Ginkgo biloba — Ein modernes pflanzliches Arzneimittel

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Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Zürich (1993) 13813: 125-168
Ginkgo biloba — Ein modernes pflanzliches Arzneimittel
Otto Sticher, ETH Zürich
Präparate aus Ginkgo-Blättern werden in der Bundesrepublik Deutschland und in Frankreich seit
längerer Zeit in der Therapie von peripheren und zentralen Durchblutungsstörungen und von
Hirnleistungsstörungen eingesetzt. Fertigarzneimittel auf der Basis des bis 1989 patentrechtlich
geschützten Spezialextraktes EGb 761 haben höchste Umsatzzahlen erreicht. Mittlerweile sind
auch in der Schweiz etliche Produkte mit Ginkgo-Extrakten erhältlich, die in erster Linie in der
Selbstmedikation eingesetzt werden.
Im vorliegenden Review werden die Systematik, Botanik, Chemie, Pharmakologie und Klinik
sowie die Analytik von Ginkgo biloba und Ginkgo-Phytopharmaka vorgestellt. Arbeiten des
eigenen Arbeitskreises, die sich mit der Qualitätskontrolle befassen, werden im Detail besprochen.
Ginkgo biloba – A Modern Phytomedicine
Phytomedicines based on extracts from the leaves of Ginkgo biloba are used in the Federal
Republic of Germany and in France a rather long time for the treatment of peripheral vascular
insufficiency and cerebrovascular insufficiency, and disturbances of cerebral function. In Europe, commercially available preparations based on the special extract EGb 761 have a turnover of
about 500 million US dollars. Meanwhile also in Switzerland various Ginkgo preparations are
on the market.
In this review taxonomy, botany, chemistry, pharmacology and clinical applications as well
as quality control of Ginkgo biloba and phytomedicines based on leaf extracts of this plant are
described. Research work of the own laboratory dealing with quality control is discussed in detail.
1 Einleitung
In Europa, insbesondere in der Bundesrepublik Deutschland und Frankreich,
aber auch in anderen Ländern wie der Schweiz, existiert ein grosser Markt für
Phytopharmaka (= aus pflanzlichen Rohstoffen hergestellte Arzneimittel), welche aus Blatt-Extrakten von Ginkgo biloba hergestellt werden. Im Unterschied
zu den meisten anderen pflanzlichen Heilmitteln, handelt es sich bei «Ginkgo»
um ein gezielt entwickeltes Phytopharmakum, das seinen Ursprung nicht in der
traditionellen Medizin hat. Der europäische Ginkgo-Markt hat einen Jahresumsatz von über 800 Millionen DM (Publikumspreise), woraus seine enorme
Bedeutung hervorgeht. Im Vergleich dazu gibt es nur wenige Monopräparate
einzelner Firmen, in der Schweiz z. B. Rocephin (Hoffmann-La Roche), Sandimmun (Sandoz) oder Voltaren (Ciba), welche weltweit Umsätze in der Grösse
von 1 Milliarde SFr. oder darüber aufweisen. Das Marktpotential für GinkgoPräparate scheint immer noch steigend zu sein, was bei der heutigen Bevölkerungsstruktur in den meisten europäischen Ländern, welche mit zunehmender
Überalterung einhergeht, nicht verwunderlich ist. Die Indikationen von Ginkgo-Extrakten sind in erster Linie auf Gebrechen älterer Menschen ausgerichtet.
Basierend auf den Untersuchungen des Ginkgo-Extraktes EGb 761 (Dr. W.
Schwabe, Arzneimittel, Karlsruhe), ergaben sich folgende Hauptanwendungsgebiete:
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Otto Sticher
a) Hirnleistungsstörungen (nachlassende intellektuelle Leistungsfähigkeit)
mit den Symptomen Schwindel, Ohrensausen, Kopfschmerzen, Gedächtnisschwäche, Stimmungslabilität mit Ängstlichkeit
b) periphere arterielle Durchblutungsstörungen mit erhaltener Durchblutungsreserve (intermittierendes Hinken) und
c) infolge Zervikalsyndroms beeinträchtigtes Hörvermögen (Firmenbroschüre «Tebonin® , Ginkgo-biloba-Spezialextrakt EGb 761»).
Es gibt heute über «Ginkgo» eine ansehnliche Literatur, u.a. auch in Buchform (z. B. E.W. Fünfgeld, 1988; P. Braquet, 1988/89; F.V. DeFeudis, 1991). Die
vorliegende Arbeit soll dem naturwissenschaftlich wie medizinisch interessierten Leser eine Übersicht geben über Systematik, Botanik, Chemie, Pharmakologie und Klinik, sowie die Analytik von Ginkgo biloba und von Ginkgo-Präparaten, wobei Arbeiten des eigenen Arbeitskreises, die sich mit der Qualitätskontrolle befassen, ausführlicher besprochen werden.
2 Systematische Einteilung der Ginkgoopsida im Pflanzenreich
Gattung (Ginkgo) und Art (biloba) wurden von Linne 1771 in seinem Werk
«Mantissa plantarum altera» erstmals gültig beschrieben. Die Zuordnung zu
einer eigenen Familie (Ginkgoaceae) und einer eigenen Klasse (Ginkgoatae,
heute Ginkgoopsida) wurde 1897 von Engler vorgenommen. Ginkgo biloba L.
ist der einzige überlebende Vertreter der Klasse Ginkgoopsida, die zu den
Coniferophytina (Gymnospermen) gehört, und zeigt keinerlei Verwandtschaft
zu anderen heute lebenden Pflanzenarten. PaläobotanisChe Studien und Fossilfunde belegen eine weltweite Verbreitung und Formenfülle der Ginkgoopsida
im Mesophyticum (Gymnospermenzeitalter; vor ca. 250-100 Mio Jahren). Mit
Sicherheit kann die Klasse bis ins Palaeophyticum (Unterperm bis Oberdevon)
nachgewiesen werden (Bild 1). Im Jura findet sich die Gattung Ginkgo mit
Sippen, die der einzigen heute noch lebenden Art Ginkgo biloba bereits sehr
ähnlich waren. Die zahlreichen verwandten Arten und Gattungen von Ginkgo
biloba sind aber alle in den letzten paar Millionen Jahren ausgestorben. Er
selber wurde während der Eiszeit aus Europa zurückgedrängt, konnte aber im
ostasiatischen Raum überleben. Heute findet man ihn als Wildbestand nur noch
in Südost-China in den Provinzen Anhui und Zhejiang. Von dort gelangte er in
historischer Zeit wieder nach Japan und Korea.
Ein Baum, der den mannigfaltigen Veränderungen von mehr als 100 Millionen Jahren so widersteht, muss von einer sehr konstanten Rasse abstammen
und stellt evolutionsgeschichtlich eine unbedingte Besonderheit dar. Dass der
Ginkgo-Baum im ostasiatischen Raum als «Baum der Erkenntnis» verehrt und
als Tempelbaum vermehrt und gehegt wurde, half vermutlich mit, sein Aussterben zu verhindern. Ginkgo biloba ist somit nach dem darwinistischen Begriff
das Paradebeispiel für ein «lebendes Fossil». Seit dem 18. Jahrhundert werden
Ginkgo-Bäume ausserhalb Asiens überall auf der Welt als Zier- und Alleebäume kultiviert. Mit Hilfe des Menschen bewohnt der Ginkgo biloba somit wieder
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Ginkgo biloba - Ein modernes pflanzliches Arzneimittel
Gymnospermae
Coniferophytina
Cycadophytina
Angiospermae
a
ö
U/
Devon
410
,s
Pinopsida`^
"Progymnosppermae"
Psilophyiatae
Bild 1 Vermutliche stammesgeschichtliche Zusammenhänge zwischen den Verwandtschaftsgruppen der Samenp fl anzen und ihre Entfaltung in den Zeitaltern der Erde. Unsichere, durch
Fossilbefunde nicht dokumentierte Verbindungen sind gestrichelt dargestellt. B = Bennetitidae,
P = Pentoxylidae, E = Ephedridae, G = Gnetidae, W = Welwitschiidae. Pinatae signalisiert die
engere Zusammengehörigkeit der Coniferen (Pinidae) und Eiben (Taxidae) (Original bei E.
Strasburger et al., 1991)
Fig. 1 Hypothetical relationship between the phylogenetic groups of spermatophytes and their
development during the geological ages. Relationships not documented by fossils are marked by
dotted lines. B = bennetitidae, P = pentoxylidae, E = ephedridae, G = gnetidae, W = welwitschiidae. Pinatae refers to the close correlation of the conifers (pinidae) and yews (taxidae) (according
to E. Strasburger et al., 1991)
Räume, die er in den letzten Mi ll ionen Jahren verloren hat (E. Strasburger et
al., 1991; P.F. Michel, 1986 und 1988; I. Müller, 1992; V. Melzheimer, 1992).
3 Botanische Merkmale von Ginkgo biloba
Ginkgo biloba stellt keine speziellen Ansprüche an den Boden, ist winterhart,
wenig anfällig gegenüber der Luft- und Landverschmutzung und wächst deshalb auch gut in den Städten. Der Ginkgo-Baum kann eine Höhe von 30 bis 40
Metern und ein ansehnliches Alter erreichen. In der Jugend hat er einen
schlanken Wuchs, später nimmt er eine breitere, oft pyramidenartige Form an.
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Bild 2 Ginkgo biloba L. (aus H.E. Hess,
1980). Männliche und weibliche Blüten sowie
Blattformen
Fig. 2 Ginkgo biloba L. (from H.E. Hess,
1980). Male and female flowers as well as leaf
shapes
In Ostasien soll es einige tausendjährige Exemplare mit bis zu 20 m Stammumfang geben (V. Melzheimer, 1992). Ginkgo biloba ist diözisch und hat meist
zweilappige, langgestielte Blätter (biloba), welche von gabelig verzweigten
Nerven durchzogen sind (Bild 2).
Bei der Fortpflanzung sind folgende Punkte von besonderem Interesse:
1. Der Ginkgo-Baum ist erst ab einem Alter von 20 Jahren vermehrungsfähig und seine Reproduktionszeit hält bis über 1000 Jahre an.
2. Zwischen der Bestäubung und der Befruchtung verstreichen etwa fünf
Monate.
3. Die männlichen Gametophyten sind keine Spermazellen, sondern Spermatozoiden, und diese sind wie bei den Pteridophyten (Farnpflanzen)
begeisselt.
Üblicherweise dauert die Zeitspanne zwischen Bestäubung und Befruchtung
bei höheren Pflanzen nur Stunden oder einige Tage, bedingt durch die Wanderung der Spermazelle zur Eizelle. Bei Ginkgo biloba wird die Reifung des
weiblichen Gametophyten aber erst durch die Bestäubung induziert; die Befruchtung kann nicht sofort stattfinden, weil zum Zeitpunkt der Bestäubung
noch keine befruchtungsfähige Eizelle vorhanden ist. Anschliessend beginnt
ein komplizierter Reifungsprozess des weiblichen Gametophyten, der von
April/Mai bis zum Herbstbeginn dauert. Wenn die Befruchtung der Eizelle
schlussendlich stattfindet, liegt die unterdessen etwa mirabellengrosse und wie
das Herbstlaub goldgelb gefärbte Samenanlage (häufig fälschlicherweise als
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Frucht bezeichnet) oft schon längst am Boden. Das Fruchtfleisch der Samenanlage enthält neben potentiell allergisierenden Substanzen (z. B. Ginkgol,
Ginkgolsäure, Bilobol = langkettige phenolische Kohlenwasserstoffderivate)
auch übelriechende Säuren (u. a. Buttersäure). Dies ist der Grund dafür, dass
in Europa vorzugsweise männliche Ginkgo-Bäume angepflanzt werden. Die
lange Zeitspanne von einer Generation zur anderen ist dafür verantwortlich,
dass das Ausmass von Mutationen auf die zeitliche Dauer betrachtet klein
gehalten wird, was dazu geführt hat, dass Ginkgo biloba als Art schon mehr als
150 Millionen Jahre überlebt hat (A. Sprecher, 1907; R.T. Major, 1967; V.
Melzheimer, 1992).
4 Inhaltsstoffe von Ginkgo biloba
Die Untersuchungen der Inhaltsstoffe von Ginkgo biloba begannen in den 20er
Jahren dieses Jahrhunderts in Japan. Aber erst nach dem Aufkommen der
modernen analytischen Methoden der Chromatographie und der Spektroskopie
setzte in den 60er Jahren eine intensive chemische Bearbeitung dieser Pflanze
Tabelle 1 Inhaltssto ffe der Blätter von Ginkgo biloba. Aus den Ginkgo-Blättern sind bis heute
eine Vielzahl von apolaren und polaren Inhaltsstoffen isoliert worden.
Table 1
Constituents of the leaves from Ginkgo biloba. Up to now a great number of apolar
and polar compounds have been isolated from Ginkgo leaves.
•
Terpene:
Diterpene mit Ginkgolid A, B, C, J, M
Sesquiterpen: Bilobalid
Polyprenole
Steroide
•
Flavonoide:
Flavon- und Flavonolglykoside
Acylierte Flavonolglykoside
B iflavonoide
Flavan-3-ole
Proanthocyanidine
•
Langkettige Kohlenwasserstoffe und ihre Derivate:
Kohlenwasserstoffe
Alkohole
Aldehyde
Ketone
Säuren
•
Alicyclische Säuren, Cyclite, Kohlenhydrate und ihre Derivate:
Shikimisäure, Chinasäure, Ascorbinsäure, Zuckersäure
Anacardiaceensäuren (Ginkgolsäure, Hydroxyginkgolsäure)
Pinit, Sequoyit, Saccharose
Höhermolekulare Polysaccharide
•
ferner Substanzen wie (Z,Z)-4,4'-(1,4-Pentadien-1,5-diyl)diphenol,
6-Hydroxykynu•ensäure, Cytokinine, ß-Lectine, Carotinoide
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Otto Sticher
ein. Untersucht wurden in erster Linie die Blätter, aus denen ab den 60er Jahren
in der Bundesrepublik Deutschland Phytopharmaka hergestellt wurden, daneben auch die Wurzelrinde, sowie das Holz und die Samen. Eine besondere
Stellung nahmen schon immer die widerlich riechenden Samen ein. Sie gelten
in China u. a. als wirksames Mittel gegen Husten, Asthma, Reizblase und
Alkoholmissbrauch.
Im folgenden wird nur näher auf die Inhaltsstoffe der Blätter von Ginkgo
biloba eingegangen. Aus diesen sind bis heute eine Vielzahl von apolaren und
polaren Substanzen isoliert worden (siehe Tab. 1) (neuere Übersichten finden
sich bei A. Scheunen, 1988; 0. Sticher et al., 1991; J. Hölzl, 1992).
Für die pharmakologischen Wirkungen von Blattextrakten kommen nach
dem heutigen Stand der Wissenschaft hauptsächlich zwei Naturstoffgruppen in
Frage, Flavonoide und Terpene, wie später noch eingehender zu besprechen
sein wird.
