lac operon.word

Das Lac Operon
Das Lactose (lac) Operon
– ein Beispiel für die prokaryotische Genregulation
Das Lactose (lac) Operon ist der Milchzucker(Lactose)-abbauende, genetische Apparat des
in unserem Darmkanal lebenden Bakteriums Escherichia (E.) coli.
1
Nobel-Preis Das lac Operon war der erste beschriebene Genregulationsmechanismus, für die
Entdeckung von welchem Francois Jacob und Jacques Monod - zwei französische Forscher
aus dem Pasteur Institut in Paris - im Jahre 1965 den Nobel-Preis bekommen haben.
2
Struktur des lac Operons Das lac Operon besteht sich aus den folgenden Elementen: (1)
Promotor; (2) Operator; und (3) drei Strukturgene. mRNAs, die mehrere Gene enthalten,
nennen wir polycistronische mRNAs, was für Bakterien und einige Viren von Eukaryoten
charakteristisch ist. Der Promotor selbst besteht sich aus zwei Teilen: aus einer RNAPolymerase-bindenden Domain und einer CAP(catabolite activator protein)-bindenden
Domain. Die Strukturgene sind folgende: das lacZ Gen, welches für β-Galactosidase kodiert,
das lacY Gen verantwortlich für die Bildung des Enzyms Galactosid-Permease und das lacA
Gen, welches für das Enzym Transacetylase kodiert. Die Funktion der β-Galactosidase ist die
Spaltung der Lactose (Milchzucker) auf Glucose und Galactose. Die Permease permeabilisiert
die Bakterienzellwand, damit das Bakterium die Lactose einfacher aufnehmen kann. Die
genaue Funktion der Transacetylase ist noch nicht bekannt, ihre Entfernung beeinflusst die
Funtion des Operons nicht bedeutend. Die Terminatorregion ist für den Stop der Transkription
verantwortlich (die Translation wird von den 3 Stopcodons gestoppt). Das lacI Gen (welches
eigentlich ein sich aus einem Gen bestehendes Operon ist) gehört zwar nicht zum lac Operon,
ist aber für ihre Funktion nötig. Das lacI Gen kodiert das Repressorprotein, welches zum
Operator bindend die Funktion des Operons hemmt.
3
Struktur des lac Operons Es gibt zwei Initiationsstellen auf der DNA-Sequenz: (1) der
Transkriptionsstartpunkt, welcher innerhalb der Operatorregion lokalisiert ist; und (2) der
Translationsinitiationspunkt (dieser wird bei Bakterien auch Shine-Dalgarno Sequenz
genannt). Der Transkriptionsstartpunkt ist also innerhalb der Operatorregion, was vorschlägt,
dass die Transkription im Fall der Bindung des Repressors mit dem Operator gehemmt ist.
4
5
Funktion des lac Operons - Repression Das Repressorprotein wird in einer niedrigen
Kopienzahl produziert, kann aber sehr effizient die Operatorregion binden, wenn keine
Lactose im Zytoplasma vorhanden ist. Die Funktion des lac Operons wird also in der
Abwesenheit von Lactose durch den Repressor gehemmt, dadurch, dass es physisch die RNAPolymerase hindert, so kann es mit der Transkription nicht beginnen. Das System ist sehr
ökonomisch, wenige Repressormoleküle können die Expression von 3, sonst intensiv
funktionierenden Genen blockieren.
Funktion des lac Operons - Induktion Wenn Lactose in der Umgebung (Darm,
Nährmedium) vorhanden ist und ins Zytoplasma des Bakteriums aufgenommen wird, die
Situation ändert sich drastisch: Lactose bindet den Repressor, welcher dadurch den Operator
nicht binden kann, oder wenn schon gebunden, wird es dissoziiert. Dadurch wird der Weg für
die RNA-Polymerase frei, die dann die polycistronische mRNA transkribiert, welche an den
Ribosomen translatiert wird und die drei Proteinprodukte entstehen. β-Galactosidase
schneidet Lactose auf Glucose und Galactose. Der eigentliche Sinn der Funktion des lac
Operons ist die Herstellung von Glucose, wenn es in der Umgebung nicht vorhanden ist,
Glucose ist nämlich die wichtigste Kohlenstoff- und Energiequelle in der Lebewelt.
