peqGOLD Plant RNA Kit

Transcrição

Arbeitsanleitung – Instruction Manual
(Safety-Line)
V0815
PEQLAB_v0815_D
1
Art.-Nr.: 12-6627
INHALT
EINLEITUNG
3
FUNKTIONSPRINZIP
3
KITBESTANDTEILE
4
LAGERUNG
4
WICHTIGE HINWEISE
5
GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
6
PEQGOLD PLANT RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE
8
A.1 Homogenisierung der Probe mittels eines kommerziell verfügbaren Homogenisators
(z.B. Precellys® 24) und Lyse
8
A.2 Homogenisierung der Probe mittels Mörser und Lyse
8
B.
9
Isolierung der RNA nach Homogenisierung der Probe
DNA-KONTAMINATIONEN
11
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA
11
RNA-QUALITÄT
11
BESTELLINFORMATIONEN
12
TROUBLESHOOTING TIPS
13
CONTENT
INTRODUCTION
14
THEORY
14
KIT COMPONENTS
15
STORAGE AND STABILITY
15
BEFORE STARTING
16
DANGEROUS COMPONENTS
17
PEQGOLD PLANT RNA ISOLATION PROTOCOL
19
A.1 Homogenization of the sample by a commercially available homogenizer (e.g.
Precellys® 24) and lysis
19
A.2 Homogenization of the sample by a mortar and lysis
19
B.
20
RNA isolation after homogenization
DNA CONTAMINATION
22
QUANTITATION AND STORAGE OF RNA
22
RNA QUALITY
22
ORDERING INFORMATION
23
24
APPENDIX
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PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr.: 12-6627
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EINLEITUNG
Der peqGOLD Plant RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um Gesamtzell-RNA
aus bis zu 100 mg Pflanzenmaterial unterschiedlichster Herkunft zu isolieren. In weniger als
60 Minuten gestattet er die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei jeweils bis
zu 100 µg RNA isoliert werden können. Er ist daneben aber auch effizient genug, um
erfolgreiche Isolierungen aus nur 10 mg oder 100 Zellen zu erlauben. Extraktionen mit
organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt
werden, wie Fällungen mit LiCl oder zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen.
Kontaminationen und Enzyminhibitoren werden vollständig entfernt.
RNA, die mit dem peqGOLD Plant RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von
Folgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A)+-RNA-Extraktionen, Northern Blots, Nuclease
Protection Assays und in vitro-Translationen weiterverwendet werden.
FUNKTIONSPRINZIP
Der peqGOLD Plant RNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften
von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von
Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt
die Entfernung sekundärer Metabolite, wie Polysaccharide und Phenole, und die Reinigung
von bis zu 100 µg nicht-degradierter RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen aufwärts.
Die aufzuarbeitenden Zellen und Gewebe werden zunächst homogenisiert und unter
denaturierenden Bedingungen lysiert, wobei alle vorhandenen RNasen und sonstigen Enzyme
effizient inhibiert werden. Das Lysat wird auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der
die RNA-Moleküle an die darin enthaltene Silikamembran binden. Zellulärer Debris und
andere Kontaminationen können durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und effizient
entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in
RNase-free Water eluiert.
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Art.-Nr.: 12-6627
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KITBESTANDTEILE
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
12-6627-00
12-6627-01
12-6627-02
PerfectBind RNA Columns
5
50
200
DNA Removing Columns
5
50
200
2 ml Collection Tubes
20
200
4 x 200
RNA Lysis Buffer P
2 x 1.5 ml
25 ml
100 ml
RNA Lysis Buffer T
2 x 1.5 ml
25 ml
100 ml
RNA Wash Buffer I
5 ml
50 ml
200 ml
RNA Wash Buffer II (Konz.)
2 ml
20 ml
3 x 20 ml
RNase-free Water
1 ml
5 ml
20 ml
1
1
1
Bestellnummer
Bestandteile
Arbeitsanleitung
LAGERUNG
Die Aufbewahrung des peqGOLD Plant RNA Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Bei
einer Umgebungstemperatur von 22 - 25 °C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens
12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im
RNA Lysis Buffer T und RNA Lysis Buffer P bilden, können durch Erwärmen auf 37 °C wieder
gelöst werden.
