Livro - Androfert

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Livro - Androfert

PREFÁCIO
A publicação do Atlas de Reprodução Humana, da
Sociedade Brasileira de Reprodução Humana (SBRH),
resultou do estímulo e do trabalho conjunto de mais de
200 autores de mais de 30 serviços de reprodução assistida,
representando mais de dez estados da Federação.
Esta obra possui 32 capítulos e mais de 300 ilustrações,
e procura preencher uma lacuna na reprodução assistida
moderna brasileira.
Este Atlas elaborado de maneira clara e concisa, com
inumeras fotos e ilustrações, contém as informações necessárias para os embriologistas, biólogos, biomédicos e médicos ginecologistas e urologistas que atuam em laboratórios
de reprodução assistida, passando, dessa forma, a ser fonte
fundamental de conhecimento para estes profissionais.
O Atlas foi elaborado para quem está iniciando na reprodução humana. Contém capítulos básicos sobre construção e controle de qualidade de um laboratório moderno
de reprodução assistida, passa pela fisiologia e pelo diagnóstico dos gametas feminino e masculino, ilustrando na
sua totalidade as técnicas avançadas de reprodução assistida. Além disso, contou com a participação especial do
Conselho Federal de Medicina (CFM) e da Anvisa nos aspectos éticos, jurídicos e da legislação do ano 2012.
O nascimento de Louise Brown, em julho de 1978, é o
grande marco da era moderna da reprodução assistida, que
contabiliza mais de 4 milhões de nascimentos no mundo
inteiro. O Brasil tem papel importante neste contexto, com
mais de 200 clínicas de fertilização presentes em todos os
estados do território nacional, responsáveis por 25 a 30 mil
ciclos por ano, totalizando cerca de 50% das fertilizações
da América Latina.
A SBRH, fundada em dezembro de 1947, cumpre sua
missão de organizar e difundir eticamente os conhecimentos da reprodução assistida, de forma prática, didática e
inédita, por meio deste Atlas.
Trata-se de mais uma conquista da SBRH, oferecendo
aos seus associados este primeiro Atlas nacional, que irá
contribuir na formação e no aprimoramento das técnicas
de reprodução assistida moderna.
A todos agradeço pela indispensável colaboração e
pelo árduo trabalho, que tornaram possível a realização da
presente obra.
Artur Dzik
Presidente da SBRH 2010-2012
1
Capítulo 9
Técnicas de extração
e processamento de
espermatozoides obtidos
do epidídimo e do
testículo
Sidney Verza Jr.
Sandro C. Esteves
Introdução
Em um curto período, dois grandes avanços ocorreram na
área de infertilidade masculina1-3: (i) o desenvolvimento da
injeção intracitoplasmática do espermatozoide no óvulo
(Intracytoplasmic Sperm Injection – ICSI) e (ii) a extensão
da ICSI para homens azoospérmicos, pela demonstração
da capacidade dos espermatozoides provenientes tanto do
epidídimo quanto do testículo em fertilizar oócitos e produzir gravidezes2,3.
Duas condições clínicas totalmente distintas podem
ser observadas nos homens com azoospermia. Na azoospermia obstrutiva (AO), a espermatogênese é normal,
mas existe um bloqueio no trato reprodutivo extracanalicular entre o epidídimo e o duto ejaculatório, ou então o
epidídimo e/ou os vasos deferentes estão parcial ou totalmente ausentes. A azoospermia obstrutiva pode decorrer
da vasectomia ou de uma falha na reversão desse mesmo
procedimento, de doenças infecciosas ou ainda de traumas ou procedimentos cirúrgicos nas regiões escrotais,
inguinal, pélvica ou abdominal. Além destas, a AO pode
ser congênita, como nos casos de fibrose cística, agenesia
congênita dos canais deferentes, cistos nos dutos ejaculatório ou prostático e na síndrome de Young4. Por outro
lado, a azoospermia não obstrutiva (ANO) resulta de um
amplo espectro de doenças que comprometem de manei-
ra dramática a espermatogênese. Entre elas, destacam-se
a criptorquidia, orquite, trauma testicular, varicocele,
exposição a radiação, quimioterapia ou outras gonadotoxinas, causas genéticas e endócrinas, podendo ainda ser
idiopática.
No contexto da reprodução assistida, o objetivo é extrair espermatozoides do epidídimo ou do testículo nos
casos de AO, e apenas do testículo nos casos de ANO,
para serem utilizados na fertilização in vitro por meio
da técnica de ICSI. Na AO, os espermatozoides são facilmente obtidos, enquanto na ANO a extração de espermatozoides testiculares pode ser muito difícil ou mesmo
impossível4,5.
