- RGV - Recursos Genéticos Vegetais

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS
GENÉTICOS VEGETAIS
DANILO MARCELO SANTOS PEREIRA
CULTIVO IN VITRO E ANÁLISE QUALITATIVA DA
FISALINA D EM PHYSALIS ANGULATA L.
Feira de Santana - BA
2011
2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Recursos
Genéticos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito para o título de Mestre em Recursos Genéticos
Vegetais.
Orientador: Prof. Dr. Lenaldo Muniz de Oliveira
Co-orientadora: Dra. Angélica Maria Lucchese
2011
Ficha Catalográfica – Biblioteca Central Julieta Carteado
P49c
Pereira, Danilo Marcelo Santos
Cultivo in vitro e análise qualitativa da Fisalina D em Physalis
angulata L. / Danilo Marcelo Santos Pereira. – Feira de Santana, 2011.
94 f.:il.
Orientador: Lenaldo Muniz de Oliveira
Co-orientadora: Angélica Maria Lucchese
Dissertação (Mestrado em Recursos Genéticos
Universidade Estadual de Feira de Santana, 2011.
Vegetais)
1.Micropropagação vegetal 2.Germinação in vitro 3.Calogênese 4.
Vitaesteróides I.Oliveira, Lenaldo Muniz de. II. Lucchese, Maria
Angélica. III.Universidade Estadual de Feira de Santana. IV.Título.
CDU: 634.7
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Profa. Dra. Moema Cortizo Bellintani
(UFBA)
__________________________________________
Profa. Dra. Sheila Vitória Resende
(UEFS)
__________________________________________
Profº Drº Lenaldo Muniz de Oliveira
Orientador e Presidente da Banca
2011
DEDICO
Aos meus pais:
Alziraldo Gama Pereira e Maria Helena Santos Pereira,
que sempre me apoiaram, confiando e me dando forças
para conquistar mais essa vitória.
AGRADECIMENTOS
DEUS! Sem ELE nada disso seria possível;
Aos meus pais Alziraldo e Maria Helena e aos meus irmãos pelo incentivo e apoio nesse
período.
À CAPES pela bolsa concedida durante o tempo de realização deste trabalho;
Ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Estadual
de Feira de Santana pelo suporte no desenvolvimento deste trabalho;
Ao Professor Dr. Lenaldo Muniz de Oliveira, pela paciência, pelos
conhecimentos transmitidos e principalmente pela orientação;
À Professora Dra Angélica Maria Lucchese pelo apoio na co-orientação;
À estudante de iniciação científica Virgínia Nunes pelo companheirismo e ajuda nos
trabalhos;
Aos colegas do Horto Florestal e do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais.
6
RESUMO
O camapú (Physalis angulata L.) pertence à família Solanaceae sendo reconhecido
por sua importância medicinal, em virtude da produção de vitaesteróides com propriedades
medicinais (fisalinas). A cultura de tecidos tem sido considerada uma ferramenta promissora
para multiplicação de espécies medicinais, contribuindo para obtenção de um maior teor de
compostos bioativos presentes nessas plantas. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver
protocolos para estabelecimento de Physalis angulata em ambiente in vitro avaliando-se o
efeito de diferentes tipos de meios de cultura e reguladores de crescimento na organogênese,
enraizamento e calogênese, analisando qualitativamente a presença de fisalina D nas folhas,
raízes e calos obtidos. Para germinação in vitro foram utilizadas sementes coletadas de plantas
cultivadas no Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). As
plantas obtidas foram utilizadas para estabelecimento in vitro das culturas primárias em meio
MS, MS/2 e WPM. Após o estabelecimento, segmentos nodais foram transferidos para meio
Wood Plant Medium (WPM), identificado como melhor meio de cultura para Physalis
angulata, suplementado com diferentes concentrações de citocininas e auxinas. As plantas
provenientes do experimento anterior foram enraizadas em meio WPM com diferentes
concentrações de AIB e posteriormente aclimatizadas em casa de vegetação. Foi avaliado
também o efeito de diferentes concentrações de reguladores vegetais sobre a calogênese em
explantes foliares e internodais. Avaliou-se a presença da fisalina D nas diferentes partes das
plantas e nos calos obtidos. Foi verificado que a espécie Physalis angulata apresenta fácil
germinabilidade nos diferentes meios de cultura testados, além de que o uso de “pulsos” de
BAP favorece maior número de brotações na multiplicação in vitro. Essa espécie possui
grande facilidade para enraizamento in vitro, mesmo na ausência de reguladores vegetais. É
possível obtenção de calos friáveis em Physalis angulata. Foi constatada a presença da
fisalina D no material in vitro cultivado. Os resultados obtidos servirão de referência para
protocolos de multiplicação dessa espécie, dando suporte a trabalhos de melhoramento
voltados para obtenção de plantas com maior teor de fisalinas e possibilitarão futuras
abordagens biotecnológicas para produção in vitro desses compostos.
Palavras-chaves: Micropropagação; Reguladores de crescimento; Calogênese; Vitaesteróides
7
ABSTRACT
The camapu "(Physalis angulata L.) belongs to the Solanaceae family is recognized for its
medicinal importance, due to the production of vitaesteróides with antineoplastic action
(physalins). Tissue culture has been considered a promising tool for propagation of medicinal
species, contributing to obtaining a higher content of bioactive compounds in these plants.
This study aimed to develop protocols for the establishment of Physalis angulata environment
in vitro by evaluating the effect of different types of culture media and growth regulators on
organogenesis, rooting and callus formation, qualitatively assessing the presence of physalins
D in leaves, roots and callus. For germination in vitro were used seeds collected from plants
cultivated in Horto, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). The plants obtained
were used for in vitro establishment of primary cultures on MS medium MS/2 and WPM.
Once established, the nodal segments were transferred to medium Wood Plant Medium
(WPM), identified as the best culture medium for Physalis angulata, supplemented with
different concentrations of auxins and cytokinins. Plants from the previous experiment were
rooted on WPM medium with different concentrations of IBA and subsequently acclimatized
in a greenhouse. We evaluated the effect of different concentrations of plant growth regulators
on callus induction from leaf explants and internode. We evaluated the presence of physalins
D in different plant parts and callus. It was found that the species Physalis angulata features
easy germination in different media tested, and that the use of "pulses" of BAP encourages
more shoots in vitro multiplication. This species has great ease of rooting, even in the absence
of growth regulators. Is possible obtain friable callus of Physalis angulata. Was confirmed the
presence of physalins in vitro cultivated material. The results will provide reference for
protocols multiplication of this species, supporting the improvement works aimed at obtaining
plants with increased content and allow physalins future biotechnological approaches for
production of these compounds in vitro.
Keywords: Micropropagation; growth regulators, callus; vitaesteróides
8
SUMÁRIO
AGRADECIMENTO
6
INTRODUÇÃO GERAL
7
CAPÍTULO 1 - Germinação, Estabelecimento e Crescimento Inicial
in vitro de Physalis angulata L.
RESUMO
11
ABSTRACT
12
INTRODUÇÃO
13
MATERIAL E MÉTODOS
15
RESULTADOS E DISCUSSÃO
18
CONCLUSÕES
27
REFERÊNCIAS
27
CAPÍTULO 2 - Multiplicação in vitro, Enraizamento e Aclimatização
de Physalis angulata L.
