Aus dem Zentrum für Augenheilkunde der Universität zu Köln Klinik

Aus dem Zentrum für Augenheilkunde
der Universität zu Köln
Klinik und Poliklinik für Allgemeine Augenheilkunde
Geschäftsführender Direktor:
Universitätsprofessor Dr. med. C. Cursiefen
Auswirkung von Ranibizumab auf die korneale Häm- und
Lymphangiogenese
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Franziska Bucher
aus Nürnberg
promoviert am
10. April 2013
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln
2013
2
Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg
1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. C. Cursiefen
2. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. med. C. Mauch
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe
Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe;
die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als
solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
Dr. rer. nat. Felix Bock
Universitätsprofessor Dr. med. Claus Cursiefen
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt.
Insbesondere
habe
ich
nicht
die
Hilfe
einer
Promotionsberaterin/eines
Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar
noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit
dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, den 23.11.12
______________
F. Bucher
3
Die
in
dieser
Arbeit
angegebenen
Experimente
sind
nach
entsprechender
Einarbeitung durch Herrn Dr. rer. nat. Felix Bock von mir selbst ausgeführt worden.
Dr. med. Anand Parthasarathy hat mit Vorversuchen zur Wirkung von Ranibizumab
auf LEC und BEC Kulturen mit kleinen Fallzahlen begonnnen. Diese in-vitro
Vorversuche, mit kleinen Fallzahlen, waren ohne statistische Signifikanz. Von mir
wurden diese Versuche in größerem Ausmaß wiederholt und mit dem in-vivo MausModel der inflammatorisch induzierten Lymphangiogenese erweitert. Dr. med. Anand
Parthasarathy war zusammen mit Dr. rer. nat. Felix Bock lediglich an der
Versuchsplanung beteiligt.
Die Ergebnisse der in dieser Arbeit gezeigten Experimente sind ausschließlich von mir
nach Einarbeitung durch Herrn Dr. rer. nat. Felix Bock selbstständig erarbeitet worden.
Die in vitro Versuche, die Operationen an den Versuchstieren und die Auswertung der
immunhistologischen Präparate wurden von mir persönlich durchgeführt.
Dr. med. Anand Parthasarathy wird mit den in dieser Arbeit dargestellten Ergebnissen
nicht promovieren.
4
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung:..........................................................................................................................................6
2.
Publikation .......................................................................................................................................11
Topical Ranibizumab Inhibits Inflammatory Corneal Hem- And Lymphangiogenesis ..........................12
Abstract.................................................................................................................................................13
Keywords: .............................................................................................................................................14
Introduction: .........................................................................................................................................15
Methods:...............................................................................................................................................16
Results...................................................................................................................................................19
Discussion .............................................................................................................................................20
References ............................................................................................................................................23
Figure 1: ................................................................................................................................................27
Figure 2 .................................................................................................................................................28
3.
Diskussion: ......................................................................................................................................31
4.
Zusammenfassung: .......................................................................................................................35
5.
Literaturverzeichnis:.......................................................................................................................36
6.
Lebenslauf:......................................................................................................................................40
5
1. Einleitung:
Die menschliche Hornhaut (Kornea) dient als klare „Windschutzscheibe“ des Auges
und trägt mit ca. 43 dpt zu einem Großteil der Brechkraft des Auges bei. Sie besteht
(von
außen
nach
Plattenepithel,
innen)
aus
Bowman-Lamelle,
einem
Stroma,
mehrschichtigen
unverhornendem
Descemet-Membran
und
einem
einschichtigem Endothel. Die Kornea ist als gefäßfrei und wird durch Diffusion mit
Nährstoffen
aus
dem
Tränenfilm
von
außen,
dem
Kammerwasser
der
Vorderkammer und dem Limbusbereich versorgt. Das Hornhautendothel und die
spezifizierten Hornhautendothelzellen sorgen ständig für eine kontinuierliche
Entwässerung aller Hornhautschichten und verhindern somit ein Aufquellen dieser,
was eine Trübung und Visusminderung zu Folge hätte. Eine ausgeprägte nervale
Innervation der Hornhaut über den Nervus Trigeminus und der Kornealreflex über
den Nervus Trigeminus und Facialis schützt unser wichtiges Sinnesorgan vor
äußeren Gefahren. Veränderungen der kornealen Innervation (z.B. nach refraktiver
Hornhautchirurgie, Traumata, jahrelangem Kontaktlinsengebrauch oder Infektionen)
führen zu einer Reduktion des Tränenfilms, Benetzungsstörungen (durch
Verminderung des Blinkreflexes) und einer Minderversorgung mit neurotrophischen
Faktoren, was zu Epitheldefekten, Ulcerationen bis hin zur Perforation (mit Gefahr
für das gesamte Auge) führen kann.(23)
Weitere Grundvoraussetzung für die Transparenz und die Klarheit der Hornhaut ist
außerdem das Fehlen von Blut- und Lymphgefäßen. Dieses sogenannte
„angiogene Privileg“ ist einzigartig, evolutionär hoch konserviert und wird durch
verschiedene Mechanismen aktiv aufrechterhalten. Wie dieses angiogene Privileg
im Detail erhalten bleibt und durch welche Mechanismen es durchbrochen werden
kann, ist bis heute allerdings noch nicht vollständig geklärt. Obwohl die Hornhaut
hohe Spiegel an VEGF („vascular endothelial growth factor“) aufweist bleibt sie
dennoch im physiologischen Zustand völlig frei von Blut- und Lymphgefäßen.(4) Nur
im angrenzenden Limbusbereich der Kornea finden sich Blut- und Lymphgefäße.
