necessidade da interação das células germinativas com os componentes
somáticos dos testículos, principalmente as células de Sertoli, as células de Leydig e
as células mióides, para que o processo espermatogênico transcorra de maneira
normal e eficiente (SKINNER,1991; DADOUNE; DEMOULIN, 1993; JÉGOU, 1993;
SPITERI-GRECH; NIESCHLAG, 1993; PESCOVITIZ et al., 1994; FRANÇA;
RUSSELL, 1998).
Os espermatozóides deixam o testículo pelos ductos eferentes e vão
em direção ao ducto espiralado do epidídimo, que continua com o ducto deferente.
As glândulas acessórias eliminam seus conteúdos no ducto deferente ou na porção
pélvica da uretra (HAFEZ; GARNER, 2004).
A espermatogênese é um processo cíclico no qual os gonócitos,
primeiras células germinativas a habitarem os túbulos seminíferos, multiplicam-se e
15
diferenciam-se em espermatogônias. A última geração destas células, formada pelas
espermatogônias B, sofre meiose, formando os espermatócitos primários e as
espermátides arredondadas, que se diferenciam em espermatozóides (GRIFFIN,
1988; CURTIS; AMANN, 1981; COUROT; HOCHEREAU RIVIERS; ORTAVANT,
1970; RUSSELL et al., 1994).
O desenvolvimento da espermatogênese depende do suporte funcional
das células de Sertoli, dos níveis adequados de esteróides, gonadotrofinas e de
fatores de crescimento (SHARPE, 1994).
A organização geral da espermatogênese é basicamente a mesma
para todos os mamíferos. A espermatogênese é um processo sincrônico, no qual a
espermatogônia (célula diplóide) se diferencia gradativamente em uma célula
haplóide altamente especializada, o espermatozóide. Esse processo pode ser
dividido em três fases, de acordo com as diferentes características funcionais: (1)
fase proliferativa, na qual as espermagônias sofrem rápidas e sucessivas divisões
mitóticas; (2) fase meiótica (espermatócitos), na qual o material genético é
recombinado e segregado; (3) fase de diferenciação ou espermiogênica, onde cada
espermátide arredondada passa por mudanças estruturais e bioquímicas e
diferenciam-se em espermatozóide, um tipo celular estruturalmente especializado
para alcançar e fertilizar o ovócito (RUSSELL et al., 1990; SHARPE., 1994).
2.1.4 Células de Leydig
Encontram-se
em
íntimo
contato
com
sistema
de
capilares
(DADOUNE; DEMOULIN, 1993) e sua principal função é a produção de
testosterona, que é importante para o desenvolvimento e a manutenção da
espermatogênese e das características masculinas (O’DONNEL et al., 2001). A
produção de testosterona pelas células de Leydig é controlada pelo LH. Aumentos
na secreção de LH são seguidos, dentro de 30 (trinta) e 60 (sessenta) minutos, por
níveis aumentados de testosterona que duram de uma a várias horas
(STANBENFELDT; EDQVIST, 1996). O LH liga-se especialmente a membrana das
células de Leydig e ativa a adenosina-monofosfato cíclica (HUHTANIEMI; TOPPARI,
1995). Este processo dá inicio à ativação das proteínas cinases que catalizam a
fosforilação das proteínas intracelulares e mobilização de precurssores dos
esteróides, principalmente através da conversão do colesterol até pregnenolona
16
(STANBENFELD; EDQVIST, 1996). O LH também tem efeito trófico sobre as células
de Leydig, visto que a remoção do mesmo cessa a produção de testosterona e leva
a grande redução no tamanho nas células de Leydig (STANBENFELD; EDQVIST,
1996;
GOODMAN,
2000).
Altas
concentrações
são
necessárias
para
a
espermatogênese e especialmente para o processo de meiose. A ação dos
andrógenos na espermatogênese acontece via células de Sertoli, já que as células
germinativas não possuem receptores para andrógenos (LYU; HANDELSMAN,
2003).
Inúmeros fatores podem influenciar na quantidade de células de Leydig
por animal, dentre os quais podem ser destacados a quantidade de LH disponível, o
número de receptores de LH por célula, a quantidade de testosterona que a célula
de Leydig é capaz de secretar por unidade de tempo, a velocidade pela qual a
testosterona deixa o testículo via vasos sanguíneos e fluidos seminais, o volume
sanguíneo do animal e a taxa de metabolismo da testosterona (RUSSELL et al.,
1994; RUSSELL, 1996).
2.1.5 Testosterona
A secreção de testosterona pelas células de Leydig está sob o
controle do LH. A secreção do LH, por sua vez, é controlada pela liberação
episódica do hormônio liberador de gonodatrofina GnRH (DUKES, 1993).
Embora grande parte da testosterona secretada para dentro dos
túbulos seminíferos seja convertida em diidrotestosterona (DHT) pela enzima 5αesteróide redutase, uma certa quantidade é convertida em estrógeno pela enzima
aromatase. Um nível relativamente alto de testosterona é necessário para a
maturação das espermátides e manutenção da espermatogênese (HAFEZ;
JAINUDEEN; ROSNINA, 2004).
A proteína ligadora de andrógeno (ABP) tem uma grande afinidade
pela testosterona e diidrotestosterona (DADOUNE; DEMOULIN, 1993) e promove
uma concentração de andrógenos intratesticular impedindo além do limite de sua
solubilidade (DADOUNE; DEMOULIN, 1993; STANBEFELD; EDQVIST, 1996).
A testosterona faz com que os testículos cresçam, devendo estar
presente, também, junto com o FSH, antes que a espermatogênese se complete.
17
Depois que um feto começa a se desenvolver no útero materno, seus testículos
começam a secretar testosterona, quando tem poucas semanas de vida apenas.
Essa testosterona, então, auxilia o feto a desenvolver órgãos sexuais masculinos e
características secundárias masculinas. Isto é, acelera a formação do pênis, da
bolsa escrotal, da próstata, das vesículas seminais, dos ductos deferentes e dos
outros órgãos sexuais masculinos. Além disso, a testosterona faz com que os
testículos desçam da cavidade abdominal para a bolsa escrotal; se a produção de
testosterona pelo feto é insuficiente, os testículos não conseguem descer;
permanecem na cavidade abdominal. A secreção da testosterona pelos testículos
fetais é estimulada por um hormônio chamado gonadotrofina coriônica, formado na
placenta durante a gestação. Em consequência, as características sexuais
interrompem seu desenvolvimento, desde o nascimento até a puberdade. Na
puberdade, o reaparecimento da secreção de testosterona induz os órgãos
sexuais masculinos a retomar o crescimento. Os testículos, a bolsa escrotal e o
pênis crescem, então, aproximadamente mais de 10 vezes (VILELA, 2009).
A testosterona é essencial à função reprodutiva nos machos, atua
estimulando os estadios finais da espermatogênese; prolonga a vida útil dos
espermatozóides no epidídimo e estimula o crescimento, o desenvolvimento e a
atividade
secretora
dos
órgãos
sexuais
do
macho,
exteriorizando
as
características sexuais secundárias, sendo necessária para a manutenção da
capacidade de serviço (HAFEZ; JAINUDEEN; ROSNINA, 2004). Correlações
significativas têm sido demonstradas entre a concentração sanguínea de
testosterona, a fertilidade e a motilidade espermática (BLOCKEY; GALLOWAY,
1978).
2.2 Proteinas do Plasma Seminal
O plasma seminal proporciona boas condições para a manutenção da
motilidade, sobrevivência, além de servir como veículo para os espermatozóides
ejaculados, consistindo em uma mistura de secreções dos testículos e glândulas
sexuais acessórias, com função carreadora dos gametas masculinos até o trato
genital feminino, viabilizando a fecundação (CHACUR et al., 2006). Entretanto,
estudos sobre as proteínas do plasma seminal e da membrana espermática ainda
18
precisam definir os tipos de proteínas e os mecanismos de ação que afetam a
viabilidade desses gametas (ASADPOUR et al., 2007).
A composição molecular do plasma seminal possui características
inerentes a cada espécie, podendo diferir entre os tipos e a atuação das proteínas
espermáticas (TÖPFER-PETERSEN et al., 2004).
Estudos recentes mostram a importância da presença das proteínas do
plasma seminal, como marcadores biológicos de fertilidade. A estação do ano
influencia na presença das proteínas do plasma seminal em bovinos criados
extensivamente (CHACUR et al, 2004).
As diferenças na fertilidade observadas entre os animais, muitas vezes
não são detectadas pelos testes rotineiros empregados na avaliação da qualidade
do sêmen. Neste sentido, estudos desenvolvidos mostram que há evidência de
associações significativas entre a expressão de proteínas seminais e a fertilidade
dos machos (KILLIAN; CHAMPAN; ROGOWSKI, 1993; MOURA; CHAMPAN;
KILLIAN, 2006a, 2006b).
