Dynabeads® HLA CLASS I und CLASS II

Tabelle 1: Empfohlene Puffer und Lösungen
Tris – ausgeglichene
Salzlösung (TBSS), pH 7,4*
Catalog nos. 21001D, 21002D
Vor dem Gebrauch 2%iges fötales Kälberserum
(FKS) oder 2%iges wärmeinaktiviertes
Humanserum (HS) zugeben.
Quenching-Lösung
Dynabeads™ HLA CLASS II
Tusche-Lösung verdünnt zu 2,5 % v/v in PBS oder
15%iges entsprechend verdünntes Rinderhämoglobin.
Stopplösung
8 g Na2EDTA auf 90 ml PBS zugeben, gut mischen, pH
mit NaOH auf 7,4 einstellen und dann das Volumen
auf 100 ml einstellen. pH mit NaOH auf 7,4 einstellen.
Die Quenching-Lösung und die Stopplösung können
gemischt und gleichzeitig dem Well zugegeben werden.
Dynabeads HLA CLASS I
™
Catalog nos. 21003, 21004D
Bei 2 ˚C bis 8 ˚C lagern
Rev. Date: 15 October 2015 (Rev. B.0)
Produktinhalt
Dynabeads™ HLA Class I und
Dynabeads™ HLA Class II erzielen in der
Regel eine hohe Reinheit (>99 %) und
Viabilität (>95 %) der isolierten Zellen.
Die Methode ist einfach, schnell und
spezifisch. Die an die Zelloberfläche
gebundenen Dynabeads™ stören nicht
die Bindung von Antikörpern zur HLATypisierung und Komplement an die
Zellen.
Hinweis: Die Viabilität von mit
Dynabeads™ HLA Class II isolierten
Zellen nach mikrozytotoxischer
Inkubation ist in der Regel geringer als
die von mit Dynabeads™ HLA Class I
isolierten Zellen.
Produktinhalt
Kat.-Nr.
Volumen
Dynabeads™
HLA CLASS I
21001D
2 ml
21002D
5 ml
Dynabeads™
HLA CLASS II
21003
2 ml
21004D
5 ml
Produktkapazität
21001D und 21003: 20 Separationen
21002D und 21004D: 50 Separationen
Dynabeads™ HLA Class I und
Dynabeads™ HLA Class II enthalten
jeweils 1,4 × 108 Beads/ml in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS) mit 0,1 % Rinderserumalbumin
(BSA) und 0,02 % Natriumazid.
Vorsicht: Natriumazid kann mit
Rohrleitungen aus Blei und Kupfer
reagieren und hochexplosive
Metallazide bilden.
Produktbeschreibung
Dynabeads™ HLA Class I ist zur
schnellen Isolierung von CD8+TLymphozyten direkt aus peripherem Blut
bestimmt. Die isolierten Zellen können
direkt in mikrozytotoxischen HLAKlasse-I (A, B, C)-Tests verwendet werden.
Dynabeads™ HLA Class II ist zur
schnellen Isolierung von HLA-Klasse-II+Zellen (vornehmlich B-Lymphozyten)
direkt aus peripherem Blut bestimmt.
Die isolierten Zellen können direkt in
mikrozytotoxischen HLA-Klasse-II (DR,
DQ)-Tests verwendet werden.
Das immunomagnetische
Zellseparationsverfahren mit den
Dynabeads™ HLA Class I oder den
Dynabeads™ HLA Class II ermöglicht die
schnelle und spezifische Isolierung von
Zielzellen direkt aus Vollblut in nur 15 min.
Die Zielzellen werden nach einer kurzen
Inkubation an die Beads gebunden und die
Bead-gebundenen Zellen werden mithilfe
eines Magneten isoliert und gewaschen.
Für den Einsatz in der In-vitro-Diagnostik.
Benötigte Materialien
Färbelösungen
• AO/EB – Stammlösung
15 mg Acridinorange.
50 mg Ethidiumbromid.