Welche Mechanismen dafür sorgen, dass diese natürliche Barriere nicht
überschritten wird, ist bisher nicht bekannt. Neue wissenschaftliche Erkenntnisse
6
erbrachte Ambati et al. mit der Erforschung der Rundschwanz-Seekuh. Diese
Unterart der Seekuh weist als einziges Säugetier im physiologischen Zustand eine
vaskularisierte Hornhaut auf. Bei ihr wurde eine Mutation im VEGF Rezeptor-1 Gen
nachgewiesen, was zu einem Fehlen des löslichen VEGF Rezeptors (sVEGF-1
oder sflt-1) führt. Weitere Analysen zeigten, dass dieser lösliche Rezeptor
normalerweise VEGF-A bindet und somit „abfängt“, bevor dieser Wachstumsfaktor
an den membranständigen zellulären VEGF Rezeptoren binden kann und es zu
einer Induktion der Gefäßbildung in der Hornhaut kommt. Viele andere angiogene
Faktoren, wie z.B. Angiostatin, Endostatin, PEDF und Thrombostatin wurden in den
letzten
Jahren
auf
Lymphangiogenese
ihre
Bedeutung
untersucht.
in
Jedoch
der
kornealen
konnte
in
Angiogenese
experimentellen
und
Studien
nachgewiesen werden, dass keiner dieser Faktoren allein für die Avaskularität von
Bedeutung ist.(4,15,22) Das unverhornende Plattenepithel der Hornhaut ist täglich
einer Vielzahl an Partikeln und somit einem andauernden Reiz durch mechanische
Beanspruchung durch den Lidschlag ausgesetzt. Das intakte Hornhautepithel
unterbindet dabei durch hohe Spiegel von VEGF Rezeptor-3 die pathologische
Neovaskularisation.(24)
Das angiogene Privileg der Hornhaut ist allerdings nicht perfekt. Unterschiedliche
Faktoren bzw. Zustände (schwere Infektionen, Entzündungen, Verbrennungen,
Verletzungen oder Verätzungen) können dieses Privileg durchbrechen und zu einer
pathologischen Gefäßneubildung (korneale Neovaskularisation) führen. Durch
dieses sekundäre Einwachsen von Blut- und Lymphgefäßen vom Limbus in das
optische Zentrum der Hornhaut verliert diese ihre Transparenz und führt zu einer
Visuseinschränkung und kann bis zur Erblindung führen. Der angiogene
Wachstumsfaktor VEGF-A nimmt hierbei eine zentrale Rolle als Gefäßinduktor ein.
Weiterhin ist VEGF-A maßgeblich bei der Entstehung pathologischer Gefäße in
Tumoren, der Iris, der Retina und Choroidea beteiligt.(1,3,40) Es konnte gezeigt
werden, dass intravitreal erhöhte VEGF-Spiegel die Entstehung von pathologischen
Gefäßen auch am hinteren Augenpol fördern, so dass diese (choroidalen)
Neovaskularisationen zu einer schnelleren Progression der zugrundeliegenden
Grunderkrankung
Inhibitoren
Behandlung
wie
führen
können.
Magugen®,
dieser
Inzwischen
Lucentis®
neovaskulären
oder
okulärer
stehen
Avastin®
verschiedene
zur
Erkrankungen
VEGF-
antiangiogenen
zur
Verfügung.
Bevacizumab (Avastin®) ist ein humaner monoklonaler Antikörper und wurde
7
erstmalig für die Behandlung des kolorektalen Karzinoms zugelassen. Ranibizumab
(Lucentis®) ist das Fab-Fragment dieses Antikörpers und das einzige Medikament
das für die Behandlung der feuchten altersabhängigen Makuladegeneration
zugelassen wurde. Ein neuerer Wirkstoff, Pegabtanib (Macugen®) ist ein Aptamer
das spezifisch nur eine Isoform von VEGF-A (VEGF-A 165) bindet. Durch diese
neuen Medikamente konnten in den letzten Jahren z.B. bei der Therapie der
altersabhängigen Makuladegeneration, dem diabetischem Makulaödem oder
retinalen Gefäßverschlüssensehr große Erfolge erzielt werden.(40,42,44) Diese VEGFInhibitoren reduzieren nicht nur signifikant die pathologische Gefäßneubildung
sondern verbessern auch signifikant die Sehschärfe vieler Patienten.
Auch die pathologische korneale Neovaskularisation wird hauptsächlich durch
VEGF-A induziert und bleibt bisher häufig ein ungelöstes therapeutisches Problem.
Patienten mit Oberflächenerkrankungen des Auges, wie z.B. einer kornealen
Herpes-Infektion, erleiden häufig eine deutliche Visusminderung durch das
Einwachsen von Gefäßen in die Hornhaut und die daraus resultierenden
veränderten optischen Eigenschaften. Eine Gefäßkauterisation zur thermischen
Verödung dieser Gefäße kombiniert mit einer subkonjunktivalen Anti-VEGFApplikation (z.B. mit Avastin) ist derzeit eine mögliche off-label Behandlung zur
Verminderung der pathologischen Neovaskularisiationen bei der Herpes-SimplexKeratitis.(37,53)
Bei der in der gesamten Medizin als erste und mittlerweile am häufigsten
durchgeführten
Transplantation,
der
Hornhauttransplantation,
spielt
die
Avaskularität der Hornhaut, für den Erfolg der Transplantation, eine entscheidende
Rolle. Korneale Neovaskularisationen zählen als wichtigster Risikofaktor für die
immunologisch
vermittelte
Abstoßungsreaktion
nach
erfolgter
Hornhautransplantation: „Hochrisikopatienten“ mit vaskularisierter Hornhaut haben
ein signifikant höheres Risiko die Empfängerhornhaut abzustoßen, als Empfänger
mit gefäßfreier Hornhaut. Durch ihre Gefäßfreiheit gilt die gesunde Hornhaut
nämlich als „immunologisch privilegiert“, da durch die fehlende Gefäßanbindung zu
den
sekundären
Spenderantigenen
lymphatischen
reduziert
ist.
