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Inline-Bestimmung des Ethanol- und
Glucosegehalts in einem Laborfermenter mit Hilfe
der NIR-Spektroskopie und multivariater
Datenanalyse
Master-Thesis
im Fachbereich Medizintechnik
der Fakultät Mechatronik und Medizintechnik
an der Hochschule Ulm
Vorgelegt von Sascha Princz
Matrikelnummer: 3105468
Ulm, April.2012
Erstprüfer:
Prof. Dr. rer. nat. Martin Heßling
Zweitprüfer:
Prof. Dr. rer. nat. Harald Groß
Bearbeitungszeitraum: Oktober.2011 bis April.2012
Eidesstattliche Erklärung
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, Sascha Princz, geboren am 17.01.1977 in Weißenhorn, dass ich die
vorliegende Master-Thesis mit dem Thema:
„Inline-Bestimmung des Ethanol- und Glucosegehalts in einem
Laborfermenter mit Hilfe der NIR-Spektroskopie und multivariater Datenanalyse“
im Fachbereich Medizintechnik/ Biotechnologie der Fakultät Mechatronik und Medizintechnik
an der Hochschule Ulm, selbständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen
Hilfsmittel und Quellen verwendet habe. Alle wörtlichen und sinngemäßen Zitate sind in
dieser Arbeit als solche kenntlich gemacht. Die Arbeit hat in gleicher oder ähnlicher Form
noch keiner Prüfungsbehörde vorgelegen.
(Ort, Datum)
Sascha Princz
(Unterschrift)
I
Danksagung
Danksagung
Meine Master-Thesis entstand im Biotechnologie-Labor des Fachbereichs Medizintechnik/
Biotechnologie der Fakultät Mechatronik und Medizintechnik an der Hochschule Ulm.
An dieser Stelle möchte ich mich recht herzlich bei Herrn Professor Dr. rer. nat. Martin
Heßling und Herrn Professor Dr. rer. nat. Harald Groß für die Betreuung meiner MasterThesis bedanken.
Ganz besonders möchte ich mich bei Frau Dipl. Ing. (FH) Ulla Wenzel und Herrn Dipl. Ing.
(FH) Rudolf Miller bedanken. Beide unterstützten mich in jeglicher Art und Weise mit ihrer
fachlichen Kompetenz bei der Erstellung meiner Master-Thesis.
Abschließend noch ein großer Dank an meine Eltern für die Unterstützung während der
gesamten Zeit meines Studiums und an meinen Sohn Jan für die schönen Momente der
Ablenkung während meiner Master-Thesis.
Sascha Princz
II
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Master-Thesis wurde erfolgreich ein Nahinfrarotspektroskopie (NIRS)System für eine Inline-Messung der Glucose- und Ethanolkonzentration während einer
Hefefermentation in dem Laborfermenter der Hochschule Ulm erstellt. Darüber hinaus
erfolgte
eine
Erstellung
und
Erprobung
verschiedener
Kalibriermodelle
für
eine
chemometrische Auswertung der mit Hilfe der NIRS gewonnenen spektralen Daten im Bezug
auf ihren Informationsgehalt zur Aussage über die Glucose- und Ethanolkonzentration in der
Fermentationsbrühe. Die spektralen Messungen wurden nach dem Transflexionsprinzip in
einem Wellenlängenbereich von 1100 nm bis 2100 nm durchgeführt.
Zunächst erfolgte in Form diverser Vorversuche eine Einarbeitung in die Systematik und
Problematik der Aufgabenstellung. Im Rahmen dieser Vorversuche wurden Aufzeichnungen
verschiedener NIR-Spektren vorgenommen. So wurden unter anderem Absorptionsspektren
von Glucose und Ethanol erstellt. Weiterhin erfolgten ausführlichere Untersuchungen zur
Temperaturabhängigkeit
temperaturabhängige
der
Absorptionsspektren
Verschiebung
der
mit
von
Hilfe
der
Wasser,
NIRS
mit
Bezug
detektierten
auf
die
relevanten
Absorptionsbanden zwischen 1100 nm bis 2100 nm. Bereits hier wurde ein Kalibriermodell
erstellt
und
Vorhersagen
zu
Glucose-
und
Ethanolkonzentrationen
in
wässrigen
Probenlösungen durchgeführt. Es wurde bei den Vorversuchen eine Problematik durch
einwandernde CO2-Blasen in den Spalt der Transflexionssonde festgestellt und eine Methode
zur Korrektur der dadurch verfälschten Absorptionsspektren entwickelt.
Nach
Abschluss
der
Vorversuche
erfolgten
anaerobe
Saccharomyces
cerevisiae
Fermentationen in einem Ein-Liter-Schüttelkolben, während deren Durchführung NIRSpektren mittels einer Inline-Messung aufgezeichnet wurden. Im Anschluss erfolgte mit Hilfe
der gewonnenen Daten die Erstellung eines Kalibriermodells und Vorhersagen zur Glucoseund Ethanolkonzentration bei anaeroben Schüttelkolbenfermentationen. Die Proben wurden
zusätzlich nach dem Abzentrifugieren der Hefezellen erneut spektroskopisch vermessen und
chemometrisch ausgewertet.
In einer anaeroben Hefefermentation mit Saccharomyces cerevisiae kam es letztendlich zum
Test des NIRS-Systems im Einsatz im Sieben-Liter-Laborfermenter der Hochschule Ulm. Es
erfolgte auch hier eine Erstellung eines Kalibriermodells sowie Vorhersagen zur Glucoseund Ethanolkonzentration aus den gewonnenen Daten.
Die Erstellung der Kalibriermodelle sowie die anschließende chemometrische Auswertung im
Hinblick auf die Vorhersage der Glucose- und Ethanolkonzentration erfolgten mit der
Software „The Unscrambler“.
Sascha Princz
III
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Eidesstattliche Erklärung ..................................................................................................... I
Danksagung ...................................................................................................................... II
Zusammenfassung ............................................................................................................ III
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................. IV
Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... VII
Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... XI
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................... XIII
1
Einleitung und Aufgabenstellung ................................................................................ 1
2
Stand der Technik und Literaturrecherche ................................................................... 4
3
Grundlagen ................................................................................................................ 7
3.1 Optische Spektroskopie ................................................................................................. 7
3.1.1 NIR-Spektroskopie ................................................................................................ 8
3.1.2 NIR-Spektrometer ............................................................................................... 11
3.1.2.1 FTIR-Spektrometer .................................................................................. 12
3.1.2.2 Dioden-Array-Spektrometer ................................................................... 12
3.1.3 Sondentechnik .................................................................................................... 13
3.1.3.1 Transmission ........................................................................................... 14
3.1.3.2 Transflexion ............................................................................................ 15
3.1.3.3 ATR ......................................................................................................... 16
3.2 Chemometrie ............................................................................................................... 18
3.2.1 Principal Component Analysis ............................................................................. 19
3.2.1.1 Mathematisches Modell der PCA .............................................................. 21
3.2.2 Partial Least Squares Regression ......................................................................... 22
3.2.2.1 Mathematisches Modell der PLS ............................................................... 23
3.2.3 Beispiel PCA und PLS ........................................................................................... 25
3.3 Versuchsplan/ DOE ...................................................................................................... 29
3.3.1 Mischungspläne .................................................................................................. 30
3.3.2 Einschränkungen ................................................................................................ 31
3.4 Kalibrierung und Validierung ....................................................................................... 32
3.4.1 Standardfehler der Kalibration ............................................................................ 33
3.4.2 Root Mean Square Error ...................................................................................... 34
3.4.3 Standard Error .................................................................................................... 34
3.4.4 Residualanalyse und Bestimmtheitsmaß.............................................................. 35
Sascha Princz
IV
Inhaltsverzeichnis
3.5 Spektrale Daten ........................................................................................................... 36
3.5.1 Geeigneter Spektral-/ Frequenzbereich .............................................................. 37
3.5.2 Vorbehandlung von Spektren .............................................................................. 37
3.5.2.1 Mittenzentrierung.................................................................................... 38
3.5.2.2 Normierung ............................................................................................. 38
3.5.2.3 Glättung .................................................................................................. 39
3.5.2.4 Basislinienkorrektur................................................................................. 40
3.5.2.5 Ableitung ................................................................................................ 41
3.6 Software für Chemometrie ........................................................................................... 42
3.7 Fermentation ............................................................................................................... 43
3.7.1 Fermentationsprozess ........................................................................................ 43
3.7.2 Fermentertechnik ................................................................................................ 44
3.7.3 Prozessanalytik ................................................................................................... 46
3.8 Hefe-Saccharomyces cerevisiae ................................................................................... 47
3.8.1 Physiologie von Saccharomyces cerevisiae .......................................................... 47
3.8.2 Stoffwechsel von Saccharomyces cerevisiae ........................................................ 47
3.8.2.1 Oxidation von Glucose ............................................................................ 47
3.8.2.2 Oxidation von Ethanol ............................................................................. 48
3.8.2.3 Crabtree-Effekt ....................................................................................... 48
3.8.2.4 Pasteureffekt ........................................................................................... 49
4
Verwendete experimentelle Technik .......................................................................... 50
4.1 Aufbau und Integration NIR-Messsystem ..................................................................... 50
4.2 Spektrometer ............................................................................................................... 51
4.2.1 Spektrometer Software ........................................................................................ 52
4.3 Sensor und Messaufbau ............................................................................................... 52
4.3.1 Transflexion ....................................................................................................... 52
4.3.2 Transmission ...................................................................................................... 55
4.4 Lichtquelle ................................................................................................................... 55
4.4.1 Lichtleitfaser ....................................................................................................... 57
4.4.2 Shutter ................................................................................................................ 57
4.5 Temperiereinheit ......................................................................................................... 58
4.5.1 Magnetrührer mit Heizplatte ............................................................................... 58
4.5.2 Elektronisches Kontaktthermometer ................................................................... 59
4.6 Laborfermenter der Hochschule Ulm ............................................................................ 60
5
Experimentelle Ergebnisse ........................................................................................ 62
5.1 Versuchsplanung/ DOE ................................................................................................ 62
5.2 Probenherstellung ........................................................................................................ 64
5.3 Virtueller Bioreaktor ..................................................................................................... 64
5.4 Temperaturabhängigkeit.............................................................................................. 66
5.4.1 Experimenteller Aufbau und Durchführung......................................................... 66
Sascha Princz
V
Inhaltsverzeichnis
5.4.2 Auswertung und Ergebnisse................................................................................ 67
5.5 Spektren ...................................................................................................................... 70
5.5.1 Wasser ................................................................................................................ 71
5.5.2 Ethanol ............................................................................................................... 73
5.5.3 Glucose ............................................................................................................... 76
5.5.4 Vergleich der Absorptionsspektren ..................................................................... 80
5.5.5 Hefe-Wasser-Gemisch ........................................................................................ 81
5.5.6 Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch ..................................................................... 84
5.6 Kalibriermodell ............................................................................................................ 85
5.7 Erste Vorhersagen ........................................................................................................ 87
5.7.1 Vorhersage Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch ................................................... 91
5.7.2 Vorhersage YPD-Probe ....................................................................................... 94
5.7.3 Vorhersage Bier .................................................................................................. 97
5.7.4 Probleme ............................................................................................................ 99
6
Schüttelkolbenfermentation .................................................................................... 106
6.1 Vorbereitung der Schüttelkolbenfermentation ........................................................... 106
6.2 Durchführung der Schüttelkolbenfermentation .......................................................... 107
6.3 Auswertung der Schüttelkolbenfermentation ............................................................. 108
6.3.1 Offline-Auswertung .......................................................................................... 108
6.3.2 Online-Auswertung .......................................................................................... 110
6.3.3 Auffälligkeiten .................................................................................................. 119
7
Testfermentation.................................................................................................... 125
7.1 Vorbereitung der Fermentation .................................................................................. 125
7.2 Durchführung der Fermentation ................................................................................ 126
7.3 Auswertung der Fermentation .................................................................................... 126
7.3.1 Offline-Auswertung .......................................................................................... 127
7.3.2 Online-Auswertung .......................................................................................... 128
7.3.3 Auffälligkeiten .................................................................................................. 133
8
Zusammenfassung der Ergebnisse und Ausblick...................................................... 138
Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 142
Anhang ......................................................................................................................... 145
A 1 Tabellen zum Kapitel 2 .............................................................................................. 145
A 2 Datenblätter zu den Chemikalien ............................................................................... 152
A 3 Bedienungsanleitungen Offline-Auswertung .............................................................. 158
Sascha Princz
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Auszug zu elektromagnetische Strahlung unter Angabe der Wellenlänge und
Frequenz [10] .................................................................................................................... 7
Abb. 2: Energiediagramm eines anharmonischen Oszillators, Schwingungsarten der IR
Spektroskopie; modifiziert nach [2, 13] ............................................................................ 10
Abb. 3: Vereinfachtes Prinzipschema eines FTIR-Spektrometers mit MichelsonInterferometer; modifiziert nach [15]................................................................................ 12
Abb. 4: Vereinfachtes Prinzipschema eines Dioden-Array-Spektrometers; modifiziert nach
[16] ................................................................................................................................. 13
Abb. 5: Prinzipskizze zur Transmissionssonde ................................................................. 15
Abb. 6: Prinzipskizze zur Transflexionssonde................................................................... 16
Abb. 7: Prinzipskizze ATR Sonde ...................................................................................... 17
Abb. 8: Detail evaneszentes Feld der ATR Sonde ............................................................... 17
Abb. 9: Übersicht der interdisziplinären Beziehungen in der Chemometrie, modifiziert nach
[19] ................................................................................................................................. 19
Abb. 10: Schematische Darstellung der Matrizen einer PCA; modifiziert nach [20, 23] ........ 21
Abb. 11: Schematische Darstellung der Matrizen einer PLS; modifiziert nach [20, 23]......... 24
Abb. 12: Spektren der 5 Messungen über 5 Wellenlängen ................................................. 25
Abb. 13: Matrix der 5 Messungen über 5 Wellenlängen, entspricht der X-Matrix................ 25
Abb. 14: Gewichtsmatrix T der X-Matrix nach einer PCA ................................................... 26
Abb. 15: Hauptkomponentenmatrix PT der X-Matrix nach einer PCA.................................. 26
Abb. 16: Residuenmatrix E der X-Matrix nach einer PCA ................................................... 26
Abb. 17: Daten aus einer Referenzanalytik für zwei Stoffe eines Gemischs......................... 26
Abb. 18: Matrix der 5 Referenzmessungen 2er Stoffe, entspricht der Y-Matrix .................. 27
Abb. 19: Gewichtsmatrix T der X-Matrix nach einer PLS .................................................... 27
Abb. 20: Faktorenmatrix PT der X-Matrix nach einer PLS ................................................... 27
Abb. 21: Residuenmatrix E der X-Matrix nach einer PLS .................................................... 27
Abb. 22: y-Vektor der Konzentration K1 über 5 (Referenz)Messungen für die PLS .............. 28
Abb. 23: Gewichtsmatrix U der Y-Matrix bzw. des y-Vektors nach einer PLS...................... 28
Abb. 24: qT-Vektor (bzw. Faktorenmatrix QT) des y-Vektors (bzw. Y-Matrix) nach einer PLS
....................................................................................................................................... 28
Abb. 25: Residuenvektor f (bzw. Residuenmatrix F) des y-Vektors (bzw. Y-Matrix) nach einer
PLS.................................................................................................................................. 28
Abb. 26: Übersicht zu möglichen Arten von Versuchsplänen, modifiziert nach [25] ............ 30
Abb. 27: Darstellung eines (3,3) Gitterplanes .................................................................... 31
Abb. 28: schematische Darstellung zur Generierung eines Kalibriermodells ....................... 32
Abb. 29: schematische Darstellung zur Vorhersage .......................................................... 33
Abb. 30: Eigenschaften der Software "The Unscrambler"; modifiziert nach [30] .................. 42
Abb. 31: stark vereinfachte Skizze zur Integration des NIR-Messsystems in das
Bioprozesssystem ............................................................................................................ 50
Abb. 32: Spektrometer TIDAS S-1000 MS-T50/16 der Firma J&M Analytik AG ................... 51
Abb. 33: schematische Darstellung zur Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR [36] .................... 53
Abb. 34: (a) Sondenaufsatz mit diffuser Reflektionsfläche (b) vereinfachtes Messschema ... 53
Sascha Princz
VII
Abb. 35: Messaufbau zur Transflexionsmessung .............................................................. 54
Abb. 36: (a) Küvettenhalter von Linos
(b) Quarzglasküvette von Carl Zeiss ..................... 55
Abb. 37: Lichtquelle AvaLight-Hal-S von Avantes ............................................................. 56
Abb. 38: Magnetrührer mit Heizplatte und Kontaktthermometer von VWR ......................... 59
Abb. 39: 7 l Laborfermenter der Hochschule Ulm mit Erweiterungen aus 2010 .................. 60
Abb. 40: Angepasstes Lattice Design für max. 15 Gew.-% Ethanol & 30 Gew.-% Glucose .... 62
Abb. 41: Verlauf der Simulation 4 einer anaeroben Hefefermentation ................................ 66
Abb. 42: Temperaturabhängige Spektren von Wasser über einen Temperaturbereich von 15°C
bis 75°C .......................................................................................................................... 68
Abb. 43: Temperaturabhängige Spektren von Wasser, 2. Oberschwingung ........................ 69
Abb. 44: Temperaturabhängige Spektren von Wasser, 1. Oberschwingung ........................ 70
Abb. 45: Diverse Wasserspektren gemessen und zum Vergleich korrigiert ......................... 72
Abb. 46: Absorptionsspektrum von Wasser, gemessen in Transflexion und NPK ................ 73
Abb. 47: Absorptionsspektrum von 100% Ethanol, gemessen und NPK .............................. 74
Abb. 48: Spektren der Ethanolmessreihe mit unterschiedlichem Ethanolgehalt .................. 75
Abb. 49: Spektren der Ethanolmessreihe mit unterschiedlichem Ethanolgehalt, Auszug ..... 76
Abb. 50: Absorptionsspektrum von 100% Glucose, berechnet und NPK .............................. 77
Abb. 51: Spektren der Glucosemessreihe mit unterschiedlichem Glucosegehalt ................. 78
Abb. 52: Spektren der Glucosemessreihe mit unterschiedlichem Glucosegehalt, Auszug 1 . 79
Abb. 53: Spektren der Glucosemessreihe mit unterschiedlichem Glucosegehalt, Auszug 2 . 79
Abb. 54: Berechnete Absorptionsspektren für 100% Glucose nach Transmission und
Transflexion .................................................................................................................... 80
Abb. 55: Direkter Vergleich der reinen Absorptionsspektren von Wasser, Glucose und
Ethanol ........................................................................................................................... 81
Abb. 56: Absorptionsspektren der verschiedenen Hefe-Wasser-Gemische bei 30°C ........... 82
Abb. 57: Transmissionsspektren der verschiedenen Hefe-Wasser-Gemische bei 30°C ........ 83
Abb. 58: Spektren (in Counts) der verschiedenen Hefe-Wasser-Gemische bei 30°C ............ 83
Abb. 59: Absorptionsspektren der Glucose-Ethanol-Wasser-Gemische bei 30°C ................ 85
Abb. 60: Ergebnis PCA eines ersten Kalibriermodells ohne Datenvorbehandlung ................ 86
Abb. 61: Ergebnis PCA eines ersten Kalibriermodells nach Basislinienkorrektur ................. 87
Abb. 62: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Glucose ..................................... 89
Abb. 63: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Ethanol ...................................... 90
Abb. 64: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Wasser ...................................... 91
Abb. 65: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Glucosegehalt, (G-EW) ................................................................................................................................... 93
Abb. 66: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagten und realen Ethanolgehalt, (G-EW) ................................................................................................................................... 93
Abb. 67: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagten und realen Wassergehalt, (G-E-W)
....................................................................................................................................... 94
Abb. 68: Vergleich Differenz zwischen vorhergesagten und realen Glucosegehalt, (YPD) .... 96
Abb. 69: Vergleich Differenz zwischen vorhergesagten und realen Ethanolgehalt, (YPD) ..... 96
Abb. 70: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagten und realen Wassergehalt, (YPD) 97
Abb. 71: Vergleich der Messung in (a) Hefe Weizen (trüb, opak) und (b) Bier ...................... 99
Abb. 72: Vergleich der Blasenbildung an der Sonde während der Messung von Bier ......... 100
Abb. 73: Auswahl verschiedener Absorptionsspektren während der Bier alkoholfrei Messung
..................................................................................................................................... 101
Sascha Princz
VIII
Abb. 74: Auswahl verschiedener Absorptionsspektren während der Gold Ochsen Messung
..................................................................................................................................... 101
Abb. 75: Auswahl verschiedener Absorptionsspektren während der Hefe Weizen Messung 102
Abb. 76: Transflexionssonde ohne (a) und mit (b) Blasenfilter ......................................... 103
Abb. 77: Ausgewählte Absorptionsspektren eines Time Scans bei einer SKF .................... 104
Abb. 78: Darstellung der gebildeten Differenzen der AU-Werte eines Time Scan .............. 105
Abb. 79: Aufbau des Versuchssystems für die Schüttelkolbenfermentation von S. cerevisiae
..................................................................................................................................... 107
Abb. 80: Offline-Auswertung zu Glucoseverbrauch und Ethanolbildung der SKF .............. 109
Abb. 81: MW der gefilterten Absorptionsspektren der Proben während einer SKF ............. 110
Abb. 82: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Glucose ................................... 111
Abb. 83: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Ethanol .................................... 112
Abb. 84: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Glucosegehalt, SKF
..................................................................................................................................... 113
Abb. 85: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Ethanolgehalt, SKF
..................................................................................................................................... 114
Abb. 86: Absorptionsspektren der zentrifugierten SKF-Proben, NPK bei 1100 nm ............ 115
Abb. 87: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Glucose ................................... 116
Abb. 88:Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Ethanol ..................................... 117
(zentrifugiert) ................................................................................................................ 118
(zentrifugiert) ................................................................................................................ 119
Abb. 91: AU-Wert Differenz einer SKF Messung direkt nach Inokulation (ungefiltert) ........ 120
Abb. 92: AU-Wert Differenz einer SKF Messung während des Fermentationsprozess
(ungefiltert) ................................................................................................................... 121
Abb. 93: AU-Wert Differenz einer SKF Messung während des Fermentationsprozess (gefiltert)
..................................................................................................................................... 121
Abb. 94: AU-Wert Differenz einer SKF Messung am Ende des Fermentationsprozess
(ungefiltert) ................................................................................................................... 122
Abb. 95: Absorptionsspektren mit Spitzen bei einzelnen Wellenlängen während einer SKF 123
Abb. 96: Absorptionsspektrum einer SKF vor der Reinigung der Sonde ............................ 123
Abb. 97: Absorptionsspektrum einer SKF nach der Reinigung der Sonde ......................... 124
Abb. 98: Offline-Auswertung zu Biomasse, Glucoseverbrauch und Ethanolbildung der
Testfermentation ........................................................................................................... 127
Abb. 99: MW der gefilterten Absorptionsspektren der Proben während der Testfermentation
..................................................................................................................................... 129
Abb. 100: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Glucose ................................. 130
Abb. 101: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Ethanol .................................. 131
Abb. 102: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Glucosegehalt,
Fermentation ................................................................................................................. 132
Abb. 103: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Ethanolgehalt,
Fermentation ................................................................................................................. 133
Abb. 104: AU-Wert Differenz Fermentation Messung direkt nach Inokulation (ungefiltert) 134
Abb. 105: AU-Wert Differenz einer Messung während des Fermentationsprozess (ungefiltert)
..................................................................................................................................... 135
Sascha Princz
IX
Abb. 106: AU-Wert Differenz einer Messung während des Fermentationsprozess (gefiltert)
..................................................................................................................................... 135
Abb. 107: AU-Wert Differenz einer Messung am Ende des Fermentationsprozess (ungefiltert)
..................................................................................................................................... 136
Abb. 108: Aneinanderreihung AU-Wert Differenzen mehrerer Fermentationsproben,
ungefiltert ..................................................................................................................... 137
Abb. 109: Aneinanderreihung AU-Wert Differenzen mehrerer SKF-Proben, ungefiltert ..... 137
Sascha Princz
X
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht wichtiger Einsatzbereich der NIRS; modifiziert aus [5] .......................... 4
Tabelle 2: Aufteilung des IR Bereichs nach DIN 5031 [11] .................................................... 8
Tabelle 3: Grund- und Oberschwingungen im IR Bereich (MIR & NIR); modifiziert nach [2] .. 11
Tabelle 4: Richtwerte normierter rel. Absorptionsintensitäten einer beliebigen
Grundschwingung und deren 1. bis 3. Oberschwingung [2] ............................................... 11
Tabelle 5: Übersicht zu möglichen Halbleitermaterialien eines Dioden-Array-Spektrometers
im NIR Bereich [17] .......................................................................................................... 13
Tabelle 6: Übersicht zur Bezeichnung von Sonden für den Einsatz zur Prozessanalytik an
Bioreaktoren; modifiziert nach [18] .................................................................................. 14
Tabelle 7: Zusammenfassung der Ergebnisse einer PCA; modifiziert nach [18] ................... 20
Tabelle 8: Zusammenfassung der durch eine PCA erhaltenen Informationen; modifiziert nach
[18] ................................................................................................................................. 22
Tabelle 9: verschiedene Validierungsmethoden für die multivariate Datenanalyse; modifiziert
nach [20] ......................................................................................................................... 33
Tabelle 10: Spezifikationen des TIDAS S-1000 MS-T50/16 von J&M Analytik AG ............... 51
Tabelle 11: Von TIDASDAQ V2.39 unterstützte Speicherformate ........................................ 52
Tabelle 12: Spezifikationen der FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes ............................. 54
Tabelle 13: Übersicht der 3 Variationen der Optischen Leistung der AvaLight-HAL-S ......... 56
Tabelle 14: Spezifikationen der AvaLight-HAL-S der Firma Avantes im Long Life Modus .... 56
Tabelle 15: Spezifikationen der Lichtleitfasern von Thorlabs ............................................. 57
Tabelle 16: Spezifikationen des VMS-C-2 der Firma VWR .................................................. 58
Tabelle 17: Spezifikationen des VT-5 der Firma VWR ........................................................ 59
Tabelle 18: Erfassbare Prozessparameter und deren Technik zur Regelung des
Laborfermenters der Hochschule Ulm; modifiziert nach [39] ............................................. 61
Tabelle 19: Anzahl der notwendigen Proben, Faktorenkombination sowie randomisierte
Reihenfolge der Versuche ................................................................................................ 63
Tabelle 20: Prozessparameter der mit dem Virtuellen Bioreaktor simulierten anaeroben
Hefefermentationen ......................................................................................................... 64
Tabelle 21: Start- und Endwerte der mit dem Virtuellen Bioreaktor simulierten anaeroben
Hefefermentationen ......................................................................................................... 65
Tabelle 22: Parameter für die Messung zur Temperaturabhängigkeit der Spektren von Wasser
....................................................................................................................................... 67
Tabelle 23: Umrechnung zwischen Nasshefemasse und Trockenbiomasse ......................... 81
Tabelle 24: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in G-E-W .......................... 88
Tabelle 25: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in G-E-W .......................... 89
Tabelle 26: Modelloptimierung für die Vorhersage von Wasser in G-E-W ........................... 90
Tabelle 27: Zusammensetzung der Blindproben (G-E-W), Angaben in Gew.-% ................... 91
Tabelle 28: Ergebnisse zur Vorhersage der Blindproben (G-E-W), Angaben in Gew.-%........ 92
Tabelle 29: Zusammensetzung der YPD-Proben, Angaben in Gew.-% ................................ 94
Tabelle 30: Ergebnisse zur Vorhersage der YPD-Proben, Angaben in Gew.-% ..................... 95
Tabelle 31: Angaben zu den vermessenen Biersorten, Alkohol in Vol.-% ............................ 97
Tabelle 32: Ergebnisse zur Vorhersage der Biersorten, Alkohol in Vol.-% & Gew.-% ............ 98
Sascha Princz
XI
Tabellenverzeichnis
Tabelle 33: Zusammensetzung des Nährmediums für die Hefefermentation .................... 106
Tabelle 34: Parameter des Time Scan Modus bei der Schüttelkolbenfermentation ............ 108
Tabelle 35: Ergebnisse der Ethanol und Glucose Auswertung zur SKF durch UV-Tests...... 109
Tabelle 36: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in SKF-Proben ................ 111
Tabelle 37: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in SKF-Proben ................. 112
Tabelle 38: Zusammensetzung der SKF-Proben für Vorhersage, Angaben in g/L .............. 112
Tabelle 39: Ergebnisse zur Vorhersage der SKF-Proben, Angaben in g/L ......................... 113
Tabelle 40: Parameter des Single Scan Modus für die zentrifugierten SKF-Proben ............ 114
Tabelle 41: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in zentrifugierten SKF-Proben
..................................................................................................................................... 116
Tabelle 42: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in zentrifugierten SKF-Proben
..................................................................................................................................... 116
Tabelle 43: Zusammensetzung der zentrifugierten SKF-Proben für Vorhersage, Angaben in
g/L ............................................................................................................................... 117
Tabelle 44: Ergebnisse zur Vorhersage der zentrifugierten SKF-Proben, Angaben in g/L .. 117
Tabelle 45: Zusammensetzung des Nährmediums für die Hefefermentation .................... 125
Tabelle 46: Parameter des Time Scan Modus bei der Testfermentation ............................ 127
Tabelle 47: Ergebnisse der Biomasse, Ethanol und Glucose Auswertung zur Testfermentation
durch UV-Tests und Filtration ........................................................................................ 128
Tabelle 48: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in Fermentationsproben .. 129
Tabelle 49: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in Fermentationsproben .. 130
Tabelle 50: Zusammensetzung der Fermentationsproben für Vorhersage, Angaben in g/L 131
Tabelle 51: Ergebnisse zur Vorhersage der Fermentationsproben, Angaben in g/L ........... 131
Sascha Princz
XII
Abkürzungsverzeichnis
ADC
ANOVA
ATP
ATR
AU
BBD
BIAS
BL
CCD
DIN
DOE
FDA
FIR
FT
FTIR
Gew.-%
G-E-W
HPLC
Analog-Digital-Wandler/ Analog Digital Converter
analysis of variance
Adenosintriphosphat
abgeschwächte Totalreflexion/ Attenuated Total Reflection
Absorptionseinheit/ Absorbance Units
Box-Behnken Design
systematischer Fehler/ Verzerrung
Baseline
Central Composite Design/ zentral zusammengesetzte Pläne
Deutsches Institut für Normung
Design of Experiment/ Versuchsplan
Food and Drug Administration
Fernes Infrarot
Fourier Transformation
Fourier-Transformations-Infrarot
Gewichtsprozent
Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch
high performance liquid chromatography/
Hochgeschwindigkeitschromatographie
InGaAs
It
Ktr.Lsg
MCR
MIR
MIRS
MLR
MW
NA
NIR
NIRS
NPK
OD
PAT
PbS
PC
PCA
PCR
PLS
PLSR
PRESS
RMSE
RMSEC
Sascha Princz
Indium-Gallium-Arsenid
Integrationszeit
Kontrolllösung
multivariate Kurvenauflösung/ Multivariate Curve Resolution
mittleres Infrarot
mittlere Infrarotspektroskopie
multiple lineare Regression
Mittelwert
Numerische Apertur
Nahes Infrarot
Nahinfrarotspektroskopie
Nullpunktkorrektur
Optische Dichte
Prozessanalysetechnik/ Process Analytical Technology
Bleisulfid
Hauptkomponente/ Principal Component
Hauptkomponentenanalyse/ Principal Component Analysis
Hauptkomponentenregression/ Principal Component Regression
Partial Least Squares
Partial Least Squares Regression
Predicted Residual Sum of Squares
Root Mean Square Error
Root Mean Square Error Calibration
XIII
RMSECV
RMSEP
SE
SEC
SECV
SEP
SG
Si
SIMCA
SMA
SKF
SQE
SQR
SQT
TTL
UV
Vol.-%
Vorb.
VBR
VE
VIS
YPD
Sascha Princz
Root Mean Square Error Cross Validation
Root Mean Square Error Prediction
Standard Error
Standard Error of Calibration
Standard Error of Cross Validation
Standard Error of Performance oder Standard Error of Prediction
Savitzky Golay
Silizium
soft independent modeling of class analogies
Sub-Miniature-A
Schüttelkolbenfermentation
Sum of Squares Explained/ erklärte Varianz
Sum of Squares Residuals/ Rest- oder Residualstreuung
Sum of Squares Total/ Gesamtstreuung
Transistor-Transistor-Logik
Ultraviolett
Volumenprozent
Vorbehandlung
Virtueller Bioreaktor/ Virtual Bioreactor
vollentsalztes
sichtbar/ visible
Yeast (Hefe) Pepton Dextrose
XIV
Einleitung und Aufgabenstellung
1
Die von Seiten der FDA (Food and Drug Administration) initiierte Leitlinie für die
pharmazeutische Industrie mit dem Titel „PAT — A Framework for Innovative Pharmaceutical
Development, Manufacturing, and Quality Assurance“ aus dem Jahre 2004 [1], hat
entscheidend zu der rasanten Weiterentwicklung der PAT (Prozessanalysetechnik, Process
Analytical Technology) für den pharmazeutischen Einsatz in den letzten Jahren beigetragen.
Der hohe Bekanntheitsgrad und vor allem die Notwendigkeit einer gut funktionierenden und
qualitativ
hochwertigen
Technik
zur
Analyse
des
Bioprozesses
haben
zu
den
unterschiedlichsten Ansätzen der Realisierung solcher Analysetechniken geführt. Das
Verlangen der chemischen Industrie nach einer Senkung der Produktionskosten sowie die
Erfüllung der regulatorischen Anforderungen der Pharmaindustrie spiegeln sich beide in
einer verbesserten Kontrolle sowie einer funktionsstarken Qualitätssicherung des Prozesses
bereits ab dem Zeitpunkt der Prozessentwicklung bis zu dessen Produktion wieder.
Um dem dafür notwendigen Anspruch einer zeitnahen Analytik gerecht zu werden hat sich
die optische Spektroskopie als ein sehr starkes Werkzeug herausgestellt. Sie bietet die
Vorteile
einer
Echtzeit-Prozesskontrolle,
erlaubt
einen
zerstörungsfreien
und
berührungslosen, nicht invasiven Einsatz zur selektiven Messung von Feststoffen, Gasen
oder Flüssigkeiten sowohl in Form einer qualitativen als auch quantitativen Analyse. Darüber
hinaus lässt sich die Spektroskopie sowohl Offline, z. B. für eine Auswertung im Labor, als
auch Online, z. B. durch Integration in die Produktionslinie, und Inline, z. B. direkte Messung
in der Fermenterbrühe, direkt während der Produktion einsetzen. Ein weiterer wichtiger und
großer Vorteil der optischen Spektroskopie ist der sehr breite Einsatzbereich. Der Grund
dafür liegt zum einen in dem breiten Spektralbereich, von UV/ VIS (200 – 780 nm) über NIR
(780 – 3000 nm) bis zum MIR (3000 – 50000 nm) [2, 11], und zum anderen in der
Vielfältigkeit der Spektrometrie-Techniken wie z. B. Reflexion, Transmission, Transflektion,
Fluoreszenz, Raman oder ATR (abgeschwächte Totalreflexion, Attenuated Total Reflection).
Obwohl es jedoch bereits seit Jahrzehnten Stand der Technik ist, mit Hilfe von Sonden und
Analysetechniken für einen kontrollierten Prozess in Bioreaktoren oder Fermentern zu
sorgen,
können
noch
nicht
alle
relevanten
Bioprozessparameter
ausreichend
oder
kontinuierlich überwacht werden. Bietet der Markt bereits eine Vielzahl von Sonden und
Analysetechniken zur Bestimmung und Kontrolle von z. B. Sauerstoffkonzentration, pH-Wert,
Temperatur
oder
der
Optischen
Dichte
in
einer
Fermenterbrühe,
fehlen
diese
kontinuierlichen Analysetechniken und Sonden für eine Inline-Messung von biotechnisch
Sascha Princz
1
wichtigen Substanzen wie Ethanol und Glucose während einer Fermentation. Aus diesem
Grund erfolgt die Auswertung der Ethanol- und Glucosekonzentration auch heute noch
vorwiegend mit Hilfe von Enzymtests im Labor von Hand. Diese Methode der Analyse dauert
für eine wirtschaftliche Produktion und vor allem schnelle Prozesskontrolle schlichtweg zu
lange um zeitnah reagieren bzw. eingreifen zu können.
Im Rahmen dieser Master-Thesis soll der Laborfermenter des Biotechnologie-Labors der
Fakultät Mechatronik und Medizintechnik an der Hochschule Ulm um ein Messsystem zur
optischen Inline-Messung und Bestimmung des Ethanol- und Glucosegehalts während einer
Fermentation erweitert werden. Dies bietet unter anderem die Möglichkeit während einer
Hefefermentation Rückschlüsse über den genauen Verbrauch an Glucose und der Bildung
von Ethanol zu erhalten und liefert somit auch eine Aussage in Echtzeit über den genauen
Stand der Fermentation bzw. in welcher Phase sich die Fermentation gerade befindet in
Echtzeit. Mit einer Gewinnung der genannten Informationen in Echtzeit während eines
Fermentationsprozesses stehen völlig neue Möglichkeiten zur Verfügung. So lassen sich
diese Informationen zum Einen sehr gut im Rahmen der Lehre nutzen, aber auch zum
Aufbau einer Regelstrategie für einen verbesserten und stabileren Prozess und einer daraus
resultierenden verbesserten Produktqualität sind solche Informationen ohne signifikante
Zeitverzögerung unumgänglich. Eine weitere Möglichkeit, die sich daraus für die Nutzung
des Bioreaktors der Hochschule Ulm ergeben kann, ist der Einsatz des Laborfermenters in
einem sogenannten Fed-Batch-Betrieb. Dabei wird während einer Fermentation z. B. Glucose
als Kohlenhydratquelle zugefüttert um diese auf einem konstanten Level zu halten und somit
den Stoffwechsel des Mikroorganismus (z. B. Hefe) und dadurch letztendlich die
Fermentation in einer gewünschten Phase (z. B. Produktion eines bestimmten Produktes) zu
halten. Dies lässt sich z. B. für eine Hefefermentation mit der Entwicklung einer
Glucosezufütterung durch eine dafür notwendige Regelstrategie, die unter anderem mit Hilfe
der aus dieser Inline-Messung gewonnenen Messwerte arbeitet, realisieren.
Das Ziel der vorliegenden Master-Thesis liegt also in einer Erweiterung des Bioreaktors der
Hochschule Ulm um eine Möglichkeit zur optischen Inline-Bestimmung des Ethanol- und
Glucosegehalts direkt in der Fermenterbrühe. Zur Realisierung dieser optischen InlineBestimmung soll die Absorption von Glucose und Ethanol während einer Fermentation mit
Hilfe der Nahinfrarotspektroskopie (NIRS) gemessen werden, und im Anschluss mit Hilfe der
Chemometrie daraus der Gehalt von Glucose und Ethanol bestimmt werden. Die Umsetzung
dieser Aufgabenstellung lässt sich in die nachfolgenden Schwerpunkte untergliedern.
Zunächst muss ein geeignetes Messsystem aufgebaut werden, dabei muss das von einer
geeigneten NIR-Lichtquelle erzeugte Licht über eine Sonde (z. B. Transflexionssonde) in die
Sascha Princz
2
Fermenterbrühe geleitet werden und nach der erfolgten Absorptionsmessung wieder über
die Sonde zurück zum Spektrometer. Die Auswertung des gemessenen Signals erfolgt dann
mit Hilfe eines geeigneten NIR-Spektrometers. Dieses liefert somit die entsprechenden
Absorptionsspektren für die anschließende chemometrische Auswertung.
Nach Zusammenstellung und Aufbau eines geeigneten Messsystems werden zunächst
diverse Messungen in Form von Vorversuchen (z. B. Absorptionsspektren von Wasser,
Glucose und Ethanol) durchgeführt. Dadurch erfolgt zum einen ein Funktionstest des
erstellten Systems und zum anderen werden Erfahrungswerte für das weitere Vorgehen und
zur Handhabung gesammelt. Im Anschluss erfolgen Messungen zur Temperaturabhängigkeit
von Wasser bei der Absorption im NIR und erste Messungen von manuell erstellten GlucoseEthanol-Wasser-Gemischen unterschiedlichster Zusammensetzung. Mit Hilfe der daraus
resultierenden Absorptionsspektren wird über eine multivariate Datenanalyse, mit Hilfe
geeigneter Software für die Chemometrie, ein Modell (Kalibriermodell) für einen ersten
Vorhersageversuch des Ethanol- und Glucosegehalts in unbekannten wässrigen Proben
erstellt.
Nach erfolgreich abgeschlossenen Vorversuchen und Vorhersagen in wässrigen Proben wird
versucht sich an die Vorhersage der Konzentrationen von Ethanol und Glucose während einer
Fermentation in dem Laborfermenter der Hochschule Ulm heranzuarbeiten. Dafür werden
zunächst Hefefermentationen mit Saccharomyces cerevisiae als Modellversuche in einem
Schüttelkolben durchgeführt. Die Messungen erfolgen mit Hilfe des Messsystems sowie
weiteren geeigneten Messmethoden (z. B. Enzymtests) für eine Referenzanalytik. Die
Referenzanalytik ist unumgänglich um die gemessenen bzw. vorhergesagten Größen
vergleichen zu können. Die so gewonnenen spektralen Absorptionsdaten sowie die
Konzentrationen aus der Referenzanalytik werden nun für den Aufbau bzw. die Erweiterung
des Kalibriermodells (zur Vorhersage der Ethanol- und Glucosekonzentration) verwendet.
Letztendlich erfolgt in einem letzten Arbeitsabschnitt die Testung des Messsystems und des
Kalibriermodells unter Realbedingung an dem Laborfermenter der Hochschule Ulm. Zunächst
wird bei einer anaeroben Hefefermentation mit Saccharomyces cerevisiae unter vereinfachten
Bedingungen (keine Sauerstoffzufuhr und kein Rühren) direkt in der Fermenterbrühe
gemessen. Auch bei dieser Fermentation wird wieder gegen die Daten aus einer geeigneten
Referenzanalytik verglichen und die dadurch gewonnen Daten ebenso zur Verbesserung und
zum Ausbau des Kalibriermodells herangezogen.
Sascha Princz
3
Stand der Technik und Literaturrecherche
2
Bereits im Jahre 1800 wurde von Sir William Herschel die nahe Infrarotstrahlung (NIR)
entdeckt [3], nichts desto trotz fristete die NIRS bis etwa Mitte des letzten Jahrhunderts ein
eher unbedeutendes Dasein im Bezug auf ihre Verwendung in Industrie und Forschung. Erst
in der zweiten Hälfte des letzten Jahrhunderts fand die NIRS ein immer größeres
Einsatzgebiet
zunächst
im
Bereich
der
Qualitätskontrolle
der
Lebens-
und
Futtermittelindustrie. Die Eigenschaften, dass es sich dabei um eine zerstörungsfreie,
schnelle und in den Produktionsprozess integrierbare Form der Analyse handelt, die zudem
meist keine aufwendige Probenvorbereitung erfordert [4], führte dazu, dass sich die NIRS
heute bereits in weiteren Teilen der Industrie in Form einer schnellen und zerstörungsfreien
Analysetechnik für die Kontrolle und zur Überwachung von Produkt und Produktion etabliert
hat.
Eine Übersicht einiger dieser etablierten Einsatzbereiche der NIRS findet sich in Tabelle 1.
Deren Inhalt wurde leicht verändert aus [5] übernommen und zeigt recht anschaulich den
industriellen Einsatzbereich der NIRS in den unterschiedlichen Fachgebieten.
Tabelle 1: Übersicht wichtiger Einsatzbereich der NIRS; modifiziert aus [5]
Fachgebiet
Einsatzbereich
Chemie
Wassergehalt,
organischen
Struktur
und
Verbindungen;
Zusammensetzung
Additive
in
von
Polymeren;
Charakterisierung von synthetischen Polymeren;
Online
Überwachung
von:
Bioprozesse,
Polymerisation,
Petrochemische Prozesse, Polymer-Extrusion
Landwirtschaft
Fett, Wasser, Protein, Öl, Reis, Sojabohnen und allgemein
Saatgut, Asche in Weizen
Nahrungsmittelindustrie
Protein,
Fett
in
Backwaren,
Wasser,
Molkereiprodukte,
Schokolade, Fleisch, Snack Food, Kakao
Pharmazie
Identität, Gehalt und Feuchte in Pulvern, Tabletten, Granulaten;
Feuchte in Gelatine-Kapseln; Kristallinitätsgrad, Polymorphie,
Dichte;
Restfeuchte
Modifikationsumwandlungen,
in
Härtegrad
Lyophilisaten;
von
Tabletten;
Stabilität; Korngröße; Mischungsgüte
Online Überwachung: Mischen, Trocknen, Direktpelletierung,
Granulieren, Filmcoating
Sascha Princz
4
Medizin
Nichtinvasive in-vivo Bestimmung von Körperfett, Cholesterol,
Sauerstoff; Hautkrebs; Wassergehalt der Haut; Kohlenhydrat,
Fett und Stickstoff in Fäzes
Umweltschutz
Schadgasmessung, Sedimente (z. B. saurer Regen); KunststoffRecycling
Wie nach Betrachtung der Tabelle zu erkennen ist, handelt es sich bei den etablierten
Methoden meist um Reflexionsmessungen an Feststoffen bzw. –körpern. Allerdings gibt es
seit einigen Jahren auch verstärkt Arbeiten, die sich mit der NIRS zur Analytik in wässrigen
Lösungen und Flüssigkeiten, wie sie z. B. in Bioreaktoren vorkommen, beschäftigen.
Standardmethoden zur Bestimmung des Alkoholgehaltes im flüssigen Lebensmittel, wie Bier
oder Wein, sind unter anderem Enzymtests, Dichtemessung nach der Fermentation bzw.
Destillation oder auch die Gaschromatographie. Diese Methoden sind aber meist sehr
zeitintensiv, kostspielig und die Ergebnisse liegen zum Teil erst stark zeitverzögert vor.
Deshalb wurde bereits in vielen Arbeiten versucht, diese Analyse mit Hilfe der NIRS
durchzuführen. Di Egidio et al. (2010) beschreiben in ihrer Arbeit [6] eine schnelle Methode
zur Bestimmung des Zuckergehaltes (Glucose und Fructose), des Phenolgehaltes (Phenol,
Anthocyanin, Flavonoid) sowie des Alkoholgehaltes (Ethanol, Glycerol) während einer
Fermentation von Rotwein. Insgesamt 75 Proben wurden in definierten Zeitabständen aus 15
Fermentationen gewonnen. Die Auswertung der Proben erfolgte in spektroskopischer Weise
mit Hilfe eines FTNIR- und FTIR-Spektrometers und die chemische Analyse mit Hilfe einer
HPLC (high performance liquid chromatography, Hochgeschwindigkeitschromatographie).
Die Auswertung der Proben mit den vorgenannten Verfahren erfolgte Online (Ex situ) nach
einer Klärung der Probenflüssigkeiten.
Eine Übersicht zu Arbeiten die sich mit der Online Überwachung des Bioprozesses in einem
Bioreaktor beschäftigen zeigt D. Landgrebe et al. in [7] (s. a. Tabelle im Anhang unter A 1.1).
Dort werden diverse Arbeiten aus den Jahren 1994 bis 2010 besprochen, die mit Hilfe der
NIRS oder MIRS (mittlere Infrarotspektroskopie) unter anderem versuchen bei einer
Fermentation mit unterschiedlichsten Mikroorganismen und Zelllinien z. B. verschiedene
Metabolite, Substrate oder Zellmassen ohne Zeitverzögerung Inline zu bestimmen. Eine
weitere umfangreiche Zusammenstellung von 38 Arbeiten, die sich mit der Prozessanalytik
mit Hilfe der NIRS beschäftigen zeigt, A. E. Cervera in [8]. Dort werden die einzelnen
Arbeiten hinsichtlich Biokatalyt, Probennahme, NIR-Methode, Analyten, Wellenlängenbereich
sowie der Methode zur Erstellung des Kalibriermodells und dessen Genauigkeit tabellarisch
aufgeführt (s. a. im Anhang unter 1.2).
Sascha Princz
5
Da bei der NIRS überlappende Absorptionsspektren [7] mit zum Teil stark überlagernden
Absorptionsbanden gewonnen werden, können daraus mehrere Komponenten bzw. Größen
simultan bestimmt werden [7]. Aufgrund dieser Eigenschaft der Absorptionsspektren werden
jedoch für die Auswertung komplexe Rechenalgorithmen benötigt. Diese Methode, die sich
der Verfahren der mathematischen Statistik bedient, bezeichnet man als Chemometrie. Somit
bildet die so genannte Chemometrie einen wichtigen Bereich, der mit der heutigen NIRS
nahezu untrennbar verbunden ist. Nur mit Hilfe einer solchen multivariaten Datenanalyse ist
letztendlich eine selektive Analyse möglich. A. S. Rathore et al. zeigen in [9] eine Übersicht
zu
verwendeten
spektroskopische
Säugetierzellen
tabellarisch
chemometrischen
Prozessanalytik
und
unter
gewonnener
Mikroorganismen.
Angabe
von
Anwendungen
Die
Prozess,
Daten
für
die
während
vorgestellten
Auswertung
Kultivierungen
Arbeiten
Prozessanalytik
und
werden
den
durch
von
ebenfalls
verwendeten
chemometrischen Methoden dargestellt (s. a. Im Anhang unter A 1.3).
Sascha Princz
6
Grundlagen
3
In
Grundlagen
dem
nachfolgenden
Kapitel
Grundlagen
werden
im
Vorfeld
einige
wichtige
Themengebiete, die zum besseren Verständnis dieser Arbeit beitragen sollen bzw.
notwendig sind, vorgestellt.
3.1 Optische Spektroskopie
Mit dem Begriff Spektroskopie (lat. spectrum für Bild, gr. skopein für ansehen) verbindet man
im Allgemeinen das Aufzeichnen von Spektren unter Zuhilfenahme eines Spektrometers [2].
Genauer betrachtet handelt es sich bei einem Spektrum um die Aufzeichnung der Emissionsoder Absorptionsintensität innerhalb eines bestimmten spektralen Bereiches, hervorgerufen
durch elektromagnetische Strahlung bei einzelnen Wellenlängen bzw. Frequenzen [2]. Es
erfolgt also eine Auftrennung der elektromagnetischen Strahlung entsprechend ihrer Energie
[3]. Abb. 1 zeigt eine Übersicht einiger wichtiger elektromagnetischer Strahlungen unter
Angabe deren zugehörigen Wellenlängen und entsprechenden Frequenzen.
Abb. 1: Auszug zu elektromagnetische Strahlung unter Angabe der Wellenlänge und Frequenz [10]
Die Gesamtheit aller qualitativen und quantitativen Analyseverfahren, die auf eine
Wechselwirkung zwischen toter und oder lebender Materie und Licht beruhen, werden unter
der Bezeichnung optische Spektroskopie zusammengefasst [3]. Aufgrund der spektralen
Unterschiedlichkeit eines jeden Stoffes, und durch die Bestimmung verschiedener optischer
Sascha Princz
7
Grundlagen
Parameter als Funktion der Wellenlänge λ, bzw. der Wellenzahl
handelt es sich hierbei um
ein hochspezifisches Verfahren für die quantitative und qualitative Analyse von Proben [3].
Die Umrechnung zwischen der Wellenlänge λ und deren Energiedarstellung als Wellenzahl
zeigt Gl. (3.1).
(3.1)
Aufgrund des großen Spektralbereichs und der unterschiedlichen Reaktionen der zu
analysierenden Probe (vgl. Absorption, Reflexion, Streuung und Lumineszenz) kommen je
nach Anforderung die unterschiedlichsten spektroskopischen Methoden zum Einsatz. Aus
diesem Grund soll nachfolgend nur das in dieser Arbeit verwendete Analyseverfahren der
Nahinfrarotspektroskopie (NIRS) näher vorgestellt werden.
3.1.1 NIR-Spektroskopie
Die NIRS gehört zur Absorptionsspektroskopie (hierbei beschreibt die Absorption eine
Änderung
des
Energiegehaltes
elektromagnetischen
Spektrums
im
Molekül)
zugeordnet.
und
Dieser
wird
dem
IR-Bereich
IR-Bereich
des
zwischen
dem
liegt
sichtbaren VIS- und dem Bereich der Mikrowellen (vgl. Abb. 1) und wird laut DIN 5031 in 3
Bereiche aufgeteilt, siehe Tabelle 2.
Tabelle 2: Aufteilung des IR Bereichs nach DIN 5031 [11]
Benennung
Abkürzung
Nahes Infrarot
NIR
Mittleres Infrarot
MIR
Fernes Infrarot
FIR
Wellenlänge [nm]
IR-A
780 - 1400
IR-B
1400 - 3000
3000 - 50000
IR-C
50000 - 1000000
Obwohl Sir William Herschel bereits im Jahre 1800 das NIR entdeckte [3], dauerte es nahezu
bis
zur
zweiten
Hälfte
des
letzten
Jahrhunderts,
bis
die
NIRS
ein
größeres
Anwendungsspektrum fand. Der Grund dafür lag vor allem in der Tatsache, dass nun
leistungsfähigere Rechner für eine erforderliche multivariate (chemometrische) Datenanalyse
vorhanden waren [12].
Auch heute nimmt die NIRS noch eine Art Sonderstellung ein. Während im angrenzenden UV/
VIS Bereich die Absorptionsspektren durch eine Anregung der Elektronen in den Molekülen
gewonnen werden, erfolgt die Aufzeichnung der Absorptionsspektren im NIR und MIR durch
eine Messung von Molekülschwingungen und im FIR durch Molekülrotationen [3]. Die
erwähnte
Sonderstellung
Sascha Princz
resultiert
aus
der
Art
der
im
NIR
auftretenden
8
Grundlagen
Molekülschwingungen. Sind es im MIR die Grundschwingungen, resultiert die Absorption im
NIR auf den Oberschwingungen (bzw. Obertöne) der Grundschwingungen und den
Kombinationsschwingungen [2].
Die dafür notwendige Anregung der Molekülschwingungen lässt sich durch das Beispiel des
anharmonischen Oszillators (für ein Molekül aus zwei Atomen) bereits verständlich
beschreiben. Das entsprechende Energiediagramm zeigt Abb. 2. Hierbei steht r für die
Bindungslänge
(Abstand
zwischen
den
beiden
Atomen
X-Y)
und
r0
für
den
Nullpunktsatomabstand mit E0 als Nullpunktsenergie. EP steht für die potentielle Energie und
die Dissoziationsgrenze bzw. Dissoziationsenergie ED gibt an, bei welcher Streckung r der
Bindung eines Moleküls dieses in seine Radikale X° und °Y zerfällt. Der entsprechende
Schwingungsterm v (Schwingungsquantenzahl) gibt an in welchem Schwingungszustand sich
das Molekül befindet bzw. welches Energieniveau besetzt ist. Die Übergänge von v=0 nach
v=1 werden als Grundschwingungen bezeichnet [2], und werden im MIR detektiert. Alle
anderen Übergänge von v=0 in v=2, 3, …n sind erlaubt und werden als Oberschwingungen
bzw.
Obertöne
bezeichnet
[2]
und
im
NIR
detektiert.
Desweiteren
sind
Kombinationsschwingungen K zu erwarten, die wie Gl. (3.2) zeigt gebildet werden können
[2].
(3.2)
Letztlich müssen zur Vollständigkeit noch die Fermi-Resonanzschwingungen erwähnt
werden, diese sind auf eine Kopplung von ähnlichen Kombinationsschwingungen K
(energiegleichen
Schwingungsübergängen)
und/
oder
Oberschwingungen
O
mit
Grundfrequenzen zurückzuführen [2].
Sascha Princz
9
Grundlagen
Abb. 2: Energiediagramm eines anharmonischen Oszillators, Schwingungsarten der IR Spektroskopie;
modifiziert nach [2, 13]
Bei diesen Molekülschwingungen handelt es sich im Allgemeinen um Valenz- bzw.
Streckschwingungen
oder
Deformations-
bzw.
Beugeschwingungen
[2].
Bei
der
Streckschwingung ändert sich der Abstand der Atome in Richtung der Bindungsachse
aufgrund einer alternierenden Verlängerung oder Verkürzung der Atombindung [2]. Bei der
mit einer geringeren Energie anregbaren Deformationsschwingung ändert sich der
Bindungswinkel der Atome zueinander, es kommt zu einer alternierenden Schließung und
Öffnung der Bindungswinkel [2]. Diese Schwingungen können sowohl symmetrisch als auch
asymmetrisch auftreten. Aufgrund der Vollständigkeit soll an dieser Stelle kurz erwähnt
werden, dass nur asymmetrische Schwingungen im IR angeregt werden und somit IR-aktiv
sind [2]. Symmetrische Schwingungen sind IR-inaktiv dafür aber Raman-aktiv [2].
Die Übergangswahrscheinlichkeit in höhere Schwingungszustände wird mit zunehmenden Δv
unwahrscheinlicher und ist ab der 4. Oberschwingung analytisch kaum noch relevant [2].
Tabelle 3 zeigt die Lage der wichtigsten Oberschwingungen. Diese lassen sich mit Hilfe einer
Faustregel abschätzen (z.B. die Frequenz der 2. Oberschwingung entspricht etwa 3*Frequenz
der Grundschwingung minus wenige Prozente als Anharmonitätsbeitrag) [2]. Die Mehrzahl
dieser Absorptionsbanden resultieren aus Oberschwingungen/ -töne von O-H-, C-H-, S-Hund N-H-Streckschwingungen.
Sascha Princz
10
Grundlagen
Tabelle 3: Grund- und Oberschwingungen im IR Bereich (MIR & NIR); modifiziert nach [2]
Grundschwingung
1. Oberschwingung
2. Oberschwingung
3. Oberschwingung
vC=O
5714 nm
ca. 3000 nm
ca. 2100 nm
ca. 1650 nm
vC-H
3571 nm
ca. 1875 nm
ca. 1309 nm
ca. 1027 nm
vN-H
3030 nm
ca. 1591 nm
ca. 1111 nm
ca. 871 nm
Wie bereits erwähnt wird die Übergangswahrscheinlichkeit in höhere Schwingungszustände
zunehmend geringer, woraus eine drastische Abnahme der Absorptionsintensität der
Oberschwingungen mit zunehmender Schwingungsquantenzahl resultiert [2]. Tabelle 4 zeigt
eine solche Abnahme der relativen Bandenintensität bezüglich einer auf eine beliebige
Grundschwingung normierte Intensität [2].
Tabelle 4: Richtwerte normierter rel. Absorptionsintensitäten einer beliebigen Grundschwingung und
deren 1. bis 3. Oberschwingung [2]
Übergang
Schwingung
relative Bandenintensität [%]
v0, v1
Grundschwingung
100
v0, v2
1. Oberschwingung
10
v0, v3
2. Oberschwingung
0,3
v0, v4
3. Oberschwingung
0,01
Durch die aufgezeigte Vielzahl an Übergangsmöglichkeiten erhält man im NIR keine
einzelnen
Absorptionsbanden,
sondern
durch
deren
Überlappung
sehr
breite
Absorptionsbanden. Deshalb ist hier keine Aussage wie z. B. im UV/VIS anhand einer
einzelnen Wellenlänge möglich, sondern man benötigt eine Auswertung mit Hilfe der
multivariaten Datenanalyse (Chemometrie).
3.1.2 NIR-Spektrometer
Die Erstellung von NIR-Spektren kann auf verschiedenen Techniken basieren, abhängig von
der Art des verwendeten Spektrometers. Nachfolgend soll nur die Technik zweier Arten von
NIR-Spektrometern kurz erläutert werden. Dem weit verbreiteten FTIR-Spektrometer
(Fourier-Transformations-Infrarotspektrometer) sowie einem, ähnlich zu dieser Arbeit
verwendeten, Dioden-Array-Spektrometer. Beiden Spektrometertypen gemeinsam ist, dass
die Proben mit dem kompletten Wellenlängenbereich der NIR-Strahlung angeregt werden. Es
erfolgt also keine Auftrennung der NIR-Strahlung in dessen einzelne Wellenlängen vor der
Probe.
Sascha Princz
11
Grundlagen
3.1.2.1 FTIR-Spektrometer
Anhand dem in Abb. 3 gezeigten stark vereinfachten Prinzipschema eines FTIRSpektrometers mit Michelson-Interferometer lässt sich die Funktion sehr anschaulich
erklären. Die NIR-Strahlung wird nach Verlassen der Strahlungsquelle an einem Strahlteiler in
zwei Teile mit gleicher Intensität aufgespalten und zum einen auf einen festen Spiegel (dient
als Referenz) und einen beweglichen Spiegel (dient zur Messung) transmittiert. Beide Teile
werden von dem entsprechenden Spiegel wieder auf den Strahlteiler reflektiert [14] und
gelangen davon durch die Probe zum Detektor.
Abb. 3: Vereinfachtes Prinzipschema eines FTIR-Spektrometers mit Michelson-Interferometer;
modifiziert nach [15]
Je nach Stellung des beweglichen Spiegels kommt es zu einer Verschiebung der beiden
Wellen zueinander [14] und somit zu einer optischen Weglängendifferenz. Diese beiden
Wellen überlagern sich nun gegenseitig und bilden ein Interferogramm [14]. Die Auftrennung
der Wellen erfolgt nach der Zeit und somit liegt das Interferogramm als eine Funktion der
Zeit vor. Es muss zunächst mit Hilfe der Fourier Transformation (FT) in eine Funktion der
Frequenz umgewandelt werden damit es letztendlich als Spektrum dargestellt werden kann.
3.1.2.2 Dioden-Array-Spektrometer
Das in Abb. 4 stark vereinfachte Prinzip eines Dioden-Array-Spektrometers erklärt dessen
Funktion bereits ausreichend. Die elektromagnetische Strahlung wird (z. B. mittels
Lichtleiter) von der Strahlungsquelle (Source) zu der zu messenden Probe (Sample) geleitet,
Sascha Princz
12
Grundlagen
und dort um die von der Probe absorbierte Strahlung abgeschwächt. Anschließend wird die
abgeschwächte elektromagnetische Strahlung (z. B. wieder mittels Lichtleiter) durch einen
Eintrittsspalt (Entrance slit) auf einen Polychromator (Dispersion device) geleitet. Bei diesem
Polychromator handelt es sich je nach Spektrometer entweder um ein (Glas-)Prisma oder um
ein Gitter, welches die eingeleitete elektromagnetische Strahlung in dessen einzelne
Wellenlängen aufspaltet, die von dort auf das entsprechende Dioden-Array trifft.
Abb. 4: Vereinfachtes Prinzipschema eines Dioden-Array-Spektrometers; modifiziert nach [16]
Dieses Dioden-Array kann aus einer Aneinanderreihung von einigen 100 Dioden bestehen
und ermöglicht zusammen mit einem Analog-Digital-Wandler (ADC) und einem Rechner die
Erstellung eines Spektrums [2]. Je nach geforderter spektraler Empfindlichkeit des
Spektrometers und dem damit verbundenen
Wellenlängenbereich kommen Dioden aus
unterschiedlichem Halbleitermaterial zum Einsatz. Eine Übersicht dieser Halbleitermaterialien
mit den relevanten Daten zeigt Tabelle 5.
Tabelle 5: Übersicht zu möglichen Halbleitermaterialien eines Dioden-Array-Spektrometers im NIR
Bereich [17]
Spektralbereich
Wellenlänge [nm]
Halbleitermaterial
UV/VIS/NIR
200 - 1100
Si (Silizium)
NIR/IR
900 - 2500
InGaAs (Indium-Gallium-Arsenid) oder PbS (Bleisulfid)
3.1.3 Sondentechnik
Bei der spektroskopischen Messung in Flüssigkeiten spielt unter anderem auch die Wahl der
richtigen Sondentechnologie eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Qualität des Messsignals.
Sascha Princz
13
Grundlagen
Für die Prozessanalytik mit Hilfe der optischen Spektroskopie an Bioreaktoren oder
Fermentern bieten sich die in Tabelle 6 aufgeführten Sonden an. Diese Sonden können zum
einen den so genannten Durchflusssonden und zum anderen den Immersionssonden
zugeordnet werden.
Tabelle 6: Übersicht zur Bezeichnung von Sonden für den Einsatz zur Prozessanalytik an Bioreaktoren;
modifiziert nach [18]
Sonden
Immersionssonden
Durchflusssonden
Transmissionssonden
(Rück)-Streusonden
 Transflexionssonden
(Reflexion, Raman, Fluoreszenz)
ATR Sonden
Durchflusssonden lassen sich z. B. über einen Bypass an das System koppeln und
ermöglichen somit eine Online-Kontrolle des Prozesses, für eine Inline-Kontrolle lassen sich
die Immersionssonden direkt in das System integrieren [18]. Beiden Arten von Sonden
gemeinsam ist, dass das Licht über eine Faser von der Lichtquelle über die Sonde in die
Probenlösung geleitet wird, und von dort je nach Prinzip über die Sonde wieder zurück zum
Detektor oder Spektrometer. Somit stellt die entsprechende Sonde also die Schnittstelle
zwischen
dem
zu
analysierenden
Medium
und
der
optischen
Messtechnik
zur
Prozessanalytik dar.
Für
die
in
dieser
Transmissionssonden,
Totalreflexion,
Arbeit
durchgeführte
Transflexionssonden
Attenuated
Total
Reflection)
Analytik
und
eigenen
bedingt
Sonden,
auch
deshalb
sich
ATR
sollen
in
erster
Linie
(abgeschwächte
diese
in
den
nachfolgenden Kapiteln etwas genauer betrachtet werden.
Zur Vollständigkeit sei noch kurz erwähnt, dass Reflexionssonden den Rückstreusonden
zugeordnet werden, da sie für die Analyse das von den Festkörpern oder Partikeln
reflektierte Licht aufnehmen und zum Spektrometer leiten. Raman- und Fluoreszenzsonden
gehören zu den Streusonden und leiten das durch das eingeleitete Licht angeregte Ramanbzw. Fluoreszenzsignal zum Detektor [18].
3.1.3.1 Transmission
Die Transmissionssonde macht sich, wie der Name schon sagt, das Prinzip der Transmission
zunutze. Hierbei wird die zu analysierende Probe direkt durchstrahlt. Anhand der Abb. 5
lässt sich das Prinzip recht anschaulich erklären. Zunächst gelangt das Licht (Signal) über
eine Lichtleitfaser und die Sonde zur zu analysierenden Probenlösung. Die beim Durchgang
durch die Probenlösung abgeschwächte Intensität des Lichtes wird anschließend über die
Sascha Princz
14
Grundlagen
Sonde und Lichtleitfaser zum Spektrometer (Detektor) geleitet, und ermöglicht eine
Bestimmung der Abschwächung (Absorption) der elektromagnetischen Strahlung (Licht oder
Signal)
durch
genau
diese
absorbierende
Probenlösung.
Eine
Begrenzung
der
Messmöglichkeit liegt hier auch an dem Optischen Pfad bzw. der Schichtdicke, da umso
größer die Absorption eine kleinere Schichtdicke bzw. Optischer Pfad gewählt werden muss.
Abb. 5: Prinzipskizze zur Transmissionssonde
Diese Absorption lässt sich mit Hilfe des Gesetzes von Lambert und Beer, also dem Lambert
Beer´schen Gesetz berechnen. Gl. (3.3) zeigt diese Berechnung der Absorbanz A mit Hilfe
der Schichtdicke d, dem molaren Absorptionskoeffizienten ε sowie der Stoffkonzentration c,
oder aus der eingestrahlten Lichtintensität I0 und der abgeschwächten oder detektierten
Intensität I.
(3.3)
Die Transmission T selbst lässt sich aus dem Verhältnis von I zu I0 beschreiben, s. Gl (3.4).
(3.4)
Somit ergibt sich aus Gl. (3.3) und Gl. (3.4) die Gl. (3.5).
(3.5)
3.1.3.2 Transflexion
Die Transflexionssonde leitet sich von der Transmissionssonde ab, und misst nach dem
gleichen Prinzip. Allerdings durchstrahlt hier der Lichtstrahl nach einer ersten Transmission
ein zweites Mal die Probenlösung, da dieser mit Hilfe einer Reflexionsfläche zurückgelenkt
Sascha Princz
15
Grundlagen
wird [18]. Das Prinzip der Transflexion ist in Abb. 6 veranschaulicht. Die meisten
Transflexionssonden besitzen einen verstellbaren physikalischen Spalt, der Optische Pfad
bzw. die Schichtdicke entspricht also zweimal dem eingestellten physikalischen Spalt, siehe
auch Abb. 6.
Abb. 6: Prinzipskizze zur Transflexionssonde
Bei der Messung in klaren Flüssigkeiten gilt das Lambert Beer´sche Gesetz auch bei der
Transflexion analog zu den Gleichungen aus dem Kapitel 3.1.3.1 zur Transmission.
Da die Transflexionssonde häufig bei trüben (opaken) Flüssigkeiten (z. B. Fermenterbrühen)
eingesetzt wird reicht hier die Gesetzmäßigkeit des Lambert Beer´schen Gesetz allerdings
nicht aus [18]. Da es aufgrund der Partikel in der Lösung neben der Absorption auch zu einer
Streuung kommt, ist heute die Zweikonstantentheorie von Kubelka und Munk als
Modellvorstellung weitestgehend akzeptiert [18]. Die Funktion von Kubelka und Munk zeigt
Gl. (3.6).
(3.6)
Hierbei berechnet sich die Kubelka-Munk-Funktion F(R) aus den Absorptionskoeffizienten k
und Streukoeffizienten s bzw. der gemessenen Reflexion R bei einer unendlichen
Schichtdicke [18].
3.1.3.3 ATR
Die ATR (Attenuated Total Reflection, abgeschwächte Totalreflexion oder interne Reflexion
oder Multiple Internal Reflectance) tritt bei dem Übergang des Lichtes von einem optisch
dichteren Material (höherer Brechungsindex, hier ATR Kristall) in ein optisch dünneres
Medium (geringer Brechungsindex, hier Probenlösung) auf, wenn dabei der kritische Winkel
Sascha Princz
16
Grundlagen
(Einfallswinkel, s. a. Gl. (3.7)) überschritten wird. Es kommt also zu einer Totalreflexion,
allerdings dringt dabei der Lichtstrahl geringfügig in das optisch dünnere Medium ein und
bildet das sogenannte evaneszente Feld. Es kommt somit an jeder Reflexionsstelle des ATR
Kristalls zu einer Absorption durch die Probenlösung, deshalb auch die Bezeichnung
abgeschwächte Totalreflexion. Abb. 7 zeigt das Prinzip einer solchen ATR Sonde mit zwei
Reflexionsstellen.
Abb. 7: Prinzipskizze ATR Sonde
Die Berechnung des oben erwähnten kritischen Einfallwinkels θC aus dem Brechungsindex nP
der Probenlösung (Medium) und des ATR Kristalls nC zeigt Gl. (3.7) [18].
(3.7)
Abb. 8: Detail evaneszentes Feld der ATR Sonde
Die Berechnung der in Abb. 8 gezeigten Eigenschaften des evaneszenten Felds sind
nachfolgend erklärt.
Die Eindringtiefe Dp des evaneszenten Felds in die zu analysierende Probenlösung lässt sich
wie Gl. (3.8) zeigt aus der Wellenlänge im dichteren Medium λ1, dem Einfallswinkel θ sowie
den Brechungsindizes von ATR Kristall und Probenlösung berechnen [18].
Sascha Princz
17
Grundlagen
(3.8)
Die Anzahl der Reflexionen N ist vor allem abhängig von der Länge l und Dicke dK des
gewählten ATR Kristalls sowie dem Einfallswinkel α. Die Berechnung dieser Anzahl von
Reflexionen zeigt Gl. (3.9).
(3.9)
Mit Hilfe der aus Gl. (3.8) berechneten Eindringtiefe Dp und der aus Gl. (3.9) erhaltenen
Anzahl der Reflexionen N lässt sich nun die effektive Weglänge P eff des evaneszenten Feldes
nach Gl. (3.10) berechnen.
(3.10)
Die ATR Sonde eignet sich z. B. hervorragend zur Messung von Proben, die zu dick sind oder
mit zu hoher Absorption um in Transmission vermessen werden zu können [18], da keine
Einschränkung durch den Optischen Pfad besteht. Die ATR Sonde kommt im UV/ VIS, MIR
und bedingt auch im NIR zum Einsatz.
3.2 Chemometrie
„Der
Begriff
Chemometrie
bezeichnet
ganz
allgemein
die
Anwendung
statistischer
mathematischer Methoden auf die Analyse chemischer Daten, unabhängig von ihrem
Ursprung“ [2].
Wie die Abb.
9 zeigt, setzt
sich
die
Chemometrie
oder
Chemometrik
aus den
interdisziplinären Beziehungen der vier aufgeführten wissenschaftlichen Fachbereiche
zusammen [19]. Die Chemometrie wird oft als Interface zwischen der Mathematik und der
Chemie bezeichnet [19], allerdings spielen neben der richtigen Messtechnik (z. B.
Spektrometriesystem zur Erfassung relevanter Messdaten) auch die Informatik eine weitere
wichtige und entscheidende Rolle in der gegenwärtigen Chemometrie.
Sascha Princz
18
Grundlagen
Abb. 9: Übersicht der interdisziplinären Beziehungen in der Chemometrie, modifiziert nach [19]
Wie bereits erwähnt gewinnt man bei der NIRS in der Regel Spektren mit zum Teil starken
Überlagerungen
der
Absorptionsbanden
und
nur
einer
geringen
Abweichung
oder
Formänderungen dieser relevanten Banden der z. B. in einer Fermenterbrühe enthaltenen
Stoffe zueinander. Berücksichtigt man jetzt noch als weiteren Aspekt, dass bei der
Spektroskopie eine sehr große Menge an Daten in kürzester Zeit gewonnen wird, hat man
den Grund, warum zur Auswertung multivariate Methoden zum Einsatz kommen. Zur
Veranschaulichung folgendes Beispiel: Die Messung eines Spektrums bei dieser Arbeit liefert
bereits 1000 Werte (Wellenlängenbereich 1100–2100 nm, bei einer Messung pro nm),
geschieht dies für „nur“ 30 Probengemische bei einer zweimaligen Wiederholung erhält man
bereits 60000 Einzelwerte. Diese Analyse von großen und vor allem voneinander abhängigen
Datenmengen erfordert eine multivariate Datenanalyse. Eine weitere große Stärke der
chemometrischen Methoden besteht auch darin, dass sie gegenüber anderen statistischen
Methoden in der Lage sind auch mit viel weniger Messungen als Variablen zu funktionieren.
Zur Durchführung dieser Analyse bedient sich die Chemometrie der bekannten Verfahren der
multivariaten Datenanalyse. Nachfolgend sollen nur die am häufigsten zum Einsatz
kommenden oder gängigsten Verfahren vorgestellt werden. Darüber hinaus werden noch
verschiedene Möglichkeiten für eine eventuell notwendige Vorbehandlung der Spektren
(Kapitel 3.5.2) dargestellt und ein kurzer Einblick über chemometrische Software (Kapitel
3.2) gegeben.
3.2.1 Principal Component Analysis
Die Hauptkomponentenanalyse kurz PCA (Principal Component Analysis) hat als eines der
wichtigsten Ziele die Datenreduktion [20]. Man reduziert einen n-dimensionalen Raum auf
einen sehr viel kleineren m-dimensionalen Raum, unter Beibehaltung der in den
Sascha Princz
19
Grundlagen
Ursprungsdaten enthaltenen größten Informationen [21]. Dabei werden stark korrelierende
Variablen (z. B. Messwerte) zu den sogenannten Hauptkomponenten (PC, Principal
Component) oder latente Variablen zusammengefasst, welche dann die Objekte (z. B.
Konzentrationen) beschreiben [20, 21]. Zur Berechnung der Hauptkomponenten gibt es
mehrere mathematische Möglichkeiten [20]. Häufig wird dazu die Datenmatrix X in die
quadratische Kovarianzmatrix überführt [20] die symmetrisch und positiv definit ist. Anhand
dieser Matrix erfolgt dann die Eigenwertberechnung [20]. Eine andere Bestimmung der
Hauptkomponenten besteht in der Suche nach der maximalen Varianz in den Ausgangsdaten
[20]. Die Richtung der maximalen Varianz in den Daten liefert immer die erste
Hauptkomponente und die zweitgrößte Varianz liefert die zweite Hauptkomponente, usw.
Diese steht senkrecht auf der ersten
Hauptkomponente, da die unterschiedlichen
Hauptkomponenten (als Eigenvektoren der symmetrischen Kovarianzmatrix) orthogonal
zueinander sind [19, 21]. Die Schwierigkeit und auch die größte Fehleranfälligkeit des
Modells liegen in der Anzahl der berechneten und für das Modell verwendeten
Hauptkomponenten. Bei einer zu geringen Anzahl von Hauptkomponenten spricht man von
einem „Underfitting“, es kommt zu einer unzureichenden Beschreibung der Daten [21, 22].
Bei
einem
„Overfitting“
besteht
dagegen
die
Gefahr,
dass
nichtgewollte
zufällige
Informationen wie z. B. Rauschen oder zufällige Fehler mit in das Modell einbezogen werden
[21, 22].
Die Ergebnisse einer PCA lassen sich wie in Tabelle 7 gezeigt zusammenfassen.
Tabelle 7: Zusammenfassung der Ergebnisse einer PCA; modifiziert nach [18]
Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse
Sascha Princz