Diversos métodos foram desenvolvidos para a extração
de espermatozoides nos homens azoospérmicos. Como
regra geral, tanto a aspiração percutânea (Percutaneous
Epididymal Sperm Aspiration – PESA6) como a aspiração
microcirúrgica (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration – MESA2) podem ser utilizadas para recuperar espermatozoides no epidídimo de homens com AO. A aspiração
testicular (Testicular Sperm Aspiration – TESA) também
pode ser utilizada na AO, principalmente nos casos de
ausência ou intensa fibrose do epidídimo, ou na falha da
PESA6,7. Na ANO, os espermatozoides testiculares podem
ser extraídos por via percutânea (TESA) ou por meio de
biópsia aberta convencional8 (Testicular Sperm Extraction
3
T É C N IC A S D E E XT R A Ç Ã O E PR O C E S S A M E N TO D E E S PE R M ATO ZOI D E S OB T I D O S D O E PI D Í D I M O E D O T E S T ÍC U LO
4
– TESE) ou microcirúrgica (micro-TESE)9. Na AO, fatores
como técnica de coleta dos espermatozoides, sua origem
(epidídimo ou testículo) e causa da azoospermia não influenciam nos resultados da FIV-ICSI10,11. Por outro lado,
a chance de extrair espermatozoides testiculares na ANO
depende do método empregado
12,13
(Tabela 1).
O processamento laboratorial dos espermatozoides
obtidos cirurgicamente difere daquele normalmente aplicado às amostras ejaculadas. Espermatozoides epididimários e testiculares são geralmente obtidos em pequeno
número e possuem motilidade reduzida ou ausente. Além
disso, espermatozoides testiculares estão confinados nos
túbulos seminíferos, que contêm outros elementos celulares. Nesses casos, o processamento espermático deve
não somente objetivar a seleção dos espermatozoides de
melhor qualidade para FIV-ICSI, mas também melhorar
o potencial de fertilização deles quando possível. Para tanto, o laboratório deve: (i) receber material com mínima ou
nenhuma contaminação de hemácias ou outros microrganismos; (ii) minimizar o dano iatrogênico celular durante
o processamento das amostras, que inclui redução da força
e tempo de centrifugação, não exposição das amostras à
luz ultravioleta e oscilações de temperatura, rígido controle da qualidade dos reagentes, dos meios de cultura, dos
materiais descartáveis e do ar do laboratório, além da utilização de técnicas antissépticas nos processos de diluição
e lavagem; e (iii) melhorar o potencial de fertilização dos
espermatozoides após o processamento, quando possível,
pelo uso de substâncias estimulantes ou pela seleção de espermatozoides vivos para FIV-ICSI no caso da existência
de apenas espermatozoides imóveis após o processamento.
Neste capítulo, disponibilizaremos uma breve descrição laboratorial, passo a passo, das técnicas frequentemente utilizadas para processar amostras obtidas via PESA/TESA/
TESE, além das alternativas disponíveis para a identificação de espermatozoides imóveis e viáveis para FIV-ICSI.
Procedimentos laboratoriais
Preparo do laboratório
Deve-se trabalhar em condições estéreis em cabine de fluxo laminar ou sala limpa durante todas as etapas.
Preparam-se 10 mL (para PESA) ou 20 mL (para
TESA/TESE) de meio de cultura tamponado e suplementado com 5% de albumina humana, que é
mantido a 37 ºC.
Transfere-se uma alíquota de 5 mL para um tubo
estéril de poliestireno de 6 mL, que é enviado para o
centro cirúrgico (o meio de cultura é utilizado para
lavar o sistema de aspiração antes das aspirações
percutâneas, e para incubar o fluido epididimário
ou o fragmento testicular após a coleta).
Colocam-se duas placas de petri (50 x 9 mm) em
uma superfície aquecida na estação de trabalho do
laboratório (apenas para PESA).
Preparam-se quatro placas de petri de duplo poço,
adicionando-se 0,5 mL no poço interno e 1 mL no
poço externo (apenas para TESA). Nos casos de
TESE, enviam-se duas dessas placas para o centro
cirúrgico.
Preparam-se duas seringas de 1 mL, conectando-se
agulhas de 26 G (para serem utilizadas na dissecção mecânica dos túbulos seminíferos nos casos de
TESA/TESE).
Processamento de amostras obtidas
do epidídimo (PESA e MESA)
Técnica cirúrgica
A aspiração de espermatozoides do epidídimo pode ser
realizada no mesmo dia da coleta dos oócitos ou no dia anterior, sob anestesia intravenosa ou local. Os principais passos do procedimento encontram-se descritos na Figura 1.
Tabela 1. Taxas de sucesso na recuperação de espermatozoides, de acordo com o tipo de azoospermia , com a técnica de extração e potencial reprodutivo dos gametas extraídos cirurgicamente na ICSI23
Azoospermia obstrutiva
Azoospermia não obstrutiva
Taxa de sucesso na obtenção de espermatozoides por método (variação)
Percutâneo
Microcirúrgico
90% (80%-100%)
90% (80%-100%)
35% (10%-100%)
50% (20%-100%)
Resultados da ICSI, média (variação)
Taxa de fertilização 2PN
Taxa de gravidez clínica
Taxa de nascidos vivos
60% (45%-75%)
50% (26%-57%)
35% (18%-55%)
50% (20%-65%)
30% (10%-45%)
20% (8%-35%)
A PESA é realizada sob anestesia
endovenosa ou local.
O epidídimo é identificado e
imobilizado.