RESUMO
33
ABSTRACT
34
INTRODUÇÃO
35
MATERIAL E MÉTODOS
37
39
CONCLUSÕES
51
REFERÊNCIAS
52
CAPÍTULO 3 – Calogênese e Caracterização Morfológica,
Bioquímica e Fitoquímica de Calos de Physalis angulata L.
RESUMO
61
ABSTRACT
62
INTRODUÇÃO
63
MATERIAL E MÉTODOS
64
66
CONCLUSÕES
74
REFERÊNCIAS
74
CONSIDERAÇÕES FINAIS
77
ANEXOS
78
9
INTRODUÇÃO GERAL
As plantas pertencentes à família Solanaceae tem sido cultivadas pelo homem a
milhares de anos, tendo como membro mais conhecido o tomate (Solanum lycopersicum L.),
utilizado principalmente como tempero na cozinha mundial. Além disso, esta família possui
muitas outras plantas utilizadas pelo homem, como a batata (Solanum tuberosum L.), as
pimentas e pimentões (Capsicum spp.), a berinjela (Solanum melongena L.) o jiló (Solanum
gilo Raddi), e o fumo (Nicotiana tabacum L.) (Souza; Lorenzzi, 2008).
O gênero Physalis, que também integra essa família, é reconhecido pela presença de
metabólitos poli-oxigenados ou vitaesteróides em seus tecidos, e inclui uma ampla variedade
de espécies que são econômica e farmacologicamente importantes (Tomassini et al., 2000).
As espécies desse gênero são reconhecidas por sua grande importância etnofarmacológica,
sendo empregadas para diversas finalidades, como antiinflamatório, antimicrobiano, antiviral,
imunomoduladora, hipotensora, tuberculostática e antimalárica (Almeida, 1993).
A espécie Physalis angulata L. é largamente empregada na medicina popular de vários
países, especialmente os da América do Sul. Nativa de quase todo o Brasil cresce
espontaneamente formando pequenas populações (Figura 1), recebendo várias denominações
populares a depender da região: camapú, joá-de-capote, saco-de-bode, bucho-de-rã e matafome (Moschetto, 2005).
Figura 1. Distribuição geográfica no Brasil de Physalis angulata (Magalhães, 2005)
10
Trata-se de uma planta anual, herbácea, ereta, que mede até um metro de altura e se
reproduz através de sementes (Vasconcellos, 1998). Possui um ciclo relativamente curto,
produzindo frutos do tipo baga 90 dias após a semeadura os quais possuem cálice
concrescente (Figura 2) (Freitas, 2004). Pertence á tribo Solaneae, subtribo Physalinae,
caracterizando-se pela presença de cálice com segmentos não auriculados, filetes não
geniculados na base, anteras dorsifixas, basifixas ou dorsibasifixas e gineceu bicarpelar (Silva
& Agra, 2005).
Figura 2. Detalhes das folhas, flores e frutos de Physalis angulata L. (Minghua, 2009)
Physalis angulata L. é considerada uma planta daninha, capaz de infestar lavouras
agrícolas, pomares e terrenos baldios. Suas sementes apresentam alta porcentagem de
germinação e seus espécimes habitam preferencialmente solos semi-úmidos e sombreados.
Seus frutos de sabor doce ou insípido são comestíveis, sendo apreciados tanto pelo homem,
especialmente aqueles que habitam as zonas rurais, como por animais em geral (Braga, 1976;
Lorenzi, 2002).
Essa espécie também é alvo de diversos estudos químicos e farmacológicos, sendo
largamente empregada na medicina popular de vários países. O principal grupo de esteróides
encontrados nessa espécie são as fisalinas (Figura 3), apresentando diversas propriedades
farmacológicas, como atividade antiparasítica, antiviral e antineoplásica (Tomassini et al.,
2000).
11
Figura 3. Estrutura molecular das fisalinas A, B, C, D e E (Tomassini et al., 2000).
Quimicamente as fisalinas são denominadas de lactonas sesquiterpênicas esteroidais e
são caracterizadas como moléculas de estrutura bastante complexa, pois, além da lactona,
apresentam outra γ lactona fundida ao anel D (Tomassini et al., 2000). Recentemente,
pesquisadores da Bahia e do Rio de Janeiro descobriram pelo menos três grupos de fisalinas
que ajudam a regular o sistema de defesa do organismo e são até 30 vezes mais potentes que
alguns dos medicamentos mais usados para aliviar inflamações (FAPESP, 2003).
O grande potencial fitofarmacológico das fisalinas para o desenvolvimento de novas
drogas bioativas também tem sido demonstrado em vários bioensaios envolvendo
microorganismos (Lopes et al., 2006) e camundongos (Soares et al., 2002). A atividade
antitumoral das fisalinas tem sido motivo de várias especulações e pesquisas. Taylor (2006)
demonstrou forte atividade citotóxica in vitro e in vivo (camundongos) das fisalinas contra
inúmeros tipos de células cancerígenas, incluindo câncer de pulmão, cólon, nasofaringe,
fígado, cérvix, melanoma e cerebral. A atividade antineoplásica de fisalina F foi evidenciada e
comprovada em ensaios in vitro com cinco linhagens de células cancerígenas humanas: HA
22 T (hepatoma); HeLa (cervix uterina); KB (nasofaringe); Colo-205 (colon) e Calu-1
(pulmão), os melhores resultados foram aqueles obtidos com as cepas HeLa e HA 22 T67
(Soares et al., 2002).
12
De acordo com Tomassini et al. (2000), os vitaesteróides apresentam um esqueleto
intacto ou modificado do ergostano. Estes derivados do ergostano são constituintes
polioxigenados presentes, preponderantemente nas espécies de Solanaceae. Magalhães (2005)
cita que esses compostos apresentam grande diversidade estrutural, sendo subdivididos,
segundo Tomassini et al. (2000), em seis grupos principais: vitanolídos, vitafisalinas,
fisalinas, acnistinas, ixocarpalactonas e perulactonas.
Por serem metabólitos secundários, as fisalinas são pouco abundantes, representando
menos de 1% do carbono total das plantas. Os metabólitos secundários exercem nas planta
diversos papeis significativos, como adaptação ao ambiente podendo atuar como antibióticos,
antifúngicos e antivirais para proteger as plantas dos patógenos ou apresentando atividades
antigerminativas ou tóxicas para outras plantas, como as fitoalexinas (Fumagali et al.; 2008).
Considerando a grande demanda por esses metabólitos, a produção pelas plantas nem
sempre é satisfatória. Além disso, esses compostos freqüentemente estão restritos a uma
espécie ou gênero e muitas vezes podem ser ativados somente durante uma determinada fase
do crescimento ou um estádio do desenvolvimento vegetal, ou ainda em estações específicas
do ano, sob condições de estresse ou de disponibilidade de nutrientes (Lourenço, 2003).
Apesar do grande investimento financeiro de muitas empresas na prospecção de novos
produtos naturais, poucos estudos têm sido desenvolvidos buscando-se formas sustentáveis de
exploração desses recursos. Problemas de vários níveis têm limitado uma exploração racional
desses bioprodutos, como: a grande dificuldade para identificação botânica e a grande
variabilidade genética presente em muitas espécies, com alterações quantitativas e qualitativas
nos metabólitos secundários produzidos, além do fato de algumas espécies sintetizarem
metabólitos secundários em concentrações muito baixas o que exige processos de extração
dispendiosos (Pereira, 2002).