Datenreduktion und Vereinfachung

Datenmodellierung

Erkennen von Ausreißern

Auswahl von Variablen („variable selection“)

Klassifizierung der Objekte

Vorhersage

„Entmischen“ von Informationen (Curve Resolution)
20
Grundlagen
3.2.1.1 Mathematisches Modell der PCA
Aus mathematischer Sicht handelt es sich bei der Hauptkomponentenanalyse um die Lösung
eines Eigenwertproblems, also um ein gängiges Verfahren der linearen Algebra [20]. Gl.
(3.11) zeigt die allgemeine Gleichung für die Hauptkomponentenanalyse [20].
(3.11)
In Abb. 10 ist die Zerlegung der mittenzentrierten (s. Kapitel 3.5.2.1) Datenmatrix X gezeigt.
Die Datenmatrix X beinhaltet alle Proben in Form der Objekte in den Zeilen N und deren
Eigenschaften in den Spalten M (beinhaltet alle Merkmale oder Variablen). Diese Datenmatrix
X wird in die Gewichts- oder Scoresmatrix T, die Faktoren- oder Hauptkomponentenmatrix
PT und die Residuenmatrix E zerlegt [20].
Abb. 10: Schematische Darstellung der Matrizen einer PCA; modifiziert nach [20, 23]
Die Gewichtsmatrix T beinhaltet alle Scores oder Faktorenwerte, d. h. für jedes Objekt und
berücksichtigte Hauptkomponente A steht dort der Koordinatenwert zu der entsprechenden
Hauptkomponente [20]. Aus diesem Grund besitzt die Matrix T exakt so viele Zeilen N wie
die Datenmatrix X und die Anzahl ihrer Spalten A ist durch die Zahl der berücksichtigten
Hauptkomponenten festgelegt [20].
Die Hauptkomponenten stehen in den Spalten der Matrix P. Die Faktoren- oder
Hauptkomponentenmatrix PT ist die transponierte Matrix von P und besitzt die gleiche
Anzahl an Zeilen A wie Hauptkomponenten berücksichtigt werden, die Anzahl der Spalten M
entspricht der Anzahl der Spalten der Datenmatrix [20].
Sascha Princz
21
Grundlagen
Da mit Hilfe der PCA eine Datenreduzierung erreicht werden soll, ist die Zahl der
Hauptkomponenten A meist kleiner als die Anzahl der Spalten M (Variablen) der Datenmatrix
X. Die Residuenmatrix E besitzt die gleiche Anzahl an Spalten M und Zeilen N wie die
Datenmatrix X und beinhaltet die Differenz zwischen der Datenmatrix X und der über die
Gewichtsmatrix T und Hauptkomponentenmatrix PT reproduzierbaren Datenmatrix X' [20].
Die Informationen, die eine PCA liefert sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
Tabelle 8: Zusammenfassung der durch eine PCA erhaltenen Informationen; modifiziert nach [18]
Informationen der Hauptkomponentenanalyse

Hauptkomponenten beinhalten die Hauptveränderung der
Daten, werden auch latente Variablen, Eigenvektoren oder
Faktoren genannt, bilden die neuen Hauptachsen

Loadings geben die Zahlenwerte der neuen Hauptachsen
(Koordinatenachsen) an, die für den Datensatz berechnet
werden

Scores sind die Koordinatenwerte für jedes einzelne Objekt
bezogen auf die neuen Hauptachsen
Die PCA hat eine Einordnung oder Klassifizierung der Daten zum Ziel [20]. Ein zweites Ziel
der multivariaten Datenanalyse oder Chemometrie liegt in der Kalibration, also z. B. der
Vorhersage unbekannter Konzentrationen anhand aufgezeichneter Spektren. Für eine
Vorhersage kommen Methoden der multivariaten Regression zum Einsatz wie z. B die PCR
(Principal Component Regression), die aus einer Verbindung der multiplen linearen
Regression (MLR) und der PCA besteht, oder die Partial Least Squares Regression (PLSR) [20].
Da im Rahmen dieser Arbeit keine PCR durchgeführt wird, soll darauf auch nicht näher
eingegangen werden, eine genaue Beschreibung findet sich aber in [20].
3.2.2 Partial Least Squares Regression
In der Chemie und Spektroskopie hat sich die PLSR, die meist nur als PLS bezeichnet wird, als
Standardmethode für die multivariate Regression durchgesetzt [20]. Vor allem die NIRS
führte zu einer weiten Verbreitung der PLS, da es damit möglich war komplette NIR-Spektren
mit Konzentrationen von chemischen Stoffen ohne große Mühe zu kalibrieren [20].
Der Vorteil der PLS gegenüber der MLR liegt darin begründet, dass bei der PLS die x-Daten
(Messwerte, z. B. Spektren) hoch korreliert und interkorreliert sein dürfen (ist bei Spektren
Sascha Princz
22
Grundlagen
immer der Fall) und die PLS auch trotz einer geringeren Anzahl an Messungen als
Spektrenwerten gerechnet werden kann [21]. Vergleicht man die PLS mit der PCR, so zeigt
sich, dass der wesentliche Unterschied in der Bestimmung der Komponenten (Faktoren) liegt.
Bei der PLS wird zur Bestimmung der Komponenten für die x-Daten bereits die Struktur der
y-Daten mit einbezogen [19], so dass diese Komponenten bereits stärker mit der Zielgröße
verknüpft sind [21]. Dies hat darüber hinaus noch den Vorteil, dass bei gleichbleibender
Modellgüte in der Regel ein mit Hilfe der PLS erstelltes Modell weniger Hauptkomponenten
als ein PCR-Modell benötigt und somit eine leichtere Interpretation der Ergebnisse möglich
ist [19, 20, 21]. Das bereits unter Kapitel 3.2.1 erwähnte Problem des „Over-“ und
„Underfitting“ bleibt auch hier bestehen [21].
3.2.2.1 Mathematisches Modell der PLS
Bei der Durchführung einer PLS gibt es zwei Ansätze, die sich nur in der Anzahl der
verwendeten Zielgrößen y unterscheiden. Verwendet man bei der Erstellung eines Modells
nur eine Zielgröße y (z. B. Ethanolgehalt) und viele Messwerte X (z. B. Spektren) so spricht
man von einer PLS1 [20]. Verwendet man allerdings mehrere Zielgrößen y (z. B. Ethanol-,
Glucose-, Wassergehalt, usw.) in einem Modell gleichzeitig, spricht man von einer PLS2 [20].
Eine schematische Darstellung zur PLS zeigt Abb. 11. Auch hier kommt es zunächst ähnlich
der PCA zu einer Zerlegung der Datenmatrix X in die Scoresmatrix T und die
Komponentenmatrix PT (vgl. Kapitel 3.2.1.1 und Gl. (3.11)). Darüber hinaus erfolgt noch eine
Zerlegung der Zielgrößenmatrix Y in die Scoresmatrix U, die Komponentenmatrix QT und
Residuenmatrix F, siehe auch Gl. (3.12).
(3.12)
Dabei muss die Zielgrößenmatrix Y die gleiche Anzahl an Zeilen N wie die Datenmatrix X
besitzen (jedes Objekt in X muss in Y eine Zielgröße haben), die Zahl der Spalten K kann
beliebig sein (abhängig von der Anzahl der gemessenen Zielgrößen (z. B. Konzentrationen
verschiedener Stoffe) pro Objekt) [20]. Die Residuenmatrix F hat die gleiche Dimension wie Y
(N Zeilen und K Spalten) und entspricht der Residuenmatrix E. Die Scores befinden sich in
der Gewichtsmatrix U und die entsprechenden Loadings in der Komponentenmatrix QT (A
Zeilen und K Spalten) [20].
Sascha Princz
23
Grundlagen
Abb. 11: Schematische Darstellung der Matrizen einer PLS; modifiziert nach [20, 23]
Die Besonderheit oder Idee der PLS ist allerdings die zuvor erwähnte Verknüpfung oder
Informationsaustausch beider Seiten miteinander bereits während der jeweiligen Zerlegung
der X- und Y-Matrix. Diese Verbindung der Datenräume ist in Abb. 11 als grüner Pfeil
dargestellt
und
lässt
sich
mit
Gl.
(3.13)
beschreiben,
wobei
B
die
Matrix
der
Regressionskoeffizienten ist [23, 24].
(3.13)
Die Verbindung der beiden Datenräume (X-Matrix mit Y-Matrix) erfolgt also über die ScoreVektoren von U mit denen von T und ermöglicht somit nach Erstellung eines PLSKalibriermodells die Berechnung der Zielgröße Yunb für unbekannte Objekte aus gemessenen
X-Werten [18] nach Gl. (3.14) [24].
(3.14)
Zur Vollständigkeit muss zur Abb. 11 noch gesagt werden, dass bei der PLS1 an der Stelle
der Matrizen Y, Q und F die Vektoren y, q und f treten [18]. Der Grund liegt wie bereits
erwähnt darin, dass bei der PLS1 die Regression nur für eine Zielgröße y (z. B. die
Konzentration von Ethanol) erfolgt.
Sascha Princz
24
Grundlagen
3.2.3 Beispiel PCA und PLS
Nachfolgend sollen die in Kapitel 3.2.1 und Kapitel 3.2.2 vorgestellte PCA und PLS mit Hilfe
eines Beispiels veranschaulicht werden. Hierzu wurde ein unrealistisches Zahlenbeispiel, mit
Bezug auf die in dieser Arbeit betreffenden Systematik, erstellt und mit Hilfe des „The
Unscrambler“ durchgerechnet. Die Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt.
Zunächst erfolgt eine Aufzeichnung von Spektren, hierzu werden 5 Messungen (M1-M5)
über einen Bereich von 5 Wellenlängen (λ1-λ5) analysiert. Siehe dazu auch Abb. 12.
Abb. 12: Spektren der 5 Messungen über 5 Wellenlängen
In einem zweiten Schritt erfolgt die Erstellung einer 5x5 Matrix, die die Messwerte der 5
Messungen über die 5 Wellenlängen enthält (s. Abb. 13). Die Dimension der Matrix wird
somit von der Anzahl der Messungen und Anzahl der Wellenlängen vorgegeben. Diese Matrix
entspricht der Matrix X in Abb. 10.
Abb. 13: Matrix der 5 Messungen über 5 Wellenlängen, entspricht der X-Matrix
Nach der Durchführung einer PCA liefert „The Unscrambler“ das in Abb. 14 gezeigte Ergebnis
in Form der Gewichtsmatrix (Faktorenwerte, Scores). Entspricht der Gewichtsmatrix T in Abb.
10. Die Dimension mit 3x5 ergibt sich hier aus der Anzahl der Hauptkomponenten (PC1PC3) und den Messungen (M1-M5).
Sascha Princz
25
Grundlagen
Abb. 14: Gewichtsmatrix T der X-Matrix nach einer PCA
Neben der Gewichtsmatrix T erhält man durch die PCA auch die in Abb. 15 gezeigte
Hauptkomponentenmatrix (Faktorenladungen, Loadings). Diese entspricht in Abb. 10 der
Matrix PT und erhält ihre 5x3 Dimension durch die Anzahl der Wellenlängen (λ1-λ5) und der
Anzahl der Hauptkomponenten (PC1-PC3).
Abb. 15: Hauptkomponentenmatrix PT der X-Matrix nach einer PCA
Ebenfalls durch die PCA erhält man die in Abb. 16 gezeigte Residuenmatrix E. Diese hat wie
die Ausgangsmatrix X eine 5x5 Dimension.
Abb. 16: Residuenmatrix E der X-Matrix nach einer PCA
Neben den Daten aus der in Abb. 13 gezeigten X-Matrix benötigt man für eine PLS eine
weitere Matrix. Diese Y-Matrix (vgl. Abb. 11) enthält z. B. Daten zu den einzelnen
Stoffkonzentrationen eines spektral vermessenen Gemischs (K1-Kn). Diese Daten werden
z. B. mit Hilfe einer geeigneten Referenzanalytik gewonnen und für jedes spektral
vermessene
Gemisch
durchgeführt
(RM1-RM5).
Mögliche
Ergebnisse
aus
einer
Referenzanalytik für 2 Stoffkonzentrationen (K1, K2) zeigt Abb. 17, hierbei stehen RM1-RM5
analog für die 5 Messungen aus Abb. 12.
Abb. 17: Daten aus einer Referenzanalytik für zwei Stoffe eines Gemischs
Sascha Princz
26
Grundlagen
Diese Daten werden nun in die in Abb. 18 gezeigte Matrix überführt. Diese Matrix entspricht
der Y-Matrix in Abb. 11. Ihre Dimension mit 2x5 resultiert aus der Anzahl der analysierten
Proben (RM1-RM5) und der Anzahl der analysierten Stoffkonzentrationen (K1-K2).
Abb. 18: Matrix der 5 Referenzmessungen 2er Stoffe, entspricht der Y-Matrix
Erfolgt die Durchführung einer PLS über beide (oder mehrere) Konzentrationen, handelt es
sich um eine PLS2. Verwendet man dahingegen nur eine Konzentration, spricht man von
einer PLS1 (dabei tritt an die Stelle der Y-Matrix ein y-Vektor, der z. B. nur die Daten für K1
über die 5 Referenzmessungen enthält). Die nachfolgend dargestellten Ergebnisse für eine
PLS1 wurden wiederum mit dem „The Unscrambler“ erzielt.
Zunächst erfolgt mit Hilfe einer PLS die Zerlegung der X-Matrix in die in Abb. 19 gezeigte
Gewichtsmatrix T,
Abb. 19: Gewichtsmatrix T der X-Matrix nach einer PLS
der in Abb. 20 gezeigten Komponentenmatrix PT
Abb. 20: Faktorenmatrix PT der X-Matrix nach einer PLS
sowie der in Abb. 21 gezeigten Residuenmatrix E. Vergleiche dazu auch Abb. 11.
Abb. 21: Residuenmatrix E der X-Matrix nach einer PLS
Sascha Princz
27
Grundlagen
Nachfolgend soll die Zerlegung der Y-Matrix durch eine PLS dargestellt werden. Wie bereits
erwähnt soll hier nur ein Beispiel für eine PLS1 gezeigt werden, deshalb handelt es sich
genauer um einen y-Vektor. Diesen Vektor zeigt Abb. 22.
Abb. 22: y-Vektor der Konzentration K1 über 5 (Referenz)Messungen für die PLS
Nach der Durchführung einer PLS1 liefert „The Unscrambler“ das in Abb. 23 gezeigte
Ergebnis in Form der Gewichtsmatrix. Entspricht der Gewichtsmatrix U in Abb. 11. Die
Dimension mit 3x5 ergibt sich hier aus der Anzahl der Faktoren (1-3) und den Messungen
(M1-M5).
Abb. 23: Gewichtsmatrix U der Y-Matrix bzw. des y-Vektors nach einer PLS
Neben der Gewichtsmatrix U erhält man durch die PLS auch den in Abb. 24 gezeigten
Faktorenvektor qT (entspricht Faktorenmatrix QT bei einer PLS2). Dies entspricht in Abb. 11
der Matrix QT. Die Dimension wird durch die Anzahl der Konzentrationen (K1-Kn) sowie der
Anzahl der Faktoren bestimmt.
Abb. 24: qT-Vektor (bzw. Faktorenmatrix QT) des y-Vektors (bzw. Y-Matrix) nach einer PLS
Ebenfalls durch die PLS erhält man den in Abb. 25 gezeigten Residuenvektor f (entspricht bei
einer PLS2 der in Abb. 11 gezeigten Residuenmatrix F). Dieser besitzt dieselbe Dimension
wie der Ausgangsvektor y oder die Ausgangsmatrix Y.
Abb. 25: Residuenvektor f (bzw. Residuenmatrix F) des y-Vektors (bzw. Y-Matrix) nach einer PLS
Sascha Princz
28
Grundlagen
3.3 Versuchsplan/ DOE
Bevor man mit einer Versuchsreihe oder Messreihe beginnt ist es vorteilhaft einen
Versuchsplan oder ein Design of Experiment (DOE) zu erstellen. So ist das Sammeln von
Proben vor allem direkt während der Produktion aber auch das spezielle Erstellen von Proben
im Labor meist mit hohem Zeitaufwand und hohen Kosten verbunden. Allein schon um solch
eine unnötige Ressourcenverschwendung im Bezug auf Zeit, Kosten und Material zu
vermeiden sollte ein DOE erstellt werden. Kurz gesagt mit einem geringen Aufwand das
bestmöglichste Ergebnis erzielen bzw. soviel Informationen wie möglich zu erhalten [18].
Weitere sehr wichtige Vorteile liegen in der Tatsache, dass die Erstellung eines
Kalibriermodells, genauer dessen Güte bzw. Qualität zum einen abhängig ist von der
gewählten Referenzanalytik und zum anderen von dem Versuchsplan oder DOE. Bereits bei
Erstellung eines Versuchsplanes muss darauf geachtet werden, dass alle relevanten Faktoren
in ausreichender Variation bzw. Kombination zur Erstellung eines Kalibriermodells eingehen.
Des Weiteren bietet sich die Möglichkeit mit Hilfe eines geeigneten Versuchsplans:
systematische Fehler schneller zu entdecken oder zu vermeiden, eine symmetrische
Anordnung in Bezug auf die Faktorkombinationen und Wiederholung von Experimenten zu
erhalten,
einer
randomisierten
Versuchsdurchführung
sowie
einer
Blockbildung
zur
Erkennung von unkontrollierten Faktoren [25].
Zur Erstellung eines Versuchsplans gibt es verschiedene Methoden bzw. Modelle, eine
Übersicht zu den verschiedenen Arten von Versuchsplänen liefert Abb. 26. Wie dort zu sehen
ist erfolgt die Zuordnung zum einen zu den zweistufigen Plänen oder Screening Designs,
hierbei variiert man die mögliche Faktoreinstellungen lediglich auf zwei Stufen (z. B. + und ) und zum anderen zu den dreistufigen Plänen oder Response Surface Designs, hierbei
variiert man die mögliche Faktoreinstellungen mindestens auf drei Stufen (z. B. 0, +1 und 1) [25].
Sascha Princz
29
Grundlagen
Abb. 26: Übersicht zu möglichen Arten von Versuchsplänen, modifiziert nach [25]
Da im Rahmen dieser Arbeit zur Erstellung eines geeigneten Versuchsplans nur ein
Mischungsplan in Frage kommt, soll nachfolgend nur auf diesen näher eingegangen werden.
Weitere Informationen zu den anderen Arten von Versuchsplänen finden sich in der für
dieses Kapitel verwendeten Literatur [25].
3.3.1 Mischungspläne
Wie aus Abb. 26 zu entnehmen ist gehören die Mischungspläne zu den sogenannten
Response Surface Designs, bei diesen Methoden ist die Antwortfläche (z. B. Konzentration) in
Abhängigkeit der Faktoren (z. B. Mischungskomponenten) bekannt [25].
Wie Gl. (3.15) zeigt, tritt bei Mischungen die Besonderheit auf, dass sich die Anteile xi aller
Mischungskomponenten M zu 100% addieren oder auf die Summe 1 normiert sind, wobei
diese meist in Volumen-, Mol- oder Gewichtsanteilen definiert sind [25].
(3.15)
Die bekanntesten und wichtigsten Mischungspläne sind die sogenannten (H, D)-Gitterpläne
oder Lattice Design, wobei H für die Anzahl der Faktoren und D für die Anzahl der einzelnen
Faktorstufen steht. Abb. 27 zeigt das Beispiel eines auf 1 normierten (3,3) Gitterplanes mit
drei Faktoren (x1, x2, x3) und jeweils drei Faktorstufen (0,33, 0,66, 1). Die Berechnung der
Faktorstufen erfolgt dabei wie in Gl. (3.16) gezeigt [25].
Sascha Princz
30
Grundlagen
(3.16)
Abb. 27: Darstellung eines (3,3) Gitterplanes
Letztendlich berechnet sich die Anzahl der (Gitter-) Punkte nach Gl. (3.17) [25]. Die Anzahl
der Punkte liefert die Information, wie viel Kombinationen der Mischungskomponenten
sinnvoll sind, und gibt somit auch die Anzahl der notwendigen Versuche wieder.
(3.17)
Gl. (3.17) stammt aus dem Bereich der Kombinatorik und beschreibt ein Modell mit
Wiederholung (Zurücklegen) ohne eine Berücksichtigung der Reihenfolge. Sie lässt sich wie
folgt
erklären:
Man
wählt
aus
H-vielen
Kugeln
(entspricht
den
Faktoren,
z.
B.
Mischungskomponenten) genau D-viele (entspricht den Faktorstufen, Anzahl der Ziehungen)
aus mit Zurücklegen und ohne Berücksichtigung der Reihenfolge. Das Ziehen einer Kugel
bedeutet einen weiteren
Anteil der entsprechenden Mischungskomponente. So entspricht
z. B. die Ziehung <A, B, A>
Mischungskomponente A und
Mischungskomponente B,
genauso wie <B, A, A> usw.
3.3.2 Einschränkungen
Je nach Versuch kann es notwendig sein den Versuchsplan hinsichtlich des geplanten
Experiments individuell anzupassen. Dies kommt vor allem häufig bei Mischungsplänen vor,
da die einzelnen Komponenten (Faktoren) nicht beliebig kombiniert werden können oder
bestimmte
Faktorkombinationen
Sascha Princz
keinen
Sinn
machen.
Solche
Einschränkungen
von
31
Grundlagen
Faktorkombinationen beruhen meist auf den folgenden zwei Varianten. Das sind zum einen
in Gl. (3.18) dargestellte Einschränkungen die jeweils nur einen Faktor betreffen
(3.18)
und zum anderen können sich diese Einschränkungen auch auf eine Kombination von
Faktoren beziehen wie in Gl. (3.19) zu sehen ist [26].
(3.19)
3.4 Kalibrierung und Validierung
Die Vorgehensweise bei der Erarbeitung eines Kalibriermodells zur Analyse unbekannter
Proben ist in Abb. 28 schematisch und vereinfacht dargestellt. Zunächst bietet es sich an ein
Design of Experiment (DOE) oder Versuchsplan zur Durchführung der Generierung eines
Kalibriermodells zu erstellen. Anhand dieses Versuchsplans werden dann die geeigneten
Proben für die Kalibration gewählt. Diese Proben werden nun z. B. mittels der NIRS
vermessen und zusätzlich mit einer weiteren Referenzmethode analysiert. Daraus resultieren
dann zum einen die NIR-Spektren sowie die y-Daten, z. B. Konzentrationen, aus der
Referenzanalytik.
Abb. 28: schematische Darstellung zur Generierung eines Kalibriermodells
Mit den auf diesem Wege erhaltenen Daten kann anschließend z. B. mit Hilfe der in Kapitel
3.2.2 vorgestellten PLS ein entsprechendes Kalibriermodell erstellt werden. Nachdem ein
entsprechendes Kalibriermodell erstellt ist, kann nun wie in Abb. 29 dargestellt eine
Vorhersage von unbekannten y-Werten z. B. Konzentration durchgeführt werden. Dazu
werden die unbekannten Proben für die Analyse wieder mittels NIRS vermessen und die
resultierenden Spektren mit Hilfe des Kalibriermodells ausgewertet. Letztendlich erhält man
dann, wie in Kapitel 3.2.2.1 dargestellt die Daten für die y-Werte entsprechend dem
verwendeten Kalibriermodell.
Sascha Princz
32
Grundlagen
Abb. 29: schematische Darstellung zur Vorhersage
Da das Kalibriermodell unter anderem von der Anzahl der gewählten Hauptkomponenten
sowie
der
Methode
zur
Referenzanalytik
abhängig
ist,
ist
es
notwendig
dieses
Kalibriermodell im Hinblick auf dessen Funktionstauglichkeit zu beurteilen.
Laut DIN EN ISO 9000:2005 handelt es sich bei einer Validierung um die „Bestätigung durch
Bereitstellung eines objektiven Nachweises (…), dass die Anforderungen (…) für einen
spezifischen beabsichtigten Gebrauch oder eine spezifische beabsichtigte Anwendung erfüllt
worden sind“ [27]. Für eine Validierung in der multivariaten Datenanalyse unterscheidet man
folgende, in Tabelle 9 gezeigte Validierungsmethoden [20].
Tabelle 9: verschiedene Validierungsmethoden für die multivariate Datenanalyse; modifiziert nach [20]
Validierungsmethoden

Cross Validation, jedes Objekt ist an der Kalibrierung
und an der Validierung beteiligt

Test Set Validation, extra Objekte für die Kalibrierung
und extra Objekte für die Validierung