Nachdem sich die auf der Basis von Blattextrakten hergestellten Phytopharmaka als wirksame durchblutungsfördernde Mittel etabliert haben und sich die
Ginkgolide (s. u.) als potente PAF-Antagonisten (PAF: Platelet Activating
Factor = Blutplättchenaktivierender Faktor) herausstellten, haben verschiedene
Gruppen auf dem Gebiet der Isolierung von Flavonoiden und Terpenen gearbeitet. Bis heute wurden annähernd vierzig verschiedene flavonoidartige Substanzen und sechs verschiedene terpenoide Verbindungen isoliert.
4.1 Flavonoide
Flavonoide sind niedermolekulare Substanzen, die weitverbreitet im Pflanzenreich vorkommen. Es ist anzunehmen, dass jede grüne Pflanze Flavonoide
enthält. Ihre Vielfalt verdanken sie der Variabilität des Aglykongrundkörpers,
des 2-Phenylchromans, und im besonderen den verschiedenen Zuckern, die vor
allem in 3- und 7-Position mit dem Aglykon verknüpft sind. Dabei kennt man
neben den üblichen 0-Glykosiden eine Reihe von C-Glykosiden. Weitere
Gruppen, die mit dem Flavonoidmolekül verknüpft sein können, sind Isopren,
Cumarsäure und Phenylpropangruppen. Zur Vielfalt der Flavonoide tragen
weiter die Flavanverbindungen und deren Polymerisate, die Proanthocyanidine, sowie die Biflavonoide bei.
Bei den Flavonoiden von Ginkgo biloba kann man eine grosse Variation von
glykosidierten Verbindungen von hauptsächlich Kämpferol und Quercetin finden: z. B. Mono-, Di- und Triglykoside (Bild 3). Neben diesen Hauptflavonoiden kommen noch Flavonolglykoside von Isorhamnetin, Myricetin und 3'-Methylmyricetin und auch Flavonglykoside von Apigenin und Luteolin (Bild 4)
vor. Strukturell interessante Verbindungen ste ll en die mit Cumarsäure veresterten Flavonoldi- und -triglykoside dar (Bild 5). Diese acylierten Flavonolglykoside stellen nützliche Leitsubstanzen in der Analytik von Ginkgo-Präparaten
dar; eine Bedeutung, die über die von einfachen Flavonoiden hinausgehen,
wurde bisher nicht erkannt (J. Hölzl, 1992). Daneben sind auch nicht glykosi-
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RI:
OH
H
OH
OCHS
Kampterolderivat
Ouercetinderivat
Isorhamnetlnderivat
HO
Bild 3 Beispiele von Mono-, Di- und Triglykosiden aus Ginkgo biloba mit Flavonolstruktor
Fig. 3 Examples of mono-, di- and triglycosides with flavonol structure isolated from
Ginkgo biloba
Bild 4 Beispiele von Flavonoidglykosiden
aus Ginkgo biloba mit Flavonstruktur
Apigeninderivat
Luteolinderivat
Fig. 4 Examples of flavonoid glycosides
with flavone structure isolated from Ginkgo
biloba
HO
Bild 5 Mit Cumarsäure veresterte Flavonolglykoside aus Ginkgo biloba. Die acylierten
Flavonolglykoside stellen nützliche Leitsubstanzen in der Analytik von Ginkgo-Präparaten dar.
Fig. 5 Flavonol coumaroyl ester glycosides
isolated from Ginkgo biloba which are useful
lead compounds foI the quality control of
Ginkgo preparations.
Rt:
H
OH
lOmpferolderat
Ouercefinderivivat
R2:
H oder Glucose
OH
Bild 6 Aus Ginkgo biloba isolierte Biflavone. Sie gehören dem Amentoflavontyp an,
welcher im Pflanzenreich am häufigsten vertreten ist.
Rn
Rt :
R2:
03:
Rd
OCH3
OCH3
OCH3
OCH3
OCH3
OH
OCH3
OH
OCH3
OH
OH
OH
OCH3
OCH3
OH
H
H
H
H
H
OCH3
Hmentoliavon
Bllobelin
GInkgelln
Isoginkgetin
Sciatlopuysin
5-Mothoay bilobetin
Fig. 6 Biflavones isolated from Ginkgo biloba belonging to the amentoflavone type representing the most frequently occurring biflavone type in the plant kingdom.
dierte diniere Verbindungen isoliert worden: z. B. Biflavone (Bild 6), Catechine
und Proanthocyanidine.
Otto Sticher
132
4.2 Terpene
Bei den charakteristischen Inhaltsstoffen von Ginkgo biloba handelt es sich um
Terpenlactone, die Ginkgolide (Diterpene) und das Bilobalid (ein Sesquiterpen). Beide Substanzgruppen konnten bisher nur aus Ginkgo biloba isoliert
werden, womit der Ginkgobaum eine einzigartige Stellung im Pflanzenreich
einnimmt. Das Molekülgerüst dieser Terpene baut sich aus mehreren fünfgliedrigen Ringen auf, die dreidimensional zu stabilen, im Fall der Ginkgolide zu
käfigartigen Strukturen kondensiert sind. Der amerikanische Chemiker E.J.
Corey wurde 1990 u.a. für die ihm gelungene Synthese der Ginkgolide mit dem
Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
Die cis-verknüpften Cyclopentanringe F, A, D und C sind bei den Ginkgoliden (Bild 7) in der Weise gefaltet, dass ein halbsphärischer Käfig mit einer
definierten Grösse von 4 A Breite und 5 A Tiefe entsteht. Der Käfig ist
ausreichend gross, um Kationen (z. B. Fell- , Cal+) aufzunehmen, oder auch
Gruppen, z. B. das Triammoniumion. Die zwei parallelen Seiten des Käfigs
werden durch Lacton-Kohlenstoffe des F- bzw. C-Ringes begrenzt. Das Zentrum des Käfigs wird aus Ring A und D gebildet. Der Tetrahydrofuranring D
hat eine besondere Position im Käfig, sein Äthersauerstoff bildet mit dem
Estersauerstoff von Ring F und C und dem C-10-Hydroxylsauerstoff ein polydentales System, ähnlich wie es in den «Crown»-Etherreihen beobachtet wurde. Dieser elektronenreiche Käfig ist ideal geeignet, um Ladungsbindungen mit
Kationen oder positiv polarisierten Molekülen einzugehen. Ein anderes wichtiges Kennzeichen von Ginkgoliden ist die tertiäre Butylgruppe.
Bis heute sind fünf Ginkgolide, welche sich nur in der Anzahl und Position
der Hydroxylgruppen unterscheiden (vgl. Bild 7) bekannt. Sie werden mit den
Buchstaben A, B, C, J und M bezeichnet. Erst 20 Jahre nach der Strukturaufklärung wurde ihr therapeutischer Wert erkannt (J. Hölzl, 1992).
R1 :
R2:
Rg:
Ginkgolid
OH
OH
OH
OH
H
H
OH
OH
H
OH
H
H
OH
OH
OH
A
B
C
J
M
Bild 7 Aus Ginkgo biloba isolierte Ginkgolide. Sie stellen zusammen mit dem Bilobalid die
charakteristischen Ginkgo-Inhaltsstoffe dar. Es
handelt sich um Terpenlactone (Diterpene), deren Molekülgerüst sich aus mehreren fünfgliedrigen Ringen aufbaut.
Fig. 7 Ginkgolides isolated from Ginkgo biloba representing together with bilobalide the
characteristic Ginkgo constituents. The ginkgolides are terpene lactones (diterpenes) having a
chemical skeleton with serveral five membered
ring systems.
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0
Bild 8 Bilobalid, ein Sesquiterpen von Ginkgo biloba. Die Struktur des Bilobalid zeigt
noch die Verwandtschaft zu den Ginkgoliden.
Biogenetisch handelt es sich urn ein Abbauprodukt der Ginkgolide.
Fig. 8 Bilobalide, a sesquiterpene isolated
from Ginkgo biloba. The structure of bilobalide shows a relationship to the ginkgolides.
Biogenetically, bilobalide is a degradation
product of the ginkgolides.
Das Bilobalid wird aufgrund der C-Zahl als Sesquiterpen bezeichnet. Biogenetisch ist es jedoch ein Abbauprodukt der Ginkgolide. Die Struktur zeigt
noch die Verwandtschaft zu den Ginkgoliden. Bilobalid enthält ebenfalls drei
Lactonringe und eine tertiäre Butylgruppe (Bild 8).
4.3 Weitere Inhaltsstoffe von Interesse
Von weiterem Interesse ist, dass Ginkgo biloba gegenüber phytopathogenen
Organismen, seien dies Viren, Bakterien, Pilze oder Insekten, nahezu resistent
ist. Bis heute weiss man noch nicht genau, welches die aktiven Verbindungen
für diese Unempfindlichkeit sind. In Frage kommen dafür die besprochenen
Terpenoide und Flavonoide, möglicherweise aber auch Anacardiaceensäuren,
alle übrigen Säuren und 2-Hexenal (Blattaldehyd, Kohlenwasserstoff). Anacardiaceensäuren sind in erster Linie aus dem Samenmantel isoliert worden, wo
sie 75% der daraus isolierten Lipide ausmachen. Von den heute bekannten
Verbindungen konnten Ginkgolsäure und Ginkgo! in geringer Konzentration
auch aus Ginkgo-Blättern isoliert werden. Dies ist mit ein Grund, warum die
Blätter nicht zur Bereitung eines Tees geeignet sind. 2-Hexenal stammt biogenetisch aus Linolensäure. Es wurde nachgewiesen, dass 2-Hexenal dann entsteht, wenn frische Blätter in Anwesenheit von Luft gelagert werden. 2-Hexenal hat eine starke fungistatische Wirkung, konnte aber nur in niedriger Konzentration in Ginkgo-Blättern nachgewiesen werden (R.T. Major, 1967).
5 Pharmakologische Untersuchungen und klinische Anwendung
5.1 Pharmakologische Untersuchungen
Pharmakologische Untersuchungen sind in erster Linie mit dem ehemals patentierten Extrakt EGb 761 durchgeführt worden. Dieser wird seit über 20
Jahren zur Behandlung von peripheren und zentralen Durchblutungsstörungen
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und von Hirnleistungsstörungen eingesetzt. Aus den davon vorliegenden Untersuchungen (vgl. dazu Reviews von A. Hasler, 1990; H. OberpichlerSchwenk und J. Krieglstein, 1992, und jeweils darin zitierte Literatur) können
eine durchblutungssteigernde Wirkung auf periphere und zentrale Gefässe,
aber auch auf die glatte Muskulatur anderer Organe, z. B. des Dünndarms und
der Trachea, sowie Wirkungen auf die Hirnfunktion, insbesondere auf das in
seiner Funktion beeinträchtigte Gehirn, abgeleitet werden.
5.11 Durchblutungssteigernde Wirkung auf periphere und zentrale Gefässe
Zur Erklärung der durchblutungssteigernden Wirkung können Effekte auf die
Blutgefässe (u. a. Vasorelaxation) und solche auf die Fliessfähigkeit des Blutes
(Verringerung der Vollblutviskosität) herangezogen werden. Für die gefässrelaxierende Wirkung werden verschiedene Mechanismen diskutiert, u. a. scheinen dabei Einflüsse auf den Prostaglandin-Metabolismus, z. B. eine verstärkte
Synthese des vasodilatatorisch wirkenden Prostacyclins, sowie Radikalfängereigenschaften des Extrakts eine Rolle zu spielen. Die Verringerung der pathologisch erhöhten Vollblutviskosität scheint auf einer verminderten Erythrozytenaggregation zu beruhen. Hier, sowie bei der Wirkung auf andere glattmuskuläre Organe spielen wieder der Prostaglandin-Metabolismus sowie eine
Blutplättchen-antagonistische Komponente des Extrakts eine Rolle (vgl. unter
5.13 und 5.14).
5.12 Wirkungen auf die Hirnfunktion
Bei den Untersuchungen zum Nachweis der Wirkungen von Ginkgo-Extrakt
auf das experimentell geschädigte Gehirn sind u. a. die Erhöhung der Hypoxietoleranz, Wirkungen auf den Energiestoffwechsel, Zerebroprotektion bei Ischämie, sowie antiödematische Wirkungen am Gehirn untersucht worden. Daneben wurden auch Wirkungen auf Lern- und Gedächtnisleistungen und Einflüsse
auf Neurotransmittersysteme studiert.
Wurden Mäuse und Ratten einer letalen Hypoxie (Sauerstoffmangelsituation) ausgesetzt, konnte ihre Überlebenszeit durch Verabreichung von GinkgoExtrakt in eindrucksvoller Weise verlängert werden (Bild 9). Ebenfalls konnte
unter Hypoxie der Zusammenbruch des zerebralen Energiestoffwechsels und
der Eintritt des Atemstillstandes bei Ratten verzögert werden. Die dafür verantwortlichen zerebroprotektiven Substanzen sind bis heute nicht bekannt. Es
scheint aber, dass sie in der Nichtflavonoid-Fraktion des Extrakts zu suchen
sind.
Bei zerebraler Ischämie (Blutleere im Gehirn) waren die zerebroprotektiven
Effekte je nach Ischämiemodell bei Verabreichung von Ginkgo-Extrakt uneinheitlich. Mit einzelnen Terpenlactonen (Ginkgolid A und B sowie Bilobalid)
konnte dagegen eine statistisch signifikante Zerebroprotektion bewirkt werden.
Dabei reduzieren die Ginkgolide den neurotoxischen Effekt von Glutamat,
n
G
•E
KONTROLLE
EGb 761
(100 mg/kg)
w 30
m
w
J
w
m
*1*
m
20
10
Ii
3.3 % 02
180 mm Hg
135
Bild 9 Verlängerung der Überlebenszeit von
Ratten unter letaler Hypoxie durch EGb 761.
Die Tiere wurden einer hypoxischen Hypoxie
(3,3% 02) oder einer hypobaren Hypoxie
(180 mm Hg) unterworfen. Die Behandlung
mit EGb 761 (100 mg/kg) erfolgte jeweils 30
Minuten vor Beginn der Hypoxie (H. Oberpichler- Schwenk und J. Krieglstein, 1992).
Fig. 9 Increase of the survival time of rats
treated with EGb 761 under lethale hypoxia.
The rats were exposed to a hypoxic hypoxia
(3.3% 02) or a hypobaric hypoxia (180 mm
Hg). The treatment with EGb 761 (100 mg/kg)
was carried out 30 min before start of the
hypoxia (H. Oberpichler- Schwenk and J.
Krieglstein, 1992).
welches während einer Ischämie vermehrt freigesetzt wird und zur Zerstörung
der vorerst stimulierten Neuronen führt. Es scheint wahrscheinlich, dass infolge der Glutamat-Einwirkung auch die Produktion von PAF (vgl. 5.14) verstärkt
wird, das seinerseits tödlich auf die Neuronen wirken kann. Damit liesse sich
der neuroprotektive Effekt auf die PAF-antagonistische Wirkung der Ginkgolide zurückführen. Allerdings hat sich herausgestellt, dass das Bilobalid, welches keine PAF-antagonistische Wirkung aufweist, von allen untersuchten
Terpenlactonen die stärkste Schutzwirkung auf das Gehirn zeigt.
