Das lac-Operon von Escherichia coli als klassisches Beispiel für

Genetisches Grundpraktikum
7. Kurstag
09.06.05
Das lac-Operon von Escherichia coli als klassisches Beispiel für
Genregulation
Die Expression von Genen wird in den meisten Fällen auf der Transkriptionsebene reguliert.
Im Prinzip gibt es zwei Mechanismen dieser Regulation. Bei der negativen Regulation wird
die Transkription von einem Repressor verhindert, der entfernt werden muß, um die
Genexpression zu ermöglichen. Bei der positiven Regulation wird die Transkription durch
einen Aktivator ermöglicht, ohne den die Gene nicht oder nur in geringem Maße abgelesen
werden. Beide Mechanismen können auch zusammenwirken. Dies ist bei der Regulation des
lac-Operons in E. coli der Fall.
p o
lacI
lacZ
lacY
lacA
X
X
keine Transkription
Repressor
p o
lacI
lacY
lacZ
lacA
Induktor löst Repressor ab, RNA-Polymerase bindet
lacI
p o
lacY
lacZ
lacA
RNA
Transkription und Translation erfolgen:
ß-Galaktosidase
Permease
Transacetylase
Abbildung 1: Negative Regulation des lac-Operons
Das lac-Operon (Abb. 1) ist eine Kette von drei Genen, lacZ, lacY und lacA, die gemeinsam
abgelesen und reguliert werden. Vor der Gengruppe liegt der Promotor (p), das
Erkennungssignal für die RNA-Polymerase. Er wird vom Operator (o) überlappt. Dies ist die
Bindungsstelle des Repressors, eines negativ regulierenden Proteins. Es wird von einem
nicht im Operon liegenden Gen lacI codiert. Der Repressor verhindert also die Transkription
des Operons. Ein Induktor kann an den Repressor binden und ihn dadurch vom Operator
entfernen. Dann wird das Operon transkribiert. Der Induktor ist ein kleines Molekül, das in
der Regel vom Substrat abgeleitet ist, das von den im Operon codierten Enzymsystem
verwertet wird. In unserem Fall ist das Substrat die Lactose, die durch das lacZ-Genprodukt,
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die ß-Galactosidase, gespalten wird. Lactose im Medium führt tatsächlich zu einer Induktion
des Operons. Dazu muß sie mit Hilfe eines Aufnahmeproteins, der Permease, dem Produkt
des lacY-Gens in die Zelle transportiert werden. Fällt die Permease aus, kann das Operon
nicht mehr durch Lactose induziert werden. Es gibt aber Induktoren, die Struturanaloga der
Lactose sind, wie das IPTG, die ohne Permease in die Zelle gelangen und die Transkription
induzieren. Die Funktion des dritten Gens, lacA, der sog. Transacetylase ist in unserem
Zusammenhang uninteressant.
Die Aufhebung der negativen Regulation des lac-Operons durch die Induktion reicht nicht zur
vollen Expression. Das Operon ist außerdem abhängig von einer Aktivierung (Abb.2). Dazu
muß der Aktivator, das Produkt des Gens crp an eine Bindestelle neben dem Promotor
binden. Das kann er nur zusammen mit einem kleinen Molekül, cAMP, das mit Hilfe der
Adenylatcyclase, dem Genprodukt des cya-Gens, gebildet wird. Der Vorteil dieses
scheinbar komplizierten Systems für die Zelle ist, daß sie entscheiden kann, ob die Induktion
des Lactoseabbauwegs sinnvoll ist. Gibt es nämlich viel Glucose im Medium, so ist deren
Verwendung für die Zelle ökonomischer. Die Verwendung der Glucose führt in der Zelle zur
Abnahme der cAMP-Konzentration. Dadurch wird die Aktivierung der Transkription des lacOperons vermieden. Dieser Mechanismus wird daher "Glucoseeffekt" genannt, aber auch
Katabolitrepression, weil tatsächlich Stoffwechselprodukte der Glucose den Effekt auslösen.
