laboratory science Stress-strain measurements of human and

Transcrição

laboratory science
Stress-strain measurements of human and porcine
corneas after riboflavin–ultraviolet-A-induced
cross-linking
Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Theo Seiler, MD
Purpose: To evaluate the biomechanical effect of combined riboflavin–ultraviolet
A (UVA) treatment on porcine and human corneas.
Setting: Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden,
Dresden, Germany.
Methods: Corneal strips from 5 human enucleated eyes and 20 porcine cadaver
corneas were treated with the photosensitizer riboflavin and irradiated with 2 double UVA diodes (370 nm, irradiance ⴝ 3 mW/cm2) for 30 minutes. After crosslinking, static stress-strain measurements of the treated and untreated corneas
were performed using a microcomputer-controlled biomaterial tester with a prestress of 5 ⫻ 103 Pa.
Results: There was a significant increase in corneal rigidity after cross-linking,
indicated by a rise in stress in treated porcine corneas (by 71.9%) and human
corneas (by 328.9%) and in Young’s modulus by the factor 1.8 in porcine corneas
and 4.5 in human corneas. The mean central corneal thickness was 850 ␮m ⫾ 70
(SD) in porcine corneas and 550 ⫾ 40 ␮m in human corneas.
Conclusions: Riboflavin⫺UVA-induced collagen cross-linking led to an increase
in mechanical rigidity in porcine corneas and an even greater increase in human
corneas. As collagen cross-linking is maximal in the anterior 300 ␮m of the cornea, the greater stiffening effect in human corneas can be explained by the relatively larger portion of the cornea being cross-linked in the overall thinner human
cornea.
J Cataract Refract Surg 2003; 29:1780 –1785 © 2003 ASCRS and ESCRS
T
he biomechanical properties of the cornea are primarily determined by the collagen fibers comprising 15 000 km and the degree of interfibrillar linkage.1
Therefore, collagen cross-linking induced by combined
Accepted for publication March 17, 2003.
From the Department of Ophthalmology, Technical University of
Dresden (Wollnesak, Spoerl), Dresden, Germany, and the Department
of Ophthalmology, University of Zurich (Seiler), Zurich, Switzerland.
None of the authors has a financial interest in any product mentioned.
Reprint requests to Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Wollensak, University
Eye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany.
E-mail: [email protected].
© 2003 ASCRS and ESCRS
Published by Elsevier Inc.
riboflavin–ultraviolet A (UVA) treatment has been used
successfully to mechanically stabilize the cornea in keratoconus (thereby stopping the progression of keratectasia2) and in corneal melting processes.3 No adverse
effects have been observed clinically.2
However, biomechanical experimental measurements of the effect of combined riboflavin–UVA
treatment on human corneas have not been done.4,5
This study measured the biomechanical effect of riboflavin–UVA-induced collagen cross-linking in human
corneas and compared it to the effect in cross-linked
porcine corneas having comparable biomechanical
properties.6,7
0886-3350/03/$–see front matter
doi:10.1016/S0886-3350(03)00407-3
LABORATORY SCIENCE: STRESS-STRAIN MEASUREMENTS AFTER COLLAGEN CROSS-LINKING
Materials and Methods
Specimen Preparation
Five freshly enucleated human eyes with intact and clear
corneas that had been removed because of endophthalmitis (1
patient), choroidal melanoma (3 patients), and a nonhealing
retinal detachment (1 patient) were used within 1 to 2 hours
of enucleation. Before treatment, the corneal epithelium was
completely scraped using a blunt hockey knife. The 12 o’clock
position was marked with a nylon thread for orientation of the
superior–inferior cut. The corneoscleral ring was then removed. With a self-constructed triple-blade scalpel, the cornea was cut into 2 equal strips of 4.0 mm width, 550 ␮m
central corneal thickness, and 14.0 mm length including
1.0 mm sclera on both ends. Human cadaver eyes had been
measured but were not included in the study as the variances
in the stress-strain measurements were too great because of
different postmortem times and degrees of autolysis.
Twenty fresh porcine cadaver eyes with intact epithelia
and clear corneas were retrieved from the local slaughterhouse
within 2 to 5 hours post-mortem. The eyes were deepithelialized mechanically, and the corneoscleral ring was removed
using a scissors. With a self-constructed double-blade scalpel,
1 corneal strip of 5.0 mm width, 850 ␮m central corneal
thickness, and 14.0 mm length including 1.0 mm sclera on
both ends was cut in a superior–inferior fashion from the
12 o’clock position of the cornea, which was easily identified
by its oval shape. Because of the natural thickness of the porcine cornea, only 1 corneal strip with clearly cut perpendicular
edges could be prepared properly from each eye. There were
shear artifacts in the deeper layers otherwise. Ten corneas were
treated with riboflavin–UVA irradiation, and 10 were used as
untreated controls.
Pachymetry
Using ultrasound pachymetry (Pachette, Technomed),
the central corneal thickness was determined in the human
and porcine eyes.
Figure 1. (Wollensak) Irradiation of riboflavin-treated human corneal strip using 2 double-UVA diodes (irradiance 3 mW/cm2 , exposure time 30 min) at 1.0 cm distance.
2000) at a distance of 1.0 cm and, if necessary, regulated with
a potentiometer.
Static Stress-Strain Measurements
The human and porcine corneal strips were clamped horizontally at a distance of 8.0 mm between the jaws of a commercially available microcomputer-controlled biomaterial
tester (Minimat, Rheometric Scientific GmbH (Figure 2). To
include the physiological stress range, a prestress of 5 ⫻ 103 Pa
(1 Pa ⫽ 1 N/m2) was used, which required a force of 10 mN
in human corneas and 20 mN in porcine corneas because of
the different thicknesses. The strain was then increased linearly with a velocity of 1.5 mm min–1, and the stress was
measured up to 2 ⫻105 Pa.4,5 The stress-strain values were
fitted by an exponential function ␴ ⫽ A exp (B ⫻ ε) using the
SPSS-calculation program (SPSS GmbH Software, Munich).
Young’s modulus (E) was calculated for 4%, 6%, and 8%
strain as the gradient of the stress-strain graph (E ⫽ d␴/dε ⫽
A ⫻ B exp (B ⫻ ε).
Treatment
Starting 5 minutes before the treatment, 0.1% riboflavin
(vitamin B2) photosensitizer solution (10 mg riboflavin-5phosphate in 10 mL 20% dextran-T-500) was dropped on the
treated strips and 20% dextran solution on the control strips
at 5-minute intervals. Ultraviolet A irradiation (370 nm) was
applied using 2 double UVA diodes (Roithner Lasertechnik)
with an irradiance of 3 mW/cm2 at a distance of 1.0 cm from
the cornea for 30 minutes (Figure 1). This is equal to a dose of
5.4 J/cm2. The parameters of exposure were chosen according
to the treatment procedure used in keratoconus patients.2
Three 1.3 V accumulators were used as a power generator.
Before treatment, the desired irradiance of 3 mW/cm2 was
controlled with a calibrated UVA meter (LaserMate-Q, Laser
Figure 2. (Wollensak) Human corneal strip between the clamps of
the stress-strain biomaterial tester (Minimat).
J CATARACT REFRACT SURG—VOL 29, SEPTEMBER 2003
1781
Statistical Evaluation
The stress data necessary for a strain of 4%, 6%, and 8%
in treated and untreated corneas (separately for human and
porcine eyes) and in human and porcine corneas were compared using the Student t test.
Results
Stress-Strain Curves
The stress-strain curves showed the typical exponential increase of a bioviscoelastic solid (Figure 3).
In porcine corneas, the stress using 6% strain was
98.5 ⫾ 29.77 ⫻ 103 Pa in the treated corneas and
57.3 ⫾ 17.3 ⫻ 103 Pa in the untreated corneas, corresponding to a 71.9% increase (Table 1). The difference
was statistically significant (P ⫽ .014).
In human corneas, the stress using 6% strain was
227.3 ⫾ 95.7 ⫻ 103 Pa in the treated corneas and
53.0 ⫾ 11.5 ⫻ 103 Pa in the untreated corneas, corre-
sponding to a 328.9% increase (Table 1). The difference
was statistically significant (P ⫽ .012).
In untreated corneas in porcine and human eyes, the
difference in the stress-strain values was not statistically
significant (P ⫽ .87). In treated corneas in porcine and
human eyes, the difference was statistically significant (P
⫽ .01). The increased biomechanical stiffness was also
reflected in the different bending behaviors (Figure 4).
Young’s Modulus
To calculate Young’s modulus, the stress-strain
values were fitted with an exponential function ␴ ⫽ A
exp (B ⫻ ε). The first derivation of this function in a
definite strain is Young’s modulus E ⫽ d␴/dε ⫽ A ⫻ B
exp (B ⫻ ε).
In porcine corneas at 6% strain, Young’s modulus
was 1.5 ⫻ 106 Pa in the untreated eyes and 2.7 ⫻ 106 Pa
in the treated eyes (increase factor 1.8). In human cor-
Figure 3. (Wollensak) Top: Stress-strain measurements of human corneas (n ⫽ 5) treated with
riboflavin–UVA (irradiance ⫽ 3 mW/cm2). Bottom:
Stress-strain measurements of porcine corneas
(n ⫽ 20) treated with riboflavin–UVA (irradiance ⫽
3 mW/cm2).
1782
Table 1. Stress values for 4%, 6%, and 8% strain and calculated Young’s modulus in brackets.
Stress at 4% (103 Pa)
Untreated
33.7 ⫾ 9.3 (E ⫽ 0.8 ⫻ 106 Pa)
57.3 ⫾ 17.3 (E ⫽ 1.5 ⫻ 106 Pa)
86.5 ⫾ 29.9 (E ⫽ 2.6 ⫻ 106 Pa)
Treated
55.8 ⫾ 17.6 (E ⫽ 1.4 ⫻ 106 Pa)
98.5 ⫾ 29.7 (E ⫽ 2.7 ⫻ 106 Pa)
151.8 ⫾ 44.7 (E ⫽ 5.3 ⫻ 106 Pa)
34.3 ⫾ 5.5 (E ⫽ 0.8 ⫻ 106 Pa)
53.0 ⫾ 11.5 (E ⫽ 1.3 ⫻ 106 Pa)
79.3 ⫾ 21.2 (E ⫽ 2.2 ⫻ 106 Pa)
135.7 ⫾ 61.4 (E ⫽ 3.0 ⫻ 106 Pa)
227.3 ⫾ 95.7 (E ⫽ 5.9 ⫻ 106 Pa)
344.7 ⫾ 141.9 (E ⫽ 11.8 ⫻ 106 Pa)
Type of Cornea
Porcine
Human
Untreated
Treated
Figure 4. (Wollensak) Treated (below) and untreated (above) porcine corneal strips with preservation of the corneal curvature in the
treated cornea due to the increase in bending stiffness by collagen
cross-linking.
neas at 6% strain, Young’s modulus was 1.3 ⫻ 106 Pa in
the untreated eyes and 5.9 ⫻ 106 Pa in the treated eyes
(increase factor 4.5).
Pachymetry
The mean central corneal thickness was 850 ⫾
70 ␮m in porcine eyes and 550 ⫾ 40 ␮m in human eyes.
Discussion
We found a significant increase in biomechanical
rigidity by a factor of 4.5 in human corneas, as indicated
by Young’s modulus, following riboflavin–UVA-induced collagen cross-linking. The increase in biomechanical stiffness in porcine eyes was also significant, but
only by a factor of 1.8.
The increase in biomechanical stiffness in the human corneas was surprisingly high. From previous mea-
surements of porcine eyes, using slightly different
treatment conditions (ie, treatment time [45 minutes],
UVA irradiation source [mercury lamp with 365 nm
UV filter], UVA irradiance [2 mW/cm2 ]), we expected
an increase in the range of a factor of 2, as found in
porcine eyes in the present study.4
From other experiments on the diameter of corneal
collagen fibers,8 resistance to enzymatic digestion,9 and
keratocyte loss after riboflavin–UVA treatment,9,10 we
know that the cross-linking and cytotoxic effects are significantly higher in the anterior portion of the cornea. This
is caused by the significant increase in UVA absorption
by riboflavin, leading to a rapid reduction of UVA irradiance and collagen cross-linking across the cornea.11
Given the uneven distribution of collagen crosslinking, with the maximum cross-linking effect in the
anterior 300 ␮m of the corneal stroma, the treated
corneas can be regarded as 2-layer structures. The
anterior portion amounts to 35% cross-linking volume
in the porcine cornea (300 ␮m/850 ␮m) and to 54%
cross-linking volume in the human cornea (300 ␮m/
550 ␮m), resulting in higher rigidity of the total cornea
in human eyes, as reflected in the stress-strain measurements (Figures 3 and 5). In normal eyes, the more rigid
anterior stroma also accounts for maintenance of the
corneal curvature.12,13
The anterior localization of the main cross-linking
effect has the advantage of allowing us to achieve a relatively high increase in corneal rigidity in human eyes
because of the relatively small thickness of the human
cornea and to spare the endothelium and the lens from
cytotoxic damage provided the corneal stroma is normally thick.
To avoid additional cross-linking inhomogeneities in
the horizontal dimensions, the irradiation was performed
over the entire length of the corneal strips using 2 double
1783
Figure 5. (Wollensak) Two-layer model of cross-linked cornea with
the anterior cross-linked and posterior non-cross-linked corneal
stroma. In porcine corneas, the relative portion of the cross-linked
cornea (t1/t) is less than in human corneas due to the greater corneal
thickness in pig eyes (850 ␮m versus 550 ␮m), resulting in less rigidity
for the total porcine cornea (as indicated by a lower ␴total) (␴ ⫽ total
stress of the cornea, ␴1 ⫽ partial stress of the cross-linked cornea
layer, ␴2 ⫽ partial stress of the noncross-linked cornea layer, t ⫽ total
thickness of the cornea, t1 ⫽ partial thickness of the cross-linked
cornea layer, t2 ⫽ partial thickness of the noncross-linked cornea
layer; ␴ ⫽ ␴1 ⫻ t1/t ⫹ ␴2 ⫻ t2/t).
UVA diodes, whereas in clinical applications, we irradiate only the central cornea using 1 double UVA diode.2
The rise in biomechanical rigidity after collagen
cross-linking in human and porcine corneas is probably
caused by an increase in the collagen fiber diameter due
to intrafibril cross-links.8
Other cross-linking methods that have been tested
successfully in vitro have a biomechanical effect on the
cornea comparable to riboflavin–UVA treatment but
cannot be used clinically because of the development of
corneal haze and scarring, as after glutaraldehyde treatment (W.J. Dupps, ARVO abstract 147, 2002),14 or
application problems and prolonged treatment time, as
with glyceraldehyde (F.J. Tessier, ARVO abstract 3234,
2002).14
In keratoconus, a 50% decrease in the stress necessary for a defined strain has been found.15 Accordingly,
we have used the cross-linking treatment mainly in progressive keratoconus and less frequently in corneal melting processes. Further applications lie in the field of
refractive surgery and are being explored in conditions
such as after iatrogenic laser in situ keratomileusis
(LASIK) induced keratectasia16,17 or for preventive
treatment before LASIK for high myopia to avoid or
reduce possible postoperative myopic regression or keratectasia. Collagen cross-linking might also help to
1784
avoid so-called central islands in broad-beam laser surgery (W.J. Dupps, ARVO abstract 147, 2002), often
caused by differential corneal hydration,18 which is
markedly reduced after cross-linking (E. Spoerl, ARVO
abstract 2339, 1997).
In conclusion, the present study showed a stronger
increase in the biomechanical rigidity of the human cornea after riboflavin–UVA treatment than in the porcine
cornea because of the relatively larger portion of crosslinking in the thinner human cornea. Practical applications of the new method are for progressive keratoconus,
corneal-melting processes, and LASIK in high myopia.
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20:394 –397
1785
Eye (2004), 1–5
& 2004 Nature Publishing Group All rights reserved 0950-222X/04 $25.00
www.nature.com/eye
G Wollensak1 , E Spoerl1 , F Reber2 and T Seiler3
Abstract
collagen crosslinking in the cornea using
ultraviolet A (UVA) and the photosensitizer
riboflavin. Collagen crosslinking leads to an
increase in intra- and interfibrillar covalent
bonds by photosensitized oxidation and causes
a biomechanical stabilization of the cornea. In a
prospective clinical pilot study including 22
patients with moderate or advanced progressive
keratoconus and with a follow-up time of up to
4 years, the progression of keratoconus could
thus be stopped in all treated eyes. Regression
with a reduction of the maximal keratometry
readings by 2 diopters was achieved in 70% of
patients.1
In stress–strain measurements of the human,2
porcine,2,3 and rabbit4 cornea, a significant
increase of mechanical rigidity was found. An
increased resistance to collagenases could be
demonstrated.5 Besides keratoconus and
corneal ulcers, the new treatment can be used in
corneal melting processes6 and in the field of
refractive surgery to reduce the risk for
iatrogenic keratectasia after LASIK (laser
assisted in situ keratomileusis).7
The impact of various treatment modalities
like corneal abrasion, PRK (photorefractive
keratectomacy),8 LASIK,8,9 and epithelial
injury10–12 on keratocytes has gained
considerable interest in recent years having a
possible influence on scarring or corneal
thinning.10 Therefore, as part of a
comprehensive safety evaluation, we have
undertaken the following experimental study to
assess the possible damage to corneal
keratocytes after combined riboflavin/UVAtreatment and to compare it to the effect of
UVA-irradiation alone.
Purpose Collagen crosslinking using
ultraviolet- A (UVA) -irradiation combined
with the photosensitizer riboflavin is a new
technique for treating progressive
keratoconus. It has been shown to increase
effectively the biomechanical strength of the
cornea and to stop or even reverse the
progression of keratoconus. As part of a safety
evaluation, the present study was undertaken
to investigate in vitro the possible cytotoxic
effect of combined riboflavin/UVA-treatment
on corneal keratocytes and to compare it to
UVA-irradiation alone.
Methods Cell cultures established from
porcine keratocytes were treated with 0.025%
riboflavin solution and various UVA (370 nm)irradiances ranging from 0.4 to 1.0 mW/cm2
and with UVA alone between 2 and 9 mW/cm2
for 30 min. The cell cultures were evaluated for
cell death 24 h after irradiation using trypanblue and Yopro-fluorescence staining.
Results An abrupt cytotoxic irradiance level
was found at 0.5 mW/cm2 for keratocytes after
UVA-irradiation combined with the
photosensitizer riboflavin, which is 10-fold
lower than the cytotoxic irradiance of 5 mW/
cm2 after UVA-irradiation alone.
Conclusions A cytotoxic effect of combined
riboflavin/UVA-treatment on keratocytes is to
be expected at 0.5 mW/cm2, which is reached in
the clinical setting in human corneas down to
a depth of 300 mm using the standard surface
UVA-irradiance of 3 mW/cm2.
Eye advance online publication, 23 January 2004;
doi:10.1038/sj.eye.6700751
Keywords: keratocytes; UVA; riboflavin;
necrosis; cell culture; crosslinking
Introduction
We have recently developed a new method for
the treatment of keratoconus by inducing
LABORATORY STUDY
Keratocyte
cytotoxicity of
riboflavin/UVAtreatment in vitro
1
Department of
Ophthalmology Technical
University of Dresden
Dresden, Germany
2
Department of Anatomy
Technical University of
Dresden Dresden, Germany
3
Institut für Refraktive und
Ophthalmo-Chirurgie
(IROC) Zurich
Switzerland
Materials
Correspondence:
G Wollensak
Wildentensteig 4
Berlin D-14195, Germany
Tel: þ 49 351 458 3763
Fax: þ 49 351 458 4335
E-mail: gwollens@
hotmail.com
All primary cultures and serial passaging were
carried out in growth media consisting of
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)
Received: 3 February 2003
Accepted in revised form:
22 October 2003
Material and methods
Keratocyte cytotoxicity
G Wollensak et al
2
supplemented with 10% foetal calf serum (FCS, from
Sigma, Deisenhofen, FRG), phenol red, and antibiotics
(penicillin–streptomycin). Trypan-blue solution13
(Biochrome AG, Berlin, FRG) and Yopro (Molecular
probes, Eugene, OR, USA)-fluorescent stain were used
for the viability assay.14
Explant culture conditions
Explant cultures13 were established from porcine eyes,
which were obtained from a local slaughterhouse within
3–5 h postmortem. The epithelium was removed
mechanically using a blunt hockey knife. Pieces 6 6 mm
of mid-stromal lamellae were dissected by a pair of
scissors, and transferred into a 25 cm2 cell culture flask
(Nunc, Wiesbaden, FRG). The flask was filled with 2 ml
DMEM plus 10% foetal calf serum and placed into an
incubator gassed with carbon dioxide 6% at 371C. Cell
outgrowth from the stromal explants started after 10–12
days, and confluence with about 2.5 106 cells per flask
was reached after 21 days. The media were exchanged
every week. The confluent stock cultures were passaged
every 3 weeks with a split ratio of 1 : 3. For dissociation
and detachment, the cultures were treated with 0.05%
trypsin–EDTA solution. The free cells were centrifuged at
230 g, transferred into new culture flasks and
resuspended. The cell growth was evaluated regularly
using an inverted phase-contrast microscope at
100 magnification (Zeiss Axiovert L5). Before the
irradiation, 5 104 cells were plated per well in
eight-well tissue plates, where they reached confluence
after 8–10 days. After another week, the UVA-irradiation
was performed.
was chosen and calculated as follows. In humans, 0.1%
riboflavin solution is applied. Using the so-called
diffusion equation and the diffusion coefficient
(D ¼ 6.5 107 cm2/s) of the related dye fluorescein, we
calculated the average riboflavin concentration over
30 min in the stroma as 0.024% riboflavin solution.