Die
Beurteilung
der
Leverage Correction, üblich bei MLR
Funktionstauglichkeit
kann
mit
verschiedenen
Methoden
zur
Überprüfung von Fehlergrößen bei der Erstellung eines Kalibriermodells erfolgen. Dabei
handelt es sich um folgende statistische Methoden:
3.4.1 Standardfehler der Kalibration
Der Standardfehler der Kalibration wird durch die Restvarianz nach der Kalibrierung
ausgedrückt und berechnet sich wie in Gl. (3.20) dargestellt für eine Kalibriergerade aus n
Stützpunkten [20]. Da jeder Regressionskoeffizient bi einen Freiheitsgrad verbraucht, ergibt
sich die Zahl der Freiheitsgrade im Nenner hier zu (n-2) [20]. Die gemessenen Werte sind mit
und die vorhergesagten Werte mit
abgekürzt.
(3.20)
Sascha Princz
33
Grundlagen
Für die Berechnung des Standardfehlers nach Gl. (3.20) ist es notwendig die Anzahl der
Freiheitsgrade zu wissen. Diese Anzahl lässt sich für die einfache Regression und MLR, durch
das Abziehen
der zu
berechnenden
Regressionskoeffizienten
von
der
Anzahl der
Kalibrierproben, einfach berechnen [20]. Da Aufgrund der PCA bei der multivariaten
Regression eine nicht bekannte Anzahl der Freiheitsgrade verloren geht, wird der
Standardfehler der Kalibration durch den mittleren quadratischen Fehler (Root Mean Square
Error, RMSE) als Fehlerangabe ersetzt [20].
3.4.2 Root Mean Square Error
Für die Berechnung des RMSE nach Gl. (3.23) muss zunächst die Fehlerquadratsumme PRESS
(Predicted Residual Sum of Squares) nach Gl. (3.21) berechnet werden. Es handelt sich bei
dem PRESS um die Quadratsumme der Residuen und gibt die Summe der Fehlerquadrate
zwischen den vorhergesagten Werten und gemessenen Werten (Referenzwerten) an [20, 25].
(3.21)
Im nächsten Schritt erfolgt die Berechnung der Restvarianz
(mittlere quadratische Fehler),
wobei im Nenner mit n die Anzahl der Proben steht, wie in Gl. (3.22) dargestellt [20].
(3.22)
Letztendlich kann dann nach Gl. (3.23) der RMSE berechnet werden, wobei keine
Freiheitsgrade subtrahiert werden, da deren Anzahl wie oben aufgeführt nicht bekannt ist
[20].
(3.23)
Meist erfolgt die Bezeichnung des mittleren quadratischen Fehlers bei der Kalibrierung als
RMSEC (RMSE Calibration) und der Validierung als RMSECV (RMSE Cross Validation) oder ohne
genaue Angabe der Validierungsmethode als RMSEP (RMSE Prediction) [20].
3.4.3 Standard Error
Als Standard Error (SE) versteht man die Standardabweichung der Residuen, bei dessen
Berechnung nach Gl. (3.25) zuvor der eventuell vorhandene systematische Fehler BIAS von
Sascha Princz
34
Grundlagen
den Residuen abgezogen wird [20]. Bei dem BIAS handelt es sich um den Mittelwert aller
Residuen, dessen Berechnung Gl. (3.24) zeigt [20].
(3.24)
Der BIAS liefert die Aussage wie gut eine Kalibrierung ist, und sollte bei einer guten
Kalibrierung sehr nahe bei null sein [20].
(3.25)
Die Bezeichnung des SE erfolgt analog zu der Bezeichnung des RMSE, also mit SECV (SE of
Cross Validation) oder SEP (SE of Prediction oder SE of Performance) bei der Validierung und
bei der Kalibrierung als SEC (SE of Calibration) [20]. Da wie bereits erwähnt der BIAS bei einer
guten Kalibrierung so gut wie null sein sollte, unterscheiden sich RMSEC und SEC nur
aufgrund des Nenners [20]. Unterscheiden sich bei der Validierung der RMSEP und SEP nicht
nur aufgrund des unterschiedlichen Nenners, liegt dies an einem BIAS, welcher von null
verschieden ist, und somit den Beweis für einen systematischen Fehler liefert [20].
3.4.4 Residualanalyse und Bestimmtheitsmaß
Das mit Gl. (3.26) berechnete Bestimmtheitsmaß R2 gibt den Anteil der erklärten Varianz an
[20], und liefert ein Maß für die Genauigkeit der vorhergesagten Werte im Vergleich zu den
Referenzwerten.
(3.26)
Um das Bestimmtheitsmaß zu erhalten erfolgt zunächst eine Streuungszerlegung [28], wobei
sich die Gesamtstreuung SQT (Sum of Squares Total) aus der Summe der erklärten Streuung
SQE (Sum of Squares Explained) und der Rest- oder Residualstreuung SQR (Sum of Squares
Residuals) bildet, siehe auch Gl. (3.27) [28].
(3.27)
Wenn alle vorhergesagten Werte gleich den Referenzwerten sind, liegen diese direkt auf der
Regressionsgeraden und die Residuen sind somit wie auch SQR gleich null. Man erhält also
Sascha Princz
35
Grundlagen
nach Gl. (3.26) ein Bestimmtheitsmaß von eins [28]. Ist dahingegen die SQE gleich null,
erhalten wir somit auch ein Bestimmtheitsmaß von null was für ein sehr schlechtes Modell
spricht [28]. Das Bestimmtheitsmaß kann demzufolge Werte zwischen null und eins
annehmen, wobei umso näher der Wert bei eins liegt desto geringer ist die Residualstreuung
SQR und umso besser das Modell [28]. Man hat also demzufolge mit Hilfe des
Bestimmtheitsmaßes eine Möglichkeit zur Aussage über die Güte eines Modells [28].
3.5 Spektrale Daten
Da es in der Spektroskopie in der Regel unüblich ist mit den gemessenen absoluten
Intensitäten zu arbeiten (Ausnahme Fluoreszenzspektren), erfolgt bereits bei der spektralen
Datenerfassung
zunächst
eine
Gewichtung
der
selbigen
mit
einer
anschließenden
Transformation [20]. Diese Gewichtung erfolgt bei der Spektroskopie, indem man die
gemessene Intensität I einer Probe durch die bei entsprechender Wellenlänge gemessene
Intensität I0 einer Referenzmessung dividiert. Man erhält somit je nach Messprinzip den Grad
der Transmission T oder der Reflexion R und die Werte sind somit wie Gl. (3.28) zeigt durch
die Referenz gewichtet [20].
(3.28)
Damit nun das Lambert Beer`sche Gesetz angewendet werden kann, müssen die
gemessenen Spektrenwerte proportional zur Konzentration sein. Dies erreicht man durch
eine Transformation der Transmissions- bzw. Reflexionsspektren in Absorptionsspektren
nach Gl. (3.29) [20].
(3.29)
Es muss allerdings beachtet werden, dass das Lambert Beer`sche Gesetz nur bei einer
Transmissionsmessung
von
klaren
Flüssigkeiten
uneingeschränkt
gilt.
Wird
eine
Reflexionsmessung durchgeführt kann T zwar durch R ersetzt werden, allerdings sind dann
nach Gl. (3.30) Konzentration und Absorption nur noch näherungsweise zueinander
proportional [20].
(3.30)
Deshalb sollte bei Transmissionsmessungen von trüben (opaken) Flüssigkeiten [18] oder an
Festkörpern nicht Gl. (3.29) sondern besser Gl. (3.6) nach Kubelka-Munk angewendet
Sascha Princz
36
Grundlagen
werden, da diese nicht nur die Absorptions- sondern auch die Streueffekte berücksichtigt
[20].
3.5.1 Geeigneter Spektral-/ Frequenzbereich
Bereits bei der Wahl der spektroskopischen Technik, wie z. B. der NIRS, wird eine erste
Einschränkung bzw. Auswahl im Bezug auf den zu messenden Wellenlängen- oder
Frequenzbereich getroffen. Da bei der Auswertung eines Spektrums z. B. mit Hilfe der PLS
stets die kompletten spektralen Datenpunkte zur Gewinnung von spektralen Informationen
bezüglich der Komponentenwerte herangezogen werden, lässt es sich leicht nachvollziehen,
dass spektrales Rauschen oder Absorptionsbanden von Störkomponenten diese Ergebnisse
verfälschen können [29]. Um nun zu verhindern, dass spektrale Strukturen, die nicht von den
relevanten Komponentenwerten stammen, interpretiert werden und somit die Ergebnisse der
Analyse verschlechtern, kann es von Vorteil sein solche Spektralbereiche
für die
Modellentwicklung nicht zu berücksichtigen [29]. Dabei kann es sehr oft hilfreich sein,
zunächst das komplette Spektrum zu analysieren und anschließend Bereiche, die eine
Verschlechterung des Modells verursachen, nicht zu berücksichtigen und gezielt nach
Bereichen zu suchen, die eine Verbesserung des Modells bewirken können [29].
3.5.2 Vorbehandlung von Spektren
Die aufgezeichneten Spektren sollten also zunächst immer mit ihren Rohdaten analysiert
werden und dann wird anhand der Ergebnisse evtl. eine Datenvorverarbeitung begründbar,
die letztendlich zu einer Verbesserung der Ergebnisse führen kann [20].
Eine entsprechende Datenvorbehandlung bietet neben der in Kapitel 3.5.1 vorgestellten
Auswahl eines geeigneten spektralen Bereichs eine weitere wichtige Vorgehensweise um eine
möglichst gute Form des Spektrums zu erhalten, welche z. B. der PLS erlaubt eine möglichst
gute Korrelation zwischen Konzentration- und Spektraldaten zu erstellen [29]. Hierbei ist
jedoch die Qualität der spektralen Rohdaten entscheidend dafür, welche Methoden für eine
sinnvolle Vorbehandlung in Betracht kommen. Nachfolgend sollen einige solche geeignete
Methoden für eine Vorbehandlung von Spektren vorgestellt werden.
An dieser Stelle soll zuvor noch angemerkt werden, dass eine Vorbehandlung der Daten
immer auch eine Veränderung bzw. Verfälschung dieser nach sich zieht und aus diesem
Grund zunächst immer angestrebt werden sollte eine bestmögliche Auswertung mittels der
Rohdaten, also ohne Datenvorbehandlung zu erreichen.
Sascha Princz
37
Grundlagen
3.5.2.1 Mittenzentrierung
Die Mittenzentrierung als Datenvorbehandlung wird in der Regel vor der Berechnung von
Scores und Loadings mit Hilfe einer PCA oder PLS durchgeführt, da somit die Scores und
Hauptkomponenten auf den Mittelwert bezogen werden und eine einfachere Interpretation
möglich wird [20]. Hierfür wird, wie Gl (3.31) zeigt, für jede Spalte der Originaldatenmatrix
der Mittelwert berechnet und von jedem Messwert der Spalte abgezogen [20]. Diese
Berechnung muss für alle Spalten der Messdatenmatrix durchgeführt werden.
(3.31)
3.5.2.2 Normierung
Im Wesentlichen erhalten Spektren die folgenden zwei wichtigen Informationen, zum einen
über die Höhe der einzelnen Banden und zum anderen deren strukturelle Information [29].
Bei einer Normierung von Spektren geht zwar die Information über die Höhe verloren, aber
die Information über die Struktur bleibt dagegen erhalten [29]. Zur Realisierung einer
Normierung stehen die nachfolgenden drei Methoden zur Auswahl.
Die Mathematik einer Normierung auf den Mittelwert zeigt Gl. (3.32), hierbei wird jeder
Spektrenwert
(z. B. gemessene Absorption bei entsprechender Wellenlänge k) auf den
Gesamtmittelwert des Spektrums normiert [20]. Dies hat zur Folge, dass z.B. systematische
Veränderungen
in
einem
Spektrum
ausgeglichen
werden
oder
zwei
Spektren
mit
verhältnismäßig gleichen Banden aber unterschiedlicher maximaler Intensität durch diese Art
der Normierung identisch werden [20].
(3.32)
Eine zweite Art der Normierung ist die in Gl. (3.33) gezeigte Vektornormierung auf die Länge
eins (Betrag-1-Norm) [20]. Durch die Division der Spektrenwerte ak durch den Betrag des
gesamten Spektrums erzielt man eine Normierung der Spektren auf den Betrag eins. Dies
bewirkt, dass alle Spektren, die in die gleiche Richtung zeigen, gleich lang werden und man
hat wiederum eine Möglichkeit systematische Veränderungen im Spektrum auszugleichen
[20].
Sascha Princz
38
Grundlagen
(3.33)
Die dritte Möglichkeit für eine Normierung von Absorptionsspektren ist die Min-MaxNormierung [29]. Hierbei wird zunächst der kleinste y-Wert gleich null gesetzt und im
Anschluss erfolgt eine Expansion der Spektren in y-Richtung bis der größte y-Wert bei 2
Absorptionseinheiten liegt [29].
Im Wesentlichen bleibt bei einer Normierung das Originalvorzeichen der Spektrenwerte und
somit das Aussehen bzw. die Spektrenform im Prinzip erhalten [20].
3.5.2.3 Glättung
Spektren können unter Umständen mit einem Rauschen behaftet sein, welches z. B. vom
Spektrometer selber verursacht werden kann. Bei diesem Rauschen handelt es sich somit um
ein Störsignal, welches vor allem gegenüber einem geringen spektroskopischen Signal einen
hohen Störeinfluss haben kann. Dieser unerwünschte Effekt kann mit Hilfe einer
sogenannten Glättung beseitigt werden [20].
Die einfachste Methode hierfür ist die Glättung über den gleitenden Mittelwert, wobei der
Grad der Glättung über die Intervallgröße (welche eine ungerade Zahl größer zwei sein muss)
bestimmt wird [20]. Um eine ausreichende Glättung zu erreichen muss also ein Intervall mit
geeigneter Größe gewählt werden. Hierbei muss allerdings darauf geachtet werden, dass es
nicht zu groß gewählt wird, damit Signaländerungen die kein Rauschen sind nicht auch
entfernt werden [20].
Um dieses Risiko zu verringert eignet sich eine Polynomglättung wie die Savitzky-GolayGlättung [20]. Diese Art der Glättung ist vor allem bei strukturierten Spektren bevorzugt
gegenüber der oben erwähnten Methode zu verwenden, da um die Struktur zu erhalten ein
relativ kleines Intervall notwendig ist was aber wie erwähnt bei der Glättung mit dem
gleitenden Mittelwert zu einer geringeren Glättung führt [20]. Auch bei der Polynomglättung
wird zunächst wieder eine Intervallgröße bestimmt durch deren Spektrenwerte (entsprechend
der Intervallgröße) dann in einem weiteren Schritt ein Polynom gefittet wird [20].
Hier sei noch erwähnt dass auch durch eine PCA eine Glättung erfolgen kann. Da bei einer
PCA zufällige Informationen wie das Rauschen erst in den höheren Hauptkomponenten
berücksichtigt
wird,
kann
bei
einer
Reproduktion
der
Spektren
ohne
diese
Hauptkomponenten das Rauschen eliminiert werden [20].
Sascha Princz
39
Grundlagen
3.5.2.4 Basislinienkorrektur
Mit
Hilfe
einer
Basislinienkorrektur
hat
man
z.
B.
die
Möglichkeit
eine
lineare
Basislinienverschiebung oder auch eine lineare Verkippung von Basislinienverschiebungen zu
eliminieren [29]. Die Ursachen, die letztendlich zu einer solchen Basislinienverschiebung
führen, können verschiedenster Natur sein. So sind neben unterschiedlichen Werten in der
Detektorverstärkung
[29],
Verunreinigungen,
Streuverluste
aber
auch
systematische
Probleme der Messapparatur für eine solche Verschiebung der Basislinie verantwortlich [20].
Da es sich hierbei lediglich um eine systematische Abweichung von der Grundlinie handelt
und keine chemische Informationen enthalten sind, kann diese mit Hilfe einer geeigneten
Basislinienkorrektur beseitigt werden [20].
Eine konstante Basislinienverschiebung kann durch eine Subtraktion eines konstanten
Offsets beseitigt werden, hierfür werden z. B. die Spektren linear so lange verschoben bis
der kleinste y-Wert auf null gesetzt ist [29]. Zunächst muss allerdings das über die
Wellenlänge x gemessene Spektrum
Information
durch die Summe der eigentlichen chemischen
und den auftretenden Störungen beschrieben werden [20]. Dies zeigt Gl.
(3.34) wobei, wie erwähnt, nur
den spektral interessanten Teil darstellt und die
Basislinienstörung von den restlichen Termen beschrieben wird [20].
(3.34)
Mit Hilfe eines solchen Modells kann nun das gemessene Spektrum entsprechend korrigiert
werden, in dem man davon das Basislinienmodell subtrahiert. Gl. (3.35) zeigt das Modell
eines Spektrums mit einer Basislinienverschiebung um einen konstanten Betrag
, was einer
Verschiebung um eine horizontale Linie entspricht [20]. Für die Korrektur muss hier
zunächst für jedes Spektrum entsprechend die Konstante
bestimmt werden und vom
gemessenen Spektrum subtrahiert werden [20]. Am geeignetsten ist es, wenn man zur
Bestimmung von
eine Wellenlänge wählt die keine chemische Information enthält und
somit auf null gesetzt werden kann [20]. Es erfolgt also eine Subtraktion eines konstanten
Offsets von dem gemessenen Spektrum [29].
(3.35)
Handelt es sich bei der Basislinienverschiebung um eine lineare Verkippung [29], wird zur
Korrektur ein lineares Modell, wie es Gl. (3.36) zeigt, benötigt [20]. Um die Steigung β zu
bestimmen werden nun zwei Bezugspunkte bzw. Wellenlängen benötigt [20], die keine
Sascha Princz
40
Grundlagen
relevante chemische Information besitzen und auf null gesetzt werden können. Es handelt
sich hierbei also um die Subtraktion einer Geraden [29].
(3.36)
3.5.2.5 Ableitung
Mit Hilfe der Ableitung eines Spektrums lassen sich Signale mit einem steilen Anstieg
gegenüber flachen Strukturen besser hervorheben, man kann also z. B. relativ kleine
scharfbandige Signale, die von einem relativ breiten oder hohen Untergrund überlagert sind,
trennen [29]. Darüber hinaus lässt sich durch eine Ableitung die spektrale Information
verstärken [20], so erhalten z. B. relativ breite Banden durch die Ableitung eine steilere Form
und können dadurch besser ausgewertet werden [29]. Allerdings gilt zu beachten, dass bei
der Ableitung die spektrale Form des Spektrums verloren geht und somit die Interpretation
in einer nachfolgenden PLS oder PCA erschwert [20].
Analog zu den zuvor erwähnten Argumenten hat man mit höheren Ableitungen die
Möglichkeit sogar extrem flache Strukturen aufzuwerten [29], allerdings wird auch mit jedem
Ableitungsschritt das Rauschen verstärkt und somit das Signal-Rausch-Verhältnis schlechter
[20]. Dies kann soweit führen, dass solche vorbehandelte Spektren zum Teil nur über einen
stark eingeschränkten Bereich ausgewertet werden können [29]. Um eine solche zusätzliche
Störung und damit verbundene Überlagerung des eigentlichen Spektrums [29] zu verhindern
sollten oder müssen verrauschte Spektren zunächst vor einer Ableitung geglättet werden.
Eine Vorgehensweise stellt eine Glättung während der Ableitung, z. B. durch das
Zusammenfassen mehrerer Datenpunkte zu einem Mittelwert und dessen anschließende
Ableitung, dar [20]. Da allerdings auch hier wie bei der Mittelung üblich spektrale
Informationen verloren gehen bietet sich als bessere Alternative eine Ableitung über ein
Polynomfit oder Savitzky-Golay-Ableitung an [20]. Hierbei erfolgt die Beschreibung des
gemessenen Spektrums durch ein Polynom des Grades n (s. a. Gl. (3.37)), allerdings gilt hier
die Polynomentwicklung nicht für das komplette Spektrum sondern nur für eine vom
Anwender festgelegte Anzahl von Datenpunkten bzw. Messwerten [20].
(3.37)
Dadurch erhält man ein Spektrum welches nun lokal durch das entsprechende Polynom
beschrieben wird [20] und somit den Anforderungen entsprechend oft abgeleitet werden
kann. Betrachtet man die erste Ableitung in Gl. (3.38) so zeigt sich, dass dadurch ein
Sascha Princz
41
Grundlagen
konstanter Offset eliminiert wird und mit der zweiten Ableitung in Gl. (3.39) werden
zusätzlich lineare Effekte entfernt [20].
(3.38)
(3.39)
Auch hier erfolgt, analog zur Glättung, eine Anpassung des Polynoms an die Datenpunkte
mit Hilfe eines Least Squares-Verfahrens und die abgeleiteten Werte lassen sich
entsprechend der Gl. (3.38) oder Gl. (3.39) aus dem Polynomfit bestimmen [20].
3.6 Software für Chemometrie
Wie in Kapitel 3.2 bereits angesprochen spielt in der Chemometrie das wissenschaftliche
Fachgebiet der Informatik ebenfalls eine bedeutende Rolle. So besteht z. B. neben der
Notwendigkeit einer geeigneten Spektrometersoftware auch das Verlangen nach einem
aussagekräftigen und einfach zu handhabenden Tool für die multivariate Datenanalyse.
Hierfür bietet der Markt bereits ein breites Feld kommerziell erwerblicher Software für die
Chemometrie, aber auch frei zugängliche Komponenten wie z. B. Toolboxen für eine
multivariate Datenanalyse mit Hilfe von MATLAB lassen sich finden. Nachfolgend soll jedoch
nur etwas näher auf die im Rahmen dieser Arbeit verwendete Software „The Unscrambler“ der
Firma CAMO Software AS aus Oslo Norwegen eingegangen werden.
Die für den chemometrischen Teil dieser Arbeit verwendete Software „The Unscrambler“
bietet neben umfangreichen Lösungen für die multivariate Datenanalyse weitere sinnvolle
Eigenschaften im Zusammenhang mit der Chemometrie [30], siehe auch Abb. 30.
Abb. 30: Eigenschaften der Software "The Unscrambler"; modifiziert nach [30]
So stehen dem Anwender im Rahmen der explorativen Datenanalyse unter anderem
Methoden
der
Sascha Princz
beschreibenden
Statistik
(wie
z.
B.
Box-Plot,
Standardabweichung,
42
Grundlagen
Kreuzkorrelation, usw.), PCA, MCR oder der Klassifizierung zur Verfügung [30]. Für eine
Regression hat man je nach Anforderung z. B. die Wahl zwischen einer MLR, PCR oder PLS
und kann eine Vorhersage der Y-Werte auf Basis von MLR, PLS oder PCR Modellen treffen.
Darüber hinaus kann bei diesen Methoden aber auch eine automatische Ausreißererkennung,
Datenvorbehandlung
(bei
Klassifizierung
und
Vorhersage)
oder
eine
interaktive
Modellerstellung durchgeführt werden [30]. Im Rahmen der Datenvorbehandlung kann unter
anderem zwischen Mittenzentrierung, Glättungen, Basislinienkorrekturen oder Methoden der
Normierung gewählt werden und für die Eigenschaft der statistischen Versuchsplanung
stehen die gängigsten Methoden wie z. B. Screening Designs, vollfaktorielle oder
teilfaktorielle Versuchspläne, usw. zur Verfügung [30]. Eine ausführliche Auflistung und
Beschreibung zu den kompletten Eigenschaften und Möglichkeiten, die „The Unscrambler“
bietet, finden sich in der für dieses Kapitel verwendeten Quelle [30].
3.7 Fermentation
Die Bezeichnung Fermentation leitet sich aus dem lateinischen Begriff „fermentum“ (für
Gärung) ab und kommt bereits seit Tausenden von Jahren in der menschlichen Kultur vor. So
z. B. in der Gärung von alkoholischen Getränken unter der Zuhilfenahme von Hefen oder der
Verarbeitung von Milchprodukten mit Hilfe von Mikroorganismen oder Enzymen. Der Begriff
Fermentation umfasst also alle biotechnischen Prozesse bei denen unter Zuhilfenahme von
Biokatalysatoren (Enzyme, Bakterien, Pilze, tierische und pflanzliche Zellen, …), unter
aeroben
oder
anaeroben
Bedingungen
Fremdprodukte,
Metaboliten
oder
Biomasse
produziert wird. Der biotechnische Prozess der Fermentation lässt sich heutzutage aus den
Bereichen der industriellen Produktion von Arznei-, Lebens- und Genussmitteln sowie der
Erzeugung von Biogas und –kraftstoff nicht mehr wegdenken, und spielt eine immer größer
werdende zentrale Rolle. In der Industrie erfolgt die Produktion solcher biotechnischen
Produkte in Bioreaktoren unter ständiger Überwachung und Regelung der wichtigsten
Prozessparameter (siehe auch Kapitel 3.7.3). Bei dem Begriff Bioreaktor handelt es sich um
ein Synonym für das Wort Fermenter und beschreibt im Wesentlichen einen abgegrenzten
Raum oder Apparat, in dem unter Anwesenheit und Mitwirkung eines Biokatalysators eine
Stoffumwandlung, also eine Fermentation stattfindet [31].
3.7.1 Fermentationsprozess
Der Ablauf eines Fermentationsprozess lässt sich im Wesentlichen in die drei nachfolgend
erklärten Schritte einteilen. Am Anfang steht mit dem als Upstreaming bezeichneten
Prozessschritt die komplette Vorbereitungsphase für die Fermentation. Hierunter fallen unter
Sascha Princz
43
Grundlagen
anderem das Ansetzen des Mediums für die Kultivierung, die Züchtung der Vorkultur sowie
die Sterilisation der Bauteile des Fermenters. Im anschließenden Prozess- oder Hauptschritt,
der Fermentation, kommt es dann zur eigentlichen biotechnischen Produktion des
entsprechenden Produktes unter kontrollierten und optimierten Prozessbedingungen. Beim
Downstreaming, dem dritten und letzten Schritt, erfolgt die Aufbereitung des gewünschten
Produktes. Hierbei wird das entsprechende Produkt zunächst aus der Fermenterbrühe isoliert
und nach einer anschließenden Konzentrierung erfolgt eine entsprechende Reinigung und
eine Konditionierung [31].
Der eigentliche Schritt, also die Fermentation selbst kann auf drei verschiedene Arten
ablaufen. Dazu zählen die Batch-Fermentation, die Fed-Batch-Fermentation sowie die
kontinuierliche Fermentation. Bei der Batch-Fermentation werden bereits zu Beginn einer
Fermentation das komplette Medium sowie der Biokatalysator zu gegeben. Es kommt also
während der Kultivierung zu keiner weiteren Zugabe oder Entnahme und somit wird z. B die
Gefahr einer Kontamination ausgeschlossen. Das Produkt wird erst am Ende der
Fermentation komplett entnommen. Die Fed-Batch-Fermentation ist im Grunde der BatchFermentation sehr ähnlich, allerdings erfolgt hier während der Fermentation z. B. eine
Zugabe des Kulturmediums. Wie der Name der kontinuierlichen Fermentation bereits verrät
kommt es bei dieser Art von Betrieb sowohl zu einer fortwährenden Zufütterung von Medium
als
auch
fortwährenden
Entnahme
des
Produktes
über
der
gesamten
Dauer
der
Fermentation.
Um den für die Fermentation verwendeten Biokatalysatoren ausreichend Nährstoffe in
entsprechender Form zur Verfügung zu stellen, kann zwischen zwei Arten von Kulturmedien
gewählt werden. Zum einen sind das die so genannten komplexen Medien. Bei dieser Art von
Medium ist die exakte Zusammensetzung der Inhaltsstoffe nicht genau definiert, da z. B.
Naturstoffe wie Maisquellwasser oder Hefeextrakt zur Herstellung dieser Medien verwendet
werden. Die zweite Art der Medien wird den synthetischen Medien zu geordnet. Hier werden
zur Herstellung keine Naturstoffe eingesetzt und somit ist die genaue chemische
Zusammensetzung und Menge der Inhaltsstoffe bekannt.
3.7.2 Fermentertechnik
Um das Ziel einer Fermentation, also die Produktion eines bestimmten Stoffes zu erreichen
muss für optimale Bedingungen während des Fermentationsprozess gesorgt werden. Neben
der Wahl der am besten geeigneten Prozessbedingungen, in Anhängigkeit zur gewünschten
Fermentation, spielt selbstverständlich auch die Wahl eines geeigneten Bioreaktors bzw.
Bioreaktorsystems eine entscheidende Rolle um eine optimale Prozessausbeute zu erzielen.
Sascha Princz
44
Grundlagen
Hierfür steht für die unterschiedlichsten Anwendungen eine Vielzahl der verschiedensten
Typen von Bioreaktoren zur Verfügung.
Je nach Art der Fermentation oder Anforderung der Biokatalysatoren können die
unterschiedlichsten
Bioreaktoren
zum
Einsatz
kommen.
Eine
kleine
Auswahl
der
verschiedenen Bioreaktortypen bilden z. B. Rührkesselreaktor, Airliftreaktor, geschüttelte
oder
gewippte
Reaktoren
sowie
Photobioreaktoren.
Diese
Bioreaktoren
können
selbstverständlich innerhalb der entsprechenden Typen z. B. in Form und Größe oder der
Rührtechnik weiter variieren. Finden bei der Fermentation z. B. wie in dieser Arbeit
verwendete Pilze ihren Einsatz als Biokatalysatoren werden in der Regel bevorzugt
Rührkesselreaktoren verwendet. Bei einer Kultivierung der empfindlicheren tierischen Zellen
handelt es sich in der Regel um nicht gerührte Reaktoren, da aufgrund des Rührens
resultierende mechanische Kräfte diese Zellen stark beschädigen oder sogar zerstören
würden.
Allen Typen gemein sind allerdings folgende Grundanforderungen: Es müssen optimale
physiologische und physikalische Bedingungen vorherrschen, d. h. der Bioreaktor muss so
dimensioniert sein, dass alle Stoffe oder die Temperatur über das Reaktorvolumen gleich
verteilt sind und somit kein Totraum entsteht. Beim Bau eines Bioreaktors müssen alle Teile,
die mit dem Medium und dem Biokatalysator in Berührung kommen, aus Materialien
gefertigt sein, die zum einen nicht toxisch sind und zum anderen mit dem Medium nicht in
Wechselwirkung treten können (falls möglich). Ein weiterer sehr wichtiger Punkt der allen
Bioreaktoren gemeinsam ist, ist die Sterilisierbarkeit. Es muss also möglich sein den
Bioreaktor sowie alle Bauteile, die mit Medium und Biokatalysator in Berührung kommen,
absolut keimfrei zu bekommen, da z. B. bei einer Fermentation von tierischen Zellen
unerwünschte Bakterien aufgrund ihres schnelleren Wachstums sehr schnell die Überhand
gewinnen würden. Da vor allem der letzte Punkt bei großen Bioreaktoren sehr zeitaufwendig
und kostenintensiv ist, geht der Trend in den letzten Jahren verstärkt zu so genannten
Einwegreaktorsystemen.
Ebenso
finden
sich
wesentliche
Unterschiede
in
der
Ausstattung
der
einzelnen
Bioreaktorsysteme im Bezug auf die zur Verfügung stehende Mess- & Regelungstechnik.
Dies hat letztendlich einen großen Einfluss auf den Umfang der möglichen Prozessanalytik
und Prozessregelung des genutzten Bioreaktorsystems.
Sascha Princz
45
Grundlagen
3.7.3 Prozessanalytik
Um die bereits erwähnten optimalen Bedingungen während einer Fermentation zu
überwachen und aufrecht erhalten zu können ist eine gut funktionierende und auf einander
abgestimmte Prozessanalytik notwendig. Diese Prozessanalytik gewährt nicht nur Einblick in
den
Fermentationsablauf
sondern
bietet neben
einer
notwendigen
Möglichkeit zur
Dokumentation bestimmter Prozessparameter, die z. B. von regulatorischer Seite gefordert
werden, auch die Chance über eine geeignete Regelungsstrategie bei der Abweichung von
einem optimalen Prozessverlauf korrigierend einzugreifen.
Diese Form der Prozessanalytik kann durch verschiedene Methoden realisiert werden. Es gibt
die Möglichkeit der Offline Prozessanalytik, hier erfolgen die entsprechenden Messungen
zeitverzögert, da die Proben zunächst aus dem Reaktor entnommen, aufbereitet und manuell
im Labor (z. B. mit Enzymtest) analysiert werden müssen. Eine schnellere Form der Offline
Analytik ist die Atline Prozessanalytik, hier werden die Proben unmittelbar nach der
Entnahme ausgewertet. Aufgrund der daraus resultierenden verzögerten Verfügbarkeit der
Ergebnisse eignet sich diese Methode nicht für eine schnelle Regelstrategie. Bei der Online
Prozessanalytik
erfolgt
die
Messung
der
interessierenden
Prozessparameter
in
der
Fermenterbrühe meist ohne signifikante Zeitverzögerung. Die Online Analytik kann auf zwei
Arten erfolgen, Ex situ und In situ. Ex situ z. B. mittels Bypass oder Durchflusszelle, dabei
wird die zu analysierende Probe aus dem Bioreaktor automatisch entnommen und ggf. nach
der Messung wieder zurückgeführt. Die vorher genannten Methoden können aber aufgrund
der Stoffwechseleigenschaften der Biokatalysatoren zu einer Verfälschung der Messwerte
führen, deshalb eignet sich am besten die sogenannte In situ oder Inline Methode. Die Inline
Prozessanalytik bietet die Möglichkeit der Messung relevanter Prozessparameter durch eine
entsprechende Sonde direkt in der Fermenterbrühe und liefert somit Messwerte in Echtzeit.
Da die Vorgänge während einer Fermentation nicht nur sehr komplex und nichtlinear sind
sondern auch noch zeitvariant, empfiehlt sich eine kontinuierliche Überwachung der
Prozessparameter in Form einer Inline Prozessanalytik. Dadurch erhält man neben einer
kontinuierlichen Prozessüberwachung zum Aufbau einer schnellen Regelstrategie, zur
Aufrechterhaltung der optimalen Prozessparameter, auch einen Einblick über den Verlauf
und aktuellen Stand einer Fermentation. Diese Informationen bieten eine sehr gute
Grundlage für eine prozessoptimierte Produktion mit hohem Qualitätsstandard, was
letztendlich zu einer Kosteneinsparung bei gleichbleibender oder sogar verbesserter
Produktqualität führen kann.
Sascha Princz
46
Grundlagen
3.8 Hefe-Saccharomyces cerevisiae
In der biotechnischen Produktion haben Hefen seit geraumer Zeit ein weitläufiges
Einsatzgebiet, welches von der Produktion rekombinanter Proteine wie Insulin bis zur
Herstellung von Lebensmitteln reicht. Aus diesem Hintergrund resultiert das gute Wissen
über die Physiologie und die Stoffwechselregulation der Hefen. Dieses Wissen und die
Tatsache,
dass
sie
einfach
und
sicher
zu
kultivieren
sind,
haben
sie
zu
den
Modellorganismen für die Ausbildung in der Biotechnologie gemacht. Die Reproduzierbarkeit
und Vorhersagbarkeit von Hefe-Fermentationsprozessen, und der Einsatz von virtuellen
Hefe-Fermentationen, liefern aussagekräftige Ergebnisse. [32]
3.8.1 Physiologie von Saccharomyces cerevisiae
Der Eukaryont Saccharomyces cerevisiae, oft auch als Back-, Bäcker- oder Bierhefe
bezeichnet, gehört zu den Sprossenpilzen (Ascomycet) und vermehrt sich wie der Name
bereits verrät überwiegenden durch Sprossung. Aufgrund seiner fakultativ anaeroben
Fähigkeit ist dieser Eukaryont in der Lage die benötigte Energie für sein Wachstum und seine
Vermehrung sowohl unter anaeroben als auch aeroben Bedingungen zu gewinnen. Die
Bierhefe gehört zu den obergärigen Hefen und wird unter anaeroben Bedingungen zur
Produktion von Ethanol genutzt. Eine aerobe Bedingung führt zu einer viel höheren
Energieausbeute für die Zelle und verursacht somit einen größeren Biomassezuwachs. Die
Vorzugstemperatur von Saccharomyces cerevisiae liegt bei etwa 28°C-32°C. Temperaturen
über 45°C führen zum Absterben dieser Hefezellen.
3.8.2 Stoffwechsel von Saccharomyces cerevisiae
Wie bereits erwähnt besitzt die Backhefe die Fähigkeit Energie auf verschiedene Art und
Weise zu gewinnen. Diese Fähigkeit hängt neben den Bedingungen, aerob oder anaerob,
auch von dem vorhandenen Angebot an Zucker (z. B. Glucose) als Kohlenhydratquelle ab.
Durch die flexible Anpassung der eukaryontischen Zelle an die jeweils vorherrschende
Umgebungsbedingung kann entweder Zucker oder Ethanol in Anwesenheit von Sauerstoff
veratmet, oder unter Abwesenheit von Sauerstoff Zucker zu Ethanol vergärt werden.
3.8.2.1 Oxidation von Glucose
Wie
bereits
erwähnt
Energieausbeute
Sascha Princz
und
liefert
die
somit
den
Atmung
größten
unter
aeroben
Bedingungen
Biomassezuwachs.
Es
die
erfolgt
höchste
also
eine
47
Grundlagen
Verstoffwechselung der Glucose unter Zuhilfenahme von Sauerstoff zu Kohlendioxid, Wasser
und Biomasse [33].
Die genaue Reaktionsgleichung für die Atmung der Hefezellen zeigt Gl. (3.40) unter Angabe
der Energieausbeute in Form von Adenosintriphosphat ATP:
C6H12O6
+ 6 O2
 6 CO2
+ 6 H2O
+ 36 ATP
Glucose
+ Sauerstoff
 Kohlendioxid
+ Wasser
+ ATP
(3.40)
3.8.2.2 Oxidation von Ethanol
Saccharomyces
cerevisiae
ist
zudem
in
der
Lage
bei
einer
ausreichenden
Sauerstoffversorgung und einem gleichzeitigen Mangel an Glucose das vorhandene Ethanol
als
Substrat
zu
verbrauchen.
Bei
dieser
Form
der
Atmung
erfolgt
also
eine
Verstoffwechselung von Ethanol unter Zuhilfenahme von Sauerstoff zu Kohlendioxid und
Wasser. Diese Affinität zu zwei Substraten (Glucose und Ethanol) wird auch als Diauxie
bezeichnet [33].
Die genaue Reaktionsgleichung für die Oxidation von Ethanol zeigt Gl. (3.41):
C2H5OH
+ 3 O2
 2 CO2
+ 3 H2O
Ethanol
+ Sauerstoff
 Kohlendioxid
+ Wasser
(3.41)
3.8.2.3 Crabtree-Effekt
Der so genannte Crabtree-Effekt tritt bei einer ausreichenden Sauerstoffzufuhr und einem zu
hohen Angebot an Zucker auf, es kommt zu einer aeroben Gärung. Dieser Effekt resultiert
aus einem Überangebot an Zucker, der nun in größerer Menge aufgenommen wird als er von
den Hefezellen zur Energiegewinnung veratmet werden kann. Dieser Zucker, der nicht durch
die Atmung verstoffwechselt wird, kann nun über die anaerobe Glykolyse in das reduzierte
Produkt Ethanol umgesetzt werden [33]. Die aerobe Gärung führt also neben einer
Ethanolbildung auch zu einer geringeren Biomasseausbeute aufgrund eines verminderten
Zellwachstums und ist somit bei einer Produktion von Biomasse nicht erwünscht. Dieser
Effekt lässt sich allerdings bei einer Fermentation im Batch-Betrieb nicht verhindern, Abhilfe
erhält man z. B. durch eine Fermentation im Fed-Batch-Betrieb (vgl. Kapitel 3.7).
Die genaue Reaktionsgleichung für den Crabtree-Effekt zeigt Gl. (3.42), die Informationen
für die stöchiometrischen Verhältnisse wurden aus [34] und [35] entnommen.
Sascha Princz
48
Grundlagen
C6H12O6
+ 0,25 O2
 2,16 CO2
+ 0,25 H2O
+ 1,92 C2H5OH
Glucose
+ Sauerstoff
 Kohlendioxid
+ Wasser
+ Ethanol
(3.42)
3.8.2.4 Pasteureffekt
Der grundlegende Unterschied zu den in den vorangegangenen Kapiteln beschriebenen
Arten der aeroben Energiegewinnung von Saccharomyces cerevisiae liegt in der Tatsache,
dass es sich hier um einen strikt anaeroben Prozess der Energiegewinnung handelt. Die
Bezeichnung Pasteureffekt führt auf Louis Pasteur zurück, welcher bereits im Jahre 1861
erkannte, dass die alkoholische Gärung unter dem Einfluss von Sauerstoff gehemmt wird.
Diese Form des Stoffwechsels von Saccharomyces cerevisiae hat neben einem stark
verringerten Biomassezuwachs auch eine geringe Energieausbeute zur Folge [33].
Die genaue Reaktionsgleichung für die anaerobe Gärung der Hefezellen zeigt Gl. (3.43) unter
Angabe der reduzierten Energieausbeute in Form von Adenosintriphosphat ATP:
C6H12O6
 2 CO2
+ 2 C2H5OH
+ 2 ATP
Glucose
 Kohlendioxid
+ Ethanol
+ ATP
Sascha Princz
(3.43)
49
Verwendete experimentelle Technik
4
In dem nachfolgenden Kapitel werden alle verwendeten Geräte und Materialien, die zur
Realisierung und Aufbau des NIR-Messsystems verwendet wurden, hinsichtlich ihrer
Beschaffenheit und Eignung aufgeführt und bewertet. Darüber hinaus werden auch die im
Rahmen der Vorarbeiten zum Aufbau des endgültigen Systems verwendeten Geräte und
Materialien kurz angesprochen und hinsichtlich ihrer Eignung bewertet.
4.1 Aufbau und Integration NIR-Messsystem
Vor der Vorstellung der einzelnen Apparaturen, soll zunächst ein Überblick über den Aufbau
des
Messsystems
selbst
sowie
dessen
mögliche
Integration
in
das
vorhandene
Bioprozesssystem der Hochschule Ulm gegeben werden. In Abb. 31 ist schematisch der
Messaufbau, bestehend aus einer Kopplung von Lichtquelle (Kapitel 4.4), NIR-Spektrometer
(Kapitel 4.2), Sonde mit integrierten Lichtleitfasern (Kapitel 4.3.1) sowie einem Rechner für
die Chemometrie und Spektrometersoftware dargestellt. Dabei sind zur Ansteuerung des
Shutters (Kapitel 4.4.2) Lichtquelle und Spektrometer direkt miteinander verbunden sowie
zur Absorptionsmessung indirekt über die Lichtleitfasern der Sonde. Zur Auswertung des
Messsignals ist letztendlich das Spektrometer an einen entsprechenden Rechner verlinkt.
Lichtquelle
Spektrometer
TIDAS
Rechner für
Chemometrie
Lichtleitfaser
Sonde
Steuer- &
Regeleinheit für das
Bioprozesssystem
Bioreaktor
Abb. 31: stark vereinfachte Skizze zur Integration des NIR-Messsystems in das Bioprozesssystem
Die Integration des Messsystems in das Bioprozesssystem erfolgt zum einen bereits durch
das direkte Einbringen der Immersionssonde in die Fermentationsbrühe, dabei dient die
Sascha Princz
50
Sonde als Schnittstelle zwischen Messsystem und Bioprozess. Eine weitere Form der
Integration kann durch eine Anbindung des Rechners zur chemometrischen Auswertung an
die Steuer- und Regeleinheit für das Bioprozesssystem erfolgen. Dadurch kann z. B. durch
Aufbau einer geeigneten Regelstrategie und einem über das Messsystem erhaltenen
Analysewert bei Bedarf korrigierend in den Bioprozess eingegriffen werden.
4.2 Spektrometer
Den Hauptteil des NIR-Messsystems bildet das in Abb. 32 gezeigte Spektrometer TIDAS S1000 MS-T50/16 der Firma J&M Analytik AG in Essingen. Dieses Spektrometer gehört zu den
in Kapitel 3.1.2.2 erklärten Dioden-Array-Spektrometern mit InGaAs als Halbleitermaterial