A eletroforese é uma técnica que vem sendo utilizada desde a década
de 50 para mapear e identificar componentes protéicos solúveis de ejaculados, na
busca de marcadores bioquímicos para diagnóstico de algumas patologias ou
diferenciação de animais quanto ao grau de sua fertilidade. Frente a alterações de
clima e manejo, associadas a patologias do trato reprodutivo masculino ou do
espermatozóide. Já foi constatado que o conteúdo do plasma seminal pode
influenciar na fertilidade dos machos (KILLIAN; CHAMPAN; ROGOWSKI, 1993).
Estudos indicam que a habilidade do espermatozóide para se ligar à heparina e a
outros glicosaminoglicanos está correlacionada com a qualidade do sêmen e
fertilidade. As proteínas com sítio de ligação para heparina no plasma seminal
influenciam na fertilidade. Estes sítios de ligação têm estrutura semelhante a
proteínas (GAGS) do líquido folicular ovariano, que são responsáveis pela
estimulação das reações acrossômicas no espermatozóide bovino, de coelho e
porco, agindo provavelmente durante a capacitação do espermatozóide (MILLER;
WINER; AX, 1990).
O plasma seminal de mamíferos contém um grupo de proteínas que se
ligam aos espermatozóides. Estas proteínas no plasma seminal de bovino foram
purificados e estão bem caracterizados bioquimicamente. Há quatro proteínas, que
são chamado BSP-A1, BSP-A2, BSP-A3, e BSP-30-kDa. Os três primeiros são de
19
aproximadamente a mesma massa molecular (entre 13 e 16 kDa), enquanto que a
massa molecular da a proteína BSP-30-kDa, como o nome indica, é 30000 Da
(MANJUNATH, 1987). BSP-A1 e BSP-A2 têm a mesma estrutura primária e diferem
apenas na extensão de glicosilação, e a sua mistura é também referida como PDC109 (ESCH et al., 1983). A banda protéica especifica de 13 kDa foi identificada nos
animais B,C,D. A proteína de 13 kDa, conhecida como PDC-109 confere alta
fertilidade em touros, agindo de forma direta no metabolismo dos espermatozóides
(DESNOYERS, 1994; RONCOLETTA et al., 1999).
20
REFERÊNCIAS
AMANN, R. P.; SCHAMBACHER, B. D. Physiology of male reproduction. Journal
of Animal Science, v. 57, suppl., p. 380-403, 1983.
ASADPOUR, S. M. et al. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of buffalo bulls
seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Animal
Reproduction Science, v. 102, p. 308-313, 2007.
BLOCKEY, M. A .B.; GALLOWAY, D. B. Hormonal control of serving capacity in
bulls. Theriogenology, New York, v. 9, n. 2, p. 143-151, 1978.
CABRERA, A.; YEPES, J. Mamiferos sudamericanos. Buenos Aires: Ediar, 1960.
v. 2, p. 160.
CHACUR, M. G. M.; MACHADO NETO, N. B.; RABESQUINE, M. M. Season
influence upon seminal plasma proteins in bulls. In: INTERNATIONAL CONGRESS
ON ANIMAL REPRODUCTION, 15, 2004, Porto Seguro. Abstracts... Porto Seguro:
Brazilian College of Animal Reproduction, 2004. v.1, p. 236.
CHACUR, M. G. M.; MARTINEZ, A. I. S.; MACHADO NETO, N. B. Perfil em SDSPAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a qualidade do sêmen de
touros da raça Nelore (Bos taurus indicus). Veterinária Notícias, v. 12, n. 1, p. 8793, 2006.
CLERMONT, Y.; ANTAR, M. Duration of the cycle of the seminiferous epithelium
and the spermatogonial renewal in the monkey (Macaca artoides). Am. J. Anat., v.
136, p. 153-166, 1973.
COUCELO, M. Bases biológicas essenciais para o ordenamento do veado.
Lisboa, 1986. 64 p. Final report - Instituto Superior de Agronomia, Universidade
Técnica de Lisboa.
COUROT, M.; HOCHEREAU RIVIERS, M. T.; ORTAVANT, R. Spermatogenesis. In:
JOHNSON, A. D.; GOMES W. R,; VANDEMARK, N. L. The testis. New York:
Academic Press, 1970. v. 1, p. 339-432.
CURTIS, S. K.; AMANN, R. P. Testicular development and establishment of
spermatogenesis in Holstein bulls. Journal of Animal Science, v. 53, n. 6, p. 16451657, 1981.
DADOUNE, J. P.; DEMOULIN, A. Structure and functions of the testis. In:
THIBAULT, C., LEVASSEUR, M.; HUNTER, R. H. F. Reproduction in mammals
and man. Paris: Ellipses, 1993. cap 13, p. 227-250.
DE ROOIJ, D. G. Stem cells in the testis. Inst. J. Exp. Path., v. 79, p. 67-80, 1998.
21
DESNOYERS, L. Characterization of the mayor proteins of bovine seminal fluid by
two dimensional polyacrulamide gel eletroforesis. Molec. Reprod. Develop., v. 37,
p. 425-443, 1994.
DUARTE, J. M. B.; MERINO, M. L. Taxonomia da evolução. In: DUARTE, J. M. B.
Biologia e conservação de cervídeos Sul-Americanos: Blastocerus, Ozotoceros e
Mazama. Jaboticabal: FUNEP, 1997. cap. 1, p. 2-21.
DUKES, H. H. Pocessos reprodutivos do macho. In: DUKES, H. H. Fisiologia dos
animais domésticos. 11.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1993. p. 603614.
ESCH, F. S et al. Primary structure of PDC-109, a major protein constituent of
bovine seminal plasma. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 113, p. 861–867,
1983.
FRANÇA, L. R.; RUSSELL, L. D. The testis of domestic animals. In: REGADERA,
J.; MARTINEZ-GARCIA. Male reproduction: a multidisciplinary overview. Madrid:
Churchill Livingstone, 1998. p. 197-219.
GARDNER, A. L. Postpartum estrus in a Red Brocket Deer, Mazama Americana,
from Peru. Journal of Mammalogy, v. 52, n. 3, p. 623-624, 1971.
GOODMAN, H. M. Controle hormonal da reprodução masculina. In: JOHNSON, L.
R. Fundamentos de fisiologia médica. 2 ed. Rio de Janeiro: Ganabara Koogan,
2000. cap. 45.
GRIFFIN, J. E. Male reproductive funtion. In: GRIFFIN, J. E.; OJEDA, S. R.
Textbook of endocrine physiology. New York: Oxford University Press, 1988. p.
165-185.
HAFEZ, E. S. E.; GARNER, D. L. Espermatozóides e plasma seminal. In: HAFEZ,
E. S. E., HAFEZ, B. Reprodução Animal. 7 ed. São Paulo: Manole, 2004. p. 97101; 105-106.
HAFEZ, E. S. E.; JAINUDEEN, M. R.; ROSNINA, Y. Hormônios, fatores de
crescimento e reprodução. In: HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. Reprodução Animal. 7
ed. São Paulo: Manole, 2004. p. 45-46.
HUHTANIEME, I.; TOPPARI, J. Endocrine, paracrine and autocrine regulation of
testicular steroidogenesis. Adv. Exp. Med. Biol., v. 377, p. 33-54, 1995.
JÉGOU, B. The Sertoli-germ cell communication network in mammals. Int. Rev.
Cytol., v. 147, p. 25-95, 1993.
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica: texto e atlas. 11.ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. v. 21: Aparelho reprodutor masculino, p. 323334.
22
KENAGY, G. J.; TROMBULAK, S. C. Size and function of mammalian testis in
relation to body size. Jounal Mammalogy, v. 77, p. 1-22, 1986.
KIERSZENBAUM, A. L. Histologia e biologia celular: uma introdução à patologia.
2.ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. p. 677.
KILLIAN, G. J.; CHAMPAN, D. A.; ROGOWSKI, L. A. Fertility-associated proteins in
Holstein bull seminal plas. Biology of Reproduction, Pennsylvania, v. 49, p. 12021207, 1993.
LYU, P. Y.; HANDELSMAN, D. J. The present and future state of homonal treatment
for male infertility. Hum. Reprod. Updat, v. 9, p. 9-23, 2003.
MAIA, M. J. F. A. Contribuição para o estudo de algumas espécies de cervídeos
(Cervus elaphus, Cervus canadensis e Dama dama) no Jardim Zoológico de
Lisboa e Tapada Nacional de Mafra. Santarém, 1993. 119 p. Relatório de Estagio
de Produção Animal - Instituto Politécnico de Santarém, Escola Superior Agrária de
Santarém, Santarém.
MANJUNATH, P. Purification and biochemical characterizaction of three major acidic
proteins (BSP-A1, BSP-A2 and BSP-A3) from bovine seminal plasm. European
Journal of Biochemistry, Berlin., v. 241, p. 685-692, 1987.