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Art.-Nr.: 12-6627
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WICHTIGE HINWEISE
Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch
und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit, um
durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu vermeiden.
! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen
Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer sollten
ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.
! RNA-Präparationen besonders sorgfältig, aber auch so zügig wie möglich durchführen
! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T und RNA Lysis Buffer P
zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der
Verwendung der Puffer durch Erwärmen auf 37 °C rückgängig gemacht werden.
! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung
mit absolutem Ethanol verdünnt werden:
Kit 12-6627-00
2 ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-6627-01
20 ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-6627-02
3 x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.
!
Verdünnter RNA Wash Buffer II sollte beim Raumtemperatur gelagert werden.
!
Alle Zentrifugationsschritte müssen bei 22 - 25 °C ausgeführt werden.
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Art.-Nr.: 12-6627
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GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
Bestandteile
Signalwort /
Symbole
Gefährliche
Inhaltsstoffe
H- und P-Sätze
-
-
-
-
-
-
-
-
-
RNA Lysis Buffer P
WARNING
guanidinium chloride
25-50%, CAS: 50-01-1
H302, H315, H319,
P101, P102, P103,
P280, P264,
P305+P351+P338,
P332+P313, P403,
P501
RNA Lysis Buffer T
DANGER
Guanidinthiocyanat 40
- 50 %, CAS: 593-840
H302+H312+H332,
H314, H412, P101,
P102, P103, P260,
P280,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
RNA Wash Buffer I
DANGER
Ethanol 25-50%,
guanidinium
thiocyanate 10-<25%,
CAS: 64-17-5, 59384-0
H225, H314, P101,
P102, P103, P210,
P241,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
-
-
-
RNase-free Water
-
-
-
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Art.-Nr.: 12-6627
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H- und P-Sätze
H225
H302
H314
H315
H319
H412
P101
P102
P103
P210
P241
P260
P264
P280
P303+P361+P353
P305+P351+P338
P332+P313
P403
P405
P501
PEQLAB_v0815_D
Erläuterungen
Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.
Gesundheitsschädlich bei Verschlucken.
Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere
Augenschäden.
Verursacht Hautreizungen.
Verursacht schwere Augenreizung.
Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.
Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder
Kennzeichnungsetikett bereithalten.
Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen.
Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen.
Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen
sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen.
Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/
Beleuchtungsanlagen/... verwenden.
Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen.
Nach Handhabung … gründlich waschen.
Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz
tragen.
BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle
kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit
Wasser abwaschen/duschen.
BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam
mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach
Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen.
Bei Hautreizung: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe
hinzuziehen.
An einem gut belüfteten Ort aufbewahren.
Unter Verschluss aufbewahren.
Inhalt/Behälter … zuführen.
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PEQGOLD PLANT RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE
A.1 Homogenisierung der Probe mittels eines kommerziell verfügbaren
Homogenisators (z.B. Precellys® 24) und Lyse
Bis zu 100 mg frisches oder gefrorenes Pflanzenmaterial in ein geeignetes Reaktionsgefäß
überführen.
450 µl RNA Lysis Buffer T oder RNA Lysis Buffer P zugeben.
Beachte: Die Ausbeute an RNA hängt davon ab, welcher Lysepuffer eingesetzt wird. Die RNA
Isolierung aus den meisten Pflanzenproben ist unter Verwendung von RNA Lysis Buffer T möglich. Bei
einigen Pflanzenproben ist aber die Extraktion der RNA nur mittels RNA Lysis Buffer P erfolgreich. Der
Extraktionsprozess sollte deshalb immer zuerst mittels RNA Lysis Buffer T durchgeführt werden. Bei
schlechten Ausbeuten sollte dann alternativ RNA Lysis Buffer P eingesetzt werden.
Homogenisierung der Probe (Homogenisierung entsprechend der Herstellerangaben des
jeweiligen Gerätes durchführen.)
Die homogenisierte Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen.
Mit Protokoll B (S. 9) fortfahren.
A.2 Homogenisierung der Probe mittels Mörser und Lyse
Zermörsern der Probe mittels flüssigem Stickstoff (alternativ auch mittels Seesand).
Bis zu 100 mg Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen.