Therefore, we used 0.025% riboflavin solution ( ¼ 500 mM)
by adding 57 ml of 0.2% riboflavin stock solution to 400 ml
colourless culture medium without phenol red. No
riboflavin was added to the cultures with UVA-treatment
alone. The riboflavin solution for the UVA-irradiation
was added to the wells 5 min before the irradiation and
was replaced by the cell medium after the irradiation.
To avoid UVA-absorption by riboflavin solution
overlying the monolayer of keratocytes attached to the
floor of the wells, we irradiated the wells from
underneath fixating the UVA-double diode (370 nm)
1 cm under the respective wells (Figure 1) with
the help of a stand. The UVA-absorption by the 100 mm
thin floor of the wells made of borsilicone was
measured to be only 2% and was negligible. Before the
treatment, the required UVA-irradiances ranging
from 0.4 to 9 mW/cm2 were controlled with
a UVA-meter (LaserMate-Q, LASER 2000,
Wessling, Germany) at a 1 cm distance and if
necessary regulated with a potentiometer in series. The
irradiation itself lasted 30 min, which is conform to the
clinical setting. Five wells were tested for each
irradiance level. The irradiation doses (J/cm2) were
calculated from the UVA-irradiances (mW/cm2) by
multiplying the value with the irradiation time in
seconds ( ¼ 30 60).
Treatment groups
The cells were exposed to three different treatments:
1. Riboflavin alone: The cells were exposed to 25, 50, 100,
and 500 mM riboflavin solution.
2. Riboflavin plus UVA: The cells were exposed to
0.025% ( ¼ 500 mM) riboflavin solution plus
UVA-irradiances ranging from 0.4 to 1 mW/cm2
(Table 1).
3. UVA alone: The cells were exposed to UVAirradiances ranging from 2 to 9 mW/cm2 (Table 1).
Except for the varying UVA-irradiances, the other
parameters like riboflavin concentration or the UVAwavelength of 370 nm were kept identical to the clinical
treatment in the second treatment group.
Irradiation procedure
A riboflavin concentration as close as possible to the
conditions of the clinical treatment of human corneas
Eye
Table 1 Cytotoxicity for porcine keratocytes after combined
riboflavin/UVA-treatment and after UVA alone
Irradiance level (mW/cm2)
9
8
7
6
5
4.5
4
3
2
0.8
0.7
0.6
0.55
0.5
0.45
0.4
( þ ) Necrosis, () no cell damage.
Riboflavin þ UVA
UVA
þ
þ
þ
þ
þ
þ
þ
þ
þ
þ
G Wollensak et al
3
Figure 1 Irradiation procedure with double UVA-diode under
the wells of the culture plate.
Figure 2 Representative morphology of the cultured porcine
keratocytes at confluence (phase-contrast, 100).
Supravital staining
To determine possible cell damage after treatment, 100 ml
of 0.25% trypan-blue solution dissolved in colourless
culture medium was applied per well for 15 min
followed by twofold rinsing with culture medium. After
microscopic evaluation of the trypan-blue staining,13 the
cells were subsequently stained with Yopro adding 1 ml
per well followed by one rinse with culture medium.14
For trypan blue (Figures 2 and 3), cultures were
examined in an inverse microscope (Leica DMIR) at
100–400-fold magnification using differential interference
contrast and for Yopro (Figure 4) using fluorescence at
488 nm (N2.1 filter). Photos were taken with a digital
camera attached to the microscope (Nikon coolpix 950).
Only the nuclei of damaged cells were labelled with the
stains.
Figure 3 Peripherial sector of the circular treatment area
(riboflavin plus 0.5 mW/cm2 UVA) with trypan-blue-positive
keratocytes and loss of cells (trypan blue, 400).
Figure 4 Peripherial sector of the circular treatment area
(5 mW/cm2 UVA) with Yopro-stained keratocyte nuclei (Yopro,
400).
Results
Cellular characteristics
Before confluence, the scattered cells appeared dendritic,
whereas they assumed a spindle-shaped appearance
when confluence was reached (Figure 2). About 10% of
the cells contained some brown-coloured,
autofluorescent granules as is typical for lipofuscein
deposits. After cytotoxic doses, the damaged cell nuclei
stained positively with trypan blue (Figure 3) and the
green-fluorescent Yopro (Figure 4). The cell damage
detected by the two stains was always observed in the
same cells and at the same irradiance level. In addition,
dead cells became more globular in shape and about
5–10% of the damaged dead cells lost adhesion floating
off the bottom of the wells. The area of the damaged cells
Eye
G Wollensak et al
4
was shaped like a circle quasi like an imprint of the UVAbeam with surviving cells only in the nonirradiated
periphery (Figures 3 and 4).
Cytotoxicity
The cytotoxic irradiance level was found to be 10-fold
lower at 0.5 mW/cm2. ( ¼ 0.9 J/cm2) for keratocytes after
riboflavin combined with UVA-irradiation compared to
5 mW/cm2 ( ¼ 9 J/cm2) for cells with UVA-irradiation
alone (Table 1). The cytotoxic effect occurred in a
threshold-like manner with a sharp and abrupt
transition from damaging to nontoxic irradiance levels.
There was no variability in the five different wells per
irradiance level and always all cells irradiated with the
toxic dose were damaged. There was no cytotoxicity
for the cells treated with riboflavin alone without
UVA-irradiation.
Discussion
The present study has shown an abrupt threshold-like
cytotoxic irradiance level of combined riboflavin/UVAtreatment at 0. 5 mW/cm2. Using the standard surface
irradiance of 3 mW/cm2 and the absorption coefficient
of 53 cm1, it can be calculated according to the
Lambert–Beer equation Idepth ¼ Isurfacee(dm) that in human
corneas the cytotoxic keratocyte UVA-irradiance of
0.5 mW/cm2 is reached down to a stromal depth of
300 mm.4,15 These data fit well to our in vivo results in
riboflavin/UVA-treated rabbit corneas, where we found
exactly the same cytotoxic irradiance of 0.5 mW/cm2
with a keratocyte loss down to a depth of 300 mm after
3 mW/cm2 surface irradiance.16
UV-induced damage of keratocytes has also been
reported by others and depends on the ultraviolet
wavelength and dose. While ultraviolet C (UVC)
(100–290 nm) is completely absorbed at the corneal
surface and 80% of ultraviolet B (UVB) (290–315 nm) in
the corneal epithelium, 25–34% of UVA (315–400 nm) is
absorbed in the stroma.17 Accordingly, massive
keratocyte damage was observed especially in the
anterior portion of the rabbit cornea following exposure
to UVA-irradiation at 350 nm.18,19
In the present in vitro study, the cytotoxic irradiance
level after combined riboflavin/UVA-treatment was
about 10-fold lower than that after treatment with UVA
alone because the cytotoxic effect, which is due to the
oxidant effect of UVA-light, is multiplied by the
photosensitizer riboflavin due to increased UVAabsorption. Concurrent with this observation,
UVA-absorption was shown by us to be increased to
95%4 in the cornea after riboflavin treatment compared to
25–35% without riboflavin.17
Eye
Riboflavin (vitamin B2) alone produced no cell damage
as is also known from other experiments20 and is not
surprising because riboflavin is also present in the retina,
liver, and heart, being an essential element in normal
nutrition.21
In terms of the clinical problems of keratocyte loss,
only long-term imbalances of the keratocyte
reconstitution bear a risk for corneal thinning.8,10
However, this is not to be expected because the
keratocyte loss can be repaired rapidly by
repopulation from migrating keratocytes of the
adjacent cornea.8,22 Loss of keratocytes has been
observed already in other corneal procedures without
having dramatic consequences. So after PRK,8
LASIK,8,9 or epithelial injury10–12 keratocyte apoptosis
of variable degree was described. However,
treatment-related keratocyte apoptosis might be
an issue because of the presumptive role of
keratocyte apoptosis in the pathogenesis of
keratoconus.8
The state of the keratocytes was assessed 24 h
following UVA-irradiation because then there is the
maximum degree of cell damage as has been shown
previously.16 To determine possible cell death, we first
conducted trypan-blue staining followed by Yopro
staining.14 Both stains are positive in the nuclei of
damaged cells without interfering with cell viability,
whereas undamaged endothelial cells are impervious to
these dyes. The DNA-intercalant dye Yopro is also
able to detect minor damage like in apoptotic cells
due to its relatively low molecular weight (MW 629
vs 961).14 Yet, as the threshold for both Yopro and
trypan blue was congruent, and at the same dose
level, the cellular damage in the present in vitro
experiment is obviously mainly due to necrosis because
otherwise the Yopro stain should have been positive
already at lower irradiance levels than the one found by
trypan blue.
In conclusion, we have shown that combined
riboflavin/UVA-treatment leads to a 10-fold lower
threshold for keratocyte cytotoxicity at 0.5 mW/cm2
compared to 5 mW/cm2 after UVA-irradiation alone.
Using riboflavin/UVA in human corneas,
keratocyte damage can be expected down to a
depth of 300 mm using 3 mW/cm2 surface irradiance.
Although no corneal thinning or scarring due to
keratocyte loss has been observed so far in a
4-year-clinical trial,1 a long-term study including
confocal in vivo microscopy in humans after
riboflavin/UVA-treatment is currently underway to
evaluate the depth of the keratocyte loss, the
repopulation process, and to exclude reliably the
development of treatment-related stromal scarring,
haze, or thinning in humans.
G Wollensak et al
5
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Eye
Basic Investigations CORNEA
43
Volume 23, Number 1
January 2004
Keratocyte Apoptosis After Corneal
Collagen Cross-linking Using
Riboflavin/UVA Treatment
Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Michaela Wilsch, PhD, and
Theo Seiler MD, PhD
Abstract
Purpose:
Combined riboflavin/UVA treatment inducing collagen cross-links in the cornea has been shown to
increase the biomechanical rigidity of the cornea
and has been used successfully in the treatment of
progressive keratoconus. The current study was
undertaken to investigate the possible cytotoxic effect of combined riboflavin/UVA treatment on corneal keratocytes in vivo.
Methods:
Thirty-four New Zealand white rabbits were treated
with 0.1% riboflavin solution and surface UVA irradiances ranging from 0.75 to 4 mW/cm2 (1.35–
7.2 J/cm2) for 30 minutes. The animals were euthanized either 4 (n = 6) or 24 (n = 28) hours postoperatively. Four additional control eyes underwent
epithelial debridement alone. The corneas of the
enucleated eyes were evaluated in routine histologic sections. In addition, the TUNEL technique
and transmission electron microscopy were used
for the detection of keratocyte apoptosis.
Results:
In the control eyes with corneal epithelial debridement only, apoptotic keratocytes were found in the
anterior 50 µm of the corneal stroma 4 hours postoperatively. However, riboflavin/UVA-induced apoptosis was only visible in the rabbit eyes enucleated 24 hours postoperatively. In these eyes, we
found apoptosis of keratocytes down to a variable
stromal depth depending on the applied UVA irradiance. A cytotoxic UVA irradiance for keratocytes
in the range of 0.5–0.7 mW/cm2 could be deduced.
Conclusions:
Riboflavin/UVA treatment leads to a dosedependent keratocyte damage that can be expected
in human corneas down to a depth of 300 µm using
a surface UVA dose of 5.4 J/cm2. Future studies
should be done to examine the keratocyte repopulation and exclude possible adverse sequelae of
keratocyte loss like stromal scarring or thinning.
Key Words: UVA radiation, cross-linking, keratocytes, riboflavin, cornea, apoptosis
(Cornea 2004;23:43–49)
C
ollagen cross-linking in the cornea using
UVA and the photosensitizer riboflavin was developed by us recently for biomechanically strengthening the cornea. In a
prospective clinical pilot study including
22 patients with progressive keratoconus
and a follow-up of up to 4 years, the progression of keratoconus could be stopped in
all treated eyes. Even regression with a reduction of the maximal keratometry readings
by 2 diopters was achieved in 70% of patients. Corneal and lens transparency as well
as endothelial cell density remained unchanged.1 In stress-strain measurements of
human, rabbit, and porcine cornea,2–4 we
could show a significantly increased biomechanical rigidity. After exposure to collagenases that play a role in both keratoconus and
corneal ulceration, a significant delay in enzymatically induced tissue dissolution by 8
days was found in cross-linked corneas indicating an increased resistance to enzymatic
digestion.5 Other applications of the new
cross-linking method lie in the treatment of
corneal melting processes6 and in the field of
refractive surgery like prevention of postoperative keratectasia after LASIK for high
myopes or regression of the refractive effect.7
As part of an extensive safety evaluation of the new treatment, we have undertaken the following experimental study to
assess the possible damage to the keratocytes after combined riboflavin/UVA treatment.
Received for publication
February 6, 2003; revision
received July 9, 2003; accepted
August 15, 2003.
From the Department of
Ophthalmology, Technical
University of Dresden, Dresden,
Germany (Drs. Wollensak and
Spoerl); Max-Planck-Institute for
Cell Biology and Genetics,
Dresden, Germany (Dr. Wilsch);
and the Department of
Ophthalmology, University of
Zurich, Zurich, Switzerland (Dr.
Seiler).
Reprints: Gregor Wollensak,
MD, Wildentensteig 4, D-14195
Berlin, Germany (e-mail:
[email protected]).
Copyright © 2003 by
Lippincott Williams & Wilkins
44
CORNEA Wollensak et al
Volume 23, Number 1
January 2004
MATERIAL AND METHODS
Thirty-eight eyes of 38 female New
Zealand white rabbits weighing 2–2.5 kg
were used. Thirty-four eyes of 34 rabbits
were treated with central epithelial abrasion,
riboflavin, and varying UVA irradiances (see
below). Four control eyes in 4 rabbits were
treated with corneal abrasion alone. The animals were divided into 2 subsets depending
on the postoperative time interval of either 4
or 24 hours, respectively:
1. Six rabbits were irradiated with a surface
UVA irradiance ranging from 0.75 to 4
mW/cm2 (0.75, 1.5, 3, and 4 mW/cm2)
(Table 1). These animals were all euthanized 4 hours postoperatively. Two additional rabbits underwent corneal epithelial debridement alone and were euthanized 4 hours postoperatively as well
(n = 8).
2. Twenty-eight rabbits treated with riboflavin and irradiated with a surface UVA irradiance ranging from 0.75 to 4 mW/cm2
(0.75, 1.5, 1.88, 2.25, 2.62, 3, and 4
mW/cm2) (Table 1) were euthanized 24
hours postoperatively. Two additional rabbits underwent corneal epithelial debridement alone and were euthanized 24 hours
postoperatively as well (n = 30).
mg/kg) and 0.5 mL xylazine hydrochloride
(5 mg/kg) were used. In each rabbit, only the
right eye was exposed to UV radiant energy.
A lid speculum was placed. After removal of
the central 5-mm portion of the epithelium
using a blunt crescent knife, riboflavin (vitamin B2) photosensitizer solution containing
0.1% riboflavin-5-phosphate and 20% dextran T-500 was dropped onto the cornea 5
minutes before the irradiation to achieve
good corneal penetration of the solution and
every 5 minutes during the irradiation. The
eyes were irradiated with UVA (370 nm) for
30 minutes using a double UVA diode (Roithner Lasertechnik, Vienna, Austria) at a distance of 1 cm from the cornea. Three 1.3-V
accumulators were used as a power generator. Before the treatment, the desired surface irradiance in the range from 0.75 to 4
mW/cm2 (Table 1) was controlled with a
calibrated UVA meter (LaserMate-Q, LASER
2000, Wessling, Germany) at a 1-cm distance
and if necessary regulated with a potentiometer. The animals were euthanized 4 or 24
hours postoperatively with general anesthesia using an overdose of intravenous sodium phenobarbital. All animal procedures
were approved by the ethics committee and
conformed to the ARVO Resolution on the
Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
Cross-linking Treatment
Tissue Preparation
General anesthesia was performed with
a subcutaneous injection of a mixture of diazepam and atropine (1 mg). For premedication, 1.5 mL ketamine hydrochloride 10% (35
The rabbit eyes enucleated 4 or 24
hours postoperatively were bisected. One
half was fixed in 4% neutral-buffered formalin
for light microscopy and the other half was
Study Design
TABLE 1. Depth of Keratocyte Loss in Relation to UVA Irradiance
Group
n
Surface UVA Irradiance
(mW/cm2)
Depth of Keratocyte Loss
(µm)
Calculated Cytotoxic UVAIrradiance (mW/cm2)
1
2
3
4
5
6
7
3
6
5
3
3
5
3
4
3
2.62
2.25
1.88
1.5
0.75
350
300
260
200
170
130
80
0.63
0.61
0.66
0.77
0.76
0.75
0.49
© 2003 Lippincott Williams & Wilkins
Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking CORNEA
Volume 23, Number 1
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immersed in 2% glutaraldehyde for transmission electron microscopy (TEM). For light microscopy, 4-µm thin paraffin sections were
stained with hematoxylin-eosin and periodic
acid–Schiff (PAS). The specimens were evaluated using a Zeiss light microscope (Axioskop) at 40- to 1000- fold magnification.
The depth of the damaged zone with loss of
keratocytes, and few remaining apoptotic
keratocytes was measured using a special
morphometry reticule
For transmission electron microscopy,
small pieces of the central cornea were postfixed in 4% osmium tetroxide, dehydrated,
and embedded in Epon resin. After observation of the semithin sections stained with toluidine blue, 50–70-nm ultrathin sections
were prepared, mounted on copper grids,
contrasted with uranyl acetate and lead citrate, and assessed using the Morgagni 268D
electron microscope (Philips) at 3500–
34,000× magnification.
TUNEL Assay
To detect apoptosis with DNA strand
breaks in situ, terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT) mediated dUTP-biotin nick
end labeling (TUNEL) was performed essentially as described previously.8 In brief, after
the quenching of endogenous peroxidase,
sections were incubated with TdT buffer (30
mN Tris, 140 mmol/L sodium cacodylate, 1
mmol/L cobalt chloride) at pH 7.2 and incubated with 0.3 u/mL TdT (Sigma, München,
Germany) and biotinylated-dUTP (1:200;
Boehringer, Mannheim, Germany) in TdT
buffer for 60 minutes at 37°C. Labeled nuclei
were detected with Vectastain ABC (Vector
Labs, Burlingame, CA) and peroxidase activity was visualized by 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) to yield a reddish brown reaction product. The sections were lightly
counterstained with hematoxylin. As a positive control, tissue sections of follicular hyperplasia of the appendix were used and
gave the expected positive staining of
tingible bodies in the germinal centers.
Calculation of Cytotoxic UVA
Irradiances and Doses
The cytotoxic UVA irradiance was determined by correlating the depth of the
keratocyte loss with the corresponding UVA
irradiances reached at the specific stromal
depth that were calculated according to the
equation Idepth = I surface · e(−dµ) (Lambert-Beer
law) using the absorption coefficient µ of 53
cm−1 that was found by us in earlier UVA
transmission measurements following riboflavin treatment (Table 1).4,9 Irradiation doses
(J/cm2) were calculated from the UVA irradiances (mW/cm2) by multiplying the value
with the irradiation time in seconds (30 ×
60).
RESULTS
Light Microscopy and TUNEL Assay
In the 6 cross-linked corneas, all euthanized 4 hours postoperatively and the 4 control eyes with corneal abrasion alone, euthanized 4 or 24 hours postoperatively, only
scattered apoptotic keratocytes were present
down to a depth of 50 µm in the anterior
stroma as shown by light microscopy in the
TUNEL-stained sections and on transmission
electron microscopy.
In the 28 cross-linked corneas, all euthanized 24 hours postoperatively, a massive
loss of keratocytes with an almost acellular
zone and some remaining apoptotic, TUNELpositive, or completely destroyed necrotic
cells were observed in variable depths of the
corneal stroma correlating with an increasing
surface UVA irradiance (Figs. 1, 2A–C, 3A;
Table 1). All these changes were only present
in the treated area with a sharp transition
zone toward the normal-appearing adjacent
tissue without treatment (Fig. 2C). Some regenerating thinned epithelium was present
over the edges of the lesion as some epithelial migration had already taken place in the
deepithelialized treatment zone within 24
hours (Fig. 2C).
Transmission Electron Microscopy
Irradiated apoptotic keratocytes revealed apoptotic changes like formation of
45
46
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January 2004
FIGURE 1. Scheme illustrates the depth of keratocyte loss depending on surface UVA irradiance.
apoptotic bodies, chromatin condensation,
and cell shrinkage (Figs. 3B,C).
Cytotoxicity
The cytotoxicity level for keratocytes
was calculated for the various stromal depths
according to the Lambert-Beer law (see
above) and found to be in the range of 0.49–
0.77 mW/cm2 irradiance corresponding to
UVA doses of 0.86–1.39 J/cm2 (Table 1).
DISCUSSION
The current study has shown significant keratocyte damage after combined
riboflavin/UVA cross-linking treatment correlating closely with the level of UVA irradiance
(Figs. 1 and 2; Table 1). Using the LambertBeer law and the absorption coefficient of 53
cm−1 for the UVA irradiation in riboflavintreated cornea,4,9 we were able to deduce a
cytotoxic irradiance threshold for keratocytes in the range of 0.5–0.7 mW/cm2 from
the depth of the keratocyte loss and the corresponding irradiance levels.
