Laseroptische Methoden basierend auf der

in: Poll R, Füssel J (Hg.): 1. Dresdner Medizintechnik-Symposium. ISBN
3-938863-85-4, TUDpress 2006 (1), 162-168.
Laseroptische Methoden basierend auf der ZweiphotonenMikroskopie zur Detektion von Chondrozyten auf artifiziellen
Kollagen-I/III-Trägern
Ronald Schade1, Jörg Martini2, Katja Tönsing2, Dario Anselmetti2 und Klaus Liefeith1
1
Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik (iba) e.V., 37308 Heilbad Heiligenstadt,
Rosenhof
2
Universität Bielefeld, Fakultät für Physik, Lehrstuhl für Experimentelle Biophysik & Angewandte
Nanowissenschaften, 33615 Bielefeld, Universitätsstraße 25
Zusammenfassung
Für die Therapie von Knorpelschäden werden in zunehmendem Maße Produkte des Tissue Engineerings
eingesetzt. Das Verfahren der Matrix-gekoppelten Autologen Chondrozyten Implantation (MACI®) stützt
sich dabei auf die präimplantative Kultivierung von Chondrozyten auf Kollagen I/III-Trägern mit
anschließender Implantation der zellbewachsenen Kollagenträger in den Knorpeldefekt. Die nichtinvasive
Kontrolle des präimplantativen Kultivierungsprozesses hinsichtlich Zellzahl, Zellwachstum und
Zellverteilung ist bisher jedoch nur eingeschränkt möglich. Es werden Möglichkeiten vorgestellt,
Chondrozyten auf Kollagen I/III-Trägern mittels Zweiphotonen-Laserscanning-Mikroskopie (2PLSM)
selektiv zu visualisieren. Durch die laserrasternde Mikroskopie können dreidimensionale
Strukturinformationen in nativen, ungefärbten MACI®-Konstrukten gewonnen werden. Durch die
Anwendung von Femtosekunden-Laserpulsen im NIR-Bereich zur Zweiphotonenanregung und Second
Harmonic Generation (SHG) ist die mikroskopische Darstellung von stark streuenden zellbewachsenen
Kollagen-Membranen bis in eine Tiefe von 300 µm möglich. Die selektive Darstellung von Chondrozyten
und Kollagen I/III-Zellträgermaterialien kann anhand a) der nativen Fluoreszenz-Emissionsspektren und b)
der SHG-Signale der Kollagen-Träger erfolgen. Die Ergebnisse stellen die Ausgangsbasis für die onlineKontrolle der Zellkultivierung im Tissue Engineering unter mechanischer Stimulation dar und können
gleichfalls zur nichtinvasiven Bestimmung der Zahl an Chondrozyten in Knorpelbiopsien im Sinne einer
Qualitätskontrolle für das Tissue Engineering eingesetzt werden.
1.
Einleitung
Wesentliche Funktionen des Bewegungs- und Stützapparates des Menschen werden durch das
Knorpelgewebe sichergestellt. Insbesondere die reibungsarme Funktion der Gelenke ist an intaktes hyalines
Knorpelgewebe gebunden. Die Eigenschaften des Knorpels werden dabei im Wesentlichen von der
Zusammensetzung der extrazellulären Knorpelmatrix (ECM) bestimmt. Die ECM von intaktem hyalinem
Knorpel besteht hauptsächlich aus Kollagen Typ II, Proteoglycanen wie Chondroitin- und Keratansulfat,
Glucosaminen und Wasser [1,2]. Die ECM-Matrix wird von Chondrozyten synthetisiert, die innerhalb von
sogenannten Lakunen in der Knorpelmatrix eingebettet sind und den einzigen Zelltyp innerhalb des Knorpels
darstellen. Wird das Knorpelgewebe aufgrund pathologischer Prozesse (Arthritis) bzw. durch Verletzungen
geschädigt, so ist das Regenerationsvermögen zur Bildung neuen Knorpelgewebes allerdings sehr
eingeschränkt und die Patienten müssen teilweise erhebliche Beeinträchtigungen im Bewegungsablauf und
Schmerzen ertragen. Um die Probleme bei der Knorpelneusynthese zu umgehen, werden verstärkt Methoden
des Tissue Engineerings eingesetzt [3,4]. Die Matrix-gekoppelte Autologe Chondrozyten Implantation
(MACI®) stellt dabei ein bisher klinisch erfolgreiches Verfahren für die Behandlung von Knorpelschäden
dar. Dieses Therapieverfahren beruht auf der Implantation autologer Chondrozyten des Patienten, die aus
einer kleiner Biopsie gesunden Knorpelgewebes entnommen, isoliert und in einer ersten Kultivierungsphase
konventionell in Monolayerkulturen vermehrt werden. Anschließend werden diese Chondrozyten auf
speziellen Zellträgermaterialien (Kollagenmembranen bestehend aus porcinem Kollagen Typ I und Kollagen