Grundanforderung
Seite 1
Das Lac Operon
6
Funktion des lac Operons – Aktivierung In der Anwesenheit von Glucose verändert sich
die Strategie des Bakteriums. Glucose kann in der Umgebung des Bakteriums vorhanden sein,
oder als Produkt des Lactoseabbaus vorkommen. Die Anwesenheit von Glucose wird von
dem sogenannten CAP (Katabolit-Aktivator-Protein, nicht mit cap am 5’ Ende der mRNAs zu
vermischen!) mit dem folgenden Mechanismus detektiert: Erstens gehen wir aus dem
Zusammenhang aus, dass wenn es Glucose gibt, gibt es keine cAMP (zyklische AdenosinMonophosphat) im Zytoplasma. Die Mengen von Glucose und cAMP sind also miteinander
invertiert proportional. cAMP bindet CAP, die Struktur von CAP wird dadurch so verändert,
dass es die CAP-Bindungsstelle des Promoters vom lac Operon binden kann. Diese Bindung
ist die Voraussetzung für die Erkennung der Polymerase-Bindungsstelle im Promoter durch
die RNA-Polymerase. Wenn es also im Zytoplasma keine Glucose vorhanden ist, gibt es
cAMP und das lac Operon wird aktiviert, wenn aber Glucose vorhanden ist, wird die cAMPMenge niedriger und das Operon stoppt zu funktionieren.
7
Zusammenfassend, die Funktion des lac Operons wird von zwei Faktoren reguliert: die
Anwesenheit oder Abwesenheit von Glucose und Lactose. Die Logik des Systems basiert auf
zwei Sachen: wenn es keine Glucose gibt, das Bakterium produziert es aus Lactose durch
enzymatische Spaltung. Die Anwesenheit von Glucose stoppt aber die Funktion des lac
Operons. Den Vorgang, wenn das Endprodukt die Reaktion stoppt nennen wir
Katabolitrepression. Den Begriff Katabolitrepression benutzen wir für solche biochemische
Reaktionen, wo die Funktion von einem Enzym durch das von dem Enzym hergestellte
Endprodukt (Katabolit) reguliert ist, dadurch, dass das Endprodukt das Enzym bindet und ihre
Raumstruktur verändert. Im Fall des lac Operons ist die Katabolitrepression komplizierter, es
wird in mehreren Schritten durch die Regulierung der Genexpression verwirklicht. Die
Erklärung für die invertierte Verhältnisse zwischen Glucose und cAMP ist folgendes: cAMP
entsteht sich aus ATP durch die Wirkung des Enzyms Adenylat-Zyklase. Glucose hemmt die
Adenylat-Zyklase, daraus kommt die „viel Glucose
wenig cAMP” (und umgekehrt)
Relation. Also, Lactose wirkt stimulierend, Glucose wirkt hemmend an die Funktion des lac
Operons. Anmerkung: in der Wirklichkeit bindet nicht die Lactose, sondern Allolactose (eine
tautomere Variation von Lactose welche spontan aus Lactose entsteht) den Repressor.
8
Mutante -Galactosidase Wenn wir im lacZ Gen eine Mutation verursachen, welche die
Funktion des Gens zerstört aber die RNA-Polymerase nicht beim Weitergehen verhindert,
Lactose wird imfolge des funktionsunfähigen Enzyms nicht gespaltet, so kann die
Katabolitrepression auch nicht vorkommen.