In the eyes of the irradiated animals that
had been euthanized 4 hours postoperatively
and in the deepithelialized control eyes, keratocyte apoptosis was located only in the anterior 50 µm, whereas in the irradiated ani© 2003 Lippincott Williams & Wilkins
mals euthanized 24 hours postoperatively,
extended and deep keratocyte loss and apoptosis was found. Obviously, in the cases euthanized 4 hours postoperatively, keratocyte
apoptosis was of the immediate type10,11 and
only due to epithelial scraping, as has been
described by others after corneal deepithelialization. 12,13 Accordingly, in the eyes
enucleated 24 hours postoperatively, a more
delayed type of apoptosis was found that was
due to UVA.10,11 Riboflavin by itself is not
cytotoxic, but as a photosensitizer, it increases the absorption of UVA, which induces the cellular damage.14
Similar UVA-induced keratocyte damage has been reported after UVA irradiation
without a photosensitizing agent. Using pigmented rabbits, Pitts et al15 found a corneal
damage threshold at the surface UVA dose
(365 nm) of 42.5 J/cm2. Our relatively low
cytotoxic UVA surface dose in the range of
1.35–7.2 J/cm2 can be explained by the multiplying effect on the UVA absorption by riboflavin.14 UVB-induced keratocyte loss can
be found already at lower dose levels because
of the shorter wavelength of UVB with a correspondingly higher energy content.
Histologically, keratocyte damage was
observed, especially in the anterior onefourth of the albino rabbit cornea after expo-
Volume 23, Number 1
January 2004
FIGURE 2. Light micrograph (A) and schematic diagram (B) of keratocyte loss and apoptosis down
to 100 µm 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 0.75 mW/cm2 (hematoxylin and
eosin, ⳯200). Light micrograph (C) and schematic diagram (D) of keratocyte loss and apoptosis
down to 170 µm 24 hours after irradiation with surface UVA irradiance of 1.88 mW/cm2 (hematoxylin and eosin, ⳯200). Light micrograph (E) and schematic diagram (F) of transition from the
irradiated area with a total keratocyte loss across the entire stroma 24 hours after irradiation with
surface UVA irradiance of 4 mW/cm2 (hematoxylin and eosin, ⳯200) to the adjacent normal cornea.
Thinned healing epithelium migrating from the right side.
47
48
Volume 23, Number 1
January 2004
FIGURE 3. A: TUNEL-positive apoptotic keratocytes (arrowheads) in the posterior half of the
cornea 24 hours after irradiation with surface
UVA irradiance of 4 mW/cm2 (oil immersion,
⳯1000). B: Apoptotic cell bodies, chromatin
condensation, and cell shrinkage in the central
keratocyte 24 hours after irradiation surface UVA
irradiance of 4 mW/cm2 (TEM, uranyl acetate
and lead citrate, ⳯3500). The frame delineates
the portion that is shown magnified in C. C:
Higher magnification of the apoptotic keratocyte
illustrates apoptotic cell bodies (TEM, uranyl acetate and lead citrate, ⳯34,000).
sure to 290–350 nm UVB irradiation over 15
minutes.16 After UVB irradiation of 0.12
J/cm2 at 280 nm and 0.47 J/cm2 at 310 nm,
other authors have reported extended UVinduced keratocyte apoptosis through the en© 2003 Lippincott Williams & Wilkins
tire thickness of the cornea 24 hours after the
treatment.17,18
The clinical importance of massive
keratocyte loss is not quite clear because the
keratocyte loss can usually be repaired by repopulation from migrating keratocytes of the
adjacent cornea.12,19 In other treatment modalities like corneal abrasion,20–22 PRK,12,19
LASIK,12,19,23 and epikeratophakia24 or diseases like keratoconus25 and herpes,26 keratocyte loss of variable extension has been reported in recent years having a possible influence on scarring, haze, 27 or corneal
thinning.20,25 However, in our clinical study,
we have not observed any change in transparency or corneal thickness after the crosslinking treatment.1 Application of the apoptosis inhibitor zinc chloride is not helpful28
because then the wanted cross-linking effect
would also be weakened.14
In conclusion, we have shown that
combined riboflavin/UVA cross-linking treatment leads to a dose-dependent keratocyte
apoptosis at 0.86–1.39 J/cm2 and can be expected in human corneas of 500-µm thickness down to a depth of 300 µm using the
usual 3 mW/cm 2 surface irradiance (5.4
J/cm2 surface dose). A clinical long-term
study using confocal in vivo microscopy29 after riboflavin/UVA treatment is currently underway to evaluate the depth of the keratocyte loss and the repopulation process and to
exclude the development of treatmentrelated stromal scarring, haze, and thinning
in humans.
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49
Endothelial cell damage after riboflavin–
ultraviolet-A treatment in the rabbit
Gregor Wollensak, MD, Eberhard Spoerl, PhD, Michaela Wilsch, PhD, Theo Seiler, MD, PhD
Purpose: To evaluate the possible cytotoxic effect of combined riboflavin– ultraviolet-A (UVA) treatment on the corneal endothelium.
Setting: Department of Ophthalmology, Technical University of Dresden,
Dresden, Germany.
Methods: The right eyes of 34 New Zealand White rabbits were treated with riboflavin and various endothelial UVA doses ranging from 0.16 to 0.9 J/cm2 (0.09 to
0.5 mW/cm2, 370 nm) and postoperative enucleation times of 4 hours and 24
hours. The endothelial cells were evaluated in histological sections. The terminal
deoxynulceotidyl transferase deoxy-UTP-nick-end labeling (TUNEL) technique and
transmission electron microscopy were used to detect apoptosis.
Results: There was no endothelial damage in the 6 rabbit eyes enucleated at
4 hours. In those enucleated at 24 hours, there was significant necrosis and apoptosis of endothelial cells in the corneas treated with an endothelial dose of
ⱖ0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2), which is about twice the endothelial UVA dose used
in the treatment of keratoconus patients.
Conclusions: In rabbit corneas with a corneal thickness less than 400 ␮m, the
endothelial UVA dose reached a cytotoxic level of ⱖ0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2)
using the standard surface UVA dose of 5.4 J/cm2 (3 mW/cm2). Pachymetry
should be routinely performed before riboflavin–UVA treatment; in thinner corneas, irradiation should not be done because of the cytotoxic risk to the
endothelium.
J Cataract Refract Surg 2003; 29:1786 –1790 © 2003 ASCRS and ESCRS
C
ollagen cross-linking in the cornea using combined
riboflavin– ultraviolet-A (UVA) treatment leads to
a significant increase in mechanical stiffness, as shown in
stress-strain measurements1–3 and increased resistance
to collagenases.4 The treatment’s main clinical use is in
progressive keratoconus,5 corneal ulcers,6 and before laser in situ keratomileusis in eyes with high myopia to
Accepted for publication February 13, 2003.
Dresden (Wollensak, Spoerl), and Max-Planck-Institute for Cell Biology
and Genetics (Wilsch), Dresden, Germany, and the Department of Ophthalmology, University of Zurich (Seiler), Zurich, Switzerland.
None of the authors has a financial interest in any product mentioned.
Reprint requests to Priv.-Doz. Dr. med. Gregor Wollensak, University
Eye Clinic Dresden, Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany.
E-mail: [email protected].
© 2003 ASCRS and ESCRS
Published by Elsevier Inc.
reduce the risk for postoperative myopic regression or
iatrogenic keratectasia.
Preservation of the endothelium is crucial for every
treatment involving the cornea; 400 to 800 endothelial
cells/mm2 is the minimum endothelial cell count for a
clear cornea.7 However, the risk involved in the new
method of cross-linking is unknown and a major concern that must be clarified before the technique can be
applied on a larger scale. In this experimental study, we
evaluated the cytotoxic damage to the corneal endothelium after riboflavin–UVA treatment.
Materials and Methods
Rabbit Eyes
In the experiments, 36 right eyes of 36 female New
Zealand White rabbits weighing 2.0 to 2.5 kg were used.
0886-3350/03/$–see front matter
doi:10.1016/S0886-3350(03)00343-2
LABORATORY SCIENCE: ENDOTHELIAL CELL DAMAGE AFTER CROSS-LINKING
The animals were divided into 2 groups: 7 rabbits killed
4 hours postoperatively and 29 rabbits killed 24 hours
postoperatively.
In the first group, 2 rabbits were irradiated with an endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2 (irradiance 0.36 mW/cm2);
1 with 0.9 J/cm2 (0.5 mW/cm2); 2 with 0.33 J/cm2
(0.18 mW/cm2), which was equivalent to the endothelial
UVA intensity used in humans; and 1 with 0.16 J/cm2 (0.09
mW/cm2) (Table 1). These animals (n ⫽ 6) were killed 4
hours postoperatively. One additional rabbit received a corneal abrasion only and was also killed at 4 hours.
In the second group, 28 rabbits treated with riboflavin
and irradiated with an endothelial UVA dose ranging from
0.16 to 0.9 J/cm2 (irradiance 0.09 to 0.5 mW/cm2) (ie, surface epithelial doses of 1.35, 2.7, 3.4, 4.0, 4.7, 5.4, and
7.2 J/cm2 [irradiance 0.75, 1.5, 1.88, 2.25, 2.62, 3.0, and
4.0 mW/cm2]) (Table 1) were killed 24 hours postoperatively.
One additional rabbit received a corneal abrasion only and
was also killed at 24 hours.
Treatment Procedure
General anesthesia was induced with a subcutaneous injection of a mixture of diazepam (1 ampule Faustan威) and
atropine (1⁄2 ampule, 1 mg). For premedication, 1.5 mL ketamine hydrochloride 10% (Rompun威) (35 mg/kg) and
0.5 mL xylazine hydrochloride (5 mg/kg) were used. The
rabbits were placed on the left side with the left eye closed; the
right eye was held open with a lid holder (Figure 1). The
central 5.0 mm portion of the epithelium was removed with a
blunt hockey knife; 5 minutes before the irradiation, a riboflavin photosensitizer solution containing 0.1% riboflavin-5phosphate and 20% dextranT-500 was placed on the cornea
to achieve good corneal penetration of the solution; this was
repeated every 5 minutes during the irradiation. The eyes were
exposed to a surface UVA (370 nm) irradiance ranging
from 0.75 to 4.0 mW/cm2 (Table 1) for 30 minutes using
a double UVA diode (Roithner Lasertechnik) 1.0 cm from the
cornea (Figure 1). The respective endothelial UVA irradiances
Figure 1. (Wollensak) Irradiation procedure showing a double UVA
diode 1.0 cm from the riboflavin-treated rabbit cornea.
between 0.09 and 0.50 mW/cm2 were calculated according to
the equation Idepth ⫽ I surface ⫻ e(⫺d␮), where depth (d) was
400 ␮m and the UVA-absorption coefficient (␮) was
53 cm⫺1, determined in earlier UVA-transmission measurements following riboflavin treatment.2 Before treatment, the
desired irradiance was controlled with a calibrated UVA meter
(LaserMate-Q, Laser 2000) at 1.0 cm and, if necessary, regulated with a potentiometer.
In the animals killed after 4 hours, anesthesia was maintained with supplemental injections. The other animals were
killed under general anesthesia with an overdose of sodium
phenobarbital 24 hours postoperatively. All animal procedures were approved by the ethics committee and conformed
to the ARVO Statement for Use of Animals in Ophthalmic
and Vision Research.
Tissue Preparation
After enucleation, the rabbit eyes were bisected and
fixed in neutral buffered 4% formalin for light microscopy
Table 1. Treatment groups, surface epithelial and endothelial UVA irradiance, and endothelial cytotoxicity in rabbits (only animals with 24
hours post-mortem).
Group
Number
of Animals
Surface Epithelial
UVA Irradiance
(mW/cm2)
Endothelial
UVA Irradiance
(mW/cm2)
Endothelial
Cytotoxicity
1
3
4.0
0.50 ⫾ 0.07
⫹⫹⫹
2
6
3.0
0.36 ⫾ 0.04
⫹⫹⫹
3
5
2.62
0.32 ⫾ 0.04
0
4
3
2.25
0.27 ⫾ 0.03
0
5
3
1.88
0.23 ⫾ 0.03
0
6
5
1.5
0.18 ⫾ 0.02
0
7
3
0.75
0.09 ⫾ 0.01
0
1787
and 2% glutaraldehyde for transmission electron microscopy
(TEM).
For light microscopy, 4 ␮m paraffin sections were stained
with hematoxylin and eosin. The specimens were analyzed
using a Zeiss light microscope (Axiomat) at ⫻20 to ⫻1000
magnification.
For electron microscopy, small pieces of central cornea
were postfixed in 4% osmium tetroxide, dehydrated, and embedded in Epon resin. Semithin sections were stained with
toluidine blue. Ultrathin sections of 50 to 70 nm were contrasted with uranyl acetate and lead citrate and assessed using
the Morgagni 268D electron microscope (Philips) at ⫻2800
magnification.
TUNEL Assay
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyUTP-nick-end labeling for detecting apoptosis was performed essentially as described by Ihling et al.8 Briefly, after
the endogenous peroxidase was quenched, sections were incubated with TdT buffer (30 mN TRIS, 140 mM sodium cacodylate, 1 mM cobalt chloride) at pH 7.2 and incubated with
0.3 eu/mL TdT (Sigma) and biotinylated-dUTP (1:200;
Boehringer) in TdT buffer for 60 minutes at 37°C. Labeled
nuclei were detected with Vectastain ABC (Vector Labs),
and peroxidase activity was visualized by 3-amino-9-ethylcarbazole to yield a reddish-brown reaction product. The
sections were lightly counterstained with hematoxylin. As
a positive control, tissue sections of follicular hyperplasia of
the appendix were used. Negative control slides were also
included.
Figure 2. (Wollensak) Complete endothelial cell loss in the treatment zone with sharp demarcation toward untreated area (arrow)
(endothelial UVA dose of 0.9 J/cm2).
Pachymetry
The central corneal thickness of the rabbit corneas was
determined preoperatively using an ultrasound pachymeter
(Pachette, Technomed).
Figure 3. (Wollensak) TUNEL-positive apoptotic endothelial cell
(arrow) (endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2, original magnification
⫻100, oil immersion).
Results
Histology
In the 6 treated animals killed at 4 hours and the
2 cases with corneal epithelial debridement alone, neither TUNEL-positive endothelial cells nor loss of endothelium was observed.
In the animals killed at 24 hours, significant endothelial cell necrosis with complete loss of endothelial
cells (Figure 2) and a few remaining apoptotic endothelial cells were observed in the treatment area in the
eyes that had an endothelial UVA dose of 0.9 J/cm2
(0.5 mW/cm2) and of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2),
which was twice as high as the therapeutic endothelial dose in humans of 0.32 J/cm2 (0.18 mW/cm2)
(Table 1).
1788
In the animals exposed to an endothelial UVA dose
of 0.16 to 0.58 J/cm2 (0.09 to 0.32 mW/cm2), the endothelial cells were intact.
TUNNEL Assay and TEM
Using the TUNEL-straining, the few remaining
endothelial cells in the 2 groups (0.9 J/cm2 and
0.65 J/cm2) were TUNEL-positive, showing brown
nuclear staining (Figure 3).
On TEM, apoptotic endothelial cells showed typical features of apoptosis-like chromatin condensation,
formation of apoptotic bodies, and cell shrinkage
(Figure 4).
Figure 4. (Wollensak) Apoptotic endothelial cell with apoptotic
bodies and chromatin condensation (TEM, original magnification
⫻2800) (endothelial UVA dose of 0.65 J/cm2).
Pachymetry
The mean central corneal thickness was 400 ␮m ⫾
20 (SD).
Discussion
This study showed a specific threshold-like cytotoxic effect of combined riboflavin–UVA treatment on
corneal endothelium starting at an endothelial UVA
dose of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2). Using the absorption coefficient of 53 cm⫺1, which we found in earlier
UVA-transmission measurements following riboflavin
treatment,2 it can be calculated that in human corneas
thinner than 400 ␮m, the cytotoxic endothelial UVA
irradiance of 0.36 mW/cm2 is reached using the standard surface irradiance of 3.0 mW/cm2.
Fortunately, the cytotoxic threshold is not reached
in normal corneas with an average corneal thickness
of 540 ␮m or in most keratoconus patients (410 to
470 ␮m).9 However, in corneal ulcers and advanced
keratoconus, the corneal thinning may be beyond this
limit. In such cases, riboflavin–UVA treatment should
be avoided and alternative methods such as amnion
transplantation for ulcers or keratoplasty for keratoconus considered. Alternatively, in thinner corneas with at
least 350 ␮m corneal thickness, a reduced surface UVA
dose of 3.6 J/cm2 (2 mW/cm2), which is the lowest dose
to produce a significant mechanical stiffening effect1
and increase resistance to enzymatic digestion,4 might
be tried cautiously; the endothelial UVA dose would
then be only 0.54 J/cm2 (0.3 mW/cm2). In addition, in
keratoconus patients with extreme thinning in a small
area only, the treatment might be used because the endothelial cell loss in a small circumscribed area might be
compensated for by the migration of adjacent undamaged endothelial cells.
The observed cytotoxic effect on the endothelium
appeared to be due to the combined effect of UVA and
the photosensitizer riboflavin, which increases UVA absorption in the cornea to 95%2 compared to 32% without riboflavin.10 From in vivo irradiation experiments in
animal eyes, it is known that UVA irradiation (320 to
400 nm) alone can induce endothelial cell damage only
after a relatively high surface UVA dose of 42.5 J/cm2
(5.4 J/cm2 in our experiment).11,12 In addition, in cell
culture experiments with combined riboflavin/light
treatment, a significant cytotoxic effect on bovine corneal endothelial cells was observed after application of a
minimum riboflavin solution of 50 ␮M and 2 hours of
white-light irradiation; riboflavin or white light alone
produced no damage in the cells.7 Endothelial damage
was also reported in cases with solar keratitis13 with a
surface ultraviolet-B (UVB) dose between 0.12 and
0.56 J/cm2.14 In rabbit corneas exposed to 310 nm UVB
with 0.47 J/cm2, TUNEL-positive endothelial cells were
found 24 hours later.15 The extensive damage after exposure to UVB is explained by the shorter UVB wavelength, with a correspondingly higher energy content.
In the animals killed at 4 hours, no apoptotic endothelial cells were observed, whereas maximum cytotoxic
damage was found at 24 hours, as described after UVA
irradiation; this so-called delayed type of apoptosis15–18
is in contrast to the immediate type of apoptosis observed in keratocytes after epithelial scraping.19,20
In conclusion, this study demonstrated that combined riboflavin–UVA treatment should be safe for the
endothelium as long as the dose is less than the endothelial cytotoxic dose of 0.65 J/cm2. In human corneas,
the endothelial cytotoxic UVA dose is only reached in
corneas thinner than 400 ␮m. Therefore, pachymetry
measurements should be performed routinely before riboflavin/UVA treatment to identify unsuitable cases.
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Ophthalmologe
2000 · 97:203–206 © Springer-Verlag 2000
Hornhaut: Kurzmitteilung
Eberhard Spörl1 · Jana Schreiber1 · Kerstin Hellmund1 · Theo Seiler1 · Peter Knuschke2
1Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde,Universitätsklinikum TU Dresden
2Klinik für Dermatologie,Universitätsklinikum TU Dresden
Untersuchungen zur
Verfestigung der Hornhaut
am Kaninchen* **
Zusammenfassung
Hintergrund: Eine mechanische Stabilisierung der Hornhaut beim Keratokonus könnte das Fortschreiten dieser Erkrankung verzögern.Die an der Hornhaut von enukleierten Schweineaugen optimierten Vernetzungsmethoden zur Erhöhung der Festigkeit
wurden im Langzeitversuch am Kaninchenmodell auf Beständigkeit und biologische
Verträglichkeit getestet.
Methode: Von 28 Kaninchen wurde das
rechte Auge behandelt, das linke Auge diente jeweils als Kontrolle.Nach der mechanischen Entfernung des Epithels wurden 19
Augen mit Riboflavin-Dextranlösung getropft und anschließend mit UV-Strahlung
(365 nm, Bestrahlungsstärke 2 mW/cm2) für
45 min exponiert.Auf 9 Augen wirkte ein Gemisch aus Methocel und 0,075% Glutaraldehyd für 20 min ein.Die Reaktion der Hornhaut wurde mit der Spaltlampenphotographie dokumentiert.Nach 1 Monat wurden 20
Tiere und nach 3 Monaten 8 Tiere getötet,
die Augen enukleiert und von Streifen (Breite 5 mm, Länge 8 mm) der Hornhäute der
Spannungs-Dehnungszusammenhang gemessen.
Ergebnisse: Vier Wochen nach der Vernetzung konnte eine signifikant höhere Festigkeit in den mit Riboflavin+UV behandelten
Hornhäuten nachgewiesen werden.Die vernetzten und unvernetzten Hornhäute unterschieden sich bei einer Dehnung von 6% in
der Spannung um den Faktor 1,61±0,75
(p=0,041).Nach 12 Wochen lag diese Festigkeitszunahme noch bei 1,3±0,48 (p=0,07).
Es kam zu keiner sichtbaren Entzündungsreaktion oder Beeinträchtigung der Transparenz.Die mit Glutaraldehyd behandelten
Hornhäute wiesen zwar auch eine Zunahme
der Festigkeit auf (Faktor 1,3±0,66), aber der
Effekt war statistisch nicht signifikant
(p=0,319), sodass ein Langzeittest dieser
Methode nicht gerechtfertigt war.