Typ III in der Form eines dreidimensionalen Vlies-Netzwerkes) ausgesät und präimplantativ für einige Tage
weiter kultiviert. Für die klinische Versorgung des Knorpeldefektes wird der zellbewachsene Zellträger
direkt in das Defektareal implantiert. Das Ziel dieses Verfahren ist es, in den Knorpeldefekt eine
ausreichende Zahl an Chondrozyten einzusetzen, wobei der Kollagenträger eine Stützfunktion übernimmt
und die Zellen quasi dreidimensional im Areal positioniert werden können. Nach der Implantation erfolgt
dann die körpereigen gesteuerte Neusynthese von Knorpelgewebe durch die implantierten Chondrozyten mit
gleichzeitigem Abbau des Kollagenträgers in einem Zeitraum bis ca. einem Jahr. Die wesentliche
Voraussetzung für die Bildung biofunktionalem hyalinen Knorpels ist die Fähigkeit der Chondrozyten zur
Synthese knorpelspezifischer ECM-Komponenten, die durch den Grad der Zelldifferenzierung bestimmt
wird. Während der Zellvermehrung in Monolayerkulturen findet jedoch rasch eine Zelldedifferenzierung
statt. Durch zellstimulierende Verfahren kann während der präimplantativen Kultivierung die
Redifferenzierung der Chondrozyten unterstützt werden. Neben der Stimulierung durch geeignete Kulturund Medienbedingungen einschließlich der Zugabe von Wachstumsfaktoren (TGF-beta1 [5], FGF-2, PDGFbb [6]) kann durch mechanischen Stress auf die Chondrozytenkulturen einschließlich hydrostatischem Druck
[7,8-10] der Differenzierungsgrad der Chondrozyten positiv beeinflusst werden. Da die Chondrozyten aus
unterschiedlichen Biopsien mit unterschiedlichem Schädigungsgrad stammen, stellen sich die
entscheidenden Fragen nach Art und Dauer der Zellstimulation, um eine optimale Zellredifferenzierung zu
erreichen. Da das Zellmaterial quantitativ begrenzt ist, müss für eine entsprechende Analyse ein
nichtinvasives online-Detektionsverfahren zur Verfügung stehen.
Laseroptische Raster-Mikroskopieverfahren bieten für entsprechende Analysen dreidimensionaler
Zellkulturen sehr gute Voraussetzungen. Aufgrund der hohen Lichtstreuung und des optisch dichten
Materials zellbewachsener Kollagen I/III-Träger ist für die dreidimensionale Analyse die NIR-induzierte
Zweiphotonenanregung der nativen Fluoreszenz eine geeignete Untersuchungsmethode. Die 2PLSM [11-15]
bietet die Vorteile der dreidimensionalen Analyse mittels optischer Schnitte und ermöglicht im Vergleich zur
Einphotonenanregung üblicher konfokaler Mikroskope aufgrund der verwendeten Anregungswellenlänge im
NIR-Bereich von 760-1000 nm eine hohe Eindringtiefe des anregenden Lichtes ohne unzulässig hohe
Fotoschädigungen und Fotobleichung des biologischen Materials [16]. Aufgrund der hohen Effizienz der
Zweiphotonenanregung von nativen intrazellulären Fluorophoren wie NAD(P)H, Flavinen, Elastin und
Kollagenen [14,17] sowie der SHG, speziell von assemblierten strukturgebenden Kollagenen [18-20] können
Komponenten von Tissue Engineering-Konstrukten durch Autofluoreszenz- und SHG-Detektion
zellschonend nichtinvasiv detektiert werden. Somit kann auf konventionelle Fluoreszenzfärbungen von
Zellen, wie sie für die konfokale Laserscanmikroskopie nach Einphotonenanregung üblich ist, verzichtet
werden. Die Autofluoreszenz-Emissionsspektren komplexer biologischer Proben weisen im Allgemeinen
jedoch eine hohe Bandbreite auf, wobei sich Spektren interessierender Einzelkomponenten nur geringfügig
unterscheiden bzw. sich spektral weit überlappen [14]. Für eine selektive Detektion von
Autofluoreszenzsignalen einzelner Komponenten eines dreidimensionalen Tissue Engineering-Konstruktes
(Chondrozyten, Kollagen-Träger, synthetisierte ECM) als Voraussetzung für eine quantitative Analyse
müssen die Autofluoreszenz- und SHG-Signale anhand ihrer spektralen Eigenschaften getrennt werden. In
diesem Artikel werden Untersuchungen zur selektiven Autofluoreszenzanalyse sowie der Optimierung der
Signalperformance bei der Analyse chondrozytenbewachsener Kollagen I/III-Träger des Knorpel-Tissue
Engineerings (bovines Knorpelmodell) vorgestellt.