Im Hinblick auf die therapeutische Anwendung von Ginkgo-Extrakt bei
Hirnleistungsstörungen sind auch Effekte auf das Lernvermögen und das Gedächtnis von Interesse. Die bisherigen Untersuchungen sind je nach Alter der
verwendeten Versuchstiere (Ratten) verschieden. Es scheint, dass der Extrakt
auf das Lernverhalten der jüngeren Ratten (8 Monate alt) keinen Effekt hatte,
während dasjenige alter Tiere (24 Monate alt) verbessert wurde. Ebenso uneinheitliche Ergebnisse ergaben Untersuchungen über die Wirkung auf das zerebrale noradrenerge System. Es konnte gezeigt werden, dass Ginkgo-Extrakt
den altersbedingten Rückgang der Zahl der muskarinergen Cholinorezeptoren
im Hippocampus von Ratten aufheben kann. Möglicherweise stellt die Normalisierung altersbedingter Rezeptordefizite der gemeinsame Wirkmechanismus
von Nootropica (den Gehirnstoffwechsel anregende Medikamente) dar.
Aus den bisherigen Ausführungen geht hervor, dass pharmakologische Wirkungen von Ginkgo-Extrakt im wesentlichen auf Radikalfängereigenschaften
und PAF-Antagonismus bestimmter Inhaltsstoffe beruhen.
5.13 Radikalfängereigenschaften
Die Wirkungen von Ginkgo-Extrakt auf Gefässtonus und die Gerinnungsfähigkeit des Blutes sowie seine protektiven Wirkungen unter ischämischen Bedingungen können durch Radikalfängereigenschaften wenigstens teilweise erklärt
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02
Otto Sticher
°
02-
e-, 2H+
Superoxidanionradikal
e', H+
H202
e-, H+
a OH'
Hydroxylradikal
Hydrogenperoxid
H20
-
02 + 02 + 2H+
H 202 + H 2 02
H202 + RH2
Superoxiddismutase
Catalase
Peroxidase
a H2 02 + 02
—
2H20 + 02
2H2O + R
H20
Bild 10 Entstehung und enzymatische Inaktivierung von Sauerstoffradikalen (H. Oberpichler- Schwenk und J. Krieglstein (1992)).
Im lebenden OIganismus werden ständig freie
Radikale durch unvollständige Reduktion von
Sauerstoff gebildet und normalerweise enzymatisch abgefangen.
Fig. 10 Formation and enzymatic inactivation of oxygen radicals (H. Oberpichler
-SchwenkadJ.Kriglst,192)Feadicals are formed continuously within living
tissues caused by incomplete reduction of
oxygen. Under normal conditions specific enzymes prevent the tissue from radical-induced
damage.
werden, was in verschiedenen in vitro-Untersuchungen nachgewiesen werden
konnte. Es gibt verschiedene Befunde, die dafür sprechen, dass die Flavonoidglykoside dafür verantwortlich sind. Allerdings dürften die Flavonoidglykoside als relativ polare Moleküle kaum hirngängig sein, so dass für Radikalfängereigenschaften auf neuronaler Ebene entweder andere Stoffe oder Metaboliten der Flavonoide in Frage kommen. Zur Erklärung dieser Frage müssten
vermehrt entsprechende Studien durchgeführt werden.
Im lebenden Organismus werden ständig Radikale durch unvollständige
Reduktion von Sauerstoff gebildet und normalerweise enzymatisch abgefangen
(Bild 10). Eine verstärkte Radikalbildung tritt bei Ischämie, Hypoxie und
metabolischen Störungen auf. Dann wird die Kapazität der enzymatischen
Inaktivierungsmechanismen leicht überschritten. Sauerstoffradikale wirken
auf verschiedene Enzymsysteme, Zellmembranen und Zellfunktionen toxisch
(Bild 11). Durch Angriff z. B. an Membranlipiden kann die Dichtigkeit von
Zellmembranen beeinträchtigt werden, was vermutlich die Entstehung von
Ödemen fördert. Von entscheidender Bedeutung für die Gefässphysiologie ist
das Zusammenspiel der Eicosanoide (Prostaglandine, Thromboxan, Prostacyclin und Leukotriene). In der Pathogenese der Durchblutungsstörungen spielt
v. a. das dynamische Gleichgewicht zwischen Prostacyclin und Thromboxan
A2 eine wesentliche Ro ll e. Prostacyclin ist für eine Vasodilatation und für eine
Hemmung der Thrombocytenaggregation, Thromboxan A2 für eine Vasokonstriktion und eine erhöhte Thrombocytenaggregation verantwortlich. Dieses
Gleichgewicht kann durch Lipidperoxide gestört werden. Lipidperoxide werden ebenfalls durch freie Radikale v.a. in der Reoxygenierungsphase nach einer
Ischämie gebildet und hemmen u. a. die Prostacyclinsynthetase, wodurch es zu
einem relativen Überschuss an Thromboxan A2 kommen kann. Ein anderer
Angriffspunkt ist das Adenylcyclase-Phosphodiesterase-System, welches die
intrazelluläre Konzentration an cAMP reguliert. Durch den relativen Oberschuss an Thromboxan A2 wird die Adenylcyclase gehemmt, was zu einer
erniedrigten cAMP-Konzentration führt. Eine hohe Konzentration an cAMP
Ginkgo biloba - Ein modernes pflanzliches Arzneimittel Ischämie
137
Reduzierter Blutfluss
Hypoxie
Gefässschädigung
Freie
Radikale
Thrombosen
erhöhte
Thrombocytenaggregation
Oedeme
A
erniedrigte
cAMP-Konzentration
Störung des ThromboxanProstacyclin-Systems
Peroxidation von
Membranlipiden
und Freisetzung
von Lipidperoxiden
Metabolismusstörungen
erhöhte
Kapillarpermeabilität
A
Störung der Membran D struktur und Membran funktion
Flavonoide
Bild 11 Radikalfängerfunktionen von Flavonoiden aus Ginkgo biloba (abgeändert nach S.S.
Chatterjee, 1984). Sauerstoffradikale wirken auf verschiedene Enzymsysteme, Zellmembranen
und Zellfunktionen toxisch. Sie können durch Radikalfänger wie z. B. Dihydroliponsäure,
Vitamin E oder Flavonoide abgefangen werden.
Fig. 11 Free radical-scavenging activity of flavonoids from Ginkgo biloba (modified according
to S.S. Chatterjee, 1984). Oxygen radicals have a toxic effect on various enzyme systems, cell
membranes and cell functions. Compounds showing free radical-scavenging activity are e.g.
dihydrolipoic acid, vitamin E or flavonoids.
fördert die Formstabilität von Thrombocyten, eine tiefe Konzentration dagegen
begünstigt die Thrombocytenaggregation. Ferner schützt Ginkgo-Extrakt
durch Membranstabilisierung die Erythrocyten vor Hämolyse und auf gleiche
Weise wird die Kapillarpermeabilität gesenkt, was die Verhinderung von
Ödemen zur Folge haben kann.
138
Otto Sticher
H2C-0- (C H2)n-C H3
0
1
11
H3C-C-0-CH
1
n = 15 oder 17
0
CH2-0-P-O-CH2- C H2-N+(CH 3 )3
OCS-
Bild 12 Strukturformel des Blutplättchenaktivierenden Faktors (PAF). Bei PAF handelt
es sich um ein Etherphospholipid (l-0-Alkyl2(R)-acetyl-glycero-3-phosphorylcholin).
Fig. 12 Structural formula of the platelet-activating factor (PAF). PAF represents an etherphospholipid (l-O-alkyl-2(R)-acetyl-glycero-3-phosphorylcholine).
5.14 PAF-Antagonismus
Als PAF-antagonistische Wirkstoffe im Ginkgo-Extrakt haben sich die Ginkgolide erwiesen. Insbesondere Ginkgolid B wurde als sehr aktiver Antagonist
von PAF erkannt. Bei PAF handelt es sich um ein Ätherphospholipid (Bild 12),
das in Leukozyten, Makrophagen, Thrombozyten und Endothelzellen auf spezifische Reize hin gebildet und freigesetzt wird (Bild 13). PAF besitzt die
Eigenschaft, die Aggregation der Thrombocyten auszulösen und ist u. a. an
Entzündungsreaktionen, an der Erhöhung der Gefässpermeabilität und an der
Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt. Nach einer Antigenbindung z. B.
an Makrophagen, Leukocyten und Thrombocyten, wird dieses physiologisch
aktive Phospholipid als Antwort aus diesen Zellen sezerniert. PAF wird anschliessend durch den PAF-Rezeptor an den Zielzellen (z. B. Endothelzellen
der Blutgefässe, LeukoCyten, Mastzellen, Thrombocyten) gebunden, was zur
Freisetzung von Mediatoren (u. a. Histamin, Eicosanoide) und verschiedenen
physiologischen Wirkungen wie Vasodilatation, Thrombocytenaggregation,
führen kann. In der Folge davon kann es zu Asthma, Entzündung, Anaphylaxie
usw. kommen. Die PAF-Antagonisten blockieren die PAF-Rezeptoren der
Zielzellen. Für die Anwendung von Ginkgo-Extrakt steht die Aggregationshemmung der Thrombocyten im Vordergrund. PAF-Rezeptoren wurden auch
im Hirn nachgewiesen. Ein möglicher Zusammenhang zu den im Tierversuch
mehrfach beobachteten Schutzwirkungen von Ginkgo-Extrakt gegenüber Sauerstoffmangelsituationen im Gehirn wurde postuliert, da PAF verschiedene
Reaktionen hervorruft, die im hypoxischen Gewebe ähnlich ablaufen.
5.2 Klinische Anwendungen
Die pharmakologische Forschung mit dem Ginkgo-Extrakt EGb 761 führte zu
folgenden Haupt-Anwendungsgebieten:
5.21 Periphere Durchblutungsstörungen
Die häufigsten Ursachen einer arteriellen Verschlusskrankheit beruhen auf
arteriosklerotischen Wandveränderungen. Die obliterierende Arteriosklerose
ist eine Erkrankung der Intima, gekennzeichnet durch Wandverhärtung, Elastizitätsverlust und Lumeneinengung. Sie ist eine polyätiologische Erkrankung
139
0
Antigen
C(CH 3)
PAF e Antagon184
z.B. Ginkgolid B
Physiologische Reaktionen
hervorgerufen durch PAF
Zielzelle:
z.B. Mastzellen. Leukocyten, Thrombocyten
z.B. Asthma, Entzündung,
Anaphylaxie, Vasodilatation,
Akkumulation und Aggregation
von Zellen
Degranulierung und Freisetzung versch. Mediatoren:
z.B. Histamin, Eicosanoide
Bild 13 Entstehung und Wirkung des Blutplättchen-aktivierenden Faktors (PAF) (abgeändert
nach N. Weber, 1986). PAF wird in Leukozyten, Makrophagen, Thrombozyten und Endothelzellen gebildet und daraus freigesetzt. PAF besitzt die Eigenschaft, die Aggregation der Thrombozyten auszulösen und ist u. a. an Entzündungsreaktionen, an der Erhöhung der Gefässpermeabilität und an der Kontraktion der glatten Muskuklatur beteiligt.
Fig. 13 Formation and pharmacological effects of the platelet-activating factor (PAF) (modified
according to N. Weber, 1986). PAF is formed in leukocytes, macrophages, thrombocytes and
endothelial cells. Generation of PAF leads to aggregation and degranulation of thrombocytes,
induces inflammatory reactions, contraction of smooth muscle, and increases the vascular
permeability.
und kann durch verschiedene Faktoren begünstigt werden. Dies sind v. a.:
Hypertonie, Hyperlipidämie, Rauchen, Bewegungsmangel, sowie Diabetes
me ll itus. Erste Manifestationen sind arterielle Durchblutungsstörungen der
Extremitäten.
Der Schweregrad der arteriellen Durchblutungsinsuffizienz wird nach Fontaine in vier Stadien eingeteilt:
– Stadium I: Unauffällige Symptome wie Kribbeln, Kältegefühl, Schwereempfinden.
– Stadium II: Claudicatio intermittens: Latenzschmerz infolge belastungsabhängiger Muskelischämie. NaCh einer bestimmten
Gehstrecke treten krampfartige Schmerzen in der Wade auf.
Schon nach wenigen Minuten Ruhe ist der Schmerz wieder
versChwunden.
– Stadium III: Ruheschmerz im Bereich der Haut und der Muskulatur, v. a.
in Horizontallage der Gliedmassen, nächtlicher Ruheschmerz in den Waden.
Otto Sachel-
140
Stadium IV: Nekrose oder Gangrän. Scharf begrenzte, sehr schlecht heilende Gewebsläsion.
Zahlreiche experimentelle und klinische Studien belegen die Wirksamkeit
von Ginkgo-Extrakt bei peripheren Durchblutungsstörungen. Ginkgo-Extrakt
hat sich beim Einsatz in Stadium II mehrfach bewährt, indem die schmerzfreie
Gehstrecke signifikant erhöht werden konnte. Im Stadium I darf eine prophylaktische Wirkung erwartet werden (A. Hasler, 1990, und darin zitierte Literatur).
-
5.22 Zerebrale Durchblutungsinsuffizienz
Die Hauptindikation für den Einsatz von Ginkgo-Extrakt ist die symptomatische Behandlung von chronischen, hirnorganisch bedingten Leistungsstörungen im Rahmen eines therapeutischen Gesamtkonzepts bei der Demenz. Diese
können degenerativer (Alzheimer-Typ) und/oder vaskulärer Art sein. Sie werden charakterisiert durch Störungen des Gedächtnisses, der Konzentrationsfähigkeit, des Denkens, der Auffassung, der Orientierung, der Affektivität und
durch Veränderung der Persönlichkeit. Kopfschmerzen, Schwindel und Ohrensausen sind häufige Symptome bei Hirnleistungsstörungen (A. Hasler, 1990;
H. Herrschaft, 1992, und jeweils darin zitierte Literatur).
Diese oft altersbedingten mentalen Funktionseinbussen können durch ein
entsprechendes Training aufgehalten, beziehungsweise verlangsamt werden.
Verschiedene Studien mit entsprechenden Testmethoden zeigten, dass GinkgoExtrakt die Resultate verbessert. Unter einer Langzeitbehandlung mit GinkgoExtrakt konnten bei Patienten mit Hirnleistungsstörungen pathologisch veränderte EEG-Befunde wesentlich verbessert werden. Dies ging einher mit einer
Reduktion von Leitsymptomen wie Kopfschmerz und Schwindel.