Organen
So
eine
zeigen
Sensibilisierung
Transplantationen
gegenüber
bei
nicht
vaskularisierten Hornhäuten eine sehr gute Erfolgsquote (Abstoßungsrate <10%),
selbst ohne permanente immunsuppressive Therapie. In Hornhäuten mit bereits vor
8
Transplantation bestehenden Neovaskularisationen sinken diese Erfolgsquoten
allerdings erheblich (Abstoßungsrate zwischen 60-90%). Wie durch Dietrich et al.
gezeigt werden konnte, spielen hierbei nicht nur Blut-, sondern vor allem auch
klinisch unsichtbare Lymphgefäße eine wichtige Rolle, da es durch diese afferenten
Lymphgefäße zu einer erleichterte Aufnahme von Spenderantigenen in die
sekundären lymphatischen Organe und Sensibilisierung mit anschließender
Abstoßungsreaktion kommt.(27,20,30)
Eine
Rolle
von
VEGF-A
im
Kontext
der
inflammatorischen
kornealen
Neovaskularisation wurde durch erhöhte VEGF-A mRNA- und Protein-Spiegel in
der Kornea nachgewiesen. Hierbei wurde VEGF-A als einer der wichtigsten
endogenen angiogenen Faktoren identifiziert.(3,41) Weiterhin konnte gezeigt werden,
dass eine subspezifische Hemmung von VEGF-A dabei signifikant das Wachstum
von pathologischen Gefäßen in die entzündete Hornhaut reduziert. Ranibizumab,
das Fab-Fragment eines rekombinanten, humanen, monoklonalen Antikörpers
gegen
VEGF-A
ist
für
die
Behandlung
pathologischer
choroidaler
Neovaskularisationen unterschiedlicher Genese bereits zugelassen und hat seine
Wirksamkeit in der Hemmung von Gefäßneubildungen am hinteren Augenpol und
dadurch in der Verbesserung der Sehkraft bewiesen.(6,14,42,52,55) Ranibizumab wird in
Tiermodellen und in der off-label Therapie am Menschen, nun auch an der
Augenoberfläche,
zur
Hemmung
kornealer
Neovaskularisation,
bei
der
Limbusstammzellinsuffizienz, bei Verätzungen und dem Neovaskularisationsglaukom angewandt.(7,9,19,31,56,57)
Weiterhin
zeigen
Bevazicumab
Studien,
einen
dass
hemmenden
der
vollständige
Effekt
auf
anti-VEGF-A
die
korneale
Antikörper
Häm-
und
Lymphangiogenese in der Maus und im Menschen hat.(11,45) Einige Studien konnten
bereits auch einen hemmenden Effekt von Ranibizumab auf die korneale
Hämangiogenese zeigen. Bisher gibt es noch keine Studie, weder klinisch noch
experimentell,
die
zeigt,
dass
VEGF-A-Inhibitoren
vollständig
korneale
Neovaskularisationen hemmen oder verhindern können. Anti-VEGF Medikamente
werden bisher (off-label) topisch als Augentropfen oder als subkonjunktivale
Injektion verabreicht. Bis heute gibt es aber keine publizierte prospektive
kontrollierte
klinische
Studie
zu
der
Oberflächenerkrankungen beim Menschen.
9
Behandlung
von
okulären
Da es zwar Daten zu dem Effekt von Ranibizumab auf korneale Blut- aber nicht auf
Lymphgefäße gibt, soll diese Studie den Effekt von topisch als Augentropfen
appliziertem Ranibizumab auf die inflammatorische korneale Lymphangiogenese
aufzeigen,
um
so
eine
mögliche
Behandlungsstrategie
zur
Hemmung
pathologischer Neovaskularisationen der Hornhaut genauer zu analysieren.
10
2. Publikation
Mit freundlicher Genehmigung durch Wiley und Blackwell Publishing und nach deren
„Copyright Form“ (Seite 26) ist die Publikation mit dem Titel „Topical Ranibizumab
inhibitsinflammatorycorneal hem- and lymphangiogenesis“ auf den folgenden Seiten
abgedruckt.
Der Artikel wurde am 20. September 2012 in Acta Ophthalmologica - DOI:
10.1111/j.1755-3768.2012.02525.x
–
bei
http://onlinelibrary.wiley.com/
vorab-
veröffentlicht.
In dieser Publikation werden die Methoden und Ergebnisse meiner Forschungsarbeit
beschrieben und dargelegt.
Diese Publikation ist bei Wiley (http://onlinelibrary.wiley.com/) erhältlich:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1755-3768.2012.02525.x/pdf
11
Topical Ranibizumab Inhibits Inflammatory
Corneal Hem- And Lymphangiogenesis
Franziska Bucher1,2*, Anand Parthasarathy1,2,3*, Antonio Bergua2 , Jasmine Onderka2, Birgit
Regenfuß1, Claus Cursiefen1 and Felix Bock1
1
Department of Ophthalmology, University of Cologne, Cologne, Germany; ² Department of
Ophthalmology, University of Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Germany; 3 Cornea Service,
Clinical Research Centre, Vasan Eye Care Hospital, Chennai, India ;4 T.N Shukla Eye Hospital,
Ranjhi, Jabalpur, India
*
Both authors contributed equally
Support: International Council of Ophthalmology (A.P); Interdisciplinary Center for Clinical
Research (IZKF) Erlangen (A9); DFG (SFB 643/B10)
Word Count: 1581
Corresponding author:
Felix Bock, PhD, CorneaLab, Experimental Ophthalmology, Dept. of Ophthalmology,
Unversity of Cologne, Kerpener Str. 62, 90524 Cologne, Germany
Tel.: +49-(0)221-478-97789, Fax: +49-(0)221-478-97836
Email: [email protected]
12
Abstract
Purpose: Ranibizumab (Lucentis®) is a Fab-Fragment of a recombinant, humanized, monoclonal
anti-VEGF antibody. This study analyzed the ability of topical Ranibizumab to inhibit
lymphangiogenesis in addition to hemangiogenesis after acute corneal inflammation in vivo. In
addition, the effect of Ranibizumab on the proliferation of human lymphatic endothelial cells
(LECs) and blood endothelial cells (BECs) in vitro was studied.