Utilizando-se seringa e agulha fina, o
fluido epididimário é aspirado
O fluido aspirado
é transferido
para um tubo
estéril contendo
meio de cultura
tamponado
e enviado ao
laboratório para
análise
Uma alíquota
da amostra é
transferida para
uma placa de
petri e observada
ao microscópio
para confirmar
a presença de
espermatozoides
SIM
Número adequado de
espermatozoides para ICSI?
Processamento espermático
Lavagem simples
NÃO
PESA é repetida em um segmento
diferente de epidídimo e/ou no epidídimo
contralateral.
Gradiente descontínuo
Avaliação ao microscópio
Diluição do fluido
epididimário com meio
de cultura para sêmen
Fluido é colocado
sobre camadas de
0,3 ml de gradiente
coloidal a 45%
e 90%
Centrifugação
a 300 xg por 10
minutos.
SIM
Número adequado de
espermatozoides móveis
para ICSI?
NÃO
Na falha da PESA, a TESA pode ser
realizada durante o mesmo procedimento
anestésico
Lavagem adicional quando
gradiente é utilizado
O sobrenadante é descartado e o sedimento é ressuspendido
em 0,2 ml do meio da cultura
Uma placa de petri contendo microgotas de 10 microlitros de meio de
cultura e 4 microlitros de PVP coberta com óleo mineral é preparada
para a captura e imobilização dos espermatozoides, respectivamente,
após a adição do material processado.
Espermatozoides móveis e morfologicamente normais são
selecionados na microgota de meio de cultura e transferidos ao PVP
para imobilização com o auxílio das microagulhas de ICSI
Espermatozoides excedentes obtidos via
PESA e que não foram utilizados para ICSI
podem ser criopreservados
Figura 1. Aspiração percutânea de espermatozoides do epidídimo (PESA). A figura mostra as etapas do procedimento, incluindo a técnica cirúrgica e o processamento laboratorial do fluido epididimário. A aspiração microcirúrgica de espermatozoides do epidídimo (MESA) também
pode ser empregada. Nesta, realiza-se uma pequena incisão na pele do escroto, de modo a expor o epidídimo, seguida da abertura de um
túbulo epididimário e aspiração do fluido nele contido com auxílio do microscópio cirúrgico e técnica microcirúrgica. Fonte: Androfert, 2011.
PESA
5
6
lhante antes do processamento espermático. Nos casos de falha da PESA ou MESA, a aspiração de espermatozoides testiculares pode ser realizada no mesmo
procedimento anestésico-cirúrgico (Figura 4).
Identifica-se o tubo contendo o fluido aspirado,
anotando também o lado e a porção do epidídimo de onde o material foi obtido. De acordo com
a qualidade inicial da amostra (número de espermatozoides sua motilidade), define-se a técnica de
processamento a ser utilizada (lavagem espermática ou minigradiente descontínuo coloidal de duas
camadas). De maneira geral, utiliza-se gradiente
quando as amostras apresentam grande quantidade
de espermatozoides, principalmente na presença de
hemácias, debris e outros elementos celulares. Nos
demais casos, utiliza-se a lavagem simples.
Técnica laboratorial
Dilui-se o fluido aspirado do epidídimo com 0,5 mL
de meio de cultura. O fluido deve ser homogeneizado com auxílio de uma pipeta para evitar aglutinação
(espermatozoides do epidídimo tendem a se aglutinar rapidamente). Deve-se manter o tubo a 37 ºC.
Coloca-se uma alíquota de 10 µL a 20 µL do fluido
epididimário homogeneizado em uma placa de petri e examina-se o material ao microscópio invertido
(magnificação óptica de 400 ×), para confirmar a presença e determinar a qualidade dos espermatozoides
(Figura 2). O cirurgião deve ser informado se o número de espermatozoides obtidos é suficiente para o
procedimento de ICSI. Se mais de uma amostra tiver
sido colhida, agrupar amostras de qualidade seme-
A
B
C
D
Figura 2. Fluido epididimário obtido via PESA. Fotomicrografias do material examinado ao microscópio óptico invertido (Nikon Eclipse
Diaphot 300) com contraste de fase (Hoffman), utilizando magnificação de 400 ×. A contaminação por hemácias (a) é geralmente observada no fluido aspirado do epidídimo. No caso de contaminação excessiva, realiza-se a lise das hemácias por diluição e lavagem com a
solução hemolisadora de hemácias*. Aspecto do fluido epididimário pós-tratamento com a solução hemolisadora (B). Amostras obtidas
das porções mais distais do epidídimo (C e D) geralmente contêm muitos espermatozoides imóveis e senescentes: (b) espermatozoides
com cauda curta, (c) espermatozoides com ausência do flagelo.
* Solução hemolisadora: solução aquosa estéril contendo NH4Cl 155mM + KHCO3 10mM + EDTA 2mM; pH = 7,2. Adiciona-se 2,0 mL da solução ao sedimento da amostra pós-diluição e lavagem, incubando-se à temperatura ambiente por dez minutos. Centrifuga-se novamente
a 300 xg por cinco minutos e ressuspende-se o sedimento com meio de cultura tamponado e suplementado com proteína.