Por essas razões, nos últimos anos esforços têm sido feitos para seleção de variedades
mais produtivas, desenvolvimento de metodologia para multiplicação de plantas melhoradas
por vias vegetativas, assegurando a preservação do genoma selecionado e desenvolvimento de
metodologias para exploração de metabólitos secundários via cultura de tecidos ou de células
(Verpoorte & Memelink, 2002).
Neste contexto, a biotecnologia, mas precisamente as técnicas de cultura de tecidos
vegetais têm sido consideradas ferramentas promissoras, tanto para propagação em larga
escala de variedades melhoradas quanto para produção de compostos bioativos com alto valor
agregado, via cultivo de células ou tecidos, possibilitando uma exploração controlada e
independente das variações ambientais.
13
Desse modo, a cultura de tecidos vegetais, através da micropropagação, permite a
multiplicação rápida de genótipos selecionados com maior produtividade, uniformidade e
desempenho no campo, constituindo uma alternativa para a propagação de mudas sadias, em
tempo e espaço físico reduzido, com alta fidelidade genética (George, 2008).
A micropropagação, uma das diversas técnicas de cultura de tecidos vegetais pode ser
divida em dois grupos: organogênese e embriogênese somática (Pasqual et al., 1997). A
organogênese é definida como a formação de estruturas a partir de tecidos e/ou células,
podendo ocorrer por duas vias: via direta, através da regeneração de plantas provenientes de
tecidos meristemáticos, sem passar pela fase de calo, apresentando alta fidelidade genética; e,
por via indireta, quando o processo de regeneração é precedido pela formação de calo
(Grattapaglia & Machado, 1998).
Assim, a micropropagação surge como ferramenta de grande importância em trabalhos
com as mais variadas espécies, como o protocolo apresentado por Bertoni et al. (2006),
intitulado micropropagação de Calendula officinalis L., que enfatiza a possibilidade para a
propagação em larga escala, usando material clonal dessa espécie num prazo máximo de seis
meses, representando uma alternativa viável de produção de matéria prima de qualidade para
a indústria de fitoterápico e cosméticos. França et al. (1995) também desenvolveram a
micropropagação a partir de segmentos nodais de Eclipta alba estabelecendo um protocolo
eficiente para produção em larga escala dessa espécie que possui atividade anti-hepatotóxica.
A mesma metodologia de propagação in vitro foi desenvolvida com o Stryphnoclendron
polyphythum (barbatimão), cuja atividade cicatrizante é atribuída aos taninos presentes na
casca da árvore (França et al., 1995).
Além da micropropagação, a cultura de calos e suspensões celulares tem sido uma
excelente alternativa para exploração de metabólitos secundários, sobretudo para metabólitos
de alto valor agregado. Muitos trabalhos têm demonstrado a possibilidade da exploração
desses compostos, principalmente utilizando cultivo de calos em meio líquido, servindo como
ponto de partida para obtenção de suspensões celulares (Parr, 1998).
Estudos comparativos da produção de metabólitos secundários na cultura de células e
na planta in natura de Gomphrena globosa mostraram que os calos foram capazes de produzir
principalmente a alantoína e o flavonóide glicosilato, além da presença de várias substâncias
que não foram verificadas nos extratos da planta in natura (André et al., 2003).
Basicamente três caminhos têm sido utilizados para exploração de metabólitos
secundários de plantas via cultivo in vitro: cultura de calos, cultura de células em suspensão,
cultura de tecidos diferenciados (Parr, 1998). A cultura de calos utiliza tecido não organizado,
14
formado por células que se multiplicam desordenadamente. Nesses tipos de cultura, diferentes
tipos de calos podem ser produzidos, sendo que os mesmos podem diferir entre si pelas
características morfológicas, potencial para produção de metabólitos e para regeneração de
plantas. Muitos trabalhos têm demonstrado a possibilidade de exploração de metabólitos
secundários a partir de cultura de calos, entretanto, estas têm sido utilizadas, rotineiramente,
como ponto de partida para obtenção de populações de células competentes para o cultivo em
meio líquido (Parr, 1998).
A cultura de células ou suspensão celular fundamenta-se na proliferação de células em
meio líquido, sob condição de agitação contínua, para evitar possíveis gradientes nutricionais
e gasosos no meio de cultura (Barrueto Cid, 1998). Além de ser uma técnica eficiente de
multiplicação rápida, a suspensão celular tem uma grande aplicação para os estudos de
bioquímica, genética, citologia, fisiologia vegetal e fitopatologia (Souza, 2007). Este tipo de
cultivo tem sido empregado na produção de alguns metabólitos secundários em escala
comercial pela utilização de biorreatores, equipamentos para cultivo de células sob imersão
temporária ou permanente. O cultivo é realizado utilizando-se meio de cultura líquido,
permitindo a renovação do ar durante este processo, bem como o monitoramento de alguns
parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido,
temperatura e concentração de íons (França, 2001).
O objetivo deste trabalho é estabelecer em ambiente in vitro plantas de Physalis
angulata, estudar o efeito de reguladores de crescimento sobre a multiplicação, enraizamento
e calogênese in vitro e avaliar qualitativamente a produção de fisalina D nas folhas, caules,
raízes e calos obtidos, buscando-se estratégias para a sua exploração de forma
economicamente viável.
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17
CAPÍTULO 1
18
GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO INICIAL IN VITRO DE PHYSALIS ANGULATA
DANILO MARCELO SANTOS PEREIRA1; LENALDO MUNIZ DE OLIVEIRA2; VIRGÍNIA
DE JESUS NUNES3; JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA4
Biólogo - Mestrando em RGV, Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira
de Santana-BA, Brasil - [email protected]; 2Engenheiro agrônomo – Dr. Professor Adjunto,
DCBIO, Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira de Santana-BA, Brasil
- [email protected]; 3Graduanda - Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira
de Santana-BA, Brasil - [email protected]; 4Engenheiro agrônomo – Dr. Professor Titular, DCBIO,
Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira de Santana-BA, Brasil [email protected];
1
Artigo a ser submetido à Revista Ciência Rural
19
RESUMO
(Germinação e crescimento inicial in vitro de Physalis angulata L.) - Physalis angulata L.
pertence à família Solanaceae e tem ocupado posição de destaque sob o ponto de vista
fitoquímico e farmacológico, em função de sua riqueza de compostos químicos presente nas
folhas e frutos. O objetivo desse estudo foi estabelecer a espécie Physalis angulata L. in vitro,
bem como identificar o melhor tipo de meio de cultura para a germinação e crescimento
inicial de plântulas in vitro dessa espécie. As sementes de Physalis angulata foram extraídas
de frutos maduros e colocadas para secar em temperatura ambiente. Em câmara de fluxo
laminar foram desinfestadas com imersão em álcool a 70% por 30 segundos, seguido de
imersão em solução de hipoclorito de sódio - NaOCl (2,5% de cloro ativo) por 3 minutos e
lavadas 4 vezes com água destilada autoclavada. Após a desinfestação, as sementes foram
inoculadas em meio de cultura WPM, MS e MS½, solidificado com 0,7% de agar e
suplementado com 3% de sacarose. O pH do meio foi corrigido para 5,7 ± 0,1 utilizando-se
KOH ou HCl 0,1N, antes da autoclavagem. Após inoculação, os tubos foram mantidos em
sala de crescimento a temperatura de 25ºC, fotoperíodo de 16 horas e radiação fotossintética
ativa de 60µmol m-2 s-1, por um período de 45 dias. No dia seguinte à inoculação deu-se início
a avaliação diária do experimento durante um período de 15 dias, avaliando-se a porcentagem
de germinação, tempo médio de germinação e o índice de velocidade de germinação. Após a
avaliação dos parâmetros da germinação das sementes, um novo experimento foi conduzido
para avaliação do efeito do tipo de meio de cultura sobre o crescimento inicial dessa espécie.