MILLER, D. J.; WINER, M. A.; AX, R. L. Heparin-binding proteins from seminal bind
to bovine spermatozoa and modulate capacitation by heparin. Biology of
Reproduction, v. 42, p. 899-915, 1990.
MOURA, A. A.; CHAMPAN, D. A.; KILLIAN, G. J. Identification of accessory sex
gland fluid proteins as related to fertility indexers of dairy bulls: a proteomic
approach. Journal of Andrology, v. 27, p. 201-211, 2006a.
MOURA, A. A.; CHAMPAN, D. A.; KILLIAN, G. J. Proteins of the cauda epididymal
fluid associated with fertility of mature dairy bulls. Journal of Androl, v. 27, p. 534541, 2006b.
O’DONNEL, L. et al. Estrogen and spermatogenesis. Endocrinol. Rev, v. 22, p.
289-318, 2001.
PAULA, T. A. R. Analise histométrica e funcional dos testículos de capivara
(Hydrochoerus hydrochaeris) adultas. Belo Horizonte, 1999. 84 p. Tese
(Doutorado em Biologia Celular) – Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte.
PESCHOVITIZ, O. H. et al. Paracrine controlo f spermatogenesis. Trends
Endocrinol. Metabol, v. 5, p. 126-131, 1994.
POCAY, P. L. B. et al. Respostas fisiológicas de vacas holandesas
predominantemente brancas e predominantemente negras sob radiação solar direta.
ARS Veterinária, v. 17, n. 2, p. 155-161, 2001.
23
RONCOLETTA, M. et al. Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e
sua relação com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça Gir.
Brazilian Journal of Veterinary Reseach in Animal Science, São Paulo, v. 36, n.
2, p. 143-148, 1999.
RUSSELL, L. D. et al. Histological and histophatological evaluation of the
testis. Bolesta: Cache River Press, 1990. cap. 1: Mammalian spermatogenesis, p.
40.
RUSSELL. J. D. et al. The hamsters Setrtoli cell in early testicular regression an
early recrudescence: a stereological and endrocrine study. Internationa Journal of
Andrology, v. 17, p. 93-106, 1994.
RUSSELL, L. D. Mammalian leydig cell structure. In: PAYNE, A. H., HARDY, M. P.;
RUSSELL, L. D. The Leydig cell. Vienna: Cache River Press, 1996. cap 10, p.
218-222.
SHARPE, R. M. Regulation of espermatogenesis. In: KNOBIL, E.; NEILL, J. D. The
phisiology of reproduction. 2.ed. New York: Raven Press, 1994. v.1, p. 13641434.
SKINNER, M. Cell-cell interaction in the testis. Endoc. Rev, v. 12, p. 45-77, 1991.
SPITERI-GRESH, J.; NIESCHLAG, E. Paracrine factors relevants to the regulation
of spermatogenesis: a review. J. Reprod. Fertil, v. 98, p. 1-14, 1993.
STALLINGS, J. R. Notes on the reproductive biology of the Grey Brocket Deer
(Mazama Gouazoubira) in Paraguay. Journal Mammalian, v. 67, n. 1, p. 172-175,
1986.
STANBENFELDT, G. H.; EDQVIST, L. Processo reprodutivo do macho. In:
SWENSON, M. J.; REECE, W. O. Duckes: fisiologia dos animais domésticos.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996. cap. 35, p. 603-614.
TÖPFER-PETERSEN, E. et al. The role of stallion seminal proteins in fertilization.
Animal Reproduction Science, v. 89, n. 1-4, p. 159-170, 2004.
VAN SOEST, P. J. Nutricional ecology of the ruminant. 2.ed. New York: Cornell
University, 1994. p. 476.
VILELA, A. L. M. Sistema reprodutor masculino, 2009. Disponível em:
<http://www.afh.bio.br/varios/analuisa.asp>. Acesso em: 09 agosto. 2012.
WALKER, E. Mammals af the world. Baltimore: John Hopkins University, 1991. p.
1398.
WILSON, D. E.; REEDER, D. M. Mammal species of the world. 3.ed. Baltimore:
John Hopkins University Press, 2005. v. 2, p. 142.
24
1
2
3
4
3 ARTIGO CIENTÍFICO
CARACTERIZAÇÃO DO SÊMEN, DO PLASMA SEMINAL E
5
CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE TESTOSTERONA EM CERVOS SAMBAR
6
(Cervus unicolor) EM CATIVEIRO
7
(Characterization semen, of seminal plasma and concentration serum testosterone in
8
sambar deer (Cervus unicolor) in captivity in the spring)
9
E.A.F. MARTINS1*; A.A. SILVA¹; L.M. GUABERTO²; L.R.A.GABRIEL
10
FILHO³; E. OBA4; O.C. SANCHES1 ; M.G.M. CHACUR¹
11
¹Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE
12
²Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE
3
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – TUPÃ
13
14
4
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – Botucatu
*[email protected]
15
16
17
RESUMO
18
O objetivo do trabalho foi avaliar o quadro espermático, as proteínas do
19
plasma seminal em SDS-PAGE e a testosterona sérica em cervos criados em cativeiro.
20
Quatro machos com idades entre 12 e 36 meses foram avaliados. Em quatro momentos
21
com intervalos de sete dias, obteve-se o peso (60,5 a 89,0 kg) e o índice de massa
22
corporal (93,07 kg/m2 a 126,56 kg/m2). Foram realizadas quatro colheitas de sêmen por
23
animal, com intervalo de sete dias, por meio de eletroejaculador, sob efeito de anestesia
24
geral. Obteve-se os valores de: volume do ejaculado (0,50±0,35 mL a 0,75±0,28 mL),
25
motilidade espermática (87,75±4,78% a 90,00±7,07%), defeitos totais (17,25±5,81% a
26
47,72±17,55%) e testosterona plasmática (6,43±4,33 ng/dL a 166,00±64,48 ng/dL). A
27
eletroforese em SDS-PAGE revelou bandas proteicas entre 7,6 kDa e 142 kDa. Conclui-
28
se que devido às contenções sucessivas, os defeitos espermáticos se elevaram. O plasma
29
seminal apresentou uma grande gama de proteínas entre 7,6 kDa e 142 kDa. A idade
30
influi na concentração de testosterona, sendo essa maior na faixa dos 36 meses.
31
Palavras-chave: cervo, morfometria corpórea, sêmen, eletroforese, testosterona.
25
32
ABSTRACT
33
The objective of this study was to evaluate the framework sperm, seminal
34
plasma proteins on SDS-PAGE and serum testosterone in deer bred in captivity. Four
35
males aged between 12 and 36 months were evaluated. In four times at intervals of
36
seven days, gave the weight (60.5 to 89.0 kg) and the body mass index (kg/m2 93.07 to
37
126.56 kg/m2). There were four semen samples per animal, with an interval of seven
38
days, by electroejaculation under general anesthesia. Obtained values: ejaculate volume
39
(0.50 ± 0.35 ml to 0.75 ± 0.28 ml), motility (87.75 ± 4.78% to 90.00 ± 7.07%) total
40
defects (17.25 ± 5.81% and 47.72 ± 17.55%) and plasmatic testosterone (6.43 ± 4.33 ng/
41
dL at 166.00 ± 64.48 ng/dL). Electrophoresis on SDS-PAGE revealed protein bands
42
between 7.6 kDa and 142 kDa. It is concluded that due to successive containments,
43
sperm defects increased. Seminal plasma showed a wide range of proteins between 7.6
44
kDa and 142 kDa. Age influences the testosterone concentration, being higher in the
45
range of 36 months.
46
Keywords: deer, body morphometry, semen, electrophoresis, testosterone.
47
48
INTRODUÇÃO
49
A família Cervídae, da qual fazem parte os veados, pertence à ordem
50
Artiodactyla (Maia, 1993). Os Cervus unicolor, conhecido como cervo sambar, são os
51
ruminantes selvagens mais disseminados no mundo (Van Soest, 1994). Porém, pouco se
52
sabe a respeito do comportamento reprodutivo dos cervos nas condições de vida livre,e
53
em cativeiro.
54
O exame andrológico é uma das técnicas mais utilizadas pelos médicos
55
veterinários para avaliar a fertilidade, caracteriza-se por exame clínico, medida de
56
circunferência escrotal e avaliação do espermatozoide para motilidade, vigor,
57
turbilhonamento, concentração e morfologia (Salvador et al., 2002). As avaliações
58
clínicas e seminais são fundamentais para classificação e prognóstico da função
59
reprodutiva (Vale Filho et al., 1986).
60
A biologia molecular na área da reprodução animal traz ferramentas para
61
o melhoramento genético, por meio da utilização de marcadores bioquímicos em
62
líquidos orgânicos que demonstram o potencial genético de um animal, cuja seleção de
26
63
genótipos superiores, para determinadas características reprodutivas possa ser
64
incrementada (Roncoletta et al., 1999).