A
nado com grande número de hemácias, realiza-se
diluição e lavagem simples com a solução hemolisadora de hemácias (Figura 2).
Prepara-se uma placa de petri contendo microgotas de meio de cultura e polivinilpirrolidona (PVP)
cobertas com óleo mineral, na qual será colocada a
amostra do aspirado epididimário processado (Figura 3).
Colocam-se 2 µL da amostra processada na microgota de PVP, caso existam espermatozoides com
motilidade progressiva. Caso haja poucos espermatozoides móveis ou se estes possuírem motilidade não progressiva, coloca-se uma alíquota de
2 µL a 4 µL da amostra processada em cada uma
das microgotas de meio de cultura. Identificam-se
os espermatozoides móveis morfologicamente normais, para capturá-los e separá-los até o momento
da ICSI.
Considera-se criopreservar o fluido epididimário
excedente e não utilizado na ICSI, dependendo de
sua qualidade. A criopreservação desses espermatozoides pode ser realizada pela técnica clássica de
congelamento, por meio de vapor de nitrogênio
líquido14.
B
Figura 3. Preparo da placa de petri. Ilustração da placa de petri contendo microgotas recobertas com óleo mineral. (A) Microgotas de
meio de cultura dispostas radialmente e microgota de PVP no formato de triângulo no centro da placa. Alíquotas (1 µL a 4 µL) de amostras
processadas obtidas por PESA/MESA/TESA/TESE são colocadas nas microgotas numeradas de 1 a 4, das quais os espermatozoides são
capturados. Estes são transferidos para a microgota de PVP (5), onde se realiza a seleção morfológica, a imobilização e a aspiração dos
espermatozoides para o interior da pipeta de microinjeção; (B) método de seleção espermática utilizando o teste do inchaço da cauda do
espermatozoide. O espermatozoide imóvel é aspirado da microgota contendo a suspensão celular (gotas 1 a 4) com auxílio da pipeta de
microinjeção. A micropipeta é inserida na solução hiposmótica (gota 8) e somente a cauda do espermatozoide é exteriorizada da pipeta.
A presença de inchaço na extremidade distal da cauda indica que a permeabilidade da membrana plasmática está intacta, sendo este um
sinal de viabilidade celular. Após serem submetidos ao teste, os espermatozoides viáveis são transferidos para uma microgota de meio de
cultura para que o reequilíbrio osmótico seja estabelecido e depois para a microgota de PVP.
Na técnica do minigradiente descontínuo coloidal,
montam-se duas camadas de 0,3 mL de gradiente,
sendo a camada inferior com gradiente de 80% a
90%, e camada superior de 40% a 45%. Sobre esta
última, deposita-se 0,5 mL da amostra de PESA
homogeneizada. Centrifuga-se o conjunto a 300 ×g
por dez minutos. A seguir, remove-se o sobrenadante e ressuspende-se o sedimento em 1,5 mL de
meio de cultura, repetindo-se a centrifugação. Remove-se novamente o sobrenadante, deixando-se
intacto o sedimento e aproximadamente 0,2 mL de
meio de cultura. Completa-se com meio de cultura
para atingir o volume final de 0,5 mL e homogeneiza-se, mantendo a suspensão aquecida até o uso.
Na lavagem simples, dilui-se a suspensão de espermatozoides com meio de cultura até atingir o
volume final de 1,5 mL a 2,0 mL. Homogeneiza-se
e centrifuga-se a suspensão a 300 ×g por dez minutos. Descarta-se o sobrenadante e ressuspende-se o
sedimento em 0,2 mL de meio de cultura.
Remove-se uma alíquota de 10 µL do fluido epididimário processado que é examinado ao microscópio invertido para se verificar a qualidade final
da amostra. Caso o material obtido esteja contami-
7
8
Processamento de amostras do
testículo obtidas por TESA
Técnica cirúrgica
A aspiração de espermatozoides do testículo pode ser realizada tanto no mesmo dia da coleta dos oócitos quanto
no dia anterior, sob anestesia intravenosa associada à anestesia local. Os principais passos do procedimento encontram-se descritos nas Figuras 4 e 5.
Técnica laboratorial (Figuras 4 e 5)
Transfere-se o(s) fragmento(s) de parênquima
testicular para o poço externo da placa de duplo
poço contendo meio de cultura e realiza-se uma
cultura. Aguarda-se cerca de dez minutos para sedimentação das células e realiza-se a avaliação microscópica. A seguir, procede-se com a captura dos
espermatozoides móveis, transferindo-os para a
microgota de PVP, onde os espermatozoides morfologicamente normais são selecionados para ICSI.