A germinação iniciou-se quatro dias após a inoculação in vitro não sendo detectadas
diferenças estatísticas entre os resultados obtidos nos diferentes tipos de meio de cultura para
a maioria dos parâmetros avaliados. No entanto, verificou-se que o meio de cultura WPM
permite um melhor desenvolvimento inicial das plântulas, devendo ser utilizado nas demais
etapas do cultivo in vitro dessa espécie.
Termos para indexação: meio de cultura, parâmetros de germinação, solanaceae.
20
ABSTRACT
(Germination and early growth in vitro of Physalis angulata L.) - Physalis angulata L.
belongs to the family Solanaceae and has occupied a prominent position in the view of
phytochemical and pharmacological, due to its wealth of chemical compounds present in
leaves and fruits. The aim of this study was to establish the species Physalis angulata L. in
vitro, and identify the best type of culture medium for germination and early growth of
seedlings of this species in vitro. The seeds of Physalis angulata were extracted from ripe
fruit and put to dry at room temperature. In laminar flow were disinfected by immersion in
70% alcohol for 30 seconds followed by immersion in a solution of sodium hypochlorite NaOCl (2.5% active chlorine) for 3 minutes and washed 4 times with sterile distilled water.
After sterilization, seeds were inoculated in WPM, MS and ½ MS, solidified with 0.7% agar
and supplemented with 3% sucrose. The pH was adjusted to 5.7 ± 0.1 using KOH or 0.1 N
HCl before autoclaving. After inoculation, the tubes were kept in growth room at 25 ° C, 16
hours photoperiod and photosynthetic active radiation of 60μmol m-2 s-1, for a period of 45
days. The day after the inoculation was started daily assessment of the experiment over a
period of 15 days, to evaluate the germination percentage, mean germination time and rate of
germination. After assessing the parameters of seed germination, an experiment was
conducted to evaluate the effect of type of culture medium on initial growth of this species.
Germination began four days after inoculation in vitro was not detected statistical differences
between the results obtained from different types of culture medium for most parameters.
However, it was found that the WPM allows a better initial seedling growth, and should be
used in other stages of in vitro cultivation of this species.
Index terms: culture medium, germination parameters, solanaceae.
21
INTRODUÇÃO
Physalis angulata L. pertence à família Solanaceae e tem ocupado posição de destaque
sob o ponto de vista farmacológico, em função de sua riqueza química, constituindo,
atualmente, uma das espécies mais promissoras para a indústria farmacêutica. Seu grande
potencial decorre da presença em suas folhas e frutos de compostos chamados fisalinas, que
em virtude de sua semelhança química com os glicocorticóides, demonstra diversas
atividades, como imunomoduladora, antimicrobiana, antitumoral, moluscicida, dentre outras
(Lopes et al., 2006).
Quimicamente as fisalinas são denominadas de lactonas sesquiterpênicas esteroidais e
são caracterizadas como moléculas de estrutura bastante complexa (Tomassini et al., 2000).
Pesquisas realizadas pela Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) no Rio de Janeiro e em Salvador,
têm demonstrado o grande potencial das fisalinas para produção de antiiflamatórios, com ação
até 30 vezes mais potente que os antiinflamatórios hoje conhecidos (Tomassini et al., 2000).
Apesar do grande potencial para utilização na indústria farmacêutica ainda persistem
dificuldades para produção comercial dessas substâncias, principalmente devido ao seu baixo
teor nas folhas e frutos. Trabalhos têm sido desenvolvidos buscando-se a seleção de espécies
e variedades dentro do gênero Physalis que apresentem maior teor de fisalinas e de frutos com
melhores caracteres agronômicos, como a pesquisa desenvolvida por Souza et al. (2009)
objetivando a seleção massal de plantas com maior produtividade de frutos.
Além do aspecto produtividade, Lagos (2006) reporta que espécies desse gênero
apresentam polinização mista, com polinização cruzada acima de 50,0%, conduzindo a uma
elevada taxa de variação entre as progênies. De acordo com Pereira et al. (2000), os caracteres
agronômicos de interesse em plantas podem variar entre espécies e cultivares bem como em
função da interação entre fatores genéticos e ambientais.
Neste contexto, as técnicas de cultura de tecidos, mais precisamente a
micropropagação, têm sido consideradas ferramentas promissoras, tanto para a propagação
em larga escala de variedades melhoradas quanto para produção de compostos bioativos com
alto valor agregado. Um exemplo importante desse tipo de estudo foi o conduzido com
Catharanthus roseus, cujos alcalóides indólicos vimblastina e vincristina são compostos
importantes no tratamento de câncer e a ajmaliana que é utilizada no tratamento de doenças
relacionadas ao sistema circulatório (Dicosmo & Misawa, 1995). As duas primeiras
substâncias
são
encontradas
na
planta
em
baixas
concentrações
(0,0005%).
A
micropropagação e a produção de células em suspensão e em larga escala tem sido apontada
22
como solução viável para contornar o problema de baixa produtividade de vimblastina, assim
como de outras substâncias de interesse farmacológico (Dicosmo & Misawa, 1995).
Diversos trabalhos têm demonstrado que a cultura de tecidos e de células pode ser
utilizada para a produção de compostos de interesse, como o desenvolvido por Zhang et al.
(2002) que constataram que a produção de antocianinas em suspensões celulares de Vittis
vinífera foi aumentada cerca de 8,3 vezes quando as culturas foram estimuladas pela adição
de ácido jasmônico e irradiadas com luz contínua. Dong & Zhong (2001) verificaram que o
acúmulo de um taxano (taxuyunnanine C) em suspensões celulares de Taxus chinensis foi
aumentado após estimulação com metil jasmonato (MJ) ou dihidrometil jasmonato (HMJ)
principalmente quando associados à sacarose.
Na micropropagação de uma espécie a primeira etapa é o estabelecimento in vitro, que
se inicia com a seleção dos explantes mais adequados e termina com a obtenção de uma
cultura livre de contaminantes e suficientemente adaptada às condições in vitro, de modo que
apresente reação à aplicação de fitorreguladores na fase seguinte de multiplicação
(Grattapaglia e Machado, 1998). Nessa etapa são utilizados como fonte de explantes ramos
sadios de matrizes mantidas no campo ou plântulas provenientes de sementes germinadas in
vitro.
Segundo Martins et al. (1998) a utilização de plântulas oriundas de sementes
normalmente traz como vantagem um maior controle sobre a assepsia do explante, em
comparação a explantes obtidos de plantas cultivadas em condições de casa de vegetação ou
de campo. O tipo de explante deve ser escolhido de acordo com a sua capacidade para se
adequar às condições in vitro, sendo mais recomendados os que contenham maior proporção
de tecido meristemático, por apresentarem maior capacidade de expressar a totipotência
(Kielse et al., 2009).