65
O plasma seminal serve como veículo para os espermatozoides
66
ejaculados, consistindo em uma mistura de secreções dos testículos e glândulas sexuais
67
acessórias, com função carreadora dos gametas masculinos até o trato genital feminino
68
viabilizando a fertilização (Manjunath, 1987; Einspanier, 1991). Os perfis
69
eletroforéticos das proteínas do plasma seminal auxiliam na avaliação clínica, em casos
70
de infertilidade (Gasset et al., 1997).
71
Relações têm sido demonstradas entre a concentração sanguínea de
72
testosterona, fertilidade e motilidade espermática (Blockey; Galloway, 1978). As
73
características fisiológicas reprodutivas podem sofrer alterações devido ao estresse em
74
cativeiro (Pocay et al., 2001).
75
Devido à escassez de dados na literatura nacional, pouco se sabe com
76
relação à esfera reprodutiva em cervos exóticos mantidos em cativeiro (Cervus
77
unicolor), dessa forma o presente estudo justifica-se, pois informações obtidas de
78
animais mantidos em cativeiro podem ser úteis para se traçar estratégias de manejo
79
reprodutivo. O objetivo do trabalho foi avaliar o quadro espermático, as proteínas do
80
plasma seminal em SDS-PAGE e a testosterona sérica em cervos criados em cativeiro.
81
82
83
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e local do experimento
84
Foram utilizados quatro (n=4) cervos sambar (Cervus unicolor) machos,
85
identificados com as letras A e B com idade de 36 meses e pesos de 89 e 95 Kg,
86
respectivamente, C com idade de 18 meses e peso de 81 kg e D com 12 meses pesando
87
60,5 Kg, criados em cativeiro (Zoológico de Presidente Prudente - SP, com latitude de
88
21º29’50”S; longitude de 49º14’2”W e altitude de 475m. Os animais recebiam
89
alimentação balanceada com frutas
90
beterraba, cenoura e abóbora em proporções iguais (8Kg); sal mineral, ração para
91
bovinos (18% proteínas), capim colonião Panicum maximum e água ad libitum. O
92
experimento foi realizado no mês de novembro de 2010 (primavera) e os fatores
93
climáticos aferidos na primavera (P) foram: temperatura ambiente média (24,5ºC),
94
insolação (239,74h), índice pluviométrico cumulativo (126 mm) e umidade relativa do
e legumes: laranja, maçã, banana, mamão,
27
95
ar (80,6%). O clima é caracterizado pela presença de massas de ar Tropicais e Polares,
96
com estação de inverno fria e seca, e verão quente e chuvoso.
97
Colheita e processamento das amostras
98
Antecedendo as colheitas, foram realizadas prévias contenções químicas,
99
administrando por via intramuscular zoletil associado à xilazina, obedecendo sempre a
100
sequência do animal A, B, C e D, e utilizando um intervalo em média de 20 minutos
101
entre colheitas.
102
Os animais foram pesados e a altura da cernelha mensurada para a
103
obtenção do índice de massa corpórea (IMC), sendo IMC = peso corpóreo (Kg) / (altura
104
da cernelha em metros)2. Foram realizadas quatro colheitas de sêmen por animal, com
105
intervalo de sete dias, por meio de eletroejaculador (Autoejac®, Neovet, Brasil) com
106
probe retal para ovinos, a qual foi introduzido no reto do animal, após prévia
107
lubrificação, sob efeito de anestesia geral, com estímulos elétricos de 2 a 3 segundos,
108
seguidos por igual tempo de repouso. As amostras de sêmen foram analisadas com
109
relação às características quantitativas e qualitativas: volume (mL), cor, aspecto,
110
motilidade espermática (%), vigor espermático (1 a 5), turbilhonamento (1 a 5),
111
concentração espermática (x106/mL), defeitos espermáticos maiores, menores e totais
112
(%). Posteriormente, os ejaculados foram centrifugados a 1500g / 15 min, separandos e
113
estocandos 1 mL de plasma seminal a -20ºC para posterior realização da técnica de
114
eletroforese em SDS-PAGE.
115
A eletroforese em SDS-PAGE, foi processada com extrações das
116
proteínas segundo Laemilli (1970) e quantificações conforme Bradford (1976) com
117
espectrofotômetro (PF-901 Chemistry Analyser Labsystems). A extração das proteínas
118
foi realizada utilizando tampão composto por: buffer A – TRIS HCl (6,0 mL) pH 6,8
119
(4,0 mL), glicerol (6,4 mL), SDS 10% (6,4 mL), mercaptoetanol (1,6 mL) e água
120
destilada (13,6 mL). Empregou-se uma relação de 2:1, colocando em tubo de ensaio
121
200μL de amostra e 1000μL do tampão de extra ção para cada amostra, mantidos por 3
122
minutos
123
espectrofotômetro com solução contendo: Bradford (4,5 mL), NaCl 0,15 M (0,45 mL) e
124
amostra de proteína (0,05 mL). As amostras foram aplicadas em cuba eletroforética
125
vertical 20x20cm (Omniphor®) ligada a (50V x 50Ma / 30min; e 300V x 16mA / 4 a
126
6h) uma fonte elétrica de 0 a 1000W (PWSYS EI®). A revelação das bandas protéicas
em
ebulição.
Logo
após,
as
proteínas
foram
quantificadas
em
28
127
foi feita em solução a 2% de Comassie Brilliant Blue G-250, com captura, visualização
128
e processamento das imagens em transminador (Doc-IT-LS® 6.0 software).
129
Concomitante às colheitas de sêmen, foram realizadas as colheitas de
130
sangue por venopunção jugular, quatro colheitas por cervo, realizadas no período da
131
manhã, entre 8:00h e 10:00h, totalizando 16 amostras, seguida por centrifugação a
132
1500g/15min, para separação do plasma, o qual foi estocando à -20ºC para posterior
133
dosagem de testosterona (ng/dL) pelo método de radioimunoensaio (RIA), utilizando
134
quite comercial para testosterona total (DPC – Coat a Count® – Med Lab).
135
Após a quarta e última colheita de sêmen e sangue, foram feitas biópsias
136
dos testículos com auxilio de agulha modelo Tru-Cut 16 gauge (16G) para biópsia. Os
137
fragmentos foram fixados em solução fixadora de Davidson por 24 horas, depois
138
lavados em água corrente por 20 minutos e transferidas para solução alcoólica à 70%.
139
Em seguida, foram processadas conforme a técnica para microscopia óptica e inclusão
140
em parafina. Os cortes foram corados pela técnica da Hematoxilina-Eosina (HE). Para o
141
processamento estatístico dos dados do sêmen, foi empregada a análise de variância e
142
para a comparação das médias aplicou-se o teste de Tukey a 5%.
143
144
RESULTADOS E DISCUSSÃO
145
O estudo da morfometria corpórea se faz importante para conhecermos o
146
porte dos animais, relacionando-o com o índice de massa corpórea (IMC) variável essa
147
utilizada para estimar a aptidão física do animal em conjunto com as variáveis
148
reprodutivas (Chacur et al., 2006; Chacur et al., 2010). As médias das características
149
morfométricas dos cervos utilizados no experimento estão apresentadas na Tabela 1.
150
151
152
Tabela 1. Média da idade e das caracteristias morfométricas: peso corpóreo, comprimento crânio-caudal, altura de cernelha, índice
de massa corpórea (IMC) e diâmetro torácico em cervos, Cervus unicolor.
Animais
Parâmetros
A
B
C
D
Idade (meses)
36
36
18
12
Peso (Kg)
89,0
95,0
81,0
60,5
Comprimento (m)
1,39
1,43
1,26
1,24
Altura da cernelha (m)
0,92
0,89
0,80
0,81
IMC (Kg/m2)
105,95
120,25
126,56
93,07
Diâmetro torácico (m)
1,01
1,09
0,88
0,87
153
154
Com relação às características quantitativas e qualitativas do sêmen, não
155
houve diferenças (P>0,05) entre os quatro momentos de colheita, exceto na morfologia
156
espermática da quarta colheita, para os defeitos maiores, menores e totais com elevação
29
157
das porcentagens de defeitos morfológicos em relação às três primeiras colheitas,
158
conforme a Tabela 2. Vale destacar que o método de colheita de sêmen por
159
eletroejaculação, mostrou-se de fácil execução para a obtenção dos ejaculados. A
160
necessidade da contenção química por sedação anestésica propiciou uma colheita de
161
sêmen rápida, pois reduziu o estresse do procedimento. A literatura destaca que o
162
estresse das condições do cativeiro é causado pelo aprisionamento, redução da liberdade
163
e pela imposição da convivência constante com vários indivíduos, e que na natureza,
164
estes animais vivem a maior parte do tempo isolados (Duarte e Merino, 1997). Dentro
165
desse raciocínio do estresse do cativeiro e dos fatores estressantes associados, uma alta
166
porcentagem de defeitos totais (40,9±10,42%) foi relatada em cervos no Brasil (Abreu
167
et al., 2009).