Caso a extração de espermatozoides tenha sido realizada no dia anterior, adicionam-se as alíquotas da suspensão nas microgotas de meio de cultura e realiza-se a captura e a seleção no dia da ICSI (a suspensão celular pode
permanecer até 48 horas em cultura, preferencialmente à
temperatura de 25 oC). Pode-se realizar a criopreservação
da suspensão celular excedente e não utilizada na ICSI, dependendo da qualidade do material, pela técnica clássica
de congelamento seminal, utilizando vapor de nitrogênio
líquido15.
lavagem dos túbulos para remover o excesso de
hemácias. Transferem-se os túbulos ainda intactos
para o poço central da placa de duplo poço contendo meio de cultura. A seguir, realiza-se a dissecção
mecânica dos túbulos seminíferos com o auxílio
de agulhas, com o objetivo de romper a parede dos
túbulos e facilitar a saída dos elementos celulares
neles contidos.
Examina-se a suspensão ao microscópio invertido
(400 ×) para verificar a presença de espermatozoides. O cirurgião deve ser informado sobre a necessidade de extrair outros fragmentos. No caso de ausência de espermatozoides no material examinado,
pode-se realizar a TESE no mesmo ato anestésico-cirúrgico (Figura 6).
Aspira-se e transfere-se para um tubo estéril o
fluido do poço central da placa de petri contendo
as células em suspensão. Dilui-se o aspirado com
3 mL de meio de cultura e centrifuga-se o conjunto
a 300 ×g por dez minutos.
Descarta-se o sobrenadante e ressuspende-se o sedimento em 0,2 mL de meio de cultura. Remove-se uma
alíquota, que é examinada ao microscópio invertido.
Caso a amostra apresente contaminação com grande
número de hemácias, realiza-se diluição e lavagem
simples com a solução hemolisadora de hemácias.
Prepara-se uma placa de petri conforme descrito
no item referente ao processamento de amostras do
epidídimo.
Coloca-se uma alíquota de 1 µL a 2 µL da amostra
processada em cada microgota de 10 µL de meio de
Processamento de amostras do
testículo obtidas por TESE e microTESE
Técnica cirúrgica
A TESE ou a micro-TESE pode ser realizada no dia da
captação dos oócitos ou no dia anterior, e é feita pela associação de anestesias intravenosa e local. Na micro-TESE,
utiliza-se microscópio e técnica microcirúrgica, como
ilustrado nas Figuras 6 e 75,9.
Técnica laboratorial (Figura 5)
No laboratório de FIV, transferem-se os fragmentos de
TESE recebidos do centro cirúrgico para o poço externo de uma placa de petri previamente preparada com
meio de cultura aquecido. Sob estereomicroscopia,
lava-se a amostra para remover o excesso de hemácias.
Para tanto, o(s) fragmento(s) é(são) transferido(s) de
um poço contendo meio de cultura para outro, repetindo-se o mesmo processo várias vezes.
Realiza-se a dispersão mecânica dos túbulos, seguindo as etapas já descritas no item referente ao
processamento de amostras de aspiradas do testículo. Preferencialmente, dois embriologistas devem
trabalhar simultaneamente nesta etapa (enquanto um deles disseca os túbulos o outro examina a
porção já dissecada ao microscópio invertido). O
cirurgião deve ser informado sobre a qualidade do
material obtido, para decidir se novos fragmentos
devem ser removidos.
Realiza-se a aspiração testicular
percutânea com agulha grossa (18 G).
Gera-se pressão negativa puxando-se
o êmbolo da seringa, e movimentase a agulha no interior do testículo
(movimentos de “vai-e-vem”) para
romper os túbulos seminíferos.
Observa-se a entrada de fragmento de
parênquima testicular na seringa. Retirase cuidadosamente a agulha e removese o fragmento residual de parênquima
que se exterioriza pela pele
Transfere-se o
fragmento de
parênquima testicular
para um tubo
contendo meio de
cultura aquecido.
Envia-se o conjunto
para o laboratório
Lava-se o fragmento de parênquima
testicular para remover o excesso
de hemácias, e a seguir realiza-se
a dispersão mecânica dos túbulos
seminíferos com auxílio de agulhas
finas
O material dissecado é examinado ao
microscópio invertido para verificar a
existência de espermatozoides
SIM
Número adequado de
NÃO
Processamento de espermatozoides da TESA
TESA ou TESE é realizada no testículo
contralateral
O parênquima testicular dissecado é transferido para um
tubo contendo meio de cultura tamponado e aquecido
Examinar ao microscópio
SIM
Realiza-se a
centrifugação
a 300 xg por 10
minutos
Número adequado de
NÃO
Considerar a realização de TESE ou microTESE no mesmo procedimento anestésicocirúrgico, ou abortar o procedimento e
considerar utilização de sêmen de doador
O sobrenadante é descartado e o sedimento é
ressuspendido em 0,2 ml de meio de cultura. Uma alíquota
do material ressuspendido é examinada ao microscópio e,
caso observe-se contaminação com hemácias, realiza-se a
diluição e lavagem com solução hemolisadora de hemácias
Prepara-se uma placa de petri contendo microgotas de meio
de cultura (10 microlitros) e PVP (4 microlitros) recobertas com
óleo mineral. Alíquotas da TESA processada são colocadas nas
microgotas de meio de cultura para a identificação e captura dos
espermatozoides. Os espermatozoides são transferidos para a
microgota de PVP, onde são selecionados para a ICSI
Espermatozoides obtidos pela TESA
e não utilizados para ICSI podem ser
criopreservados
Figura 4. Aspiração percutânea de espermatozoides do testículo (TESA). A figura mostra as etapas do procedimento, incluindo a técnica
cirúrgica e o processamento laboratorial do parênquima testicular. A inserção da agulha deve ser realizada na região anteromedial ou
anterolateral do polo superior do testículo, num ângulo oblíquo em direção ao polo inferior, pois, nesta região, a túnica albugínea é relativamente avascular. Fonte: Androfert, 2011.