Methods: The inhibitory effect of Ranibizumab on LECs and BECs was studied in vitro using
a proliferation ELISA assay. To study the in vivo effects of Ranibizumab, the mouse model of
suture induced inflammatory corneal neovascularization was used. Study mice received topical
Ranibizumab as eye drops. After one week excised corneas were stained with LYVE-1 and
CD31. Hemangiogenesis and lymphangiogenesis were analyzed morphometrically by using a
semiautomatic method based on the image analyzing program Cell^F.
Results: An antiproliferative effect of Ranibizumab was seen in vitro on both human BECs
and LECs with a significance of p<0.0001 and p <0.0004, respectively. In vivo experiments
showed that topical application of Ranibizumab significantly inhibits both hemangiogenesis
(p=0.0026) and lymphangiogenesis (p=0.0026) in the cornea.
Conclusion: Ranibizumab is a potent inhibitor of inflammatory corneal hemangiogenesis and
lymphangiogenesis in vivo with a direct inhibitory effect on both endothelial cell types in vitro.
This study for the first time demonstrates an inhibitory effect of Ranibizumab on lymphatic
vessels which could have a wider range of clinical applications.
13
Keywords: Ranibizumab, cornea, neovascularization, VEGF, hemangiogenesis,
lymphangiogenesis
14
Introduction:
The vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) is required for vascular development and
for pathological tumor, iris, retinal and choroidal neovascularization (Adamis et al. 1996;
Amano et al. 1998; Ishida et al. 2003). Pathological corneal neovascularization following an
inflammatory insult is mainly mediated by VEGF-A and remains an unsolved therapeutic
problem. Additionally the concurrent invasion of lymphatic vessels has implications for
allograft transplant survival (Cursiefen et al. 2002; Cursiefen et al. 2006; Cursiefen 2007;
Dietrich et al. 2010). The role of VEGF-A in inflammatory neovascularization has been well
elucidated by the raised VEGF-A mRNA and protein levels in the cornea thus identifying
VEGF-A as a functional endogenous corneal angiogenic factor (Amano et al. 1998; Joussen et
al. 2003). Subsequent specific inhibition of VEGF-A bioactivity would suppress vessel growth
(Krzystolik et al. 2002; Ishida et al. 2003).
Ranibizumab, a Fab-Fragment of a recombinant, humanized, monoclonal anti-VEGF antibody
is licensed for the treatment of pathological choroidal neovascularization due to various
etiologies and has demonstrated efficacy both in regressing new vessels and improving visual
acuity (Boyer et al. 2007; Kaiser et al. 2007; Antoszyk et al. 2008; Regillo et al. 2008; Silva et
al. 2008). Ranibizumab has been applied in animal models and off-label use in humans to
inhibit corneal vascularisation including diseases with limbal stem cell deficiency like chemical
injuries and vessel growth in neovascular glaucoma (Awadein 2007; Chilov et al. 2007;
Dunavoelgyi et al. 2007; Erdurmus & Totan 2007; Bahar et al. 2008; Bahar et al. 2008;
Carrasco 2008; Uy et al. 2008; Yoeruek et al. 2008). There are also studies showing that the
anti-VEGF antibody Bevazicumab has an inhibitory effect on hem- and lymphangiogenesis in
mouse and man (Bock et al. 2007; Koenig et al. 2009). In addition there are a number of studies
showing an inhibitory effect of Ranibizumab on corneal neovascularisation. However, the
patient series reported are small and there are still no long term data. Furthermore there is no
study, neither experimental nor clinical, showing that VEGF-A-inhibitors can completely
15
prevent or reverse the corneal neovascularisation. We have previously demonstrated that
corneal hem- and lymphangiogenesis can be inhibited by competitively binding a specific
neutralizing anti-VEGF antibody to VEGF-A with a specific neutralizing anti-VEGF antibody
in an animal model and human subjects (Bock et al. 2007; Bock et al. 2008). In addition recent
works have now shown that VEGF-A is also implicated in lymphangiogenesis (Hirakawa et al.
2005; Halin et al. 2007). Anti-VEGF agents have been previously administered topically and
injected but given the fact that there are no published prospective controlled clinical trials on
anti-VEGF treatment for ocular surface disease, its exact administration has yet to be
determined (Awadein 2007; Bock et al. 2008; Uy et al. 2008).
Most recently Sener et al described in an animal model a profound effect of locally applied
Ranibizumab on corneal neovascularisation (Sener et al. 2011). In addition, Dana et al.
successfully completed a phase I clinical study analysing the antiangiogenic effect of topical
Ranibizumab (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00681889?term=nct00681889&rank=1).
Further studies using Ranibizumab at the ocular surface are currently in progress
(http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=ranibizumab+cornea).
Since there are so far no data available on the effect of Ranibizumab on lymphatic vessels, this
study was initiated to analyze the inhibitory effect of topical Ranibizumab on corneal
lymphangiogenesis.
Methods:
Blood and lymphatic endothelial cell proliferation ELISA
Human lymphatic microvascular endothelial cells (HLMVEC; Cambrex Bio Science,
Walkersville, MD, USA) and blood endothelial cells were cultured in EGM2-MV medium
(Cambrex Bio Science) following manufacturer`s instructions (Bock et al. 2007). For the
ELISA, cells were seeded in a 96-well plate in EGM2-MV medium at a density of 2 x 103
cells/well and left over night to attach. For each group, 30 wells were supplied with either
16
verum or control substance. Medium was replaced with serum-, bFGF- and VEGF-A-free
EGM2-MV medium. Ranibizumab (10nM, 48ng/ml; Novartis International AG, Basel,
Switzerland) and BrdU (0.1 µl/ml; Cell Proliferation ELISA, BrdU, Roche, Penzberg,
Germany) were added. After 3h the medium was supplemented with 0.0025±0.002 µg/ml
(costumer data) human VEGF-A (EGM2-MV supplement, Cambrex Bio Science, Walkersville,
Inc.). Cells were fixed and stained after 3 days according to manufacturer`s instructions (Cell
Proliferation ELISA, BrdU, Roche, Penzberg, Germany). Colorimetric analyses were
performed with the ELISA reader SLT Spectra (SLT Labinstruments Deutschland GmbH,
Crailsheim, Germany). Absorbance at 450 nm with a reference wavelength of 690 nm is
defined as the BrdU labeling index.