Der therapeutische Nutzen von Nootropica ist umstritten. So wundert es
nicht, dass auch der Einsatz von Ginkgo-Extrakt zur Behandlung von dementiellen Syndromen nicht a ll gemein Zustimmung findet. Obwohl in acht von elf
vorliegenden placebokontrollierten Doppelblindstudien ein positiver Effekt
auf sehr unterschiedliche klinische und apparative Parameter bei Patienten mit
einem hirnorganischen Psychosyndrom belegt werden konnte, genügen diese
Arbeiten nach H. Herrschaft (1992) von ihrem Prüfdesign her nicht den 1991
in der Bundesrepublik Deutschland vom Bundesgesundheitsamt erlassenen
strengen Richtlinien zum Wirksamkeitsnachweis von Nootropica. Das vorgelegte Datenmaterial reicht jedoch aus, um Ginkgo-Extrakt bei dieser Indikation
als wahrscheinlich wirksam zu beurteilen.
5.23 Schwindel, Hörstörungen, Ohrensausen
Schwindel, Hörstörungen und Ohrensausen können vielfältige Ursachen haben. Eine mangelnde Durchblutung des Gehirns oder des Innenohrs werden
häufig in einen Zusammenhang mit den genannten Symptomen gebracht. Die
Schwindelsymptomatik gilt als eines der Krankheitsbilder, das durch Ginkgo-
141
Extrakt am besten positiv zu beeinflussen ist. Dies und die veIschiedentlich
festgestellte Wirksamkeit des Extraktes bei Ohrensausen und nachlassenden
Hörleistungen dürfte wesentlich zur Verbreitung von Ginkgo-Zubereitungen
beigetragen haben (A. Hasler, 1990, und darin zitierte Literatur). Nach H.
Herrschaft (1992) sind auch bei diesen Indikationen für den Wirksamkeitsnachweis weitere Studien mit spezie ll em Prüfdesign erforderlich, um die therapeutische Wirksamkeit zweifelsfrei zu belegen.
6 Analytik
Da bis heute keine Arzneibuchmonographie für Ginkgo biloba existiert, bestehen auch keine offiziellen Anforderungen an die zu verarbeitende Blattdroge.
Die Hersteller setzen dafür und für ihre standardisierten Extrakte, sofern solche
verwendet werden, die Normen selbst. Die Standardisierung von Phytopharmaka ist in erster Linie eine pharmazeutische Massnahme zur Sicherstellung
einer gleichbleibenden Qualität von Arzneipflanzenextrakten. Sie erfolgt vorteilhafterweise mit wirksamkeitsrelevanten Inhaltsstoffen, also nach heutigem
Kenntnisstand mit Flavonoiden und/oder mit Terpenen (vgl. dazu Reviews von
O. Sticher, 1992 und 1993).
6.1 Analytik der Flavonoide
Die Analytik der Flavonoide hat seit der Einführung der HPLC grosse Fortschritte gemacht. Zu deren Quantifizierung bietet sich zwar primär die Gesamtflavonoidbestimmung verschiedener Arzneibücher (z. B. DAB 10, Ph. Helv.
VII) an. Diese Methode ist jedoch unspezifisch. Sie erlaubt keine detaillierteren
Aussagen über die qualitative und quantitative Zusammensetzung der Flavonoide in einer Pflanze. Sie ist zudem nicht problemlos von einer Pflanze auf
die andere übertragbar und hat sich für Ginkgo-Blätter nicht bewährt. Da ein
wesentlicher Anteil der Flavonoide in Ginkgo biloba polarer ist als bei den
üblichen Flavonoiddrogen der Arzneibücher, ist eine quantitative Extraktion
mit der Arzneibuchmethode (Acetonextraktion) nicht möglich. Ferner scheint
die Bestimmung stark von der Methenamin-Menge abzuhängen, was mit dem
hohen Gehalt von störenden Proanthocyanidinen zusammenhängen könnte (H.
Hasler, 1990). Selektiv ist andererseits die Flavonoidanalytik mittels RP-HPLC
und anschliessender UV-Detektion. Diese Methode darf heute dank vollcomputerisierter Anlagen als Routineanalyseverfahren der Wahl bezeichnet werden.
Bis heute gibt es in der Literatur nur wenige Untersuchungen über die
Trennung und quantitative Bestimmung von Ginkgo-Flavonoiden. Als erste
haben F. Briancon-Scheid et al. (1982, 1983) eine HPLC-Trennung von Biflavonoiden vorgestellt. Ähnliche HPLC-Trennungen wurden von Y. Song (1986)
sowie von P. Pietta et al. (1988) beschrieben. F. Briancon-Scheid et al. (1982)
evaluierten verschiedene Säulenmaterialien und Elutionsmittel und kamen zum
142
Otto Sticher
Schluss, dass eine optimale Trennung nur mit Normalphasen-Chromatographie
möglich ist. Während die Trennung der vier reinen Biflavone Bilobetin, Isoginkgetin, Ginkgetin und Sciadopitysin an einer LiChrosorb-Diol-Säule
(1011m) mit einem Tetrahydrofuran-/Chloroform-Gradienten erfolgreich
durchgeführt werden konnte, war dieses System zur quantitativen Bestimmung
der Biflavone in rohen Blattextrakten nicht verwendbar (F. Briancon-Scheid et
al., 1983). Dazu wurde von denselben Autoren (F. Briancon-SCheid et al., 1983)
ein weiteres Elutionssystem entwickelt, bei dem eine LiChroprep-Diol-Vorsäule zur Entfernung von störenden Substanzen, eine LiChrosorb-Diol-Trennsäule
(5 [an) sowie eine Kombination einer isokratischen Trennung mit einem Zweistufen-Gradienten (Hexan-Chloroform (25:75) und Tetrahydrofuran) eingesetzt wurden. Aus dem von den Autoren-präsentierten HPLC-Chromatogramm
(Bild 3 bei F. Briancon-Scheid et al., 1983) lässt sich allerdings unschwer
entnehmen, dass das vorgestellte System sowohl für den qualitativen Nachweis
und ganz speziell für eine quantitative Bestimmung der Biflavone nicht genügen kann. Trennsystem wie Vorreinigung sind zu wenig selektiv. P. Pietta et al.
(1988) kritisierten vor allem die lange Analysendauer von 75 Minuten und
entwickelten eine isokratische RP-HPLC-Trennung unter Verwendung einer
Novapak C18 Säule (mit Guard-Pak IBondapak C18 Vorsäule) sowie Tetrahydrofuran- 1-Propanol-Wasser (21:10:69) als Elutionsmittel. Das präsentierte
Trennsystem erlaubt eine schnelle (15 Minuten) und reproduzierbare Trennung
der vier Biflavonoide. Diese können unter Verwendung von externen Standardsubstanzen quantitativ bestimmt werden. Trennsystem und Vorreinigung
sind genügend selektiv, was dem HPLC-Chromatogramm (Bild 2 bei P. Pietta
et al., 1988) entnommen werden kann. Zwei weitere isokratische HPLC-Systeme auf LiChroCart RP-18 250-4 Kartuschen (mit RP-8 Vorsäule) unter Verwendung von Methanol-Wasser-Ameisensäure (75:25:4) bzw. Methanol-Wasser-Ameisensäure (80:20:4) als Elutionsmittel wurden von A. Schennen (1988)
beschrieben. Sie erlauben z. B. die Zuordnung oder die Reinheitskontrolle von
isolierten Biflavonoiden, eignen sich aber weniger gut für eine quantitative
Bestimmung, da sie für das Paar Ginkgetin/Isoginkgetin keine Basislinientrennung erlauben. Dünnschichtchromatographische Nachweismethoden, auf die
hier nicht näher eingegangen wird, sind bei A. Schennen (1988) sowie bei H.
Wagner et al. (1989) beschrieben.
Analyseverfahren zur quantitativen Bestimmung der Biflavone eignen sich
nicht für eine Standardisierung, da derzeit keine Hinweise auf einen Beitrag
dieser Substanzen zur Wirkung bei den von Ginkgo-Präparaten zugelassenen
Indikationen vorliegen. Ihr Nachweis kann hingegen zur Abklärung biologischer Fragestellungen (F. Briancon-Scheid et al., 1983; Y. Song, 1986; A.
Hasler, 1990; 0. Sticher et al., 1991) sowie als Fingerprintanalyse zum Nachweis der in Ginkgo biloba genuin vorhandenen Flavonoide (A. Hasler, 1990;
A. Hasler et al., 1992) eingesetzt werden.
Eine Quantifizierung der genuin vorhandenen Flavonoidglykoside wäre in
der Arzneipflanzenanalytik wünschenswert. Dies ist aber oft nicht möglich,
weil entweder die entsprechenden Referenzsubstanzen kommerziell nicht er-
143
hältlich sind oder das Spektrum der Flavonoidglykoside so komplex ist, dass
die Analytik für eine pharmazeutische Kontrolle zu kompliziert wird. Beides
trifft für die Flavonoide von Ginkgo biloba zu. Dennoch werden Ginkgo-Extrakte seit längerer Zeit von der Industrie auf «Flavon»glykoside standardisiert.
Dabei wird die Tatsache ausgenützt, dass sich diese durch eine Hydrolyse auf
die Aglyka zurückführen lassen. Eine Standardisierung lässt sich so realisieren.
Die UV-Spektren dieser Flavonoidaglyka erlauben eine selektive Detektion bei
Wellenlängen über 300 nm. Methoden, welChe durch Hydrolyse der Flavonoidglykoside die komplexe Einzelbestimmung von über 20 Substanzen auf die
Hauptaglyka Isorhamnetin, Kämpferol, Quercetin und die Nebenaglyka Myricetin und Luteolin reduzieren, wurden von A. Schennen (1988), von H. Wagner
et al. (1989) und von unserer Arbeitsgruppe (A. Hasler et al., 1990a) vorgestellt.
A. Schennen sowie H. Wagner et al. trennten die nach Hydrolyse der Glykoside
mit methanolischer Salzsäure erhaltenen Aglyka-Gemische nach Vorreinigung
über Sephadex LH-20 auf einer LiChroCart RP-18 Säule mit RP-8 Vorsäule
und Methanol-Wasser-Ameisensäure (55:41:4) als Elutionsmittel (A. Schennen, 1988) bzw. auf einer NuCleosil C18 (5 µm) Säule und einem
Methanol-/Wasser-Gradienten (H. Wagner et al., 1989). Während bei H. Wagner et al. die quantitative Bestimmung der Aglyka nach der Methode des
externen Standards durchgeführt und zur Berechnung des Gesamtglykosidgehaltes auf ein Acylglykosid (mittleres Molekulargewicht = 745) oder auf Rutin
(Molekulargewicht = 665) umgerechnet wurde, wurde bei A. Schennen Rutin
als interner Standard verwendet, ohne Angaben darüber zu machen, wie die
publizierten Aglyka-Gehalte berechnet worden sind. A. Schennen benutzte
seine Methode zur Abklärung biologischer Fragestellungen, H. Wagner et al.
Ginkgo blloba
Blaadroge / Trockenexlrakl
über 20
Flavonoidglykoside
Extraktion und Hydrolyse der
Flavonoldglykoside
70 nil WON / 10 ml HCI (25%);
); so min
Probenaulbereltung
Heinigung BbarC-18
(3 Flavonoidaglyka
Bild 14 Analyseschema für die HPLCBestimmung der Flavonoidaglyka von
Ginkgo biloba. Die grosse Zahl von Flavonoidglykosiden lässt sich durch eine
Hydrolyse auf die drei Aglyka Isorhamnetin, Kämpferol und Quercetin zurückführen, wodurch sich eine einfache,
schnell durchzuführende und Ieproduzierbare Methode für die Standardisierung von Ginkgo-Extrakten realisieren lässt.
Fig. 14 Work-up procedure and HPLC
determination of flavonoid aglycones
from Ginkgo biloba. The great variety of
genuine flavonoid glycosides can be reduced by hydrolysis to the three major
aglycones kaempferol, quercetin and
isorhamnetin. As a result a simple, rapid
and reproducible method for the standardization of Ginkgo extracts can be
realized.
Otto Sticher
144
die ihrige zur Gehaltsbestimmung von Flavonoiden in Ginkgo-Blättern, -Extrakten und in Fertigarzneimitteln.
In unseren Laboratorien wurden drei verschiedene HPLC-Methoden zum
Nachweis bzw. zur quantitativen Bestimmung der Flavonoide aus Ginkgo-Blättern und -Extrakten entwickelt. Auf diese soll im folgenden im Detail eingegangen werden.
6.11 Bestimmung der Flavonoidaglyka nach Hydrolyse der Glykoside
Mit der ersten Methode werden die Flavonoidglykoside hydrolysiert und die
daraus entstehenden Aglyka qualitativ und quantitativ erfasst (A. Hasler, 1990;
A. Hasler et al., 1990a; A. Hasler et al., 1990b). Die Aufarbeitung besteht
grundsätzlich aus zwei Schritten: Extraktion und Hydrolyse der Glykoside
sowie Probenaufarbeitung.
Die pulverisierte Droge oder der Trockenextrakt werden mit einem Methanol-Salzsäure-Gemisch (70 ml Methanol / 10 ml Salzsäure (25%)) während 60
Minuten rückflussiert (Bild 14). Anstelle von Aceton, das von der Ph. Helv.
VII zur Hydrolyse zum Beispiel bei Birkenblättern vorgeschrieben wird, muss
Methanol eingesetzt werden, damit auch die polareren Tri- und Diglykoside
extrahiert werden können. Der Zusatz von Salzsäure erlaubt eine direkte
hydrolytische Spaltung der Glykoside während der Extraktion. Die Lösung mit
den Algyka wird über eine C18 Kartusche (zum Beispiel Bond Elut) gereinigt
und für die HPLC-Analytik injiziert. Die Flavonoidaglyka können mit einer
Reversed-Phase-Säule (z. B. Hypersil ODS; 5 µm; nach vorheriger Validierung
zur Optimierung des Trennmaterials) mit einem Methanol-/Wasser-Gradienten
unter Zugabe von 0,5% ortho-Phosphorsäure und Detektion im UV bei 370 nm
analysiert werden (Tab. 2).
Tabelle 2 Chromatographische Parameter zur Bestimmung der Flavonoidaglyka von Ginkgo
biloba
Table 2
Chromatographic parameters for the determination of the flavonoid aglycones from
Ginkgo biloba
– Mobile Phase:
A = Methanol, B = 0,5% ortho-Phosphorsäure in Wasser
– Stationäre Phase:
Hypersil ODS, 5 µm (100 x 4 mm ID; Knauer- Kartusche)
– Gradientverlauf:
In 12 min von 38-48,2% Methanol (0,85% McOH/min); 5 min
100% McOH, 5 min 38% McOH
– Fluss:
2 ml / min
– Druck:
ca. 180 bar
– Temperatur:
25°C
– UV-Detektion:
370 nm
– Injektionsvolumen:
10 pl
Ginkgo biloba - Ein mode rnes pflanzliches Arzneimittel
Umrechnung vom
Aglykagehalt
auf den
Ginkgoflavonolglykosidgehalt
Ginkgoflavonolglykoside =
FI avon o lcu m aroyl g lykoside
mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
um 760
/
Umrech nungsfakloren:
Mi tt lerer Umrechnungsfaktor = 2.51
l
• Isorhamnetin: 2.39
• Kämpferol: 2.64
• Quercetin: 2.51
U u rccllnung:
E (Aglyka) x 2,51 =
Gehalt an Ginkgoflavonolglvkosiden
145
Bild 15 Umrechnung vom Aglykagehalt auf den Ginkgoflavonolglykosidgehalt. Die Umrechnungsfaktoren für
die Aglyka Isorhamnetin (MG 316,27),
Kämpferol (MG 286,24) und Quercetin
(MG 302,2) werden mit Hilfe des Molekulargewichtes von Flavonolcoumaroylglykosiden mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 760 bestimmt.
