Versuch6_beta Galaktosidase

Versuch 6: Induktion der β-Galaktosidase von Escherichia coli
Induktion der β-Galaktosidase von Escherichia coli
1. Einleitung
Das Bakterium Escherichia coli ist in der Lage verschiedene Substrate für seinen
Stoffwechsel zu nutzen. Neben Glucose und Acetat kann es auch das Disaccharid
Lactose verwerten. Die für den Lactosestoffwechsel benötigten Enzyme werden
gemeinsam als so genanntes lac-Operon reguliert.
Das Operon umfasst einen lac-Promotor, einen lac-Operator sowie die Strukturgene
für die Enzyme β-Galaktosidase (lacZ),
Lactosepermease
(lacY)
und
Transacetylase (lacA).
Zur Regulation der Enzymexpression
unterliegt
das
gesamte
lac-Operon
sowohl einer positiven, als auch einer
negativen Kontrolle.
Abb. 1 Bestandteile des Lac-Operons
Wenn keine Lactose im Nährmedium vorhanden ist, werden die Enzyme des
Lactosestoffwechsels durch den lac-Repressor (lacI), der in der DNA vor dem LacOperon
codiert
ist,
unterdrückt.
Der
Repressor bindet an die Operatorregion des
lac-Operons und verhindert die Transkription
der
Strukturgene.
Ist
Galactosyl-β-1,4-D-Glucose)
vorhanden,
Galactosidase
wird
zu
diese
Lactose
im
von
Allolactose
(β-DMedium
der
β- Abb. 2 Lactose
(β-D-
Galactosyl-β-1,6-D-Glucose) umgesetzt, welche dann als Induktor für die Expression
der Strukturgene des lac-Operons wirkt. Der Induktor bindet an den Repressor
woraufhin sich dessen Konformation ändert und eine Bindung an den Operator nicht
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mehr möglich ist (negative Regulation). Zur endgültigen Expression der Enzyme des
Lactosestoffwechsels bedarf es aber auch eines positiven Regulationssignals.
In einem glucosefreien Medium bildet die Zelle cyclisches AMP (cAMP), das als
„Hungersignal“ wirkt. cAMP bildet mit dem Genaktivatorprotein CRP (cAMP Rezeptor
Protein) einen Komplex, der an dem Promotor bindet und damit die Expression der
Strukturgene
ermöglicht.
Die
Bildung
von
cAMP
wird
durch
das
Phosphotransferasesystem (PTS) kontrolliert.
Abb. 3 Phosphotransferasesystem von E.coli
Um Glucose in die Zelle aufnehmen zu können, wird diese über eine Enzymkaskade,
die man als PTS bezeichnet, phosphoryliert. Als Phosphat-Donor dient
Phosphoenolpyruvat, dass das Phosphat auf das Enzym EI überträgt. Von EI aus
wird das Phosphat über HPr und EIII auf EIIA übertragen. EIIA überträgt das Phosphat
dann auf Glucose, welche als Glucose-6-Phosphat in die Zelle aufgenommen wird.
Diesen Transportmechanismus bezeichnet man als Gruppentranslokation, da das
Substrat während der Aufnahme in die Zelle chemisch verändert wird.
In einem glucosehaltigen Medium liegt das Enzym EIIA hauptsächlich
dephosphoryliert vor. Dieser Zustand wirkt sowohl auf die Adenylat-Cyclase, als auch
auf die Lactosepermease hemmend. Es kann also weder cAMP gebildet werden
(durch die Adenylat-Cyclase) noch Lactose in größerem Umfang in die Zelle
transportiert werden (durch die Lactosepermease).
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Ist im Medium keine Glucose vorhanden, liegt das Enzym EIIA meist im
phosphorylierten Zustand vor. Dieser Zustand aktiviert die Adenylat-Cyclase und
cAMP kann gebildet werden. Das gebildete cAMP kann jetzt mit CRP zu einem
Komplex zusammentreten und die Expression der Enzyme des lac-Operons
aktivieren (natürlich muss auch das zweite Signal des Induktors vorhanden sein).
Bei Fehlen von Glucose wird außerdem die Hemmung der Lactosepermease
aufgehoben und Lactose kann in die Zelle aufgenommen werden (im Symport mit
H+-Ionen).
Um zu gewährleisten, dass der Stoffwechsel wirklich nur bei Fehlen von Glucose auf
Lactoseverwertung umschaltet, muss cAMP kontinuierlich aus der Zelle entfernt
werden. Wenn es zu einer Akkumulation von cAMP kommen würde, würden die
Enzyme des Lactosestoffwechsels auch bei Vorhandensein von Glucose aktiviert
werden können und somit ein ungünstigeres Substrat verwertet werden.
Wenn die Lactose in die Zelle aufgenommen wird, wird sie durch die β-Galactosidase
in Glucose und Galactose gespalten. Glucose kann direkt den Hexoseabbauwegen
zugeführt werden. Galactose muss vor dem Abbau erst zu Glucose isomerisiert
werden.
Damit das System funktionieren kann, muss in der Zelle ständig eine geringe Anzahl
der Enzyme des Lactosestoffwechsels expremiert werden. Wäre dies nicht der Fall,
könnte Lactose weder in die Zelle aufgenommen werden, noch könnte sie in
Allolactose umgesetzt werden und als Induktor wirken. Wenn das lac-Operon
aktiviert wird, kann die Konzentration der Enzyme in der Zelle um den Faktor 1000
steigen.