Mouse model for suture induced inflammatory corneal neovascularization
For this assay female BALB/c mice (aged 6-8 weeks) were used. The protocols were in
accordance with the Association for Research in Vision and Ophthalmology’s Statement for the
Use of Animals in Ophthalmology and Vision Research and institutional guidelines regarding
animal experimentation were followed.
Prior to surgery, each animal was deeply anesthetized with an intramuscular injection of
KetanestS (8 mg/kg) and Rompun (0.1 ml/kg). Three 11-0 nylon sutures (Serag Wiessner,
Naila, Germany) were placed intrastromally extending over 120° of corneal circumference
each. The outer point of entry was near the limbus, and the inner exit point was the corneal
centre equidistant from limbus to obtain standardized angiogenic responses in three parts of the
cornea. Sutures were left in place for duration of experiment. The central 2 mm of the
epithelium was debried prior to suturing. Treatment group (n=25) received Ranibizumab
(Roche, USA) as topical drops (5µl/drop; conc.: 5mg/ml) four times daily for 5 days (equals
0.5mg, dosage advise by the manufacturer for intravitreal injections) while the control group
(n=25) received saline solution. The mice were euthanized after 1 week. Same experiments
were performed without central debridement of the epithelium prior to suturing (n=5 received
17
Ranibizumab, n=5 saline solution). Eye drops were given as in the group of mice with
debridement prior to suturing (four times a day for 5 days, 0,5mg Ranibizumab). Mice were
euthanized after 7 days as it is the best point of time with the maximum of hem- and lymphatic
vessels (Cursiefen et al. 2006).
Corneal whole mounts and morphological assessment of hemangiogenesis and
lymphangiogenesis.
The blood and lymphatic vessels in the corneal wholemounts were stained with LYVE-1 and
CD31 antibodies as described previously (Cursiefen et al. 2002; Chen et al. 2004; Bock et al.
2007). In short, lymphatic vessels were stained with rabbit anti-mouse LYVE-1 (1:500;
AngioBio, DelMar, USA) and blood vessels were stained with an anti-CD-31-FITC (Acris
Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Germany) antibody. LYVE-1 was detected with a Cy3conjugated secondary antibody. Isotype control was assured with a FITC-conjugated normal
rat2A IgG for CD31-FITC and with a normal rabbit IgG (both Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, USA) for LYVE-1.
Functional and statistical analysis
Double stained wholemounts were analyzed with a fluorescence microscope (BX51, Olympus
Optical Co., Hamburg, Germany) and digital pictures were taken with a 12-bit monochrome
CCD camera (F-View II, Olympus, Hamburg, Germany). Each wholemount picture was
assembled out of 9 pictures taken at 100x magnification. The areas covered with blood or
lymphatic vessels were detected with an algorithm established in the image analyzing program
Cell^F (Olympus, Hamburg, Germany) as described previously (Bock et al. 2008). The
quantification of the vascularized area was done on multi image alignments covering the whole
cornea (Bock et al. 2008). Statistical analysis was done by Microsoft Excel 2000 and InStat 3
Version 3.06 (GraphPad Software Inc, San Diego, California, USA). Graphs were drawn using
Prism4, Version 4.03 (GraphPad Software Inc, San Diego, California, USA). Student’s t-test
was used to detect the difference between the groups.
18
Results
Ranibizumab has a direct inhibitory effect on LECs and BECs
Ranibizumab inhibits blood endothelial cell (BECs) proliferation in vitro along with a
previously not shown antilymphangiogenic effect on lymphatic endothelial cells (LECs). The
student’s t-test showed that the proliferation of both cell cultures was significantly inhibited by
Ranibizumab treatment (BECs: p<0.0001; LECs: p=0.0003) (Figure 1).
Topical Ranibizumab inhibits hem and lymphangiogenesis in vivo
We provided quantitative analysis of the neovascularised corneal area identified by
immunohistochemical staining as shown previously (Bock et al. 2008) which revealed that
topical application of Ranibizumab in mice with epithelium debridement significantly reduces
the density of blood and lymphatic vessels in the corneas of treated mice by binding to murine
VEGF-A relative to animals that received normal saline after seven days of topical application
(control: 100 % [SE mean: 4.87%] (Figure 2), Ranibizumab: 79.52% [SE mean: 4.19%], p=
0.0026 (Figure 2 a). For lymphatic vessels we were able to demonstrate an equally significant
inhibition (control: 100 % [SE mean: 8.44%], Ranibizumab: 69.52% [SE mean: 4.54%], p=
0.0026 (Figure 2 b). Inhibition of hem- (control: 100% [SE mean: 11.4%], Ranibizumab:
76.7% [SE mean: 10.2%], p=0.0157) (Figure 2 g) and lymphangiogenesis (control: 100% [SE
mean: 16.8%], Ranibizumab: 53.1% [SE mean: 15.7%], p=0.0035) (Figure 2 h) in corneas
without debrided epithelium was comparable to those that underwent debridement.
19
Discussion
Our experiments demonstrate for the first time an antiproliferative effect of Ranibizumab on
LECs and BECs in vitro and a significant effect of Ranibizumab on corneal lymphangiogenesis
in the cornea in vivo.
