Fermentatoren und deren Betrieb

Fermentatoren
und deren
Betrieb
Fermenter / Bioreaktor
ist ein Behälter, in dem bestimmte Mikroorganismen, Zellen oder kleine
Pflanzen unter möglichst optimalen Bedingungen kultiviert werden
Unterscheidung
nach der Art der O2-Zufuhr
Oberflächenreaktoren (EMERS)
- Versorgung der MO aus angrenzender Gasphase erfolgt über die Oberfläche des
Mediums
- Biomasse: dünne Nährmedienfilme auf festen Oberflächen, feste Oberflächen
oder aufschwimmende Biomasse
- bei geringem Sauerstoffbedarf (z.B. Schimmelpilze für Citronensäure- oder
Antibiotika-Herstellung)
für Massenproduktionen sind SUBMERSreaktoren besser geeignet
- Versorgung mit Sauerstoff erfolgt aus dem Kulturmedium
- Transportvorgänge werden durch Erzeugung von Turbulenz intensiviert (Turbulenz
durch Energiedissipation
nach Art des Energieeintrages
Energieeintrag durch mechanisch bewegte Einbauten (Rotationsbewegung oder axiale
Bewegung der Einbauten, kinetische Energie wird in die Flüssigkeit übertragen und
dort dissipiert)
Energieeintrag durch Zwangsumlauf der Flüssigkeit (Beschleunigung der Flüssigkeit
durch eine Pumpe, Dissipation der kinetischen Flüssigkeitsenergie in verschiedenen
Gasdispergierorganen)
Energieeintrag durch Vordruck des Gases (kinetische Energie des komprimierten
Gases wird in Form von Blasen in der Flüssigkeit dissipiert
Allgemeiner Aufbau eines
Rührkessel-fermenters
Stirred tank reactor STR
Als ältester Chemiereaktor wird der Rührkessel auch für biotechnische Prozesse
bevorzugt eingesetzt.
umfangreichen Auslegungsunterlagen
universelle Einsetzbarkeit (großer Viskositätsbereich, besonders für aerobe Prozesse
In chemischer Industrie üblicher Schlankheitsgrad (H/D≈1) wird bei Bioreaktoren
mit Werten zwischen 2 und 3 abgewichen, d.h. die Reaktoren werden schlanker.
(größere spezifische Kühlfläche benötigt, um die Wärme abzuführen,
längere Verweilzeit des durchströmenden Gases, bessere O2-Ausnutzung)
Folgende verfahrenstechnische Grundoperationen sind bei der Auslegung von
Rührreaktoren von Bedeutung:
- Wärmeübertragung
- Homogenisieren
- Dispergieren (Gas-flüssig, flüssig-flüssig)
- Suspendieren
Zulauf
Inokulum
Antrieb
Abluft
Schauglas
Kontrolle Füllstand,
Schaum
Kühlflüssigkeit
Kühlmantel
Rührwerk
Parameterkontrolle
Mannloch
Probenentnahme
Luftzufuhr
Mit Filter
Belüfter
Ablauf mit Ventil
AL Abluft
Airlift- fermenter
(Blasensäulenreaktor)
P Pumpe
L Luftzufuhr
Probenentnahme
H Heizung / Kühlung
Luft oben eingebracht
Luft unten
eingebracht
Innerer Umlauf
Luft in vertikales Kernrohr (Strömungsleitrohr) eingetragen und über den
Raum, den das Rohr einschließt, nach oben befördert.
Luft entweicht nach oben hin ,
am Kopfende erfolgt eine Rückströmung über den Ringraum, der die
gaslose Flüssigkeit zum Reaktorboden befördert
In Folge entsteht eine kontinuierliche Strömung
äußerem Umlauf:
mittels einer Blasensäule wird ein Umlaufstrom erzeugt.
Anwendung Airlift Fermenter
Erzeugung von Zitronensäure
Single Cell Protein (SCP)
Abwassertechnologie: Belebtschlammverfahren
Pressure Cycle Reaktor
35 m hoch Abwasserreinigung
Deep Shaft Reaktor:
in der aeroben Abwasserreinigung
bis zu 200m tiefer Schacht,
Luft wird durch ein vertikales Strömungsleitrohr von oben eingeblasen
Luft im oberen Drittel des Reaktors eingetragen und von der abwärts fließenden
Flüssigkeit mitgerissen.