Bei Kultivierung von E.coli in Medien die Glucose und Lactose enthalten, tritt eine so
genannte Diauxie auf. Damit bezeichnet man einen doppelten Wachstumscyclus
bzw. ein zweiphasiges Wachstum, das dadurch bedingt ist, dass zuerst sämtliche im
Medium enthaltene Glucose verstoffwechselt wird, bevor die Enzyme des
Lactosestoffwechsels gebildet werden. Erst danach wird die Lactose als Substrat
genutzt. Die Diauxie ist mit den oben ausgeführten Regulationsmechanismen des
lac-Operons leicht zu erklären.
Im vorliegenden Versuch soll die Induktion des lac-Operons über das Enzym βGalactosidase untersucht werden. Dazu werden unter entsprechenden Bedingungen
gezüchtete Vorkulturen mit einem induzierenden (Lactose) und einem nicht
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induzierenden (Glucose) Medium gezüchtet. Außerdem wird ein Medium verwendet,
das sowohl Glucose als auch Lactose enthält.
Nach ca. zweistündiger Inkubation wird über die OD578 die gebildete Zellmasse
(Zellzahl) bestimmt. Danach wird die Aktivität der β-Galactosidase ermittelt. Dazu
werden die Zellen mit Detergenzien permeabilisiert ohne dass die β-Galactosidase
geschädigt wird. Als Nachweisreagenz dient σ-Nitrophenyl-β-Galactosid (ONPG), ein
Strukturanalogon der Lactose, dass durch die β-Galactosidase in Galactose und σNitrophenol gespalten wird.
Abb. 4: Spaltung des ONPG durch die β-Galactosidase
Das gebildete σ-Nitrophenol ist gelb gefärbt und kann photometrisch bei 420nm
gemessen werden.
2. Material und Methoden
Die ausführliche Versuchsbeschreibung sowie die Zusammensetzung der
verwendeten Lösungen sind im Skript (Versuch 6) zu finden.
3. Ergebnisse
Zur Berechnung der Enzymaktivität der β-Galactosidase wurde die Optische Dichte
der Versuchskulturen im Photometer bei 578nm bestimmt.
Tab. 1: Bestimmung der OD578 der Versuchskulturen
Blindwert (BW) = 0,050
OD578
unverdünnt-BW
verdünnt-BW
Verdünnungsfaktor
Endwert
Glucose
0,474
0,29
2
0,58
Lactose
0,455
0,455
Glucose + Lactose
0,476
0,24
2
0,48
Lagen die ermittelten Werte über 0,5 wurde eine entsprechende Verdünnung
durchgeführt.
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Die Aktivität der β-Galaktosidase wurde ebenfalls photometrisch bestimmt.
Gemessen wurde die Absorption des σ-Nitrophenols bei 420nm.
Tab. 2: Bestimmung der Aktivität der β-Galactosidase
Inkubationszeit
Blindwert
E420 (1)
E420 (2)
E420 (3)
Mittelwert (1-3)
Mittelwert-BW
Miller Units
Glucose
30min
0,051
0,057
0,055
0,056
0,056
0,005
1
Lactose
3min
0,058
0,51
0,483
0,482
0,492
0,434
1589
Glucose + Lactose
30min
0,048
0,319
0,319
0,317
0,318
0,270
94
Von den jeweils drei ermittelten Werten wurde der Mittelwert gebildet und der
Blindwert abgezogen. Zur Berechnung der Enzymaktivität in Miller-Units wurde
folgende Formel verwendet:
1000 * (E420 Probe – E420 BW)
Aktivität (Miller-Units) = -------------------------------------------------------------Zeit [min] * VProbe [ml] * (OD578 Probe – OD578 Medium)
Die Berechnung der Miller-Units soll am Beispiel des Lactose Ansatzes demonstriert
werden:
1000 * (0,492 – 0,058)
Aktivität (Miller-Units) = ------------------------------------ = 1589
30 * 0,2 * (0,505 – 0,05)
4. Diskussion
Die Ergebnisse des Versuches entsprachen vollkommen unseren Erwartungen.
Wenn E. coli in einem Medium kultiviert wird, dass als C-Quelle ausschließlich
Glucose enthält, ist die Aktivität der Enzyme des Lactoseabbauweges sehr gering.
Es werden nur äußerst geringe Mengen der Enzyme gebildet, die dazu dienen,
Lactose im Medium zu erkennen um bei Bedarf auf den Lactosestoffwechsel
umschalten zu können (siehe auch Einleitung).
Eine Kultivierung mit lactosehaltigem Medium ohne Glucose führt zu einer
Aktivitätssteigerung der Enzyme um mehr als das tausendfache. Lactose bzw.
Allolactose aktiviert zusammen mit dem in Abwesenheit von Glucose gebildeten
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cAMP-CRP-Komplex die Produktion der Enzyme des lac-Operons. Somit kann
Lactose gespalten und die Monomere in den Hexosestoffwechsel eingebracht
werden.
Wird dem Nährmedium sowohl Glucose als auch Lactose zugesetzt, beginnt E. coli
zuerst mit der Verwertung der Glucose. Erst wenn die Glucose komplett verbraucht
ist, wird vollständig auf den Lactosestoffwechsel umgeschaltet, da erst dann das
positive cAMP-CRP Signal auf das lac-Operon einwirken kann. Wie in der Einleitung
ausgeführt wurde, bezeichnet man dieses zweiphasige Wachstum als Diauxie.
Dennoch findet auch schon während der Glucoseverwertung eine stärkere
Produktion der Enzyme des Lactosestoffwechsels statt, die als eine erhöhte
Enzymaktivität (in Miller-Units) im Versuch erkannt werden konnte.
5. Literatur
Schlegel: Allgemeine Mikrobiologie, 1992
Skript zum Praktikum
Internet
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