The majority of the laboratory experiments with Ranibizumab has focused on the intravitreal
use of the drug (Husain et al. 2005; Kim et al. 2006; Lu & Adelman 2008; Lu & Adelman
2009; Zayit-Soudry et al. 2010; Kim et al. 2011; Lai et al. 2011). Our corneal and in vitro
experiments comprehensively show that Ranibizumab has an antiproliferative effect not only
on BECs but also on LECs in vitro and additionally shows a significant effect on inflammatory
lymphangiogenesis in the cornea even after short time application. These results underline the
recent finding that VEGF-A seem to play a crucial role in the development of inflammatory
induced lymphangiogenesis (Chen et al. 2004; Cursiefen 2007). We observed a stronger impact
on lymphangiogenesis in the in vivo model than in the in vitro system. Although it was shown,
that VEGF- A has a direct proliferative effect on lymphatic endothelial cells (Bock et al. 2007),
Maruyama et al (Maruyama et al. 2005) showed, that the prolymphangiogenic effect of VEGFA is mainly indirect via the recruitment of macrophages, which in turn release
prolymphangiogenic growth factors like VEGF-C and D. Blocking VEGF and with it
lymphangiogenesis has a profound effect on transplant survival (Dietrich et al. 2010). With
Ranibizumab only blocking VEGF-A and not all of the various angiogenic factors in vivo, as
e.g. bFGF, angiostatin, endostatin, or pigment epithelium–derived factor (PEDF), it will be not
possible to completely block hem- and lymphangiogenesis. With Ranibizumab given as eye
drops there is always a uncertainty of the exact used dosage. We followed the advised
concentration for intravitreal Ranibizumab (0,5mg) as explained in the methods. Like the
progenitor Bevacizumab (Avastin®) the IgG1 kappa isotype monoclonal antibody fragment
Ranibizumab competitively binds with all isoforms of VEGF (Chen et al. 1999; Liang et al.
2006). In addition Ranibizumab lacks the Fc region of the antibody and is less likely to cause
20
complement-mediated inflammation after application which might be an additional benefit in
inflamed eyes (Ferrara et al. 2006).
These aforementioned effects and advantages of Ranibizumab have implications for the ongoing
clinical trials for the use of topical Ranibizumab in patients with progressive neovascularisation
at the ocular surface (http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=ranibizumab+cornea). The
important role of an anti-VEGF therapy to prolong graft survival in high risk cornea with
regressed or new blood and lymphatic vessels has recently been demonstrated (Bachmann et al.
2008; Hos et al. 2008; Dietrich et al. 2010). Having shown here that Ranibizumab also inhibits
lymphangiogenesis in the cornea further research will show whether Ranibizumab also promotes
graft survival by interfering with the afferent and efferent arm of the immune reflex arc as shown
earlier (Chen et al. 2004; Dana 2006).
Experiments without debridement of the epithelium showed an even stronger effect on hemand lymphangiogenesis. There might be two facts which contribute to this effect. Dastjerdi et
al. (Dastjerdi et al. 2011)has recently shown, that vascularized corneas are sufficiently
penetrated by the anti-VEGF-A antibody bevacizumab. In addition it is known, that the corneal
epithelium is not only a physical barrier but also contains decoy-mechanisms, e.g. soluble
VEGFR1, R2 or R3 (Cursiefen et al. 2006; Ambati et al. 2007; Albuquerque et al. 2009),
which maintain the avascularity of the cornea. So the debridement on the one hand guarantees a
good penetration of the drug and on the other hand lowers the antiangiogenic properties of the
cornea. Therefore the angiogenic stimulus after abrasion might be higher than with the intact
epithelium, so that a higher antiangiogenic effect at the same concentration of ranibizumab can
be seen with epithelium.
Further studies to determine optimal dose for topical use and penetration through intact
epithelium along with the elucidation of the mechanism of action of Ranibizumab on
lymphangiogenesis provide additional avenues for research.
21
In conclusion Ranibizumab inhibits not only hem-, but also inflammatory corneal
lymphangiogenesis in vivo. Topical Ranibizumab as a pharmacological agent has not only the
ability to reduce inflammation associated neovascularization but can have additional clinical
indications which have to be further explored.
22
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26
Figure 1
Figure 1:
Ranibizumab inhibits proliferation of blood endothelial cells (BECs), (left panel: Ranibizumab
10nmol/l; inhibition by 20%, p<0.0001) and lymphatic endothelial cells (LECs) in vitro (right
panel: Ranibizumab 10nmol/l: Inhibition by 10 %, p=0.0003). Proliferation was measured by a
cell proliferation ELISA with BrdU.
27
Figure 2
Blood
Lymph
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Control
Ranibizumab
28
Figure 2:
Ranibizumab inhibits proliferation of blood and lymphatic vessels in vivo (a-h). Fluorescent
pictures of corneal whole mounts showing Ranibizumab treated corneas (c,d) with lesser
growth of blood vessels and lymph vessels as compared to controls (a,b); Graphs showing (in
debrided corneas) that hemangiogenesis was inhibited by ~20% as compared to controls, p =
0.0026 and lymphangiogenesis by ~30%, p= 0.0026 (e,f). Also vascularised corneas with
epithelium showed inhibition of hem- (~25%, p=0.0157) and lymphangiogenesis (~45%,
p=0.0035) while treated with Ranibizumab compared to controls (g,h).