Schlussfolgerungen: Die Kombination von
Riboflavin+UV-Strahlung ist geeignet zur
Erzeugung von mindestens temporären Vernetzungen in der Hornhaut bei Kaninchen
ohne klinische Zeichen für Nebenwirkungen
wie Trübung oder Entzündung.
Schlüsselwörter
Vernetzung · Cornea · Keratokonus ·
Riboflavin · Ultraviolette Strahlung
Beim Keratokonus kommt es infolge
der abnehmenden Festigkeit [1] zu einem Hervorwölben der Hornhaut, was
erhebliche funktionelle Konsequenzen
hat. Eine künstliche in-vivo Vernetzung
der Hornhaut mit gesicherter Verfestigung ergäbe eine sinnvolle Prävention von Keratektasien. Nachdem invitro Untersuchungen an enukleierten
Schweineaugen eine Zunahme der Festigkeit nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit Glutaraldehyd zeigte [17],sollen
beide Vernetzungstechniken am Tiermodell überprüft werden mit dem Ziel der
Einschätzung der Biokompatibilität und
der Dauer des Vernetzungseffektes.
Material und Methoden
D
ie Funktion von kollagenhaltigen
Strukturen besteht meist in der Aufrechterhaltung einer bestimmten Form
oder Stabilität, wobei hauptsächlich
der Vernetzungsgrad, der unter physiologischen Bedingungen enzymatisch
gesteuert wird, die mechanischen Eigenschaften bestimmt. Verstärkt treten
Vernetzungen beim Altersprozess [5, 6]
oder auch bei Diabetes [9, 14] auf. Diese können aber auch gezielt erzeugt
werden, um in vitro kollagene Biomaterialien [10, 13] und Implantate [2, 7]
zu stabilisieren. Dieses Verfahren hat
sich z.B. bei Epikeratoplasik [18], Herzklappen- [8] und Meniskusersatz [19]
sowie bei der Gewebevergrößerung
mit kollagenen Biomaterialien [16] bewährt. Erste in vivo Vernetzungen sind
in der Augenheilkunde bisher nur bei
der Photovernetzung von fibrinogenhaltigen Klebern im Tiermodell bekannt [4].
Hornhautexposition mit Riboflavin
Insgesamt 28 Kaninchen (weiße Neuseeländer) wurden entsprechend den
“Principles of laboratory animals care”
unter Anästhesie (1,5 ml Velonarkon®
und 0,5 ml Rompun®) monokular behandelt, wobei jeweils das Partnerauge
als Kontrolle diente. Nach der mechanischen Entfernung des Epithels der
Hornhaut unter dem OP-Mikroskop
wirkte bei 19 Kaninchen eine 0,11%ige
*Teile dieser Originalarbeit sind auf der 97.
Tagung der Deutschen Ophthalmologischen
Gesellschaft vorgetragen worden
**Gefördert durch die BrunenbuschStein-Stiftung
Dr. rer. nat. habil. E. Spörl
Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde,
Universitätsklinikum TU, Fetscherstr.74,
01307 Dresden
Der Ophthalmologe 3•2000
203
Ophthalmologe
2000 · 97:203–206 © Springer-Verlag 2000
E. Spörl · J. Schreiber · K. Hellmund ·
T. Seiler · P. Knuschke
Cross-linking effects in the cornea
of rabbits
Summary
Background: The mechanical stabilization of
the cornea in keratoconus may delay progression of this disease.The cross-linking
techniques optimized in corneas of enucleated porcine eyes were investigated under
in vivo conditions in rabbits to estimate the
biocompatibility and duration of the stiffening effect.
Methods: Twenty-eight rabbits were treated
monocularly, the fellow eye serving as control.The epithelium was mechanically removed and 19 eyes were treated with riboflavin plus ultraviolet irradiation (365 nm,
2 mW/cm2) for 45 min and 9 eyes with
0.075% glutaraldehyde for 20 min.After
treatment, the eyelids were sutured for 3
days.The healing process was controlled by
slit-lamp examination and photographically
documented.After 1 month, 20 animals and
after 3 months 8 animals were sacrificed, the
eyes enucleated, and the stress-strain relation of the corneas measured and compared
to the fellow eye.
Results: The epithelium was closed after 4-5
days.The transparency of the corneas remained clear during follow-up, and there
were no signs of inflammatory reaction.
Stress for a strain of 6% was higher in the
treated corneas by a factor of 1.3±0.66
(P=0.319) in the glutaraldehyde group and
by a factor of 1.6±0.75 (P=0.0408) in the riboflavin group at 1 month, and by 1.3±0.48
(P=0.07) at 3 months after treatment.
Conclusions: The cross-linking technique using riboflavin plus UV irradiation is suitable
for at least temporarily stiffening the cornea
in vivo and seems to be a promising method
for conservative treatment of keratectasia.
Riboflavinlösung (10,95 mg Riboflavin5-phosphat in 10 ml 20%iger Dextranlösung) für 5 min auf die Hornhaut ein.
Die sich anschließende UV-Bestrahlung
erfolgte bei einer Wellenlänge von
365 nm, die mittels einer Quecksilberdampflampe (HQE-40, EMI, Ilmenau)
und einem Interferenzfilter für 365 nm
mit 25 nm Halbwertsbreite erzeugt wurde. Deren Applikation mit einem Quarzlichtleiter ergab eine kreisförmige Fläche von 7 mm Durchmesser auf der
Hornhaut (Abb. 1). Die so erzeugte Bestrahlungsstärke von 2 mW/cm2 (gemessen mit dem UV-Leistungsmesser
LASER-MATE, Fa. Coherent, dessen Sensorempfindlichkeit für 365 nm mit einem von der Physikalisch-Technischen
Bundesanstalt kalibrierten Thermopile
überprüft wurde) wirkte für die Dauer
von 45 min auf die Hornhaut ein, wobei
alle 5 Minuten ein Tropfen Riboflavinlösung auf die Hornhaut getropft wurde,
um ein Austrocknen zu vermeiden. Anschließend wurde ein Antibiotikum
(Ofloxacin, Floxal® Augensalbe, Dr.
Mann Pharma) zur antibiotischen Abschirmung aufgetragen und das Lid mit
einer U-Naht für 3 Tage vernäht.
In Vorversuchen an Schweineaugen
wurde der Einfluss der Riboflavinkonzentration und der Bestrahlungszeit auf
die Festigkeitszunahme getestet, wobei
das Ergebnis unabhängig war von der
Riboflavinkonzentration im Bereich von
0,015% bis 0,15%, während Bestrahlungszeiten größer als 30 min einen signifikanten Effekt bewirkten. Um möglichst viel Bestrahlungsenergie in der
Hornhaut zu absorbieren (etwa 90%)
Abb.1 䉱 Behandlung mit Riboflavin und
UV-Bestrahlung, wobei die UV-Strahlung
über eine flexible Quarzfaser lokal begrenzt
appliziert wird
und damit die tiefer liegenden Gewebe
zu schützen sowie eine gleichmäßige
Vernetzung der Hornhaut zu erreichen,
wurde die Konzentration von 0,11% gewählt (Abb. 2).
Hornhautexposition mit
Glutaraldehyd
Bei der zweiten Technik (Abb. 3) kam ein
Gemisch aus Methocel und 0,075%
Glutaraldehyd bei 9 Kaninchen zur Anwendung, das für die Dauer von 20 min
auf die Hornhaut einwirkte. Das Methocel diente dabei nur zur Erhöhung der
Viskosität des Gemisches. Um nur den
zentralen Teil der Hornhaut zu vernetzen und ein Auslaufen des Gemisches
auf den Limbus zu verhindern, diente
Key words
Cross-links · Cornea · Keratoconus ·
Riboflavin · Ultraviolet radiation
Abb.2 䉱 Transmission der Hornhaut für 365 nm in Abhängigkeit von der Riboflavinkonzentration
204
ein aufgelegter Silikonring (Ø 7 mm ) als
Begrenzung. In Vorversuchen konnte die
Dichtheit dieses Ringes mit einem Methocel-Fluoreszeingemisch nachgewiesen werden.
Nach der Applikation wurde das
Glutaraldehyd entfernt, die Hornhaut
mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und die Nachbehandlung wie in
der UV-Gruppe durchgeführt.
Eine Untersuchung der Hornhaut
erfolgte mit der Handspaltlampe am 3.,
5. und 6. Tag sowie an der Spaltlampe
mit photographischer Dokumentation
am 4. Tag, nach 1 und 3 Monaten.
Nach 1 bzw. 3 Monaten wurden die
Kaninchen getötet, die Augen enukleiert
und aus den Hornhäuten vertikale Streifen 5x8 mm geschnitten. Die Dicke der
Hornhautstreifen wurde mit einem Ultraschallpachymeter gemessen. Nach einer
5minütigen Vordehnung der Streifen mit
einer Spannung von 104 N/m2, was einem
intraokularen Druck von etwa 9 mm Hg
entspricht, wurden die Spannungs-Dehnungsexperimente mit einem kommerziellen Materialtester (MINIMAT, Polymer
Laboratories) mit einer Dehnungsgeschwindigkeit von 1,5 mm/min und bis zu
einer Spannung von 5·105 N/m2 (50-faches
des physiologischen intraokularen
Druckes) durchgeführt.
Um die mechanischen Eigenschaften der behandelten und unbehandelten
Hornhaut zu vergleichen, wurden die
Spannungen, die für eine Dehnung von
e=6% notwendig waren, ausgewertet.
Das Verhältnis von s (behandelt)/s(unbehandelt) diente als Maß für die Verfestigungszunahme.
Die statistische Analyse basiert auf
dem WILCOXON-Rangtest, wobei pWerte kleiner als 0,05 als statistisch signifikant galten.
Ergebnisse
nicht verändert. Die Daten wurden photographisch dokumentiert.
Biomechanische Charakterisierung
Bei den Hornhäuten, die mit Glutaraldehyd vernetzt wurden, konnte zwar nach
4 Wochen eine Zunahme der Festigkeit
um den Faktor 1,3±0,66 nachgewiesen
werden. Dieser Effekt war statistisch
nicht signifikant (p=0,319). Aus diesem
Grund wurden die Versuche mit 12 Wochen Nachbeobachtungszeit nicht
durchgeführt. Nach Riboflavin+UV kam
es initial zu einer signifikanten Verfestigung, was die s(behandelt)/s(unbehandelt)-Werte (Tabelle 1) zeigen. Nach 1
Monat war das Verhältnis 1,61±0,75
(p=0,041) und nach 3 Monaten 1,3±0,48
(p=0,07).
Diskussion
Der Keratokonus und andere Formen
der Keratektasie sind progressive Erkrankungen, die wahrscheinlich auf einer Abnahme der Festigkeit der Hornhaut basieren [1]. Die morphologischen
und biochemischen Ursachen sind nicht
bekannt, obwohl Veränderungen der
Proteoglycane gefunden wurden [3, 20].
Auch eine erhöhte Menge an proteolytischen Enzymen und weniger Proteasehemmer wurden in Keratokonushornhäuten nachgewiesen [21]. Dabei ist
noch nicht klar, ob dies die primäre Ursache des Keratokonus ist oder eine sekundäre Reaktion.Andere morphologische Veränderungen wie Einrisse der
Bowman’schen Membran und eine Verdünnung des Stromas werden als sekundäre Effekte während des Prozesses der
Ektasie erklärt.
Um eine Erhöhung der Festigkeit zu
erreichen, wurden die in den in vitroUntersuchungen aussichtsreichsten Methoden Riboflavin+UV Strahlung bzw.
Abb.3 䉱 Applikation einer 0,075%igen
Glutaraldehydlösung, wobei ein Silikonring
eine Vernetzung der Hornhautperipherie
verhindert
Glutaraldehyd angewendet. Das Hauptergebnis dieser Untersuchungen ist eine
temporäre Festigkeitszunahme von etwa 50% nach Riboflavin+UV Behandlung ohne sichtbare Komplikationen wie
Trübung, Entzündung oder Katarakt.
Bereits nach dem Herausschneiden
der Hornhautstreifen konnte man schon
makroskopisch einen Unterschied zwischen der behandelten und unbehandelten Hornhaut feststellen, wie Abb. 4a-c
zeigt. Während die unbehandelten
Hornhautstreifen gerade herunterhingen mit zahlreichen Falten, behielten die
behandelten Streifen eine Restkrümmung, was nur mit einer Zunahme der
Scherspannung zu erklären ist. Somit
ändert sich mit der Vernetzung auch das
Biegeverhalten. Die einzelnen Kollagenlamellen sind durch die Vernetzung stärker miteinander verbunden, damit kann
ein Auseinandergleiten der Lamellen,
was auch bei der Entstehung einer Keratektasie diskutiert wird [12], verhindert werden.
Glutaraldehyd brachte bei den kurzen Behandlungszeiten keinen signifikanten Effekt, da es nur eine oberflächliche Hornhautschicht von etwa 200 µm
Epithelschluß und
Hornhauttransparenz
In der Gruppe der UV-bestrahlten Kaninchen war das Epithel nach dem 4. Tag
geschlossen. Bei den mit Glutaraldehyd
behandelten Hornhäuten konnte ein
Epithelschluss erst nach dem 5. Tag beobachtet werden, wobei sich eine geringe subepitheliale Trübung zeigte, die
sich aber wieder auflöste. Die Transparenz der Hornhaut war durch beide Behandlungsverfahren nach 4 Wochen
Tabelle 1
Festigkeitszunahme bei der Behandlung mit Riboflavin+UV-Bestrahlung
und bei Glutaraldehyd
Behandlungsverfahren
Zahl
Glutaraldehyd 0,075%/20 min 9
Riboflavin+UV 45 min
11
Riboflavin+UV 45 min
8
Nachbeobachtung
(Monate)
Festigkeitszunahme
(bei 6% Dehnung)
p-Wert
(WILCOXON)
1
1
3
1,3±0,66
1,61±0,75
1,3±0,48
0,313
0,041
0,07
205
5.
6.
7.
a
b
c
Abb.4a–c 䉱 Demonstration des Biegeverhaltens der Hornhaut.
(a) mit Glutaraldehyd behandelt, (b) mit Riboflavin und UV-Strahlung behandelt und (c) unbehandelt
vernetzt. Dies konnte an Schweinehornhäuten in-vitro fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden.Aus diesem
Grund erwies sich Glutaraldehyd für die
in-vivo Vernetzung von Keratokonushornhäuten als nicht geeignet [17]. Implantate könnten aufgrund der erhöhten
Einwirkungzeit möglicherweise erfolgversprechend mit Glutaraldehyd vorbehandelt werden [7, 8, 16, 19].Andererseits
ist zu erwarten, daß mit längerer Einwirkungszeit die Nebenwirkungen auf das
Hornhautendothel größer werden.
Um eventuelle Veränderungen des
Hornhautendothels, der Linse oder der
Retina durch die UV-Strahlung einschätzen zu können, wurde die Strahlenbelastung aus Transmissionsmessungen
abgeschätzt.
Abbildung 2 zeigt die Transmission
der Schweinehornhaut bei unterschiedlichen Riboflavinkonzentrationen.Aus der
Hornhautdicke, der verwendeten Riboflavinkonzentration von 0,11% und der
Bestrahlungsstärke von 2 mW/cm2 ergibt
sich eine Strahlenbelastung des Endothels von 100 µW/cm2.Aus der Transmissionsmessung der unbehandelten Hornhaut und der maximal (für UV-exponierte Arbeitsplätze) zulässigen Bestrahlungsstärke von 1 mW/cm2 [15] können
am Endothel etwa 500 µW/cm2 wirksam
werden.
Damit beträgt die Strahlenbelastung
des Endothels bei der UV-Vernetzung
nur etwa 20% der zulässigen Grenze, sodaß auch keine Gefahr für Linse oder Retina besteht.Vergleicht man die applizierte Bestrahlungsdosis von 5,4 J/cm2 mit
dem Grenzwert der Bestrahlungsdosis
von 42,5 J/cm2 für die Hornhaut bei
365 nm [11], so dürften keine Schädigungen zu erwarten sein. Der biomikroskopische Nachweis der Unschädlichkeit für
206
Endothelzellen muss aber noch erbracht
werden.
Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse scheint die Vernetzung mit Riboflavin und UV-Strahlung eine geeignete Methode zur sicheren Verfestigung der
Hornhaut zu sein. Infolge von Um- und
Abbauprozessen der Kollagene und Proteoglykane besteht mit der Zeit die Möglichkeit der Abnahme der Festigkeit. Es
sind weitere Untersuchungen notwendig,
um zu entscheiden, ob eine Wiederholung der Riboflavin und UV-Exposition
erforderlich ist.
Fazit für die Praxis
Experimentelle Untersuchungen an
Kaninchenaugen haben gezeigt, daß
mittels Exposition der Hornhaut mit Riboflavin in Kombination mit UV-Bestrahlung
eine mechanische Stabilisierung der Hornhaut bewirkt werden kann.Weitere Untersuchungen müssen noch zeigen, ob diese
Methoden zur Stabilisierung der Hornhaut
bei Keratokonus oder zur Vorbehandlung
von Spenderhornhäuten geeignet sind.
8.
9.
10.
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Nachtrag bei der Korrektur. Die Technik der
UV-Vernetzung wurde erheblich vereinfacht
durch den Ersatz der Quecksilberdampflampe, des Interferenzfilters und der Quarzfaser durch zwei UV-Leuchtdioden (370 nm,
750 mW), (Roithner Lasertechnik, Wien).
Ophthalmologe
1997 ´ 94:902±906 Springer-Verlag 1997
Hornhaut
Eberhard Spörl1 · Michael Huhle1 · Michael Kasper2 · Theo Seiler1
1
Augenklinik und Poliklinik, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden
2
Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Carl-Gustav-Carus, Technische Universität Dresden
Erhöhung der Festigkeit der
Hornhaut durch Vernetzung* **
Zusammenfassung
Hintergrund: Die biomechanische Festigkeit
der Hornhaut soll durch künstliche Quervernetzung der Kollagenfibrillen (Strahlenvernetzung, chemische Vernetzung) erhöht
werden, um eine evtl. konservative Therapie
des Keratokonus zu prüfen.
Methode: Von enukleierten Schweineaugen
wurde das Epithel entfernt. Je 10 Augen in
8 Testgruppen wurden mit UV-Strahlung
(l = 254 nm), einer 0,5 %igen Riboflavinlösung und UV-Strahlung (365 nm), blauem
Licht (436 nm) und Sonnenlicht sowie mit
chemischen Vernetzern ± Glutaraldehyd
(1 % und 0,1 %, 10 min) und KarnovskyLösung (0,1 %, 10 min) ± behandelt. Als
Standard dienten jeweils Kontrollgruppen
mit 10 unbehandelten Hornhäuten. Aus jeder Hornhaut wurde ein zentraler Streifen
von 5 mm Breite und 9 mm Länge geschnitten und die Spannungs-Dehnungs-Kurven
gemessen.
Ergebnisse: Bei UV-Bestrahlung von mit Riboflavin vorbehandelten Hornhäuten nimmt
die Dehnbarkeit signifikant ab (p < 0,05).
Auch die mit Glutaraldehyd oder KarnovskyLösung behandelten Hornhäute zeigen eine
signifikante Zunahme der Festigkeit
(p < 0,05).
Schluûfolgerung: UV-Strahlen und Riboflavin sowie niedrigkonzentriertes Glutaraldehyd oder Karnovsky-Lösung führen zu einer
Verfestigung der Hornhaut wahrscheinlich
aufgrund von Vernetzungen der Kollagene
oder der Proteoglykane. Weitere Untersuchungen sind jedoch bezüglich der Optimierung der Dosis-Wirkungs-Beziehung und der
In-vivo-Bedingungen erforderlich.
Schlüsselwörter
Hornhaut · Kollagen · Keratokonus · Proteoglykane · Vernetzung
902
Der Ophthalmologe 12´97
U
m die Form der Hornhaut zu verändern, z. B. beim Astigmatismus, bei der
Myopie und bei der Hyperopie, stehen
dem Augenarzt zahlreiche Therapieverfahren zur Verfügung. ¾ndern sich
aber die Hornhautform und -dicke, wie
z. B. beim Keratokonus, so bleibt als einzige kurative Therapie die Keratoplastik. Das Krankheitsbild des Keratokonus ist klar umschrieben. Biochemische
Untersuchungen zur Ursache des Keratokonus legen Veränderungen der Proteoglykane nahe [22, 23]. Biomechanische Untersuchungen weisen eine geringere Festigkeit der Hornhaut mit Keratokonus nach [2, 14].
Die molekulare Erklärung dieses
Festigkeitsverlusts ist noch unbefriedigend: So werden eine Verringerung der
Vernetzungen innerhalb der Kollagenmatrix, eine Reduzierung der Kontaktstellen zwischen benachbarten Proteoglykanen der Grundsubstanz oder auch
eine erhöhte Aktivität proteolytischer
Enzyme diskutiert [23]. Neue elektronenmikroskopische und Röntgenstrahlstreumessungen konnten im vorderen
Stoma beim Keratokonus das Fehlen
von solchen Lamellen nachweisen, die
benachbarte Fibrillenlagen durchkreuzen und miteinander verbinden [4, 16].