Der Deep Shaft Reaktor stellt den größt möglichen Bioreaktortyp dar,
hoher Druck am Reaktorboden (ca. 11 bar) führt zu einer Wachstumshemmung
Großreaktoren können mehrere 1000m3 aufweisen
werden vornehmlich zur Reinigung von Chemieabwässern (BASF, Bayer AG)
Diese enorme Größe erlaubt eine Kostenreduktion um 60-70%
Deep jet Fermenter:
der Sauerstoffeintrag erfolgt über eine Düse, oberhalb der zu begasenden Flüssigkeit
Die umgepumpte Flüssigkeit, die zuvor mit Sauerstoff begast wird, trifft mit hoher
Geschwindigkeit (8-12 m/s) auf die Flüssigkeitsoberfläche.
Die Düse taucht in die Flüssigkeit ein (Tauchstrahl)
oder befindet sich knapp oberhalb der Oberfläche (Freistrahl).
Hoher Sauerstoffeintrag aus (14 kg/m3h)
Fassungsvermögen von mehreren 1000m3.
Anwendungsgebiete
Abwasserbehandlung oder
die Produktion von Futtermitteln (1-2 Mio. Tonnen/Jahr)
Luft
Einlauf, Trichter
Tauchstrahl- fermenter
Luft und Medium treffen zusammen
Luft
Überlaufrohr
übergelaufenes Medium neu mit Luft gemischt
2 Reaktionsraun
1 Wand
3 Pumpe
Aufbau und Regelung des Braun-Bioreaktors
Die Abmessungen nach der DECHEMA Norm für Bioreaktoren (DECHEMA 1991) standardisiert.
Höhe-Durchmesser-Verhältnis 3 zu 1.
Das Unterteil besteht aus einem doppelwandigen Stahlzylinder.
Das Oberteil des Reaktors ist zur visuellen Betrachtung aus einem Glaszylinder gefertigt.
Der stählerne Reaktordeckel und der Stahlzylinder besitzen diverse Einlässe für
Messsonden,
Zu- und Abluft,
Probennahme,
Beimischung von Suspensionen und
Zugabe von Korrekturmitteln.
Über einen Begasungsring am Boden wird kontinuierlich mit einem konstantem Volumenstrom mit Luft
begast.
Die Durchmischung der Kulturbrühe und der gleichzeitige Gasaustausch werden durch vier seitliche
Stromstörer und zwei 6-Blatt- Scheibenrührer gewährleistet.
polarographischen Elektrode (METTLER TOLEDO) erfasst die relative Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2)
sterilisierbaren Einstabmesskette misst pH-Wert, durch Zugabe von Säure (10 %-ige Phosphorsäure) bzw.
Base (2 M NaOH) geregelt.
Widerstandsthermometer erfasst die Temperatur, Regulierung erfolgt über den doppelwandigen Stahlmantel
durch Einleitung von Wasser.
Die Rührerwelle ist über eine Magnetkupplung mit dem Rührermotor verbunden.
Antischaummittel manuell zudosierbar.
CO2-Sensor im Abluftstrom misst die Kohlendioxidkonzentration der Abluft
Die Sterilität durch Autoklavieren des Bioreaktors und Mediums vor der Fermentation
Zu- und Abluftfiltern während der Fermentation.
Die Steuerung erfolgte über eine Einrichtung (DDC) Die DDC zeichnet kontinuierlich Daten auf und stellt
sie graphisch dar. Sie regelte Temperatur, Sauerstoffpartialruck, Rührerdrehfrequenz und Zugabe der
Korrekturmittel.
Schaumbremse
Silikonölen und darin implementierten Kieselsäure-Partikeln
Hollow fiber bioreactor
are perfusion bioreactors extremely high cell densities (>109 cells/ml).
very large surface area for attaching cells
allows continuous removal of waste products and supply of nutrients
productivity can easily be more than 20-fold that of a suspension culture
(Yang et al., 2004).
Big advantage: the product fluid is cell free and thus easily purified.
( When using protein-free media, the Mab levels can be more than 40 % of
the total protein in the product flow (Castillo, 2003). )
in comparison to STR the HFB
is smaller (fits to normal ceiling height room) and
utilities required include only CO2 and electricity
whereas for the STR vast utility systems for O2, N2, compressed air, purified
water, steam, drainage, CIP (clean in place) and SIP (sterilize in place) are
required.
for producing the same amount of product, the investment cost of the HFB is
lower than that ofthe STR.
Most hollow fiber bioreactors are in use in small scale.
The scale-up has proved to be difficult: oxygen concentration in the medium
exit end of the system becomes the limiting factor at larger scale
They also have relatively short operation life, because of the accumulation of dead
cells and fouling of the membrane (Yang et al., 2004).