29
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30
3. Diskussion:
Der
VEGF-A-Inhibitor
Ranibizumab
(Lucentis®)
der
für
die
altersabhängige
Makuladegeneration entwickelt und zugelassen wurde zeigt in unserer Studie zum
ersten Mal einen direkten antiproliferativen Effekt auf Lymphendothelzellen (LECs)
und Blutendothelzellen (BECs) in vitro sowie eine signifikante Hemmung kornealer
Lymphangiogenese in vivo. Die Bindung von VEGF-A durch Ranibizumab, dem FabFragment des entsprechenden monoklonalen Antikörpers, reduziert das Wachstum
von Blut- und Lymphendothelzellen und hemmt das Einwachsen von pathologischen
Gefäßen in die physiologisch avaskuläre Hornhaut. Dass die Anwesenheit von
VEGFR-1, VEGFR-3 und Thrombospondin als endogene antiangiogene Faktoren
maßgeblich an dieser Avaskularität der Kornea beteiligt ist, konnte in früheren
Arbeiten
bereits
gezeigt
werden.(4,24,45,51,53)
Allerdings
können
zahlreiche
Erkrankungen einen Zusammenbruch dieses angiogenen Privileges auslösen und
trotz Anwesenheit dieser endogenen Faktoren zu pathologischen kornealen
Neovaskularisationen führen. Primäres Ziel dieser Arbeit war es, neue Wege zu
analysieren, wie pathologische Neovaskularisationen der Kornea zu verhindern sind,
und damit die Klarheit sowie die Avaskularität der Kornea aufrecht zu erhalten.
Die Mehrzahl der experimentellen Studien mit Ranibizumab konzentriert sich lediglich
auf die intravitreale Gabe des Medikaments. Hauptsächlich finden VEGF-Inhibitoren
Anwendung
für
die
Makuladegeneration,
Behandlung
eines
der
diabetischen
feuchten
Form
Makulaödems
der
altersabhängigen
oder
nach
retinalen
Gefäßverschlüssen.(38,43,44,47,50,58) Es gibt nur wenige klinische Studien, die sich mit der
topischen Wirkung dieser Substanzen bei neovaskulären Oberflächenerkrankungen
des Auges befassen.
Unsere in vitro und in vivo Experimente zeigen, dass Ranibizumab nicht nur auf LECs
und BECs inhibierend wirkt, sondern zusätzlich einen hemmenden Effekt in der
entzündlich induzierten Lymphangiogenese der Kornea aufzeigt, auch nach einer
kurzen topischen Applikation von 5 Tagen in Form von Augentropfen. Diese
Ergebnisse unterstreichen aktuelle Forschungsergebnisse, welche zeigen, dass
VEGF-A
eine
entscheidende
Rolle
in
der
Entwicklung
der
entzündlichen
Lymphangiogenese spielt und damit wichtig für die Avaskularität dieser ist.(17,27)
31
Obwohl eine Vielzahl an angiogenen Faktoren für pathologische Neovaskularisationen
verantwortlich sind, zeigt schon die Hemmung eines einzigen Faktors (wie hier z.B.
VEGF-A) bereits einen signifikanten Effekt.
Dabei beobachteten wir einen stärkeren inhibierenden Effekt von Ranibizumab im
fadeninduzierten inflammatorischen Maus-Model der kornealen Neovaskularisation als
in den in vitro Versuchen, bei welchen lediglich der direkte Effekt von Ranibizumab auf
die Proliferation von vaskulären Endothelzellen untersucht wurde. Auch wenn
bewiesen ist, dass VEGF-A einen direkt proliferativen Effekt auf lymphatische
Endothelzellen hat,(11) haben Cursiefen und Maruyaman gezeigt,(21,51) dass der
prolymphangiogene Effekt von VEGF-A hauptsächlich indirekt ist und durch die
Rekrutierung von Makrophagen induziert wird. Diese in die entzündete Hornhaut
rekrutieren Makrophagen produzieren wiederum eine Vielzahl prolymphangiogener
Wachstumsfaktoren wie z.B. VEGF-C und -D und führen somit zu einer signifikanten
Amplifikation inflammatorischer kornealer (Häm- und) Lymphangiogenese. Weiterhin
konnte gezeigt werden, dass sich Makrophagen, welche in die entzündete Hornhaut
rekrutiert werden, direkt in präexistente Lymphgefäße integrieren können. Somit wirkt
eine Hemmung der Rekrutierung von Makrophagen in zweifacher Hinsicht
antilymphangiogen:
Durch
verminderte
Wachstumsfaktorsekretion
und
durch
verminderte Integration von Makrophagen in (bereits gebildete) Lymphgefäße. Die
Blockade dieses indirekten, Makrophagen-vermittelten Lymphangiogenese-Pathways
scheint eines der Mechanismen zu sein, durch welchen Ranibizumab einen stärkeren
Einfluss
auf
die
in
vivo
Lymphangiogenese
im
Vergleich
zur
in
vitro
Lymphendothelzellproliferation hat.
Die Blockade von VEGF-A und damit Hemmung der Lymphangiogenese hat einen
deutlich
positiven
transplantation.(30)
Effekt
auf
das
Hochrisikopatienten,
Empfängerbett aufweisen,
haben
ein
Transplantatüberleben
die
ein
erhöhtes
pathologisch
Risiko,
nach
Hornhaut-
vaskularisiertes
die Spenderhornhaut
abzustoßen. Die größten Erfolgsraten haben Hornhauttransplantationen in einem
gefäß- und entzündungsfreien Empfängerbett. Hier liegt die Erfolgsrate mit 90% weit
über den unter 50% der Hochrisikopatienten mit vaskularisiertem Empfängerbett.