RNA Polymerase
crp
cya
ATP
lacI
cbs p o
lacZ
lacY
lacA
cAMP
Adenylatcyclase
cya
RNA Polymerase
CRP
crp
lacI
cbs p o
lacZ
lacY
lacA
Abbildung 2: Positive Regulation des lac-Operons. Selbst in Abwesenheit des Repressors wird das lacOperon nicht maximal exprimiert, weil die RNA-Polymerase nur unstabil am Promotor bindet. Erst die Bindung
des CRP-Proteins an seinen Bindungsort (cbs) neben der RNA-Polymerase stabilisiert deren Bindung und führt
so zur Aktivierung der Transkription. Dazu ist noch das Effektormolekül cAMP nötig, das durch die
Adenylatcyclase aus ATP gemacht wird.
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Genetisches Grundpraktikum
7. Kurstag
09.06.05
Versuchsziele
In diesem Versuch soll gezeigt werden, dass das lac-Operon mit Lactose oder dem
künstlichen Induktor Isopropyl-ß-thiogalactosid (IPTG) induziert werden kann und dass
Glucose diese Induktion herabsetzt, weil die Aktivierung des Operons unterbleibt.
Außerdem soll eine Mutante identifiziert werden, die ein verändertes Induktionsverhalten
zeigt.
Versuchsdurchführung
Es werden drei E. coli-Kulturen mit einer Dichte von 3 x 108/ml ausgegeben, eine WildtypKultur (Hfr3000), eine lacZ-Mutante (als Negativkontrolle) und eine unbekannte Mutante,
deren Natur untersucht wird. Die Zellen sind in glucosefreiem Medium gewachsen. 1 ml der
Bakterien werden 30 min bei 37 °C mit den verschiedene Induktoren mit oder ohne
Vorinkubation in Anwesenheit von Glucose weiter inkubiert. Danach werden die Zellen
durchlässig gemacht und ihr ß-Galactosidasegehalt gemessen.
1. Induktion
Wildtyp:
Probe WT Glu/Lac: 100 µl Glucose zugeben, 30 min inkubieren, 100 µl Lactose zugeben,
20 min inkubieren
Probe WT Glu/IPTG: 100 µl Glucose zugeben, 30 min inkubieren, 10 µl IPTG zugeben,
20 min inkubieren
Probe WT Lac: 100 µl Lactose zugeben, 20 min inkubieren
Probe WT IPTG: 10 µl IPTG zugeben, 20 min inkubieren
(Konzentrationen der Lösungen: Glucose 10%; Lactose 10%; IPTG 10-2 M).
Unbekannte Mutante:
Vier Proben, Mut Glu/Lac, Mut Glu/IPTG, Mut Lac und Mut IPTG, analog zu den
entsprechenden Wildtypproben behandeln.
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lacZ-Mutante:
Die Proben mit Glucose entfallen. Es werden nur die Proben LacZ Lac und LacZ IPTG
analog den entsprechenden Wildtypproben hergestellt und 20 min inkubiert.
Nach der Inkubation werden die Proben 5 min abzentrifugiert und das Medium wird entfernt.
2. ß-Galactosidasetest
Die Zellen werden in 1 ml Testpuffer aufgenommen, mit 10 µl Chloroform versetzt, kräftig
gemischt und 30 min bei 37 °C bebrütet. Dadurch werden die Zellen durchlässig und
abgetötet Anschließend wird 100 µl o-Nitrophenyl-ß-Galactosid (ONPG)-Lösung (10 mg/ml)
zugegeben und bei 30 °C weiter inkubiert. Dabei entsteht bei Anwesenheit von ßGalactosidase das gelbe Nitrophenol. Seine Bildung wird anhand von Vergleichsproben
verfolgt.
Rezepte:
Wachstumsmedium: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl auf 1 l Wasser, pH auf 7,5
einstellen.
Testpuffer: 0,06 M Na2HPO4; 0,04 M NaH2PO4; 0,01 M KCl; 1 mM MgSO4 ; 50 mM
Mercaptoethanol; pH 7,0.
Vergleichsproben:
ONPG in 10-2 M NaOH, Verdünnungsreihe in Schritten um den Faktor 4.
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