As diferentes etapas da micropropagação requerem diferentes condições nutricionais e
um adequado balanço hormonal. Os meios de cultura se baseiam nas exigências nutricionais
das plantas, sendo adequados às necessidades de cada espécie e etapas in vitro (Santos-Serejo
et al., 2006). Meios de cultura não-adequados podem causar sintomas de deficiência mineral e
até a morte dos propágulos (Monteiro et al., 2000). Existe uma grande variedade de meios de
cultura adaptados para diversas espécies, diferindo, sobretudo, na constituição e concentração
de nutrientes (Mantovani e Franco, 1998). Os meios comumente usados são o MS (Murashige
e Skoog, 1962) e o WPM (Woody Plant Medium) (Lloyd & McCown, 1981).
Na tentativa de otimizar o crescimento in vitro dos tecidos vegetais, diversos estudos
propõem a redução ou incremento de alguns macro e/ou micronutrientes que compõem esses
meios de cultura, suprindo melhor as exigências nutricionais de cada espécie, à exemplo dos
23
meios modificados para amoreira-preta (Rubus sp.) e videira (Vitis sp.) (Villa et al., 2008,
2009). Rodrigues et al., (2003) também testaram diferentes concentrações e diferentes meio
de cultura (MS, MS¾, SH e Villegas) para estabelecimento in vitro do gênero Prunus, sendo o
meio MS¾ o que promoveu a maior porcentagem de estabelecimento dos explantes das
espécies desse gênero.
Assim, o objetivo desse trabalho foi estabelecer a espécie Physalis angulata L. in
vitro, identificando o melhor tipo de meio de cultura para a germinação e crescimento inicial
de plântulas in vitro dessa espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
As sementes foram coletadas de frutos maduros, colhidos de plantas cultivadas na
Unidade Experimental Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).
Estas foram lavadas e colocadas para secar sobre papel toalha à temperatura ambiente. Para
desinfestação, as sementes foram lavadas em água corrente, seguindo da imersão em álcool a
70% por 30 segundos e em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl a 2,5% de cloro ativo) por
3 minutos e, finalmente, lavadas por quatro vezes com água destilada autoclavada, segundo a
metodologia descrita por Vasconcellos et al. (2003) (Figura 1). Durante a desinfestação todas
as etapas foram desenvolvidas em câmara de fluxo laminar.
24
Sementes de Physalis angulata
Desinfestação
Álcool 70% (30seg)
NaOCl a 2,5% de cloro ativo (3 min)
Meio de cultura
3% de sacarose; 0,7% de ágar
WPM (Lloyd e McCown,
1981)
MS (Murashige e Skoog,
1962)
MS½ (Murashige e
Skoog, 1962)
Figura 1. Esquema de desinfestação e inoculação das sementes de Physalis angulata.
Após a desinfestação, as sementes foram inoculadas em meio de cultura solidificado
com 0,7% de ágar e suplementado com 3% de sacarose, tendo o pH do meio corrigido para
5,7 ± 0,1 (utilizando-se KOH ou HCl 0,1N), antes da autoclavagem. Avaliou-se o efeito de
três tipos de meio de cultura: WPM (Lloyd e McCown, 1981), MS (Murashige e Skoog,
1962) e MS½ (MS com metade da concentração de sais). As sementes foram inoculadas em
tubos de ensaios (12x100 mm), contendo 10 mL de meio de cultura. Os tubos foram mantidos
em sala de crescimento a temperatura de 25 ± 3ºC, fotoperíodo de 16 horas e radiação
fotossintética ativa de 60µmol m-2 s-1, por um período de 45 dias. No dia seguinte à inoculação
deu-se início a avaliação diária dos parâmetros da germinação durante um período de 15 dias,
avaliando-se a porcentagem de germinação, tempo médio de germinação e o índice de
velocidade de germinação, a partir das sementes inoculadas em cada tratamento. O
experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições
por tratamento, sendo cada repetição constituída por 25 sementes.
Determinou-se a porcentagem de germinação pela fórmula proposta nas Regras para
Análise de Sementes (Brasil, 1992):
25
onde:
G = porcentagem de germinação.
NG = número de sementes germinadas.
NT = número de sementes colocadas para germinar.
O tempo médio de germinação foi obtido através de contagens diárias das sementes
germinadas até o décimo quinto dia após a semeadura e calculado através da fórmula abaixo,
proposta por Labouriau (1983), sendo os resultados expressos em dias.
onde:
t = tempo médio de germinação (dias/semente);
ni = número de sementes germinadas num intervalo de tempo;
n = número total de sementes germinadas;
ti = dias de germinação.
O índice de velocidade de germinação foi calculado pelo somatório do número de
sementes germinadas a cada dia, dividido pelo número de dias decorridos entre a semeadura e
a germinação, de acordo com a fórmula de Maguire (1962).
ivG = (G1/N1) + (G2/N2) + (G3/N3) + ... + (Gn/Nn)
onde:
ivG = índice de velocidade de germinação,
G1, G2, G3,..., Gn = número de plântulas computadas na primeira, segunda, terceira e última
contagem;
N1, N2, N3, ..., Nn = número de dias da semeadura à primeira, segunda, terceira e última
contagem.
Após a avaliação dos parâmetros da germinação das sementes, um novo
experimento foi conduzido para avaliação do efeito do tipo de meio de cultura sobre o
crescimento inicial dessa espécie. As sementes foram desinfestadas utilizando-se a mesma
metodologia descrita para o primeiro experimento. Estas foram inoculadas em diferentes
meios de cultura (WPM, MS e MS½), solidificados com 0,7% de ágar e suplementados com
3% de sacarose, com o pH do meio corrigido para 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem. As
sementes foram inoculadas em tubos de ensaios (12x100 mm), contendo 15 mL de meio de
26
cultura. Os tubos foram mantidos em sala de crescimento a temperatura de 25 ± 3ºC,
fotoperíodo de 16 horas e radiação fotossintética ativa de 60µmol m-2 s-1, por um período de
45 dias. Após 15, 30 e 45 dias de cultivo in vitro quantificou-se o número médio de raízes
(NR), número médio de folhas por planta (NF), comprimento da parte aérea (CPA),
comprimento da raiz (CR), massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca foliar (MSF) e
massa seca da raiz (MSR) da plantas obtidas.
O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com quatro
repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída de 25 tubos com uma planta por
tubo. Foram avaliadas quatro plantas por repetição em cada período e em cada tratamento. Os
resultados do experimento foi submetido à análise de variância utilizando o software SISVAR
(Ferreira, 2003), comparando-se as médias a 5% de probabilidade usando o teste de Tukey
para os parâmetros de germinação e Scott-Knott para os parâmetros de crescimento inicial.
Os resultados obtidos durante o estabelecimento in vitro de Physalis angulata L.,
demonstraram eficiência do protocolo de desinfestação das sementes, não sendo verificada
contaminação em nenhuma das unidades experimentais. De modo semelhante não se verificou
oxidação dos meios de cultura, que se manteve translúcido em todos os tratamentos (Figura
2).