Fig. 15 Conversion of the aglycone
content into a Ginkgo flavonol glycoside content. The conversion factoIs for
the aglycones isorhamnetin (MW
316.27), kaempferol (MW 286.24) and
quercetin (MW 302.2) are determined
with the molecular weight of flavonol
coumaroyl ester glycosides with an
average molecular weight of approximately 760.
Die Berechnung der Gehalte (Bild 15) erfolgt via einen Umrechnungsfaktor
auf Flavonoidglykoside. Das geschieht in Anlehnung an die Praxis in der
pharmazeutischen Industrie, welche bei der Standardisierung ihrer Präparate
statt auf Aglyka in erster Linie aus marktpo li tischen Überlegungen auf «Ginkgoflavon»glykoside umrechnet, wobei üblicherweise auch eine Analyse der
Aglyka durchgeführt wird, obwohl keine publizierten Angaben vorliegen.
Unter dem Begriff «Ginkgoflavon»glykoside (richtigerweise Flavonolglykoside) werden dabei die mit Cumarsäure veresterten Kämpferol- und Quercetinderivate (= Flavonole) mit einem mittleren Molekulargewicht um die 760
verstanden, wodurch der Gehalt optisch nochmals höher ausfällt. Da diese
Flavonoide als Leitsubstanzen in Ginkgo-Blättern und Ginkgo-Extrakten betrachtet werden können, ist eine Standardisierung auf diese Inhaltsstoffe aus
pharmazeutischer Sicht akzeptabel.
Das Chromatogramm eines hydrolysierten Ginkgo-Extraktes aus Blättern
zeigt ein typisches Bild (Bild 16). Kämpferol und Quercetin bilden die Hauptpeaks, die sich in ihrer Grösse meist entsprechen. Die Konzentration von
Isorhamnetin ist etwa fünfmal geringer als diejenige der Hauptaglyka. Die ganz
kleinen Nebenpeaks stellen weitere Aglyka dar, z. B. Apigenin und Luteolin.
Sie können, falls sie in grösserer Menge vorkommen, ebenfalls erfasst werden.
Nach unseren Untersuchungen enthalten getrocknete Blätter aus dem Drogenhandel einen Gehalt von 0,2 bis 0,4% Aglyka, was einem berechneten
Gehalt von 0,5 bis 1% Ginkgoflavonolglykosiden entspricht. Die grünen Blätter gelten als qualitativ wertvo ll er, obwohl wir in unseren Untersuchungen in
bezug auf die Flavonoide (mit Ausnahme des Monats Mai, in welchem nicht
voll ausgewachsene Blätter analysiert wurden) keinen jahreszeitlich bedingten
Unterschied im Flavonoidgehalt von Ginkgo-Blättern feststellen konnten
Otto Stichen
146
UV von Quercetin
Ginkgo - Blätter
100 —
70 —
c
a)
0
60
i
0
a)
50 —
E
40 -
210400
nm
E30 —
UV von Kämpferol
c
100
1 ca)E
20
ct
'c3
10
o
V
^
60
E
20
3
6
Zeit (min)
9
12
Bild 16 HPLC-Chromatogramm mit UV- Spektren der Aglyka nach Hydrolyse eines Blattextraktes von Ginkgo biloba. Kämpferol und Quercetin bilden die Hauptpeaks, die sich in ihrer
Grösse meist entsprechen. Die Konzentration von Isorhamnetin ist etwa fünfmal geringer als
diejenige der Hauptaglyka.
Fig. 16 HPLC chromatogram of a Ginkgo leaf extract after hydrolysis of the flavonoid glycosides. Kaempferol and quercetin are the main peaks which correspond in peak height intensity.
The concentration of isorhamnetin is approximately five times lower of either of the main
aglycones.
(Bild 17). Allerdings bestehen Unterschiede in der Ontogenese einzelner Flavonoidgruppen. A. Hasler (1990) konnte zeigen (Bild 18), dass innerhalb einer
Vegetationsperiode der Gehalt an den zwei Haupt-Cumarsäurederivaten 3-0[2-0-(6-0- { p-Cumaroyl } -ß-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]quercetin und 3-0[2-0-(6-0- { p-Cumaroyl } -(3-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]kämpferol, bestimmt in Blättern eines weiblichen Ginkgobaumes, stufenweise auf etwa die
Hälfte abnimmt. Ausnahme ist wieder der Monat Mai, in welchem auch das
0
147
Aglyka
ffl Ginkgoflavonolglykoside
1.60
1.40
1.20
1.00
0
co
0.80 0.60 0.40 -
0.20
0.00
Mai
Juni
Juli
August
September Oktober
November
Bild 17 Gehalt an Flavonoidaglyka und Ginkgoflavonolglykosiden in Abhängigkeit der Erntezeit (weiblicher Ginkgo biloba, Zürich, Mythenquai, bezogen auf getrocknete Blätter). Es kann
kein jahreszeitlich bedingter Unterschied im Flavonoidgehalt von Ginkgo-Blättern (mit Ausnahme des Monats Mai, in welchem nicht voll ausgewachsene Blätter analysiert wurden) festgestellt
werden.
Fig. 17 Concentration of flavonol aglycones and Ginkgo flavonol glycosides in dependence of
the harvest time (leaves of a female tree, Zurich, Mythenquai, calculated with reference to the
dried leaves). With respect to the flavonoid content of Ginkgo leaves, no significant differences
can be seen in our ontogenetic studies (with exception of the month May, in which young leaves
were analyzed).
Verhältnis der beiden Substanzen zueinander umgekehrt ist als in den übrigen
Monaten. Im Gegensatz zu den Cumarsäurederivaten nimmt der Gehalt der drei
Haupt-Rutinoside (Bild 19) vom Monat Mai bis Juli ab und steigt ab Juli bis
November wieder kontinuierlich an. Die Biflavone verhalten sich anders als
Otto Sticher
148
Cumarsäurederivate:
R-3-O-rha(2"-->1 "')glc(6"'--1–)cum
Bild 18 Cumarsäurederivate in Blättern von
Ginkgo biloba während der Vegetationsperiode (weiblicher Ginkgo biloba, Zürich, Mythenquai). Es kann gezeigt werden, dass der
Gehalt an den zwei Haupt-Cumarsäurederivaten (Nr. 21 und 22, vgl. Tabelle 3) während der
Ontogenese stufenweise auf etwa die Hälfte
abnimmt.
10000
8000
E
c; 6000
E
4000
Fig. 18 Flavonol coumaroyl ester glycosides
in leaves of Ginkgo biloba (female tree, Zurich, Mythenquai). It can be shown that the
content of the two main coumaroyl derivatives
(No. 21 and 22, see Table 3) decreases gradually to approximately 50% during the ontogenetic studies.
2000
Rutinoside
Bild 19 Rutinosidderivate in Blättern von
Ginkgo biloba während der Vegetationsperiode (weiblicher Ginkgo biloba, Zürich, Mythenquai). Der Gehalt der drei Haupt-Rutinoside nimmt vom Monat Mai bis Juli ab und
steigt ab Juli bis November wieder kontinuierlich an.
Erntemonat
Fig. 19 Rutinoside derivatives in leaves of
Ginkgo biloba (female tree, Zurich, Mythen
-quai).Thecontfrmaiunosdes decreases from May to July and increases
again continuously from July to November.
die Glykoside (Bild 20). Der Monat Mai fällt hier, im Vergleich mit den anderen
Monaten, durch den tieferen Gehalt auf. In den grünen Blättern (Juni bis
Oktober) steigt der Gehalt bis in den Monat August an und nimmt dann bis zum
Oktober wieder ab. Interessant ist, dass der Monat November (gelbe, bereits
abgefallene Blätter) wieder einen markant höheren Gehalt aufweist als der
Vormonat.
Zu teilweise ähnlichen Resultaten kamen A. Lobstein et al. (1991). Ihre
Untersuchungen, welche ebenfalls an Blättern eines einzelnen Baumes durchgeführt worden sind, ergaben den höchsten Gehalt an Acylflavonolglykosiden
Ginkgo biloba - Ein modernes pflanzliches Arzneimittel Biflavone
Sciadopitysin
Isoginkgetin
Ginkgetin
eilobetin
Amentotlavon
11
149
Bild 20 Biflavone in Blättern von Ginkgo
biloba während der Vegetationsperiode
(weiblicher Ginkgo biloba, Zürich, Mythen
verhalten sich anders als-quai).DeBflvon
die Glykoside (Bild 18 und 19). In den grünen
Blättern steigt der Gehalt bis in den Monat
August an und nimmt dann bis zum Oktober
wieder ab. Interessant ist, dass der Monat November (gelbe, bereits abgefallene Blätter)
wieder einen markant höheren Gehalt aufweist als der Vormonat.
Fig. 20 Biflavones in leaves from Ginkgo
biloba during the vegetative season (female
tree, Zurich, Mythenquai). The behaviour of
the biflavones is different from that of the
glycosides (Fig. 18 and 19). In green leaves the
content of biflavones increases until August
and decreases again from August to October.
It is of interest to note that the month November (yellow, fallen off leaves) shows again a
prominent higher content than the preceding
month.
in den Blattknospen im Frühjahr (März), während die höchsten Gehaltswerte
an Flavonoidglykosiden im April gemessen worden sind. Anschliessend nahm
ihr Gehalt bis zum Oktober ab, während er im November wieder anstieg. Die
Biflavone nahmen im Verlauf der Vegetationsperiode langsam zu, ohne allerdings hohe Gehaltswerte zu erreichen. Diese Resultate zeigen, dass zu ihrer
Absicherung eine grössere Feldstudie, bei der Material von verschiedenen
Standorten, während verschiedener Jahre, Bäumen verschiedenen Alters sowie
männlicher und weiblicher Individuen berücksichtigt wird, durchgeführt werden muss.
6.12 Bestimmung der Flavonoidaglyka und Nachweis der Biflavone
Bei der zweiten Methode wird anschliessend an dasselbe Extraktions- und
Probenaufarbeitungs-Procedere als Eluent ein Methanol-/TetrahydrofuranGradient mit 0,5% ortho-Phosphorsäure und als Trennsäule Nucleosil 100-C18
(3 µm) verwendet. Sie erlaubt neben der quantitativen Analyse der Aglyka einen
qualitativen Nachweis der Biflavone in einem Run in 20 Minuten (Bild 21) und
ermöglicht in Vollextrakten und daraus hergestellten Präparaten den Nachweis,
dass zur Verarbeitung wirklich Ginkgo-Blätter verwendet worden sind und nicht
irgendein ähnliches Flavonoidmuster aufweisendes Pflanzenmaterial. Die ubiquitär vorkommenden Aglyka allein sind nicht spezifisch genug zur Identifizierung von Ginkgo-Blättern und Vollextrakten. Diese Methode kann allerdings
nicht zur Analyse angereicherter Extr akte verwendet werden, bei denen die
Biflavonoide entfernt worden sind (z. B. beim Ext rakt EGb 761). Der qua li tative
150
Otto Sticker
Nachweis der Biflavone mittels RP-HPLC hat gegenüber der DC-Methode den
Vorteil, dass auch die Biflavone Ginkgetin/lsoginkgetin aufgetrennt werden
können. Diese beiden Substanzen konnten mittels DC (A. Schennen, 1988; H.
Wagner et al., 1989) bisher nicht aufgetrennt werden.
6.13 Fingerprintanalyse der genuin vorkommenden Flavonoide
Bei der dritten Methode wird die Extraktion zweimal nacheinander mit Ethanol
80% (zeigt äusserst günstige Lösungseigenschaften für die polaren Glykoside
wie für die apolaren Biflavone) durchgeführt. Nach Filtration über eine C18
Kartusche (Bond Elut) wird unter Verwendung von Nucleosil 100-C 18 (3 µm)
als Trennsäule als Eluent ein Isopropanol-Tetrahydrofuran (25:65)/AcetonitrilGradient mit 0,5% ortho-Phosphorsäure verwendet. Sie ermöglicht eine Fingerprintanalyse aller natürlich vorkommenden Ginkgo-Flavonoide in einer
einzigen HPLC-Analyse in 30 Minuten (Bild 22). Diese Methode erlaubt die
Identifizierung von 22 Flavonoidglykosiden, 6 Flavonoidaglyka und 5 Biflavonen. Sie stellt aufgrund der grossen Polaritätsunterschiede der in Ginkgo
biloba vorkommenden Flavonoide (sehr polare, polare und apolare Verbindungen) grosse Anforderungen an die HPLC-Anlage, u. a. ist der Einsatz eines
Drei-Pumpen-Systems erforderlich. Ein solches Fingerprint-Chromatogramm
muss mit Hilfe der Dioden-Array-Technologie überprüft und die einzelnen
Peaks müssen durch die UV-Spektren und durch entsprechende Reinstoffe
qualifiziert werden.
Diese Fingerprintanalyse ist besonders zur Durchführung von Stabilitätskontrollen wertvoll. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die Flavonoidglykoside wie auch die Biflavone sich während der Lagerung nicht zersetzen und,
dass das Verhältnis der Verbindungen sich nicht verändert (A. Hasler, 1990).
Eine Zunahme des Aglykongehaltes verbunden mit einer Abnahme des Glykosidgehaltes würde darauf hinweisen, dass im Blatt- oder Extraktmaterial unerwünschte Abbaureaktionen stattgefunden haben. Die Fingerprintanalyse ermöglicht besonders die Identifizierung der sehr typischen FlavonolcumarsäuBild 21 HPLC-Chromatogramm eines Blattextraktes von Ginkgo biloba mit UV- Spektren der
Aglyka und der Biflavone nach Hydrolyse der Flavonoidglykoside. Die hier präsentierte Methode erlaubt neben der quantitativen Analyse der Aglyka einen qualitativen Nachweis der Biflavone
in einem einzigen Run und ermöglicht in Vollextrakten und daraus hergestellten Präparaten den
Nachweis, dass zur Verarbeitung authentische Ginkgo-Blätter verwendet worden sind und nicht
irgendein ähnliches Flavonoidmuster aufweisendes Pflanzenmaterial. Die ubiquitär vorkommenden Aglyka allein sind nicht spezifisch genug zur Identifizierung von Ginkgo- Blättern und
Vollextrakten.
Fig. 21 HPLC chromatograms and UV spectra of the aglycones and biflavones of a hydrolyzed
Ginkgo leaf extract. The presented method allows, beside the quantitative determination of the
flavonoid aglycones, a qualitative determination of the biflavones in a single run. This analysis
method ensures that authentic Ginkgo leaves have been used as starting material for extraction.
The ubiquitous aglycones alone are not specific enough to identify Ginkgo leaves or Ginkgo full
extracts.