Beachte: Bei Verwendung von flüssigem Stickstoff muss ein Auftauen der Probe nach dem Mörsern
verhindert werden. Beim Zermahlen der Probe mittels Seesand muss der Probe der Lysepuffer
zugegeben werden. Nach dem Zermahlen wird die Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und
die noch benötigte Menge an Lysepuffer zugegeben.
450 µl RNA Lysis Buffer T oder RNA Lysis Buffer P zugeben.
Beachte: Die Ausbeute an RNA hängt davon ab, welcher Lysepuffer eingesetzt wird. Die RNA
Isolierung aus den meisten Pflanzenproben ist unter Verwendung von RNA Lysis Buffer T möglich. Bei
einigen Pflanzenproben ist aber die Extraktion der RNA nur mittels RNA Lysis Buffer P erfolgreich. Der
Extraktionsprozess sollte deshalb immer mittels RNA Lysis Buffer T durchgeführt werden. Bei schlechten
Ausbeuten sollte dann alternativ RNA Lysis Buffer P eingesetzt werden.
Mit Protokoll B (S. 9) fortfahren.
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B.
Isolierung der RNA nach Homogenisierung der Probe
1. Laden und Binden
Das Reaktionsgefäß für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln
inkubieren. Sollte ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, dann während der
Inkubationszeit 3 bis 4 mal für 10 Sekunden vortexen.
DNA Removing Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und die Probe auf die DNA
Removing Column überführen. 2 Minuten bei 10.000 x g* zentrifugieren. DNA Removing
Column und Collection Tube verwerfen, Filtrat weiterverwenden.
Gleiches Volumen an 70 %igem Ethanol zum Filtrat geben und sorgfältig mittels einer Pipette
mischen. PerfectBind RNA Column in ein neues Collection Tube stecken.
Ansatz auf die PerfectBind RNA Column überführen und 1 Minute bei 10.000 x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen.
2. Waschen I
Neues Collection Tube nutzen, 500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Column
zugeben und für 1 Minute bei 10.000 x g* durch die Säule zentrifugieren. Säulendurchfluss
verwerfen und Collection Tube weiterverwenden.
3. DNase I Verdau (optional)
Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird,
ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich.
Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA
durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase IVerdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (Bestellnr.: 12-1091-01/02).
a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten:
DNase I Digestion Buffer
73.5 µl
RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl
Gesamtvolumen
75 µl
Hinweis:
1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I-Lösung
niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix
immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen.
2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase
Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet!
* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25
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b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column
pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des
Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet.
c. Säule bei Raumtemperatur (25 - 30 °C) für 15 Minuten inkubieren.
d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben.
Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei 10.000 x g* für
5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt
(Schritt 4) weiterverwenden.
4. Waschen II
650 µl des komplettierten RNA Wash Buffer II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 %
Ethanol) auf die Säule pipettieren. Zentrifugation für 1 Minute bei 10.000 x g*.
Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. Waschschritt wiederholen.
5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)
Zentrifugensäule in das geleerte Collection Tube stecken und durch zweiminütiges
Zentrifugieren bei 10.000 x g* vollständig trocknen.
6. Elution
PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA
mit 30 bis 80 µl RNase-free Water eluieren. Wasser dazu direkt auf die Matrix pipettieren,
1 Minute inkubieren und 1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren.
Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite
Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert
wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der
gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf 70 °C und
eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der Säule können die Erträge noch
weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die RNA auch direkt in einem größeren
Volumen RNase-free Water eluiert werden.
* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25
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DNA-KONTAMINATIONEN
Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA
vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT-PCRs muss
deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende
Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der Säule, der in das bestehende Protokoll
zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 3: DNase I Verdau). Alternativ
kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt
werden.
Der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von DNA-Kontaminationen kann mit Hilfe
von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse
auf mögliche Kontaminationen zulässt.
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA
Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption
eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen
werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich
demnach wie folgt:
RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption260 x 40 x Verdünnungsfaktor
Das A260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqGOLD Plant RNA
Kit erzielbare A260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb RNA einer Reinheit von
90 % bis 100 %.
RNA, die mit dem peqGOLD Plant RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in RNase-free Water für
mindestens ein Jahr bei –70 °C aufbewahrt werden.