Gelänge es, eine biologisch verträgliche Methode zu entwickeln, die Hornhautfestigkeit zu stabilisieren bzw. zu
erhöhen, so könnte dies ein Ansatz für
eine konservative Therapie des Keratokonus darstellen.
Aus Polymerchemie und Biochemie ist bekannt, daû mit energiereicher
Strahlung (Infrarot-, Ultraviolett- und
Röntgenstrahlung) oder mit bestimmten chemischen Verbindungen Polymere vernetzt werden können. Milne u.
Zika [12] fanden eine Erhöhung der Viskosität einer Kollagenlösung nach UVBestrahlung. Die Vernetzung von Bindegewebe nimmt mit dem Alter zu und
tritt verstärkt beim Diabetes auf. Die
Vernetzung wird auch gezielt zur Erhöhung der Stabilität von kollagenen Biomaterialien für Bioprothesen, wie z. B.
Herzklappen, Blutgefäûe und Duraersatz, genutzt. In der Augenheilkunde
wurde über die erste Anwendung der
künstlichen Vernetzung bei der Herstellung von kollagenen Biomaterialien für
die synthetische Epikeratoplastik berichtet.
In unseren Untersuchungen prüften wir die Wirkung von chemischen
Vernetzern und von UV-Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge bezüglich
der Veränderung der biomechanischen
Eigenschaften der Hornhaut.
Material und Methode
Als Untersuchungsobjekte dienten
Schweineaugen, die 15±30 min postmortal im Schlachthof enukleiert und in der
Kühlbox bei + 10 C transportiert und
gelagert wurden. Die Messungen an der
Hornhaut erfolgten innerhalb von 8 h
postmortal, um evtl. autolytische Veränderungen so gering wie möglich zu
halten. Die intakten Bulbi wurden in einer 20 %igen Dextranlösung (Dextran
T 500, Pharmacia Biotech, Freiburg) gelagert, um die Hornhaut auf eine Dicke
von 0,8 mm zu dehydrieren. Die Dicke
der Hornhaut wurde ultraschallpachymetrisch bestimmt (Pachette, Technomed, Baesweiler).
*
Vortrag gehalten auf der 94. Tagung der
Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft
**
Unterstützt von der Brunenbusch-SteinStiftung, Stuttgart
Prof. Dr. Dr. T. Seiler
Augenklinik und Poliklinik, Universitätsklinikum
Carl-Gustav-Carus, Technische Universität
Dresden, Fetscherstraûe 74, D-01307 Dresden
Ophthalmologe
1997 ´ 94:902±906 Springer-Verlag 1997
E. Spörl · M. Huhle · M. Kasper · Th. Seiler
Artificial stiffening of the cornea by
induction of intrastromal cross-links
Summary
Purpose: To increase the stability of the cornea by artificial cross-linking (radiation or
chemical agents) and to investigate a future
therapy for keratoconus.
Materials and methods: The epithelium of
enucleated porcine eyes was removed. Ten
eyes in each of eight test groups were treated
with UV light (l = 254 nm), 0.5 % riboflavin
and UV light (365 nm), blue light (436 nm)
and sunlight, and the chemical agents glutaraldehyde (1 % and 0.1 %, 10 min) and
Karnovsky's solution (0.1 %, 10 min). Strips
of 5 mm in width and 9 mm in length were
cut from each cornea and the stress-strain
behaviour of the strips was measured. For
comparison, eight groups of ten untreated
corneas each were measured by the same
method.
Results: Compared to untreated corneas riboflavin and UV irradiation as well as glutaraldehyde and Karnovsky's solution treatment resulted in significantly increased stiffness of the cornea (p < 0.05).
Conclusions: The biomechanical behaviour
of the cornea can be altered by low-concentration glutaraldehyde, Karnovsky's solution,
and by riboflavin and UV irradiation, which
offers potential conservative treatment of
keratoconus. To optimize this effect further
investigation is necessary regarding the
dose-effect relation and the in-vivo conditions.
Key words
Collagen · Cornea · Cross-linking · Keratoconus · Proteoglycans
Interferenzfilter von 365 und 436 nm
lieferten eine Intensität von 20 W/m2
durch die Quarzscheibe. Die Sonnenlichtbestrahlung wurde an einem sonnigen Tag (abgeschätzte Intensität
85 W/m2) durchgeführt. Die mit Riboflavin behandelten Kontrollgruppen wurden dem gleichen Zeitablauf
unterworfen, blieben jedoch jeweils
im Dunklen.
Zwei Vernetzungsmethoden kamen
zur Anwendung:
· Vernetzung mit UV-Strahlung
· Vernetzung mit chemischen Vernetzern.
Dabei wurden immer gleichzeitig
2 Gruppen zu je 10 intakten Augen untersucht. Bei der einen Gruppe (Testgruppe) wurde die Vernetzungswirkung
getestet. Die andere Gruppe diente als
Kontrollgruppe.
Vernetzung mit UV-Strahlung
· UV-Strahlung von 254 nm: Nach der
Entfernung des Epithels schloû sich
eine UV-Bestrahlung der Augen in einer feuchten Kammer durch eine
Quarzscheibe mit einer Wellenlänge
von 254 nm für 20 min an. Die Entfernung des Epithels ist wichtig, da es die
UV-Strahlung unterhalb von 290 nm
fast vollständig absorbiert. Eine
Quecksilberlampe (HNU 6, EMI, Ilmenau) diente als Lichtquelle mit einer Intensität von 90 W/m2 durch die
Quarzscheibe.
· Riboflavin
und
UV-Strahlung
(365 nm), blaues Licht (436 nm) und
Sonnenlicht: Eine Lösung von Riboflavin (0,5 %, B2-Inject, Jenapharm,
Jena) und 20 % Dextran wirkten für
60 min auf die Hornhaut der intakten
Augen der Test- und der Kontrollgruppe ein. Anschlieûend wurde je
eine Testgruppe mit Licht der Wellenlänge 365 nm (45 min, ohne Epithel),
436 nm (45 min, ohne Epithel) und
eine Testgruppe mit Sonnenlicht für
2 h in der gleichen Anordnung wie
bei 254 nm bestrahlt. Eine Xenonlampe (XBO 50, EMI, Ilmenau) und
Um zu prüfen, ob Riboflavin allein einen Effekt bewirkt, wurde eine Testgruppe mit Riboflavin behandelt aber
nicht bestrahlt. Die dazugehörige Kontrollgruppe lagerte nur in 20 % Dextran.
Vernetzung mit chemischen
Vernetzern
Das Einwirken der Substanzen, die in
Tabelle 1 angegeben sind, konnte mit
Hilfe einer Augenhalterung realisiert
werden, die es ermöglichte, daû nur die
Hornhaut in die Flüssigkeit eintauchte.
Nach der UV- bzw. chemischen Behandlung lagerten alle Augen (die Testgruppe und die Kontrollgruppe) für
45 min wieder in einer feuchten Kammer in einem dunklen Raum.
Aus jeder Hornhaut wurde ein zentraler Streifen von 5 mm Breite und
9 mm Länge herausgeschnitten und die
Dicke mit einem Ultraschallpachymeter
(Pachette, Technomed, Baesweiler) an
3 Stellen bestimmt. In einem Spannungs-Dehnungs-Meûgerät
(MINIMAT, Rheometric Scientific GmbH,
Bensheim) wurden die Hornhautstreifen mit einer Spannung von 5 103 N/
m2 für 5 min vorgedehnt, anschlieûend
erfolgte die Spannungs-Dehnungs-Messung im Spannungsbereich von
5 103±2 105 N/m2 bei einer Deforma-
Tabelle 1
Behandlung der Hornhäute zur Erzeugung von Vernetzungen
Gruppe
n
UV-Bestrahlung
Chemische Behandlung
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10
10
10
10
10
10
10
80
254 nm, 20 min
365 nm, 45 min
436 nm, 45 min
Sonnenlicht, 120 min
Keine
Keine
Keine
Keine
Keine
Keine
Riboflavin
Riboflavin
Riboflavin
Riboflavin
Glutaraldehyd
Glutaraldehyd
Karnovsky-Lösung
Keine
0,5 %, 45 min
0,5 %, 45 min
0,5 %, 45 min
0,5 %, 45 min
1 %, 10 min
0,1 %, 10 min
0,1 %, 10 min
903
Hornhaut
Diskussion
Abb. 1 ~ Einfluû von UV-Strahlung und Riboflavin auf das Spannungs-Dehnungs-Verhalten der Hornhaut
(Gruppe 1±4 und 9). Die Behandlung mit UV-Licht (254 nm) allein führte nicht und mit Riboflavin/436 nm
nur zu einer schwach signifikanten Verfestigung der behandelten Hornhäute. Riboflavin/Sonnenlicht
und Riboflavin/365 nm dagegen zeigten einen hochsignifikanten Effekt
tionsgeschwindigkeit von 1,5 mm/min
[19].
Die Mittelwerte der Spannung der
Testgruppe wurden mit denen der dazugehörigen Kontrollgruppe bei Dehnungen von 4, 6 und 8 % verglichen. Zur
Prüfung der statistischen Signifikanz
diente der Mann-Whitney-Test aus
dem Statistikprogramm SPSS 4.01 für
DOS 1993 (SPSS GmbH Software, München). Unterschiede zwischen der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe wurden ab p < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet.
Anhand der Fluoreszenz der chemisch erzeugten Vernetzungen konnte
die Eindringtiefe von Glutaraldehyd in
das Hornhautgewebe qualitativ bestimmt werden [13]. Drei Hornhäute
der Behandlungsgruppen 6±8 und der
Kontrollgruppe wurden in flüssigem
Stickstoff gefroren. Gefrierschnitte von
5±8 mm Dicke vom Hornhautzentrum
wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (PH-2, Olympus, Hamburg) bei
einem
Anregungsspektrum
von
450±490 nm und bei einem Fluoreszenzspektrum von 515±565 nm untersucht.
Die Veränderung durch UV-Bestrahlung mit 254 nm bei einer Bestrahlungszeit von 20 min ist nicht signifikant. Ein
signifikanter Unterschied trat in allen
Fällen der UV-Bestrahlung nach einer
Vorbehandlung mit Riboflavin auf (Tabelle 2). In Abb. 2 sind die SpannungsDehnungs-Kurven für die chemischen
Vernetzer, die einen signifikanten Unterschied hervorriefen, dargestellt.
Abb. 3 zeigt die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen einer unbehandelten
und einer mit 0,1 % Glutaraldehyd behandelten Hornhaut. Die Transparenz
der Hornhaut blieb in allen Testgruppen
erhalten.
Die Stabilität des Bindegewebes, natürlich auch der Hornhaut, wird normalerweise durch die enzymatische Vernetzung der Kollagenfibrillen gewährleistet. Des weiteren kommen auch nichtenzymatische
Vernetzungen
vor,
insbesondere die nichtenzymatische
Glykosilierung. Darunter versteht man
die chemische Reaktion zwischen Glukose bzw. deren Metaboliten und primären Aminogruppen von Proteinen
[5, 17, 19, 24, 25].
Die nichtenzymatische Vernetzung
des Kollagens nimmt mit dem Alter
schwach zu [1, 3, 10]. Besonders stark
nimmt sie bei Diabetikern zu, und auch
eine Erhöhung der Festigkeit des Kollagens konnte nachgewiesen werden [8,
13, 17]. Dabei kommt es zu Veränderungen der physikochemischen Eigenschaften wie Löslichkeit, thermische Eigenschaften, mechanische Festigkeit,
Viskosität, Versteifung, Verdickung
und Resistenz gegenüber Kollagenasen
[9, 11, 17, 19]. Kent et al. [8] fanden eine
Erhöhung der mechanischen Festigkeit
und eine Verringerung der Löslichkeit
am Bindegewebe von Rattenschwänzen
nach Inkubation in Glukose [2].
Die Vernetzung mit UV-Strahlung
von 254 nm wurde zwar an einer zirkulierenden Kollagenlösung nachgewiesen [12], aber aufgrund der geringen
Eindringtiefe von nur einigen Mikrometern in der Hornhaut ist die Wirkung
gering. Gröûere Wellenlängen werden
Ergebnisse
In Abb. 1 sind die Spannungs-Dehnungs-Kurven der Testgruppen, bei denen die Strahlungsvernetzung angewendet wurde, dargestellt. Zum Vergleich ist die Mittelwertkurve aller Kontrollgruppen ebenfalls eingezeichnet.
904
Abb. 2 ~ Einfluû von Glutaraldehyd und Karnovsky-Lösung auf das Spannungs-Dehnungs-Verhalten
der Hornhaut (Gruppe 6±9). Trotz der hohen Standardabweichung ist die Zunahme der Festigkeit für alle
Behandlungen statistisch signifikant, trotz der kleinen Gruppengröûe (n = 10)
Abb. 3 ~ Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer unbehandelten (links) und einer mit
Karnovsky-Lösung 10 min behandelten (rechts) Hornhaut, um die Tiefenverteilung der Vernetzungen
qualitativ zu zeigen (1 cm = 60 mm). Offensichtlich wird bei der Behandlung nur die vordere Hälfte
des Stromas erreicht
nur über einen Photosensibilisator
wirksam, wobei es sehr wichtig ist, daû
die Wellenlänge von diesem absorbiert
wird, aber auch genügend tief in die
Hornhaut eindringt. Riboflavin ist solch
ein nicht-toxischer, wasserlöslicher
Photosensibilisator, der auch leicht in
das Stroma eindringt. So riefen Wellenlängen von 365 und 436 nm statistisch
signifikante Unterschiede hervor. Sogar
bei der Testgruppe von Riboflavin und
2 h Sonnenbestrahlung trat ein statistisch signifikanter Unterschied auf.
Riboflavin ohne Lichtbestrahlung
(Gruppe 5) verursachte keine biomechanischen Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur in
20 % Dextran lagerte.
Die Bestrahlungsdauer spielt einen
entscheidenden Faktor bei der Vernetzung. Die Vernetzungsreaktion beginnt
nicht unmittelbar mit dem Bestrahlungsbeginn, sondern benötigt eine
Startphase. Einige Untersucher berichten, daû bei der Photoreaktion mit Riboflavin Sauerstoffradikale entstehen,
deren Vernetzungswirkung am Glaskörperkollagen in vitro nachgewiesen werden konnte [7].
Bei den chemischen Vernetzern
zeigte Glutaraldehyd die gröûte Wirkung, auch nach einer Verringerung
der Konzentration von ursprünglich
1 % für 10 min auf 0,1 % für 10 min. Um
das Penetrationsvermögen von Glutaraldehyd zu verbessern, wurde zusätz-
lich ein Gemisch von Glutaraldehyd
und
Formaldehyd + Phosphatpuffer
(Karnovsky-Lösung) verwendet.
Ungeklärt bleibt dabei, ob sich die
Vernetzungen intra- oder interfibrillär
bilden. Interfibrilläre Verbindungen
kann man sich zwar bei Sehnen vorstellen, in denen die Kollagenfibrillen miteinander verwoben sind. Im Hornhautstroma jedoch liegen die Kollagenfibrillen parallel mit einem relativ konstanten
Abstand von 20±40 nm, der mit Proteoglykanen ausgefüllt ist, und es ist nicht
klar, wie bei den verschiedenen Vernetzungstechniken interfibrilläre Verbindungen zwischen den Kollagenmolekülen entstehen können. Aber auch die Co-
reproteine der Proteoglykane können in
der Vernetzungskette beteiligt sein.
Nach unseren Kenntnissen liegen in der
Literatur keine Hinweise über Proteinvernetzungen im lebenden Gewebe auûer zwischen Kollagenmolekülen vor.
Quellungsexperimente an vernetzten
Hornhäuten können weitere Erkenntnisse über diesen Prozeû liefern [6].
In geringen Konzentrationen wird
Glutaraldehyd bereits zur Stabilisierung
von Implantaten, z. B. Herzklappen [15],
des Meniskus [21] und bei der Stimmbandbehandlung [18], eingesetzt. Von
Kollagen, welches mit geringen Konzentrationen von Glutaraldehyd vernetzt
wurde, ist bekannt, daû es widerstandsfähiger gegenüber Kollagenasen ist.
Das so vernetzte Kollagen soll gut toleriert werden, da es keine Entzündungsund keine Fremdkörperreaktion verursacht. Eine kurze Glutaraldehydfixierung erhält zahlreiche Enzymaktivitäten und weitgehend auch die immunologische Charakteristik der Proteine
[18]. Daneben macht sie das Kollagenmolekül weniger angreifbar für Kollagenasen. Diesen Effekt nutzten wir klinisch in einigen Fällen von einschmelzenden Hornhautulzera, bei denen die
konventionelle Therapie versagt hatte.
So konnten wir den Einschmelzungsprozeû in allen Fällen durch die Applikation von Karnovsky-Lösung (0,1 %,
10 min) stoppen.
Perspektiven
Diese In-vitro-Experimente sollen nur
als erster Schritt in Richtung auf eine
konservative Behandlung der Keratek-
Tabelle 2
Signifikanzwerte zur Charakterisierung der Zunahme der Festigkeit
der behandelten Hornhäute im Vergleich zur entsprechenden unbehandelten Kontrollgruppe
Gruppe
1
2
3
4
5
6
7
8
Behandlung
UV (254 nm, 20 min)
Riboflavin, 365 nm, 45 min
Riboflavin, 436 nm, 45 min
Riboflavin, Sonne, 120 min
Riboflavin
Glutaraldehyd 1 %
Glutaraldehyd 0,1 %
Karnovsky-Lösung 0,1 %
p -Wert bei
e = 4%
6%
8%
0,390
0,0001
0,0288
0,0001
0,3932
0,0016
0,0302
0,0185
0,796
0,0001
0,0433
0,0005
0,8534
0,0016
0,0412
0,0185
0,579
0,0003
0,0753
±
0,7959
0,0164
0,0461
0,0147
905
Hornhaut
tasie verstanden werden. Es ist noch unklar, wie lang die Vernetzungen und die
dadurch erhöhte Festigkeit in lebenden
Geweben bestehen bleiben. Erste Beobachtungen an lebenden Kaninchenaugen, die zentral auf der Hornhaut mit
0,1 % Karnovsky-Lösung behandelt
wurden, zeigten nur eine leichte subepitheliale Trübung, die nach 3 Wochen
verschwand. Durch die Vernetzungen
der Kollagenfibrillen wird die mechanische Stabilität erhöht, jedoch nicht die
Anordnung der Fibrillen und damit die
Transparenz verändert.
Die Kombination von Riboflavin
und Lichtenergie sowie Karnovsky-Lösung sind die beiden aussichtsreichsten
Methoden für die Erhöhung der Festigkeit der Hornhaut. Eine biologische Testung muû in weiteren Tierexperimenten erfolgen.
Durch UV-Strahlung und Riboflavin sowie niedrigdosiertes Glutaraldehyd oder Karnovsky-Lösung wird eine Verfestigung der
Kornea erreicht, wahrscheinlich aufgrund
von Vernetzung der Kollagene oder der Proteoglykane. Eine Erhöhung der biomechanischen Festigkeit der Hornhaut könnte eine
konservative Therapie des Keratokonus ermöglichen, weitere Untersuchungen sind jedoch noch erforderlich.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
906
13.
14.
15.
Literatur
In biomechanischen Untersuchungen weisen
Augen mit einem Keratokonus eine geringere Festigkeit der Kornea auf, die molekularen Grundlagen dieses Phänomens sind noch
nicht zufriedenstellend bekannt. Ursächlich
diskutiert werden eine Verringerung der Vernetzung innerhalb der Kollagenmatrix, eine
Reduktion der Kontaktstellen zwischen benachbarten Proteoglykanen der Grundsubstanz oder auch eine erhöhte Aktivität proteolytischer Enzyme.
Neue elektronenmikroskopische und
Röntgenstrahlenstreumessungen zeigten im
vorderen Hornhautstroma von Keratokonuspatienten das Fehlen von Lamellen, die benachbarte Fibrillenlagen durchkreuzen und
miteinander verbinden.
12.
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190 KLINISCHE STUDIE
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
der Hornhaut mit UV-Licht und Riboflavingabe als neuer
Bestrahlung
Behandlungsversuch bei einschmelzenden Hornhautprozessen,
erste Ergebnisse bei vier Patienten1, 2, 3
Eckbert Schnitzler1, Eberhard Spörl1, Theo Seiler2
1
Augenklinik des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden, Fetscherstr. 74, 01307 Dresden
(Dir.: Prof. Dr. A. Frühauf)
2
Augenklinik Zürich, Frauenklinikstraûe 24, CH-8091 Zürich (Dir.: Prof. Dr. T. Seiler)
Zusammenfassung
Hintergrund: Ulzerationen der Hornhaut stellen Prozesse dar,
die in schweren Fällen nur mittels operativer Engriffe erfolgreich behandelt werden können. Die UV-Bestrahlung mit Riboflavin ist ein neues Verfahren, bei dem solche Einschmelzungsprozesse aufgehalten werden können.
Patienten und Methode: Es wurden vier Patienten mit einschmelzenden Ulzera der Hornhaut unterschiedlicher Genese behandelt. Die UV-A-Bestrahlung erfolgte einmalig. Es wurden zwei
UV-Leuchtdioden, die eine Wellenlänge von 370 nm emittierten
mit einer Bestrahlungsstärke von 2,5 mW/cm2 und einer Bestrahlungsdauer von 30 Minuten verwendet. Die mit 2 ± 3 Tropfen
0,11 %-iger Riboflavinlösung betropfte Hornhaut wurde im Abstand von etwa 1 cm Entferung bestrahlt, so dass sich eine bestrahlte Fläche mit einem Durchmesser von 6 ± 7 mm ergab.