TESA
9
10
A
B
C
D
E
F
Figura 5. Processamento laboratorial do parênquima testicular. Esquema ilustrando o passo a passo do processamento de amostras obtidas via TESA/TESE: (A) placa de petri com o fragmento de parênquima testicular imerso em meio de cultura; (B) aspecto do fragmento de
parênquima testicular observado ao estereomicroscópio com magnificação de 70X; (C) com auxílio de agulhas finas, os túbulos seminíferos são delicadamente separados, permitindo a observação de seus diâmetros (fotografia obtida do estereomicroscópio com magnificação de 70X). Observam-se túbulos seminíferos de aspectos e diâmetros diferentes numa mesma amostra de tecido: túbulos com menor
diâmetro e translúcidos à luz (seta branca), e túbulos ingurgitados e mais escuros (seta preta). Os túbulos ingurgitados e mais escuros tem
mais chance de conter células da linhagem germinativa; (D) dissecção mecânica dos túbulos seminíferos sob estereomicroscopia com
auxílio de agulhas acopladas a seringas; (E) placa de petri com a amostra dissecada, em que se observa a ausência de túbulos seminíferos
visíveis; (F) fotomicrografia da suspensão celular pós-dissecção, obtida do microscópio invertido com contraste de fase (magnificação: 400
×). No destaque, verifica-se a presença de espermatozoides na amostra.
Realiza-se a
microdissecção dos
túbulos seminíferos
com o intuito
de identificar e
remover os túbulos
ingurgitados,
que representam
aqueles onde
há maior
probabilidade de
haver espermatogênese ativa. Os túbulos removidos
são colocados no poço central de uma placa de petri
contendo meio de cultura tamponado e aquecido, e o
material é enviado para o laboratório de FIV
Na micro-TESE, utilizam-se
microscópio cirúrgico,
instrumental e técnica
microcirúrgica. O testículo
é exteriorizado do escroto,
e uma incisão ampla é
realizada numa região não
vascularizada da túnica
albugínea, permitindo
a exposição ampla do
parênquima testicular
Os túbulos seminíferos
são lavados para remover
o excesso de hemácias,
e a seguir realiza-se sua
dispersão mecânica com
auxílio de agulhas finas
A amostra é observada
ao microscópio para
confirmar a presença de
espermatozoides
SIM
Número adequado de
Processamento de espermatozoides da micro-TESE
Os túbulos seminíferos dissecados são transferidos
para um tubo contendo meio de cultura tamponado
e aquecido
Realiza-se a
centrifugação
a 300 xg 10
minutos
NÃO
Continuar a microdissecção para remover
fragmentos adicionais ou realizar a microTESE no testículo contralateral
Examinar ao microscópio
Número adequado de
espermatozoides para
ICSI?
Ausência de espermatozoides após
micro-TESE bilateral
Abortar o procedimento
ou considerar utilização de
sêmen de doador para ICSI
O sobrenadante é descartado e o sedimento é
ressuspendido a 0,2 ml de meio de cultura. Uma
alíquota do material ressuspendido é examinada ao
microscópio, e caso observe-se contaminação com
hemácias, realiza-se a diluição e lavagem com solução
hemolisadora de hemácias.
Prepara-se uma de placa petri contendo microgotas de meio de
cultura (10 microlitros) e PVP (4 microlitros) recobertas com óleo
mineral. Alíquotas da micro-TESE processada são colocadas nas
microgotas de meio de cultura para a identificação e captura dos
espermatozoides. Os espermatozoides são transferidos para a
microgota de PVP, onde são selecionados para a ICSI
Espermatozoides obtidos pela micro-TESE
e não utilizados para ICSI podem ser
criopreservados
Figura 6. Extração microcirúrgica de espermatozoides do testículo (micro-TESE). A figura ilustra as etapas do procedimento, incluindo a
técnica cirúrgica e o processamento laboratorial do parênquima testicular. A principal diferença entre micro-TESE e TESE convencional
(biópsia testicular) refere-se à utilização de magnificação e à técnica microcirúrgica na primeira. Por outro lado, a TESE convencional é
realizada por meio de pequena incisão na túnica albugínea, e o fragmento de parênquima testicular (geralmente medindo entre 5 mm
e 10 mm) que se exterioriza da incisão é extraído. Na TESE convencional, fragmentos únicos ou múltiplos podem ser extraídos. O processamento laboratorial das amostras obtidas via micro-TESE ou TESE convencional é semelhante; entretanto, este é menos trabalhoso na
primeira, uma vez que a biópsia é dirigida para os túbulos seminíferos dilatados e, assim, uma quantidade menor de parênquima testicular
é enviada ao laboratório em comparação à TESE convencional, o que facilita o processamento. Fonte: Androfert, 2011.