für die Dioden. Mit diesem Spektrometer lässt sich ein Wellenlängenbereich von 11002100 nm, entspricht in Wellenzahlen etwa dem Bereich von 9090,9-4761,9 cm-1, darstellen.
Das Spektrometer verfügt über keinen internen Shutter für die Dunkelstrommessung. Über
die verwendete Software TIDASDAQ V2.39 und einem TTL Ausgang des Spektrometers lässt
sich jedoch auf Wunsch ein externer Shutter ansteuern.
Abb. 32: Spektrometer TIDAS S-1000 MS-T50/16 der Firma J&M Analytik AG
Weitere Informationen zur Spezifikation des Spektrometers lassen sich aus Tabelle 10
entnehmen.
Tabelle 10: Spezifikationen des TIDAS S-1000 MS-T50/16 von J&M Analytik AG
Wellenlängenbereich
1100–2100 nm
Auflösungsvermögen
< 8 nm
Wellenlängenrichtigkeit
< 1 nm
Wellenlängenreproduzierbarkeit
< 0,1 nm
Detektortyp
InGaAs-Diodenzeile
Anzahl Pixel
256
Sascha Princz
51
Basisliniendrift
< 3*10-3 AU/h nach USP 1119
Signalrauschen
Max: < 0,8 mAU
Anschluss optisch
SMA 905
A/D Wandler
16 Bit
4.2.1 Spektrometer Software
Die Steuerung und Bedienung des in Kapitel 4.1 beschriebenen Spektrometers erfolgt mit
Hilfe der Software TIDASDAQ V2.39. Diese stammt, wie das Spektrometer, von der Firma J&M
Analytik
AG.
entsprechenden
Neben
der
Bedienung
Messungsparameter
des
Spektrometers
unterstützt
die
und
Software
der
das
Einstellung
der
Abspeichern
der
gemessenen Daten in die unter Tabelle 11 gelisteten vier Dateiformate.
Tabelle 11: Von TIDASDAQ V2.39 unterstützte Speicherformate
J&M Spectralys [*.uvd,*.3D]
Thermo Galactic Grams [*.SPC]
ASCII Table Data [*.txt]
ASCII Excel [*.csv]
Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe der Software und der entsprechenden Ausgänge am
Spektrometer auch externe Geräte, wie z. B. der bereits erwähnte Shutter anschließen und
steuern. Für die Auswertung der Spektren stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung,
welche je nach Art der Messung genutzt werden können. Hierfür besteht die Möglichkeit
eigene Berechnungsformeln zur Auswertung der Messungen zu hinterlegen. Eine weitere
sinnvolle und in diesem Zusammenhang genutzte Funktion ist das Abspeichern von
aufgezeichneten Referenzspektren und die Möglichkeit, diese zu jedem Zeitpunkt und
gewünschter Messung wieder zu laden.
4.3 Sensor und Messaufbau
Je nach verwendetem Messprinzip, welche unter Kapitel 3.1.3 bereits genauer beschrieben
sind, ist die Anforderung an den für die Messung der entsprechenden Probe verwendeten
Sonde bzw. Messaufbau eine andere. Im Folgenden sollen die für die im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführten Messprinzipien verwendete Sonde und Messaufbau genauer erklärt
werden.
4.3.1 Transflexion
Für die Messung nach dem Prinzip der Transflexion (s. a. Kapitel 3.1.3.2) wurde eine
Tauchsonde der Firma Avantes vom Typ FDP-7IR200-2-VAR verwendet. In Abb. 33 ist der
Sascha Princz
52
Aufbau dieser Tauchsonde (Pathlength stimmt mit der in dieser Arbeit verwendeten Sonde
nicht überein) schematisch dargestellt. Die Fasern dieser Tauchsonde sind für einen
Spektralbereich von 350-2000 nm ausgelegt und haben einen Durchmesser von 200 µm.
Zur Einkopplung des Lichtes dienen sechs Fasern und eine siebte Faser leitet das an der
diffusen weißen Fläche reflektierte Licht zum Spektrometer weiter.
Abb. 33: schematische Darstellung zur Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR [36]
Wie in Abb. 34 (a) zu sehen befindet sich die weiße Reflektionsfläche am Ende des
abnehmbaren Sondenaufsatzes. Durch die diffus reflektierende weiße Oberfläche wird das
Anregungslicht I0 mit der beim Durchgang durch die Probe abgeschwächten Intensität I
reflektiert (s. a. Abb. 34 (b)), und ermöglicht eine Bestimmung der Abschwächung der
elektromagnetischen Strahlung durch genau diese absorbierende Probe.
Abb. 34: (a) Sondenaufsatz mit diffuser Reflektionsfläche (b) vereinfachtes Messschema
Eine weitere Funktion dieses Sondenaufsatzes liegt in der Möglichkeit zur Verstellung des
optischen Weges. Der Abstand des Sondenaufsatzes, Abstand von Lichtaustrittsfläche zu
Reflektionsfläche, lässt sich je nach Gebrauch von 0,25-10 mm verändern. Somit hat man
Sascha Princz
53
die Möglichkeit, dass ein Optischer Weg bzw. Pfad zwischen 0,5-20 mm frei gewählt werden
kann.
Weitere Informationen zur Spezifikation der Tauchsonde lassen sich aus Tabelle 12
entnehmen.
Tabelle 12: Spezifikationen der FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes
Fasern
6 Lichtleitfasern, 1 Detektionsfaser, Ø 200 µm, Länge 2 m
350–2000 nm
Anschluss optisch
2 x SMA 905
Optischer Weg
0,5–20 mm (0,25–10 mm physischer Abstand)
Sonde
Edelstahl Zylinder, 150 mm Ø 12,7 mm, wasserdicht
Temperaturbereich
-30 °C bis +100 °C
Druck
Sondenkopf 10 bar @ 25 °C
Biegung (Fasern)
Minimaler Biegeradius: kurzzeitig 20 mm, langzeitig 120 mm
Die Integration dieser Tauchsonde in den kompletten Messaufbau zur Messung nach dem
Prinzip der Transflexion zeigt Abb. 35. Für diesen Messaufbau kommt neben der Lichtquelle,
dem Spektrometer, der Tauchsonde auch noch eine Temperiereinheit zum Einsatz.
Abb. 35: Messaufbau zur Transflexionsmessung
Nähere Angaben zu den einzelnen Bausteinen dieses Messaufbaus finden sich in den
entsprechenden Kapiteln.
Sascha Princz
54
4.3.2 Transmission
Für die Messung in Transmission wurde ein Aufbau mit dem in Abb. 36 (a) gezeigten
Küvettenhalter der Firma Linos und der in Abb. 36 (b) abgebildeten Quarzglasküvette von
Carl Zeiss verwirklicht. Diese Quarzglasküvetten aus QS eignen sich für diese Art von
Absorptionsmessungen sehr gut, da sie für den Einsatz bei Wellenlängen von 200–2500 nm
ausgelegt sind. Für die Messungen selbst wurde die zu messende Probe in die
Quarzglasküvette mit einer Schichtdicke von 1 mm gefüllt. Dies entspricht einem
Probenvolumen von 350 µl. Mittels eines Lichtleiters erfolgte dann die Einkopplung des
Lichtes in den Küvettenhalter und somit in die darin befindliche Quarzglasküvette mit der
entsprechenden Probenflüssigkeit. Nach dem Durchtritt des Lichtes durch Küvette und Probe
erfolgte die Weiterleitung zum Spektrometer mittels einer zweiten Lichtleitfaser.
Abb. 36: (a) Küvettenhalter von Linos
(b) Quarzglasküvette von Carl Zeiss
Die Integration des Küvettenhalters in den Messaufbau erfolgte anstelle der Tauchsonde.
4.4 Lichtquelle
Als Lichtquelle wurde die in Abb. 37 gezeigte luftgekühlte Halogenlampe AvaLight-Hal-S
von der Firma Avantes gewählt. Als Leuchtmittel dient eine 10 W Halogenglühlampe. Die
Auswahl für diese Lichtquelle lag natürlich zum einen in dem Wellenlängenbereich von 360–
2500 nm sowie in der ausgezeichneten Stabilität von ± 0,1 % der Lampe.
Sascha Princz
55
Abb. 37: Lichtquelle AvaLight-Hal-S von Avantes
Desweiteren besitzt die Lampe einen Filterhalter sowie einen integrierten Lampenshutter.
Dieser Shutter lässt sich über einen TTL Anschluss auch extern steuern. Die Steuerung des
Shutters erfolgt mittels einer TTL Verbindung zum Spektrometer und der Spektrometer
Software. Mittels eines internen Jumpers lässt sich die Nennleistung der Lampe ändern,
somit bietet diese Lichtquelle die Möglichkeit einer Variation der Optischen Leistung in drei
Stufen. Die relevanten Angaben bezüglich dieser drei Stufen finden sich in Tabelle 13.
Tabelle 13: Übersicht der 3 Variationen der Optischen Leistung der AvaLight-HAL-S
Jumper Einstellung
Optische Leistung
Farbtemperatur
Lebensdauer
Long Life
70 %
Ca. 2700 K
> 4000 h
Normal (default)
100 %
Ca. 2850 K
2000 h
High Power
150 %
Ca. 3000 K
< 1000 h
Für den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Gebrauch der Lampe wurde der Long Life
Modus gewählt. Dies entspricht einer Optischen Leistung von 70 %. Da sich nach Abschluss
diverser Vorversuche bezüglich der idealen Jumper Einstellung gezeigt hatte, dass die 70 %
Variation vollkommen ausreichend und am besten geeignet war. Dies hat neben dem Effekt
der idealen Abstimmung auf den Messaufbau einen zusätzlichen ökonomischen Vorteil, der
sich sowohl in einer verlängerten Lebensdauer des Leuchtmittels als auch in einer
Energieeinsparung wiederspiegelt.
Weitere Informationen zur Spezifikation der Lichtquelle, nur mit Bezug auf die 70 %
Einstellung, lassen sich aus Tabelle 14 entnehmen.
Tabelle 14: Spezifikationen der AvaLight-HAL-S der Firma Avantes im Long Life Modus
Stabilität
Stabilisierungszeit
Abgegebene Leistung (Leuchtmittel)
360–2500 nm
± 0,1 %
ca. 15 min
11,3 VDC/ 0,8 A
Lebensdauer (Leuchtmittel)
> 4000 h
Optische Leistung 200 µm Faser
0,35 mW
3,2 mW
Sascha Princz
56
7 mW
Farbtemperatur (Leuchtmittel)
2700 K
Spannungsversorgung
24 VDC/ 1,25 A
Abmessung
132x110x44 mm
4.4.1 Lichtleitfaser
Um
den
in
Kapitel
4.3.2
vorgestellten
Aufbau
zu
realisieren
mussten
geeignete
Lichtleitfasern verwendet werden. Es war zum einen eine Faser zur Einkopplung des Lichtes
in die zu messende Probe notwendig und zum anderen eine Faser, die das Licht nach dem
Durchgang durch die Probe für die Messung zum Spektrometer führt. Für den Einsatz in dem
zuvor erwähnten Aufbau zur Transmissionsmessung, wurden zwei baugleiche Fasern des
Herstellers Thorlabs gewählt, die sich lediglich im Faserdurchmesser unterscheiden. Beide
Fasern besitzen die Eignung für einen Wellenlängenbereich von 400–2200 nm und jeweils
zwei SMA905 Anschlüsse. Zur Leitung des Lichtes von der Lichtquelle zur Probe wurde ein
Kerndurchmesser von 1000 µm (M30L02) gewählt und für die Leitung des Lichtes von der
Probe zum Spektrometer ein Kerndurchmesser von 600 µm (M29L02).
Weitere Informationen zur Spezifikation der beiden Lichtleitfasern lassen sich aus Tabelle 15
entnehmen.
Tabelle 15: Spezifikationen der Lichtleitfasern von Thorlabs
Bezeichnung
Kerndurchmesser
Claddingdurchmesser
Manteldurchmesser
NA
M29L02
600 ± 10 µm
630 ± 10 µm
1040 ± 30 µm
0,39 ± 0,02
M30L02
1000 ± 15 µm
1030 ± 30 µm
1400 ± 50 µm
0,39 ± 0,02
4.4.2 Shutter
Ein Shutter hat die Aufgabe zu verhindern, dass elektromagnetische Strahlung auf den
Sensor zur Detektion im Spektrometer gelangt, um dort eine Messung des vom Spektrometer
verursachten
Dunkelstroms zu
ermöglichen.
Der
Shutter
für
das
hier vorgestellte
Messsystem befindet sich wie bereits erwähnt an der Lichtquelle und nicht am bzw. im
Spektrometer selbst. Bei diesem Shutter handelt es sich um einen mechanischen Shutter, der
direkt am Austritt des Lichtes, genauer vor dem Filterhalter und dem SMA905 Anschluss für
die Lichtleitfaser, angebracht ist. Die Bedienung dieses Shutters ist zum einen manuell an
der Lichtquelle selbst möglich oder aber, wie bereits erwähnt, extern über einen
vorhandenen TTL Anschluss.
Die Notwendigkeit eines Shutters liegt auf der Hand, da es sinnvoll ist zumindest vor jeder
Messung den Dunkelstrom für eine unumgängliche Dunkelstromkorrektur aufzuzeichnen.
Sascha Princz
57
Der Grund einer mehrmaligen Messung des Dunkelstromes beruht auf der Tatsache, dass
dieser über der Zeit Schwankungen unterworfen ist. Dass der Shutter nicht direkt im
Spektrometer angebracht ist, hat darüber hinaus noch den Vorteil, dass ein evtl. im
Messaufbau auftretendes Rauschen (zwischen Shutter und Spektrometer z. B. Lichtleiter,
Sensor) mit in die Dunkelstromkorrektur eingeht.
4.5 Temperiereinheit
Um eine gleichbleibende Qualität der Messergebnisse zu gewährleisten war es sinnvoll die
Messung der Proben bei einer gleichen und konstanten Temperatur durchzuführen. Dies ist
außerdem für die Verwendung der Messergebnisse in einem späteren Kalibriermodell zur
Online Messung im Bioreaktor sehr wichtig, da diese Daten bei gleicher Temperatur wie der
Betriebstemperatur des Bioreaktors aufgezeichnet werden müssen.
Dafür musste eine geeignete Apparatur verwendet werden, die zum einen eine sichere
konstante Temperierung der Probe mit einer gleichzeitigen Messung der Probentemperatur
gewährleistet, und zugleich eine Messung in der Probe nach dem Prinzip der Transflexion
ermöglicht.
Nachfolgend werden die einzelnen Komponenten der verwendeten Temperiereinheit
bezüglich ihrer Spezifikation dargestellt.
4.5.1 Magnetrührer mit Heizplatte
Die Temperierung der Proben erfolgte mit Hilfe eines Magnetrührers mit integrierter
Heizplatte. Dabei kam das Modell VMS-C-2 der Firma VWR zum Einsatz, welches durch die
Kombination von Heizplatte und Magnetrührer zum einen zu der erforderlichen Erwärmung
der Probe führt und zugleich für eine ausreichende Durchmischung der Probe sorgt. Diese
Umwälzung der Probe ist wichtig um ein Temperaturgefälle innerhalb der Probe zu
verhindern und somit eine bestmögliche homogene Temperierung der Probenflüssigkeit zu
gewährleisten.
Der VMS-C-2 verfügt über eine rückgekoppelte Mikroprozessorsteuerung für eine konstante
Soll-Temperatur
und
Drehzahl,
sowie
einer
Anschlussmöglichkeit
für
ein
Kontaktthermometer zur präzisen Temperaturregelung.
Weitere Informationen zur Spezifikation des VMS-C-2 lassen sich aus Tabelle 16 entnehmen.
Tabelle 16: Spezifikationen des VMS-C-2 der Firma VWR
Maximales Rührvolumen H2O
Drehzahlbereich
Sascha Princz
10 l
100 bis 1500 min-1
58
Temperaturbereich
50 bis 500 °C
Motorleistung Aufnahme/ Abgabe
15/ 1,5 W
Heizleistung
1000 W
Plattengröße
200x200 mm
BxTxH
220x330x105 mm
Gewicht
5 kg
Abb. 38 zeigt die oben genannte Magnetrührer-Heizplatten Kombination VMS-C-2 in
Verbindung mit dem in Kapitel 4.5.2 vorgestellten elektronischen Kontaktthermometer VT-5.
Abb. 38: Magnetrührer mit Heizplatte und Kontaktthermometer von VWR
4.5.2 Elektronisches Kontaktthermometer
Zur Sicherstellung einer genauen Temperaturkontrolle der Probe kam das ebenfalls in Abb.
38 gezeigte elektronische Kontaktthermometer VT-5 der Firma VWR zum Einsatz. Dies lässt
sich wie bereits erwähnt mit dem in Kapitel 4.5.1 beschriebenen VMS-C-2 verbinden und
sorgt für eine genaue Temperaturkontrolle und Aufrechterhaltung der Soll-Temperatur ohne
Temperaturspitzen.
Weitere Informationen zur Spezifikation des VT-5 lassen sich aus Tabelle 17 entnehmen.
Tabelle 17: Spezifikationen des VT-5 der Firma VWR
Sensortyp
PT 1000
Fühler
Edelstahl
Mess-/ Kontrollbereich
Messgenauigkeit
-50 °C bis +450 °C
±0,2 K (plus Fühlertoleranz PT 1000)
Auflösung
0,1 K
Regelgenauigkeit
0,1 K
Sascha Princz
59
Toleranz
±0,5 K
BxTxH
82x22x83 mm
Gewicht
0,2 kg
4.6 Laborfermenter der Hochschule Ulm
Die Hochschule Ulm besitzt einen Sieben-Liter-Laborfermenter der Firma Bioengineering,
welcher während einer Diplomarbeit im Jahr 2005 von Wilhelm Gruber [37] aufgebaut wurde.
Im Jahr 2010 erfolgte eine umfassende Erweiterung und Ausbau des bereits bestehenden
Systems. Zum einen wurde der Bioreaktor in diesem Rahmen um eine komplette
Abgasanalytik sowie um ein neues Regelungs- und Steuerungssystem während der
Bachelorarbeiten von Sascha Princz [38] und Andreas Zink [39] erweitert. In Abb. 39 ist der
Laborfermenter bereits mit den zuvor erwähnten Änderungen aus dem Jahr 2010 abgebildet.
Genauer ist dort der Laborfermenter mit seinem doppelwandigen Glaskessel sowie dem
zugehörigen Mess- und Regelungssystem während einer Hefefermentation dargestellt.
Abb. 39: 7 l Laborfermenter der Hochschule Ulm mit Erweiterungen aus 2010
Der Laborfermenter ermöglicht mittels seinem umfangreichen Mess- und Regelungssystem
die erforderliche Überwachung des Fermentationsprozesses sowie eine Anpassung bzw.
Regelung der für eine erfolgreiche Fermentation notwendigen Parameter. Die Ermittlung
dieser Prozessparameter erfolgt über die entsprechenden Sonden und deren Anpassung
bzw. Regelung über die entsprechende Technik bzw. Stellparameter. Ein Überblick über die
wichtigsten Prozessparameter, die ermittelt werden können, und die Technik zur Regelung
dieser Parameter zeigt Tabelle 18.
Sascha Princz
60
Tabelle 18: Erfassbare Prozessparameter und deren Technik zur Regelung des Laborfermenters der
Hochschule Ulm; modifiziert nach [39]
Prozessparameter
Technik zur Parameterregelung
Temperatur der Fermenterbrühe
wassertemperierter Mantel des Bioreaktors
Rührerdrehzahl des Magnetrührers
Steuerung des Magnetrührers
pH-Wert des Mediums
Zugabe von Lauge oder Säure über
Rollerpumpe
Optische Dichte (OD) der Fermenterbrühe
Sauerstoffpartialdruck
Rührerdrehzahl, Massendurchflussregler
(Gasfluss)
O2 & CO2 in der Abluft durch Abgasanalytik
Schaumbildung der Fermenterbrühe
Zugabe von Antischaum über Rollerpumpe
Volumenstrom der Begasung mit Luft &
Massendurchflussregler für Luft und für
Sauerstoff
Sauerstoff
Sascha Princz
61
Experimentelle Ergebnisse
5
In diesem Kapitel erfolgt die Aufgliederung und Auswertung der im Hinblick auf diese Arbeit
getätigten experimentellen Versuche. Dies geschieht in Form einer Darstellung der
Ergebnisse sowie der genauen Vorgehensweise zu den einzelnen Versuchen.
5.1 Versuchsplanung/ DOE
Zur Erstellung des Versuchsplans für die im Rahmen der Vorversuche dieser Arbeit
durchgeführten Probenmessungen zur Realisierung eines Kalibriermodells wurde die Lattice
Methode gewählt, und den Anforderungen und Einschränkungen gemäß individuell
angepasst. Das angepasste Lattice Design ist in Abb. 40 zu sehen, wobei an die drei Ecken
die Mischungskomponenten VE (vollentsalztes) Wasser mit 100% sowie Ethanol und Glucose
zu jeweils 50% gesetzt wurden. Da für das in dieser Arbeit zu erstellende Kalibriermodell
eine maximale Glucose Konzentration von 30% und eine Ethanol Konzentration von 15%
ausreichend sind, waren die mit den zwei roten Linien eingeschränkten Kombinationen
rechts unten ausreichend.
Abb. 40: Angepasstes Lattice Design für max. 15 Gew.-% Ethanol & 30 Gew.-% Glucose
Sascha Princz
62
Das richtige Ablesen soll kurz an dem schwarzen Punkt erklärt werden, dort besteht das
Gemisch zu 20% aus Glucose, 10% Ethanol und 70% Wasser. Die Prozentangaben beziehen
sich jeweils auf Gewichtsprozent (Gew.-%).
Nach der Auswertung des DOE mit Hilfe Gl. (3.17) ergab sich für den eingeschränkten
Bereich eine Anzahl von 28 Proben. Die möglichen Kombinationen der einzelnen
Mischungskomponenten sind in Tabelle 19 ausführlich dargestellt. Um eine randomisierte
Reihenfolge für eine spektroskopische Auswertung der Proben zu erhalten wurden diese
zunächst in Excel eingegeben und mit dessen Hilfe Zufallszahlen erzeugt, welche
letztendlich eine zufällige Reihenfolge für die Messungen vorgab. Die Reihenfolge für die
Versuchsdurchführung ist in der letzten Spalte der Tabelle 19, unter Versuch Nr. aufgeführt.
Die Randomisierung für die Versuchsdurchführung wurde gewählt um eventuell auftretende
systematische Fehler erkennen zu können.
Tabelle 19: Anzahl der notwendigen Proben, Faktorenkombination sowie randomisierte Reihenfolge
der Versuche
Probe Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Sascha Princz
Glucose [Gew.-%]
0
0
0
0
5
5
5
5
10
10
10
10
15
15
15
15
20
20
20
20
25
25
25
25
30
30
30
30
Ethanol [Gew.-%]
0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
0
5
10
15
Wasser [Gew.-%]
100
95
90
85
95
90
85
80
90
85
80
75
85
80
75
70
80
75
70
65
75
70
65
60
70
65
60
55
Versuch Nr.
6
7
12
18
1
13
15
26
2
5
21
28
3
17
19
20
8
9
14
22
4
16
23
27
10
11
24
25
63
5.2 Probenherstellung
Die Herstellung der Proben für die Vorversuche erfolgte zunächst durch das Erstellen von
Gemischen aus Ethanol, Glucose und VE Wasser. Diese Proben wurden durch das Einwiegen
der einzelnen Komponenten in Gew.-% hergestellt. Zur Erstellung wurde D(+)-Glucose und
Ethanol absolut der Firma Merck gewählt. Genaue Angaben zu den Chemikalien finden sich
im Anhang unter A 2.
5.3 Virtueller Bioreaktor
Um das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Kalibriermodell zur chemometrischen Auswertung
der mittels spektroskopischer Messungen erhaltenen Daten bezüglich ihrer Ethanol- und
Glucosekonzentration zu testen und auch zu erweitern war es unter anderem notwendig,
neben
Schüttelkolbenfermentationen
auch
am
Bioreaktor
der
Hochschule
Ulm
Fermentationen von Hefezellen durchzuführen. Die Idee war es, diese Hefezellen in einer
ersten
Fermentation
unter
anaeroben
Bedingungen
zu
fermentieren
(näheres
in
Kapitel 3.8.2.4). Im Rahmen dieser Fermentation sollten somit zunächst Ergebnisse ohne den
Einfluss von zu erwartenden Störungen durch Begasung und erhöhter Rührerdrehzahl sowie
der letztendlich daraus resultierenden Bildung kleiner Luftbläschen gewonnen werden. Bevor
allerdings diese Fermentation real durchgeführt wurde, wurden zunächst entsprechende
Fermentationen mit Hilfe des Virtuellen Bioreaktors (Virtual Bioreactor, VBR) simuliert. Dabei
handelt es sich um ein Werkzeug zur Simulation von Fermentationen, welches von der
Hochschule Bremen mit der Software WinErs erstellt wurde. Das Ziel der Simulation war es,
eine optimale Parametereinstellung für eine kurze Fermentationszeit zu finden, bei der
trotzdem eine relative hohe Menge an Glucose und Ethanol während der Fermentation für die
Messungen vorkommen.
Tabelle 20 zeigt die Einstellungen der wichtigsten Prozessparameter während der
simulierten anaeroben Hefefermentationen. Es wurden zum Vergleich vier verschiedene
Fermentationen durchgeführt, wobei sich die Prozessparameter neben einer Variation der
Temperatur auch in der Rührerdrehzahl unterscheiden.
Tabelle 20: Prozessparameter der mit dem Virtuellen Bioreaktor simulierten anaeroben
Hefefermentationen
Simulation
Rührerdrehzahl
Temperatur
Begasung
Reaktorvolumen
1
100 min-1
20 °C
aus
5L
2
100 min-1
20 °C
aus
5L
3
100 min-1
30 °C
aus
5L
Sascha Princz
64
4
200 min-1
30 °C
aus
5L
Wie Tabelle 21 zeigt wurden die zwei Fermentationen bei 20°C mit zwei unterschiedlichen
Mengen an Biomasse (Hefezellen) durchgeführt. Was zu einer erhöhten Bildung von Ethanol
sowie einer Reduzierung der Fermentationsdauer geführt hat, allerdings mit zwei Tagen und
drei Stunden immer noch relativ lange gedauert hätte. Aus diesem Grund wurde eine weitere
anaerobe Hefefermentation bei 30°C simuliert. Dies hatte zwar wie zu erwarten einen viel
höheren Biomassezuwachs zur Folge allerdings auch die erwünschte hohe Ethanolbildung
bei einer, mit einem Tag und etwa acht Stunden, relativ kurzen Fermentationszeit. Um eine
noch kürzere Fermentationsdauer zu erreichen wurde für die Simulation 4 das Substrat
(Glucose) auf 136 g/L verringert, was mit einer Dauer von etwas über 20 h zu einer
praktikablen Lösung führte.
Tabelle 21: Start- und Endwerte der mit dem Virtuellen Bioreaktor simulierten anaeroben
Hefefermentationen
Simulation
Biomasse
Substrat (Glucose)
Ethanol
Dauer
Start
Ende
Start
Ende
Start
Ende
1
8,4g/L
33,6g/L
300g/L
0g/L
0g/L
85,3g/L
2d 19h 50min
2
16,6g/L
43,1g/L
300g/L
0g/L
0g/L
99,1g/L
2d 03h 10min
3
8,4g/L
53,9g/L
300g/L
0g/L
0g/L
98,4g/L
1d 07h 43min
4
8,4g/L
30,1g/L
136g/L
0g/L
0g/L
50,2g/L
0d 20h 05min
Aus diesem Grund fiel die Entscheidung auf Simulation Nummer 4, da hier zu Beginn mit
etwa 13,6 % Glucose (136 g/L) und am Ende mit etwa 5,2 % Ethanol (50,2 g/L) während der
Fermentation hohe Konzentrationen der beiden Stoffe für die Messung vorhanden sind, und
die reduzierte Fermentationsdauer gleichzeitig zu einer Einsparung der Fermentationskosten
führt.
Abb. 41 zeigt zum Abschluss noch den nach der Simulation (Nummer 4) zu erwartenden
Prozessverlauf der anaeroben Hefefermentation im Bezug auf die Prozessparameter
Biomasse (Hefezellen, rot), Substrat (Glucose, grün) und Metabolit (Ethanol, blau).
Sascha Princz
65
140
35
120
30
100
25
80
20
60
15
40
10
20
5
0
Biomasse [g/L]
Konzentration [g/L]
0
0
2,5
5
7,5
10
12,5
15
17,5
20
22,5
Prozesszeit (h)
Glucose [g/l]
Ethanol [g/l]
Biomasse [g/l]
Abb. 41: Verlauf der Simulation 4 einer anaeroben Hefefermentation
5.4 Temperaturabhängigkeit
Hier soll zunächst die Abhängigkeit der Absorptionsspektren in Bezug auf die Temperatur
des spektroskopisch vermessenen VE Wassers dargestellt werden. Da tiefe Temperaturen die
Wasserstoffbrückenbindungen begünstigen und stabilisieren und somit auch einen Einfluss
auf
die
Oberschwingungen
von
Wasser
haben,
kommt
es
bei
unterschiedlichen
Temperaturen zu einer Verschiebung der mit Hilfe der NIRS detektierten relevanten
Adsorptionsbanden von Wasser.
5.4.1 Experimenteller Aufbau und Durchführung
Für den Nachweis der Temperaturabhängigkeit der Spektren von Wasser, speziell im NIRBereich
von
1100–2100 nm,
wurde
VE
Wasser
verwendet.
Zur
Erstellung
einer
aussagekräftigen Messreihe wurde ein Temperaturbereich von 15–75°C gewählt, und in
Abständen von 5°C Schritten durchlaufen. Das Wasser wurde auf die entsprechende
Temperatur aufgeheizt und im jeweils temperaturstabilen Zustand ein entsprechendes
Spektrum aufgezeichnet. Die Messung der Absorptionsspektren von Wasser erfolgte als
Transflexionsmessung.
Die
Erwärmung
des
VE
Wassers
zum
Durchlaufen
der
Temperaturreihe geschah mittels des VWR Magnetrührers mit integrierter Heizplatte VMSC7. Die Steuerung der Heizplatte sowie die Überwachung der Temperatur erfolgte mit Hilfe
des
elektronischen
Kontaktthermometers
VT-5,
ebenfalls
von
VWR.
Eine
optische
Darstellung des Messaufbaus zeigt Abb. 35.
Sascha Princz
66
Die Berechnung der Absorptionsspektren erfolgte mittels der Spektrometer Software. Dafür
wurde zunächst zu Beginn ein Referenzspektrum für alle späteren Messungen aufgezeichnet,
wobei die Lichtquelle und Luft als Referenz dienten. Bei den nachfolgenden Messungen
wurde zuvor jeweils eine extra Dunkelstromkorrektur durchgeführt. Die Einstellungen
weiterer relevanter Parameter für die Messungen können der Tabelle 22 entnommen werden.
Tabelle 22: Parameter für die Messung zur Temperaturabhängigkeit der Spektren von Wasser
Integrationszeit (It)
Mittelung (N)
Aufwärmphase Spektrometer
8,5 ms
64
120 min
Aufwärmphase Lichtquelle
60 min
Optischer Weg Sensor
0,5 mm
5.4.2 Auswertung und Ergebnisse
Die Daten der Messungen wurden mit Hilfe der Spektrometer Software in Form von ASCII
Excel [*.csv] Dateien abgespeichert. Dieses Speicherformat wurde gewählt um anschließend
mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel entsprechende Auswertungen
vornehmen zu können. Abb. 42 zeigt die entsprechende graphische Darstellung aller 13
aufgezeichneten Spektren über den Temperaturbereich von 15–75°C. Sehr schön zeigt sich
hier die Verschiebung der Absorptionsbanden der 1. und 2. Oberschwingung bei
zunehmender Temperatur in den kurzwelligeren Bereich.
Sascha Princz
67
Temperaturabhängige Spektren von Wasser
2
1,8
Absorbance Unit
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge [nm]
Wasser 15°C
Wasser 20°C
Wasser 25°C
Wasser 30°C
Wasser 35°C
Wasser 40°C
Wasser 45°C
Wasser 50°C
Wasser 55°C
Wasser 60°C
Wasser 65°C
Wasser 70°C
Wasser 75°C
Abb. 42: Temperaturabhängige Spektren von Wasser über einen Temperaturbereich von 15°C bis 75°C
Betrachtet man nun
den Bereich der durch die 2. Oberschwingung verursachten
Absorptionsbande, etwa zwischen 1410 nm und 1460 nm (Abb. 43), zeigt sich neben einer
Verschiebung in den kurzwelligeren Bereich bei zunehmender Temperatur zunächst auch
eine geringfügige Abnahme der Peakhöhe die aber dann bei höheren Temperaturen wieder
stärker ansteigt.
Sascha Princz
68
Temperaturabhängige Spektren von Wasser, 2. Oberschwingung
Absorbance Unit
0,6
0,4
0,2
0
1350
1370
1390
1410
1430
1450
1470
1490
1510
1530
1550
Wellenlänge [nm]
Wasser 15°C
Wasser 20°C
Wasser 25°C
Wasser 30°C
Wasser 35°C
Wasser 40°C
Wasser 45°C
Wasser 50°C
Wasser 55°C
Wasser 60°C
Wasser 65°C
Wasser 70°C
Wasser 75°C
Abb. 43: Temperaturabhängige Spektren von Wasser, 2. Oberschwingung
Vergleicht
man
dazu
die
in
Abb.
44
dargestellte
Verschiebung
der
durch
die
1. Oberschwingung verursachten Absorptionsbande, etwa zwischen 1900 nm und 1950 nm,
zeigt sich neben der bereits erwähnten Verschiebung in den kurzwelligeren Bereich bei
zunehmender Temperatur auch ein Ansteigen der Peakhöhe ohne vorherige Abnahme der
selbigen.
Sascha Princz
69
Temperaturabhängige Spektren von Wasser, 1. Oberschwingung
2
1,8
Absorbance Unit
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1850
1900
1950
2000
2050
2100
Wellenlänge [nm]
Wasser 15°C
Wasser 20°C
Wasser 25°C
Wasser 30°C
Wasser 35°C
Wasser 40°C
Wasser 45°C
Wasser 50°C
Wasser 55°C
Wasser 60°C
Wasser 65°C
Wasser 70°C
Wasser 75°C
Abb. 44: Temperaturabhängige Spektren von Wasser, 1. Oberschwingung
5.5 Spektren
In der Phase der Vorversuche zu dieser Arbeit erfolgte eine ausführliche Aufzeichnung
entsprechender Absorptionsspektren von VE Wasser, Ethanol, Glucose, Glucose-EthanolWasser-Gemischen
(G-E-W)
und
Hefe-Wasser-Gemischen
unterschiedlichster
Konzentrationen. Dies geschah im interessierenden Wellenlängenbereich von 1100–
2100 nm. Diese Phase der Arbeit diente zum einem dem Vergleich der unter den Kapiteln
4.3.1 und 4.3.2 beschriebenen Methoden miteinander sowie einem Vergleich der aus der
Literatur bekannten Spektren mit den eigens ermittelten Spektren. Darüber hinaus lag der
Fokus dieser Vorversuche natürlich auch auf der Ermittlung relevanter Daten für eine spätere
Erstellung
eines
Kalibriermodells
für
eine
chemometrische
Ermittlung
der
Stoffkonzentrationen unbekannter Probengemische.
Mit Hilfe einer weiterreichenden Auswertung der Glucosespektren wurde eine Berechnung
eines theoretischen Absorptionsspektrums von 100 % gelöster Glucose durchgeführt. Diese
Motivation lag an der Tatsache, dass in der Literatur keine vergleichbaren Spektren gefunden
werden konnten.
Aufgrund der unter Kapitel 5.4.2 dargelegten Temperaturabhängigkeit der Spektren von
Wasser wurde für die Aufzeichnung der Spektren im Rahmen dieser Arbeit eine
Probentemperatur von 30°C gewählt. Die Motivation für die Festlegung der Probentemperatur
Sascha Princz
70
auf 30°C erfolgte aus dem Grund, dass das erstellte Kalibriermodell zunächst an
Fermentationen von Hefezellen erfolgen soll. Da die Vorzugstemperatur dieser Hefezellen
bei einer Temperatur von etwa 30°C liegt war diese Temperatur naheliegend.
5.5.1 Wasser
Absorptionsspektren von Wasser für einen NIR-Bereich von 1100-2100 nm lassen sich
bereits in der Literatur finden. Da jedoch die äußere Form dieser Spektren sehr stark von der
verwendeten Messtechnik (unter anderem der Empfindlichkeit und maximalen Auflösung des
Spektrometers) und Messprinzip abhängig sind, wurden im Rahmen dieser Arbeit eigene
Spektren von Wasser aufgenommen. Ein weitaus wichtigerer Grund lag allerdings in der
Notwendigkeit eigene Wasserspektren für die nachfolgenden Auswertungen und natürlich
das spätere Kalibriermodell zu erhalten. Die Durchführung zur Aufzeichnung entsprechender
Spektren erfolgte zum einen nach dem Prinzip der Transmission sowie der Transflexion.
Abb. 45 zeigt neben den gemessenen Spektren auch zwei korrigierte Spektren. Die blaue
Kurve zeigt das Rohspektrum, welches nach dem Prinzip der Transflexion aufgezeichnet
wurde, und die rote Kurve das Rohspektrum nach dem Prinzip der Transmission. Um nun
beide
Absorptionsspektren
miteinander
vergleichen
zu
können
mussten
zunächst
verschiedene Korrekturschritte durchgeführt werden. So wurde zunächst das Spektrum aus
der Transflexionsmessung einer Nullpunktkorrektur (NPK) unterzogen, das Resultat zeigt die
grüne Kurve im Diagramm. Die NPK war notwendig da das Wasser gegen die Referenz Luft
oder Lichtquelle vermessen wurde und dadurch bis zu einer Wellenlänge von etwas über
1300 nm negative Werte resultierten. Im letzten Schritt erfolgte eine Skalierung des
nullpunktkorrigierten Spektrums. Die Berechnung des Skalierungsfaktors erfolgte aus dem
Verhältnis des ersten Peaks bei etwa 1450 nm der beiden Rohspektren zu einander. Diese
Skalierung war notwendig um die Spektren der unterschiedlichen Prinzipien miteinander
vergleichen zu können. Die violette Kurve zeigt das skalierte NPK Spektrum für den direkten
Vergleich.
Sascha Princz
71
Wasserspektren bei 30 °C gemessen und korrigiert
4,9
Wasser 30 °C Transflektion
3,9
Absorbance Unit
Wasser 30 °C Transmission
2,9
Wasser 30 °C Transflektion (NPK)
Wasser 30 °C Transflektion (NPK, skaliert)
1,9
0,9
-0,1
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
Wellenlänge [nm]
1800
1900
2000
2100
Abb. 45: Diverse Wasserspektren gemessen und zum Vergleich korrigiert
Der direkte Vergleich des violetten und roten Spektrums zeigt, dass diese bis auf den Bereich
des zweiten Peaks nahezu deckungsgleich sind. Der Grund für die Abweichung im Bereich
zwischen etwa 1800–2100 nm liegt zum einen in der Wahl des Messprinzips und zum
anderen aber vor allem in der Länge des Optischen Pfades. Die Messung nach Transmission
erfolgte in einer Quarzglasküvette mit einer Schichtdicke oder Optischen Pfad von 1 mm. In
der Grafik zeigt sich sehr schön, dass die Absorption des Wassers im Bereich um 1940 nm
zu stark für den gewählten Optischen Pfad ist und somit die Kurve nicht vollständig
dargestellt werden kann. Die Betrachtung der violetten Kurve zeigt, dass aufgrund des
anderen Messprinzips (Transflexion) und vor allem dem kleineren Optischen Pfad von 0,5
mm dieser Bereich viel besser aufgelöst werden kann.
Abb. 46 zeigt nun das nach dem Transflexionsprinzip gemessene Spektrum von VE Wasser
mit den typischen Absorptionsbanden der 1. und 2. Oberschwingung in dem untersuchten
Wellenlängenbereich von 1100–2100 nm mit Hilfe der NIRS.
Sascha Princz
72
Absorptionsspektrum von Wasser bei 30 °C
2,5
1. Oberschwingung
Wasser (gemessen, NPK)
Absorbance Unit
2
1,5
1
2. Oberschwingung
0,5
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge [nm]
Abb. 46: Absorptionsspektrum von Wasser, gemessen in Transflexion und NPK
5.5.2 Ethanol
Das in Abb. 47 gezeigte Absorptionsspektrum zeigt das Resultat der Messung nach dem
Prinzip der Transflexion von 100 % Ethanol. Auch bei diesem Spektrum wurde eine NPK
durchgeführt. Der Grund war auch hier, wie bei dem Spektrum von VE Wasser, das gegen die
Referenz Luft/Lichtquelle vermessen wurde und dadurch bis zu einer Wellenlänge von etwas
über 1300 nm negative Werte resultierten. Sehr gut ist auch zu erkennen, dass die
Absorption von Ethanol in dem untersuchten Bereich im Vergleich zu dem zuvor gezeigten
Absorptionsspektrum von VE Wasser sehr viel geringer ist.
Sascha Princz
73
Absorptionsspektrum von Ethanol bei 30 °C
0,3
100% Ethanol (gemessen, NPK)
Absorbance Unit
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge [nm]
Abb. 47: Absorptionsspektrum von 100% Ethanol, gemessen und NPK
Im Rahmen der Absorptionsmessungen von Ethanol erfolgte zudem eine Messung von
unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen in VE Wasser. Das Ergebnis dieser Messungen
zeigt Abb. 48. Die Angabe der Ethanolkonzentration erfolgt in Gew.-%. Der Grund für die
negativen Absorptionsspektren liegt darin, dass die abgebildeten Absorptionsspektren
gegen ein Wasserspektrum bei gleicher Temperatur als Referenz gemessen wurden. Die
negative Ausbreitung um die Wellenlängenbereiche von 1440 nm und 1960 nm resultiert
daher
von
den
starken
Absorptionsbanden
des
Wassers,
um
so
höher
also
die
Ethanolkonzentration umso negativer ist das Absorptionsspektrum in diesem Bereich. Da
dieser Effekt lediglich auf einer Verdrängung von Wasser beruht, ist dies kein zuverlässiges
Merkmal zur Bestimmung der Ethanolkonzentration.
Sascha Princz
74
Spektren der Ethanolmessreihe bei 30 °C
0,2
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Absorbance Unit
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
-1
1% Ethanol
2% Ethanol
3% Ethanol
5% Ethanol
10% Ethanol
20% Ethanol
30% Ethanol
40% Ethanol
50% Ethanol
60% Ethanol
-1,2
Wellenlänge [nm]
Abb. 48: Spektren der Ethanolmessreihe mit unterschiedlichem Ethanolgehalt
Viel interessanter ist in diesem Zusammenhang der Bereich zwischen etwa 1670 nm und
1750 nm
wie
ihn
Abb.
49
zeigt.
Sehr
gut
ist
hier
aufgrund
des
positiven
Absorptionsspektrums zu erkennen, dass in diesem Bereich die Absorption von Ethanol
höher als die des Wassers ist.
Sascha Princz
75
Spektren der Ethanolmessreihe bei 30 °C, Auszug
0,04
Absorbance Unit
0,03
0,02
1% Ethanol
2% Ethanol
3% Ethanol
5% Ethanol
10% Ethanol
20% Ethanol
30% Ethanol
40% Ethanol
50% Ethanol
60% Ethanol
0,01
0
1670
-0,01
1680
1690
1700
1710
1720
1730
1740
1750
Wellenlänge [nm]
Abb. 49: Spektren der Ethanolmessreihe mit unterschiedlichem Ethanolgehalt, Auszug
5.5.3 Glucose
Abb. 50 zeigt das Resultat der Berechnung für das Absorptionsspektrum nach dem Prinzip
der Transflexion von 100% Glucose. Da es nicht möglich ist den als Feststoff vorliegenden
Zucker Glucose mit einem Anteil von 100% zu lösen und in Transflexion zu vermessen,
wurden verschiedene Glucose-Wasser-Gemische angesetzt und daraus letztendlich das
vorliegende Spektrum berechnet. Auch bei diesem Spektrum wurde eine NPK durchgeführt.
Der Grund war auch hier, wie bei den Spektren zuvor, das gegen die Referenz Luft oder
Lichtquelle vermessen wurde. Sehr gut ist auch hier zu erkennen, dass die Absorption von
Glucose in dem untersuchten Bereich im Vergleich zu dem Absorptionsspektrum von Wasser
viel geringer ist, allerdings doch höher als das von Ethanol.
Sascha Princz
76
Absorptionsspektrum von Glucose bei 30 °C
1,4
100% Glucose (berechnet, NPK)
1,2
Absorbance Unit
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge [nm]
Abb. 50: Absorptionsspektrum von 100% Glucose, berechnet und NPK
Wie bereits bei Ethanol erfolgten auch hier Absorptionsmessungen unterschiedlicher
Glucosekonzentrationen in VE Wasser. Das Ergebnis dieser Messungen zeigt Abb. 51 mit den
entsprechenden
Glucosekonzentrationen
in
Gew.-%.
Der
Grund
für
die
negativen
Absorptionsspektren liegt wiederum darin, dass die abgebildeten Absorptionsspektren
gegen ein Wasserspektrum bei gleicher Temperatur als Referenz vermessen wurden. Somit
resultieren die negative Ausbreitung um die Wellenlängenbereiche von 1440 nm und
1960 nm auch hier von den starken Absorptionsbanden des Wassers, um so höher also die
Glucosekonzentration umso negativer ist das Absorptionsspektrum in diesem Bereich. Da
dieser Effekt wiederum auf eine Verdrängung von Wasser beruht ist dies kein zuverlässiges
Merkmal zur Bestimmung der Glucosekonzentration.
Sascha Princz
77
Spektren der Glucosemessreihe bei 30 °C
0,2
0,1
Absorbance Unit
0
1100
-0,1
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
1% Glucose
2% Glucose
3% Glucose
5% Glucose
10% Glucose
20% Glucose
30% Glucose
40% Glucose