RNA-QUALITÄT
Vor
ihrer
Verwendung
in
Folgeexperimenten
sollte
durch
denaturierende
Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung zunächst noch die Qualität der
extrahierten RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden
erkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rRNAs repräsentieren. Sollten diese
Banden in Richtung niedermolekularer RNA-Größen schmieren, ist es während der
Präparation, Lagerung oder Weiterbearbeitung zu einer Degradation gekommen, die sich je
nach Folgeexperiment mehr oder weniger negativ auswirken kann.
Obwohl RNA-Moleküle < 200 Basen nur sehr ineffizient an die PerfectBind-Silikamatrix des peqGOLD
Plant RNA Kits binden, kann auf dem Gel noch eine dritte distinkte Bande aus tRNAs erscheinen. Diese
Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterial besonders hoch war.
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Art.-Nr.: 12-6627
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BESTELLINFORMATIONEN
für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut:
(Safety-Line)
12-6627-00
12-6627-01
12-6627-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
peqGOLD Bacterial RNA Kit
(Safety-Line)
12-6850-00
12-6850-01
12-6850-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
peqGOLD Viral RNA Kit
(Safety-Line)
12-6874-00
12-6874-01
12-6874-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
peqGOLD Total RNA Kit
(Safety-Line)
12-6834-00
12-6834-01
12-6834-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
(Classic-Line)
12-6634-00
12-6634-01
12-6634-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
peqGOLD Blood RNA Kit
(Safety-Line)
12-6814-00
12-6814-01
12-6814-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
(Classic-Line)
12-6614-00
12-6614-01
12-6614-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit
(Safety-Line)
12-6831-00
12-6831-01
12-6831-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr.: 12-6627
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Problem
Ursache
Abhilfe
Wenig oder keine
RNA im Eluat
RNA bleibt auf der Säule
Elution wiederholen.
RNase-free Water vor dem Eluieren auf 70 °C
erwärmen.
Säule vor dem Eluieren für 10 min mit RNasefree Water inkubieren.
Säule durch längere oder höhertourige
Zentrifugation besser trocknen.
Säule ist überladen
Menge des Ausgangsmaterials reduzieren.
Säule verstopft
Unvollständiger Aufschluss Probe sorgfältiger lysieren.
oder unvollständige Lyse
Zentrifugationszeit verlängern.
des Pflanzenmaterials
Präzipitierte RNA löst
sich nicht
Hoher Nukleinsäure- und
Polysaccharidgehalt
Nicht mehr als 50 mg bis 100 mg einsetzen.
RNA-Degradation
Ausgangsmaterial
Proben sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren
und gegebenenfalls bei –70 °C lagern.
Präparation zügiger und exakter nach Vorschrift
durchführen.
RNase-Kontamination
Nur RNase-freies Material verwenden und
Handschuhe tragen.
Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen.
DNA-Kontamination
Physikalische Ähnlichkeit
von DNA und RNA
Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei
37 °C inkubieren.)
Probleme bei
Folgereaktionen
Salzübertragung während Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II mit
der Elution
4 Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde.
Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II bei
Raumtemperatur gelagert und verwendet wurde.
Waschschritt mit RNA Wash Buffer II
wiederholen.
Niedrige
Absorptionsraten
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RNA in saurem Puffer
oder Wasser verdünnt
RNase-free Water ist sauer und kann die A260Werte dramatisch herabsetzen. RNA zum
Vermessen in TE-Puffer verdünnen.
Art.-Nr.: 12-6627
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INTRODUCTION
The peqGOLD Plant RNA Kit provides a convenient and rapid method for the isolation of
total RNA from a variety of plant samples up to 100 mg. The system is efficient enough to
allow isolation of total RNA from as little as 10 mg of tissue or 100 cells. peqGOLD Plant
RNA Kits are ideal for processing multiple plant samples in less than 60 min. Each
PerfectBind RNA Column has a binding capacity of about 100 µg RNA. The need for
organic extractions is eliminated, making total RNA isolation fast, safe, and reliable.
RNA purified using the peqGOLD Plant RNA Kit is ready for applications such as RT-PCR,
Northern blotting, poly(A)+-RNA (mRNA) purification, nuclease protection assays, and in
vitro translation.