micro-TESE
11
12
A
B
C
D
E
F
Figura 7. Aspectos microcirúrgicos da extração de espermatozoides testiculares via micro-TESE. (A) Montagem da mesa auxiliar contendo
instrumental microcirúrgico, placa de petri com meio de cultura e fios de sutura; (B) o procedimento é realizado com o auxílio do microscópio cirúrgico com magnificação variando entre 16 × e 25 ×; (C-F) aspectos intraoperatórios da micro-TESE; (C) realiza-se uma ampla
incisão numa região na túnica albugínea do testículo para exposição do parênquima testicular; (D) a exposição do parênquima testicular
é obtida pela eversão da túnica albugínea; (E) visualização dos túbulos seminíferos através do microscópio cirúrgico (aumento de 25 ×) e
identificação de uma região contendo túbulos mais dilatados (no detalhe); (F) remoção do fragmento de parênquima testicular contendo
o túbulo seminífero dilatado, com o auxílio de pinça microcirúrgica (no destaque).
Sertoli (Figura 8). Nos casos em que a histologia testicular
revela os padrões de espermatogênese normal e hipospermatogênese, as chances de obtenção de espermatozoides
para a ICSI são de 100% e 65% a 90%, respectivamente14.
Por outro lado, espermatozoides são obtidos numa faixa
que varia entre 10% a 70% e 5% a 30%, respectivamente,
nos casos de parada de maturação germinativa e aplasia
germinativa (Sertoli-cell only), dependendo da técnica empregada para a extração13,14.
A
B
C
D
Figura 8. Aspecto microscópico dos túbulos seminíferos examinados a fresco. Fotomicrografias obtidas do microscópio óptico invertido
(Nikon Eclipse Diaphot 300) com contraste de fase (Hoffman), utilizando magnificação de 100 ×. (A-D) Túbulos seminíferos de diâmetros
variados, pré-processamento (intactos); (A) túbulo seminífero de diâmetro muito reduzido e translúcido, normalmente observado nos
casos de histologia testicular revelando Sertoli-cell only (aplasia germinativa). Não existem células germinativas na luz destes túbulos;
(B) túbulo seminífero de diâmetro reduzido, geralmente observado nos casos de histologia testicular revelando hipospermatogênese. O
diâmetro é maior em comparação ao anterior (A), e é possível encontrar células germinativas e espermatozoides nestes casos; (C) túbulo
de diâmetro normal, geralmente encontrado nos casos de parada de maturação germinativa. Nesses casos, também é possível encontrar
focos de espermatogênese completa e espermatozoides. Observa-se discreta transparência em comparação ao túbulo que contém espermatogênese normal (D).
Os túbulos seminíferos apresentam diâmetros variados
quando examinados ao microscópio antes do processamento (Figuras 5 e 8). O diâmetro dos túbulos seminíferos
(Figura 8) e o padrão histológico do testículo (Figura 9)
correlacionam-se com a chance de se obterem espermatozoides pelas técnicas de TESA, TESE e micro-TESE. Os túbulos de maior diâmetro possuem maior chance de conter
espermatogênese ativa, ao passo que os túbulos finos (diâmetro < 100 micra) geralmente possuem apenas células de
13
14
A
B
C
Figura 9. Fotomicrografias ilustrando a relação entre os resultados da histologia testicular e o padrão celular geralmente observado após
o processamento do parênquima testicular. Na parte superior, encontram-se ilustrados os três principais padrões histológicos encontrados
nos casos de azoospermia não obstrutiva: (A) Sertoly cell-only (SCO) ou aplasia germinativa; (B) parada de maturação germinativa (PM);
(C) hipospermatogênese (HIPO). Na parte inferior, observa-se o padrão celular geralmente encontrado em cada uma dessas condições.
Na SCO, geralmente se observam apenas células de Sertoli (a), além de linfócitos (b) e hemácias (c). Na PM, visualiza-se a presença de
grande número de células germinativas e, geralmente, a diferenciação celular estaciona antes da formação do espermatozoide: (d) espermatogônia/espermatócito primário, (e) espermatócito secundário, (f) espermátide redonda (observe o contorno suave e a vesícula
acrossômica proeminente na porção apical). É importante destacar que focos isolados de espermatogênese ativa com diferenciação até
espermatozoides podem ser encontrados na SCO e PM (não demonstrado). Na HIPO, observa-se a presença de células germinativas em
quantidade reduzida, porém todos os estágios estão presentes, até os espermatozoides: (a) células de Sertoli, (e) espermatócito secundário, (f) espermátide redonda e espermatozoide (no destaque). Fotomicrografias obtidas das suspensões celulares observadas ao microscópio invertido com contraste de fase e aumento de 400 × (parte inferior) e de lâminas de histologia coradas com hematoxilina e eosina
(aumento de 1000 ×).