In 1 ml 95%igem Ethanol lösen. 49 ml PBS zugeben.
Gut mischen. In Aliquots zu 1 ml aufteilen und
einfrieren.
• AO/EB – Gebrauchslösung
1 ml der Stammlösung auftauen und 1:10 in PBS
(pH 7,4) verdünnen. AO/EB gut mischen. Die
Zubereitung kann in einer Braunglasflasche bei 2 °C
bis 8 °C bis zu einem Monat lang aufbewahrt werden.
*Hinweis: Zum Resuspendieren der Zellen können auch andere Puffer verwendet werden, diese sollten jedoch mit
Ca2+, Mg2+ und 2%igem FCS oder 2%igem HS angereichert werden. Nur analysenreine Reagenzien verwenden.
• Die empfohlenen Pipettiervolumen und Inkubationszeiten sorgfältig einhalten.
• Alle Puffer kühl halten.
Protokolle
Probe vorbereiten
• Magnet (DynaMag™-Portfolio).
Empfehlungen siehe unter
thermofisher.com/magnets.
• Mischer, der das Schwenken und
Drehen der Röhrchen ermöglicht.
• Röhrchen zur Blutentnahme mit
Gerinnungshemmer (z. B. AcidCitrate-Dextrose (ACD), Heparin).
• Glasware, 5-ml-Pasteur-Pipetten.
• Behälter für Blut und Entsorgung.
• Kühlvorrichtung.
• Empfohlene Puffer und Lösungen
siehe Tabelle 1.
Bei bestimmten Patienten ist die Zahl von HLA-Klasse-I- und -II-Zellen niedrig
(z. B. durch hämatologische Störungen, Leukämie, Urämie) oder das Serum
kann große Mengen an löslichen HLA-Klasse-I- und -II-Molekülen enthalten,
die die Zellisolierungsfähigkeit der Beads beeinträchtigen können. Um eine
zufriedenstellende Ausbeute von HLA-Klasse-I- und HLA-Klasse-II-Zellen für
die Typisierung zu erzielen, das folgende Verfahren vor der Zellseparation für
Proben anwenden, deren geringe Lymphozytenausbeute bei konventionellen
Zellisolierungsverfahren bekannt ist.
1. 10 ml Blut 5 min bei 800–1000 × g ohne Bremse zentrifugieren.
2. Plasma verwerfen und den Buffy Coat sowie die oberste Erythrozytenschicht in
ein sauberes 10-ml-Röhrchen überführen.
3. 5 ml kaltes PBS mit 0,6 % Natriumcitrat (pH 7,4) dem Buffy Coat zugeben und
sanft mischen.
4. Mit Schritt 3 unter „Zellseparation“ fortfahren.
Allgemeine Hinweise
Zellseparation
• Diese Produkte sind für die In-vitroDiagnostik vorgesehen.
• Aufgrund der bei diesem Verfahren
verwendeten Säugetierzellen sind
adäquate Labortechniken zu befolgen.
• Alle Proben sind als potenziell
infektiös zu behandeln.
• Bei allen Arbeiten sind Handschuhe
zu tragen und geeignete Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.
• Einen Mischer verwenden, der das
Schwenken und Drehen der Röhrchen
ermöglicht, um sicherzustellen, dass
sich Dynabeads™ nicht im Röhrchen
absetzt.
• Beim Pipettieren Luftblasen
(Aufschäumen) vermeiden.
Die Blutproben sollten so frisch wie möglich sein, vorzugsweise nicht älter als 4 Tage.
Blutproben von urämischen und leukämischen Patienten sollten innerhalb von
24 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden.
1. 5 ml Blut (ACD) in ein Standard-Blutsammelröhrchen aufnehmen und bei 2 °C bis
8 °C kühlen, um die Bindung von phagozytischen Zellen an die Beads zu verhindern.
2. Jeder Probe 5 ml kaltes PBS mit 0,6 % Natriumcitrat hinzugeben.
3. Dynabeads™ resuspendieren (z. B. >30 s im Vortexmischer oder 5 min schwenken
und drehen) und 100 μl Dynabeads™ zur Blutprobe hinzugeben.