A
C
B
D
Figura 2. Estágios da germinação in vitro de sementes de Physalis angulata L. inoculadas em
meio de cultura WPM: (A) 1 dia após inoculação; (B) 4 dias após inoculação; (C) 6 dias após
inoculação; (D) 8 dias após inoculação.
27
A germinação iniciou quatro dias após a inoculação não sendo detectadas diferenças
estatísticas entre os resultados obtidos nos diferentes tipos de meio de cultura para a
porcentagem de germinação (Figura 3), o tempo médio de germinação (Figura 4) e o índice de
velocidade de germinação (Figura 5). Contudo, os maiores valores absolutos para
porcentagem de germinação e tempo médio de germinação foram obtidos em meio WPM
(89,0% e 3,75 dias, respectivamente). Para o índice de velocidade de germinação,
diferentemente dos resultados obtidos para porcentagem e tempo médio de germinação, os
maiores valores absolutos foram obtidos nas sementes inoculadas em meio MS1/2 (Figura 5)
(Anexo 1).
Germinação (%)
100
a
a
a
80
60
40
20
0
MS
MS/2
WPM
Meio de cultura
Figura 3. Porcentagem de germinação das sementes de Physalis angulata L. inoculadas em
diferentes meios de cultura. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si
Tempo Médio de Germinação
(dias)
significativamente em nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste de Tukey.
4,0
a
a
3,0
a
2,0
1,0
0,0
MS
MS/2
WPM
Meio de cultura
28
Figura 4. Tempo médio de germinação das sementes de Physalis angulata L. inoculadas em
diferentes meios de cultura. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si
significativamente em nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste de Tukey.
a
8
a
IVG
7,5
7
a
6,5
MS
MS/2
WPM
Meio de cultura
Figura 5. Índice de velocidade de germinação das sementes de Physalis angulata L.
inoculadas em diferentes meios de cultura. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre
si significativamente em nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste de Tukey.
Os resultados de porcentagem de germinação, tempo médio de germinação e índice de
velocidade de germinação de plântulas demonstraram a facilidade de germinação dessa
espécie em condições in vitro, independentemente do tipo de meio da cultura.
Resultados semelhantes aos obtidos nesse trabalho foram verificados por Stein et al.
(2007), que constataram maior taxa de germinação em sementes de Inga vera willd
inoculadas em meio WPM, quando comparado aos meios MS e MS1/2. De modo semelhante,
Rosal et al. (2004), em experimento com sementes de candeia, obtiveram maior valor para
porcentagem de germinação para as sementes inoculadas em meio WPM. Já Skrebsky et al.
(2004) em trabalho desenvolvido com Ginseng brasileiro e Nery et al. (2008) trabalhando
com Tabebuia serratifolia, não observaram diferenças significantes para taxa de germinação
testando diferentes meios de cultura. Nogueira et al. (2004), avaliando a germinação in vitro
de murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.), verificaram que os meios MS e WPM1/2
foram mais eficientes, induzindo maior índice de velocidade de germinação em sementes
dessa espécie.
29
A composição do meio de cultura, em relação aos macro e micro elementos e dos
elementos orgânicos, apresenta grande importância e, sendo assim, ao iniciar um processo
biotecnológico com células vegetais, deve-se, em primeira instância, estabelecer a formulação
adequada do meio que será utilizado (Drapeau et al., 1986).
O meio de cultura WPM apresenta 25% das concentrações de íons nitrato e amônia do
meio MS, que por sua vez destaca-se como sendo mais utilizado para cultura de tecidos
vegetais (Misawa, 1994). A adequada embebição das sementes vai depender da concentração
de sais ou outros compostos osmoticamente ativos no meio de germinação e do potencial
osmótico das sementes. Conseqüentemente, a concentração de sais no meio de cultura poderá
viabilizar ou inviabilizar a ocorrência da germinação. Tendo em vista que as sementes de
Physalis angulata tiveram alto percentual germinativo nos diferentes meios de cultura
testados pode-se constatar a facilidade germinativa in vitro dessa planta. Resultados esses que
se assemelham aos obtidos em condições ex vitro por Souza et al. (2009) que verificaram uma
taxa de germinabilidade de 87% para as sementes de Physalis angulata.
A análise do crescimento aos 15 dias de cultivo in vitro demonstrou que os diferentes
tipos de meio de cultura testados não promoveram resultados estatisticamente diferentes
(Anexo 2) para o número de raízes, massa seca de folhas e massa seca de raízes por planta
(Tabela 1). Para o número de folhas por planta e comprimento da raiz obteve-se um maior
valor para as plantas cultivadas em meio WPM, diferindo estatisticamente dos resultados
obtidos nos demais tipos de meio de cultura, que promoveram resultados semelhantes entre si
(Tabela 1). Já para o comprimento da parte aérea e massa seca da parte aérea os maiores
valores foram obtidos em plantas cultivadas em meio WPM e MS1/2. (Tabela 1).
30
Tabela 1. Número médio de raízes (NR), número médio de folhas (NF), comprimento da
parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca
foliar (MSF) e massa seca da raiz (MSR) de plantas de Physalis angulata L. após 15 dias de
cultivo in vitro em diferentes tipos de meio de cultura. Feira de Santana, BA, 2011.
Meio de
NR
NF
CPA (cm)
CR (cm)
MSPA (g)
MSF (g)
MSR (g)
MS
9,12a
4,31b
3,82b
6,83b
0,0016b
0,0049a
0,0019a
MS1/2
11,25a
4,37b
6,56a
6,25b
0,0040a
0,0086a
0,0011a
WPM
12,12a
5,00a
6,88a
7,48a
0,0047a
0,0066a
0,0020a
CV (%)
33,15
12,73
13,10
13,09
20,41
24,18
29,58
cultura
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si significativamente em nível
de 5% de probabilidade de erro pelo teste Scott Knott.
Aos 30 dias de cultivo a análise de crescimento demonstrou que para o número de raiz
e número de folha por planta, os maiores valores foram obtidos para as plantas cultivadas em
meio MS1/2 (Tabela 2), sendo detectadas diferenças estatísticas entre os resultados obtidos
neste tratamento e os demais testados (Anexo 3). De modo semelhante, para o comprimento
da parte aérea e massa seca da parte aérea, obteve-se maiores valores nas plantas cultivadas
em meio MS1/2 (Tabela 2). Ressalta-se que a análise feita com estas mesmas variáveis, com
exceção do número de folhas, no período de 15 dias, demonstrou que os resultados obtidos
nos meios WPM e MS1/2 não diferiam estatisticamente entre si, demonstrando que o meio
MS1/2 passou a permitir um melhor crescimento das plantas com o avanço da idade, o que
culmina com maior demanda por nutrientes para a alocação da biomassa. Já para
comprimento de raiz, o maior valor foi encontrado nas plantas cultivadas em meio MS.