Postoperativ können als Folge einer akuten Entzündungsreaktion, induziert durch die
korneale Wundheilung, Gefäße über das Transplant-Interface bis in das Zentrum der
Kornea einwachsen. Als afferenter Arm des Immunreflexbogens schaffen diese neu
32
gebildeten Lymphgefäße einen vereinfachten Weg für antigenpräsentierende Zellen
und Antigene zu den regionalen Lymphknoten und erhöhen auf diesem Weg die
Wahrscheinlichkeit einer Sensibilisierung und anschließender Abstoßungsreaktion.(51)
Eine Therapie mit VEGF-Inhibitoren könnte bei dieser Patientengruppe eine
Behandlungsmöglichkeit
zur
Vermeidung
von
immunologisch
vermittelten
Abstoßungsreaktionen darstellen. Bisher hat jedoch keines der verfügbaren anti-VEGF
Medikamente eine Zulassung für die topische Anwendung an der Augenoberfläche
erhalten. Die wichtige Rolle einer anti-VEGF Therapie zur Verlängerung des
Transplantatüberlebens in Hochrisiko-Empfängern wurde erst kürzlich gezeigt.(8,30,36)
Nicht nur Patienten nach erfolgter Hornhauttransplantation, sondern auch Patienten
mit anderen neovaskulären Erkrankungen der Hornhaut, könnten von einer topischen
Behandlung mit VEGF-Inhibitoren profitieren. Prinizipiell jeder Zustand der das
angiogene Privileg der Kornea durchbricht stellt eine Bedrohung für das Sehen da und
es
bestehen
derzeit
nur
begrenzte
Behandlungsmöglichkeiten
diese
neuen
pathologischen Gefäße zu unterdrücken. Auch beim schweren trockenen Auge, der
Limbusstammzellinsuffizienz, Tumoren der Augenoberfläche oder der herpetischen
Keratitis kann es zu diesen kornealen Neovaskularisation kommen. Sobald Gefäße in
das Zentrum hineingewachsen sind und die Hornhaut an Transparenz verloren hat
besteht keine Möglichkeit dies rückgängig zu machen. Da in dieser Arbeit gezeigt
werden konnte, dass Ranibizumab auch die Lymphangiogenese in der Kornea
signifikant hemmt, wird man weitere klinische Studien und Langzeitdaten benötigen
bis zur Zulassung dieser Substanzen für die Augenoberfläche.
Da Ranibizumab in vivo nur VEGF-A und nicht die anderen angiogenen Faktoren, wie
z.B.
VEGF-C,
VEGF-D,
bFGF,
Angiostatin,
Endostatin,
oder
PEDF
(„pigmentepitheliumderivedfactor“) hemmt, wird es nicht möglich sein die Häm- und
Lymphangiogenese mit der Anwendung eines einzelnen Medikamentes vollständig zu
blockieren. Weitere experimentelle Studien sind notwendig um das Geheimnis des
angiogenen Privilegs vollständig zu lüften.
Unsere in vivo Versuche ohne Epithelabrasio zeigten einen stärkeren Effekt auf die
Häm- und Lymphangiogenese als mit Abrasio. Zwei Mechanismen könnten hierfür die
Ursache sein: Dastjerdi et al.(29) zeigten kürzlich, dass vaskularisierte Korneas von
dem anti-VEGF-A Antikörper Bevacizumab trotz intaktem Epithel in ausreichender
33
Konzentration penetriert werden. Außerdem ist bekannt, dass das Epithel der Kornea
nicht nur eine physikalische Barriere ist, sondern auch einen Großteil der bereits
beschriebenen Decoy-Mechanismen wie z.B. lösliche VEGFR1, R2 oder R3 enthält,
welche dafür verantwortlich sind, dass die Kornea avaskulär bleibt.(2,5,24,26) Deswegen
garantiert das Debridement des Epithels zum einen eine gute Penetration des
Medikaments und zum anderen reduziert es die endogenen antiangiogenen
Eigenschaften der Kornea. Der angiogene Stimulus kann also nach Abrasio höher
sein als bei intaktem Epithel, so dass ein höherer antiangiogener Effekt bei der
gleichen Konzentration von Ranibizumab gesehen werden kann als bei intaktem
Epithel.
Für
eine
mögliche
klinische
Anwendung
von
VEGF-Inhibitoren
an
der
Augenoberfläche beim Menschen spielen natürlich noch andere Faktoren eine
entscheidende Rolle. Nicht nur die Hemmung der Gefäße sondern auch die
Verträglichkeit und Toxizität dieser Substanzen müssen weiter charakterisiert werden.
Bisher konnte nicht nachgewiesen werden ob die Inhibierung von VEGF-A an der
Augenoberfläche zu Veränderungen z.B. der kornealen Innervation führen oder einen
neurotoxischen Effekt haben.
In Anbetracht der wenigen vorhandenen klinischen Studien und der bisher noch nicht
ausreichenden Untersuchung auf mögliche Nebenwirkungen an der Augenoberfläche
wird es noch mehrere Studien benötigen, ob sich diese Medikamente zur topischen
Anwendung (z.B. als Augentropfen) eignen.
34
4. Zusammenfassung:
Die
Wirkung
von
Ranibizumab
(Lucentis®)
auf
die
korneale
Häm-
und
Lymphangiogenese in vivo und auf die Proliferation humaner, lymphatischer
Endothelzellen (“lymphatic endothelial cells“ LECs) und Blutgefäß-Endothelzellen
(„blood endothelial cells“ BECs) in vitro wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal
beschrieben.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Ranibizumab ein potenter Inhibitor der
inflammatorischen kornealen Häm- und Lymphangiogenese in vivo und der direkten
Proliferation beider Endothelzelltypen in vitro darstellt. Es konnte erstmals gezeigt
werden, dass Ranibizumab einen hemmenden Effekt auf Lymphgefäße hat und damit
eine breite klinische Anwendung eröffnet.
Neue Behandlungsmöglichkeiten bei Hornhauttransplantatabstoßung, herpetischer
Keratitis oder dem trockenen Auge könnten nun erschlossen werden. Hierzu werden
weitere Studien notwendig sein um die optimale Dosis für die topische Behandlung zu
bestimmen, welche eine ausreichende Penetration durch das intakte Epithel
gewährleistet.
Zusammenfassend hemmt Ranibizumab nicht nur die entzündlich assoziierte Häm-,
sondern auch die Lymphangiogenese in vivo. Weitere klinische Anwendungsbereiche
müssen erst noch erforscht werden.
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6. Lebenslauf:
Mein
Lebenslauf
wird
aus
Gründen
des
Datenschutzes
elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
40
in
der