50% Glucose
60% Glucose
-0,6
-0,7
-0,8
Wellenlänge [nm]
Abb. 51: Spektren der Glucosemessreihe mit unterschiedlichem Glucosegehalt
Ähnlich
wie
bei
Ethanol
gibt
es
auch
hier
Bereiche,
die
im
interessierenden
Wellenlängenbereich eine höhere Absorption als Wasser aufweisen. Von diesen Bereichen
gibt es bei Glucose sogar zwei. Der größere Bereich liegt etwa zwischen 1530 nm und
1780 nm (wie ihn Abb. 52 zeigt) und der zweite beginnt bei etwa 2070 nm und reicht aber
über den mittels in dieser Arbeit verwendeten Grenzbereich von 2100 nm hinaus (s. a. Abb.
53).
Sascha Princz
78
Spektren der Glucosemessreihe bei 30 °C, Auszug 1
0,05
0,04
Absorbance Unit
0,03
1% Glucose
2% Glucose
3% Glucose
5% Glucose
10% Glucose
20% Glucose
30% Glucose
40% Glucose
50% Glucose
60% Glucose
0,02
0,01
0
1530
1580
1630
1680
1730
1780
-0,01
-0,02
Wellenlänge [nm]
Abb. 52: Spektren der Glucosemessreihe mit unterschiedlichem Glucosegehalt, Auszug 1
Spektren der Glucosemessreihe bei 30 °C, Auszug 2
0,11
1% Glucose
2% Glucose
3% Glucose
5% Glucose
10% Glucose
20% Glucose
30% Glucose
40% Glucose
50% Glucose
60% Glucose
Absorbance Unit
0,09
0,07
0,05
0,03
0,01
2070
-0,01
2075
2080
2085
Wellenlänge [nm]
2090
2095
2100
Abb. 53: Spektren der Glucosemessreihe mit unterschiedlichem Glucosegehalt, Auszug 2
Da es
wie bereits
erwähnt technisch
nicht möglich
ist
eine Lösung
mit einem
Konzentrationsgehalt von 100% Glucose herzustellen und spektroskopisch zu vermessen,
wurde das Absorptionsspektrum für 100% Glucose berechnet. Um einen Vergleich bzw.
Sascha Princz
79
Kontrolle der Richtigkeit der Berechnung zu bekommen, wurde dasselbe mit Hilfe einer
Messung
nach
dem
Transmissionsprinzip
durchgeführt
und
ebenfalls
ein
Absorptionsspektrum berechnet. Abb. 54 zeigt das Ergebnis dieser Berechnungen. In rot das
berechnete Absorptionsspektrum aus den nach dem Prinzip der Transflexion gewonnenen
Daten und in blau aus den Daten nach dem Transmissionsprinzip. Auch hier musste das
Spektrum nach dem Transflexionsprinzip für einen direkten Vergleich skaliert werden, das
Ergebnis
zeigt
das
grüne
Spektrum.
Der
direkte
Vergleich
zeigt
das
beide
Absorptionsspektren (blau und grün) nahezu deckungsgleich sind, lediglich der Peak bei
etwa 1940 nm unterscheidet sich wie bereits erwähnt aufgrund des unterschiedlichen
Optischen Pfades.
Absorptionsspektren 100% Glucose, Transmission vs. Transflexion
3
100% Glucose Transmission
Absorbancce Unit
2,5
2
100% Glucose Transflexion
Faktor*Transflexion
1,5
1
0,5
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge [nm]
Abb. 54: Berechnete Absorptionsspektren für 100% Glucose nach Transmission und Transflexion
5.5.4 Vergleich der Absorptionsspektren
Die im Rahmen der Vorversuche dieser Arbeit gewonnenen reinen Absorptionsspektren von
VE
Wasser,
Glucose
und
Ethanol
sind
für
einen
direkten
Vergleich
in
Abb.
55
gegenübergestellt. Hier zeigt sich nun sehr anschaulich die zum Teil sehr viel höhere
Absorption des Wassers in dem Wellenlängenbereich von 1100 nm bis 2100 nm. Genauso
zeigen sich aber auch die zuvor erwähnten Bereiche, in denen die Absorption durch Glucose
und Ethanol stärker als die durch das Wasser verursachte Absorption sind. Allerdings ist
Sascha Princz
80
auch zu erkennen, dass sowohl Ethanol als auch Glucose in diesen Bereichen Absorptionen
zeigen die sich addieren. So z. B. in dem Bereich zwischen 1670 nm und 1750 nm sowie ab
2070 nm was letztendlich zu einer Überlagerung dieser Absorptionsbanden führt. Diese
Überlagerung führt mit dazu, dass eine Auswertung in Hinblick auf die einzelnen
Stoffkonzentrationen mit Hilfe einer multivariaten Datenanalyse, sprich der Chemometrie
erfolgen muss.
Absorptionsspektren von Wasser, Glucose und Ethanol
2,1
1,8
Wasser (gemessen, NPK)
100% Glucose (berechnet, NPK)
Absorbance Unit
1,5
100% Ethanol (gemessen, NPK)
1,2
0,9
0,6
0,3
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge [nm]
Abb. 55: Direkter Vergleich der reinen Absorptionsspektren von Wasser, Glucose und Ethanol
5.5.5 Hefe-Wasser-Gemisch
Im Rahmen der Vorversuche erfolgten zusätzlich Absorptionsmessungen von Hefe-WasserGemischen mit unterschiedlicher Konzentration an Biomasse, sprich Hefezellen. Hierfür
wurde die Nasshefe wieninger hefe, des Herstellers F. X. Wieninger GmbH, in VE Wasser
gelöst und gegen die Referenz Wasser in Transflexion spektroskopisch bei 30°C vermessen.
Die Angaben der Hefekonzentration erfolgt in Gew.-% und bezieht sich auf die Nasshefe.
Eine Umrechnung zwischen Nasshefemasse und der entsprechenden Trockenbiomasse an
Hefezellen liefert Tabelle 23, wobei 7,1 g Nasshefe in etwa einer Trockenbiomasse von 2 g
entsprechen.
Tabelle 23: Umrechnung zwischen Nasshefemasse und Trockenbiomasse
Gew.-%
Nasshefe [g]
Trockenbiomasse [g]
1,00
10,0
2,82
Sascha Princz
81
2,98
29,8
8,39
4,00
40,0
11,27
5,96
59,6
16,79
7,00
70,0
19,72
10,0
100,0
28,17
Das Ergebnis der Messungen in Form von Absorptionsspektren ist in Abb. 56 zu sehen. Hier
zeigt sich eine Zunahme der Extinktion aufgrund dem Mehr an Biomasse in den einzelnen
Gemischen. Die Berechnung erfolgte nach dem Lambert Beer´schen Gesetz, obwohl dieses
aufgrund der durch die Hefezellen auftretenden Streuung hier nicht mehr uneingeschränkt
gültig ist. Diese Form der Berechnung und Darstellung wurde allerdings für einen besseren
Vergleich mit den anderen Spektren gewählt.
Absorptionsspektren verschiedener Hefekonzentrationen bei 30°C
0,9
0,8
Absorbance Unit
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1030
1230
1430
1630
1830
2030
Wellenlänge [nm]
Hefe1%
Hefe2,98%
Hefe4%
Hefe5,96%
Hefe7%
Hefe10%
Abb. 56: Absorptionsspektren der verschiedenen Hefe-Wasser-Gemische bei 30°C
Eine Aussage über die Transmissionseigenschaften der entsprechenden Hefekonzentrationen
zeigt Abb. 57. Hier wurde zur Berechnung der Transmission, nach Gl. (3.4), als eingestrahlte
Lichtintensität I0 ein Intensitätsspektrum von VE Wasser herangezogen. Somit entspricht
reines VE Wasser einer Transmission von 100 %. Bei genauer Betrachtung zeigt sich auch hier
das mit zunehmender Biomasse, und der damit verbundenen Zunahme der Trübung der
Flüssigkeit, die Transmission stark abnimmt.
Sascha Princz
82
Transmissionsspektren verschiedener Hefekonzentrationen bei 30°C
90
80
Transmission [%]
70
60
50
40
30
20
10
0
1030
1230
1430
1630
1830
2030
Wellenlänge [nm]
Hefe1%
Hefe2,98%
Hefe4%
Hefe5,96%
Hefe7%
Hefe10%
Abb. 57: Transmissionsspektren der verschiedenen Hefe-Wasser-Gemische bei 30°C
Abb. 58 zeigt einzelne Intensitätsspektren der verschiedenen Hefekonzentrationen sowie
reinem VE Wasser im Vergleich. Auch hier zeigt sich recht deutlich, dass die zunehmende
Trübung der Flüssigkeit einen starken Einfluss auf die Intensität der einzelnen Spektren hat.
Spektren verschiedener Hefekonzentrationen vs Wasser bei 30°C
50000
Counts
40000
30000
20000
10000
0
1030
1230
1430
1630
1830
2030
Wellenlänge [nm]
Hefe1%
Hefe2,98%
Hefe4%
Hefe7%
Hefe10%
Wasser (Ref)
Hefe5,96%
Abb. 58: Spektren (in Counts) der verschiedenen Hefe-Wasser-Gemische bei 30°C
Sascha Princz
83
Da sich bei wiederholten Messungen dieser Zusammenhang der Transmissionsabnahme
bestätigt hat, kann diese Eigenschaft bzw. Wissen zum Beispiel für einen ersten Versuch zur
Vorhersage der Biomasse und somit der Trockenbiomasse an Hefezellen genutzt werden.
5.5.6 Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch
Um eine Auswertung mit Hilfe der Chemometrie durchführen zu können, musste zunächst
ein geeignetes Kalibriermodell erstellt werden. Zur Erstellung dieses Kalibriermodells
erfolgte eine spektroskopische Vermessung der 28 Gemische mit den in Tabelle 19
dargestellten Stoffkonzentrationen. Die Erstellung der mit dem angepassten Lattice Modell
(Abb. 40) ermittelten Proben erfolgte durch eine Einwaage der entsprechenden Stoffe. Somit
sind die Angaben der einzelnen Stoffkonzentrationen in den Proben wiederum in Gew.-%, die
Reihenfolge der Vermessung mittels der NIRS erfolgte in der angegebenen randomisierten
Reihenfolge. Das Ergebnis in Form der gewonnen Absorptionsspektren zeigt Abb. 59.
Sascha Princz
84
Absorptionsspektren Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch bei 30°C
0,05
1100
-0,05
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Absorbance Unit
-0,15
-0,25
-0,35
-0,45
-0,55
Wellenlänge [nm]
-0,65
Versuch# 2 10%G-10%E-80%W AU
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
-0,2
AU
1100
Versuch# 27 25%G-5%E-70%W AU Wellenlänge [nm]
-0,7
Abb. 59: Absorptionsspektren der Glucose-Ethanol-Wasser-Gemische bei 30°C
5.6 Kalibriermodell
Mit den in Abb. 59 gezeigten Absorptionsspektren der entsprechenden Probengemische
erfolgte nun die Erstellung eines ersten Kalibriermodells für eine Vorhersage der
Stoffkonzentrationen von Glucose und Ethanol in unbekannten wässrigen Proben. Die
Vorhersage bzw. Erstellung des Kalibriermodells erfolgte mit Hilfe der PLS. Die für die
Erstellung dieses Kalibriermodells ebenfalls benötigten Konzentrationen der einzelnen Stoffe
Sascha Princz
85
waren durch das Einwiegen bekannt, und somit dient hier die Methode des Einwiegens als
Referenzanalytik zur Bestimmung der entsprechenden Konzentrationen. Die Erstellung eines
ersten Kalibriermodells erfolgte nun direkt in der Software „The Unscrambler“ aus den zuvor
gewonnenen Absorptionsspektren sowie der bekannten Konzentrationen der enthaltenen
Stoffe.
Nachdem die spektroskopisch vermessenen Spektren der 28 Probelösungen sowie die
dazugehörigen Konzentrationen in Form der entsprechenden Datenmatrix im Unscrambler
hinterlegt wurden, erfolgte zunächst die Durchführung einer PCA anhand der Rohdaten. Das
Ergebnis dieser PCA ist grafisch in Abb. 60 dargestellt. Obwohl hier bereits die erste (PC-1,
98%) und zweite (PC-2, 2%) Hauptkomponente 100% der Varianz erklären, sieht man am
rechten oberen Rand sowie der linken oberen Ecke eine unsymmetrische und nichtlineare
Verteilung der Proben.
Abb. 60: Ergebnis PCA eines ersten Kalibriermodells ohne Datenvorbehandlung
Zu erwarten wäre aufgrund der linearen Abdeckung des Datenraumes, durch die lineare und
symmetrische Verteilung der unterschiedlichen Probelösungen (vgl. dazu Kapitel 5.1), eine
ähnlich lineare und symmetrische Anordnung der Proben, wie in dem ausgewählten Bereich
des in Abb. 40 gezeigten Lattice Modells.
Schaut man
sich
dazu
noch
die in
Abb.
59 gezeigten
Absorptionsspektren
der
Probenlösungen an, sieht man, dass eben diese Spektren eine Abweichung zur Basislinie
haben. Nach der Durchführung einer linearen Basislinienkorrektur (über 2 Stützstellen) und
Sascha Princz
86
einer darauffolgenden PCA über die korrigierten Daten erhält man die in Abb. 61 gezeigte
Verteilung der verschiedenen Probengemische.
Abb. 61: Ergebnis PCA eines ersten Kalibriermodells nach Basislinienkorrektur
Es zeigt sich, dass mit Hilfe einer entsprechenden Vorbehandlung der Daten, wie hier durch
die Eliminierung nicht chemischer Informationen, eine annähernd symmetrische Verteilung
erreicht werden kann.
5.7 Erste Vorhersagen
Für eine Kontrolle des erstellten Kalibriermodells erfolgten im nächsten Schritt diverse
Vorhersagen für unterschiedliche Proben mit teilweise unbekannten Inhaltsstoffen und
Zusammenstellung. Die Angaben zu den entsprechenden Proben so wie die erzielten
Ergebnisse der Vorhersagen finden sich in den nachfolgenden Kapiteln. Darüber hinaus wird
im Anschluss auf die dabei aufgetretenen bzw. erwartenden Probleme unter Kapitel 5.7.4
näher eingegangen.
Bevor allerdings mit der Vorhersage verschiedener Proben begonnen werden konnte, wurden
zunächst
verschiedene
Methoden
zur
Vorbehandlung
(Vorb.)
der
Spektren
des
Kalibriermodells, im Hinblick auf ihre R2 und RMSE Werte hin analysiert. In Tabelle 24 finden
sich die Ergebnisse für die Modelloptimierung zur Vorhersage von Glucose mit Angabe der
Anzahl der verwendeten Komponenten (unter Rang). Die Abkürzung SG steht für SavitzkyGolay und BL für Baseline. Bei der BL Offset erfolgt eine Korrektur um einen, bei einer
Sascha Princz
87
bestimmten Wellenlänge, vorhandenen Offset. Bei der BL Linear erfolgt eine Korrektur um
eine Gerade, die Stützstellen für die lineare Basislinienkorrektur lagen bei etwa 1100 nm und
1540 nm. Die Zahlen in den Klammern bei der Vorbehandlung Detrend stehen für den Grad
des
Polynoms.
Es
erfolgt
ebenfalls
eine
dem
Grad
des
Polynoms
entsprechende
Basislinienkorrektur, wobei allerdings die Software selbst die entsprechenden Stützstellen
bestimmt. Die Tabellen zeigen nicht alle durchgeführten Methoden, es sind lediglich die
Methoden aufgeführt, die am geeignetsten für eine Vorhersage des entsprechenden Stoffs
erschienen.
Tabelle 24: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in G-E-W
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
3
0,9872
0,958
1,174
1. Ableitung SG
1100-2100
3
0,9960
0,517
0,656
Detrend (1)
1100-2100
3
0,9982
0,369
0,437
Detrend (2)
1100-2100
3
0,9987
0,318
0,379
BL Offset
1100-2100
3
0,9933
0,726
0,848
BL Linear
1100-2100
3
0,9977
0,437
0,513
Einen Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der Spektren für ein Kalibriermodell
und zur Vorhersage von Glucose zeigt Abb. 62. Der Vergleich erfolgt zum einen bezüglich
des R² und zum anderen bezüglich der RMSE Werte für die Kalibrierung und Validierung des
entsprechenden
Kalibriermodells.
Hierbei
sieht
man
recht
anschaulich,
dass
eine
entsprechende Vorbehandlung eine sichtbare Verbesserung des Kalibriermodells gegenüber
dem Kalibriermodell basierend auf den Rohdaten bringt.
Sascha Princz
88
Vergleich der Vorbehandlung für Glucose
1
4
0,998
3,5
0,996
3
0,994
R²
0,99
2
0,988
RMSE
2,5
0,992
1,5
0,986
1
0,984
0,5
0,982
0,98
0
keine Vorb.
BL Offset
1. Ableitung
SG
R2
BL Linear
RMSEC
Detrend (1) Detrend (2)
RMSECV
Abb. 62: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Glucose
Tabelle 25 zeigt die Ergebnisse für die Modelloptimierung zur Vorhersage von Ethanol,
ebenfalls mit Angabe der dazu verwendeten Komponenten.
Tabelle 25: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in G-E-W
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
3
0,9831
0,443
0,754
1. Ableitung SG
1100-2100
3
0,9879
0,514
0,638
Detrend (1)
1100-2100
3
0,9972
0,258
0,306
Detrend (2)
1100-2100
3
0,9965
0,292
0,345
BL Offset
1100-2100
3
0,9904
0,485
0,569
BL Linear
1100-2100
3
0,9951
0,338
0,392
Den Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der Spektren für ein Kalibriermodell
von Ethanol zeigt Abb. 63. Auch hier zeigt sich deutlich, dass eine entsprechende
Vorbehandlung eine Verbesserung des Kalibriermodells gegenüber dem Kalibriermodell
basierend auf den Rohdaten bringt.
Sascha Princz
89
Vergleich der Vorbehandlung für Ethanol
1
4
3,5
0,995
3
R²
2
0,985
RMSE
2,5
0,99
1,5
1
0,98
0,5
0,975
0
keine Vorb. 1. Ableitung
SG
BL Offset
R2
BL Linear
RMSEC
Detrend (2)
Detrend (1)
RMSECV
Abb. 63: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Ethanol
Tabelle 26 zeigt die Ergebnisse für die Modelloptimierung zur Vorhersage von Wasser. Auch
hier findet sich die Angabe der dazu verwendeten Komponenten.
Tabelle 26: Modelloptimierung für die Vorhersage von Wasser in G-E-W
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
2
0,9955
0,688
0,796
1. Ableitung SG
1100-2100
2
0,9930
0,842
0,994
Detrend (1)
1100-2100
2
0,9984
0,417
0,476
Detrend (2)
1100-2100
2
0,9983
0,427
0,489
BL Offset
1100-2100
2
0,9965
0,611
0,702
BL Linear
1100-2100
2
0,9977
0,516
0,574
In Abb. 64, dem Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der Spektren für ein
Kalibriermodell von Wasser, zeigt sich ebenso, dass eine entsprechende Vorbehandlung (bis
auf eine Ausnahme) eine Verbesserung des Kalibriermodells gegenüber dem Kalibriermodell
basierend auf den Rohdaten bringt.
Sascha Princz
90
Vergleich der Vorbehandlung für Wasser
1
4
3,5
0,998
3
2,5
0,994
2
RMSE
R²
0,996
1,5
0,992
1
0,99
0,5
0,988
0
1. Ableitung keine Vorb.
SG
BL Offset
R2
RMSEC
BL Linear
Detrend (2)
Detrend (1)
RMSECV
Abb. 64: Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Wasser
Bei einer abschließenden Betrachtung aller drei Vergleiche ist zu erwarten, dass bei den
nachfolgenden Vorhersagen mit den durch BL Linear, Detrend (1) und Detrend (2)
vorbehandelten Spektren erhaltenen Kalibriermodelle die besten Ergebnisse zu erzielen sind.
5.7.1 Vorhersage Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch
Für den ersten Test des im Rahmen der Vorversuche erstellten Kalibriermodells erfolgte die
spektroskopische
Konzentrationen
Vermessung
anhand
von
und
anschließende
Vorhersage
der
Glucose-Ethanol-Wasser-Gemischen.
entsprechenden
Damit
bei
der
Auswertung bzw. Vorhersage die Probenzusammensetzung nicht bekannt war, wurden die in
Tabelle 27 dargestellten Proben von Herrn Dipl. Ing. (FH) Rudolf Miller durch Einwiegen
erstellt. Die Angaben zu den einzelnen Konzentrationen sind somit in Gew.-% und wurden
blind in Transflexion vermessen.
Tabelle 27: Zusammensetzung der Blindproben (G-E-W), Angaben in Gew.-%
Probe
Glucose
Ethanol
Wasser
1
8
4
88
2
20
0
80
3
4
8
88
Die Ergebnisse der Vorhersage für die entsprechenden Stoffkonzentrationen, die mit Hilfe
des im Rahmen der Vorversuche erstellten Kalibriermodells getroffen wurden, zeigt Tabelle
28. Auch hier finden sich wieder die Angaben zu den entsprechend berücksichtigten
Komponenten und der verwendeten Methode für die Vorbehandlung. Dabei steht die erste
Sascha Princz
91
Zahl unter Rang für die zur Vorhersage von Glucose verwendete Anzahl an Komponenten,
die zweite für Ethanol und die dritte für Wasser.
Tabelle 28: Ergebnisse zur Vorhersage der Blindproben (G-E-W), Angaben in Gew.-%
Probe
Glucose
Ethanol
Wasser
Vorb.
Rang
1
7,29
3,09
89,80
keine Vorb.
3/3/2
2
19,20
0,26
81,39
keine Vorb.
3/3/2
3
5,38
7,60
88,02
keine Vorb.
3/3/2
1
7,58
3,67
88,71
Detrend (1)
3/3/2
2
19,71
0,59
79,58
Detrend (1)
3/3/2
3
4,22
8,24
87,29
Detrend (1)
3/3/2
1
7,34
3,82
88,77
Detrend (2)
3/3/2
2
19,41
0,79
79,65
Detrend (2)
3/3/2
3
3,83
8,49
87,33
Detrend (2)
3/3/2
1
7,65
3,62
88,64
BL Linear
3/3/2
2
20,15
0,12
79,61
BL Linear
3/3/2
3
4,72
7,72
87,23
BL Linear
3/3/2
Berechnet man die Differenz zwischen realer Stoffkonzentration und dem mit Hilfe des
Kalibriermodells vorhergesagten Wert, und trägt diese grafisch über den Sollwert auf, bietet
sich
die
Möglichkeit
einer
Beurteilung
der
entsprechenden
Methode
zur
Spektrenvorbehandlung anhand der (betragsmäßigen) Größe der Differenz.
In Abb. 65 ist die Differenz der einzelnen Methoden zur Vorhersage von Glucose in einem GE-W aufgetragen. Es zeigt sich, dass die besten Vorhersagen mit dem Kalibriermodell aus
den mittels Detrend (1) vorbehandelten Spektren erzielt wurden, gefolgt von BL Linear und
Detrend (2).
Sascha Princz
92
Differenz Vorhersage- & Sollwert für Glucose
1,5
Differenz [Gew.-%]
1
0,5
0
0
4
8
12
16
20
-0,5
-1
Soll [Gew.-%]
keine Vorb.
Detrend(1)
Detrend(2)
BL Linear
Abb. 65: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Glucosegehalt, (G-E-W)
Abb. 66 zeigt, dass die besten Vorhersagen bezüglich des Ethanolgehalts in G-E-W mit dem
Kalibriermodell der mittels BL Linear vorbehandelten Spektren erzielt wurden, gefolgt von
Detrend (1).
Differenz Vorhersage- & Sollwert für Ethanol
1
0,8
Differenz [Gew.-%]
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
-0,4
-0,6
-0,8
-1
Soll [Gew.-%]
keine Vorb.
Detrend(1)
Detrend(2)
BL Linear
Abb. 66: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagten und realen Ethanolgehalt, (G-E-W)
Und für die Vorhersage des Wassergehaltes zeigt Abb. 67, dass sich eine Vorbehandlung der
Spektren vor Erstellung eines Kalibriermodells als sinnvoll erweist. Hierbei sind die
Sascha Princz
93
Vorhersagen aufgrund der drei Vorbehandlungsmethoden, BL Linear, Detrend (1) und
Detrend (2), nahezu identisch.
Differenz Vorhersage- & Sollwert für Wasser
2
Differenz [Gew.-%]
1,5
1
0,5
0
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
-0,5
-1
keine Vorb.
Soll [Gew.-%]
Detrend(1)
Detrend(2)
BL Linear
Abb. 67: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagten und realen Wassergehalt, (G-E-W)
5.7.2 Vorhersage YPD-Probe
Für eine erste erschwerte Vorhersagebedingung wurde durch die Vermessung verschiedener
YPD-Proben mit unterschiedlichen Glucose- und Ethanolkonzentrationen gesorgt. Bei
diesem Versuch zur Vorhersage war die Schwierigkeit unter Anwesenheit zweier dem
Kalibriermodell nicht bekannter Stoffe, Hefeextrakt (Y, Yeast) und Pepton (P) die beide in
dem komplexen Medium (welches bei den nachfolgenden Fermentationen zum Einsatz
kommt) enthalten sind, die richtigen Glucose- und Ethanolkonzentrationen vorherzusagen.
Auch hier wurden die entsprechenden Probengemische durch Einwiegen erstellt, die
Angaben zu den einzelnen Konzentrationen in Tabelle 29 sind somit in Gew.-%. Die Proben
wurden ebenfalls blind in Transflexion vermessen.
Tabelle 29: Zusammensetzung der YPD-Proben, Angaben in Gew.-%
Probe
Yeast
Pepton
Glucose
Ethanol
Wasser
1
1
2
2
0
95
2
1
2
8
0
89
3
1
2
2
8
87
4
1
2
16
11
70
Sascha Princz
94
Die in
Tabelle
30 gezeigten
Ergebnisse der Vorhersagen, für
die
entsprechende
Stoffkonzentration in den YPD-Proben, wurden auch hier mit Hilfe des im Rahmen der
Vorversuche erstellten Kalibriermodells getroffen. Neben den Angaben zu den entsprechend
berücksichtigten Komponenten, finden sich auch Angaben zu den verwendeten Methoden
für die Vorbehandlung.
Tabelle 30: Ergebnisse zur Vorhersage der YPD-Proben, Angaben in Gew.-%
Probe
Glucose
Ethanol
Wasser
Vorb.
Rang
1
2,41
0,91
96,06
keine Vorb.
3/3/2
2
9,99
0,68
89,10
keine Vorb.
3/3/2
3
6,73
9,10
84,97
keine Vorb.
3/3/2
4
17,95
11,59
71,71
keine Vorb.
3/3/2
1
3,17
1,91
94,99
Detrend (1)
3/3/2
2
9,53
1,04
89,47
Detrend (1)
3/3/2
3
3,70
9,35
86,72
Detrend (1)
3/3/2
4
17,22
12,51
70,01
Detrend (1)
3/3/2
1
2,15
2,58
95,39
Detrend (2)
3/3/2
2
8,44
1,76
89,86
Detrend (2)
3/3/2
3
2,62
10,05
86,99
Detrend (2)
3/3/2
4
16,23
13,16
70,23
Detrend (2)
3/3/2
1
4,07
0,99
95,26
BL Linear
3/3/2
2
10,44
0,15
89,64
BL Linear
3/3/2
3
4,57
8,55
86,61
BL Linear
3/3/2
4
18,31
11,43
69,99
BL Linear
3/3/2
Trägt man für eine Vorhersage in den YPD-Proben die entsprechende Differenz grafisch über
den Sollwert auf, bietet sich auch hier die Möglichkeit einer Beurteilung der entsprechenden
Methode zur Spektrenvorbehandlung anhand der (betragsmäßigen) Größe der Differenz.
In Abb. 68 ist die Differenz der einzelnen Methoden zur Vorhersage von Glucose in den YPDProben aufgetragen. Hier zeigt sich eindeutig, dass die besten Vorhersagen mit dem
Kalibriermodell aus den mittels Detrend (2) vorbehandelten Spektren erzielt wurden.
Sascha Princz
95
Differenz Vorhersage- & Sollwert für Glucose
5
4,5
Differenz [Gew.-%]
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Soll [Gew.-%]
keine Vorb.
Detrend (1)
Detrend (2)
BL Linear
Abb. 68: Vergleich Differenz zwischen vorhergesagten und realen Glucosegehalt, (YPD)
Zur Vorhersage des Ethanolgehalts in den YPD-Proben eignet sich, wie Abb. 69 verdeutlicht,
eine Vorbehandlung der Spektren mittels BL Linear vor Erstellung eines Kalibriermodells sehr
gut. Die Vorbehandlungen mit Hilfe Detrend (1) und Detrend (2) zeigen dagegen eine
Verschlechterung
der Vorhersage
im Vergleich
mit
den
Ergebnissen
eines
mittels
Rohspektren erstellten Kalibriermodells.
Differenz Vorhersage- & Sollwert für Ethanol
3
Differenz [Gew.-%]
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
10
12
Soll [Gew.-%]
keine Vorb.
Detrend (1)
Detrend (2)
BL Linear
Abb. 69: Vergleich Differenz zwischen vorhergesagten und realen Ethanolgehalt, (YPD)
Abb. 70 stellt dar, dass sich eine Vorbehandlung der Spektren vor Erstellung eines
Kalibriermodells zur Vorhersage des Wassergehaltes in YPD-Proben als sinnvoll erweist.
Sascha Princz
96
Hierbei sind die Vorhersagen aufgrund der Detrend (1) Vorbehandlung am geeignetsten,
gefolgt von BL Linear und Detrend (2).
Differenz Vorhersage- & Sollwert für Wasser
2
1,5
Differenz [Gew.-%]
1
0,5
0
-0,5
65
70
75
80
85
90
95
100
-1
-1,5
-2
-2,5
Soll [Gew.-%]
keine Vorb.
Detrend (1)
Detrend (2)
BL Linear
Abb. 70: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagten und realen Wassergehalt, (YPD)
5.7.3 Vorhersage Bier
Im letzten Teil zu den Vorversuchen wurden durch eine Messung in verschiedenen Bieren
zusätzlich
erschwerte
Vorhersagebedingungen
geschaffen.
Bei
diesem
Versuch
zur
Vorhersage war wiederum die Schwierigkeit, ähnlich wie in Kapitel 5.7.2, unter Anwesenheit
dem Kalibriermodell nicht bekannter Stoffe die richtige Ethanolkonzentration vorherzusagen.
Weitaus interessanter erschienen hier allerdings folgende Tatsachen: Da es sich bei dem
Hefe Weizen (durch Anwesenheit der Hefe) um eine trübe Flüssigkeit handelt und alle hier
vermessenen Biersorten CO2 enthalten, konnten hier bereits erste Erfahrungen mit diesen
Schwierigkeiten gesammelt werden. Die Angaben zu den vermessenen Bieren finden sich in
Tabelle 31. Die einzelnen Konzentrationen sind in Vol.-% angegeben und wurden den
Herstellerangaben, auf dem entsprechenden Etikett, entnommen. Die Vermessung der
Proben erfolgte ebenfalls in Transflexion.
Tabelle 31: Angaben zu den vermessenen Biersorten, Alkohol in Vol.-%
Biersorte
Hersteller
Alkohol
Alkoholfrei (Alkfrei)
Oettinger
Bier, Helles
Gold Ochsen (Original)
5,1
Hefe Weizen
Ustersbacher
5,5
Sascha Princz
-
97
Die in Tabelle 32 gezeigten Ergebnisse zu den Vorhersagen der einzelnen Biersorten, wurden
ebenfalls mit dem im Rahmen der Vorversuche erstellten Kalibriermodell getroffen. Neben
den Angaben zu den entsprechend berücksichtigten Komponenten, finden sich auch
Angaben zu den verwendeten Methoden für die Vorbehandlung. Es wurden verschiedene
Vorbehandlungen
über
den
kompletten,
sowie
individuell
eingeschränkten
Wellenlängenbereich vorgenommen. In der Tabelle zu den Vorhersagen werden nur diese
erwähnt, die zu den besten bzw. sinnvollsten Ergebnissen geführt haben. Die Umrechnung
der durch die Vorhersage erhaltenen Gew.-% in Vol.-% erfolgte nach Gl. (3.44), entnommen
aus [40].
(3.44)
Hierbei stehen ρn für die spezifische Dichte (bei 20°C) des nicht-alkoholischen Anteils, ρa für
spezifische Dichte (bei 20°C) des Alkohols und ρg für die spezifische Dichte (bei 20°C) des
gesamten Getränks [40].
Tabelle 32: Ergebnisse zur Vorhersage der Biersorten, Alkohol in Vol.-% & Gew.-%
Biersorte
Alkohol
R2
RMSECV
Vorb.
λ [nm]
Rang
-
0,992
0,535
BL Linear
1100-2100
3
3,78
4,83
0,993
0,497
BL Linear
1100-1741
3
4,40
5,62
0,992
0,423
keine Vorb.
1100-2100
3
Gew.-%
Vol.-%
Alkoholfrei
-1,76
Bier, Helles
Hefe Weizen
Da bei den Angaben, des Alkoholgehaltes der entsprechenden Biersorten eine Schwankung
von 0,5 Vol.-% erlaubt sind, macht ein direkter Vergleich zwischen Vorhersage und
angegebenem Wert keinen Sinn. Es lässt sich jedoch, anhand des vorhergesagten Werts, eine
Zuordnung bzw. Aussage zur möglichen Alkoholmenge des Bieres treffen. Das Interessante
an der gelungen Vorhersage des Ethanolgehalts in dem Hefe Weizen liegt vielmehr in der
Tatsache, dass die Messungen in einer opaken (trüben) Flüssigkeit erfolgten. Vergleiche
dazu auch Abb. 71, dort ist der Unterschied bei der Messung in (a) Hefe Weizen und (b) Bier
dargestellt.
Sascha Princz
98
Abb. 71: Vergleich der Messung in (a) Hefe Weizen (trüb, opak) und (b) Bier
Diese Reihe der letzten Vorversuche war darüber hinaus, vor allem im Bezug auf die
erwartete Blasenproblematik, recht informativ. Ausführlicheres zu dieser Problematik findet
sich in dem nachfolgenden Kapitel 5.7.4.
5.7.4 Probleme
Wie bereits im Vorfeld vermutet, dass es aufgrund der Begasung und des Rührens während
einer aeroben Hefefermentation durch die daraus resultierende Blasenbildung zu einer
Störung der Absorptionsmessungen mit der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten
Transflexionssonde kommen kann, traten ähnliche Probleme aufgrund einer Blasenbildung,
verursacht durch anwesendes bzw. gebildetes CO2, bereits während der spektroskopischen
Messungen des Bieres auf.
Was während der Messungen der verschiedenen Biersorten bereits festzustellen war, war die
Bildung von Blasen (CO2) an der Sonde sowie das Einwandern der Blasen in den Spalt
(optischen Weg zur Messung) der Sonde. In Abb. 72 ist dieses Problem bildlich dargestellt.
Dort zeigt die Aufnahme (a) eine Situation mit Blasen im Spalt während einer Messung, und
die Aufnahme (c) eine Messung ohne Blasen im Spalt. Zusätzlich wurde zur besseren
Darstellung dieses Problems des Einwanderns der Blasen eine Aufnahme (b) gemacht, wobei
der Spalt (bzw. optische Weg) weiter geöffnet wurde und somit das Einwandern und Ablagern
der Blasen im Spalt besser zu sehen ist.
Sascha Princz
99
Abb. 72: Vergleich der Blasenbildung an der Sonde während der Messung von Bier
Diese Blasen im optischen Weg hatten und haben letztendlich zum Teil sehr große
Auswirkungen auf die erhaltenen Absorptionsspektren, und stellen somit ein nicht
unerhebliches Problem währen der Messungen mit dieser Art von Sonde dar.
Diese zum Teil durch die Blasen stark verfälschten Absorptionsspektren der entsprechenden
Biere sind in den Abb. 73 (Oettinger, alkoholfreies Bier), Abb. 74 (Gold Ochsen, Original) und
Abb. 75 (Hefe Weizen) im Vergleich den zu erwartenden Absorptionsspektren (ohne Blasen)
gegenübergestellt. Es wurden für jedes Bier mehrere Absorptionsspektren über einen
längeren Zeitraum aufgezeichnet, wobei die Aufzeichnungen zunächst in Form eines Single
Scan (mit N=64 und It=11,5s) durchgeführt wurden.
Sascha Princz
100
3 Spektren der Messung Bier alkoholfrei mit und ohne Blasen
0,5
Absorbance Unit
0
1100
1300
1500
1700
1900
2100
-0,5
-1
-1,5
-2
Wellenlänge [nm]
Alkfrei 2
Alkfrei 4
Alkfrei 11
Abb. 73: Auswahl verschiedener Absorptionsspektren während der Bier alkoholfrei Messung
Abb. 73 zeigt nun drei ausgesuchte Spektren der Absorptionsmessungen von alkoholfreien
Bier, wobei sich die teilweise gravierenden Einflüsse der Blasen recht anschaulich zeigen
(rote und blaue Kurve).
Die grüne Kurve (Alkfrei 11) zeigt ein zu erwartendes
Absorptionsspektrum für ein alkoholfreies Bier.
3 Spektren der Messung Gold Ochsen mit und ohne Blasen
0,2
0,15
Absorbance Unit
0,1
0,05
0
1100
1300
1500
1700
1900
2100
-0,05
-0,1
-0,15
Wellenlänge [nm]
Gold Ochsen 2
Gold Ochsen 6
Gold Ochsen 7
Abb. 74: Auswahl verschiedener Absorptionsspektren während der Gold Ochsen Messung
Sascha Princz
101
In Abb. 74 zeigt sich, ebenfalls an Hand von drei ausgesuchten Spektren, der Einfluss der
Blasen auf die Absorptionsspektren während der Messungen des Gold Ochsen Bieres. Auch
hier sind die gravierenden Einflüsse der Blasen recht gut zu erkennen (rote und blaue Kurve).
Die
grüne
Kurve
(Gold
Ochsen
6)
zeigt
zum
Vergleich
ein
zu
erwartendes
Absorptionsspektrum für ein alkoholhaltiges Bier.
3 Spektren der Messung Hefe Weizen mit und ohne Blasen
0,5
0,4
Absorbance Unit
0,3
0,2
0,1
0
1100
-0,1
1300
1500
1700
1900
2100
-0,2
-0,3
Wellenlänge [nm]
Hefe Weizen 1
Hefe Weizen 4
Hefe Weizen 6
Abb. 75: Auswahl verschiedener Absorptionsspektren während der Hefe Weizen Messung
Abb. 75 zeigt in den drei ausgesuchten Absorptionsspektren des Hefe Weizen Bieres
ebenfalls eine zum Teil gravierenden Verfälschung der Spektren aufgrund der Blasen im
optischen Weg (rote und blaue Kurve). Die grüne Kurve (Hefe Weizen 4) zeigt ein zu
erwartendes Absorptionsspektrum für ein alkoholhaltiges Bier bzw. Hefe Weizen.
Da wie bereits erwähnt zu erwarten ist, dass dieses Problem auch bei einer anaeroben sowie
aeroben
Hefefermentation
verstärkt
auftreten
wird,
da
zu
Beginn
aufgrund
der
Verstoffwechselung von Glucose eine starke Bildung von CO2 stattfindet (siehe dazu auch Gl.
(3.40), Gl. (3.42) und Gl. (3.43)), musste eine einfache und leicht zu realisierende Lösung
gefunden werden um dieses Problem zu lösen. Es erfolgten Überlegungen sowie Versuche in
verschiedene
Richtungen,
wie
einer
mechanischen
Lösung
z.
B.
in
Form
einer
Blasenzerstörung mit Hilfe von Ultraschall oder einer Barriere zur Verhinderung des
Eindringens der Blasen in den optischen Pfad, sowie einer datengestützten Korrektur bzw.
Problemlösung. Nachdem die Idee mit dem Ultraschall, aufgrund der nicht einzuschätzenden
Einflüsse auf die Messtechnik des Bioprozesssystems sowie den Biokatalysator und somit
Sascha Princz
102
den Bioprozess selbst, schnell wieder verworfen wurde, erfolgten erste Versuche mit Hilfe
einer mechanischen Barriere. Dabei wurde, ähnlich dem Prinzip der Filtration, ein Filtertuch
um den Kopf der Transflexionssonde angebracht und somit ein Eindringen der Blasen
verhindert. Abb. 76 zeigt die Sonde einmal mit Filter (b) und einmal ohne Filter (a) während
des Versuchs mit kohlensäurehaltigem Mineralwasser.
Abb. 76: Transflexionssonde ohne (a) und mit (b) Blasenfilter
Mit Hilfe dieses Filters konnte ein Eindringen der Blasen erfolgreich verhindert werden,
allerdings hatte diese Methode auch eine Messwertverzögerung zur Folge. Dieser Effekt
zeigte sich bei einem Vergleich der Messungen mit Filter in kohlensäurehaltigem
Mineralwasser und ohne Filter in demselben Mineralwasser ohne Kohlensäure (wurde zuvor
manuell durch Rühren entfernt), als während beiden Messungen kontrolliert Ethanol
zugegeben wurde und bei dem Aufbau mit Filter eine zeitverzögerte Änderung des
spektroskopischen Signals, gegenüber der Messung ohne Filter, auftrat. Allerdings war bei
dieser Methode die Befürchtung, dass sich während einer fortschreitenden Hefefermentation
Hefezellen in bzw. auf dem Filter anlagern und letztendlich einen Austausch des zu
messenden Mediums erschweren bzw. sogar verhindern.
Um eine Gefahr zusätzlicher mechanischer Probleme zu umgehen wurde folgendes Vorgehen
versucht. Die Aufzeichnung der Spektren durch die Spektrometersoftware erfolgte bis zu
diesem Zeitpunkt der Arbeit mit Hilfe der Single Scan Einstellung. Dabei wurde pro Messung
ein
einzelnes
gemitteltes
Spektrum
(über
N=64
Spektren
mit
einer
I t=11,5 ms)
abgespeichert. Gerade wenn in diesen 64 Spektren für die Mittelung ein oder mehrere
Sascha Princz
103
Spektren zu einem Zeitpunkt, wo sich Blasen im Spalt befinden, aufgezeichnet werden,
kommt
es
zu
einer
mehr
oder
weniger
starken
Verfälschung
des
gemittelten
Absorptionsspektrums. Um dieses Problem zu umgehen wurde nun die Time Scan
Einstellung der Spektrometersoftware gewählt. Bei dieser Einstellung werden über einen
definierten Zeitraum (hier 60 s) in einem bestimmten Intervall (hier 1 s) entsprechend viele
Spektren (hier
) mit einer It=11,5 ms aufgezeichnet. Diese Spektren wurden dann
hinsichtlich ihrer äußeren Form beurteilt und anschließend für eine nachfolgende Mittelung
ausgewählt oder verworfen. Für eine bildliche Erklärung wurden in Abb. 77 drei ausgewählte
Absorptionsspektren (Messung1, Messung24 und Messung46) dargestellt. Diese Spektren
wurden
bei
einem
Time
Scan
während
der
unter
Kapitel
6
vorgestellten
Schüttelkolbenfermentation (SKF) nach einer Fermentationsdauer von etwa 13 Stunden
aufgezeichnet. Dabei zeigt die grüne Kurve ein zu erwartendes Spektrum und die rote und
blaue Kurve ein Spektrum mit unterschiedlich starken Verfälschungen aufgrund der bereits
erklärten Blasenproblematik. Die Idee zur Ermittlung vorhandener verfälschter Spektren, um
diese vor einer Mittelung verwerfen zu können, lag in einer vorherigen Filterung aller im
Rahmen des entsprechenden Time Scan aufgezeichneten Absorptionsspektren.
3 Messungen eines Time Scan bei SKF
1,6
1,4
Absorbance Unit
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
Wellenlänge nm
Messung24
Messung1
Messung46
Abb. 77: Ausgewählte Absorptionsspektren eines Time Scan bei einer SKF
Um
ein
entsprechendes
Filterkriterium
festlegen
zu
können
wurde
zunächst
ein
Wellenlängenbereich, der keine Wasserabsorption zeigt (hier 1360 nm) gewählt, sowie ein
Wellenlängenbereich mit mittelstarker Wasserabsorption (hier 1431 nm). Anschließend
Sascha Princz
104
wurde die Differenz der AU-Werte bei diesen beiden Wellenlängen berechnet und als
Filterkriterium festgelegt. Diese für den zuvor erwähnten Time Scan erhaltenen Differenzen
der AU-Werte sind in der in Abb. 78 gezeigten Grafik abgebildet.
Differenz AU-Werte
AU-Wert Differenzen (1360-1431nm) eines Time Scans
0,15
0,14
0,13
0,12
0,11
0,1
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
Abb. 78: Darstellung der gebildeten Differenzen der AU-Werte eines Time Scan
Anhand dieser Grafik erfolgt nun die Ermittlung eines individuellen Schwellwerts (hier
0,065). Spektren, deren Differenz über diesem Schwellwert liegt, werden verworfen und die
restlichen
Spektren
werden
zur
Bildung
eines
gemittelten
Absorptionsspektrums
herangezogen. Bereits hier fällt dem Betrachter auf, dass eine gewisse Periodizität in den
AU-Wert Differenzen, und somit im Auftreten der Blasenproblematik, zu erkennen ist. Siehe
dazu auch Kapitel 7.3.3.
Letztendlich fiel die Entscheidung auf die datengestützte Problemlösung, obwohl auch hier
eine Zeitverzögerung in Kauf genommen wird, aber zusätzliche mechanische Probleme, wie
z. B. ein Zusetzen des Filtermediums durch Hefezellen, ausgeschlossen werden können.
Sascha Princz
105
6
Die ersten Versuche einer Konzentrationsbestimmung mit Hilfe des bis zu diesem Zeitpunkt
der Arbeit erstellten Kalibriermodells erfolgten anhand der Messungen von Fermentationen,
die in einem Schüttelkolben durchgeführt wurden. Neben einem ersten Versuch der
Konzentrationsbestimmung waren diese Messungen aber auch wichtig für die Integration
und
Erweiterung
der
mittels
NIRS
und
Referenzanalytik
erhaltenen
Daten
in
das
Kalibriermodell. Für die Referenzanalytik, also zur genauen Bestimmung der Ethanol- und
Glucosekonzentration in der Fermenterbrühe kamen enzymatische Testsets (UV-Test) der
Firma R-Biopharm AG sowie Teststäbchen der Firma Merck KGaA für eine reflektrometrische
Auswertung zum Einsatz. Nähere und weiterführende Angaben zu den entsprechenden Tests
finden sich in den entsprechenden Bedienungsanleitungen im Anhang.
6.1 Vorbereitung der Schüttelkolbenfermentation
Für die Schüttelkolbenfermentation mussten zunächst die nachfolgenden Vorbereitungen
getroffen werden.