151
UV 4.628 (A)
120-
120
80
100;
3
70
Q
100
60
80-.
80
It
E 60
50
Q
E 40
30
E 40:
20
405
214
Wavelength (nm)
2 4
405
Wavelength (nm)
LC
220-
B
332 ,4
550,100
200:
Q
O
180:
-o
160:
ä)
ä
E
140:
120:
-
C
E
C
0)
C
100:
80
C
=
0)
L
60:
0)
^
Y0
C U)
ö
U)
00
40
200
0
20
Time (min )
UV 10.947
(R)
UV 14.292
70
60
50
B
70
60
60
c
G
50
E 30
E 30
20
20
20
10
10
10
2 4
Wavelength
403
(nm)
2 4
Wavelength
(nm)
403
(R)
250
200
I
((1
40
50
40
¢
E 30
UV 19.086
UV 15.240 (R)
70
50
40
(R)
2 4
Wavelength
S
E 100
50
(nm)
403
2 4
Wavelength
(nm)
403
Otto Sticher
152
200
100
E
100
200
0
20
10
Zeit
30
(min)
Bild 22 Fingerprintchromatogramm eines ethanolischen Blattextraktes von Ginkgo biloba
(oben) im Vergleich mit den isolierten Flavonoiden und Referenzsubstanzen (unten). Mit der
Fingerprintanalyse ist die Identifizierung von 22 Flavonoidglykosiden, sechs Aglyka und fünf
Biflavonen möglich. Die Fingerprintanalyse ist u. a. zur Durchführung von Stabilitätskontrollen
wertvoll.
Fig. 22 Fingerprint chromatogram of an ethanolic leaf extract of Ginkgo biloba (upper chromatogram) and of the isolated flavonoids and reference compounds (lower chromatogram). With
the fingerprint analysis it is possible to identify unambiguously 22 flavonoid glycosides, six
flavonoid algycones and five biflavones. The method is especially useful performing stability
tests.
reester 21 und 22 (Bild 22 und Tab. 3). Beide werden gut voneinander und von
anderen Substanzen getrennt.
Eine Fingerprintanalyse zur Trennung der Flavonoide in Ginkgo-Blättern
wurde auch von H. Wagner und Mitarbeitern (1989) beschrieben. In dieser
Arbeit konnten zwanzig Peaks in 55 Minuten unter Verwendung einer
LiChroCart 125-4 Säule, einer Guard-Pak RP-18 Vorsäule sowie eines Acetonitril-/Wasser-Gradienten als Elutionsmittel getrennt, aber nur zwei Flavonoide
(Astragalin und Rutin), die vier Biflavone (Bilobetin, Ginkgetin/lsoginkgetin,
Sciadopitysin) sowie Ginkgol, Shikimisäure und 6-Hydroxykynurensäure zugeordnet werden. P. Pietta et al. (1991) entwickelten eine HPLC-Methode unter
Verwendung einer C8 Aquapore RP-300 (7 µm) Säule und eines linearen
Wasser-2-Propanol (95:5)/2-Propanol-Tetrahydrofuran-Wasser (40:10:50)Gradienten. Es gelang ihnen dabei fünfzehn bekannte Ginkgo-Flavonoide in
50 Minuten zu trennen. Die Zuordnung konnte für sechs Flavonoide unter
Einsatz von Referenzsubstanzen vorgenommen werden. Die weiteren Flavonoidglykoside wurden durch Aufnahme der UV-Spektren mit der Diodenarray-
153
Tabelle 3 Gradientenelutionsprofil der in Ginkgo biloba vorkommenden Flavonoide
Table 3
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
The gradient elution profile of the naturally occurring flavonoids of Ginkgo biloba
Flavonoid
3.21
3-0-[2-0-(6-0 {p-Cumaroyl }- 3-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]-7-0-[f3-Dglucosyl]quercetin
3.47
3-0-[2-0, 6-0 Bis(a-L-rhamnosyl)- 3-D-glucosyl]quercetin
4.09
3-0-[2-O, 6-0-Bis(a-L-rhamnosyl)-(3-D-glucosyl]isorhamnetin
4.71
3-0-[2-0, 6-0-Bis(a-L-rhamnosyl)-13-D-glucosyl]kämpferol
4.97
3-0-[6-0-(a-L-Rhamnosyl)-13-D-glucosyl]myricetin
5.96
3-0-[6-0-(a-L-Rhamnosyl)-ß-D-glucosyl]-3'-methylmyricetin
6.53
3-0-[2-0-(6-0-{p-[j3-D-Glucosyl]cumaroyl)-J3-D-glucosyl)-a-Lrhamnosyl]quercetin
7.19
3-0-[6-0-(a-L-Rhamnosyl)-f3-D-glucosyl]quercetin
8.73
3-0-[2-0-(6-0-{p-[(3-D-Glucosyl]cumaroyl}-(3-D-glucosyl)-a-Lrhamnosyl]kämpferol
8.73
3-0-[6-0-(c-L-Rhamnosyl)-(3-D-glucosyl]isorhamnetin
9.68
3-0-[3-D-Glucosyl]quercetin
10.37
3-0-[6-0-((x-L-Rhamnosyl)-13-D-glucosyl]kämpferol
10.74
3-0-[2-0-03-D-Glucosyl)-a-L-rhamnosyl]quercetin
11.39
3-0-[J3-D-Glucosyl]isorhamnetin
13.00
3-0-[[3-D-Glucosyl]kämpferol
13.58
7-041-D-Glucosyl]apigenin
14.58
3-0-[2-0-(13-D-Glucosyl)-a-L-rhamnosyl]kämpferol
15.22
3-0-[a-L-Rhamnosyl]quercetin
16.65
3'-0-[J3-D-Glucosyl]luteolin
17.05
3-0-[a-L-Rhamnosyl]kiimpferol
17.60
3-0-[2-0-(6-0-{p-Cumaroyl}-J3-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]quercetin
18.51
3-0-[2-0-(6-0- {p-Cumaroyl) -f 3-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]kämpferol
Myricetin
18.76
20.60
Luteolin
21.50
Quercetin
22.22
Apigenin
22.76
Isorhamnetin
22.91
Kämpferol
24.02
Amentoflavon
25.06
Bilobetin
27.00
Ginkgetin
Isoginkgetin
27.17
29.35
Sciadopitysin
tR
154
Otto Sticher
Technik vorgenommen, allerdings bei weniger als 10 Milliabsorptions (mAU).
Solche Zuordnungen ohne weitere Untersuchungen mit Hilfe von Referenzsubstanzen sind sehr zweifelhaft. In beiden Arbeiten (H. Wagner et al., 1989; P.
Pietta et al., 1991) sind sowohl die beschriebenen Trennmethoden als auch die
durchgeführten Peakidentifikationen nicht optimal und nicht vollständig.
Ebenfalls kürzlich publizierten A. Lobstein et al. (1991) eine HPLC-Methode
zur Trennung der Ginkgo-Flavonoide und Biflavone unter Verwendung einer
LiChroCart 125-4, Superspher 100 RP-18 Säule (Vorsäule Lichroprep RP-18)
und eines Acetonitril-/Wasser (mit 10% 0,1 N Phosphorsäure)-Gradienten. Da
kein DiodenarrayDetektor zum Einsatz kam und nur wenig Referenzsubstanzen
zur Verfügung standen, konnten nur einzelne Peaks zugeordnet werden. 3-0[2-0-(6-0-{p-Cumaroyl}-f3-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]quercetin und 3-0[2-0-(6-0- { p-Cumaroyl } 43-D-glucosyl)-a-L-rhamnosyl]kämpferol sowie die
Biflavone wurden in Ginkgo-Blättern quantitativ bestimmt.
6.2 Analytik der Terpenlactone
Die Analytik der Terpenlactone bereitete bis in die neueste Zeit grosse Schwierigkeiten, da die Konzentration der Terpene in den Blättern nur gering ist (nach
T.A. van Beek et al., 1991, häufig unter 0,1%), selektive Detektionsmethoden
und eine die Ginkgolide und das Bilobalid nach Extraktion aus Blättern anreichernde analytische Probenaufbereitungsmethode nicht erarbeitet waren. Zwischen 1981 und 1993 sind einige HPLC- (A. Guth et al., 1981; A. Lobstein-Guth
et al., 1983; B.P. Teng, 1988; Y. Komoda et al., 1988; P. Pietta et al., 1990; T.A.
van Beek et al., 1991; T.A. van Beek und G.P. Lelyveld, 1992) sowie DC-Methoden (H. Wagner et al., 1989; B.P. Teng, 1988; S.G. Tallevi und W.G.W. Kurz,
1991; T.A. van Beek und G.P. Lelyveld, 1993) und eine GC-Methode (A. Hasler
und B. Meier, 1992) zur Analytik der terpenoiden Inhaltsstoffe publiziert
worden.
A. Guth et al. (1981) und A. Lobstein-Guth et al. (1983) publizierten als erste
HPLC-Systeme zur Trennung von Bilobalid und der Ginkgolide A, B und C.
Sie verwendeten LiChrosorb RP-18 (101.1m) als Trennsäule und UV-Detektion
bei 220 nm zum Nachweis der Substanzen. Sie kamen zum Schluss, dass von
den untersuchten isokratischen Trennsystemen eine Mischung von Wasser-Methanol-Tetrahydrofuran (75:5:15) eine genügende Trennleistung für Bilobalid
und die Ginkgolide darstellt. Die vorgeschlagene Aufarbeitung und Vorreinigung eines Ginkgo-Extraktes war allerdings zeitaufwendig und wenig wirksam
(vgl. Bild 3 bei A. Lobstein-Guth et al., 1983), so dass die präsentierte Methode
unbefriedigende Resultate lieferte. B.P. Teng (1988) beschrieb die HPLC-Trennung von Bilobalid und der Ginkgolide A, B, C und J in einem Ginkgo-Extrakt.
Er verwendete eine RP C18 Trennsäule, Wasser-Methanol-Tetrahydrofuran
(7:2:1) als Elutionsmittel und einen Refraktometer zum Nachweis der Substanzen. Nach ihm ist eine UV-Detektion nicht möglich, da bei der verwendbaren
Wellenlänge (220 nm) zuviele Verunreinigungen den Nachweis der Ginkgolide
verunmöglichen. Leider publizierte B.P. Teng keine experimentellen Angaben,
155
so dass die Analyse nicht reproduziert werden kann. Ähnlich verhält es sich
mit einer RP-HPLC-Methode unter Verwendung von Nova-Pak C 18 Radial-Pak
(4 µm) als Trennsäule und 33% Methanol-Wasser als Elutionsmittel, welche
von Y. Komoda et al. (1988) publiziert worden ist. Neben der Feststellung, dass
die Verwendung des Refraktometers zum Nachweis der Terpenlactone bessere
Resultate liefert als die UV-Detektion, fehlen wesentliche experimentelle Daten, welche eine Reproduzierbarkeit der Methode gewährleisten würden. P.
Pietta et al. (1990) schlugen erstmals ein einfaChes Proben-Vorreinigungverfahren unter Verwendung einer Kombination von Extrelut Säule und Bakerbond
Aluminium Säule vor. Als Trennsäule wurde MiCrosorb C18 (3 µm) und als
Elutionsmittel 2-Propanol-Wasser (10:90) eingesetzt. Trotz der Fortschritte bei
der Probenaufbereitung kann die vorgeschlagene Trennmethode höchstens zum
Nachweis, nicht aber für eine quantitative Bestimmung der Terpenlactone
verwendet werden. Bei der von den Autoren vorgeschlagenen UV-Detektion
bei 220 nm werden verschiedene Verunreinigungen zusammen mit den Terpenen detektiert, was dem HPLC-Chromatogramm und den on-line UV-Spektren
Bild 23 Analyseschema für die HPLC-Bestimmung der Terpenlactone (Bilobalid und
Ginkgolide) von Ginkgo biloba (nach T.A.
van Beek et al., 1991). Die quantitative Bestimmung der Terpenlactone erfordert eine
aufwendige Probenaufbereitung und RI-Detektion anstelle der üblichen UV-Detektion.
Abdampfen
des McOH
Verdünnter Wasser-Extrakt
Probenaufarbeifunq:
a) Polyamid-Säule
b) Bond Elut C18-Säule
(2 und 5% wässr. MaOH)
Gereinigter Extrakt
Abdampfen des Lösungsmittels
Auflösen des Rückstandes In MWOH
Fig. 23 Work-up procedure and HPLC determination of terpene lactones (bilobalide
and ginkgolides) from Ginkgo biloba according to T.A. van Beek et al. (1991). The quantitative determination of the terpene lactones
affords a rather time-consuming clean-up procedure and RI detection instead of the usual
UV detection.
HPLC-Analyse
Tabelle 4 Chromatographische Parameter zur Bestimmung der Terpenlactone (Bilobalid und
Ginkgolide) von Ginkgo biloba (nach T.A. van Beek et al., 1991)
Table 4
Chromatographic conditions for the determination of the terpene lactones (bilobalide
and ginkgolides) from Ginkgo biloba according to T.A. van Beek et al. (1991)
– Mobile Phase:
Wasser-Methanol (67:33), isokratisch
– Stationäre Phase:
Spherisorb C 1 8, 5 p.m (231 x 4,6 mm ID;
selbstgepackte Säule)
– Fluss:
1 ml / min
– Temperatur:
Raumtemperatur
– Detektion:
RI-Detektor
– Interner Standard:
Benzylalkohol
156
Otto Sticher
(vgl. Bild 3 und 4 bei P. Pietta et al., 1990) entnommen werden kann. Die
vorgestellte Methode ergäbe wahrscheinlich unter Verwendung eines Refraktometers zur Detektion der Terpene tolerierbare Resultate, allerdings unter
Verlusten bei der Nachweisgrenze. Zusammenfassend kann bemerkt werden,
dass alle besprochenen Methoden entweder unbefriedigend sind, fehlerhafte
Resultate ergeben oder in Ermangelung detaillierter experimenteller Angaben
nicht reproduziert werden können (T.A. van Beek et al., 1991).
Eine vielversprechende Probenaufarbeitungs-, Detektions- sowie quantitative Bestimmungsmethode für die Terpenlactone wurde von T.A. van Beek et
al. (1991) vorgestellt. In den folgenden Ausführungen soll näher auf die Arbeiten dieser Autoren sowie auf persönliche Mitteilungen von T.A. van Beek
eingegangen werden.