Ergebnisse: Bei drei von vier Patienten kam es nach der UVVernetzung zum Sistieren des Einschmelzungsprozesses, was
ein operatives Vorgehen mindestens zeitweilig erübrigte.
Schlussfolgerungen: Insgesamt kann das oben beschriebene
Verfahren in desperaten Fällen, wegen des Fehlens von Nebenwirkungen, zumindest als Behandlungsversuch vor eventuellen
späteren invasiven Eingriffen empfohlen werden.
formed 2 ± 3 drops of 0,11 % Riboflavinsolution were applied to
the cornea. The treatment area was 6 ± 7 mm in diameter.
Results: After the treatment in three of the four patients the
melting process of the cornea stopped. At least temporarily, a
surgical procedure could be delayed.
Conclusion: Because of the absence of any side-effects in serious cases the method is recommended prior to surgery.
Key words: ulcus ± cornea ± UV-radiation ± Riboflavin ± crosslinking of collagen
Crosslinking of the corneal collagen by UV-radiation with
Riboflavin for the mode of treatment melting ulcera of the
cornea, first results of four patients
Die Ulzeration von Hornhautstroma ist gekennzeichnet durch
den Abbau von Kollagen. Die sterile Einschmelzung wird eingeleitet von Proteinasen, die Proteoglykane andauen, welche die
Kollagenfibrillen umgeben. Danach erst können Kollagenasen
ansetzen, die die Kollagenfibrillen selber angreifen [1]. Ein weiterer Abbau wird dann von anderen Proteinasen fortgesetzt, die
auch von manchen Mikroben hergestellt werden, z. B. Pseudomonas [2]. Der Ursprung der endogenen Kollagenasen bei sterilen einschmelzenden Prozessen der Hornhaut ist allerdings
nicht geklärt. Obwohl das Hornhautepithel selber kaum Kollagenasen herstellt, ist es doch in der Lage, die Kollagenaseproduktion in den Keratozyten zu modulieren, z. B. durch Interleukin-1 [3], insbesondere bei Vorliegen eines Epitheldefektes [4].
Möglicherweise wichtiger für die Produktion von Kollagenasen
sind allerdings Entzündungszellen. Neutrophile Granulozyten
findet man häufig am Ort der aktiven Einschmelzung [5]. Sie
enthalten in ihren primären Lysosomen mehrere lytische Enzyme, unter anderem Kollagenasen und Elastasen [6].
Background: Corneal melting is a serious condition and in
many cases maybe managed only by surgery. UV-radiation with
Riboflavin is a new method that may stop the melting process
of the cornea.
Patients and method: Four patients suffering from melting ulcera of the cornea of various origin underwent a single UV-radiation. Two ultraviolet diodes were used emitting light with an
wavelength of 370 nm with an energy of 2,5 mW/cm2. The radiation time was 30 minutes. Before he radiation was per-
Schon seit langem ist bekannt, dass mit Fixativen (z. B. Glutaraldehyd) behandeltes Kollagen von Kollagenasen weniger angreifbar ist [7], was therapeutisch genutzt wird zur mechanischen und chemischen Stabilisierung von kollagenhaltigen
Implantaten (z. B. Meniskusersatz) [8]. Dies wird auf eine
Quervernetzung des Kollagens zurückgeführt. Daher ist es wenigstens theoretisch möglich, mittels einer Quervernetzung
des stromalen Kollagens einem von Kollagenasen vermittelten
Einschmelzungsprozess der Hornhaut entgegenzutreten.
Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217: 190 ± 193
Georg Thieme Verlag Stuttgart New York
ISSN 0023-2165
1
Schlüsselwörter: Ulkus ± Cornea ± UV-Bestrahlung ± Riboflavin ± Kollagenvernetzung
·
2
3
Manuskript erstmalig eingereicht am 2. 2. 00 und in der vorliegenden Form angenommen am 10. 5. 00.
Herrn Professor G. O. H. Naumann gewidmet.
Die Autoren haben kein finanzielles Interesse an der vorgelegten
Studie.
Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217 191
UV und Riboflavin bei Hornhautulkus
Tab. 1 Patienten, die mit UV-Licht und Riboflavin behandelt wurden
Nr.
Visus vor
Bestrahlung
Visus nach
Bestrahlung
Nachbeobachtungszeitraum
weitere operative
Eingriffe
Befund nach
Vernetzung
Diagnose
1
+ HBW 1/2 m
1/5
12 Monate
x
stabil
2
+ HBW
+ HBW
3 Monate
3
+ HBW
LP recta
3 Wochen
zwischenzeitlich
stabil
progredient
4
+ HBW
1/20
Bindehautdeckung
nach 3 Monaten
Keratoplastik
à chaud
x
Keratitis unklarer
¾tiologie
Hornhautrandulkus
bei Rosazea
trophisches
Hornhautulkus
Transplantateinschmelzung
12 Monate
stabil
(+ HBW = positive Handbewegungen, LP recta = intakte Lichtscheinprojektion)
Wir möchten die ersten Ergebnisse eines neuen Verfahrens zur
Behandlung von stromalen Einschmelzungen vorstellen, bei
dem ein weiteres Fortschreiten durch UV-Bestrahlung unter
gleichzeitiger Riboflavingabe verhindert werden soll. Grund
für diesen Effekt soll eine erhöhte Kollagenvernetzung sein [9].
Patienten und Methode
nung ohne Vaskularisation (tiefe Randfurche/Abb. 1), worauf
nach zwei Wochen die UV-Bestrahlung der Hornhaut mit Riboflavin erfolgte. Erst nach diesem Eingriff zeigte sich eine zirkuläre Einsprossung der Gefäûe und eine Stabilisierung der
Hornhaut, die im weiteren Beobachtungszeitraum von sieben
Monaten bestehen blieb, und es kam auch zum Aufklaren der
Hornhaut (Abb. 2).
Es wurden vier Patienten mit einschmelzenden Ulzera der
Hornhaut unterschiedlicher Genese behandelt (Tab. 1). Die Vernetzung erfolgte zu einem Zeitpunkt, bei dem nur noch ein operativer Eingriff (z. B. Bindehautdeckung oder Keratoplastik à
chaud) als Alternative zu unserer Behandlungsmethode in Frage
kam. Vor der Behandlung wurden die Patienten über das Verfahren und die fehlenden klinischen Erfahrungen damit sowie
theoretisch denkbare Komplikationen ausführlich aufgeklärt.
Die UV-A-Bestrahlung erfolgte mit zwei UV-Leuchtdioden, die
Licht einer Wellenlänge von 370 nm mit einer Bestrahlungsstärke von 2,5 mW/cm2 emittieren (Roithner Lasertechnik,
Wien). Die mit 2 ± 3 Tropfen 0,11 %iger Riboflavinlösung betropfte Hornhaut wurde im Abstand von etwa 1 cm Entfernung
bestrahlt, so dass sich eine bestrahlte Fläche mit einem Durchmesser von 6 ± 7 mm ergab.
Jeweils im Intervall von 5 Minuten wurden 1 ± 2 Tropfen Riboflavinlösung getropft, um ein Austrocknen der Hornhaut zu
verhindern. Die Bestrahlungsdauer betrug 30 min. Anschlieûend wurde ein Antibiotikum (Ofloxacin, Floxal-Augensalbe,
Dr. Mann Pharma) aufgetragen.
Abb. 1 Präoperativer Befund mit Hornhautverdünnung. Es besteht
eine progressive tiefe Randfurche von 800 ± 1000 sowie von 200 ± 500
ohne Vaskularisation.
Das Zielkriterium war die Verfestigung und das Verhindern einer
weiteren Ausdehnung des Ulkus durch Proteolyse. Die gewählten Parameter der Methode (Konzentration der Riboflavinlösung
und Bestrahlungsdauer) richteten sich nach den Ergebnissen von
Vorversuchen an Schweine- und Kaninchenaugen [9].
Erster Patient (Nr. 1): 81-jähriger Patient mit länger bestehender Erosio und fehlender Epithelisierung infolge Keratitis unklarer Genese, der uns mit fast vollständig fehlendem Epithel
vorgestellt wurde. Der Patient erhielt eine Bindehautdeckung,
da es unter konservativer Therapie zu keiner genügenden Epithelialisierung kam. Drei Monate danach erfolgte die Abtragung der Bindehautdeckung und Säuberung der Hornhaut. Im
weiteren Verlauf zeigte sich am Rand der ödematös getrübten
Hornhaut von 8 ± 11 h und von 2 ± 3 h eine progressive Verdün-
Abb. 2 Befund sieben Monate postoperativ mit feiner Vaskularisation in den verdünnten peripheren Hornhautarealen nasal und temporal, sowie Aufklaren der Hornhaut.
192 Klin Monatsbl Augenheilkd 2000; 217
Zweiter Patient (Nr. 2): Eine 47-jährige Patientin mit Rosazea
wurde uns nach viermonatiger erfolgloser konservativer Therapie (Oxytetrazyklin 1,5 g oral, Refobacin, Atropin, VitaminA, Floxal sine-Augentropfen) eines Hornhautrandulkus von 3
Uhrzeiten vorgestellt. Das Ulkus erstreckte sich von
6 Uhr bis 9 Uhr. Es erfolgte eine Bindehautdeckung, die nach
6 Monaten wieder eröffnet wurde. Einen Monat später stellte
sich die Patientin mit erneuter Befundverschlechterung vor.
Die Hornhautoberfläche war unregelmäûig und das Ulkus,
nur über eine Strecke von einer Uhrzeit vaskularisiert, war im
weiteren Verlauf progredient. Als Alternative zu einer erneuten Bindehautdeckung erfolgte die Vernetzung. Danach kam
es zur Stabilisierung des Befundes ohne weitere Progredienz.
Es zeigten sich vereinzelte Vaskularisationen der Hornhaut.
Dieser Befund war jedoch nicht bleibend und 3 Monate später
kam es zur erneuten Verschlechterung mit Bildung eines tiefen
Randfurchenulkus von 9 Uhr über 12 bis 4 Uhr, das wieder eine
Bindehautdeckung notwendig machte.
Dritter Patient (Nr. 3): Ein 61-jähriger Patient zeigte nach
zweifacher perforierender Keratoplastik bei Z.n. Hornhautabszess sowie Abstoûungsreaktion im Mai/99 ein trophisches Ulkus, das unter konservativer Therapie keine Besserung zeigte.
Es erfolgte eine UV-Bestrahlung mit Riboflavin, die jedoch das
Geschehen nicht aufhalten konnte und 3 Wochen nach der Bestrahlung musste eine Keratoplastik à chaud durchgeführt
werden. Die lichtmikroskopische Untersuchung des trepanierten Hornhautgewebes bestätigte die chronische Entzündung
erbrachte, entsprechend der möglichen Vergröûerung keinen
Hinweis auf eine Veränderung der Kollagenstruktur.
Vierter Patient (Nr. 4): 44-jähriger Patient mit Z.n. perforierender Rekeratoplastik bei primär vorliegendem Ulcus corneae
unklarer Genese und Abstoûungsreaktion der ersten Keratoplastik. Bei diesem Patienten zeigte sich eine erneute Abstoûungsreaktion mit Tansplantateinschmelzung von 900 bis 100
reichend mit diffuser Endotheltrübung. Es erfolgte neben entsprechender konservativer Therapie die UV-Bestrahlung mit
Riboflavin, um ein weiteres Einschmelzen der Hornhaut zu
verhindern. Nach der Bestrahlung kam es zu einem zirkulären
Übergreifen der Bindehaut auf die Peripherie des Transplantates und einem Sistieren der Einschmelzungsreaktion.
Ergebnisse
Bei drei von vier Patienten kam es nach der UV-Vernetzung
zum Sistieren des Einschmelzungsprozesses, was ein operatives Vorgehen mindestens zeitweilig erübrigte. Eine zusätzliche Trübung der Hornhaut war nicht zu beobachten.
Nebenwirkungen der UV-Strahlung an der Hornhaut wie z. B.
endotheliale, stromale Veränderungen wurden bei den spaltlampenmikroskopischen Kontrollen nicht festgestellt. Ebenfalls wurden keine zusätzlichen Linsentrübungen beobachtet.
Diskussion
Bei entzündlichen Reaktionen der Hornhaut kommt es zur
Leukozyteninfiltration und zur Freisetzung von Kollagenasen
und Metalloproteinasen [10]. Diese führen zur Verschiebung
des Synthese-Katalysegleichgewichtes in der Hornhaut und
können einen gefürchteten Einschmelzungsprozess der Hornhaut bewirken. Durch UV-Bestrahlung der Hornhaut mit Ribo-
Schnitzler E et al
flavin kann eine Festigkeitszunahme der Hornhaut erzielt werden. Der Effekt soll auf einer verstärkten Vernetzung der Kollagenfibrillen beruhen [11].
Durch die Vernetzung kommt es aber auch zu anderen Veränderungen der Hornhaut wie der Löslichkeit, Versteifung und
erhöhten Resistenz gegenüber Kollagenasen, wie es beim Diabetes mellitus und bei der natürlichen Alterung der Hornhaut
beschrieben wurde [9,11,12,13,14,15]. Als Vernetzungssubstanz wurde Riboflavin gewählt, da für diese Substanz im Gegensatz zu der anderen vernetzenden Substanz Glutaraldehyd
[9,16] bisher keine zellulären Nebenwirkungen bekannt sind.
Bisherige Behandlungsansätze der Hornhauteinschmelzung
beinhalten eine Reihe von konservativen und chirurgischen
Maûnahmen. Die Applikation von EDTA und Steroiden soll die
Kollagenasen hemmen und die Aktivierung von neutrophilen
Granulozyten verhindern [17,18], wobei Steroide auch die Kollagenbildung (Vernetzung) hemmen und damit die Hornhaut
destabilisieren können. Die Bindehautdeckung gilt als einfaches und potentiell reversibles Verfahren ebenso wie die Amniondeckung [19]. Gröûere Defekte erfordern jedoch eine lamellierende oder perforierende Keratoplastik. Verbandslinsen
können die Epithelisierung fördern [20].
Insgesamt kann das oben beschriebene Verfahren in desperaten Fällen, wegen des Fehlens von Nebenwirkungen zumindest
als Behandlungsversuch vor eventuellen späteren invasiven
Eingriffen, empfohlen werden. Die tatsächliche Erfolgsaussicht
der UV-Vernetzung sollte in weiteren Studien mit einer gröûeren Patientenzahl eingeschätzt werden.
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Ophthalmologe 2003 · 100:44–49
DOI 10.1007/s00347-002-0700-3
Originalien
G.Wollensak1 · E. Spörl1 · T. Seiler2
1 Universitäts-Augenklinik Dresden · 2 Universitäts-Augenklinik,Zürich
Behandlung von Keratokonus
durch Kollagenvernetzung
Zusammenfassung
Hintergrund. Ziel dieser Studie war der
Nachweis, ob sich die Hornhaut bei Keratokonuspatienten mittels photochemischer Riboflavin/UVA-Kollagenvernetzung verfestigen lässt, um so die progressive Hornhautektasie zu stoppen.
Patienten und Methode. Wir behandelten
16 Augen von 15 Patienten mit gesicherter
Progression und überwiegend moderatem
Keratokonus.Nach Epithelabrasio wurde Riboflavinlösung auf die Hornhaut appliziert
und mit UVA aus 1 cm Abstand für 30 min
bestrahlt.Nachkontrollen, die Visus, Hornhauttopographie und Messung der Endothelzelldichte einschlossen, erfolgten im
1.Jahr alle 3 Monate, danach alle 6 Monate,
wobei der Nachbeobachtungszeitraum zwischen 1 und 3 Jahren lag.
Ergebnisse. Eine Progression der Keratektasie konnte bei allen Patienten gestoppt werden.Bestkorrigierter Visus und der maximale
Keratometerwert besserten sich gering in ca.
50% der Fälle.Bei allen Patienten blieben die
Hornhauttransparenz und die Endothelzelldichte stabil.
Schlussfolgerungen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass möglicherweise die Quervernetzung des Kollagens eine geeignete konservative Behandlungsmöglichkeit ist, um das
Fortschreiten des Keratokonus aufzuhalten.
Weitere Studien sind geplant, um Spätkomplikationen auszuschließen und den Langzeiteffekt dieser Methode zu sichern.
Schlüsselwörter
Keratokonus · Hornhaut · Vernetzung ·
Riboflavin · UV
44 |
D
er Keratokonus ist eine zumeist bilateral auftretende Hornhautdegeneration
mit kegelförmiger Hervorwölbung der
verdünnten Kornea. Der Begriff „Keratokonus“ wurde durch von Ammon aus
Dresden bereits Anfang des 19. Jahrhunderts geprägt. Die Inzidenz beträgt
1/2000 in der Gesamtbevölkerung. Typischerweise beginnt der Keratokonus in
der Pubertät und schreitet dann bei ca.
21% aller Keratokonuspatienten so weit
voran, dass eine Keratoplastik wegen
Vernarbung oder irregulärem Astigmatismus durchgeführt werden muss [10,
16]. Deswegen ist der Keratokonus auch
insgesamt gesehen mit bis zu 16% eine
der häufigsten Indikationen zur Keratoplastik [7].
Vor der Keratoplastik werden vor
allem harte Kontaktlinsen zur Behandlung eingesetzt. Seltener angewandte
Verfahren sind Epikeratoplastik und intrakorneale Ringe [4, 10, 13]. Allen diesen Verfahren ist jedoch gemeinsam,
dass sie nur die refraktiven Folgen des
Keratokonus behandeln, jedoch nicht
die Ursache der Hornhautverdünnung
und daher das Fortschreiten des Keratokonus nicht aufhalten können bzw. sogar zum Teil beschleunigen.
Basierend auf umfangreichen tierexperimentellen Untersuchungen [14,
15], bei denen es uns gelang, mittels photochemischer Vernetzung die Hornhaut
signifikant zu verfestigen (Abb. 1, 2, 3),
verfolgten wir in der vorliegenden prospektiven Studie einen ganz anderen
Ansatz, bei dem es Ziel ist, durch Erhöhung der Kollagenquervernetzung in
der Hornhaut die Erkrankung an ihrer
Wurzel zu packen und ein Fortschreiten
des Keratokonus zu verhindern.
Nach Zustimmung der Ethikkommission des Universitätsklinikums zum Studiendesign (EK 310499) wurden 15 Patienten (16 Augen) in die prospektive klinische Studie eingeschlossen. Das mittlere Alter der 6 weiblichen und 9 männlichen Patienten betrug 32,18±10,86
Jahre (13–51 Jahre). Es wurden bevorzugt Patienten mit moderatem Keratokonus behandelt, d. h., die Keratometerwerte lagen bei den meisten zwischen
48 und 56 dpt (Tabelle 1). Bei allen Patienten lag anamnestisch eine deutliche
Progression des Keratokonus in den
letzten 2 Jahren vor, weshalb die Patienten zum Teil auch von weit entfernt
überwiesen wurden. Dabei war bei ca.
der Hälfte der Patienten die Progression durch Hornhauttopographieaufnahmen gesichert.
Die Patienten wurden vor der Behandlung über den experimentellen
Charakter der Behandlung und über die
regelmäßigen Kontrolluntersuchungen
aufgeklärt.Aus Vorsichtsgründen wurde
bevorzugt nur ein Auge behandelt, nur
im ersten Fall alle beiden Augen, da wegen Leber- Optikusatrophie beidseitige
Erblindung bestand. Bei 2 Patienten lag
eine Trisomie 21, bei 1 Fall eine Neuro-
© Springer-Verlag 2003
Teile des Beitrags wurden auf der 99.Tagung
der Deutschen Ophthalmologischen
Gesellschaft präsentiert.
Priv.-Doz. Dr. G.Wollensak
Universitäts-Augenklinik Dresden,
Fetscherstraße 74, 01307 Dresden
E-Mail: [email protected]
Ophthalmologe 2003 · 100:44–49
DOI 10.1007/s00347-002-0700-3
G.Wollensak · E. Spörl · T. Seiler
Treatment of keratoconus by collagen
cross linking
Abstract
Background. We were able to show a significant increase in corneal stiffness of rabbit
and porcine eyes after combined riboflavin/UVA-induced collagen cross-linking.In
this study, we tried to treat keratoconus patients with this method to stop the progression of corneal ectasia.
Patients and methods. We treated 16 eyes
of 15 patients with progressive keratoconus
and mostly moderate keratectasia (48–56
dpt).After removal of the epithelium
(7 mm ∅), riboflavin solution was applied
on the cornea, which was irradiated with
UVA (370 nm, 3 mW/cm2) at a distance of
1 cm for 30 min.Post-operative follow-up
controls were conducted every 3 months in
the first year and then every 6 months, always including visual acuity testing, corneal
topography and measurements of endothelial cell density.The follow-up time was between 1 and 3 years.
Results. Progression of keratectasia was
stopped in all patients.Best corrected visual
acuity and the maximal keratometry values
improved slightly in about 50% of the cases.
In all patients corneal transparency, the degree of keratectasia registered by corneal topography and the density of endothelial
cells remained unchanged within the followup time.No negative side-effects were observed.
Conclusions. Our results show that collagen
cross linking might be a useful conservative
treatment modality to stop the progression of
keratoconus.By this means the need for keratoplasty might be significantly reduced.Given
the simplicity of the technique and minimal
costs of the treatment it might also be well
suited for developing countries.Further studies are envisaged to exclude long-term side
effects and to evaluate the long term durability of the mechanical stiffness effect.