However, when producing antibody products for research (laboratory scale, 10–100
mg) or for diagnostic purposes (100 mg to several grams of antibody product), the
HFB is a viable and economical alternative
They are especially good in hybridoma cultures that are generally difficult to grow
in bioreactor suspension culture, as these cells are sensitive to shear and bubble
damage
The main advantage of the disposable bioreactors:
cleaning and sterilizing issues are removed
investment costs are minimized
reduced construction times
Flexibility to modify the process configurations
The downtime and turnaround times are shortened because no cleaning is required
lower risk for cross-contamination as new bags are used for each run.
( Most of the biopharmaceutical facilities are multipurpose-plants, where the potential cross
contaminations are a great concern, and the lower contamination risk is really an Advantage)
main disadvantages
large-scale bags are unavailable
operating costs can be increased significantly because of constant buying of new bags
scale-up complications,
reliance on suppliers
increased expenses as the operating costs and waste costs are increased as also more solid waste is
created
more warehouse storage space is needed
Festbettreaktor
ein Fluid strömt durch eine feste Schüttung oder Packung. Das Festbett
dient dabei oft der Fixierung heterogener Katalysatoren oder der
Mikroorganismen
- hohe Raum-Zeitausbeute.
- keine besonderen Maßnahmen für den Produktaustrag
- inhomogene Durchströmung unter Kanalbildung
- Verschließen der Hohlräume (durch Schwebstoffe und nachwachsende
MO)
Batch,
fed-batch
Chemostat
perfusion?
The bioreactors can be operated either
in
batch, (Stapel) der Reihe nach abzuarbeiten
fed-batch or in
continuous
perfusion mode.
Batch system.
all nutrients are supplied in the beginning of the culture
fed-batch
is started at a low volume and the culture is later supplied with concentrated feed
solution to maximum volume and no medium is removed
chemostat
are
culture is constantly supplied with fresh medium and used medium and cells
removed simultaneously
perfusion
withdrawn
culture, fresh medium is supplied at the same rate than spent culture is
(biomass is returned or retained in the vessel).
In batch
the cells grow until essential nutrients becomes limiting and the cells and
product are harvested.
The cell densities are generally about 5
In fedbatch
x 106 cells/ml.
process the culture time may be longer (even 10 – 15 days) as nutrients are
added during the cultivation.
Cell densities of 107
cells/ml are achieved.
In perfusion the nutrients are constantly added and also possibly inhibiting products are
removed.
Cell densities are significantly higher on perfusion processes (even 2
109
–4x
cells/ml) and culture times can be 15 – 75 days (Dalm, 2007).
In batch
einfache Steuerung
Kontamination unwahrscheinlich
•vollständige Befüllung des Reaktionsgefäßes mit den
Ausgangsstoffen
•Reaktion der Edukte, deren Konzentration kontinuierlich fällt, zu
Produkten, deren Konzentration kontinuierlich ansteigt.
•Entleerung des Reaktionsgefäßes und Weiterleitung der Produkte
zum Downstream-Prozess
•Vorbereitung des Reaktionsgefäßes auf die nächste Befüllung
(Reinigung, Wartung)
Vorteile:
- niedrige Investkosten durch geringeren Regelaufwand
- hohe Flexibilität (Einsatz für verschiedenste Produkte)
- hohe Umsätze durch definierte Kultivierungszeiten
- geringe Gefahr von Infektionen und Mutationen der Kultur (rel. geringe
Fermentationszeiten)
Nachteile:
- nichtproduktive Totzeiten zum Füllen, Aufheizen, Sterilisieren, Abkühlen,
Entleeren und Reinigen des Fermentors
- stärkere Beanspruchung durch häufiges Sterilisieren (z.B. Sensoren)
- höherer Aufwand bei Aufzucht der Mikroorganismen in Vorkulturen für
spätere Beimpfung
- größerer Personalbedarf (Lohnkosten) oder Einsatz von Prozeßrechnern
(u.U. Aufhebung des ursprünglichen Vorteils geringer Investkosten)
- größere Gefahr für das Personal, mit den ggf. pathogenen Mikroorganismen
oder giftigen Produkten in Berührung zu komme
Anwendungen:
- Herstellung geringer Produktmengen
- Herstellung verschiedener Produkte mit dem gleichen
Fermentor
- bei leichter Infektionsmöglichkeit bzw. Mutationsgefahr
- bei diskontinuierlicher Produktabtrennung
In fedbatch
Substratconzentration
inhibierend ist
wenn hohe
am Anfang
•teilweise Befüllung des Reaktionsgefäßes mit den Ausgangsstoffen
•Reaktion der Edukte zu Produkten.
•Ab einer definierten Konzentration wird nun jeweils genau so viel Edukt
"zugefüttert", wie durch die Reaktion verbraucht wird.