4. 5 min bei 2 °C bis 8 °C durch sanftes Schwenken und Drehen mischen.
Hinweis: Keine Kopf-über-Kopf-Rotation verwenden, da dies die Zielzellen
beschädigen und den Hintergrund im mikrozytotoxischen Test erhöhen kann.
5. Die Zellen zum Isolieren 2 min in einem Magneten platzieren.
6. Überstand abgießen, ohne das Pellet mit den Bead-gebundenen Zellen zu stören.
7. Das Röhrchen aus dem Magneten entnehmen und die Bead-gebundenen Zellen in
5 ml kaltem PBS (pH 7,4) mit 0,6 % Natriumcitrat resuspendieren.
8. Röhrchen 2 min im Magneten platzieren, um die Bead-gebundenen Zellen zu
konzentrieren und den Überstand abgießen, während das Röhrchen sich weiterhin
im Magneten befindet.
9. Die Schritte 7 bis 8 vier Mal wiederholen; 5 ml kaltes PBS (pH 7,4) ohne
Natriumcitrat für jeden Waschvorgang verwenden.
10.Die Bead-gebundenen Zellen in 0,4 ml TBSS (pH 7,4) mit Ca2+, Mg2+ und 2 % FCS
oder 2 % wärmeinaktiviertem HS oder gleichwertig resuspendieren.
Mikrozytotoxische HLA-Prüfung
• Die Inkubationszeiten mit Serum und Komplementen sind lediglich Richtwerte
und sind gemäß dem in der Platte verwendeten Serum zu optimieren.
• Die HLA-Typisierung mit Dynabeads™ HLA Class I- oder Dynabeads™ HLA Class
II-isolierten Zellen ist sensitiver als konventionelle HLA-Typisierungstechniken.
Daher wird eine Verkürzung der Inkubationszeit mit HLA-Typisierungsserum
(30+ min) und Komplement (30+ min) empfohlen.
• Vor dem Gebrauch kann eine Titration von Typisierungs-Antiseren erforderlich sein.
• Aufgrund der höheren Sensitivität des Tests ist es wichtig, keine
Verdünnungsmittel zu verwenden, die zytotoxische Substanzen enthalten.
Gewebetypisierungsverfahren
1. Direkt vor dem Gebrauch Terasaki-Platten mit 1 μl optimal verdünnten HLAAntiseren pro Well auftauen.
2. Die isolierte Zellsuspension gut mischen. Die Dosierspritze füllen und jedem
Well 1 μl Zellsuspension hinzugeben.
Hinweis: Die isolierten Zellen in der Spritze weder durchspülen noch kräftig schütteln.
3. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren (im Dunklen).
4. 5 μl Komplement zu jedem Well hinzugeben (oder das vom Hersteller der
handelsüblichen Platten angegebene Volumen).
Hinweis: Möglicherweise muss das Komplement titriert werden, um zusätzliche
Reaktionen mit Dynabeads™-isolierten Zellen zu verhindern.
5. 30 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubieren (im Dunklen).
6. 1 μl AO/EB-Färbelösung hinzugeben.
7. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren (im Dunklen).
8. Innerhalb 1 Stunde in einem inversen Mikroskop ablesen.
Hinweis: Bei Bedarf können 5 μl Quenching-/EDTA-Stopplösung zugegeben werden.
Beschreibung der Materialien
Dynabeads™ HLA Class I und Dynabeads™ HLA Class II sind gleichförmige,
superparamagnetische Polystyrol-Beads (4,5 μm Durchmesser). Dynabeads™ HLA
Class I ist mit einem spezifischen monoklonalen Maus-Anti-Human-Primärantikörper
für das CD8-Membranantigen in menschlichen Zellen beschichtet. Dynabeads™ HLA
Class I ist mit einem spezifischen monoklonalen Maus-Anti-Human-Primärantikörper
für das HLA-Klasse-II-Membranantigen in menschlichen Zellen beschichtet.