Keywords
Keratoconus · Cornea · Cross linking · UV ·
Riboflavin
Abb.1 Prinzip der photochemischen Vernetzung von
Kollagen mit Riboflavin als
Photosensibilisator
dermitis vor.Augenbohren war bei Fall 1
anamnestisch bekannt.
Folgende Parameter wurden vor der
Behandlung im 1.postoperativen Jahr alle
3 Monate, danach zumeist nur noch alle
6 Monate erhoben: der beste korrigierte
Visus, Keratometerwerte, Hornhauttopographie mit dem Videokeratoskop
(C-Scan,Technomed),Augeninnendruck,
Hornhautfoto,Spaltlampen- und Fundusuntersuchung sowie zentrale Endothelzelldichte mit dem Endothelmikroskop
(EM-1200, Tomey), wobei die Endothelzelldichte mit der Fixed-frame-Methode
bestimmt wurde und jeweils ca. 90–100
Zellen pro Messung erfasst wurden. Eine
Pachymetrie (Pachette,Technomed) wurde bei den letzten 4 Patienten (Patient
13–16) durchgeführt.Dabei wurden Werte
zwischen 460–540 µm gemessen.
Behandlungsprocedere. Die Behandlung
erfolgte in lokaler Tropfanästhesie mit
Proxymetacainhydrochlorid-AT 0,5%.
Im Zentrum der Hornhaut wurde auf einer Fläche von 7 mm Durchmesser eine
Epithelabrasio durchgeführt. Diese ist
notwendig, weil sonst die Epithelschicht
das Eindringen von Riboflavin ins Hornhautstroma verhindert. Als Photosensibilisator wurde eine 0,1%ige Riboflavinlösung (10,95 mg Riboflavin-5-phosphat
in 10 ml 20%iger Dextran-T-500-Lösung) auf die Hornhaut getropft und mit
ultraviolettem UVA-Licht der Wellenlänge von 370 nm und der Bestrahlungsintensität von 3 mW/cm2 mit einem Abstand von 1 cm für 30 min bestrahlt
(Abb. 4).Als UVA-Strahlungsquelle dienten zwei UV-Leuchtdioden mit einer
Strahldivergenz von 10 (Roithner Lasertechnik, Wien), bei denen ein Potentiometer zur Spannungsregelung in Reihe
geschaltet wird. Als Spannungsversorgung dienten drei 1,3-V-Akkus. Vor der
Behandlung wurde die Bestrahlungsintensität von 3 mW/cm2 mit dem UVMessgerät LaserMate-Q (LASER 2000,
Wessling, BRD) in 1 cm Abstand kontrolliert. Bei Abweichungen der Bestrahlungsstärke wurde die Spannung der
Leuchtdiode mittels Potentiometer auf
die Sollbestrahlungsintensität geregelt.
Während der Bestrahlung wurden im
Intervall von 5 min 1–2 Tropfen Riboflavin auf die Hornhaut getropft. Nach Abschluss der Behandlung wurde antibiotische Augensalbe appliziert.
Um die UV-Dosis für die menschliche Linse abschätzen zu können, wurden
in einem Vorversuch bei 10 frisch enukleierten,mit Riboflavin vorbehandelten
Schweineaugen mit einem UV-Extinktionsmessgerät (Perkin Elmer) die korneale UV-Transmission bei 370 nm gemessen [14] und betrug somit 7% der primären Bestrahlungsintensität, d. h., die
verwendete Bestrahlungsintensität wurDer Ophthalmologe 1•2003
| 45
Originalien
Abb.2 Deutlicher Versteifungseffekt durch
Riboflavin-UVA-Behandlung (oben) behandelte
gelbe, (unten) unvernetzte graue Schweinehornhaut
de von 3 mW/cm2 durch die korneale Absorption bei einer Hornhautdicke von
500 µm auf 0,21 mW/cm2 (=0,378 Ws/cm2
bei 30 min Bestrahlungszeit) in der
Nähe der Linse und auf 10 µW/cm2
(=0,018 mWs/cm2 bei 30 min Bestrahlungszeit) vor der Netzhaut reduziert.
Ergebnisse
Die maximale Nachkontrollzeit lag bei
3,5 Jahren, die mittlere Nachkontrollzeit
bei 23,2±9,4 Monaten. Mit dem Wilcoxon-Test für Paardifferenzen findet sich
eine signifikante Verbesserung für den
Visus um 1,3 Linien (p<0,01) und für
den maximalen Keratometerwert um
1,38 dpt (p<0,01). Leichte Verbesserung
des Visus fanden sich in ca. 68% und des
Keratometerwertes (Abb. 5) in ca. 50%
der Fälle, wobei die restlichen Fälle konstant gegenüber dem präoperativen Befund blieben.
Nebenwirkungen wie Endothelzellschäden oder Kataraktbildung wurden
bei keinem der Patienten festgestellt. Es
kam zu keiner Zunahme der Trübung
der Hornhaut, bei 2 Patienten (Patient 1
und 2) wurde sie sogar deutlich besser
(s. Tabelle 1).
Diskussion
Mit der hier vorgestellten Methode der
Kollagenvernetzung ist eine Erweite-
46 |
rung des therapeutischen Spektrums bei
Keratokonus gegeben, und es scheint
zum ersten Mal möglich zu sein, das
Fortschreiten des Keratokonus zu stoppen und evtl. in Einzelfällen sogar wieder etwas rückgängig zu machen. Es
konnte eine signifikante Abnahme der
Keratektasie anhand der Keratometerwerte in 50% und eine Zunahme des Visus um eine Visusstufe in 68% statistisch
nachgewiesen werden. Die zahlreichen
bisherigen operativen Verfahren zur Behandlung des Keratokonus wie thermale Keratoplastik, intrakorneale Ringe,
Epikeratoplastik oder lamelläre Keratoplastik können nur vorübergehend refraktive Sehverbesserungen bringen [4,
10, 13], jedoch das Fortschreiten des Keratokonus nicht aufhalten. Auch bei der
Kontaktlinse ist ein positiver Einfluss
auf das Fortschreiten des Keratokonus
nicht bewiesen [19]. Letztendlich bleibt
daher langfristig nur die Hornhauttransplantation, wobei hierbei Probleme
wie sekundäre Katarakt oder Glaukom,
irregulärer Astigmatismus, Abstoßung
und Keratokonusrezidiv möglich sind.
Schwierigkeit bei der Einschätzung
des Behandlungseffektes
Eine Schwierigkeit bei der Einschätzung
des Behandlungseffektes ist die Tatsache,
dass der Keratokonus schon spontan
zum Stillstand kommen kann („forme
fruste“). Daher sind die positiven Verläufe unserer Patienten theoretisch auch
ohne die vorangegangene Vernetzung
möglich.Allerdings war der Keratokonus
praktisch bei allen Patienten anamnestisch vor der Behandlung progredient
gewesen, in knapp 50% war dies auch
durch Topographie belegt.Außerdem ist
aus epidemiologischen Studien bekannt,
Abb.3 Biomechanischer Materialtester (Minimat) zur Messung des Spannungsdehnungsverhaltens von vernetzter
Schweinehornhaut
dass ca. 21% der Keratokonuspatienten
langfristig eine Keratoplastik brauchen
[16], während es in unserer Studie bei
keinem zu einer Progression des Befundes kam. Sollten in der Zukunft allerdings negative Verläufe nach Vernetzungsbehandlung beobachtet werden,
müssten diese aber umso stärker gewertet werden, da nicht auszuschließen ist,
dass einige Fälle auch ohne Behandlung
stabil geblieben wären. In unserer Studie
gab es aber bisher keinerlei „therapeutische Ausreißer“. Es bleibt auch abzuwarten, ob der Behandlungseffekt auch noch
in 5–10 Jahren anhält. Möglicherweise
muss die Behandlung alle paar Jahre wegen der Umbauvorgänge im Rahmen des
Kollagenstoffwechsels der Hornhaut wiederholt werden, da die biologische Halbwertszeit des kornealen Kollagens ca. 2–3
Jahre beträgt.
Behandlungsprinzip
Das Prinzip der beschriebenen Behandlung beruht auf der photochemischen
Vernetzung der Kollagenfasern der
Hornhaut und findet z. B. auch in der Industrie zur Härtung von Lacken und
Plastikwerkstoffen in ähnlicher Weise
Anwendung. Bei der UV-Bestrahlung
der Hornhaut werden Kollagen-Crosslinks durch die bei der Bestrahlung entstehenden Sauerstoffradikale induziert
(s.Abb. 1), wobei das Riboflavin als Photosensibilisator wirkt und den Vernetzungseffekt potenziert. Es kommt dabei
zu einer Verhärtung der Hornhaut ähnlich wie nach Formalin- oder Glutaraldehydfixation, dessen „Verhärtungseffekt“ jedem Pathologen aus der täglichen Praxis bestens bekannt ist und
auch auf der Erhöhung der Crosslinks
im Gewebe beruht. In ähnlicher Weise
Tabelle 1
Kontrollparameter prä- und postoperativ
Patient
1R
1L
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Postoperatives
Zeitintervall
(Monate)
Visus
Präoperativ
41
41
29
27
27
25
25
24
23
23
21
19
14
13
13
6
–
–
HBW
0,4
0,5
0,8
HBW
0,8
0,6
0,3
0,8
0,4
0,3
0,4
0,5
0,2
Endothelzellzahl
Maximaler K-Wert
Transparenz
Postoperativ
Präoperativ
Postoperativ
Präoperativ
Postoperativ
Postoperativ
1/20
0,9
0,6
1,0
HBW
0,8
0,7
0,6
0,9
0,7
0,5
0,3
0,8
0,3
–
–
–
2.300
2.400
2.200
1.700
–
2.600
2.580
–
2.450
2.290
2.110
2.360
2.060
2275±211(6)
2413±186(6)
2257±218(6)
1875±197(3)
–
2723±169(5)
2668±228(5)
2815±208(4)
2396±196(5)
2257±258(4)
2214±151(4)
2437±217(4)
2139±273(2)
–
–
–
49,69
57,94
49,36
49,10
50,32
50,72
56,49
53,19
55,50
55,17
52,80
45,88
59,00
48,30
58,04
49,41
48,20
45,90
49,04
54,52
51,11
52,61
54,56
–
45,94
57,76
+
+
+
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
=
Der Wert für den postoperativen Visus und den Keratometerwert sind von der letzten Untersuchung; die Zahl in Klammern bei der postoperativen Endothelzellzahl
=Anzahl der postoperativen Endothelzellmessungen.
kommt es auch bei der Blutgerinnung
zum Crosslinking von Fibrin und damit
zur Bildung eines festen Thrombus.
Der therapeutische Ansatz der Vernetzung wird im übrigen auch in der
Medizin bereits vielfältig bei anderen
Indikationen verwendet. So wurde die
Kollagenvernetzung mittels Glutaraldehyd bzw. Formalin bei Bioherzklappen, bei injizierbarem Kollagen für die
Stimmbänder zur Behandlung der Rekurrensparese und periurethral bei Harninkontinenz und zur Härtung von Faszien beim Trommerfellersatz genutzt. In
der Zahnheilkunde werden zahlreiche
Werkstoffe durch Lichtaktivierung ausgehärtet [8]. In der Ophthalmologie
wurden injizierbare Linsenmaterialien
durch photochemische Vernetzung verfestigt [6] und ein Riboflavin-Fibrinogen-Gemisch durch Argonlaseraktivierung als Bioklebemittel für die nahtlose
Keratoplastik getestet [5].
Interessanterweise wurde passend
zu unserem neuen Therapieansatz in
biochemischen Untersuchungen bei Keratokonus eine Abnahme der Hydroxylysin-Crosslinks gezeigt [3]. Des Weiteren wurde beim Keratokonus eine Zunahme der Kollagenasen, eine Abnahme
von Proteasehemmern [19], eine Zunahme von Kollagenabbauprodukten in der
Tränenflüssigkeit [1] und eine Störung
des zwischen den Kollagenfibrillen gelegenen Glycosaminoglycangerüstes [18]
festgestellt, alles Faktoren, die zur Reduktion der mechanischen Kollagenfaserstabilität führen. In biomechanischen
Untersuchungen wurde beim Keratokonus eine signifikant reduzierte mechanische Festigkeit in Spannungs-Dehnungs-Experimenten festgestellt [2].
Auch konnte bei epidemiologischen Studien gezeigt werden, dass bei Patienten
mit Diabetes mellitus, bei denen Kollagen-Crosslinks in der Hornhaut durch
sog.„advanced glycation end products“
vermehrt sind [11], Keratokonus signifikant seltener auftritt als in der Normalbevölkerung [12].
Nebenwirkungen und
Komplikationen
Abb.4 Bestrahlungstechnik
mit 2 UV-Dioden über der mit
Riboflavin getropften, zentral
abradierten Hornhaut bei einem Keratokonuspatienten
Bemerkenswerterweise wurden nach
der Behandlung weder Kurz- noch
Langzeitnebenwirkungen beobachtet.
Insbesondere wurden keine Endothelzellschäden und keine Katarakt beobachtet. Wir konnten messen, dass durch
das hohe Absorptionsvermögen von RiDer Ophthalmologe 1•2003
| 47
Originalien
noch nicht nötig ist. Falls sich die Methode langfristig bezüglich Therapieeffekt und Nebenwirkungen bewährt, wollen wir später auch sehr frühe Formen
des Keratokonus behandeln, bei denen
der Patient noch geringe Beschwerden
hat. Insgesamt könnte sich dann die Zahl
der Keratoplastiken bei Keratokonus
deutlich vermindern, sodass Spenderhornhäute vermehrt für andere Indikationen zur Verfügung stehen würden [7].
Andere denkbare Indikationen für
die Behandlung sind neben dem Keratokonus die pelluzidale marginale Randdegeneration, Keratoglobus, Hornhautstablisierung im Rahmen von refraktiven Eingriffen und Hornhautulzera. Da
die Behandlung einfach und kostengünstig ist, wäre sie in Zukunft auch in
Entwicklungsländern durchführbar, in
denen Kontaktlinsen oder Keratoplastik
oftmals nicht zur Verfügung stehen.
Abb.5a,b Hornhauttopographie vor (a) und 22 Monate nach (b)
Behandlung mit leichter Verbesserung der Keratometerwerte
(50,26 dpt→48,32 dpt)
boflavin für 370 nm die Energie zu 93%
im Hornhautstroma absorbiert wird
und das Endothel, die Linse und die
Netzhaut weitestgehend vor UV-Schäden geschützt sind [14]. So wird z. B. die
Schwellendosis von 70 Ws/cm2 für einen
UV-bedingten Linsenschaden bei 370 nm
bei einer Bestrahlung von 30 min mit
0,378 Ws/cm2 deutlich unterschritten.
Bei der therapeutischen Dosis wurden
von uns jedoch im Tierexperiment bei
sehr dünnen Hornhäuten (kritische Dicke: 400 µm) massive Endothelschäden
beobachtet (noch unveröffentlichte Daten). Eine Behandlung mit der Bestrahlungsstärke von 3 mW/cm2 sollte daher
bei einer Hornhaut mit einer Dicke weniger als 400 µm nicht durchgeführt werden. Daher führen wir seit 1 Jahr auch
immer vor der Behandlung eine Pachymetrie durch (Patient 13–15).Glücklicherweise werden selbst beim fortgeschritte-
48 |
nen Keratokonus diese Werte in der Regel nicht unterschritten. So fanden Watters und Owen eine durchschnittliche
Hornhautdicke von 446±38 µm im Konusbereich bei fortgeschrittenem Keratokonus, wobei jedoch insbesondere die
Hornhaut im Bereich unter dem Konusapex noch etwas dünner sein kann [17].
Indikationen der Methode
In erster Linie ist die Methode geeignet,
die weitere Progression des Keratokonus
zu stoppen. Eine minimale Verbesserung
der Keratektasie des Keratokonus ist jedoch zum Teil möglich. Daher behandeln wir zurzeit in erster Linie moderat
fortgeschrittene Stadien des Keratokonus, bei denen zum einen eine vorangegangene Progression anamnestisch vorlag und zum anderen die Behandlung
noch Sinn macht, da eine Keratoplastik
Die Induktion von Kollagenquervernetzungen durch Behandlung mit Riboflavin und
UVA-Licht scheint eine neue Möglichkeit zu
sein, eine Progression von Keratokonus bereits im Frühstadium durch Erhöhung der
biomechanischen Festigkeit zu stoppen
und damit auch eine Keratoplastik zu vermeiden.Langzeitstudien müssen noch
Klarheit über Dauer des Effektes und mögliche Langzeitnebenwirkungen bringen.
Aufgrund der geringen Kosten und Unkompliziertheit der Behandlung ist diese auch
gut für Entwicklungsländer geeignet.
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39:1117–1124
Springer-Verlag und
Die Deutsche Bibliothek kooperieren in der Langzeitarchivierung von Online-Publikationen
Der wissenschaftliche Springer-Verlag und Die
Deutsche Bibliothek haben die Volltext-Versionen
von derzeit 430 Springer-Zeitschriften in über
zwei Millionen Einzeldateien zur Langzeiterhaltung auf den Archivserver der Deutschen Bibliothek überführt.Das 1998 begonnene Pilotprojekt
mit dem Ziel, die Langzeitarchivierung von Online-Publikationen sicherzustellen, wurde damit
für den Zeitschriftenbereich zu einem vorläufigen
Abschluss gebracht.Somit können Leserinnen
und Leser die archivierten Volltext-Daten in den
Räumen der Deutschen Bibliothek bequem nutzen.Darüber hinaus arbeiten der Springer-Verlag
und Die Deutsche Bibliothek daran, das Archivierungsverfahren auf die elektronisch verfügbaren
Springer-Buchreihen auszudehnen.
Bereits im März 2002 hatte der Springer-Verlag
gemeinsam mit anderen Verlagen der Arbeitsgruppe “Elektronische Depotbibliothek” mit der
Deutschen Bibliothek eine Rahmenvereinbarung
über die Archivierung von Online-Publikationen
abgeschlossen. Die Bibliothek strebt an, ihrem
Auftrag der lückenlosen Archivierung aller deutschen und deutschsprachigen Publikationen auch
im elektronischen Bereich gerecht zu werden.
Der Springer-Verlag ist mit seinem Internet-basierten Informationsservice einer der führenden
internationalen Anbieter wissenschaftlicher Online-Inhalte mit Zugang zu knapp 500 Zeitschriften, 1.600 Büchern, zwei Lernsoftwares und fünf
Expertensystemen. Monatlich kann der SpringerOnline-Service im Durchschnitt 55 Millionen Zugriffe verzeichnen. Das inhaltliche Spektrum
umfasst elf verschiedene Fachgebiete aus Naturwissenschaft,Technik, Medizin, Psychologie,Wirtschaftswissenschaften und Jura.
Die Deutsche Bibliothek ist die deutsche Nationalbibliothek mit den drei Standorten Deutsche
Bücherei Leipzig, Deutsche Bibliothek Frankfurt
am Main und Deutsches Musikarchiv Berlin. Sie
hat die Aufgabe, lückenlos alle deutschen und
deutschsprachigen Publikationen ab 1913 zu
sammeln. Mit inzwischen etwa 12.000 OnlineDissertationen verfügt sie über die weltweit
größte Sammlung an originär digital veröffentlichten Hochschulschriften. Die Deutsche Bibliothek hat im Oktober 2001 eine Anmeldeschnittstelle für Online-Publikationen eingerichtet, die
allen Verlagen und verlegenden Stellen die freiwillige Abgabe von Veröffentlichungen zur Archivierung ermöglicht.
Henna-Tätowierungen
als Ursache für lebenslange
Allergien
Immer mehr Menschen lassen sich mit dem
alten orientalischen Färbemittel Henna temporäre Bilder in die Haut tätowieren. Leider
können diese so genannten Temptoos kontaktallergische Hautreaktionen auslösen –
oft sogar erst, wenn das Hautbild bereits
verblasst ist.
Reines Henna wird von den meisten Menschen
vertragen. Dem traditionellen Henna wird jedoch
häufig Paraphenylendiamin (PPD) beigemengt,
um den Farbton augenscheinlich zu verbessern
und eine schnellere Trockenzeit zu erreichen. PPD
ist ein schwarzer Farbstoff, dessen hohes Sensibilisierungspotenzial als Kontaktallergen belegt ist.
Als Haarfärbemittel ist es seit Jahrzehnten in
Deutschland verboten und lediglich für bestimmte industrielle Zwecke in einer Konzentration bis
zu 6 % zugelassen. Das dekorative Bemalen der
Haut mit PPD-haltigen Farbstoffgemischen
unterliegt der Kosmetikverordnung. Produkte aus
Nicht-EU-Ländern sind an diese Vorgaben aber
nicht gebunden und enthalten oft erhebliche
Mengen an PPD.
Bereits einige Tage nach Tätowierung können
erste Hautreaktionen wie Juckreiz, Rötungen,
Knötchen- und Bläschenbildung auftreten. Auch
über Schwellungen von Haut und Schleimhaut
(Angioödeme), Beinödeme, Nesselsucht (Urtikaria) oder Astma bronchiale wurde berichtet. In
der Regel lassen sich die Beschwerden erfolgreich mit Kortikosteroiden und zusätzlicher Antihistamingabe behandeln.