•Entleerung des Reaktionsgefäßes (Ernte) und Weiterleitung der Produkte zum
Downstream-Prozess
•Vorbereitung des Reaktionsgefäßes auf die nächste Befüllung (Reinigung,
Wartung)
Vorteile:
Eduktkonzentration auf ein bestimmtes Maß begrenzbar
( Vorteil bei stark exothermen Reaktionen (Reaktionswärme abführbar)
- niedrige Substratkonzentration verhindert eine Substratinhibierung der
Wachstumsrate.
- deutlich höhere Endkonzentrationen an Biomasse und somit auch an Produkt
erreichbar als beim Batch-Prozess.
- Gefahr der Sekretion von (häufig toxischen) Sekundärmetaboliten (OverflowProdukten) geringer
-Wachstumsrate regulierbar,( Reproduzierbarkeit verbessert
Nachteile:
- schwere Bilanzierbar
- Schwierige Massstabübertragung
- Hohe Aufwand für Kontrolle
Kontinuierlicher Rührfermentor
Kontibetrieb (CSTR – continuous stirred tank reactor):
- steriles (X0=0) oder zellhaltiges Medium wird kontinuierlich in den Fermentor
geleitet, die gleiche Menge wird dem Fermentor ständig entnommen
(Volumendurchsatz V )
- Zulauf: S0, X0, P0 Ablauf: Se, Xe, Pe
- wie beim idealen Satzreaktor wird davon ausgegangen, dass ständiges Rühren für
einheitliche Prozessvariablen im gesamten Reaktor sorgt
- dementsprechend stimmt die Zusammensetzung im Fermentor und am Ablauf
überein, während am Reaktoreintritt eine sprunghafte Änderung der
Zusammensetzungvon S0, X0, P0 auf Se, Xe, Pe erfolgt (Mischzeit der
einzelnen Komponenten ist gegenüber der Aufenthaltszeit
vernachlässigbar)
Vorteile:
- weitgehende Möglichkeiten von Mechanisierung /Automatisierung
- geringerer Personalbedarf (Lohnkosten), geringere Gefahren durch
bessereMechanisierung
- kleinere Reaktoren möglich, da unproduktive Totzeiten entfallen
- gleichbleibende Produktqualität infolge gleichbleibender
Betriebsbedingungen
- geringere Beanspruchung durch Sterilisation Nachteile: - geringere
Flexibilität, da nur begrenzte Parameteränderungen
Nachteile:
- geringere Flexibilität, da nur begrenzte Parameteränderungen
möglichsind; somit erhöhte Anforderungen an
gleichbleibende Rohstoffqualität
- hohe Investkosten (Regelung/Automatisierung, kont.
Nährmediensterilisation)
- kont. Dosierung von nicht löslichen festen Substraten (z.B. Stroh
o.ä.) kann sehr aufwendig sein
- größere Infektions-/Mutationsgefahr durch lange
Kultivierungszeiten
Anwendungen:
- für Prozesse mit großen Produktionsleistungen
- bevorzugt für gasförmige, flüssige oder lösliche feste Substrate
- bei Mikroorganismen, die gegen Mutationen relativ stabil sind
In perfusion
komplexe Steuerung
aber downstream kontinuierlich möglich, ist oft billiger
Discontinuierlich Batch
Kontinuierlich
Semikontinuierlich ( partieller Mediumwechsel nach Zeitintervall)
Sind homogene Kulturen ( wenn normal vollständig gemischt)
(Die sich aber ständig ändern)
Heterogene Systeme
Der kontinuierlichen Kultur mit Diskontinuität des Mediumflusses,
Wechsel des Substrates
Muli stage Systeme ( mehrere Fermentatoren hintereinander)
Various cell retention techniques
include filters,
settlers,
centrifuges or
hydrocyclones
The cell retention device may be positioned
either inside or outside of the bioreactor
At industrial scale the cell retention is usually done
by centrifuges, settling devices or spin filters.
The membranes and filters foul easily and therefore
the rotated filters or baskets are widely used
The settlers were used up to 50 liter scale,
the centrifuges up to 100 liter scale and the
spin-filters up to 500 liter scale
settler
With microbial
cultivations,
the stirred-tank
bioreactor is almost always the choice.
The optimization and scale-up of the STR is straightforward until certain size limit.
Microbial cells are grown with different feeding strategies: batch, fed-batch or continuous
mammalian and insect cell cultures
the STR technique is not quite as simple.
cells are more shear sensitive, the agitation and gas sparging can be a problem.
cells are also so anchor-dependent that they cannot be adapted to grow in suspension.
(Microcarriers may sometimes help)
when possible, the basic suspension culture is used.