THEORY
The peqGOLD Plant RNA Kits use the reversible binding properties of the PerfectBind
matrix, a new silica-based material. This is combined with the speed of mini-column spin
technology. A specifically formulated high salt buffer system allows more than 100 µg of
RNA molecules greater than 200 bases to bind to the matrix.
Cells or tissues are first lysed under denaturing conditions that practically inactivate
RNases. Samples are then applied to the PerfectBind RNA Columns to which total RNA
binds, while cellular debris and other contaminants are effectively washed out. High
quality RNA is finally eluted in RNase-free Water.
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14
Order No.: 12-6627
KIT COMPONENTS
5 Purifications
50 Purifications
200 Purifications
12-6627-00
12-6627-01
12-6627-02
5
50
200
5
50
200
20
200
4 x 200
RNA Lysis Buffer P
2 x 1.5 ml
25 ml
100 ml
RNA Lysis Buffer T
2 x 1.5 ml
25 ml
100 ml
RNA Wash Buffer I
5 ml
50 ml
200 ml
RNA Wash Buffer II (Conc.)
2 ml
20 ml
3 x 20 ml
RNase-free Water
1 ml
5 ml
20 ml
Instruction manual
1
1
1
Product Number
Components
STORAGE AND STABILITY
peqGOLD Plant RNA Kit components should be stored at room temperature (22 °C –
25 °C). All components are stable for at least 12 months from the date of purchase when
stored at 22 – 25 °C. During shipment crystals may form in the RNA Lysis Buffer T and
RNA Lysis Buffer P. Warm up to 37 °C to dissolve.
PEQLAB_v0815_E
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Order No.: 12-6627
BEFORE STARTING
Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components
and have the necessary materials ready before starting.
!
Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNase
contamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when using
the supplied reagents.
!
Work carefully but as quickly as possible during the procedure.
!
Under cool ambient conditions, crystals may form in the RNA Lysis Buffer T and RNA
Lysis Buffer P. This is normal and the bottle should be warmed (37 °C) to dissolve the
salt before use.
!
RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as
follows:
Kit 12-6627-00
Add 8 ml 100 % EtOH to 2 ml Wash Buffer II
Kit 12-6627-01
Add 80 ml 100 % EtOH to 20 ml Wash Buffer II
Kit 12-6627-02
Add 3 x 80 ml 100 % EtOH to 3 x 20 ml Wash Buffer II
!
Store diluted RNA Wash Buffer II at room temperature.
!
All steps must be carried out at room temperature (22 – 25 °C).
PEQLAB_v0815_E
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Order No.: 12-6627
DANGEROUS COMPONENTS
Components
Signal word /
symbols
Dangerous
components
H and P statements
-
-
-
-
-
-
-
-
-
RNA Lysis Buffer P
WARNING
guanidinium chloride
25-50%, CAS: 50-01-1
RNA Lysis Buffer T
DANGER
Guanidinthiocyanat 40
- 50 %, CAS: 593-840
RNA Wash Buffer I
DANGER
Ethanol 25-50%,
guanidinium
thiocyanate 10-<25%,
CAS: 64-17-5, 59384-0
H302, H315, H319,
P101, P102, P103,
P280, P264,
P305+P351+P338,
P332+P313, P403,
P501
H302+H312+H332,
H314, H412, P101,
P102, P103, P260,
P280,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
H225, H314, P101,
P102, P103, P210,
P241,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
-
-
-
RNase-free Water
-
-
-
PEQLAB_v0815_E
17
Order No.: 12-6627
H and P statements
H225
H302
H314
H315
H319
H412
P101
Descriptions
Highly flammable liquid and vapour.
Harmful if swallowed.
Causes severe skin burns and eye damage.
Causes skin irritation.
Causes serious eye irritation.
Harmful to aquatic life with long lasting effects.
If medical advice is needed, have product container or label at
hand.
P102
P103
P210
Keep out of reach of children.
Read label before use.
Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other
ignition sources. No smoking.
P241
Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/…/
equipment.
P260
P264
P280
Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray.
Wash … thoroughly after handling.
Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face
protection.
IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated
clothing. Rinse skin with water/shower.
P303+P361+P353
P305+P351+P338
IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove
contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.
P332+P313
P403
P405
P501
If skin irritation occurs: Get medical advice/attention.
Store in a well-ventilated place.
Store locked up.