Nährmedium: Für die Hefefermentation im Schüttelkolben wurde 1 kg Universalmedium
mit der in Tabelle 33 gezeigten Zusammensetzung hergestellt und verwendet.
Tabelle 33: Zusammensetzung des Nährmediums für die Hefefermentation
Zusammensetzung des Nährmediums
Chemikalie/ Nährstoff

g kg-1
Hefeextrakt
10
Pepton
20
Glucose
136
VE Wasser
834
Startbiomasse: Es wurde 8,4 g kg-1 Trockenbiomasse von Saccharomyces cerevisiae
verwendet. Dabei entsprachen den benötigten 8,4 g Trockenbiomasse ungefähr 29,82 g
der verwendeten Nasshefe wieninger hefe (F. X. Wieninger GmbH).
Nachdem die Vorbereitungen beendet waren, wurde das Nährmedium mit Hilfe eines
Autoklaven bei 121°C für 15 min sterilisiert. Anschließend erfolgte der Aufbau des in Abb.
79 gezeigten Versuchssystems, bestehend aus dem Messsystem, Temperiereinheit und
einem sterilen Ein-Liter-Schüttelkolben.
Sascha Princz
106
Abb. 79: Aufbau des Versuchssystems für die Schüttelkolbenfermentation von S. cerevisiae
6.2 Durchführung der Schüttelkolbenfermentation
Vor Beginn der Hefefermentation wurde zunächst das Medium auf 30°C vortemperiert und
die Nasshefe in einem Teil des Mediums gelöst. Nach dem Start der Fermentation erfolgte
die Inokulation (Einbringen der Startbiomasse) des Schüttelkolbens.
Nachfolgend
sind
die
Einstellungen
der
Prozessparameter
während
der
Schüttelkolbenfermentation aufgeführt:

Rührerdrehzahl:
Stufe 1

Begasungsrate:
keine

Temperatur:
30°C
Die Rührerdrehzahl bezieht sich auf Einstellung der Temperiereinheit für das Rühren mit
Hilfe eines Rührfischs, und wurde während der spektroskopischen Messungen abgeschaltet.
Der Grund für das Rühren zwischen den Messungen war wichtig um eine homogene
Temperaturverteilung zu erreichen sowie gleichzeitig ein Absinken der Hefezellen auf den
Boden zu verhindern.
Für die erforderliche Offline-Auswertung des Prozessverlaufs, zur Feststellung der Glucoseund Ethanolkonzentration, erfolgte die erste Probenentnahme direkt nach der Inokulation
und anschließend in einem Zeitintervall von 60 Minuten. Dabei wurde jeweils ein
Probenvolumen von zweimal 2 ml entnommen. Zusätzlich wurden in größeren Zeitabständen
extra
Proben
Sascha Princz
entnommen
und
direkt
mit
Hilfe
einer
reflektometrischen
Analyse
107
(Teststäbchen der Firma Merck KGaA, Bedienungsanleitungen im Anhang) ausgewertet um
eine Aussage über den Verlauf bzw. Stand der Fermentation zu erhalten.
6.3 Auswertung der Schüttelkolbenfermentation
Unmittelbar
nach
jeder
Probenentnahme
wurden
die
für
eine
Offline-Auswertung
entnommenen Proben sofort bei 8000 Umdrehungen pro Minute und 4°C für zwei Minuten
zentrifugiert (Heraeus, Multifuge 3S-R) und der Überstand tiefgefroren. Die Proben wurden
tiefgefroren um eine Auswertung zu einem späteren Zeitpunkt durchführen zu können.
Nach dem Auftauen wurde in dem durch das Zentrifugieren von den Hefezellen getrennten
Überstand
mittels
einem
Glucose-
und
Ethanol-UV-Test
(Firma
R-Biopharm
AG,
Bedienungsanleitungen im Anhang) der jeweilige Substratgehalt ermittelt.
Die Aufnahme der Absorptionsspektren erfolgte in einem Time Scan Modus, das heißt es
wurden über einen Zeitraum von 60 s, in einem Zeitintervall von 1 s, 60 Absorptionsspektren
mit einer Integrationszeit von 11,5 ms aufgezeichnet. Die genauen Einstellungen dazu
können aus Tabelle 34 entnommen werden.
Tabelle 34: Parameter des Time Scan Modus bei der Schüttelkolbenfermentation
Representation
Absorption
Scan Typ
Time scan
Integration Time [ms]
11,5
Accumulation
1
Bunching (Pixel)
1
Total Scan Time [s]
60
Sample Intervall [s]
1
6.3.1 Offline-Auswertung
Die Auswertung der während der anaeroben SKF entnommenen Proben liefert nach Abb. 80
folgende Ergebnisse.
Während dem zu Fermentationsbeginn vorherrschenden Überschuss an Glucose (grüne
Kurve) wurde, neben Biomasse, hauptsächlich Ethanol (blaue Kurve) gebildet. Nachdem das
Glucoseangebot, nach einer Fermentationsdauer von etwa 14 Stunden, aufgebraucht war
kam es erwartungsgemäß zu keiner weiteren signifikanten Ethanolbildung. Aus diesem
Grund wurde die SKF nach 18 Stunden beendet.
Sascha Princz
108
Verlauf Glucose & Ethanol [g/L] während Hefefermentation
140
Konzentration [g/L]
120
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Fermentationsdauer [h]
Ethanol [g/L]
Glucose [g/L]
Abb. 80: Offline-Auswertung zu Glucoseverbrauch und Ethanolbildung der SKF
In Tabelle 35 sind neben den Ergebnissen der durch die UV-Tests erhaltenen Glucose- und
Ethanolkonzentrationen auch die Ergebnisse der Kontrolllösungen (Ktr.Lsg) für Glucose (soll
0,5 g/L) und Ethanol (soll 0,06 g/L) aufgelistet. Diese wurden mitgeführt um eine Kontrolle
zur richtigen Durchführung der Auswertung zu erhalten.
Tabelle 35: Ergebnisse der Ethanol und Glucose Auswertung zur SKF durch UV-Tests
Probe
Prozesszeit [h]
Glucose [g/L]
Ethanol [g/L]
Ktr.Lsg1
-
0,4845
0,0568
1
0
137,32
1,76
2
1
123,50
5,83
3
2
109,68
10,54
4
3
107,96
14,17
5
4
80,32
16,70
6
5
71,68
21,08
7
6
63,48
25,22
8
7
51,82
27,30
9
8
44,91
32,94
10
9
35,41
35,36
11
10
29,11
39,97
12
11
21,07
44,92
13
12
10,80
46,53
14
13
5,44
48,14
15
14
0
59,43
16
15
0
59,43
17
16
0
59,43
Sascha Princz
109
18
17
19
0
62,42
18
0
62,42
-
0,4716
-
Ktr.Lsg2
6.3.2 Online-Auswertung
Nach einer ersten Betrachtung der mit Hilfe der Inline-Messung im Rahmen der Time Scans
aufgezeichneten Einzelspektren zeigte sich wie erwartet auch hier das Problem der
Blasenproblematik (mehr dazu in Kapitel 6.3.3 und 7.3.3). Aus diesem Grund erfolgte in
einem ersten Schritt eine Filterung der relevanten Spektren nach der in Kapitel 5.7.4
vorgestellten Methode. Das Ergebnis nach einer Filterung zeigt Abb. 81 in Form von
gemittelten Absorptionsspektren zu den einzelnen Messungen. Aus der Grafik ist auch zu
erkennen, dass die Spektren ab einer Wellenlänge von etwa 1900 nm zum Teil stark
verrauscht sind, und auch mit zunehmender Prozesszeit der Offset zur Basislinie stark
zunimmt.
Mittelwerte der gefilterten Absorptionsspektren einer SKF
1,4
1,2
Absorbance Unit
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1100
1200
Probe1
Probe8
Probe15
1300
Probe2
Probe9
Probe16
1400
1500
1600
1700
1800
Wellenlänge [nm]
Probe3
Probe4
Probe5
Probe10
Probe11
Probe12
Probe17
Probe18
Probe19
1900
2000
Probe6
Probe13
2100
Probe7
Probe14
Abb. 81: MW der gefilterten Absorptionsspektren der Proben während einer SKF
Vor der Durchführung einer Vorhersage wurden zunächst verschiedene Methoden zur
Vorbehandlung (Vorb.) der Spektren des Kalibriermodells, im Hinblick auf ihre R 2 (der
Validierung) und RMSE Werte hin analysiert. In Tabelle 36 finden sich die Ergebnisse für die
Modelloptimierung zur Vorhersage von Glucose in den SKF-Proben mit Angabe der Anzahl
Sascha Princz
110
der
verwendeten
Komponenten
(unter
Rang).
Die
Stützstellen
für
die
lineare
Basislinienkorrektur (BL Linear) lagen bei etwa 1100 nm und 1540 nm. SG (2;9) steht für eine
Savitzky-Golay-Glättung, mit einem Polynom 2. Grades über 9 Stützstellen. Die Zahlen in
den Klammern bei der Vorbehandlung Detrend stehen für den Grad des Polynoms. Befinden
sich mehrere Methoden in der Spalte für die Vorbehandlung, wurden diese in der
aufgeführten Reihenfolge durchgeführt. Die Tabellen zeigen nicht alle durchgeführten
Methoden, es sind lediglich die Methoden aufgeführt, die am geeignetsten für eine
Vorhersage des entsprechenden Stoffs erschienen.
Tabelle 36: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in SKF-Proben
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
5
0,9167
5,109
14,218
SG (2;9)
1100-2100
3
0,9259
11,040
13,434
SG (2;9) BL Linear
1100-2100
4
0,8923
6,058
16,268
Einen grafischen Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der Spektren für ein
Kalibriermodell und zur Vorhersage von Glucose in SKF-Proben zeigt Abb. 82. Der Vergleich
erfolgt zum einen bezüglich des R² (bei Validierung) und zum anderen bezüglich der RMSE
Werte für die Kalibrierung und Validierung des entsprechenden Kalibriermodells.
0,93
50
45
0,92
40
35
0,91
0,9
25
RMSE
R²
30
20
0,89
15
10
0,88
5
0,87
0
SG (2;9) BL Linear
keine Vorb.
R²
RMSEC
SG (2;9)
RMSECV
In Tabelle 37 finden sich die Ergebnisse für die Modelloptimierung zur Vorhersage von
Ethanol in den SKF-Proben mit allen relevanten Angaben.
Sascha Princz
111
Tabelle 37: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in SKF-Proben
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
5
0,8703
1,167
7,776
SG (2;9)
1100-2100
3
0,9534
4,024
5,622
SG (2;9) BL Linear
1100-2100
3
0,9419
2,865
4,850
Abb. 83 zeigt einen grafischen Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der
Spektren für ein Kalibriermodell und zur Vorhersage von Ethanol in SKF-Proben.
0,96
50
45
0,94
40
0,92
35
R²
25
0,88
RMSE
30
0,9
20
15
0,86
10
0,84
5
0,82
0
keine Vorb.
SG (2;9) BL Linear
R²
RMSEC
SG (2;9)
RMSECV
Die Stoffkonzentrationen der für die Vorhersage ausgewählten SKF-Proben zeigt Tabelle 38.
Die Angaben sind in g/L.
Tabelle 38: Zusammensetzung der SKF-Proben für Vorhersage, Angaben in g/L
Probe
Glucose
Ethanol
4
107,96
14,17
7
63,48
25,22
11
29,11
39,97
14
5,44
48,14
Die Ergebnisse erzielter Vorhersagen der entsprechenden Stoffkonzentrationen zeigt Tabelle
39. Auch hier finden sich wieder die Angaben zu den entsprechend berücksichtigten
Komponenten und der verwendeten Methode für die Vorbehandlung.
Sascha Princz
112
Tabelle 39: Ergebnisse zur Vorhersage der SKF-Proben, Angaben in g/L
Probe
Glucose
Ethanol
Bereich λ [nm]
Vorb.
Rang
4
93,66
13,73
1100-2100
keine Vorb.
5/5
7
69,10
24,22
1100-2100
keine Vorb.
5/5
11
37,67
34,72
1100-2100
keine Vorb.
5/5
14
26,38
47,33
1100-2100
keine Vorb.
5/5
4
100,85
11,76
1100-2100
SG (2;9)
3/3
7
65,68
26,95
1100-2100
SG (2;9)
3/3
11
33,97
36,78
1100-2100
SG (2;9)
3/3
14
8,78
53,67
1100-2100
SG (2;9)
3/3
4
91,11
13,91
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
4/3
7
63,19
23,81
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
4/3
11
38,55
34,23
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
4/3
14
30,60
48,92
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
4/3
Auch
hier
wurde
für
eine
Beurteilung
der
entsprechenden
Methode
zur
Spektrenvorbehandlung die Differenz zwischen realer Stoffkonzentration und dem mit Hilfe
des Kalibriermodells vorhergesagten Wert berechnet, und grafisch über den Sollwert
aufgetragen.
In Abb. 84 ist die Differenz der einzelnen Methoden zur Vorhersage von Glucose während
einer SKF aufgetragen. Es zeigt sich, dass die besten Vorhersagen mit dem Kalibriermodell
aus den mittels SG (2;9) vorbehandelten Spektren erzielt wurden.
Differenz Vorhersage- & Sollwert Glucose
30
25
20
Differenz [g/L]
15
10
5
0
-5
0
20
40
60
80
100
120
-10
-15
-20
Soll [g/L]
keine Vorb.
SG (2;9)
SG (2;9) BL Linear
Sascha Princz
113
Zur Vorhersage des Ethanolgehalts in den SKF-Proben eignet sich, wie Abb. 85 zeigt, eine
Vorbehandlung der Spektren mittels SG (2;9) BL Linear und keine Vorb. der Spektren vor
Erstellung eines Kalibriermodells. Die Vorbehandlungen mit Hilfe SG (2;9) zeigt dagegen eine
Verschlechterung der Vorhersage.
Differenz Vorhersage- & Sollwert Ethanol
6
Differenz [g/L]
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
-2
-4
-6
Soll [g/L]
keine Vorb.
SG (2;9)
SG (2;9) BL Linear
Zusätzlich zur Inline-Messung während der Hefefermentation wurde eine spektroskopische
Vermessung der Proben nach der Zentrifugation, also ohne Hefezellen, durchgeführt. Die
Vermessung erfolgte ebenfalls mit dem in dieser Arbeit vorgestellten NIRS-System in
Transflexion zu einem späteren Zeitpunkt. Die genauen Einstellungen des Spektrometers für
die zentrifugierten SKF-Proben zeigt Tabelle 40.
Tabelle 40: Parameter des Single Scan Modus für die zentrifugierten SKF-Proben
Die
Represantation
Absorption
Scan Typ
Single scan
11,5
Accumulation
64
Bunching (Pixel)
1
gewonnen
Spektren
der
zentrifugierten
SKF-Proben
zeigt
Abb.
86.
Die
Absorptionsspektren wurden für eine übersichtlichere Darstellung einer NPK bei 1100 nm
unterzogen. Die Proben stammen aus zwei SKF. Im Vergleich zu den durch eine InlineMessung gewonnenen Spektren (Abb. 81) zeigt sich eine deutlich veränderte Spektrenform
Sascha Princz
114
aufgrund der fehlenden Hefezellen. Neben dem für Ethanol typischen spektralen Verlauf
zwischen 1670 nm und 1750 nm (vgl. Abb. 48) zeigt sich auch eine Abnahme in dem für
Glucose typischen Wellenlängenbereichen von 1530 nm bis 1780 nm sowie ab 2070 nm (vgl.
Abb. 51).
Absorptionsspektren der zentrifugierten SKF-Proben, NPK bei 1100nm
Absorbance Unit
0
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
-0,05
-0,1
-0,15
-0,2
Probe1
Probe7
Probe13
Probe19
Probe2
Probe8
Probe14
Probe20
Wellenlänge [nm]
Probe3
Probe4
Probe9
Probe10
Probe15
Probe16
Probe21
Probe22
Probe5
Probe11
Probe17
Probe23
Probe6
Probe12
Probe18
Probe24
Abb. 86: Absorptionsspektren der zentrifugierten SKF-Proben, NPK bei 1100 nm
Im Anschluss erfolgte eine Auswertung mit Hilfe der „The Unscrambler“ Software. Hierfür
erfolgte zunächst eine Vorhersage mit Hilfe des im Rahmen der Vorversuche erstellten
Kalibriermodells. Da diese Vorhersage keine verwertbaren Ergebnisse lieferte, musste aus
den vorhandenen Daten der zentrifugierten SKF-Proben ein neues Kalibriermodell erstellt
werden. Es wurden zufallsweise Proben zur Erstellung eines Kalibriermodells ausgewählt, die
nicht für die Erstellung verwendeten Proben wurden für die Vorhersage verwendet.
Auch hier wurden zunächst verschiedene Methoden zur Vorbehandlung (Vorb.) der Spektren
des Kalibriermodells, im Hinblick auf ihre R 2 (der Validierung) und RMSE Werte hin analysiert.
Glucose in den zentrifugierten SKF-Proben mit Angabe der Anzahl der dafür verwendeten
Komponenten. Die Stützstellen für die lineare Basislinienkorrektur lagen bei etwa 1100 nm
und 1540 nm. Die Basislinienkorrektur um einen konstanten Offset erfolgte bei 1100 nm.
Die Tabellen zeigen nicht alle durchgeführten Methoden, es sind lediglich die Methoden
aufgeführt, die am geeignetsten für eine Vorhersage des entsprechenden Stoffs erschienen.
Sascha Princz
115
Tabelle 41: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in zentrifugierten SKF-Proben
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
5
0,9700
4,520
8,250
Detrend (1)
1100-2100
3
0,9656
6,051
9,166
Detrend (2)
1100-2100
3
0,9640
5,859
9,263
BL Offset
1100-2100
4
0,9623
5,767
9,295
BL Linear
1100-2100
3
0,9694
5,826
8,175
Abb. 87 zeigt den grafischen Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der
Absorptionsspektren
für
ein
Kalibriermodell
zur
Vorhersage
von
Glucose
in
den
zentrifugierten SKF-Proben.
0,972
50
45
0,97
40
0,968
35
R²
25
0,964
RMSE
30
0,966
20
15
0,962
10
0,96
5
0,958
0
BL Offset
Detrend (2)
R²
Detrend (1)
RMSEC
BL Linear
keine Vorb.
RMSECV
Ethanol in den zentrifugierten SKF-Proben mit allen relevanten Angaben.
Tabelle 42: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in zentrifugierten SKF-Proben
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
4
0,9821
1,715
3,256
Detrend (1)
1100-2100
3
0,9745
2,874
3,673
Detrend (2)
1100-2100
2
0,9616
3,500
4,163
BL Offset
1100-2100
4
0,9867
1,506
2,577
BL Linear
1100-2100
3
0,9763
2,741
3,702
Sascha Princz
116
Abb. 88 zeigt einen grafischen Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der
Spektren für ein Kalibriermodell und zur Vorhersage von Ethanol in den zentrifugierten SKFProben.
0,99
50
0,985
45
0,98
40
35
30
0,97
RMSE
R²
0,975
25
0,965
20
0,96
15
0,955
10
0,95
5
0,945
0
Detrend (2)
Detrend (1)
R²
BL Linear
RMSEC
keine Vorb.
BL Offset
RMSECV
Abb. 88:Vergleich der Methoden zur Vorbehandlung für Ethanol
Die Stoffkonzentrationen der für die Vorhersage ausgewählten zentrifugierten SKF-Proben
zeigt Tabelle 44. Die Angaben sind in g/L.
Tabelle 43: Zusammensetzung der zentrifugierten SKF-Proben für Vorhersage, Angaben in g/L
Probe
Glucose
Ethanol
5
80,32
16,70
7
63,48
25,22
14
5,44
48,14
21
0
62,42
Eine Auswahl der Ergebnisse zur Vorhersage der entsprechenden Stoffkonzentrationen zeigt
Tabelle 44. Auch hier finden sich wieder die Angaben zu den entsprechend berücksichtigten
Tabelle 44: Ergebnisse zur Vorhersage der zentrifugierten SKF-Proben, Angaben in g/L
Probe
Glucose
Ethanol
Bereich λ [nm]
Vorb.
Rang
5
76,09
18,25
1100-2100
keine Vorb.
5/4
7
61,73
27,56
1100-2100
keine Vorb.
5/4
14
5,59
55,83
1100-2100
keine Vorb.
5/4
21
-0,16
60,28
1100-2100
keine Vorb.
5/4
5
77,61
19,93
1100-2100
Detrend (1)
3/3
Sascha Princz
117
Zur
7
64,44
29,18
1100-2100
Detrend (1)
3/3
14
3,59
54,44
1100-2100
Detrend (1)
3/3
21
-0,47
60,00
1100-2100
Detrend (1)
3/3
5
77,79
19,62
1100-2100
Detrend (2)
3/2
7
62,93
28,87
1100-2100
Detrend (2)
3/2
14
5,57
54,37
1100-2100
Detrend (2)
3/2
21
-0,59
59,62
1100-2100
Detrend (2)
3/2
5
76,31
18,14
1100-2100
BL Offset
4/4
7
62,4
27,98
1100-2100
BL Offset
4/4
14
5,07
55,51
1100-2100
BL Offset
4/4
21
-1,28
60,12
1100-2100
BL Offset
4/4
5
77,02
20,26
1100-2100
BL Linear
3/3
7
63,26
29,78
1100-2100
BL Linear
3/3
14
3,53
54,65
1100-2100
BL Linear
3/3
21
-1,91
60,76
1100-2100
BL Linear
3/3
Vorhersage
des
Glucosegehalts
in
zentrifugierten
SKF-Proben
liefert
eine
Spektrenvorbehandlung mit Hilfe Detrend (2) die besten Ergebnisse. Einen Vergleich der
verschiedenen Vorbehandlungsmethode für die Vorhersage von Glucose in zentrifugierten
SKF-Proben liefert Abb. 89.
1,5
Differenz [g/L]
0,5
-0,5 0
10
20
30
40
50
60
70
80
-1,5
-2,5
-3,5
-4,5
Soll [g/L]
keine Vorb.
Detrend (1)
Detrend (2)
BL Offset
BL Linear
(zentrifugiert)
Abb. 90 zeigt einen Vergleich der verschiedenen Vorbehandlungsmethoden für die
Vorhersage der Ethanolkonzentration in zentrifugierten SKF-Proben.
Sascha Princz
118
8
Differenz [g/L]
6
4
2
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
-2
-4
Soll [g/L]
keine Vorb.
Detrend (1)
Detrend (2)
BL Offset
BL Linear
(zentrifugiert)
6.3.3 Auffälligkeiten
Im Rahmen der Auswertung, der mit Hilfe einer Inline-Messung gewonnener Spektren bei der
SKF, haben sich neben dem zu erwartenden Problem der Blasenproblematik weitere
Auffälligkeiten und Effekte gezeigt.
Zunächst soll anhand der nachfolgenden Abbildungen (Abb. 91 bis Abb. 93) die
Blasenproblematik gezeigt werden. Abb. 91 zeigt die Differenz zwischen den AU-Werten bei
1360 nm und 1431 nm direkt nach der Inokulation (Start der Fermentation, Prozesszeit 0 h).
Es ist zu sehen, dass innerhalb der 60 Messungen des Time Scans keine signifikanten
Unterschiede in den Differenzen der AU-Werte auftreten. Zu diesem Zeitpunkt der SKF fand
noch keine Verstoffwechselung der Glucose durch die Hefezellen statt, und somit auch keine
Bildung von CO2.
Sascha Princz
119
0,06
Differenz 1360-1431 nm Probe 1 SKF
Differenz AU-Werte
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
SKF110412#1
Abb. 91: AU-Wert Differenz einer SKF Messung direkt nach Inokulation (ungefiltert)
Abb. 92 zeigt ebenfalls die Differenz zwischen den AU-Werten bei 1360 nm und 1431 nm,
allerdings während des Fermentationsprozess (Prozesszeit 2 h). Es ist zu sehen, dass
innerhalb der 60 Messungen des Time Scan bereits signifikante Unterschiede in den
Differenzen der AU-Werte auftreten. Zu diesem Zeitpunkt der SKF fand bereits eine
Verstoffwechselung der Glucose zu Ethanol durch die Hefezellen statt. Entsprechend
Gl. (3.43) kam es hier bereits vermehrt zu einer Bildung von CO2 und der daraus
resultierenden Blasenbildung. Für eine spätere Mittelung der Spektren erfolgte eine
Filterung, nach der in Kapitel 5.7.4 vorgestellten Methode. Der Schwellwert für die Filterung
lag hier bei 0,0565 (roter Balken in Abb. 92). Somit wurden alle Spektren, deren AU-Wert
Differenz über diesem Schwellwert lag, verworfen.
Sascha Princz
120
0,18
Differenz 1360-1431 nm Probe 3 SKF mit Schwellwert 0,0565
0,16
Differenz AU-Werte
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
SKF110412#3
Abb. 92: AU-Wert Differenz einer SKF Messung während des Fermentationsprozess (ungefiltert)
Die Differenz zwischen den AU-Werten bei 1360 nm und 1431 nm nach der Filterung ist in
Abb. 93 dargestellt. Lediglich diese 37 Spektren aus dem Time Scan wurden für eine
Mittelung herangezogen.
0,06
Differenz 1360-1431 nm Probe 3 SKF nach Filterung
Differenz AU-Werte
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37
Messung
SKF110412#3
Abb. 93: AU-Wert Differenz einer SKF Messung während des Fermentationsprozess (gefiltert)
Nachdem zum Ende
der SKF
das komplette Glucoseangebot von
den
Hefezellen
verstoffwechselt war, kam es zu keiner weiteren CO2- und daraus resultierender
Blasenbildung. Abb. 94 zeigt eine ungefilterte AU-Wert Differenz bei einer Messung zum
Sascha Princz
121
Ende der Fermentation (Prozesszeit 18 h). Wie zu sehen ist, kam es hier zu keiner
signifikanten Abweichung der AU-Wert Differenzen.
0,09
Differenz 1360-1431 nm Probe 19 SKF
0,08
Differenz AU-Werte
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
SKF110412#19
Abb. 94: AU-Wert Differenz einer SKF Messung am Ende des Fermentationsprozess (ungefiltert)
Eine weitere, in Abb. 95 grafisch dargestellte, Auffälligkeit zeigte sich während einer der SKF.
Dabei wurden bei einzelnen Spektren innerhalb eines Time Scans, Spitzen von etwa
10 Absorbance Units bei einzelnen Wellenlängen detektiert. Auffällig daran ist auch, dass
diese Spitzen nur bei den Wellenlängen 1026 nm und 1946 nm auftraten. Insgesamt wurden
3 Spektren mit Spitzen in der Größenordnung von 10 Absorbance Units detektiert. Diese
traten innerhalb zwei verschiedener Time Scans auf, einmal nach einer Prozesszeit von 16 h
(eine Spitze bei 1026 nm) und zweimal bei 18 h (eine Spitze bei 1026 nm und eine zweite
bei 1946 nm, gezeigt in Abb. 95). Da im Rahmen dieser Arbeit die gewonnenen
Absorptionsspektren erst ab einer Wellenlänge von 1100 nm genutzt werden, haben die
Spitzen bei 1026 nm keinen Einfluss. Das Spektrum mit einer Spitze bei 1946 nm wurde
verworfen. Der Grund für das Auftreten dieses Effekts ist nicht nachvollziehbar, und trat
auch bei keiner der anderen SKF sowie der Testfermentation im Laborfermenter auf. Daher
ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich hierbei lediglich um einen Messfehler bei den
einzelnen Pixeln handelt.
Sascha Princz
122
10
9
Absorptionsspektren einer SKF mit Spitzen bei einzelnen
Wellenlängen
8
Absorbance Unit
7
6
5
4
3
2
1
0
1000
1200
1400
1600
Wellenlänge [nm]
Messung 7
Messung 16
1800
2000
Abb. 95: Absorptionsspektren mit Spitzen bei einzelnen Wellenlängen während einer SKF
Ein weiterer, bereits im Vorfeld vermuteter Effekt, lässt sich anhand der nachfolgenden zwei
Abbildungen (Abb. 96 und Abb. 97) darstellen. Wie von dem Einsatz anderer Sonden und
Edelstahlteilen bei einer Hefefermentation bekannt ist, kann es mit zunehmender Prozesszeit
zu einer Ablagerung der Hefezellen auf deren Oberfläche kommen. Betrachtet man das in
Abb. 96 dargestellte Absorptionsspektrum, welches zum Ende der SKF (Prozesszeit 18 h)
aufgenommen wurde, zeigt sich ein relativ großer Offset zur Basislinie.
Spektrum aus SKF vom 11.04.12 vor Reinigung Sonde
1,4
Absorbance Unit
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
Wellenlänge [nm]
1800
1900
2000
2100
SKF_110412#19
Abb. 96: Absorptionsspektrum einer SKF vor der Reinigung der Sonde
Vergleicht man dazu das in Abb. 97 dargestellte Absorptionsspektrum, welches nach einer
Reinigung der Sonde nur kurz nach dem in Abb. 96 gezeigten Absorptionsspektrum
Sascha Princz
123
aufgezeichnet wurde, zeigt sich, dass der Offset um ein Vielfaches geringer ist. Bei einer
genaueren Betrachtung zeigt sich darüber hinaus, dass sich neben einer Veränderung der
Form des Spektrums
auch
das Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund der
Ablagerung
verschlechtert hat. Dies lässt sich dadurch begründen, dass aufgrund der Ablagerung auf der
Reflektionsfläche und der Lichtaustritt- bzw. Signaleintrittsöffnung der Sonde, das Signal
zunehmend abgeschwächt wird.
Spektrum aus SKF vom 11.04.12 nach Reinigung Sonde
0,65
Absorbance Unit
0,55
0,45
0,35
0,25
0,15
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
Wellenlänge [nm]
1800
1900
2000
2100
SKF_110412#20nRein
Abb. 97: Absorptionsspektrum einer SKF nach der Reinigung der Sonde
Sascha Princz
124
Testfermentation
7
Testfermentation
Im Rahmen dieser Master-Thesis wurde eine anaerobe Fermentation von Saccharomyces
cerevisiae
in
dem
unter
Kapitel
4.6
beschriebenen
autoklavierbaren
Sieben-Liter-
Laborfermenter der Hochschule Ulm durchgeführt. Ziel dieser Fermentation war die
Funktionstauglichkeit des NIR-Systems zur Ermittlung des Glucose- und Ethanolgehalts in
der Fermenterbrühe während der entsprechenden Fermentation. Für eine Kontrolle der mit
Hilfe des erstellten Kalibriermodells ermittelten Konzentrationen von Glucose und Ethanol
erfolgte neben einer Online-Auswertung mit dem NIR-System und Kalibriermodell auch eine
manuelle Auswertung der Versuchsproben. Auch hier diente als Referenzanalytik jeweils ein
enzymatisches Testset (UV-Test) der Firma R-Biopharm AG. Nähere Angaben zu den
jeweiligen
Tests
finden
sich
wie
bereits
erwähnt
in
den
entsprechenden
Bedienungsanleitungen im Anhang.
7.1 Vorbereitung der Fermentation
Für die Fermentation mussten zunächst die nachfolgenden Vorbereitungen getroffen
werden.