With the most used cell lines these problems have been solved and they can be cultured in STR (Chu
and Robinson, 2001).
biopharmaceuticals are produced in suspension cell cultures (STR) using batch or perfusion mode.
The cell culture densities in stirred tank bioreactors are generally limited by oxygenation,
because the agitation and gas sparging has to be kept low.
Mab volumetric productivity is in the range of 20 – 70 mg/l/day.
With better feeding strategies and/or perfusion with cell retention the cell density of 107/ml can be
achieved and
therefore also significant increase in Mab productivity (up to 150 mg/l/day) (Yang et al., 2004).
Tricks mit MO
Hohlfasern,
Mikrokapseln aus
Polyacrylamid
Alginat ( mit Glutaraldehyd)
Agar
Carrageenan ( Zellen an innerer Oberfläche, gering DiffusionsBehinderung) linear sulfated polysaccharides
extracted from red seaweeds, Vegetarischer Ersatz für Gelantine
Adsorbtiv durch pH Ionenstärke begrenzt
Flockung durch Polyelektrolyte
Glutaraldehyd für cross linking
Erhöhte Sedimentation
Enzyme in den Zellen ev. Inaktiviert
NEUE Eigenschaften durch
Coimmobilisierung
Verschiedener MO
Oder MO und Enzymen
Tannin ( Polyhydroxyphenole)
u.a.Aus tropischen Pflanzen gewinnbar
Anwendung:
Umwandlung von Kohlenhydraten
Herstellung von Aminosäuren
Umwandlung von Antibiotika
Herstellung von org. Säuren
Energiegewinnung
Abwasserreinigung
Vorteile:
Kein Isolieren, Reinigen der Enzyme
Enzyme im nat. Milieu, bessere Stabilität (pH, Temp, Salz)
Multienzymreaktionen möglich
Cofaktoren da
Hohe Zelldichten
Geringer Nährstoffbedarf
Nachteile:
Diffusionsbehinderung durch Membran und Zellwand
Vernetzer teils toxisch
Auch inaktive Zellen mit fixiert
Nebenreaktionen möglich, Proteolyse
Kontaminationsgefahr bei Dauerbetrieb
Teils schlecht Raum-Zeit Ausbeuten
Erste Anwendung:
Herstellung von L-Aspartat aus Ammoniumfumarat
Grosse Bedeutung
Herstellung von Fructosesirup mit Glucoseisomerase
Halbwertszeiten immobilisierter Zellsysteme
Sind beeindruckend lang
150 Tage bei Asparaginsäureherstellung ( mit PAA als linker)
50 Tage bei L-Malat Produktion
60 Tage bei Glucoseisomerase
Immobilisierungsmedium entscheidend
600 Tage bei Asparaginsäureherstellung mit Carrageenan
Enzyme
wenn möglich aus Bakterien
Hohe Enzymausbeute in kurzer Fermentationszeit
Wachstum auf billigen Rohstoffen
Keine Bildung unerwünschter Substanzen (Toxine, Proteasen, Antibiotika)
Geringe Bildung störender Substanzen (Farbstoffe, Schleim)
Selten
Oberflächenverfahren (Rennin z.B.)
Meist
Submersverfahren
10 000 - 100 000 l, discontinuierlich
1980: 10- 550 t 7 a
Häufigster Prozess
Transglutaminase, Fleischkleber (aus Hackfleisch Steaks machbar)
1. Generation
Lösliches Enzym, lösliches Substrat
2. Generation
Trägergebundenes Enzym ohne Coenzym, lösliches Substrat
Batch- oder Flow-Verfahren
3. Generation
Trägergebundenes Enzym mit coimmobilisiertem Coenzym,
lösliches Substrat
Mehrstufenreaktionen
Reaktionsketten
Träger für immobilisierte Enzyme möglichst Porös
Funktionelle Gruppen am Träger
Vorteile
Bessere Stabilität
Wiederverwendbar
keine Diffusionsbarriere
Aber
Reinigung nötig
Ev. Aktivitätsverluste
Methoden der Enzymimmobilisierung
Membrankonfigurationen bei Einsatz löslicher Enzyme
Rekatortypen für Enzymreaktionen
Säulenreaktor
Mit immobilisiertem Enzym gefüllt, Substrat fliesst darüber
STR
fixiertes Enzym mit löslichem Substrat oder
Unlösliches Substrat mit löslichem Enzym
Röhrenreaktoren
Festbettreaktoren
z.T. Mit verschiedenen Enzymen
Beispiel
Herstellung von Alanin
Zukunft
Multienzym
Fermentation oder Biokatalyse ?