31
Meio de
cultura
MS
NR
NF
CPA (cm)
CR (cm)
MSPA (g)
MSF (g)
MSR (g)
7,69b
4,94b
5,00c
11,0a
0,003c
0,008b
0,002a
12,3a
7,36a
12,4a
7,15b
0,016a
0,016a
0,002a
7,69b
4,88b
6,85b
7,94b
0,005b
0,005b
0,001a
33,88
21,53
15,88
22,50
18,54
14,92
31,29
MS/2
WPM
CV (%)
A análise de crescimento realizada aos 45 dias de cultivo demonstrou que para o
número de raízes e massa seca da parte aérea, as maiores taxas de crescimento foram obtidas
em meio de cultura WPM e MS1/2 (Tabela 3). Enquanto que os resultados para a massa seca
de folhas e de raízes foram semelhantes estatisticamente nas plantas cultivadas nos três meios
de cultura. Já para o número de folhas por planta e comprimento da parte aérea o melhor valor
foi obtido em plantas cultivadas em meio WPM. (Anexo 3).
32
Meio de
cultura
MS
NR
NF
CPA (cm)
CR (cm)
MSPA (g)
MSF (g)
MSR (g)
6,44b
7,63b
5,35c
11,7a
0,007b
0,014a
0,002a
10,1a
7,49b
12,3b
8,57b
0,020a
0,016a
0,001a
11,6a
9,06a
13,9a
13,1a
0,027a
0,018a
0,004a
30,40
18,91
19,82
39,69
42,12
14,58
74,81
MS/2
WPM
CV (%)
Lédo et al. (2007), em trabalho desenvolvido com mangabeira (Hancornia speciosa),
também verificaram um maior comprimento da raiz em plantas cultivadas em meio MS1/2. Já
Leitzke et al. (2009) e Fick (2007), trabalhando com amoreira-preta (Rubus fruticosus) e
louro-pardo (Cordia trichotoma), respectivamente, encontraram maior número de raízes por
planta e maior comprimento das raízes em plantas cultivadas em meio WPM. Diferentemente
dos resultados obtidos com Physalis angulata, Tonietto et al. (2008) obtiveram maior massa
seca da parte aérea em plantas de menta (Menta piperita) cultivadas em meio MS completo.
Da mesma forma, Bellintani et al. (2007) verificaram maior massa seca em Orthophytum
mucugense cultivadas em meios MS e MS1/2. Já em relação à massa seca de raízes, Tonietto
et al. (2008) e Bellintani et al. (2007) obtiveram maior valor em plantas cultivadas em meio
MS, entretanto, utilizaram meio de cultura suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP).
Contrariamente, Bertolucci et al. (2000), em trabalho desenvolvido com marmelinho
(Tounefortia paniculata) verificaram que as plantas mantidas em meio WPM apresentaram
maior valor de massa seca das raízes, enquanto que Tamaki et al. (2007), em trabalho
desenvolvido com Ananas comosus, obtiveram valores equivalentes para a massa seca das
raízes para as plantas cultivadas em meio MS e MS1/2.
Em relação à massa seca total, Castro et al. (2007) verificaram que maiores acúmulos
de matéria fresca e seca em Stryphnodendron adstringens (Mart.), foram observadas em
33
plântulas cultivadas em meios MS e WPM, sendo estes 25% superiores em relação àqueles
observados para plântulas cultivadas em meios com a metade da concentração dos sais. Esses
resultados contraditórios reforçam a idéia de que as respostas de crescimento em função da
concentração de sais no meio de cultura são altamente relacionadas às exigências nutricionais,
típicas de cada espécie.
A análise de crescimento ao longo dos 45 dias demonstrou que para o cultivo in vitro
de plantas de Physalis angulata as maiores taxas de crescimento podem ser obtidas com a
utilização do meio de cultura WPM e MS/2 (Figura 6), sobretudo em relação ao comprimento
da parte aérea e acúmulo de massa seca na parte aérea. O comprimento da parte aérea e a
massa seca da parte aérea são parâmetros importantes para o cultivo in vitro, pois permitem a
obtenção de maior número de explantes para a próxima etapa de micropropagação e,
conseqüentemente, maior taxa de multiplicação.
34
Número de folhas por planta..
Número de raizes por planta..
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
15
30
10
8
6
4
2
0
45
15
30
Tempo de cultivo in vitro (dias)
MS/2
WPM
MS
Comprimento da raíz (cm)..
Comprimento da parte aérea (cm )
MS
16
14
12
10
8
6
4
2
30
10
8
6
4
2
0
15
45
30
45
MS
W PM
Massa seca da parte aérea (g)..
M S/2
WPM
12
Tempo de cultivoin vitro (dias )
MS
MS/2
14
0
15
45
Tempo de cultivoin vitro (dias)
MS/2
WPM
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
15
30
45
MS
MS/2
WPM
Figura 6. Médias do número de raiz por planta, número de folha por planta, comprimento da
parte aérea, comprimento da raiz e massa seca da parte aérea de Physalis angulata L. aos 15,
30 e 45 dias de crescimento em diferentes tipos de meios de cultura.
Esse resultado corrobora com os obtidos por Fick et al., (2007) em trabalho com
estabelecimento e crescimento in vitro de plântulas de louro-pardo (Cordia trichotoma), para
os quais o meio WPM proporcionou maior crescimento das plântulas e uma resposta mais
rápida dos explantes em relação à emissão de folhas e raízes. Já Unemoto et al., (2007) em
trabalho de propagação in vitro de orquídeas brasileiras em meio simplificado, constataram
que os melhores meios de cultura para estabelecimento da espécie Laelia lundii foram o MS e
MS modificado com metade dos macronutrientes.
35
A escolha do melhor meio de cultura é essencial no processo de micropropagação
visto que além de fornecer os nutrientes necessários, possibilita um melhor crescimento das
plantas in vitro (Thorpe et al., 1991; Caldas et al., 1998).
CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos nesse trabalho pode-se concluir que os tipos de meio de
cultura testados não afetam de modo diferenciado os parâmetros da germinação da espécie
Physalis angulata L. no ambiente in vitro e que o meio de cultura WPM e MS1/2 permite um
melhor desenvolvimento inicial das plântulas, devendo ser utilizado nas demais etapas da
micropropagação dessa espécie.
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39
CAPÍTULO 2
40
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO, ENRAIZAMENTO E ACLIMATIZAÇÃO DE
PHYSALIS ANGULATA L.
DANILO MARCELO SANTOS PEREIRA1; LENALDO MUNIZ DE OLIVEIRA2; VIRGÍNIA
DE JESUS NUNES3; JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA4
- [email protected]; 3Graduanda - Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira
de Santana-BA, Brasil - [email protected]; 4Engenheiro agrônomo – Dr. Professor Titular, DCBIO,
Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira de Santana-BA, Brasil [email protected];
2
Artigo a ser submetido à Revista Ciência Rural
41
RESUMO
(Multiplicação in vitro, enraizamento e aclimatização de Physalis angulata L.) - A espécie
Physalis angulata L. possui em seus caules, folhas e frutos diversas substâncias de valor
farmacológico e medicinal, como flavonóides, esteróides e vitaesteróides, sendo as fisalinas o
composto de maior interesse atual. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da citocinina 6benzilaminopurina
(BAP) utilizada
isoladamente
ou
em
combinação
com
ácido
naftalenoacético (ANA) na multiplicação in vitro da espécie Physalis angulata por via direta
e posterior enraizamento e aclimatização das mudas obtidas. Em todos os experimentos foram
utilizados segmentos nodais inoculados em meio de cultura WPM solidificado com 0,7% de
ágar e suplementado com 3% de sacarose. Avaliou-se o efeito isolado e associado de
diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,33; 2,66; 3,99μM) e ANA (0,0; 0,53; 1,07; 1,61μM)
sobre a indução e crescimento das brotações de Physalis angulata. Avaliou-se ainda o efeito
de “pulsos” de BAP nas concentrações (0,0; 1,33; 2,66; 3,99μM), por oito dias, seguido do
cultivo em meio desprovido de reguladores de crescimento. As plantas obtidas do melhor
tratamento de multiplicação in vitro foram transferidas para meio com diferentes
concentrações do ácido indolbutírico (AIB) (0,0; 4,92; 9,84; 14,76; 19,68μM), avaliando-se o
efeito no enraizamento das mesmas. As plantas obtidas foram submetidas à aclimatização em
casa de vegetação. A concentração de 1,33μM de BAP promoveu a formação do maior
número de brotos, embora estes tenham sido pouco alongados. A associação de ANA com
BAP não promoveu respostas satisfatórias à multiplicação in vitro dessa espécie. O uso de
“pulsos” com 2,66μM de BAP possibilitou um aumento significativo no número de brotações
por explante, número de folhas por brotação e comprimento dos brotos em P. angulata,
mostrando ser um procedimento eficaz para multiplicação in vitro dessa espécie. A
concentração de 14,76μM de AIB promoveu o maior comprimento da raiz principal,
possibilitando 100% de sobrevivência das plantas durante a aclimatização.