Dispose of contents/container to …
PEQLAB_v0815_E
18
Order No.: 12-6627
PEQGOLD PLANT RNA ISOLATION PROTOCOL
A.1 Homogenization of the sample by a commercially available homogenizer
(e.g. Precellys® 24) and lysis
Apply up to 100 mg fresh or frozen plant tissue to a suitable reaction tube.
Add 450 µl RNA Lysis Buffer T or RNA Lysis Buffer P.
Note: The yield of RNA depends on the lysis buffer used. RNA isolation of most plant samples is
possible using RNA Lysis Buffer T. Some plant samples however require RNA Lysis Buffer P for
successful RNA extraction. Therefore the extraction process should always be accomplished first
by using RNA Lysis Buffer T. With bad yields alternatively RNA Lysis Buffer P should be used.
Homogenization
instructions.)
of
the
sample
(Homogenize
corresponding
to
manufacturers
Apply sample to a 1.5 ml microfuge tube.
Proceed with protocol B (page 20).
A.2 Homogenization of the sample by a mortar and lysis
Pestle the sample under liquid nitrogen (alternatively sea sand).
Apply up to 100 mg sample to a 1.5 ml microfuge tube.
Add 450 µl RNA Lysis Buffer T or RNA Lysis Buffer P.
Note: The yield of RNA depends on the lysis buffer used. RNA isolation of most plant samples is
possible using RNA Lysis Buffer T. Some plant samples however require RNA Lysis Buffer P for
successful RNA extraction. Therefore the extraction process should always be accomplished first
by using RNA Lysis Buffer T. With bad yields alternatively RNA Lysis Buffer P should be used.
Proceed with protocol B (page 20).
PEQLAB_v0815_E
19
Order No.: 12-6627
B.
RNA isolation after homogenization
1. Load and bind
Incubate the reaction tube for 30 minutes at room temperature with continuous shaking. If
continuous shaking is not possible, vortex 3 to 4 times for 10 seconds during incubation
time.
Place a DNA Removing Column into a 2.0 ml Collection Tube and transfer the sample to
the DNA Removing Column. Centrifuge for 2 minutes at 10.000 x g*. Discard the DNA
Removing Column and Collection Tube, re-use filtrate.
Add the same volume of ethanol (70 %) to the filtrate and mix thoroughly through a
pipette. Place a PerfectBind RNA Column to a new Collection Tube.
Apply the sample to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 1 minute at
10.000 x g*. Discard the flow-through liquid and the Collection Tube.
2. Wash I
Take a new Collection Tube, add 500 µl RNA Wash Buffer I to the column and centrifuge
the PerfectBind RNA Column/Collection Tube for 1 minute at 10.000 x g*. Discard the
flow-throw liquid and the re-use Collection Tube.
3. DNase I Digestion (optional)
Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of the
DNA without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most
downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require
further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order
No. 12-1091).
a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix:
DNase I Digestion Buffer
RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl)
Total volume
73.5 µl
1.5 µl
75 µl
Note:
1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture!
Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before
RNA isolation.
2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers
are not compatible with on-membrane DNase digestion!
* Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 25
PEQLAB_v0815_E
20
Order No.: 12-6627
b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind
RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly
onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to
the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA column.
c. Incubate at room temperature (25 – 30 °C) for 15 minutes.
d. Place a PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl RNA
Wash Buffer I. Place the column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at 10.000 x g*
for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next step.
Continue with step 4.
4. Wash II
Add 650 µl RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of abs. ethanol) to the column
and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly for 1 min at
10.000 x g*. Discard the flow-through liquid and re-use the Collection Tube. Repeat this
wash step.
5. Dry (Important, do not skip this step!)
Place the PerfectBind RNA Column in the Collection Tube used in step 4 and centrifuge for
2 minutes at 10.000 x g* to completely dry the column matrix.
6. Elution
Place the PerfectBind RNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 30 to
80 µl RNase-free Water directly to the binding matrix in the PerfectBind RNA Column,
incubate for 1 minute and centrifuge for 1 minute at 6.000 x g* to elute RNA.
A second elution may be necessary if the expected yield of RNA is > 50 µg. Alternatively, RNA
may be eluted with a higher volume of water. While additional elution increase total RNA yield,
the concentration will be lowered since more than 80 % of RNA is recovered with the first elution.