168
169
170
171
172
173
Tabela 2. Características quantitativas e qualitativas do sêmen de cervos em distintos momentos de colheita, mantidos em cativeiro.
Colheitas
Variável
1
2
3
4
Volume (mL)
0,75±0,28 A
0,75±0,28 A
0,50±0,35 A
0,62±0,25 A
Cor
1,75±0,95 A
1,50±1,00 A
1,25±0,50 A
1,25±0,50 A
Aspecto
1,75±0,95 A
1,75±0,50 A
1,25±0,50 A
1,25±0,50 A
Motilidade (%)
87,50±5,00 A
83,75±4,78 A
90,00±7,07 A
83,75±4,78 A
Vigor (1-5)
5,00±0,00 A
5,00±0,00 A
4,75±0,50 A
4,75±0,50 A
Turbilhão (1-5)
4,00±2,00 A
4,00±2,00 A
4,00±2,00 A
4,00±2,00 A
Concentração
1137,5±892,5 A
1144,1±557,6 A
1140,6±699,6 A
1027±763,6 A
(x106 / mL)
Defeitos maiores
7,36±4,25 A
5,79±2,19 A
9,62±3,93 A
17,00±1,87 B
(%)
Defeitos menores
10,51±3,82 A
11,45±6,50 A
10,78±2,79 A
25,85±15,05 B
(%)
Defeitos totais (%)
18,35±13,93 A
17,25±5,81 A
20,41±2,74 A
47,72±17,55 B
Letras diferentes (A, B) na linha (P<0,05); Cor: (1) amarelo, (2) branco, (3) branco marmóreo; Aspecto: (1) cremoso, (2) leitoso,
(3) aquoso.
Com relação à morfologia espermática, os valores médios obtidos para os
174
defeitos maiores (cabeça isolada patológica, pequena anormal, gota proximal, defeito de
175
peça intermediária, cauda fortemente dobrada ou enrolada e enrolada na cabeça);
176
menores (cabeça isolada normal, retroaxial, abaxial, dobrada ou enrolada e gota
177
citoplasmática distal) estão descritos na Tabela 3.
178
Dessa forma, a alta porcentagem de defeitos espermáticos obtida na
179
quarta colheita, pode estar associada ao estresse cumulativo e às contenções semanais
180
para a obtenção dos ejaculados, semelhantes aos descritos por Cheng et al. (2009).
181
182
183
30
184
185
Tabela 3. Porcentagens de defeitos maiores, menores e totais nas quatro colheitas de sêmen em cervos sambar..
Animal
A
A
A
A
B
B
B
B
C
C
C
C
D
D
D
D
Colheita
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Defeitos Maiores
5,46
5,5
6,22
14,21
3,27
4,67
7,88
7,35
4,48
14,07
9,86
10,09
16,25
16,98
15,19
19,6
Defeitos Menores
6,72
6,5
3,82
25
19,62
5,6
6,89
13,72
12,55
7,28
9,86
13,46
14,77
14,62
27,45
46,56
Defeitos Totais
12,18
12
10,04
39,21
22,89
10,27
14,77
21,07
17,03
21,35
19,72
23,55
31,02
31,06
42,64
66,16
186
187
No presente estudo, o volume dos ejaculados foi semelhante ao
188
observado em machos sexualmente maturos “Formosan Sika deer” e “Formosan
189
Sambar deer” com 0,5±0,4 mL (Cheng et al., 2004) e diferiu do relatado por Abreu et
190
al. (2009) com 0,91±0,68mL em Mazama nana e Ascher et al. (2000) com volume de
191
1,5±0,6mL em cervos Dama dama. O volume dos ejaculados pode variar conforme a
192
espécie, idade, peso, frequência de ejaculação e tamanho do aparelho reprodutor dos
193
cervos (Ascher et al., 2000; Cheng et al., 2004; Abreu et al., 2009).
194
As motilidades médias obtidas no presente estudo foram superiores às
195
descritas por Cheng et al. (2004) com 77±6% , Abreu et al. (2009) com 70±8% e
196
Ascher et al. (2000) com 65,50±19,3%. Por outro lado, as concentrações espermáticas
197
médias foram inferiores à média de 1.471,3±940,0 x106/mL, Abreu et al. (2009) com
198
1.536±351 x106/mL e Ascher et al. (2000) com 2.100±1.400 x106/mL. O vigor
199
espermático foi superior ao valor médio de 3,00±0,67 em cervos Mazama nana relatado
200
por Abreu et al. (2009). A concentração espermática pode oscilar devido ao método de
201
colheita por eletroejaculação (Chacur, 2012; Chacur et al., 2012) e ao estresse do
202
cativeiro (Ascher et al., 2000; Cheng et al., 2004; Abreu et al., 2009).
203
A análise microscópica dos testículos dos cervos foi realizada e o
204
material processado pela técnica de hematoxilina-eosina (HE) mostrando integridade do
205
arcabouço dos túbulos seminíferos, observada por meio da presença das células da
206
linhagem espermatogênica disposta em camadas homogêneas (Fig. 1).
207
208
31
209
210
211
212
213
Figura 1. Corte de testículo, mostrando túbulos seminíferos, com o epitélio germinativo
íntegro HE (400x) de cervos, Cervus unicolor.
214
O estudo do perfil proteico do plasma seminal nos animais por meio da
215
eletroforese vem sendo correlacionado com a fertilidade dos mesmos, podendo
216
colaborar para a compreensão dos efeitos dos fatores do clima e da contenção do
217
cativeiro sobre as características reprodutivas (Chacur, 2012).
218
Com relação ao perfil protéico do plasma seminal dos cervos, os géis revelaram
219
a presença de bandas com pesos moleculares variando entre 7,6 kDa e 142 kDa. Essas
220
bandas apresentaram diferentes porcentagens de ocorrência, entre 6,66% e 26,66% das
221
amostras de plasma seminal (Tabela 4). As bandas com ocorrência igual ou superior a
222
20% das amostras foram: 10, 13, 19, 20, 21, 29, 30, 51, 82, 88, 90, 96 e 122 kDa.
223
Dessas 13 bandas protéicas, sete possuem peso moleculares igual ou inferior a 30 kDa,
224
revelando uma distribuição homogênea entre a ocorrência de bandas leves (até 50 kDa)
225
e pesadas (igual ou superior a 51 kDa), conforme ilustradas nas figuras (Fig. 2 e Fig. 3).
226
227
228
Tabela 4. Ocorrência de bandas protéicas especificas no plasma seminal de cervos sambar na estação da primavera..
Cervos
Proteínas (kDa)
A
7,6 10 11 14 15 16 19 20 21 27 30 73 75 81 82 88 89 96 97 100 107 120 123 125 129 132 141
B
10 13 18 20 22 27 30 36 50 51 52 60 74 77 81 82 87 90 92 95 118 122 131 134
C
10 13 18 19 21 29 48 51 53 79 82 86 88 92 96 102 110 119 126 133 142
D
13 21 29 49 52 61 75 83 88 90 95 96 108 121 133
32
229
A banda protéica especifica de 13 kDa foi identificada nos animais
230
B,C,D. A proteína de 13 kDa, conhecida como PDC-109 confere alta fertilidade em
231
touros, agindo de forma direta no metabolismo dos espermatozóides (Desnoyers, 1994;
232
Roncoletta et al., 1999).
233
Nos cervos A e B foi observada a banda de 20 kDa a qual segundo
234
Barrios et al. (2000) pode ser responsável pela recuperação da permeabilidade da
235
membrana espermática após a mesma ser submetida ao choque térmico pelo frio.
236
A banda protéica de 75 kDa foi encontrada nos cervos A e D. Essa
237
proteína é chamada de SP-2, sendo a sua presença relacionada de forma negativa com a
238
fertilidade (Brandon et al., 1999).
239
Bandas proteicas entre 21 e 22 kDa foram identificadas nos cervos B, C e
240
D. Proteínas variantes da HPB com aproximadamente 21,5 kDa e 31 kDa são associadas
241
ao incremento da fertilidade (Bellin et al., 1998). Os animais B e D apresentam a banda
242
de 30 kDa. Em bovinos, um grupo de proteínas conhecida como BSP-A1, BSP-A2,
243
BSP-A3 e BSP-30 kDa possivelmente induzem alterações moleculares na membrana
244
plasmática, essenciais no processo da capacitação espermática (Therien; Manjunath,
245
1998; Bergeron, 2004).
246
As bandas de 79 kDa (cervo C); 81 kDa (cervos A e B) e 90 kDa (cervos
247
B e D) foram identificadas. Conforme Chacur et al. (2006) esses peptídeos quando
248
presentes no plasma seminal contribuíram de forma positiva com as características
249
qualitativas do sêmen.
250
251
252
253
Figura 2. Proteínas leves e pesadas do plasma seminal em Cervus unicolor.
Figura 3. Proteínas do plasma seminal de cervídeos.