2.
Material und Methoden
2.1
Chondrocyten auf Kollagen I/III-Trägern
Die Chondrozyten wurden aus gesunden bovinen Rinderknie-Biopsien mittels Collagenase- und PapainVerdau gewonnen und in Monolayerkultur expandiert (Medium: DMEM/Ham’s F12, 10% FBS, Gentamicin
50 mg/l, 10 mg/l Ascorbinsäure, 37°C, 5% CO2, 80% Luftfeuchtigkeit), maximal zwei Zellpassagen).
Anschließend wurden 5x105 Zellen/cm2 auf zwei unterschiedlichen Kollagen I/III-Trägermaterialien (VliesMembran ACI-MaixTM sowie Schwammscaffold [Porengröße 30-50 µm]; Matricel GmbH, Aachen) ausgesät
und bis zu 5 Tagen weiter inkubiert. Die mikroskopische Analyse der zellbewachsenen Kollagen I/III-Träger
erfolgte mittels Zweiphotonen-Laserscanning-Mikroskopie.
2.2
Zweiphotonen-Laserscanning Mikroskopie (2PLSM)
Die Komponenten des 2PLSM umfassen einen Millenia X Festkörper-Laser sowie einem Tsunami Ti:SaLaser zur Generierung von 100 fs-Laserpulsen im Wellenlängenbereich von 760-960 nm (Bild 1: 1; beide
Laser Spectra-Physics), ein TriM Scope als Multifocus-Scan-Einheit (Bild 1: 2-4; LaVison BioTec GmbH
Bielefeld) und ein Mikroskop (Bild 1: 5; IX 71, Olympus).
Die Scan-Einheit besteht aus einer Pre-Chirp-Strecke zur Kompensation der Laserpuls-Dispersion (Bild 1: 2)
und zwei galvanometrischen Spiegel-Scannern für den Scan der Laserfoci in der X-Y-Ebene der Probe (Bild
1: 4). Die Strahl-Multiplexer-Sektion des TriM Scope (Bild 1: 3) splittet den einfallenden Laserstrahl in eine
variable Anzahl an Strahlen gleicher Anregungsleistung auf [21]. Durch Kombination des StrahlMultiplexings mit einer Steuerung der anregenden Laserenergie können in der zu analysierenden Probe (Bild
1: 6) ausreichende Fluoreszenzsignalintensitäten mit kurzen Aquisitionszeiten für die Datenaufnahme und
gleichzeitiger Minimierung von Fotoschädigungen erzielt werden.
Die anregenden NIR-Laserstrahlen werden über einen dichroitischen Spiegel (Bild 1: 9; 2P-Beamsplitter 680
DCSPXR, Chroma) auf die NIR-gecoatete Objektiv-Linse (Bild 1: 10; XLUMPLFL20XW, Arbeitsabstand 2
mm, Olympus) geleitet, während das NIR-Streulicht im Detektionsweg durch einen Shortpass-Filter (2PEmitter E 700 SP, Chroma) geblockt wird. Mit Hilfe einer Z-Scan-Einheit (MFD, Märzhäuser) kann in
Verbindung mit dem Objektiv mit langem Arbeitsabstand ein weiter Bereich tief in die Z-Ebene der Probe
hinein analysiert werden.
Die Detektion der Fluoreszenzsignale im non-descanned-Modus wird über eine CCD-Kamera (Bild 1: 8;
IXON BV887ECS-UVB, Andor Technology) bzw. einen Photomultiplier (PMT) bei Einzelstrahlanregung
(Bild 1: 11; H7422-40, Hamamatsu) realisiert. Für spektral aufgelöste Analysen können ein Filterrad mit
geeigneten Filtern, ein Spektrometer (SpectraPro 2300i, Acton Research Corporation) bzw. ein GeradsichtDispersionsprisma (LINOS Photonics GmbH & Co. KG) in den Detektions-Lichtweg eingekoppelt werden
(Bild 1: 7). Alternativ kann eine spektrale Analyse im Einzelstrahl-Descanned-Modus unter Verwendung
eines 32-fach Linear-PMT, angekoppelt an ein Spektrometer erreicht werden. An jedem einzelnen Element
des 32-fach-Linear PMT’s werden somit ca. 8 nm des Emissionsspektrums abgebildet (Bild 1: 11 oben). Die
Datenaufnahme wird über das Software-Paket Imspector (LaVision BioTec) kontrolliert. Die Auswertung
von bis zu 5-dimensionalen Fluoreszenzdatensets (geometrische X-Y-Z-Achsen sowie spektrale und
zeitliche Datenachsen) wird über die Software-Programme Imspector, ImageJ [22], Imaris 4.0 (Bitplane AG)
bzw. Volocity 4 (Improvision) vorgenommen.