Verbundene Produkte
Produkt
Kat.-Nr.
DynaMag™-5
12303D
DynaMag™-15
12301D
MPC -1
12001D
™
REF auf Etiketten ist das Symbol für die Katalognummer.
Gültige Version der Gebrauchsanweisung: Siehe mit diesem Kit gelieferte Version
der Gebrauchsanweisung. Wenn Sie diese Version der Gebrauchsanweisung in
landesspezifischer Sprache benötigen, können Sie sie kostenlos anfordern:
1. telefonisch unter 888-821-4443, App. 2.
Anwender in Europa können sich zwecks Unterstützung auch an +44 192-528-2700
wenden.
2. per E-Mail an [email protected].
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Technologies' General Terms and Conditions of Sale found on Life Technologies' website at
www.lifetechnologies.com/termsandconditions. If you have any questions, please contact Life
Technologies at www.lifetechnologies.com/support.
Färbung von isolierten Zellen in HLA-Mikrozytotoxizitäts-Tests
Limited Use Label License: No. 451: No right to resell
Für die Färbung der mithilfe von Dynabeads™ HLA Class I oder Dynabeads™
HLA Class II isolierten Zellen in Mikrozytotoxizitäts-Tests wird die Färbung
mit Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. Acridinorange (AO) und Ethidiumbromid
(EB)) empfohlen. Die Beurteilung von vitalen (grün) und toten (rot) Zellen kann
mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops (Anregungsfilter 450/490 nm) erfolgen. Die
zytotoxischen Reaktionen werden nach Zugabe der Färbelösungen fortgesetzt. Diese
Reaktionen können durch Zugabe von in PBS gelöstem 8%igem EDTA zum Well
gestoppt werden. Das EDTA erhält die Ablesbarkeit der Platte über Nacht aufrecht.
Hinweis: Bei Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen müssen die Platten im
Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert werden (20 °C bis 22 °C). Der Farbstoff sollte
keiner direkten Lichteinstrahlung ausgesetzt und im Dunklen aufbewahrt werden.
Notice to Purchaser: Resale of this product is expressly prohibited. No right to resell this product
or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. For information
on obtaining additional rights, please contact [email protected] or Out Licensing, Life
Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008.
Manufactured by Thermo Fisher Scientific Baltics UAB, V.A.Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius,
Lithuania. Thermo Fisher Scientific Baltics complies with the Quality System Standards ISO 9001
and ISO 13485.
Färbungsverfahren A:
1. Nach der Inkubation mit den Seren und dem Komplement in jeden Well 1 μl AO/
EB-Gebrauchslösung geben und 15 min inkubieren.
2. Die Platte innerhalb von einer Stunde nach Zugabe der Färbelösung ablesen,
wenn kein EDTA zum Stoppen der Färbereaktion verwendet wird.
Färbungsverfahren B:
1. Dynabeads™-isolierte Zellen werden in die Wells der Platte gegeben.
2. Die Färbelösung zusammen mit dem Komplement in die Wells geben: 2 ml
Kaninchen-Komplement und 50 μl AO/EB-Stammlösung zugeben, dann die
Platte 30 min inkubieren.
Hinweis: Die vom Plattenhersteller angegebene Komplementmenge beachten.
3. Die Platte innerhalb von einer Stunde ablesen, wenn kein EDTA zum Stoppen der
Färbereaktion verwendet wird.
Hinweis: Bei Verwendung von Terasaki-Platten kann es schwierig sein, die negativen
(grünen) Zellen vom Hintergrund zu unterscheiden. Die Hintergrundfärbung
kann durch Zugabe von 5 μl entsprechend verdünnter Tusche oder entsprechend
verdünntem Hämoglobin zu jedem Well abgedeckt werden.
DISCLAIMER: TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, LIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) WILL NOT BE LIABLE
FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR
ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING YOUR USE OF IT.
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