33
254
Vale destacar que estudos comprovam a correlação da testosterona com a
255
qualidade espermática de ruminantes criados extensivamente em clima tropical
256
(Chacur2000; Chacur et al., 2012). Por outro lado, a literatura consultada traz poucas
257
informações a esse respeito ao tratar dos cervos como objeto do estudo. No presente
258
trabalho, as concentrações séricas de testosterona, obtidas no mês de novembro
259
(primavera) estão descritas na tabela 5, onde observam valores maiores para os cervos A
260
e B com idade de 36 meses. Possivelmente, a faixa etária superior dos cervos A e B com
261
36 meses influenciou na maior concentração de andrógeno circulante. Pesquisadores
262
publicaram resultados relativos à concentração de testosterona em cervos de distintas
263
espécies, sendo Lopez et al. (2010) com valores entre 2 e 10 ng/dL, também na estação
264
da primavera, em cervos (Cervus elaphus hispanicus). Valores similares ao do presente
265
trabalho foram ainda relatados por Lopes et al. em 2010 para a estação do outono, mês
266
de setembro, com concentração sérica média de 86,5±16,3 ng/dL. Pereira et al. (2005)
267
descrevem concentração de testosterona entre 50 e 100 ng/dL por meio da colheita de
268
fezes em cervos (Ozotoceros bezoarticus bezoarticus).
269
Nas espécies dos veados somente os dominantes produzem sêmen de boa
270
qualidade (Comizzoli et al., 2000). Este fato está relacionado com o comportamento
271
sexual e social a partir do princípio de setembro, época do inicio da ciclicidade
272
reprodutiva, onde se verifica a presença de fêmeas na fase de estro (Coucelo, 1986). No
273
presente estudo, foi observado comportamento sexual ativo na presença de fêmeas em
274
estro, com cortejo e coberturas, realizados pelos cervos A e B, os quais eram
275
dominantes em relação aos animais C com idade de 18 meses e D com 12 meses.
276
277
Tabela 5. Concentração de testosterona sérica (ng/dL) em cervos, Cervus unicolor.
Cervo
A
B
C
D
Testosterona (ng/dL)
166,00±64,48
75,86±15,16
12,71±8,51
6,43±4,33
278
279
Correlações significativas têm sido demonstradas entre a concentração
280
sanguínea de testosterona, a fertilidade e a motilidade espermática (Blockey; Galloway,
281
1978). Uma sazonal elevação da concentração de testosterona foi observada na
282
primavera em cervos “columbian black-tailed”, “red deer” e “follon deer” (West,
283
Nordan, 1976; Rolf, Firder, 1990). Em cervos “white-tailed deer” a máxima
284
concentração de testosterona não foi necessária para o processo da espermatogênese,
34
285
mas foi essencial para a manifestação do comportamento reprodutivo (Bubenik et al.,
286
1982).
287
Segundo Pereira et al. (2005) existe uma correlação significativa entre
288
níveis de testosterona e comportamento reprodutivo, razão pela qual o ciclo sazonal
289
deste hormônio modula o comportamento sexual dos machos durante o período de
290
acasalamento, os machos (apenas indivíduos com os chifres expostos) demarcando o
291
seu território. Vale destacar que se faz necessária a continuidade dos trabalhos
292
relacionados à reprodução dos cervos para uma melhor compreensão dos fatores que
293
afetam as características da fisiologia da reprodução desses animais.
294
295
CONCLUSÃO
296
297
Boa qualidade espermática foi observada na primavera, nas três primeiras
298
colheitas. As características dos ejaculados não diferiram entre as colheitas sucessivas,
299
exceto a morfologia espermática que se elevou na quarta colheita, possivelmente devido
300
ao estresse das contenções semanais sucessivas. Grande variedade na distribuição de
301
bandas proteicas no plasma seminal foi obtida, entre 7,6 e 142 kDa. A idade influi na
302
concentração de testosterona, sendo maior na faixa dos 36 meses.
303
304
REFERÊNCIAS
305
ABREU, O.C.; MARTINEZ, C.A.; MORAES. W et al. Características reprodutivas de
306
veado-bororó-do-sul ou veado-mão-curta (Mazama nana). Pesq. Vet. Brás., v.29, n.12,
307
p.993-998, 2009.
308
ASCHER, G.W.; BERG, D.K.; EVANS, G. Storage of semen and artificial
309
insemination in deer. Animal Reproduction. Science., v.62, p.195-211, 2000.
310
BARRIOS, B.R.; PÉREZ-PÉ, M.; GALEGO, A. et al. Seminal plasma protein reverse
311
the cold-shok damage of ram sperm membrane. Bio. Reprod., v.63, p.1531-1537, 2000.
312
BELLIN, M.et al. Fertility of ranger beef bulls grouped according to presence or
313
absence of heparin binding protein in serm menbranes and seminal fluid. Journal
314
Animal Science. Kinsville, v. 72, p, 2441-2448, 1994.
315
BERGERON, A. Comparative study on the phospholipid-binding proteins in seminal
316
plasma of different species. In: XV INTERNATIONAL CONGRESS ON ANIMAL
35
317
REPRODUCTION, 15., 2004, Porto Seguro. Abstract… Belo Horizonte: Brasilian
318
College af Animal reproduction, 2004. v.1, p.226.
319
BRANDON, C.I. The cause of pathologic change of testicular degeneration in large.
320
Vet. Med., v.23, n.1, p.531-36, 1999.
321
BUBENIK, G.A.; MORRIS, J.M.; SCHAMS, D.; CLAUS, A. Photoperiodicity and
322
circannual levels of LH, FSH, and testosterone in normal and castrated male, white-
323
tailed deer. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology., v.60, n.6, p.788-793,
324
1982.
325
BLOCKEY, M.A. de B.; GALLOWAY, D.B. Hormonal control of serving capacity in
326
bulls. Theriogenology,, v.9, n.2, p.143-151, 1978.
327
CHACUR, M.G.M. Seminal Plasma Proteins as Potential Markers of Relative Fertility
328
in Zebu Bulls (Bos taurus indicus), Rijeka: In Tech, 2012, Electrophoresis ISBN-
329
980653307 1171.
330
CHACUR, M. G. M. Estresse térmico em touros bufalinos Bubalus bubalis, avaliações
331
das características fisiológicas da reprodução. 2000. Tese (Doutorado em Medicina
332
Veterinária). Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária –
333
Universidade Estadual Paulista, Botucatu. 2000.
334
CHACUR, M.G.; ARAUJO, M.C.; KRONKA, S. Características seminais, corpóreas e
335
anatômicas do aparelho reprodutor de reprodutores da raça Canchim aos 14 e 48 meses
336
de idade. Arquivo de Ciências Veterinária e Zootecnia da UNIPAR., v.9, p.21-27, 2006.
337
CHACUR, M.G.M.; AURÉLIO, P.T.F.; OBA, E. et al. Influência de um nutracêutico
338
no sêmen, testosterona, cortisol, eritrograma e peso corpóreo em touros jovens Bos
339
taurus indicus. Semina Agrárias, v.31, p.439-450, 2010.
340
CHACUR, M.G.M; MIZUSAKI, K.T.; SANTOS F.H. et al. Influência da estação do
341
ano nas características do sêmen e na concentração de hormônios em touros Nelore e
342
Simental. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.64, n.3, p.540-546, 2012.
343
CHACUR, M. G. M.; OBA, E. Heat stress in buffalo bulls Bubalus bubalis, evaluations
344
of reproduction phisiologycal characteristics. Veterinária Notícias, Uberlândia, v. 11, n.
345
1 , p. 111-112, 2005.
346
CHENG, F.P.; WU, J.; CHAN, J et al. The effect of different extenders on post-taw
347
sperm survival, acrosomal integrity and longevity in cryopreserved semen of Formosan
348
Silka deer and Formosan Samba deer. Theriogenology., v.61, p.1605-1616, 2004.
36
349
COMIZZOLI, P.; MERMILLOD P.; MAUGET, R. Reproductive biotchnologies for
350
endangered mammalian species. Reprod. Nutr. Dev., v.40, p.493-504, 2000.
351
COUCELO, M. Bases biológicas essenciais para o ordenamento do veado. Lisboa,
352
1986. 64 p. Final report - Instituto Superior de Agronomia, Universidade Técnica de
353
Lisboa.
354
DESNOYERS, L. Characterization of the mayor proteins of bovine seminal fluid by
355
two dimensional polyacrulamide gel eletroforesis. Molec. Reprod. Develop., v.37,
356
p.425-443, 1994.
357
DUARTE, J. M.B.; MERINO, M.L. Tecnologia da reprodução para a propagação e
358
conservação de espécies ameaçadas de extinção. In: DUARTE J.M.B. Biologia e
359
Conservação de cervídeos sul-americanos: Blastocerus, Ozotoceros e Mazama.
360
Jaboticabal, SP: FUNEP, p.228-238, 1997.
361
ESPANIER, R. Characterizaction of a new bioactive protein from bovine seminal fluid.