Ginkgo-Blätter werden selektiv mit Methanol-Wasser (10:90), Phytopharmaka mit Wasser allein, extrahiert (Bild 23). Nach einer Probenaufbereitung
mit Polyamid (MN-SC 6 für Säulenchromatographie) und C18 Kartuschen
(Bond Elut) in Serie können die Terpene in den erhaltenen Extrakten mit
RP-HPLC (Tab. 4) unter Verwendung von Spherisorb (5 µm; selbstgepackte
Säule) und Wasser-Methanol (67:33) als mobiler Phase getrennt und mit einem
Refraktometer nachgewiesen werden. Kochendes Wasser, das wenige Prozent
Methanol enthält, hat sich als selektives Extraktionsmittel für die Ginkgolide
erwiesen. Obwohl damit eine Reihe von störenden Substanzen mitextrahiert
werden, können diese durch die vorgeschlagene Probenaufbereitung entfernt
werden. Mit Hilfe der Polyamidkartusche werden die meisten phenolischen
Stoffe (u. a. auch die Flavonoide) entfernt. Die Terpenlactone werden in der
C18 Kartusche unter Einsatz eines Elutionsmittels mit einem niedrigen Methanolanteil zurückgehalten. Nach Erhöhung des Methanolgehaltes können sie
von der Säule abgelöst werden. Nach dieser Probenaufbereitung können die
Terpenlactone unter Einsatz einer RI-Detektion, nicht aber einer UV-Detektion, analysiert werden. Eine für die UV-Detektion notwendige optimale Vorreinigung konnte von den Autoren nicht gefunden werden.
T.A. van Beek et al. (1991) konnten mit dieser Methode unter Verwendung
von Benzylalkohol als internem Standard in allen untersuchten Ginkgo-Blättern und Ginkgo-Phytopharmaka Bilobalid und Ginkgolide nachweisen, wenn
auch mit beträchtlichen Unterschieden zwischen Blattmustern verschiedener
Herkunft oder zwischen Ginkgo-Päparaten von verschiedenen Herstellern. Von
den untersuchten Blattprovenienzen (Bild 24) enthielten Blätter eines französischen Musters den höchsten Gesamtgehalt an Terpenlactonen, alle anderen
enthielten viel weniger. Der Terpenlacton-Gesamtgehalt aller untersuchten
Muster variierte um einen Faktor 40. In allen untersuchten Mustern war der
Gehalt an Bilobalid gleich gross oder höher als derjenige aller nachgewiesenen
Ginkgolide zusammen.
Dieselben Autoren (T.A. van Beek et al., 1991) konnten zeigen, dass Ginkgo-Phytopharmaka, die auf der Basis eines teilweise gereinigten Spezialextraktes beruhen, wie zum Beispiel Tebonin, Rökan, Tanakan viel höhere Gehalte
an Ginkgoliden und Bilobalid enthalten, als andere, speziell holländische
157
Terpenlactongesamtgehalt
in Ginkgo- Blättern
BB
Herkun ft
Gehalt (%)
China
0,134
Holland
0,037
Holland (1989)
0,196
Holland
0,006
Frankreich
0,266
Frankreich
0,252
Deutschland
0,032
Holland (1989)
GC
GA GB
GJ
rD
Der Terpenlactongesamtgehalt
variierte um einen Faktor 40.
time (mini
BB
BB
IS
Frankreich
Deutschland
GC
GA
IS
GJ
GB
time (min)---
time (mini-
Bild 24 HPLC-Chromatogramme und Terpenlactongehalte von Ginkgo- Blättern veIschiedener
Herkunft (nach T.A. van Beek et al., 1991). Der Terpenlactongesamtgehalt aller untersuchten
Muster variierte bei diesen Analysen um einen Faktor 40.
Fig. 24 HPLC chromatograms and quantitative results of terpene lactones in Ginkgo biloba
leaves obtained from different sources according to T.A. van Beek et al. (1991). The total
concentration of the terpenoids varied by a factor of 40.
Otto Sticher
158
OB`
is
BB I
Is
Terpenlactongesamtgehalt
Tebonin
Rökan
BCI
I
Tanakan
r is
GC
Ir
G
GA
GA
GB
G1--
GB
GB
5
10
15
time (mint
20
IS
25
Präparate
Gehalt (°/0)
Tanakan (F)
0.220
Rökan (D)
0,192
Tebonin (D)
0,213
Geriaforce (NL)
0.017
Ginkgoplant (NL)
0.013
Naphyto D0 (NL)
0,012
Ginkgogink (F)
0.111
GA
time (mini--
..
lime (mint
GG
IS
IS
Ginkgogink
Geriaforce
Ginkgoplant
GI
e6
GA
GB
(
GA
( SB
Der Terpenlactongesamtgehalt
variierte um einen Faktor 18.
time Iminl -
lime Iminl---
Bild 25 HPLC-Chromatogramme und Terpenlactongehalte von Ginkgo-Phytopharmaka (nach
T.A. van Beek et al., 1991). Der Terpenlactongesamtgehalt der untersuchten Präparate war sehr
unterschiedlich und variierte um einen Faktor 18.
Fig. 25 HPLC elution profile and determination of terpene lactones in Ginkgo phytomedicines
according to T.A. van Beek et al. (1991). The total concentration of the terpenoids varied by a
factor of 18.
Präparate, die nach Vorschriften der homöopathischen Pharmakopöe hergestellt worden sind (Bild 25). Ein französisches Präparat (Ginkgogink) zeigte
eine vollständig versChiedene Zusammensetzung als alle anderen, die untersucht worden sind. Es enthielt grosse Mengen an Ginkgoliden, während Bilobalid nicht nachgewiesen werden konnte. Da Bilobalid von den Terpenlactonen
in allen untersuchten Blättern und Präparaten den Hauptinhaltsstoff darstellt,
kann daraus geschlossen werden, dass bei diesem Präparat Bilobalid während
dem Herstellungsprozess selektiv entfernt worden ist. Zusätzlich konnten im
Chromatogramm dieses Präparates einige zusätzliChe Peaks nachgewiesen
werden, die in allen anderen untersuchten Mustern nicht vorkamen.
Die Verwendbarkeit der von T.A. van Beek et al. (1991) vorgestellten
Methode zur Standardisierung von Ginkgo-Präparaten wird die Zukunft ergeben, sobald die Methode in der Routineanalytik erprobt worden ist. Nach einer
privaten Mitteilung von T.A. van Beek eignet sich die beschriebene Methode
gut zur Analyse der Ginkgo-Terpenlactone, obwohl die Probenaufbereitung
recht zeitaufwendig ist und sehr stark von der Qualität der kommerziell erhältlichen C18 Reinigungskartuschen abhängt. Es ist deshalb zu hoffen, dass in
Kürze eine stark vereinfachte Probenaufbereitung unter Verwendung von nur
159
20000
Bild 26 Gaschromatogramm eines GinkgoVollextraktes nach Extraktion, Reinigung und
Derivatisierung gemäss A. Hasler und B. Meier (1992). Peak bei tR : 10.259 = Trimethylsilylether von Bilobalid, Peaks bei tR > 17 min =
Trimethylsilylether der Ginkgolide A, B, C
und J und von Cholesterol als internem Standard (vgl. Bild 27)
"
15000
10000
5000
I
i
20
15
10
Timc (min )
5
Fig. 26 GC traces of a Ginkgo full extract
after the extraction, purification and derivatization procedure according to A. Hasler and
B. Meier (1992). Peak at t R : 10.259 = trimethylsilyl ether of bilobalide, peaks at tR
> 17 min = trimethylsilyl ethers of the ginkgolides A, B, C and J, and cholesterol as internal
standard (see Fig. 27)
y
12000
10000
‘o
os
n
Bild 27 Ausschnitt aus dem Gaschromatogramm (vgl. Bild 26) zwischen tR 17.0 und
19.5 min. Die Peaks zeigen die Trimethylsilylderivate der Ginkgolide. Ginkgolid A =
Peak bei tR : 17.369, Ginkgolid B = Peak bei tR:
18.616, Ginkgolid C = Peak bei tR : 19.182,
Ginkgolid J = Peak bei tR : 17.923, ISTD =
interner Standard (Cholesterol)
°O
^
°•
f
`
8000
6000 "
i
U
^_^
^.l\
Time (min)
19.5
4000
17.0
Fig. 27 GC traces of the section between tR
17.0 and 19.5 min of the chromatogram in
Fig. 26. The peaks show the trimethylsilyl
derivatives of the ginkgolides. Ginkgolide A
= peak at tR : 17.369, ginkgolide B = peak at tR:
18.616, ginkgolide C = peak at tR : 19.182,
ginkgolide J = peak at tR : 17.923, ISTD =
internal standard (cholesterol)
einer Säule beschrieben wird. Ebenfalls wäre es wünschenswert, dass durch die
Probenaufbereitung sämtliche, eine UV-Detektion störenden Substanzen, entfernt werden könnten. Der Ersatz der RI-Detektion durch eine UV-Detektion
hätte grosse Vorteile, unter anderem bei der Peakidentifikation und der PeakReinheitskontrolle. Ebenso würden dadurch NaChweisgrenze (bei RI-Detektion ca.10 ppm) und Basislinienstabilität verbessert.
160
Otto Sticher
In einer neueren Arbeit untersuchten T.A. van Beek und G.P. Lelyveld
(1992) unter Einsatz der oben beschriebenen HPLC-Methode den Gehalt der
Terpenlactone (Ginkgolide A, B, C und Bilobalid) in Abhängigkeit der Jahreszeit. Für alle vier untersuchten Substanzen war der Gehalt im Frühjahr am
kleinsten, um dann graduell bis zum Spätsommer bzw. Herbstbeginn anzusteigen. Anschliessend nahm er bis zum Blattabfall stetig ab. T.A. van Beek und
G.P. Lelyveld konnten zeigen, dass die Konzentration der Ginkgolide und des
Bilobalids bei drei untersuchten Bäumen (junger Baum mit unbestimmtem
Geschlecht, 60jähriger weiblicher Baum, 60jähriger männlicher Baum) sehr
unterschiedlich war. Eine weitere Ontogenesestudie, auf die hier nicht näher
eingegangen werden kann, wurde ebenfalls kürzlich von V. Flesch et al. (1992)
vorgestellt.
H. Wagner und B. Steinke (1991) sowie B. Steinke et al. (1992, 1993) haben
eine biologische Standardisierung von Ginkgo-Extrakten vorgeschlagen. Die
Methode beruht auf der Bestimmung der Hemmung der durch PAF hervorgerufenen Plättchenaggregation durch Ginkgo-Extrakte. Da die Bestimmung nur
für Ginkgolide spezifisch ist, nicht aber für Bilobalid, welches sich in neueren
Untersuchungen als Substanz mit der stärksten neuroprotektiven Wirkung
gezeigt hat (J. Krieglstein und F. Ausmeier, 1992; H. Oberpichler-Schwenk und
J. Krieglstein, 1992) und ebenfalls nicht für Flavonoide, ist der Begriff «biologische Standardisierung» in diesem Zusammenhang zum heutigen Zeitpunkt
irreführend. Er müsste in «biologische Bestimmung der Ginkgolide, berechnet
als Ginkgolid B» umbenannt werden.
Vielversprechender scheint eine ebenfalls erst kürzlich vorgestellte GC-Methode für den Nachweis und die Bestimmung der Terpenlactone und damit auch
für eine Standardisierung von Phytopharmaka zu sein. A. Hasler und B. Meier
(1992) konnten zeigen, dass die zeitaufwendige Probenaufbereitung, die heute
noch bei der HPLC der Terpenlactone erforderlich ist, durch den Einsatz der
Kapillar-Gaschromatographie vermieden werden kann. Die Autoren konnten
die Ginkgolide und das Bilobalid nach Extraktion und Derivatisierung in die
Trimethylsilylderivate qua litativ trennen und quantitativ bestimmen (Bild 26
und 27).
6.3 Ginkgo- Extrakte und -Handelspräparate
6.31 Der Extrakt als Wirkstoff von Phytopharmaka
In der Phytotherapie stellt der Extrakt als Ganzes den Wirkstoff dar. Eine
allgemeingültige Definition dazu fehlt allerdings. Von der Ansicht, Phytopharmaka müssten alle Komponenten des pflanzlichen Ausgangsmaterials im natürlichen Mengenverhältnis enthalten, bis hin zu der Ansicht, sie müssten nur
die für die Wirkung verantwortlichen Substanzen enthalten, ist der Übergang
fliessend. Letztendlich entscheiden bei der Extraktherstellung die eingesetzten
161
Zerkleinerte Blätter von Ginkgo biloba
2 - 47o Havonolglykoside.
Vollextrakt
/
1
Verschied. Reinigungsbzw. Trennschritte:
• Flüssig/FlüssigExtraktion
• Fällung
• Konzentrierung
L
/
Standardisierung:
Minimalgehalt
von 2%
Entfernung / Reduzierung
von unerwünschten Ver- :
bindungen. z.B. Höhermolekulare Gerbstoffe.
Eiweißverbindungen. Poly-:
saccharide sowie Biflavone
und Ginkgolsäuren
Angereicherter oder
Spezial-Extrakt, z.B. EGb 761
Standardisiert aut:
124% Flavonolglykoside'
6% Terpen lactone
fGinkgolide. Bllobalid)
Bild 28 Standardisierung von Ginkgo-Präparaten. Ginkgo-Vollextrakte werden auf einen Minimalgehalt von 2% Flavonolglykosiden und angereicherte Extrakte auf 24% Havonolglykoside und/oder 6% Terpenlactone
standardisiert.
Fig. 28 Standardization of Ginkgo preparations. Ginkgo full extracts are standardized on
a minimum content of 2% flavonol glycosides
and enriched extracts on 24% flavonol glycosides and/or 6% terpene lactones.
Verfahren (verwendete Lösungsmittel, Methoden und Schritte der Extraktion)
über die Art und Menge der Inhaltsstoffe (R. Hänsel, 1990, 1991).
Wie bei anderen Arzneipflanzen, gibt es auch bei Ginkgo «Vollextrakte»,
auch als «Roh- oder Einfachextrakte» bezeichnet (Bild 28). In ihnen liegen die
meisten Inhaltsstoffe in ähnlichem Verhältnis vor wie im pflanzlichen Ausgangsmaterial. Solche Extrakte werden meist mit Alkohol Wasser als Extraktionsmittel hergestellt, dessen Lösungseigenschaften dazu führen, dass eine
recht komplexe Mischung von polaren (jedoch wenig Zucker) bis ziemlich
apolaren (jedoch wenig Wachse und Fette) Naturstoffen aus der Matrix der
Gerüstsubstanzen herausgelöst werden. Im Falle von Ginkgo sind zur Erzielung einer hohen Ausbeute an Flavonoiden 40 bis 60 Prozent Alkohol zu
empfehlen. Geeignet ist auch wässriges Aceton. Ein solcher Vollextrakt enthält
in der Regel zwei bis vier Prozent Ginkgoflavonolglykoside. Fertigarzneimittel
auf der B asis von Vollextrakten werden in verschiedenen Ländern Europas für
die Selbstmedikation zugelassen. Für die Selbstmedikation zulässige Indikationen sind z. B. in der Schweiz: nachlassende geistige und körperliche Leistungsfähigkeit, Konzentrations-, Gedächtnis- und Antriebsschwäche, arteriosklerotische Beschwerden wie Schwindelgefühl und Vergesslichkeit sowie
weitere, ähnliche Symptome.