Bild 1 Schema der Komponenten des 2PLSM: 1 Ti:Sa-Laser; 2 Pre-Chirp; 3 Strahl-Multiplexer; 4 Scanner-Spiegel; 5
Mikroskop; 6 Probe; 7 Filterrad/Spektrometer/Prisma; 8 Kamera; 9 Dichroitischer Spiegel; 10 Objektiv; 11 PMT
(Details siehe Text)
3.
Ergebnisse
3.1
Autofluoreszenz und SHG
Die Zweiphotonen-Anregung von zellbewachsenen Kollagen I/III-Trägern induziert Autofluoreszenz- sowie
SHG-Signale. SHG (Second Harmonic Generation) stellt einen physikalischen Effekt an Grenzflächen bzw.
an/zwischen Phasen dar, die Moleküle mit optisch nicht-zentrosymmetrischem Aufbau aufweisen (z.B.
Kollagene, Elastin, Myosin). Die SHG-Signale selbst stellen Oberschwingungen nach
Frequenzverdoppelung der anregenden Wellenlänge dar [23]. Aufgrund der Schmalbandigkeit und der
deutlichen Trennung der Peaks im Spektralbereich können SHG-Signale äusserst effizient von breitbandigen
Autofluoreszenzsignalen der Einzelkomponenten unterschieden werden. Da nur die Kollagen I/III-Fasern der
Vliese auswertbare SHG-Signale liefern, ist eine selektive Visualisierung innerhalb zellbewachsener Tissue
Engineering-Konstrukte möglich (Bilder 2und 3). Die SHG-Detektion von Kollagen in artifiziellen
Kollagen-Trägern setzt dabei jedoch eine lokal konzentrierte Hyperstruktur von Kollagenfibrillen, wie sie
z.B. in Kollagen-Vliesen vorliegt voraus. In Kollagen I/III-Schwämmen konnten bei einer Anregungsenergie
von bis zu 15 mW pro Focuspunkt keine auswertbaren SHG-Signale detektiert werden.
Bild 2 Autofluoreszenz und SHG von Chondrozyten auf
Kollagen I/III-Vlies (820 nm, Einzelstrahl-Modus 15 mW,
PMT-Detektion, links: Autofluoreszenz [ohne Filter], rechts:
Projektion der sukzessiv detektierten SHG-Signale der
Kollagen-Fasern [HQ 410/20] der gleichen Probe, im Original:
Falschfarbenzuweisung)
3.2
Bild 3 3D-Rekonstruktion eines Chondrozyten an
einer
Kollagenfaser
anhand
selektiver
Autofluoreszenz und SHG-Detektion (820 nm,
Einzelstrahl-Modus 15 mW, PMT-Detektion, SHG
der Kollagen-Faser [HQ 410/20], Autofluoreszenz
eines Chondrozyten [HQ 525/50 und HQ 575/50], im
Original: Falschfarbenzuweisung)
Spektrale Analyse der Autofluoreszenz
Die spektrale Analyse der Autofluoreszenz an jedem
Pixel einer Bildebene mittels Spektrometer/Prisma liefert
charakteristische Merkmale der Emissionssignale der
einzelnen Strukturen in der Probe (Bild 4). Die
spektralen Unterschiede von Chondrozyten und
Kollagen-I/III-Trägern werden für eine Klassifizierung
der Spektren pro Pixel genutzt. Durch eine spektrale
Entmischung (spectral unmixing) und eine selektive
Falschfarbenzuweisung pro Pixel in Abhängigkeit der
Spektrencharakteristik ist die selektive Visualisierung
und damit eine softwarebasierte quantitative Bildanalyse Bild 4 Emissionsspektren von Chondrozyten auf
möglich. Der Nachteil bei diesem Verfahren besteht in Kollagen I/III-Schwämmen (785 nm, 32 Foci à 5.5
mW, Prisma, Genauigkeit ± 10 nm)
der hohen Datenmenge, die bei spektral aufgelöster
Bild 5 Chondrozyten auf Kollagen I/III-Schwamm, spektral entmischte Bilddaten an fünf Z-Ebenen (im Original:
Falschfarbenzuweisung)
Analyse von 1 nm über einen Spektralbereich von ca. 460-620 nm pro Pixel entsteht. Eine sinnvolle Analyse
kann erreicht werden durch a) Reduzierung der Zahl an Z-Ebenen (Bild 5), wobei hier auf eine echte
kontinuierliche 3D-Analyse verzichtet werden muss, b) durch Reduzierung der spektralen Auflösung auf 510 nm oder c) durch Einschränkung des zu scannenden X-Y-Areals.