362
Biochemical and Biophsical Reseach Communications. Gattingen., v.179, n.2, p.1006-
363
1010, 1991.
364
GASSET, M. Conformation features and thermal stability of bovine seminal plasma
365
protein PDC-109 oligomers and phosphorycholine-boud complexes. European Journal
366
is Biochemistry. Berlin,, v.250, p.735-744, 1997.
367
LÓPEZ, G.E.; CASTILLEJOS, L.T.; CEACERO, F et al. Testosterone, Cortisol and
368
Antler Growth Cicle in Iberian Red Deer Stags (Cervus elaphus hispanicus).
369
Reproduction in Domestic Animal., v.45, p.243-249, 2010.
370
MAIA, M. J. F. A. Contribuição para o estudo de algumas espécies de cervídeos
371
(Cervus elaphus, Cervus canadensis e Dama dama) no Jardim Zoológico de Lisboa e
372
Tapada Nacional de Mafra. Santarém, 1993. 119 p. Relatório de Estagio de Produção
373
Animal - Instituto Politécnico de Santarém, Escola Superior Agrária de Santarém,
374
Santarém.
375
MANJUNATH, P. Purification and biochemical characterizaction of three major acidic
376
proteins (BSP-A1, BSP-A2 and BSP-A3) from bovine seminal plasm. European
377
Journal of Biochemistry, Berlin., v.241, p.685-692, 1987.
378
PEREIRA, G.J.R.; DUARTE, B.M.J. Seasonal changes in fecal testosterone
379
concentrations and their relationship to the reproductive behavior, antler cycle and
37
380
grouping patterns in free-ranging male Pampas deer (Ozotoceros bezoarticus
381
bezoarticus). Theriogenology., v.63, p.2113-2125, 2005.
382
POCAY, P.L.B. et al. Respostas fisiológicas de cavas holandesas predominantemente
383
brancas e predominantemente negras sob radiação solar direta. ARS VETERINARIA., v.
384
17, n.2, p.155-161, 2001.
385
RONCOLETTA, M.; FRANCESCHINI, P.H.; LIMA, V.F.M.H et al. Perfil em SDS-
386
PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a congelabilidade do sêmen
387
de touros doadores da raça gir. Brazilian Journal of Veterinary Reseach in Animal
388
Science. São Paulo., v.36, n.2, p.143-148, 1999.
389
ROLF, H.J.; FISCHER, K. Serum testosterone (T) and 5-á-dihydrotestosterone (DHT)
390
in male fallow deer (Dama dama L.): Seasonality and age dependence. Comparative
391
Biochemistry and Physiology Part A. Physiology., v.95A, p.445-452, 1990.
392
SALVADOR, D.F.; DIAS, J.C.; VALE FILHO, V.R. et al. Perfil andrológico de touros
393
da raça Nelore com três e quatro anos de idade, criados extensivamente em condições
394
do estado do Mato Grosso do Sul. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.26, p.64-67, 2002.
395
THERIEN, I. R.; MANJUNATH, P. Major protein of bovine seminal plasma and bigh-
396
density lipoprotein induce cholesterol effux from epididymal sperm. Biol. Reprod.,
397
v.59, p.768-776, 1998.
398
VALE FILHO, V.R.; PINHEIRO, L.E.L.; BASUR, P.K. Reproduction in zebu cattle.
399
In: MORROW, D.A (2Ed). Current therapy in theriogenology. Philadelphia: W.B.
400
Saunders Company, 1986. p. 437-442.
401
VAN SOEST, P.J. Nutricional ecology of the ruminant (2Ed). New York: Cornell
402
University, 1994. p.476.
403
WEST, N.O.; NORDAN, H.C. Hormonal regulation of reproduction and the antler
404
cycle in the male Columbian black-tailed deer (Odocoileus hemionus columbianus).
405
Part I. Seasonal changes in the histology of the reproductive organs, serum testosterone,
406
sperm production and the antler cycle. Can. J. Zool., v.54, p.1617-1636, 1976.
38
ANEXO
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
(Brazilian Journal of Veterinary and Animal Sciences)
Política Editorial
O periódico Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (Brazilian Journal of
Veterinary and Animal Science), ISSN 0102-0935 (impresso) e 1678-4162 (on-line), é
editado pela FEPMVZ Editora, CNPJ: 16.629.388/0001-24, e destina-se à publicação de
artigos científicos sobre temas de medicina veterinária, zootecnia, tecnologia e inspeção de
produtos de origem animal, aquacultura e áreas afins.
Os artigos encaminhados para publicação são submetidos à aprovação do Corpo Editorial,
com assessoria de especialistas da área (relatores). Os artigos cujos textos necessitarem de
revisões ou correções serão devolvidos aos autores. Os aceitos para publicação tornam-se
propriedade do Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (ABMVZ) citado como
Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. Os autores são responsáveis pelos conceitos e informações
neles contidos. São imprescindíveis originalidade, ineditismo e destinação exclusiva ao
ABMVZ.
Reprodução de artigos publicados
A reprodução de qualquer artigo publicado é permitida desde que seja corretamente
referenciado. Não é permitido o uso comercial dos resultados.
A submissão e tramitação dos artigos é feita exclusivamente on-line, no endereço eletrônico
<www.abmvz.org.br>.
Não serão fornecidas separatas. Os artigos encontram-se disponíveis nos endereços
www.scielo.br/abmvz ou www.abmvz.org.br.
Orientação para tramitação de artigos
 Toda a tra m ita ção dos a rtigos é fe ita e xclus iva m e nte pe lo S is te m a de publica ção online
do ABMVZ no endereço www.abmvz.org.br.
 Ape na s o a utor re s pons á ve l pe lo a rtigo de ve rá pre e nche r a ficha de s ubm si são, sendo
necessário o cadastro do mesmo no Sistema.
 Toda com unica ção e ntre os dive rs os a tore s do proce s s o de a va lia ção e publica ção
(autores, revisores e editores) será feita exclusivamente de forma eletrônica pelo Sistema,
sendo o autor responsável pelo artigo informado, automaticamente, por e-mail, sobre
qualquer mudança de status do artigo.
 A s ubm is s ã o s ó s e com ple ta qua ndo a ne xa do o te xto do a rtigo e m Word e e m pdf no
campo apropriado.
 Fotogra fia s , de s e nhos e gra vura s de ve m s e r ins e rida s no te xto e ta mbé m e nvia da s , e m
separado, em arquivo com extensão jpg em alta qualidade (mínimo 300dpi),
39
zipado, inserido no campo próprio.
 Ta be la s e grá ficos nã o s e e nqua dra m no ca mpo de a rquivo zipa do, de ve ndo s e r ins e rida s
no corpo do artigo.
 É de e xclus iva re s pons a bilida de de que m s ubm e te o a rtigo ce rtificar-se de que cada um
dos autores tenha conhecimento e concorde com a inclusão de seu nome no mesmo
submetido.
 O ABMVZ com unica rá via e le trônica a ca da a utor, a s ua pa rticipa ção no a rtigo. Ca s o, pe lo
menos um dos autores não concorde com sua participação como autor, o artigo será
recusado.
Tipos de artigos aceitos para publicação:
 Artigo científico
É o relato completo de um trabalho experimental. Baseia-se na premissa de que os
resultados são posteriores ao planejamento da pesquisa.
Seções do texto: Título (português e inglês), Autores e Filiação, Resumo, Abstract,
Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão (ou Resultados e Discussão),
Conclusões, Agradecimentos (quando houver) e Referências.
O número de páginas não deve exceder a 15, incluindo tabelas e figuras.
O número de Referências não deve exceder a 30.
 Relato de caso
Contempla principalmente as áreas médicas, em que o resultado é anterior ao interesse de
sua divulgação ou a ocorrência dos resultados não é planejada.
Seções do texto: Título (português e inglês), Autores e Filiação, Resumo, Abstract,
Introdução, Casuística, Discussão e Conclusões (quando pertinentes), Agradecimentos
(quando houver) e Referências.
O número de páginas não deve exceder a 10, incluindo tabelas e figuras.
O número de Referências não deve exceder a 12.
 Comunicação
É o relato sucinto de resultados parciais de um trabalho experimental, dignos de publicação,
embora insuficientes ou inconsistentes para constituírem um artigo científico.
O texto, com título em português e em inglês, Autores e Filiação deve ser compacto, sem
distinção das seções do texto especificadas para “Artigo científico”, embora seguindo aquela
ordem. Quando a Comunicação for redigida em português deve conter um “Abstract” e
quando redigida em inglês deve conter um “Resumo”.
O número de páginas não deve exceder a 8, incluindo tabelas e figuras.
O número de Referências não deve exceder a 12.
40
Preparação dos textos para publicação
Os artigos devem ser redigidos em português ou inglês, na forma impessoal. Para ortografia
em inglês recomenda-se o Webster’s Third New International Dictionary. Para ortografia em
português adota-se o Vocabulário Ortográfico da Língua Portuguesa, da Academia Brasileira
de Letras.