Daneben existieren «angereicherte oder Spezialextrakte». Sie werden nach
der Extraktion durch mehrstufige Reinigungs- bzw. Trennschritte aufbereitet
und enthalten dadurch einen höheren Gehalt an erwünschten Wirkstoffen,
während unerwünschte Inhaltsstoffe weitgehend eliminiert worden sind. Gink-
162
Otto Sticher
go-Präparate sind in Europa auf dem Weg über einen solchen «angereicherten
oder Spezialextrakt» bekanntgeworden, dessen Herstellungsverfahren in den
Forschungslaboratorien der Firma Schwabe, Karlsruhe, entwickelt worden ist.
Er wurde unter der Bezeichnung EGb 761 bekannt. Zur Herstellung dieses
klinisch und pharmakologisch geprüften Ginkgo-Extraktes wird gemäss der
1989 abgelaufenen Patentschrift (Deutsches Patentamt, Offenlegungsschrift
2117429) ein recht aufwendiges Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt, wobei die an der Wirkung mitbeteiligten erwünschten Inhaltsstoffe, die
Flavonoide und Ginkgolide, angereichert werden. Höhermolekulare Inhaltsstoffe wie Gerbstoffe, Eiweissverbindungen und Polysaccharide, aber auch
andere unerwünschte Verbindungen, z. B. Biflavone und Ginkgolsäuren, die
wegen Komplexbildung mit anderen Substanzen oder allergenen Eigenschaften
unerwünscht sind, werden entfernt bzw. ihr Anteil im Extakt wird stark reduziert (R. Hänsel, 1990, 1991). Ein solches Verfahren ist insbesondere dann
notwendig, wenn ein Ginkgo-Extrakt zu einer Injektionslösung verarbeitet
werden soll. Solche sind in der Phytotherapie der Bundesrepublik Deutschland
verbreitet, während z. B. in der Schweiz entsprechende Präparate nicht zugelassen sind. Fertigarzneimittel auf der Basis des Extraktes EGb 761 beanspruchen aufgrund der pharmakologischen und klinischen Belege Indikationen, die
in der Regel eine Verschreibung der Präparate erfordern. Der Einsatz von
Ginkgo-Extrakten bei fortgeschrittenen peripheren und zerebralen Durchblutungsstörungen ohne Abklärung der mannigfaltigen Ursachen durch den Arzt
und ohne Überwachung lässt sich nicht verantworten. Um fortschreitende
degenerative Prozesse aufzuhalten oder zu verlangsamen ist die Medikation
nur ein Element eines umfassenden Therapiekonzeptes, das im Falle von
Hirnleistungsstörungen, z. B. ein Gedächtnis-, im Fall von peripheren Durchblutungsstörungen ein Gehtraining mit einschliessen muss.
Darüber hinaus sind auch homöopathische Präparate und Kombinationsprodukte, z. B. mit Ginseng- oder Knoblauchextrakten, im Handel, auf die hier
nicht näher eingegangen wird.
6.32 Standardisierung
Bis vor kurzem waren alle Ginkgo-Fertigarzneimittel auf einen Gehalt an
«Ginkgoflavon»glykosiden eingestellt. Seit kurzem werden einzelne Präparate
auch auf Terpenlactone standardisiert. Die Präparate auf der Basis des Spezialextraktes EGb 761, wie Tebonin forte (Schwabe), Rökan (Intersan), Tanakan
(Ipsen) und Ginkobil (Ratiopharm) werden auf einen Gehalt von 24% «Ginkgoflavon»glykosiden standardisiert. Andere, auf gleichem oder ähnlichem
Herstellungsverfahren beruhende Extraktpräparate wie Kaveri (Lichtwer Pharma), Craton (Bioplanta Arzneimittel), Gincosan [Ginkgo-/Ginseng-Präparat]
(Pharmaton) werden auf einen «Ginkgoflavon»glykosidgehalt von 16-25%,
standardisiert, zwei weitere Präparate, Ginkgo-Dragees (Duopharm) und Ginkgo-Dragees (Salus-Haus) auf einen solchen von 7,4%. Präparate auf der Basis
von Vollextrakten wie Valverde Vital-Dragees (Ciba-Geigy) oder Allium Plus
163
[Ginkgo-/Knoblauch-Präparat] (Zeller) sind auf einen Flavonoid-Mindestgehalt von 2%, das französische Präparat Arkogelules Ginkgo (Arkopharma) auf
0,5% Flavonoide standardisiert. Entsprechend untersCheiden sie sich in der
Dosierung (z. B. Tagesdosis Tebonin forte 120 mg Extrakt, Valverde Vital-Dragees 500 mg Extrakt). Zur Standardisierung wird, wie unter Analytik der
Flavonoide beschrieben, eine HPLC-Analyse der Flavonoidaglyka durchgeführt und anschliessend auf den Glykosidgehalt umgerechnet.
Neuerdings werden Präparate, die auf dem Extrakt EGb 761 beruhen (Tebonin forte, Rökan, Tanakan, Ginkobil), auch auf 6% Terpenlactone (Ginkgolide
und Bilobalid) standardisiert. T.A. van Beek et al. (1991) erhielten in ihren
Untersuchungen bei Tebonin forte Tropfen einen Totalgehalt an Terpenlactonen von 0,21%, was umgerechnet auf den Extrakt einem Gehalt von 5,25%
entspricht. In diesem Zusammenhang muss klar festgehalten werden, dass die
deklarierten 24% «Ginkgoflavon»glykoside bzw. 6% Terpenlactone sich auf
die Standardisierung der für die Herstellung der Fertigarzneimittel verwendeten Extrakte bezieht. Da für die Produktion der Fertigarzneimittel nur ein
Aliquot dieses Extraktes verwendet wird, z. B. im Fall der Tebonin forte
Tropfen 4 g Extrakt auf 100 ml Lösung, ist der Endgehalt an Wirkstoffen im
Fertigarzneimittel um einen Faktor 25 niedriger. In bezug auf die Verwendung
wirksamkeitsrelevanter Inhaltsstoffe für die Standardisierung ist der Bezug auf
Flavonolglykoside und Terpenlactone nicht nur begrüssenswert, sondern heute
absolut erforderlich. Es ist zu vermuten, dass andere Firmen bei ihren Präparaten damit bald nachziehen werden, bzw. dass sie von den Zulassungsbehörden dazu angehalten werden. Bei den neuesten Untersuchungen von T.A. van
Beek und G.P. Lelyveld (1992) variierte der Totalgehalt an Ginkgoliden in
Blattmustern eines jungen und eines 60jährigen männlichen Baumes um den
Faktor 160. Einmal mehr konnte damit gezeigt werden, dass eine Qualitätskontrolle nicht nur die Flavonoide, sondern auch die Terpenlactone einschliessen
muss.
6.33 Generika bei den Phytopharmaka – Phytogenerika
Seit Erlöschen des Patentschutzes von EGb 761 wird die Frage, ob es auch bei
Phytopharmaka Generika gibt, wohl aus marktpolitischen Überlegungen, mit
äusserster Vehemenz, diskutiert. Zweifellos kann festgehalten werden, dass
«Extrakt nicht gleich Extrakt» ist. Herstellungs- und Reinigungsverfahren
eines angereicherten Extraktes, speziell im Falle von Ginkgo biloba, umfassen
eine ganze Reihe von Schritten, welche in einem anderen Betrieb kaum vollständig reproduzierbar sind. Folglich sind Extrakte verschiedener Herkunft in
der Regel von mehr oder weniger unterschiedlicher Zusammensetzung. Dies
ist gerade bei solchen Extrakten von Bedeutung, bei denen die Wirkung nicht
vorherrschend durch einen einzelnen Stoff hervorgerufen wird, sondern durCh
das komplizierte Zusammenspiel verschiedener Inhaltstoffe (R. Hänsel, 1990,
1991). Doch daraus kann nicht abgeleitet werden, dass auf dem Gebiet der
Phytopharmaka keine Generika möglich sind, es sei denn, man würde bei der
164
Otto Sticher
Zulassung von Phytopharmaka in Zukunft Normen anlegen, die auch gut
dokumentierte Extrakte derzeit kaum erfüllen können. Schliesslich können
auch zwischen Generika synthetischer Arzneimittel und entsprechenden Originalpräparaten Unterschiede bestehen, etwa bedingt durch ein anderes galenisches Verfahren bei der Herstellung. Während jedoch bei den Synthetika-Monopräparaten Methoden für den Vergleich der Bioverfügbarkeit zur Verfügung
stehen, fehlen solche für Phytopharmaka, so dass eine Beurteilung schwieriger
ist. Sie wird in diesem Fall nur mit vergleichbaren Wirkungs- und Wirksamkeitsnachweisen möglich.
Hier liegt generell die Hauptproblematik bei der Beurteilung von Phytopharmaka. Im Falle von Ginkgo liegen bisher keine pharmakologischen und klinischen Untersuchungen von Blättern vor. Alle Untersuchungen sind mit standardisierten Extrakten und den daraus hergestellten Präparaten durchgeführt
worden, in erster Linie, wie schon früher festgestellt, mit dem ehemals patentierten Extrakt EGb 761. Praktisch alle anderen (eine Ausnahme stellt Kaveri
dar (A. Hartmann und V. Schultz, 1991)), nicht mit diesem Extrakt hergestellten
Spezialitäten beziehen sich in ihren Indikationen auf die Resultate von EGb
761, unabhängig davon, wie sie hergestellt worden sind. Ein solches Vorgehen
lässt sich in keiner Weise rechtfertigen. Ob allerdings die Zulassung eines
neuen Ginkgo-Präparates mit analytisch nachweisbaren hohen Flavonoid- und
Terpenlactongehalten verweigert werden kann, nur weil das Herstellungsverfahren nicht in allen Punkten demjenigen des Extraktes EGb 761 entspricht, wie
das derzeit in der Bundesrepublik Deutschland praktiziert wird, ist fragwürdig.
Mindestens stellt ein solches Vorgehen aus der Sicht der bisherigen Praxis im
Falle von Generika eine Novität dar. Eine Ausdehnung dieser Praxis auch auf
Phytopharmaka anderen pflanzlichen Ursprungs brächte eingreifende Konsequenzen auf die heute sich auf dem Markt befindenden Fertigarzneimittel.
7 Bilanz
Medikamente auf der Basis von Ginkgo-Blattextrakten haben einen bedeutenden Platz in der Behandlung veIschiedener Altersbeschwerden erlangt. Wie seit
Jahren fast alle Arzneimittel, die eine Wirkung zur Verbesserung der zerebralen, beziehungsweise peripheren Durchblutung beanspruchen, steht auch Ginkgo-Extrakt trotz umfangreicher Studien im Mittelpunkt von Kontroversen.
Obwohl in den meisten der vorliegenden placebo-kontrollierten Doppelblindstudien ein positiver Effekt auf sehr unterschiedliche klinische und apparative
Parameter bei Patienten mit einem hirnorganischen Psychosyndrom belegt
werden konnte, sind weitere Studien notwendig, die die heute geltenden strengen Richtlinien zum Wirksamkeitsnachweis von Nootropica befolgen.
Der Einsatz von Ginkgo-Extrakten bei fortgeschrittenen peripheren und
zerebralen Durchblutungsstörungen ohne Abklärung der mannigfachen Ursachen durch den Arzt und ohne Überwachung lässt sich nicht verantworten. Um
fortschreitende degenerative Prozesse aufzuhalten oder zu verlangsamen, ist
die Medikation nur ein Element eines umfassenden Therapiekonzeptes, das im
Ginkgo biloba - Ein modernes pflanzliches Arzneimittel 165
Falle von Hirnleistungsstörungen, z. B. ein Gedächtnis-, im Fall von peripheren
Durchblutungsstörungen ein Gehtraining mit einschliessen muss.
Ginkgo-Präparate mit niedrigerem Flavonoid- bzw. Terpenlactongehalt, die
nicht den hohen Indikationsanspruch des Extraktes EGb 761 beanspruchen,
werden in verschiedenen Ländern Europas, u. a. auch in der Schweiz, für die
Selbstmedikation zugelassen. Zur Diskussion steht damit die Frage, ob für die
Behandlung von primären Symptomen einer beginnenden Mangeldurchblutung ein Spezialextrakt mit hohem Flavonoid- und Terpenlactonanteil oder ein
Vollextrakt, wie er in der Phytotherapie üblicher ist und bei anderen Flavonoid-Proanthocyanidindrogen (z. B. Weissdorn) Standard ist, benötigt wird. Dosisfindungsstudien, die zur Lösung dieses Problems beitragen würden, liegen
keine vor. Es gibt Hinweise in Form von Erfahrungsberichten, dass Vollextrakte
Vigilanz und geistige Leistungsfähigkeit im Alter verbessern. Darauf deutet
auch die Verbreitung der Urtinktur hin. Sorgfältig durchgeführte psychometrische, aber auch andere Studien, müssen dies bestätigen.
Heute sind jedem Laboratorium gut zugängliche analytische Methoden für
die Qualitätskontrolle bzw. Standardisierung sowohl der Flavonoide als auch
der Terpenlactone von Ginkgo-Blattmaterial und Ginkgo-Präparaten verfügbar. Das rechtfertigt die Forderung nach standardisierten Präparaten bei der
Zulassung neuer Ginkgo-Phytopharmaka. Die ursprünglich praktizierte Einstellung auf Flavonolglykoside genügt dem Verlangen nach einer Standardisierung auf wirksamkeitsrelevante Inhaltsstoffe nicht mehr. Deshalb sollten in Zukunft sowohl Flavonolglykoside als auch Terpenlactone (Bilobalid
und Ginkgolide) erfasst werden. Nicht standardisierte Präparate sollten in
Zukunft nicht mehr zugelassen werden.
Die mit dem Erlöschen des Patentschutzes von EGb 761 entstandene Generika-Situation sollte nicht dazu führen, dass neue Präparate niCht zugelassen
werden, nur weil das Herstellungsverfahren nicht in allen Punkten mit demjenigen des Extraktes EGb 761 identisch ist. Damit wäre jede Art von Phytogenerika ausgeschlossen. Die Hersteller neuer Ginkgo-Extrakte und Ginkgo-Präparate sind dennoch aufgerufen, Methoden für den Vergleich der Bioverfügbarkeit zu erarbeiten, oder, solange noch keine solchen zur Verfügung stehen,
ihre Produkte einer klinischen Prüfung zu unterziehen. t
1 Meinem früheren Mitarbeiter Dr. Andreas R. Hasler (Zeller Söhne AG, Romanshorn) danke
ich für die im Rahmen seiner Dissertation in den Jahren 1986-1990 durchgeführten experimentellen Arbeiten. Ihm sowie Prof. Dr. Beat Meier (ETH Zürich/Zeller Söhne AG, Romanshorn)
danke ich ferner für wertvo lle Informationen und für viele anregende und konstruktive Diskussionen, welche u. a. auch zur Publikation einiger Arbeiten über neue Flavonoide sowie die
Qualitätskontrolle von Ginkgo und Ginkgo-Präparaten geführt haben.
166
Otto Sticher
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Prof. Dr. O. Sticher, Departement Pharmazie, ETH-Zentrum, Clausiusstrasse 25, CH-8092 Zürich

Ginkgo biloba — Ein modernes pflanzliches Arzneimittel

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