9
Transkriptionsstop in den Genen Jacob und Monod beobachteten, dass wenn eine Mutation
in den Strukturgenen vorkommt, welche die Transkription stoppt (dies kommt sehr selten vor,
nicht mit den Translationsstopcodone zu vermischen!), dann hängt die Anzahl der
nichtfunktionierenden Gene davon ab, in welchem Gen diese Mutation vorhanden ist. Wenn
die Mutation im lacA Gen erfolgt, dann werden die lacZ und lacY Gene normal transkribiert,
wenn die Mutation im lacY Gen erfolgt, dann wird nur das lacZ Gen transkribiert, im Fall
einer Transkriptionsstopmutation im lacZ Gen können aber keine der Gene transkribiert
werden. Aus diesem Experiment konnten Jacob und Monod die Reihenfolge der drei Gene
(lacZ, lacY, lacA) bestimmen.
10
Oc Mutation des Operons Die zwei französischen Forscher haben so eine Mutation induziert,
welche das lac Operon auch in der Abwesenheit von Lactose und Glucose aktiv gemacht hat,
also Proteine entstanden aus den drei Strukturgenen. Es stellte sich heraus, dass es um so eine
Mutation geht, welche im Operator erfolgt, und als Ergebniss der Repressor diese Region
Grundanforderung
Seite 2
Das Lac Operon
nicht binden kann. Anders gesagt, der Repressor kann die Transkriptionsinitiationsstelle nicht
blockieren, so kann die RNA-Polymerase unverhindert funktionieren.
11
I- Mutation des Repressors Eine andere Mutation, welche das Repressorgen betrifft
(Entstehung von funktionsunfähigem Repressor) hat denselben Effekt: das lac Operon ist auch
in der Abwesenheit von Lactose (und Glucose) aktiv. Im Fall von einem aus zwei
Komponenten bestehenden System ist es also eigentlich egal, welcher Komponent
funktionsunfähig wurde, das System zeigt die selbe Unregelmä igkeiten.
12
IS Mutation des Repressors Eine andere Mutation des Repressors verursacht, dass der
Repressor die Lactose nicht binden kann. Als Ergebnis, zwar Lactose im Zytoplasma
vorhanden ist (keine Glucose), es kann die Funktion des lac Operons nicht induzieren, das
Operon bleibt still.
13
CAP-I Mutante Nehmen wir an, dass CAP so eine Mutation erleidet, dass es cAMP nicht
binden kann. Im Folge dieser Mutation bleibt das Operon still, auch wenn es keine Glucose
im Zytoplasma gibt, cAMP aber schon, und der Repressor wurde durch Lactose entfernt.
RNA-Polymerase kann in diesem Fall den Promotor nicht erkennen, weil CAP es vorher nicht
gebunden hat.
14
CAP-II Mutante Eine andere CAP Mutation verursacht, dass die Struktur von CAP so
verändert, dass es den Promotor auch ohne cAMP binden kann. In diesem Fall ist die
Funktion des Operons auch in der Anwesenheit von Glucose nicht gehemmt
15
16
17a
17b
Zu viele Repressoren Wenn wir viele Kopien des Repressorgens mit Hilfe von Plasmidvektoren in das
Bakterium einschleusen, dann entstehen viele Repressormoleküle, die die Transkription des lac Operons auch in
der Anwesenheit von Lactose hemmen. Wenn es nämlich zu viele Repressormoleküle vorhanden sind, ist die
niedrige Menge von Lactose nicht fähig, die Repressormoleküle von dem Operator des lac Operons zu entfernen.
Zu viele Operatoren In der Abwesenheit von Lactose ist die Funktion des lac Operons gehemmt. Wenn wir
aber mit Hilfe von Plasmidvektoren viele Operatore in das Bakterium einschleusen, dann binden die
Repressormoleküle nur selten an den einzigen Operator welcher in der BakterienDNA vorhanden ist, so können
sie die Funktion des lac Operons nicht bedeutend hemmen.
Partielle Diploide-I Um die Funktion des lac Operons zu verstehen, mussten die oben beschriebenen
Mechanismen erstmal aufgeklärt werden. Als erster Schritt musste es geklärt werden, ob die regulatorischen
Elemente einen cis-Effekt ausüben (sie sind an der DNA) oder sie sind zytoplasmatische Faktoren (TransFaktoren; hier Proteine). Die Funktion des Operators wurde folgenderweise aufgeklärt: man hat ein Bakterium
benutzt, in welchem das lacY Gen mutant war, aber diese Mutation hat die Transkription des lacA Gens nicht
beeinflusst. Daneben war der Operator des lac Operons auch mutant (Oc Mutation). So ein Bakterium kann auch
in der Abwesenheit von Lactose funktionsfähige lacZ und lacA Produkte produzieren.