Congelamento e descongelamento
de espermatozoides epididimários e
testiculares
Espermatozoides epididimários e testiculares podem ser
criopreservados utilizando-se protocolos aplicados rotineiramente às amostras ejaculadas15,16. Após o descongelamento, deve-se remover o crioprotetor pela técnica de
lavagem simples. Nos casos em que apenas espermatozoides imóveis são encontrados, devem-se utilizar técnicas
laboratoriais (descritas a seguir) que permitam selecionar
espermatozoides vivos para ICSI.
Métodos para a seleção de
espermatozoides vivos para ICSI
Alguns parâmetros seminais convencionais têm demonstrado pouco ou nenhum impacto nos resultados da ICSI,
exceto nos casos em que apenas espermatozoides imóveis
são utilizados17. Nos casos de descongelamento de amostras de PESA/TESA/TESE, não é incomum observar a
ausência completa de espermatozoides móveis após o processamento. Diferentes estratégias, descritas a seguir, podem ser aplicadas para diferenciar espermatozoides imóveis vivos dos mortos, permitindo que os primeiros sejam
utilizados durante a ICSI.
Teste hiposmótico (THO)18 – Teste do
inchaço da cauda do espermatozoide
Com o auxílio da micropipeta de injeção, aspiram-se os espermatozoides imóveis morfologicamente
normais da microgota de meio de cultura e transfere-se para o PVP.
Aspira-se cada espermatozoide individualmente,
do PVP para o interior da micropipeta, no sentido
cabeça-cauda.
Teste da flexibilidade da cauda do
espermatozoide20
Com o auxílio da pipeta de microinjeção, aspira-se
o espermatozoide imóvel morfologicamente normal da microgota de meio de cultura, transferindo-o para o PVP.
Toca-se a cauda do espermatozoide com a ponta da micropipeta, movimentando-a para cima e
para baixo. A cauda é considerada flexível quando se movimenta independentemente da cabeça
(essa flexibilidade é considerada um marcador de
vitalidade do espermatozoide20). Quando a cauda
permanecer rígida, realizando movimentos em
conjunto com a cabeça, o espermatozoide é considerado inviável.
Repete-se este procedimento até obter o número
necessário de espermatozoides para ICSI.
Utilização da solução de pentoxifilina
para estimular a motilidade
espermática21
Prepara-se uma placa de petri contendo 8 microgotas de 50 µL, sendo quatro delas com meio de cultura e outras quatro com a solução de pentoxifilina.
Colocam-se alíquotas de 4 µL da amostra de PESA/
TESA/TESE processada nas microgotas da solução de
pentoxifilina e incuba-se por 20 minutos.
Examina-se a amostra ao microscópio invertido para verificar a presença de espermatozoides
móveis. Geralmente, observa-se um discreto movimento de cauda, intercalado por períodos sem
movimento, nos espermatozoides que respondem
à pentoxifilina.
Aspira-se o espermatozoide móvel com o auxílio
da micropipeta de injeção, transferindo-o para uma
gota de meio de cultura. Repetir esta etapa de três a
quatro vezes para lavar a pentoxifilina, que deve ser
eliminada, pois estudos animais demonstraram que
ela pode ser embriotóxica22.
Transferem-se os espermatozoides selecionados
para a gota de PVP, onde se procede à seleção daqueles morfologicamente normais. Repete-se este
procedimento até se obter o número necessário de
espermatozoides para ICSI.
A pentoxifilina atua inibindo a enzima fosfodiesterase,
responsável pela degradação da adenosina monofosfato
cíclica (AMPc), que tem papel importante na regulação
da motilidade espermática. O efeito final é o aumento da
concentração intracelular de AMPc, que estimula o movimento do flagelo e, consequentemente, a motilidade espermática21.
Referências
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Move-se a pipeta para a microgota de solução hiposmótica (Figura 4) e exterioriza-se apenas parte da cauda do espermatozoide para o interior da
solução (o restante permanece na micropipeta).
Aguarda-se de 5 a 10 segundos e observa-se se
ocorre inchaço da extremidade distal da cauda.
Esse inchaço é relativamente pequeno, porém suficiente para o observador diferenciar o espermatozoide vivo (inchaço da cauda presente) daquele
cuja cauda não apresenta inchaço (espermatozoide
inviável).
Aspira-se o espermatozoide testado para o interior da pipeta. A seguir, ele é transferido para uma
microgota contendo meio de cultura. Essa etapa é
importante para permitir o reequilíbrio osmótico
(o inchaço da cauda tende a desaparecer em aproximadamente 10 a 20 segundos). Quando não for
observado inchaço, descartar o espermatozoide na
solução hiposmótica.
Transfere-se o espermatozoide vivo após equilíbrio
osmótico para a microgota de PVP.
O procedimento deve ser realizado com cada espermatozoide isoladamente, até que um número suficiente de
espermatozoides vivos tenha sido selecionado para ICSI.
O teste do inchaço da cauda apresenta ótimos resultados
para amostras frescas que contenham somente espermatozoides imóveis, porém tem eficácia reduzida nas amostras
criopreservadas19.
15
16
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