3.3
Spektraler Einzelstrahl-Descanned-Modus
Trotz Zweiphotonenanregung weisen die optisch dichten Proben der chondrozytenbewachsenen Kollagen
I/III-Träger relativ geringe Autofluoreszenzsignale und Streulichteinflüsse auf, was die optische Auflösung
der Probenstrukturen erschwert. Durch den parallelisierten descanned-Modus können Streulichteinflüsse
wirkungsvoll unterdrückt werden (hier nicht gezeigt). Durch die Kombination eines Spektrometers mit einem
32-fach Linear-PMT können die Vorteile der selektiven Visualisierung von Chondrozyten und KollagenTrägern durch Autofluoreszenz mit einer guten Auflösung und hoher Bilddynamik gekoppelt werden. Die
spektrale Auflösung des 32-fach-PMT beträgt dabei ca. 8 nm, was sich als ausreichend für das spektrale
Entmischen der Autofluoreszenzsignale der Chondrozyten und Kollagen-Träger erwiesen hat (Bild 6). Der
Vorteil dieses Verfahrens liegt in der deutlichen Reduzierung der Datenmenge und einer schnellen und
echten kontinuierlichen 3D-Analyse über die gesamte Tiefe der Probe in Z-Richtung.
Bild 6 Chondrozyten auf Kollagen I/III-Vlies (links) und –Schwamm (rechts): Autofluoreszenz, Detektion mittels 32fach-Linear-PMT im Einzelstrahl-Descanned-Modus (im Original: Falschfarbenzuweisung)
4.
Diskussion
Für die Analyse und Bewertung von Zellen und Zellverbänden im Kontakt mit (Bio)-Materialoberflächen
bzw. unter dem Einfluss externer Agentien/Stimulantien (z.B. Pharmazeutika, physiko-chemische Faktoren)
werden zunehmend online-Verfahren eingesetzt, die eine kontinuierliche Datenerfassung und damit die
Analyse kinetischer Prozesse der Zellreaktionen ermöglichen. Die wesentliche Voraussetzung ist die
nichtinvasive Detektion geeigneter Zellparameter wie Zellzahl, Zellmorphologie, Zellverteilung und
Metabolismus. Durch die Weiterentwicklung und Optimierung laserscannender optischer Verfahren stehen
dafür inzwischen leistungsfähige Werkzeuge zur Verfügung. Durch die vorliegenden Untersuchungen
wurden Verfahren der Zellanalyse nach Zweiphotonen-Anregung entwickelt, die eine selektive
Visualisierung der Hauptkomponenten von Tissue Engineering-Konstrukten für die Therapie von
Knorpelschäden ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Kopplung geeigneter Detektionsverfahren mit
der 2PLSM a) die selektive Analyse von Chondrozyten und Kollagen I/III-Trägern anhand ihrer spektralen
Autofluoreszenz-Emissionseigenschaften und b) die simultane Analyse der Autofluoreszenz und SHG
geeignete Methoden einer zellschonenden, nichtinvasiven Analyse bei Anregungsenergien im Bereich von 515 mW pro Focuspunkt darstellen. Die Bildgebung der naturgemäß stark streuenden Proben
dreidimensionaler Zellverbände auf Trägermaterialien kann durch den descanned-Modus der Datenaufnahme
deutlich verbessert werden. Auf der Basis der Ergebnisse sind die Voraussetzungen für eine optische onlineBewertung von Tissue Engineering-Konstrukten unter den Bedingungen einer zellstimulierenden
Kultivierung in Fließkammer-Bioreaktoren geschaffen worden. Weiterführende Untersuchungen verfolgen
das Ziel, durch die FLIM-Analyse (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) weitere Optionen für eine
selektive 2PLSM-Analyse von Zellen und Trägermaterialien zu schaffen. Hierbei ist insbesondere der Effekt
zellstimulierender Reize auf metabolische Zellfunktionen von großem Interesse.
Diese Forschungsarbeiten werden im Rahmen der BMBF-Forschungsinitiaitive „Biophotonic I“ (FKZ 13N8432,
13N8434, 13N8435) gefördert.
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