Pre-heating RNase-free Water to 70 °C before adding to the spin column and incubating the spin
column for 5 minutes at room temperature before centrifugation may increase yield. Instead of
eluting twice, the RNA can directly be eluted in a bigger volume of RNase-free Water.
* Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 25
PEQLAB_v0815_E
21
Order No.: 12-6627
DNA CONTAMINATION
No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work
(such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with
RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion (12-1091-01/02) is a simple and
fast method and can be integrated into the standard protocol between the washing steps
(see page 14).
Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination. Using RNA as a template in a control PCR reaction will also allow the
detection of DNA contamination.
QUANTITATION AND STORAGE OF RNA
Determine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at
260 nm and then at 280 nm. One A260-unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA
concentration is calculated as follows:
RNA conc. (µg /ml) = Absorption260 × 40 × Dilution Factor
The ratio of A260/280 is an indication of nucleic acid purity. Values higher than 1.8
indicates > 90 % nucleic acid.
Store RNA samples at –70 °C in RNase-free Water. Under such conditions RNA
prepared with the peqGOLD system is stable for at least one year.
RNA QUALITY
It is highly recommended to determine the RNA quality prior to further applications.
Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assess
the quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These are the 28 S and
18 S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA,
then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling, or
storage.
Although RNA molecules less than 200 bases in length do not efficiently bind the PerfectBind
matrix, a third RNA band, the tRNA band, may be visible when a large number of cells are used.
PEQLAB_v0815_E
22
Order No.: 12-6627
ORDERING INFORMATION
For RNA isolation from cells, tissues and blood:
(Safety-Line)
12-6627-00
12-6627-01
12-6627-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
peqGOLD Bacterial RNA Kit
(Safety-Line)
12-6850-00
12-6850-01
12-6850-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
peqGOLD Viral RNA Kit
(Safety-Line)
12-6874-00
12-6874-01
12-6874-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
(Safety-Line)
12-6834-00
12-6834-01
12-6834-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
(Classic-Line)
12-6634-00
12-6634-01
12-6634-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
(Safety-Line)
12-6814-00
12-6814-01
12-6814-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
(Classic-Line)
12-6614-00
12-6614-01
12-6614-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
peqGOLD MicroSpin Total RNA Kit
(Safety-Line)
12-6831-00
12-6831-01
12-6831-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
PEQLAB_v0815_E
23
Order No.: 12-6627
Problem
Likely cause
Suggestion
Repeat elution.
Little or no RNA eluted RNA remains on the
column
Clogged column
Pre-heat RNase-free Water to 70 °C prior to
elution.
Incubate column for 10 min with RNase-free
Water prior to centrifugation.
Increase centrifugation time or speed to
completely dry the column.
Column is overloaded
Reduce quantity of starting material.
Incomplete disruption or
lysis of plant tissue
Completely disrupt sample in liquid nitrogen.
Increase centrifugation time.
Reduce amount of starting material.
Precipitated RNA will
not dissolve
High nucleic acid and
polysaccharide content
Reduce amount of starting material. Do not
apply more than 50 - 100 mg.
Degraded RNA
Source
Freeze starting material quickly in liquid
nitrogen and store at -70 °C without thawing.
Follow protocol closely, and work quickly.
Ensure not to introduce RNase during the
procedure.
RNase contamination
Check buffers for RNase contamination.
Problem in
downstream
applications
Ensure RNA Wash Buffer II has been diluted
with 100 % ethanol as indicated on bottle.
Diluted RNA Wash Buffer II must be stored at
room temperature.
Salt carry-over during
elution
Repeat wash with RNA Wash Buffer II.
DNA contamination
Co-purification of DNA
Low Abs ratios
RNA diluted in acidic
buffer or water
PEQLAB_v0815_E
24
Digest with RNase-free DNase and
incubation at 37 °C for 5 min.
RNase-free Water is acidic and can
dramatically lower Abs260 values. Use TE
buffer (pH 8) to dilute RNA prior to spec
analysis.
Order No.: 12-6627
APPENDIX
Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser.
Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter.
PEQLAB_v0815_E
Order No.: 12-6627
25

peqGOLD Plant RNA Kit

Transcrição

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