Partielle Diploide-I Partiell diploid können wir solche Bakterienzellen nennen, die ausser ihrer eigenen DNA
auch ein kleines DNA-Fragment enthalten, welches mit einem Fragment der eigenen DNA homolog ist. Wenn
wir in ein Bakterium mit Hilfe des F’ Plasmids (anwesen in einer Kopie) ein DNA-Fragment mit so einem lac
Operon einschleusen, welches im lacZ Gen mutant ist aber einen intakten Operator hat, dann in der Abwesenheit
von Lactose (und Glucose) entstehen nur lacZ und lacA Genprodukte aber kein lacY Produkt. Erklärung: eine
Expression erfolgt nur von der eigenen DNA des Bakteriums, weil das Operon am F’ Plasmid durch den
Repressor gehemmt ist. Wenn wir aber Lactose zum System geben, dissoziiert der Repressor vom F’ Plasmid, so
kann schon auch das lacY Produkt erzeugt werden. Dieses Experiment demonstrierte, dass das Operator ein cisElement (DNA-Abschnitt) ist, weil wenn es ein diffusibiles Protein (Trans-Element) wäre, dann würde die Oc
Mutation einen Effekt an beide Operonen haben und funktionsfähige Produkte würden von allen drei Genen
entstehen. Mit anderen Worten, die Tatsache dass funktionsfähige -Galactosidase (Produkt des lacZ Gens) nur
im Folge von Induktion entstehen kann, weist darauf hin, dass es nicht egal ist, ob der Operator auf der
BakterienDNA oder auf der PlasmidDNA lokalisiert ist, der Operator ist also ein cis-Element.
Grundanforderung
Seite 3
Das Lac Operon
18
Partielle Diploide-II Jacob und Monod wollte in einem anderen Experiment ausfinden, ob der Repressor ein
cis-oder trans-Element ist. Sie haben so einen Bakterienstamm benutzt, welcher neben der lacY Mutation auch
eine lacI- Mutation enthielt. In dem Experiment haben sie dasselbe mutante F’-Plasmid ins Bakterium
eingeschleust, wie im vorigen Experiment. Funktionsfähiger Repressor war also nur auf dem Plasmid. In der
Abwesenheit von Lactose war keines der beiden Operonen aktiv, nach der Induktion mit Lactose entstanden aber
alle drei, funktionsfähige Proteine, was darauf hinweist, dass beide Operone funktionierten. Die
Schlussfolgerung war, dass der Repressor kein DNA-Abschnitt, sondern ein im Zytoplasma frei bewegender
Faktor, also ein trans-Element ist.
19
Abbau der Lactose beim Menschen erfolgt durch das Enzym Lactase. Im adulten Alter
verlieren Säugetiere die Fähigkeit, Lactose abzubauen, weil sie in diesem Alter normalerweise
keinen Zugriff auf Milch haben. Das Funktionsverlust des Enzyms Lactase im adulten Alter
ist also ein adaptiver Prozess. Bei kaukasoiden Menschen ist aber so eine Mutation in der
Promotorregion des Lactase-Gens aufgetreten, welche die kontinuierliche Funktion der
Lactase auch im adulten Alter sichert. Die Menschen haben auf Tierzucht übertreten, weil
Milch sich als ein wichtiges Nahrungsmittel erwies, diese Mutation hatte also einen adaptiven
Wert. Im Fall von einem Teil der Menschen, die Lactose nicht abbauen können, kann
Lactose-Intoleranz auftreten, der Grund dafür ist der osmotisch ungünstige Effekt des
unverdauten Zuckers auf den Darmkanal.
Grundanforderung
Seite 4