Nährmedium: Für die Hefefermentation wurden drei Liter Universalmedium mit der in
Tabelle 45 gezeigten Zusammensetzung hergestellt und verwendet.
Tabelle 45: Zusammensetzung des Nährmediums für die Hefefermentation
Zusammensetzung des Nährmediums

Chemikalie/ Nährstoff
g L-1
g (3 L)-1
Hefeextrakt
10
30
Pepton
20
60
Glucose
136
408
Startbiomasse: Es wurde 8,4 g L-1 Trockenbiomasse von Saccharomyces cerevisiae
verwendet. Dabei entsprachen den benötigten 25,2 g Trockenbiomasse ungefähr 89,46 g
der verwendeten Nasshefe wieninger hefe (F. X. Wieninger GmbH).
Nachdem diese Vorbereitungen beendet waren wurde das Nährmedium bei 121°C für 15 min
sterilisiert. Anschließend erfolgten die erforderliche Kalibrierung der pH-Sonde und der
Zusammenbau des Bioreaktors. Nach dem Zusammenbau erfolgte der Anschluss an die
Steuerung sowie die erforderliche Vorpolarisierung der pO2-Elektrode.
Sascha Princz
125
Testfermentation
7.2 Durchführung der Fermentation
Vor Beginn der Fermentation musste die pO2-Elektrode im mit Luft begasten Medium
kalibriert werden. Nach dem Start der Fermentation erfolgte die Inokulation (Einbringen der
Startbiomasse) des Fermenters.
Nachfolgend sind die Einstellungen der Prozessparameter des Laborfermenters während der
Testfermentation aufgeführt:

Rührerdrehzahl:
300 u min-1

Begasungsrate:
aus

Temperatur:
30°C

pH-Wert:
nicht kontrolliert

pO2:
anaerob
Für die Offline-Auswertung des Prozessverlaufs erfolgte die erste Probenentnahme nach der
Inokulation und anschließend alle 60 Minuten für die Substratbestimmung (Glucose, Ethanol)
und alle 120 Minuten für die Biomassebestimmung. Für die Online-Auswertung erfolgte die
Aufzeichnung
der
Absorptionsspektren
in
demselben
Rhythmus
wie
zweimal
2 ml
die
manuelle
Probenentnahme.
7.3 Auswertung der Fermentation
Unmittelbar
nach
jeder
Probenentnahme
wurden
sofort
bei
8000 Umdrehungen pro Minute und 4°C für zwei Minuten zentrifugiert (Heraeus, Multifuge
3S-R) und der Überstand tiefgefroren. Das tiefgefrieren der Proben erfolgte auch hier, um zu
einem späteren Zeitpunkt die Offline-Auswertung des Glucose- und Ethanolgehalts
durchführen zu können. Für die Offline-Auswertung der Biomasse wurden je 10 ml zur
direkten Zellzahlbestimmung entnommen. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte durch eine
Filtration der bei der Probenentnahme entnommenen Fermentationsbrühe (mit einer
Membran Vakuumpumpe Vacuubrand-CVC2) mit einer anschließenden Trocknung.
In dem durch das Zentrifugieren von den Hefezellen getrennten Überstand wurde nach dem
Auftauen
mit
Hilfe
von
Glucose-
und
Ethanol-UV-Tests
(Firma
R-Biopharm
AG,
Bedienungsanleitungen im Anhang) der entsprechende Substratgehalt ermittelt.
Die Aufnahme der Absorptionsspektren erfolgte in einem Time Scan Modus, das heißt es
wurden über einen Zeitraum von 60 s, in einem Zeitintervall von 1 s, 60 Absorptionsspektren
mit einer Integrationszeit von 19,5 ms aufgezeichnet. Die genauen Einstellungen dazu
Sascha Princz
126
Testfermentation
können aus Tabelle 46 entnommen werden. Vor den Aufzeichnungen der Spektren wurde
der Magnetrührer des Fermenters abgeschaltet.
Tabelle 46: Parameter des Time Scan Modus bei der Testfermentation
Represantation
Absorption
Scan Typ
Time Scan
19,5
Accumulation
1
Bunching (Pixel)
1
Total Scan Time [s]
60
Sample Intervall [s]
1
7.3.1 Offline-Auswertung
Die Auswertung der während der anaeroben Testfermentation entnommenen Proben liefert
nach Abb. 98 folgende Ergebnisse.
Während dem zu Fermentationsbeginn vorherrschenden Überschuss an Glucose (grüne
Kurve) wurde neben Biomasse (rote Kurve) hauptsächlich Ethanol (blaue Kurve) gebildet.
Nachdem das Glucoseangebot, nach einer Fermentationsdauer von etwa 14 Stunden,
aufgebraucht war kam es erwartungsgemäß zu keiner weiteren signifikanten Ethanolbildung.
Aus diesem Grund wurde die Fermentation nach etwa 16 Stunden beendet.
140
14
120
12
100
10
80
8
60
6
40
4
20
2
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Biomasse [g/L]
Konzentration [g/L]
Verlauf Glucose, Ethanol & Biomasse [g/L] während anaerober
Hefefermentation
16
Fermentationsdauer [h]
Ethanol [g/L]
Glucose [g/L]
Biomasse [g/L]
Abb. 98: Offline-Auswertung zu Biomasse, Glucoseverbrauch und Ethanolbildung der Testfermentation
Sascha Princz
127
Testfermentation
In Tabelle 47 sind neben den Ergebnissen der durch die UV-Tests erhaltenen Glucose- und
Ethanolkonzentrationen auch die Ergebnisse der Kontrolllösungen (Ktr.Lsg) für Glucose (soll
0,5 g/L) und Ethanol (soll 0,058 g/L) aufgelistet. Diese wurden mitgeführt um eine Kontrolle
zur richtigen Durchführung der Auswertung zu erhalten. Die Ergebnisse zur Auswertung im
Bezug auf die Biomassezunahme während der Testfermentation sind ebenfalls in Tabelle 47
zu sehen.
Tabelle 47: Ergebnisse der Biomasse, Ethanol und Glucose Auswertung zur Testfermentation durch
UV-Tests und Filtration
Probe
Prozesszeit [h]
Ktr.Lsg1
-
1
0
2
1
3
2
4
3
5
4
6
5
7
6
8
7
9
8
10
9
11
10
12
11
13
12
14
13
15
14
16
15
17
16
Ktr.Lsg2
Glucose [g/L]
-
0,4663
137,32
120,91
117,46
104,93
93,71
80,75
71,25
58,30
52,25
38,43
29,02
20,38
9,41
1,98
0
0
0
0,4698
Ethanol [g/L]
0,0547
1,75
6,08
10,53
15,32
19,75
24,07
31,33
34,67
40,66
45,49
48,60
51,60
54,60
60,81
59,89
61,73
59,43
0,0543
Biomasse [g/L]
-
8,6
8,53
9,34
9,65
10,93
11,48
11,89
12
12,25
-
7.3.2 Online-Auswertung
Auch hier zeigte sich, genau wie bei der SKF, nach einer ersten Betrachtung der mit Hilfe der
Inline-Messung im Rahmen der Time Scans aufgezeichneten Einzelspektren das Problem der
Blasenproblematik (mehr dazu in Kapitel 7.3.3). Deshalb erfolgte auch hier zunächst eine
Filterung der relevanten Spektren nach der in Kapitel 5.7.4 vorgestellten Methode. Das
Ergebnis nach einer Filterung zeigt Abb. 99 in Form von gemittelten Absorptionsspektren zu
den entsprechenden Messungen der Proben. Die Grafik zeigt, dass die Spektren auch hier ab
einer Wellenlänge von etwa 1900 nm zum Teil stark verrauscht sind. Desweiteren nimmt
auch hier mit zunehmender Prozesszeit der Offset zur Basislinie zu.
Sascha Princz
128
Testfermentation
0,45
Mittelwert der gefilterten Absorptionsspektren der Testfermentation
0,4
0,35
Absorbance Unit
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1100
-0,05
1200
Probe 1
Probe 7
Probe 13
1300
Probe 2
Probe 8
Probe 14
1400
1500
1600
1700
1800
Wellenlänge [nm]
Probe 3
Probe 4
Probe 9
Probe 10
Probe 15
Probe 16
1900
Probe 5
Probe 11
Probe 17
2000
2100
Probe 6
Probe 12
Abb. 99: MW der gefilterten Absorptionsspektren der Proben während der Testfermentation
Auch hier wurden vor der Durchführung einer Vorhersage verschiedene Methoden zur
Vorbehandlung (Vorb.) der Spektren des Kalibriermodells, im Hinblick auf ihre R 2 (der
Validierung) und RMSE Werte hin analysiert. Tabelle 48 zeigt die Ergebnisse für die
Modelloptimierung zur Vorhersage von Glucose mit Angabe der Anzahl der verwendeten
Faktoren (unter Rang). Die Stützstellen für die lineare Basislinienkorrektur (BL Linear) lagen
bei etwa 1100 nm und 1540 nm. SG (2;9) steht für eine Savitzky-Golay-Glättung, mit einem
Polynom 2. Grades über 9 Stützstellen. Die Zahlen in den Klammern bei der Vorbehandlung
Detrend stehen für den Grad des Polynoms. Befinden sich mehrere Methoden in der Spalte
für die Vorbehandlung, wurden diese in der aufgeführten Reihenfolge durchgeführt. Die
Tabellen zeigen nicht alle durchgeführten Methoden, es sind lediglich die Methoden
aufgeführt, die am geeignetsten für eine Vorhersage des entsprechenden Stoffs erschienen.
Tabelle 48: Modelloptimierung für die Vorhersage von Glucose in Fermentationsproben
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
2
0,9561
4,416
11,345
BL Linear
1100-2100
3
0,9426
3,788
12,329
SG (2;9)
1100-2100
3
0,9956
1,907
3,449
SG (2;9) Detrend (1)
1100-2100
3
0,9852
2,932
6,641
1100-2100
4
0,9375
1,547
15,888
SG (2;9) BL Linear
1100-2100
1
0,9541
11,277
12,594
Sascha Princz
129
Testfermentation
Abb. 100 zeigt den grafischen Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der
Absorptionsspektren
für
ein
Kalibriermodell
zur
Vorhersage
von
Glucose
in
den
Fermentationsproben.
1
50
0,99
45
0,98
40
0,97
35
0,96
30
0,95
25
0,94
20
0,93
15
0,92
10
0,91
5
0,9
RMSE
R²
0
SG (2;9)
Detrend (2)
BL Linear
SG (2;9) BL
Linear
R²
keine Vorb.
RMSEC
SG (2;9)
Detrend (1)
SG (2;9)
RMSECV
Tabelle 49 zeigt die Ergebnisse für die Modelloptimierung zur Vorhersage von Ethanol in den
Fermentationsproben mit allen relevanten Angaben.
Tabelle 49: Modelloptimierung für die Vorhersage von Ethanol in Fermentationsproben
Vorb.
Bereich λ [nm]
Rang
R2
RMSEC
RMSECV
keine Vorb.
1100-2100
2
0,9509
1,723
4,732
BL Linear
1100-2100
2
0,9274
3,380
7,249
SG (2;9)
1100-2100
3
0,9931
1,000
1,958
1100-2100
4
0,9636
0,712
4,217
1100-2100
3
0,9562
1,517
4,690
SG (2;9) BL Linear
1100-2100
2
0,9176
4,551
6,694
In Abb. 101 ist ein grafischer Vergleich der einzelnen Vorbehandlungsmethoden der
Spektren für ein Kalibriermodell und zur Vorhersage von Ethanol in Fermentationsproben
dargestellt.
Sascha Princz
130
Testfermentation
1
50
45
0,98
35
0,94
30
R²
25
0,92
20
0,9
15
RMSE
40
0,96
10
0,88
5
0,86
0
SG (2;9) BL
Linear
BL Linear
keine Vorb.
R²
RMSEC
SG (2;9)
Detrend (2)
SG (2;9)
Detrend (1)
SG (2;9)
RMSECV
In Tabelle 50 finden sich die Stoffkonzentrationen der für die Vorhersage ausgewählten
Fermentationsproben. Die Angaben sind auch hier in g/L.
Tabelle 50: Zusammensetzung der Fermentationsproben für Vorhersage, Angaben in g/L
Probe
Glucose
Ethanol
4
104,93
15,32
6
80,75
24,07
9
52,25
40,66
15
0
59,89
Die Ergebnisse zur Vorhersage der entsprechenden Stoffkonzentrationen zeigt Tabelle 51.
Auch hier finden sich wieder die Angaben zu den entsprechend berücksichtigten
Tabelle 51: Ergebnisse zur Vorhersage der Fermentationsproben, Angaben in g/L
Probe
Glucose
Ethanol
Bereich λ [nm]
Vorb.
Rang
4
94,40
20,04
1100-2100
keine Vorb.
2/2
6
82,10
25,13
1100-2100
keine Vorb.
2/2
9
44,35
41,47
1100-2100
keine Vorb.
2/2
15
16,96
52,87
1100-2100
keine Vorb.
2/2
4
91,38
19,71
1100-2100
BL Linear
3/2
6
77,36
28,54
1100-2100
BL Linear
3/2
9
50,24
39,41
1100-2100
BL Linear
3/2
15
-1,70
60,03
1100-2100
BL Linear
3/2
Sascha Princz
131
Testfermentation
Den
4
101,87
17,07
1100-2100
SG (2;9)
3/3
6
85,53
23,80
1100-2100
SG (2;9)
3/3
9
44,93
41,23
1100-2100
SG (2;9)
3/3
15
17,93
52,58
1100-2100
SG (2;9)
3/3
4
98,13
18,75
1100-2100
3/4
6
81,98
24,37
1100-2100
3/4
9
45,23
41,11
1100-2100
3/4
15
1,35
59,91
1100-2100
3/4
4
97,77
18,81
1100-2100
4/3
6
83,7
24,21
1100-2100
4/3
9
46,63
41,42
1100-2100
4/3
15
1,94
60,94
1100-2100
4/3
4
88,75
18,52
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
1/2
6
65,88
30,6
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
1/2
9
47,01
39,42
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
1/2
15
2,36
60,08
1100-2100
SG (2;9) BL Linear
1/2
grafischen
Vergleich
der
einzelnen
Vorhersagen
des
Glucosegehalts
in
Fermentationsproben liefert Abb. 102. Auch hier stehen die Vorhersagen in Abhängigkeit zu
den entsprechenden Vorbehandlungsmethoden der Absorptionsspektren.
20
15
Differenz [g/L]
10
5
0
-5
0
20
40
60
80
100
-10
-15
-20
keine Vorb.
Soll [g/L]
BL Linear
SG (2;9)
SG (2;9) BL Linear
Abb. 102: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Glucosegehalt, Fermentation
Sascha Princz
132
Testfermentation
Abb.
103
zeigt
den
Vergleich
der
Vorhersagen
des
Ethanolgehalts
in
den
Fermentationsproben, mit Bezug auf die unterschiedlichen Vorbehandlungsmethoden der
Absorptionsspektren vor Erstellung eines Kalibriermodells.
8
6
Differenz [g/L]
4
2
0
-2
10
20
30
40
50
60
-4
-6
-8
Soll [g/L]
keine Vorb.
BL Linear
SG (2;9)
SG (2;9) BL Linear
Abb. 103: Vergleich der Differenz zwischen vorhergesagtem und realem Ethanolgehalt, Fermentation
7.3.3 Auffälligkeiten
Wie bereits erwähnt hat sich auch im Rahmen der Auswertung der durch eine Inline-Messung
gewonnenen
Spektren
bei
der
Testfermentation
das
zu
erwartende
Problem
der
Blasenproblematik gezeigt.
Zunächst soll auch hier anhand der nachfolgenden Abbildungen (Abb. 104 bis Abb. 107) die
Blasenproblematik bei der Testfermentation gezeigt werden. Abb. 104 zeigt die Differenz
zwischen den AU-Werten bei 1360 nm und 1431 nm direkt nach der Inokulation (Start der
Fermentation, Prozesszeit 0 h). Es ist zu sehen, dass innerhalb der 60 Messungen des Time
Scan keine signifikanten Unterschiede in den Differenzen der AU-Werte auftreten. Zu diesem
Zeitpunkt der Fermentation fand noch keine Verstoffwechselung der Glucose durch die
Hefezellen statt, und somit auch keine Bildung von CO2.
Sascha Princz
133
Testfermentation
Differenz 1360-1431 nm Inokulation Fermentation
0,05
0,045
Differenz AU-Werte
0,04
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
FER180412#Inok
Abb. 104: AU-Wert Differenz Fermentation Messung direkt nach Inokulation (ungefiltert)
Abb. 105 zeigt ebenfalls die Differenz zwischen den AU-Werten bei 1360 nm und 1431 nm,
allerdings während des Fermentationsprozess (Prozesszeit 3 h). Es ist zu sehen, dass
innerhalb der 60 Messungen des Time Scans auch hier bereits signifikante Unterschiede in
den Differenzen der AU-Werte auftreten. Zu diesem Zeitpunkt der Fermentation fand bereits
eine Verstoffwechselung der Glucose zu Ethanol durch die Hefezellen statt. Entsprechend
Gl. (3.43) kam es hier bereits vermehrt zu einer Bildung von CO2 und der daraus
resultierenden Blasenbildung. Für eine spätere Mittelung der Spektren erfolgte eine
Filterung, nach der in Kapitel 5.7.4 vorgestellten Methode. Der Schwellwert für die Filterung
lag hier bei 0,054. Somit wurden alle Spektren deren AU-Wert Differenz über diesem
Schwellwert lag verworfen.
Sascha Princz
134
Testfermentation
Differenz 1360-1431 nm Probe 4 Testfermentation, ungefiltert
0,09
0,08
Differenz AU-Werte
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
FER180412#4
Abb. 105: AU-Wert Differenz einer Messung während des Fermentationsprozess (ungefiltert)
Die Differenz, zwischen den AU-Werten bei 1360 nm und 1431 nm, nach der Filterung ist in
Abb. 106 dargestellt. Lediglich diese 30 Spektren aus dem Time Scan wurden für eine
Mittelung herangezogen.
Differenz 1360-1431 nm Probe 4 Testfermentation, gefiltert
Differenz AU-Werte
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Messung
FER180412#4
Abb. 106: AU-Wert Differenz einer Messung während des Fermentationsprozess (gefiltert)
Nachdem zum Ende der Testfermentation das komplette Glucoseangebot von den Hefezellen
verstoffwechselt war, kam es zu keiner weiteren CO2- und daraus resultierender
Blasenbildung mehr. Abb. 107 zeigt eine ungefilterte AU-Wert Differenz bei einer Messung
Sascha Princz
135
Testfermentation
zum Ende der Fermentation (Prozesszeit 15 h). Wie zu sehen ist, kam es auch hier zu keiner
signifikanten Abweichung der AU-Wert Differenzen mehr.
Differenz 1360-1431 nm Probe 16 Testfermentation, ungefiltert
0,06
Differenz AU-Werte
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Messung
FER180412#16
Abb. 107: AU-Wert Differenz einer Messung am Ende des Fermentationsprozess (ungefiltert)
Wie bereits in Kapitel 5.7.4 angesprochen tritt das Problem der Blasenproblematik mit einer
gewissen Periodizität auf, deren Ursache sich im Moment noch nicht erklären lässt. In Abb.
108 sind die Differenzen der AU-Werte von 6 ausgewählten Time Scans während der
Fermentation aufeinanderfolgend abgebildet. Zu Beginn, also direkt nach der Inokulation
(Prozesszeit 0 h) treten noch keine erkennbaren Differenzen auf, hier findet noch keine
Verstoffwechselung der Glucose durch die Hefezellen statt. Probe 3, 5 und 12 (Prozesszeit
2 h, 4 h und 11 h) zeigt dagegen signifikante AU-Wert Differenzen mit einer gewissen
Periodizität auf, hier sind die Hefezellen bereits dabei die Glucose zu Ethanol zu vergären.
Ab Probe 13 (Prozesszeit 12 h) ändert sich das Bild der AU-Wert Differenzen, zu diesem
Zeitpunkt der Fermentation stand den Hefezellen nur noch wenig Glucose zur Verfügung,
und ab Probe 15 (Prozesszeit 14 h) treten keine AU-Wert Differenzen mehr auf. Zu diesem
Zeitpunkt der Fermentation ist keine Glucose mehr vorhanden (vgl. Tabelle 47) und es
kommt somit auch zu keiner Bildung von CO2 mehr.
Sascha Princz
136
Testfermentation
0,16
Probe 13
Probe 5
Inokulation
0,14
Probe 15
Probe 12
Probe 3
Differenz AU-Werte
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
1
13
25
37
49
61
73
85
97
109
121
133
145
157
169
181
193
205
217
229
241
253
265
277
289
301
313
325
337
349
361
0
Messung
Abb. 108: Aneinanderreihung AU-Wert Differenzen mehrerer Fermentationsproben, ungefiltert
Interessant erscheint, dass wie bereits erwähnt, diese Problematik sowohl bei der SKF als
auch
bei
der
Testfermentation
aufgetreten
ist.
Somit
scheiden
die
beiden
Bioprozesssysteme, SKF und Laborfermenter, als Ursache für die Periodizität aus. Damit
verbleiben als mögliche Ursachen nur noch das verwendete NIRS-System oder der
Bioprozess selbst.
Abschließend zeigt Abb. 109 die Differenzen der AU-Werte von 5 ausgewählten Time Scans
während der SKF ebenfalls aufeinanderfolgend abgebildet.
Differenzen AU-Werte
0,2
Probe 3
Inokulation
Probe 19
Probe 12
Probe 16
Probe 5
0,15
0,1
0,05
1
13
25
37
49
61
73
85
97
109
121
133
145
157
169
181
193
205
217
229
241
253
265
277
289
301
313
325
337
349
361
0
Messung
Abb. 109: Aneinanderreihung AU-Wert Differenzen mehrerer SKF-Proben, ungefiltert
Sascha Princz
137
Zusammenfassung der Ergebnisse und Ausblick
8
Zusammenfassung der Ergebnisse
Im Rahmen dieser Master Thesis wurde erfolgreich ein NIRS-System für eine Inline-Messung
in einem Sieben-Liter-Laborfermenter der Hochschule Ulm erstellt. Mit Hilfe dieses NIRSSystems erfolgten ausführliche spektrale Vermessungen verschiedener Proben in einem
Wellenlängenbereich von 1100 nm bis 2100 nm nach dem Transflexionsprinzip. Aus diesen
gewonnen Daten erfolgte im Anschluss eine Erstellung verschiedener Kalibriermodelle mit
Hilfe
der
multivariaten
Datenanalyse,
sowie
Vorhersagen
zu
den
Glucose-
und
Ethanolkonzentrationen verschiedener Proben mit sehr guten Ergebnissen. Letztendlich
erfolgte ein in vollem Umfang erfolgreicher Test des NIRS-Systems sowie sehr gute
Vorhersagen
zur
Glucose
und
Ethanolkonzentration
während
einer
anaeroben
Hefefermentation in dem Laborfermenter der Hochschule Ulm unter Verwendung des
Mikroorganismus S. cerevisiae.
Im Rahmen der Vorversuche wurden Absorptionsspektren von 100 % Ethanol, VE Wasser und
100 % gelöster Glucose in dem Wellenlängenbereich von 1100 nm bis 2100 nm erstellt. Da
Glucose nicht zu 100 % in gelöster Form vorliegen kann, wurden zur Erstellung eines
entsprechenden
Absorptionsspektrums
verschiedene
Glucose-(VE)Wasser-Gemische
spektroskopisch vermessen, und aus den gewonnen Daten ein Absorptionsspektrum für
100 %
Glucose
berechnet.
Transflexionsmessungen
als
Dieser
auch
Vorgang
wurde
Transmissionsmessungen
sowohl
in
durchgeführt,
Form
von
um
einen
Vergleich der jeweils berechneten Spektren zu erhalten. Weiterhin wurden, nach den
Vorgaben eines eigens erstellten Versuchsplans, verschiedene Glucose-Ethanol-WasserGemische erstellt, spektroskopisch vermessen und aus den gewonnenen Daten mit Hilfe der
Software „The Unscrambler“ verschiedene Kalibriermodelle generiert. Hierbei erfolgte auch
ein ausführlicher Vergleich der verschiedenen Kalibriermodelle hinsichtlich ihrer R² (bei
Validierung) und RMSE Werte, resultierend aus den unterschiedlichen durchgeführten
Methoden zur Vorbehandlung der Spektren. Mit Hilfe dieser Kalibriermodelle erfolgten nun
Vorhersagen des Glucose-, Ethanol- und Wassergehalts verschiedener wässriger Proben. Die
spektrale Vermessung sowie Vorhersage erfolgte sowohl an Proben mit dem Kalibriermodell
bekannten Inhaltsstoffen (z. B. Glucose-Ethanol-Wasser-Gemisch) als auch Proben, deren
Inhaltstoffe dem Kalibriermodell nicht alle bekannt waren, wie z. B. YPD-Proben (Yeast
Pepton
Dextrose
teilweise
mit
Ethanolzugabe)
und
verschiedenen
Bieren
(Helles,
Alkoholfreies, Hefe Weizen). Diese Vorhersagen lieferten sehr gute Ergebnisse sowohl für die
Sascha Princz
138
Proben mit bekannten als auch für Proben mit unbekannten Inhaltsstoffen. Bei den
spektralen Vermessungen an den Bieren wurde zudem festgestellt, dass durch das
Einwandern
der
in
dem
Bier
enthaltenen
CO2-Bläschen
eine
Verfälschung
der
Absorptionsspektren erfolgt. Diese Verfälschung der Spektren wurde anhand entsprechender
Absorptionsspektren aus den Biermessungen ausführlich aufgezeigt. Um dieses Problem zu
lösen oder zu verhindern, erfolgten Versuche zu einer mechanischen Verhinderung des
Einwanderns der Bläschen sowie einer datengestützten Problemlösung. Die Entscheidung fiel
auf
die
datengestützte
Lösung,
die
bereits
während
der
Auswertungen
zu
den
Schüttelkolbenfermentationen (SKF) und der Testfermentation im Laborfermenter zum
Einsatz kam und sich dabei im praktischen Einsatz bewährt und als überaus geeignet
erwiesen hat. Anhand von verschiedenen Hefe-Wasser-Gemischen (mit S. cerevisiae) wurden
ebenfalls
in
aufgezeichnet
dem
und
eine
Abnahme
zwischen
der
1100 nm
Transmission
und
2100 nm
aufgrund
Spektren
zunehmender
Hefekonzentration gezeigt.
In der vorgelegten Arbeit erfolgte zudem ein ausführlicher Nachweis der Abhängigkeit der
Absorptionsspektren von der Temperatur des spektroskopisch vermessenen VE Wassers. Da
tiefe Temperaturen die Wasserstoffbrückenbindungen begünstigen und stabilisieren und
somit auch einen Einfluss auf die Oberschwingungen von Wasser haben, kommt es bei
unterschiedlichen Temperaturen zu einer Verschiebung der mit Hilfe der NIRS detektierten
relevanten
Absorptionsbanden
von
Wasser.
In
diesem Zusammenhang
erfolgte die
Aufzeichnung verschiedener NIR-Spektren in einem Temperaturbereich von 15°C bis 75°C
(mit einer Schrittweite von 5°C). Dadurch konnte deutlich die Verschiebung der aus der 1.
und 2. Oberschwingung resultierenden Absorptionsbanden in den kurzwelligeren Bereich bei
zunehmender Temperatur innerhalb des Wellenlängenbereichs von 1100 nm bis 2100 nm
aufgezeigt werden.
Nach Abschluss der Vorversuche erfolgten zunächst erfolgreiche Inline-Messungen mit dem
NIRS-System während Hefefermentationen in Ein-Liter-Schüttelkolben und letztendlich in
dem Sieben-Liter-Laborfermenter der Hochschule Ulm. Die Fermentationen in beiden
Systemen erfolgten anaerob unter Verwendung des Mikroorganismus S. cerevisiae. Als
Referenzanalytik zur Bestimmung des Glucose- und Ethanolgehalts in den spektroskopisch
vermessenen Proben dienten entsprechende enzymatische UV-Tests. Aus den gewonnen
Daten wurden wiederum diverse Kalibriermodelle erstellt und im Hinblick auf ihre R² (bei
Validierung) und RMSE Werte, resultierend aus den verschiedenen durchgeführten Methoden
zur Spektrenvorbehandlung, vergleichend gegenüber gestellt. Die Resultate aus den
Vorhersagen mit Bezug auf die Glucose- und Ethanolkonzentration der entsprechenden
Sascha Princz
139
Proben lieferten sowohl für die SKF-Proben als auch Fermentationsproben sehr gute
Ergebnisse.
Ausblick
Wie erwähnt sind Voraussagen mit sehr guten Ergebnissen, im Bezug auf den Verlauf der
Glucose- und Ethanolkonzentrationen während anaeroben Hefefermentationen, sowohl im
Schüttelkolben als auch Laborfermenter erfolgreich gelungen. Die erstellten und getesteten
Kalibriermodelle basieren momentan auf einer verhältnismäßig geringen Anzahl an
spektralen Daten und Referenzwerten, deshalb bietet sich die Möglichkeit im Rahmen
weiterer Fermentationen relevante Daten für einen Ausbau des Kalibriermodells zu
gewinnen. Dadurch kann das Kalibriermodell erweitert werden und eine Verbesserung der
quantitativen Voraussagen über die entsprechenden Stoffkonzentrationen erreicht werden.
Für eine stabilere Vorhersage niederer Glucosekonzentrationen (0 g/L bis etwa 20 g/L) kann
versucht
werden,
gezielt
Absorptionsspektren
aufzunehmen,
während
sich
der
Fermentationsprozess exakt in diesem Konzentrationsbereich bewegt, um dadurch das
Kalibriermodell gezielt in diesem Bereich zu sensibilisieren. Der Einsatz des NIRS-System
sowie der chemometrischen Modelle erfolgten im Rahmen dieser Arbeit, wie bereits erwähnt,
im Zuge anaerober Hefefermentationen ohne eine pH-Wert- und Schaumkorrektur. Deshalb
erscheint es sinnvoll deren Einsatz schrittweise an die Problematik korrigierter aerober
Hefefermentationen heranzuführen. Dabei müssen sowohl der Einfluss der Begasung und der
teilweise viel höheren Rührerdrehzahl, als auch der verwendeten Korrekturmittel erfasst und
ausgewertet werden. Interessant erscheint auch, im Rahmen weiterer Fermentationen und
der daraus gewonnen Daten, zu versuchen das Kalibriermodell um eine Vorhersage der
Biomasse zu erweitern. Desweiteren kann getestet werden, ob sich das Kalibriermodell mit
Hilfe der aus dem Nachweis der Temperaturabhängigkeit des Wassers gewonnen Daten, auf
andere Temperaturbereiche übertragen bzw. anpassen und anwenden lässt.
Für einen kontinuierlichen Einsatz und dauerhafte Integration in das Bioprozesssystem der
Hochschule Ulm erscheint es sinnvoll eine kombinierte Software zu erstellen. Diese Software
bietet idealerweise eine Integration von Spektrometerbedienung, multivariater Datenanalyse
sowie Möglichkeiten zu datengestützten Problemlösungen wie z. B. der Blasenproblematik in
einem. Dabei sollte unter anderem darauf geachtet werden, dass bestimmte Parameter zur
Spektrometeraufzeichnung, in Form von Kochrezepten, vom Benutzer erstellt und in einer
Art Bibliothek hinterlegt werden können. Idealerweise sollte auch eine Kommunikation bzw.
Austausch von Daten zwischen dieser Software und der des Bioprozesssystems ermöglicht
werden.
Sascha Princz
140
Im Hinblick auf die durch das Einwandern von Bläschen in den Spalt der Transflexionssonde
verursachte Problematik kann der Einsatz von ATR-Sonden in Betracht gezogen werden.
Hierbei müsste allerdings darauf geachtet werden, dass eine ausreichende Absorptionsfläche
von Seiten der ATR-Sonde geboten wird, damit das detektierte Absorptionssignal von
Glucose und Ethanol gegenüber der Wasserabsorption ausreichend groß für den in dieser
Arbeit untersuchten Wellenlängenbereich ist. Im besten Fall bietet die ATR-Sonde neben
Autoklavierbarkeit
auch
die
Möglichkeit
einer
problemlosen
Integration
in
den
Laborfermenter bzw. dessen Abdeckung.
Wie bereits erwähnt wurden im Rahmen dieser Arbeit Auffälligkeiten und daraus
resultierende Probleme im Zusammenhang mit CO2-Blasen erkannt. Bei der Auswertung und
Suche nach einer Problembehebung wurde eine gewisse Periodizität im Auftreten dieses
Problems
nachgewiesen.
Da
diese
Auffälligkeiten
sowohl
während
der
SKF
und
Testfermentation auftraten, kann das Bioprozesssystem als Ursache für die Periodizität
weitestgehend ausgeschlossen werden. Auffällig ist auch, dass dieses Problem bzw. die
Periodizität bei den Fermentationen nur solange auftrat, wie die Hefezellen noch ein Angebot
an Glucose hatten. Hier wäre es interessant in weiteren gezielten Versuchen die Ursache
dieser Periodizität zu erkunden.
Sascha Princz
141
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Sascha Princz
144
Anhang
Anhang
A 1 Tabellen zum Kapitel 2
A 1.1
Tabelle aus [7]
Sascha Princz
145
Anhang
Sascha Princz
146
Anhang
A 1.2
Tabelle aus [8]
Sascha Princz
147
Anhang
Sascha Princz
148
Anhang
Sascha Princz
149
Anhang
Sascha Princz
150
Anhang
A 1.3 Tabelle aus [9]
Sascha Princz
151
Anhang
A 2 Datenblätter zu den Chemikalien
A 2.1
Glucose
Sascha Princz
152
Anhang
Sascha Princz
153
Anhang
A 2.2
Ethanol
Sascha Princz
154
Anhang
Sascha Princz
155
Anhang
A 2.3
Pepton
Sascha Princz
156
Anhang
A 2.4
Hefeextrakt
Sascha Princz
157
Anhang
A 3 Bedienungsanleitungen Offline-Auswertung
A 3.1
Alkohol-Test
Sascha Princz
158
Anhang
A 3.2
Ethanol UV-Test
Sascha Princz
159
Anhang
Sascha Princz
160
Anhang
Sascha Princz
161
Anhang
Sascha Princz
162
Anhang
Sascha Princz
163
Anhang
A 3.3
Glucose-Test
Sascha Princz
164
Anhang
A 3.4
Glucose UV-Test
Sascha Princz
165
Anhang
Sascha Princz
166
Anhang
Sascha Princz
167
Anhang
Sascha Princz
168
Anhang
Sascha Princz
169
Anhang
Sascha Princz
170

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