Formatação do texto
 O te xto de ve s e r a pre s e nta do e m Micros oft Word, e m form a to A4, com m a rge m 3cm
(superior, inferior, direita e esquerda), em fonte Times New Roman tamanho 12 e em
espaçamento entrelinhas 1,5, em todas as páginas, com linhas numeradas.
 Nã o us a r rodapé. Referências a empresas e produtos, por exemplo, devem vir,
obrigatoriamente, entre parêntesis no corpo do texto na seguinte ordem: nome do produto,
substância, empresa e país.
Seções de um artigo
 Título. Em português e em inglês. Deve contemplar a essência do artigo e não
ultrapassar 150 dígitos.
 Autores e Filiação. Os nomes dos autores são colocados abaixo do título, com
identificação da instituição a que pertencem. O autor para correspondência e seu e-mail
devem ser indicados com asterisco.
Nota:
1. o texto do artigo em Word deve conter o nome dos autores e filiação.
2. o texto do artigo em pdf não deve conter o nome dos autores e filiação.
 Resumo e Abstract. Deve ser o mesmo apresentado no cadastro contendo até 2000
dígitos incluindo os espaços, em um só parágrafo. Não repetir o título e incluir os principais
resultados numéricos, citando-os sem explicá-los, quando for o caso. Cada frase deve
conter uma informação. Atenção especial às conclusões.
 Palavras-chave e Keywords. No máximo cinco.
 Introdução. Explanação concisa, na qual são estabelecidos brevemente o problema, sua
pertinência e relevância e os objetivos do trabalho. Deve conter poucas referências,
suficientes para balizá-la.
 Material e Métodos. Citar o desenho experimental, o material envolvido, a descrição dos
métodos usados ou referenciar corretamente os métodos já publicados. Não usar subtítulos.
Nos trabalhos que envolvam animais e organismos geneticamente modificados deverá
constar, obrigatoriamente, o número do protocolo de aprovação do Comitê de Bioética e/ou
de Biossegurança, quando for o caso.
 Resultados. Apresentar clara e objetivamente os resultados encontrados.
 Tabela. Conjunto de dados alfanuméricos ordenados em linhas e colunas. Usar linhas
horizontais na separação dos cabeçalhos e no final da tabela. A legenda recebe inicialmente
a palavra Tabela, seguida pelo número de ordem em algarismo arábico e é referida no texto
como Tab., mesmo quando se referir a várias tabelas. Pode ser apresentada em
espaçamento simples e fonte de tamanho menor que 12 (menor tamanho aceito é 8).
41
 Figura. Qualquer ilustração que apresente linhas e pontos: desenho, fotografia, gráfico,
fluxograma, esquema, etc. A legenda recebe inicialmente a palavra Figura, seguida do
número de ordem em algarismo arábico e é referida no texto como Fig., mesmo se referir a
mais de uma figura. As fotografias e desenhos com alta qualidade em formato jpg, devem
ser também enviadas, em um arquivo zipado, no campo próprio de submissão.
Nota:
 Toda ta be la e /ou figura que já te nha s ido publica da de ve conte r, a ba ixo da le ge nda ,
informação sobre a fonte (autor, autorização de uso, data) e a correspondente referência
deve figurar nas Referências.
 As ta be la s e figura s de ve m pre fe re ncia lm e nte , s e r ins e rida s no te xto no pa rá gra fo
seguinte à sua primeira citação.
 Discussão. Discutir somente os resultados obtidos no trabalho. (Obs.: As seções
Resultados e Discussão poderão ser apresentadas em conjunto a juízo do autor, sem
prejudicar qualquer das partes).
 Conclusões. As conclusões devem apoiar-se nos resultados da pesquisa executada.
 Agradecimentos. Não obrigatório. Devem ser concisamente expressados.
 Referências. As referências devem ser relacionadas em ordem alfabética. Evitar
referenciar livros e teses. Dar preferência a artigos publicados em revistas nacionais e
internacionais, indexadas. São adotadas as normas ABNT/NBR-6023 de 2002, adaptadas
conforme exemplos:
Como referenciar:
1. Citações no texto
 Cita çõe s no te xto de ve rã o s e r fe ita s de a cordo com ABNT/NBR 10520 de 2002. A
indicação da fonte entre parênteses sucede à citação para evitar interrupção na sequência
do texto, conforme exemplos:
 a utoria única : (S ilva , 1971) ou S ilva (1971); (Anuá rio..., 1987/88) ou Anuá rio... (1987/88)
 dois a utore s : (Lope s e More no, 1974) ou Lope s e More no (1974)
 m a is de dois autores: (Ferguson et al., 1979) ou Ferguson et al. (1979)
 m a is de um a rtigo cita do: Dunne (1967); S ilva (1971); Fe rgus on et al. (1979) ou (Dunne,
1967; Silva, 1971; Ferguson et al., 1979), sempre em ordem cronológica ascendente e
alfabética de autores para artigos do mesmo ano.
 Citação de citação. Todo esforço deve ser empreendido para se consultar o documento
original. Em situações excepcionais pode-se reproduzir a informação já citada por outros
autores. No texto, citar o sobrenome do autor do documento não consultado com o ano de
publicação, seguido da expressão citado por e o sobrenome do autor e ano do documento
consultado. Nas Referências, deve-se incluir apenas a fonte consultada.
 Comunicação pessoal. Não fazem parte das Referências. Na citação coloca-se o
sobrenome do autor, a data da comunicação, nome da Instituição à qual o autor é vinculado.
2. Periódicos (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL. v.48, p.351, 1987-88.
FERGUSON, J.A.; REEVES, W.C.; HARDY, J.L. Studies on immunity to alphaviruses in
foals. Am. J. Vet. Res., v.40, p.5-10, 1979.
HOLENWEGER, J.A.; TAGLE, R.; WASERMAN, A. et al. Anestesia general del canino. Not.
Med. Vet., n.1, p.13-20, 1984.
3. Publicação avulsa (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
DUNNE, H.W. (Ed). Enfermedades del cerdo. México: UTEHA, 1967. 981p.
LOPES, C.A.M.; MORENO, G. Aspectos bacteriológicos de ostras, mariscos e mexilhões. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 14., 1974, São Paulo. Anais...
São Paulo: [s.n.] 1974. p.97. (Resumo).
42
MORRIL, C.C. Infecciones por clostridios. In: DUNNE, H.W. (Ed). Enfermedades del cerdo.
México: UTEHA, 1967. p.400-415.
NUTRIENT requirements of swine. 6.ed. Washington: National Academy of Sciences, 1968.
69p.
SOUZA, C.F.A. Produtividade, qualidade e rendimentos de carcaça e de carne em bovinos
de corte. 1999. 44f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Escola de
Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.
4. Documentos eletrônicos (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores
et al.):
QUALITY food from animals for a global market. Washington: Association of American
Veterinary Medical College, 1995. Disponível em: <http://www. org/critca16.htm>. Acessado
em: 27 abr. 2000.
JONHNSON, T. Indigenous people are now more cambative, organized. Miami Herald, 1994.
Disponível em: <http://www.summit.fiu.edu/ MiamiHerld-Summit-RelatedArticles/>. Acessado
em: 5 dez. 1994.
Nota:
 Artigos que nã o e s te ja m rigoros a m e nte de ntro da s norm a s a cim a nã o s e rã o a ce itos pa ra
avaliação.
 O S is te m a re conhe ce , a utom a tica m e nte , com o “
De s is tê ncia do Autor” a rtigos e m
diligência ou “Aguardando diligência do autor”, que não tenha sido respondido no prazo
dado pelo Sistema.
Taxas de submissão e de publicação:
 Taxa de submissão. A taxa de submissão de R$30,00 deverá ser paga por meio de
boleto bancário emitido pelo sistema eletrônico de submissão de artigos. Ao solicitar o
boleto bancário, o autor informará os dados para emissão da nota fiscal. Somente artigos
com taxa paga de submissão serão avaliados.
Caso a taxa não seja quitada em até 30 dias será considerado como desistência do autor.
 Taxa de publicação. A taxa de publicação de R$70,00, por página impressa em preto e
R$220,00 por página impressa em cores será cobrada do autor indicado para
correspondência, por ocasião da prova final do artigo. A taxa de publicação deverá ser paga
por meio de boleto bancário emitido pelo sistema eletrônico de submissão de artigos. Ao
solicitar o boleto bancário, o autor informará os dados para emissão da nota fiscal.
Recursos e diligências:
 No ca s o de o a utor e nca m inha r re s pos ta a diligê ncia s s olicita das pelo ABMVZ, ou
documento de recurso, o mesmo deverá constar como a(s) primeira(s) página(s) do texto do
artigo somente na versão em Word.
 No ca s o de a rtigo nã o a ce ito, s e o a utor julga r pe rtine nte e nca m inha r re curs o, o m e s m o
deve ser feito pelo e-mail [email protected].