Zu den Spätreaktionen der Henna-Tätowierungen zählt die kontaktallergische Dermatitis. Oft
sind die Temptoos bereits vollständig verblasst,
wenn der Patient die ersten Beschwerden angibt.
Eine einmal erworbene Allergie begleitet den Patienten häufig lebenslang: Beim Tragen von
schwarzer Kleidung etwa können sich juckende
und schuppende Hautveränderungen bilden, teilweise mit blasigen Streureaktionen an Händen
und Füßen. Noch gravierender sind die Auswirkungen auf das Arbeitsleben: PPD und andere
verwandte Stoffe sind in bestimmten Berufen
wie Friseur, Drucker,Textilverarbeiter, Schuh- und
Lederwarenverkäufer, Chemiewerker oder Arbeiter in der Gummi-, Kunststoff oder Papierindustrie schwer zu meiden.
Quelle: Informationsdienst Wissenschaft
Weitere Informationen unter: http://link.springer.
de und http://www.ddb.de
| 49
Riboflavin/Ultraviolet-A–induced Collagen
Crosslinking for the Treatment of Keratoconus
GREGOR WOLLENSAK, MD, EBERHARD SPOERL, PHD, AND THEO SEILER, PHD, MD
● PURPOSE:
In animal eyes, a significant increase in
corneal biomechanical stiffness has been found after
collagen crosslinking by combined riboflavin/ultraviolet-A (UVA) treatment. The aim of the present study
was to evaluate the clinical usefulness of riboflavin/
UVA-induced collagen crosslinking for bringing the
progression of keratoconus to a halt.
● DESIGN: Prospective, nonrandomized clinical pilot
study.
● METHODS: Twenty-three eyes of 22 patients with
moderate or advanced progressive keratoconus (maximum K value, 48 –72 diopters) were included. After
central corneal abrasion, photosensitizing riboflavin
drops were applied and the eyes exposed to UVA (370
nm, 3 mW/cm2) in a 1-cm distance for 30 minutes.
Postoperative examinations were performed in 6-month
intervals, including visual acuity testing, corneal topography, slit-lamp examination, measurement of endothelial cell density, and photographic documentation. The
follow-up time was between 3 months and 4 years.
● RESULTS: In all treated eyes, the progression of keratoconus was at least stopped. In 16 eyes (70%) regression with a reduction of the maximal keratometry
readings by 2.01 diopters and of the refractive error by
1.14 diopters was found. Corneal and lens transparency,
endothelial cell density, and intraocular pressure remained unchanged. Visual acuity improved slightly in 15
eyes (65%).
● CONCLUSIONS: Collagen crosslinking may be a new
way for stopping the progression of keratectasia in
patients with keratoconus. The need for penetrating
keratoplasty might then be significantly reduced in keratoconus. Given the simplicity and minimal costs of the
treatment, it might also be well-suited for developing
countries. Long-term results are necessary to evaluate
the duration of the stiffening effect and to exclude long
Accepted for publication Dec 2, 2002.
InternetAdvance publication at ajo.com Feb 26, 2002.
Dresden, Dresden, Germany (G.W., E.S), and the Department of Ophthalmology, University of Zurich, Zurich, Switzerland (T.S.).
Inquiries to Gregor Wollensak, MD, University Eye Clinic Dresden,
Fetscherstrasse 74, D-01307 Dresden, Germany; fax: (⫹49) 351-4584335; e-mail: [email protected]
620
©
2003 BY
term side-effects. (Am J Ophthalmol 2003;135:
620 – 627. © 2003 by Elsevier Inc. All rights reserved.)
K
ERATOCONUS IS A NONINFLAMMATORY CONELIKE
ectasia of the cornea, which is usually bilateral and
progresses over time. Its reported frequency is approximately 1 in 2,000 in the general population.1 Usually,
the condition starts at puberty, progressing in approximately 20% to such an extent that penetrating keratoplasty becomes necessary.2,3
Besides penetrating keratoplasty, hard contact lenses are
the major treatment modality for keratoconus. In rare
cases, epikeratoplasty, photorefractive keratectomy, or intracorneal rings can be considered.1,4 –7 However, all of
these techniques only correct the refractive errors of
keratoconus but do not treat the cause underlying the
corneal ectasia and therefore cannot stop the progression
of keratoconus.
A new technique of collagen crosslinking by the photosensitzer riboflavin and UVA similar to photopolymerization in polymers8 has been developed. In extensive
experimental studies in rabbit and porcine eyes, including
biomechanical stress–strain measurements,9 –11 we showed
a significant increase in corneal rigidity by approximately
70% in untreated vs treated corneas9 (Figure 1) after
collagen crosslinking by the combined riboflavin/UVA
treatment.
The aim of the present pilot study was to evaluate the
effect of the new crosslinking method on the progression of
keratectasia in patients with keratoconus and to exclude
possible serious side effects.
DESIGN
THIS WAS A PROSPECTIVE, NON-RANDOMIZED PILOT STUDY.
METHODS
● SETTING AND PATIENTS: Starting in 1998, 23 eyes of
22 patients (10 females, 12 males) from the University Eye
Clinic of Dresden were included in the study. The clinical
ELSEVIER INC. ALL
RIGHTS RESERVED.
0002-9394/03/$30.00
doi:10.1016/S0002-9394(02)02220-1
FIGURE 2. Treatment of the central 7 mm of the centrally
abraded cornea with riboflavin drops and two UVA diodes.
ples in the Declaration of Helsinki. Subjects read and
signed an institutional ethics committee–approved consent form before participation in the study.
FIGURE 1. (Top) Stiffening effect of porcine cornea after
crosslinking with preserved curvature in the treated cornea
(above) and massive bending of the untreated control cornea
(below). (Bottom) Wrinkling of untreated porcine cornea (left)
and form stability with impressive smoothness of the centrally
crosslinked porcine cornea (right).
diagnosis of keratoconus was based on corneal topography
(Figure 3) and clinical signs of keratoconus such as stromal
thinning, Fleischer ring, Vogt striae, or apical stromal scar.
The preoperative progression of keratoconus was confirmed from medical history in all patients, and it was
clearly documented by serial corneal topography12 in 12
eyes (52%; Figure 4). The average age of the recruited
patients was 31.7 ⫾ 11.9 years and ranged from 13 to 58
years (Tables 1 and 2). Except for patient 1, who had
congenital Leber amaurosis and acute bilateral keratoconus, the patients had a moderate to advanced degree of
progressive keratoconus13 with maximum keratometer values between 48 and 72 diopters (Tables 1 and 2). For safety
reasons, in all cases except patient 1, only one eye was
treated; the fellow eye served as a control eye. Patients 11
and 22 wore hard contact lenses in the treated eyes before
and after the treatment. The prospective, nonrandomized
pilot study was conducted in accordance with the princiVOL. 135, NO. 5
TREATMENT
OF
● OBSERVATION PROCEDURES:
The preoperative
screening and the postoperative examinations included
measurement of best-corrected visual acuity, corneal topography using a videokeratoscope (C-scan; Technomed,
Baseweile, Germany), intraocular pressure by Goldmann
applanation tonometry, central endothelial cell density
using an endothelial cell microscope (EM-1200; Tomey,
Erlangen, Germany), corneal photography, and slit-lamp
and fundus examination. Preoperative pachymetry (Pachette; Technomed, Baseweile, Germany) was performed
only in the last eight patients with minimal pachymetry
values ranging from 460 to 540 ␮m.
● TREATMENT PROCEDURE:
The treatment procedure
was conducted under sterile conditions in the operating
room. Proxymetacainhydrochloride 0.5% eyedrops were
applied for preoperative local anesthesia. The central 7
mm of the corneal epithelium was cautiously removed
using a blunt knife. As a photosensitizer, riboflavin 0.1%
solution (10 mg riboflavin-5-phosphate in 10 ml dextranT-500 20% solution) was applied 5 minutes before the
irradiation and every 5 minutes during the irradiation.
After allowing riboflavin to permeate through the cornea
for at least 5 minutes, the UVA irradiation was started
using two UV diodes (370 nm; Roithner Lasertechnik,
Vienna, Austria) with a potentiometer in series to regulate
the voltage. Three 1.3-V accumulators were used as a
power generator. Before each treatment, the desired irradiance of 3 mW/cm2 was controlled with a UVA meter
(LaserMate-Q; LASER 2000, Wessling, Germany) at a
1-cm distance and, if necessary, regulated with the potentiometer. The patient’s cornea was irradiated with the
UVA-light diodes (370 nm) at a 1-cm distance for 30
minutes using 3 mW/cm2 irradiance, which corresponds to
KERATOCONUS
BY
CROSSLINKING
621
FIGURE 3. Corneal topography of a treated patient (Top) shortly before and (Bottom) 10 months after crosslinking with slight
regression of the maximum K value by 1.06 diopters.
622
AMERICAN JOURNAL
OF
OPHTHALMOLOGY
MAY 2003
FIGURE 4. (Top) Column diagram demonstrating pretreatment progression of maximum K value in the half year before treatment
and posttreatment regression as measured at the latest follow-up examination for each patient. y axis: difference in maximum K value
in diopters; x axis: patient number; shaded bars ⴝ preoperative change of K value; solid bars ⴝ postoperative change of K value.
(Bottom) Biphasic curve illustrating the mean change over time of the maximum K value relative to the K value on the day of
treatment with mean preoperative progression by 1.4 diopters and postoperative regression by 2.0 diopters (x axis: time in months;
y axis: change of maximum K value in D).
VOL. 135, NO. 5
TREATMENT
OF
KERATOCONUS
BY
CROSSLINKING
623
TABLE 1. Investigation Parameters
Visual Acuity
Refractive Correction
Maximum K Value
Endothelial Cell
Density
Patient
Age
Postoperative Interval
Preop
Postop
Preop
Postop
Preop
Postop
Preop
Postop
Corneal and Lens
Transparency
1r
1l
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
13
13
41
32
19
38
58
49
36
29
36
31
29
39
39
31
19
28
51
32
30
24
22
47
47
35
33
33
31
31
30
29
29
27
27
24
20
19
19
12
9
8
7
6
5
3
no LP
no LP
HM
20/50
20/40
20/25
HM
20/25
20/33
20/66
20/25
20/40
20/50
20/66
20/50
20/40
20/100
20/66
20/66
20/66
20/33
20/66
20/50
no LP
no LP
20/400
20/22
20/33
20/20
HM
20/25
20/28
20/33
20/22
20/33
20/28
20/40
20/66
20/25
20/66
20/33
20/200
20/50
20/20
20/50
20/40
—
—
—
⫺3
⫺1.75
⫺0.75
⫺3
3.5
⫺8.25
⫺13
⫺4.5
⫺6
⫺7
⫺3
⫺2.75
⫺6.75
⫺10.25
⫺0.75
0.375
⫺3.5
⫺1.0
⫺3.0
⫺1.25
—
—
—
⫺1.5
⫺1.5
⫺0.75
⫺2.75
3.5
⫺3.5
⫺13.125
⫺2.125
⫺7
⫺5.5
0
⫺2.5
⫺2.125
⫺4.25
⫺4
⫺0.875
⫺2.5
0.5
⫺2.5
⫺0.25
—
—
—
49.69
57.94
49.36
49.10
50.32
50.94
56.49
53.19
49.85
55.50
55.17
52.80
45.88
59.00
56.00
55.60
67.07
51.06
72.47
46.07
—
—
—
48.30
57.90
49.32
48.20
44.45
48.20
53.29
51.11
50.13
52.61
54.56
52.00
45.44
57.34
53.81
52.18
62.72
47.08
68.60
45.70
—
—
—
2,300
2,400
2,200
1,700
—
2,600
2,580
—
2,150
2,450
2,290
2,110
2,360
2,060
2,400
2,100
2,700
2,050
1,850
1,950
—
—
—
2,300
2,390
2,250
1,700
—
2,640
2,600
2,700
2,130
2,450
2,280
2,090
2,400
2,100
2,420
2,050
2,700
2,050
1,850
1,900
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
⫽
The preoperative values for visual acuity and maximum K value were determined on the day of treatment. The postoperative values are
given for the last visits.
⫽ indicates unchanged transparency; HM ⫽ hand motion; LP ⫽ light perception; postop ⫽ postoperative; preop ⫽ preoperative.
val, 1.23 to 3.07 diopters; P ⫽ .001, paired Student t test),
comparing the preoperative values on the day of treatment
vs the postoperative values of the last examination (Figure
3). In five patients the K value remained stable, and in one
patient a minimal increase of the K value of 0.28 diopters
was present. In the fellow control eyes, however, 5 of 23
eyes (22%) showed a continuous progression of the maximum K value by an average of 1.48 diopters in the first
year after the crosslinking treatment of the contralateral
eye.
The postoperative healing process was unremarkable,
except for slight transient stromal edema until reepithelialization after 3 days. There were no side effects, such as
persistent epithelial defects or scarring. During the first
postoperative night, some pain medication was administered. The corneal and lens transparency and the endothelial cell density (P ⫽ .45) remained unchanged (Tables
1 and 2). Contact lens wear for refractive correction in
patients 19 and 22 could be continued without tear film
stability problems.
No statistically significant difference was found between
the mean preoperative intraocular pressure of 13.6 ⫾ 2.0
mm Hg on the day of treatment and the mean postoper-
a dose of 5.4 J/cm2 (Figure 2). After the treatment, an
antibiotic ointment was applied until reepithelialization.
RESULTS
THE FOLLOW-UP TIME RANGED FROM 3 TO 47 MONTHS,
with a mean follow-up time of 23.2 ⫾ 12.9 months (Tables
1 and 2). Best-corrected visual acuity improved statistically
significantly in 15 patients (65%) by an average of 1.26
lines (95% confidence interval, ⫺0.68 to 2.21; P ⫽ .026,
paired Student t test), comparing the preoperative values
on the day of treatment vs the postoperative values of the
last examination. The refractive correction improved significantly by an average of 1.14 diopters (95% confidence
interval, 0.12 to 2.17; P ⫽ .03) in spherical equivalent
(Table 2).
The mean preoperative progression of the maximum K
value was 1.42 ⫾ 1.18 diopters (Figure 4, bottom) in 12
eyes (52%). Postoperative regression of keratoconus, as
measured by the maximum K values (Table 1), was found
in 16 patients (70%; Figure 4, top and bottom) with an
average reduction of 2.01 diopters (95% confidence inter624
AMERICAN JOURNAL
OF
OPHTHALMOLOGY
MAY 2003
TABLE 2. Summary of Patient Data and Results
Mean ⫾ SD
23.2 ⫾ 12.9
1.42 ⫾ 1.18
2.01 ⫾ 1.74
1.14 ⫾ 2.18
Mean follow-up
Preoperative progression in K value
Postoperative regression K value
Postoperative regression in refractive error (spherical
equivalent)
Postoperative increase in visual acuity
Postoperative intraocular pressure
Postoperative transparency of lens and cornea
Postoperative density of endothelial cells
Number of patients: 22
Number of eyes: 23
Gender: 12 males, 10 females
Age: 31.7 ⫾ 11.9 years
months
D
D
D
1.26 ⫾ 1.5 lines
Unchanged
Unchanged
Unchanged
P Value
.0001
.030
.026
.612
.45
The postoperative values were calculated as the difference between the value on the day of
treatment and at the last follow-up visit. The preoperative progression K value was calculated as the
difference in K value between the value half a year before treatment and the day of treatment.
ative intraocular pressure of 13.8 ⫾ 2.5 mm Hg (P ⫽ .615)
at the last visit.
DISCUSSION
THIS STUDY HAS SHOWN THAT COLLAGEN-CROSSLINKING
appears to be effective in stopping the progression of
keratoconus quasi “freezing” the cornea. This effect is
corroborated by the following data of the study1: Postoperative regression was observed in 70% of patients with a
decrease of the mean keratometer values by 2.01 diopters
postoperatively despite documented preoperative progression by 1.42 diopters in 52%.2 The postoperative refractive
corrections could also be reduced by an average of 1.14 ⫾
2.18 diopters.3 In the untreated fellow control eyes, a
postoperative progression of keratectasia by 1.48 diopters
was found in 22%.4 In biomechanical measurements of
earlier experiments, an increase in biomechanical stability
of approximately 70% was measured.9
In contrast to other therapeutic measures for treating
keratoconus, such as thermal keratoplasty, intracorneal
rings, or epikeratoplasty (which basically are only transient
refractive corrections),4 –7 the new minimal invasive
method presented here seems to be the first approach to
stop or even reduce the progression of keratoconus. An
arrest of keratoconus by contact lenses has been described
only in anecdotal reports but has never been confirmed in
a systematic study.1
The success of crosslinking treatment in keratoconus is
not surprising, because a significantly reduced tensile
strength has been measured biomechanically14 in keratoconous and a significant increase in corneal rigidity has
been measured in porcine and rabbit corneas treated by
VOL. 135, NO. 5
TREATMENT
OF
riboflavin/UVA using quantitative biomechanical stressstrain measurements.9 –11 The impressive stiffening effect
after riboflavin/UVA treatment (Figure 1) is similar to
formaldehyde-induced tissue stiffening and fixation in
pathologic specimens caused by collagen crosslinking.
Pathohistologically, we were able to demonstrate a
significant increase in collagen fiber diameter as the
underlying histopathologic correlate.15 Increased corneal
collagen fiber diameters and increased collagen rigidity
have also been described in diabetes mellitus and aging,
where collagen crosslinking is also increased.16 –18 In these
conditions, keratoconus rarely occurs.19 Increased resistance to pepsin digestion after crosslinking has been
found,20 which might be important for keratoconus because a significantly elevated activity of collagenases has
been found.21,22
The arrest of the progression of keratoconus in our
patients could have been spontaneous as a so-called forme
fruste of keratoconus.23 In epidemiologic studies, however,
21% of patients with keratoconus progress to a state where
keratoplasty is required.2,3 In all our cases a progression of
keratoconus was known before the beginning of the
treatment at least by clinical history and clearly documented by corneal topography in 12 eyes (52%; Figure 4,
top). Moreover, postoperative regression was observed in
16 eyes (70%) after treatment, and this has never been
reported in the natural course of the disease.
In the two cases with hard contact lens wear (patients
11 and 22), the keratometry readings might have been
influenced by an orthokeratoplastic effect,24 but these two
cases did not show regression. The contact lenses were still
tolerated after crosslinking, and their use did not have to
be stopped.
KERATOCONUS
BY
CROSSLINKING
625
In the present study, we treated moderate to advanced
keratoconus stages.13 If the good results of the new method
are corroborated over time, it would be preferable to treat
earlier stages of the disease so that a better visual acuity
might be preserved. Earlier stages were not included in this
study, because the possible risks involved were not yet
known.
We did not find an increase of the mean intraocular
pressure values postoperatively. Applanation tonometry is
not sensitive enough to reflect the increase in corneal
rigidity. A slight increase in intraocular pressure measurement might also be masked by the normal slight variability
in intraocular pressure.
We have not observed any complications or adverse
events of the new method, especially no decrease in
endothelial cell density or cataract formation. We have
previously measured the amount of irradiation intensity
transmitted by the porcine cornea using a UVA photometer. With 3 mW/cm2 of UVA irradiance at the surface
of the cornea and a riboflavin concentration of 0.1%, there
is a massive reduction of the UVA light by 95%, resulting
in an irradiance of 0.15 mW/cm2 (⫽ an irradiation dose,
0.27 J/cm2) at the endothelial level in a 500-␮m-thick
cornea.9 Without riboflavin, the UVA light would be
reduced in the cornea only by approximately 30%, with
approximately 50% UVA absorption in the lens.25
In experiments with rabbit eyes, the cytotoxic threshold
irradiance for the endothelial cells after combined riboflavin/UVA treatment is 0.36 mW/cm2 (⫽0.65 J/cm2),
which may be reached with a corneal thickness of under
400 ␮m using 3 mW/cm2 irradiance (⫽5.4 J/cm2) at the
epithelial level.26 Preoperative pachymetry is essential and
was included in the last eight patients of the study. The
central corneal thickness in keratoconus usually is not
reduced to less than 400 ␮m.27 If so, however, the crosslinking treatment should be avoided.
The UVA dose of 0.65 J/cm2 (0.36 mW/cm2) is far
below a cataractogenous level of 70 J/cm2.28 In addition,
lens damage is usually induced by UVB light in the
wavelength range of 290 to 320 nm, which has a higher
energy because of a shorter wavelength than UVA.28,29
The durability of the stiffening effect is unknown.
Because the collagen turnover in the cornea is estimated to
be between 2 to 3 years,30,31 a repeat treatment may
become necessary in the long run.
Collagen crosslinking could also be useful for the treatment of iatrogenic keratectasia resulting from laser in situ
keratomileusis32,33 either as prophylaxis or as postoperative
treatment. The new treatment can also be used for treating
corneal melting lesions or superficial ulcers.34 The residual
corneal thickness should be at least 400 ␮m to spare the
endothelium.
We believe that collagen crosslinking might become a
standard treatment for progressive keratoconus. Long-term
studies must exclude serious late complications and confirm the durability of the stiffening effect. The new method
626
AMERICAN JOURNAL
might reduce the need for donor material resulting from
keratoconus, which represents approximately 16% of all
keratoplasty indications.35 Given the very low costs and
the simplicity of the new method, it could be applied in
developing countries where access to keratoplasty or contact lenses is a problem.
ACKNOWLEDGMENT
The authors thank Prof. Josef Wollensak (Berlin) for
continuous support and stimulation in the development of
the new method.
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