Termos para indexação: Reguladores de crescimento, micropropagação, “pulsos” de BAP.
42
ABSTRACT
(In vitro multiplication, rooting and acclimatization of Physalis angulata L.) - The species
Physalis angulata L. has on their stems, leaves and fruits of various substances of
pharmacological and medical purposes, such as flavonoids, steroids and vitaesteróides, and
the physalins the compound of greatest current concern. The aim of this study was to evaluate
the effect of cytokinin 6-benzylaminopurine (BAP) used alone or in combination with
naphthaleneacetic acid (NAA) in vitro multiplication of the species Physalis angulata and
later by direct rooting and acclimatization of seedlings. In all experiments, nodal segments
were inoculated in WPM solidified with 0.7% agar and supplemented with 3% sucrose. We
evaluated the isolated and combined effect of different concentrations of BAP (0.0, 1.33,
2.66, 3.99 mM) and NAA (0.0, 0.53, 1.07 and 1.61 mM) on induction and growth of shoots of
Physalis angulata. We also evaluated the effect of "pulses" of BAP concentrations (0.0, 1.33,
2.66, 3.99 mM), for eight days, followed by culture in an environment devoid of growth
regulators. The plants obtained the best treatment for multiplication in vitro were transferred
to a medium with different concentrations of butyric acid (IBA) (0.0, 4.92, 9.84, 14.76, 19.68
mM), evaluating the effect rooting them. The plants obtained were subjected to
acclimatization in the greenhouse. The concentration of 1.33 mM BAP promoted the
formation of more shoots, although they were slightly elongated. The association of NAA
with BAP did not provide satisfactory answers to the in vitro multiplication of this species.
The use of "pulses" with 2.66 mM BAP allowed a significant increase in the number of shoots
per explant, number of leaves per shoot and shoot length of P. angulata, proving to be an
effective procedure for in vitro multiplication of this species. The concentration of 14.76 mM
IBA promoted the greater length of main root, allowing 100% survival of plants during
acclimatization.
Index terms: growth regulators, micropropagation, "pulses" of BAP.
43
INTRODUÇÃO
A espécie Physalis angulata L. vem sendo alvo de grande interesse devido à presença,
em suas folhas, frutos e raízes, de substâncias de valor farmacológico, como flavonóides e
esteróides (Chaves et al., 2005; Silva & Agra, 2005; Tomassini et al., 2000). Além disso, um
grupo de metabólitos secundários majoritários, caracterizados como vitaesteróides, tem sido
encontrado em raízes e folhas da P. angulata, sendo denominadas de fisalinas (Soares et al.,
2003). Quimicamente as fisalinas são denominadas de lactonas sesquiterpênicas esteroidais e
são caracterizadas como moléculas de estruturas bastante complexas, pois, além da lactona,
apresentam outra γ lactona fundida ao anel D (Tomassini et al., 2000). Esses compostos
apresentam importante atividade antineoplásica, com forte efeito citotóxico in vitro e in vivo
contra inúmeros tipos de células cancerígenas de humanos e animais, incluindo câncer de
pulmão, do cólon, da nasofaringe, do fígado, da cérvix, de pele e cerebral (Taylor, 2006).
Mesmo apresentando grande potencial fitoquímico, poucos são os estudos voltados
para exploração sustentável dessa planta. Um dos fatores que tem dificultado a exploração
econômica das fisalinas é o seu baixo teor nos tecidos, aliado à grande variabilidade nas
populações em termos de concentração dos compostos bioativos. Souza et al. (2010)
verificaram grande variabilidade genética para as características do fruto nas progênies de
Physalis angulata. Sendo assim, métodos de propagação vegetativa devem ser buscados, de
modo a garantir a rápida multiplicação de variedades selecionadas, dando suporte a trabalhos
de melhoramento voltados para obtenção de plantas com maior teor de fisalinas.
A cultura de células e tecidos vegetais tem criado uma nova possibilidade para
propagação de plantas, propiciando a multiplicação sistematizada de plantas elites pelo
processo de micropropagação. A micropropagação tem sido utilizada para multiplicar
centenas de espécies medicinais. Rotineiramente vem sendo usada para a multiplicação de
genótipos selecionados ou para substituição acessos que tenham adquirido caracteres
indesejáveis, como baixa produtividade e susceptibilidade a doenças (Pereira, 2002).
Um fator importante para multiplicação in vitro é a utilização de substâncias
reguladoras de crescimento, visto que estas suprem prováveis deficiências das quantidades de
fitormônios nos explantes da planta matriz, induzindo os processos de desdiferenciação e
rediferenciação, com conseqüente formação de tecidos e órgãos (Termignoni, 2005). Os
reguladores vegetais destacam-se como os principais controladores da morfogênese in vitro
44
(Taiz & Zeiger, 2009). A identificação de um correto balanço hormonal é de grande
relevância para o desenvolvimento de um protocolo de micropropagação, de modo a se
conseguir uma taxa de multiplicação adequada. Na fase de multiplicação in vitro o objetivo
principal é produzir o maior número possível de plantas, no menor espaço de tempo, embora
alguns aspectos importantes, como qualidade e homogeneidade das partes aéreas produzidas,
devem ser considerados.
Dentre os pontos importantes na multiplicação in vitro destacam-se aqueles referentes
às concentrações de citocininas e o tipo de meio usado. A citocinina é indispensável nesta fase
para a quebra da dominância apical e indução da proliferação de gemas axilares (Chaves et
al., 2005). Porém, o uso em excesso deste regulador é tóxico e caracteriza-se principalmente
pela redução do alongamento das brotações, redução do tamanho das folhas, encurtamento
dos entrenós, engrossamento exagerado dos caules e vitrificação generalizada, ocasionando
sérios problemas na fase de enraizamento (Bassan & Bobrowski, 2003).
Na fase de enraizamento in vitro a indução de raízes se dá por meio do uso de auxinas,
responsáveis por estimular a divisão celular e reduzir a dominância apical. Entretanto, estas
são essenciais para indução de raízes mas não requeridas para o crescimento das mesmas,
sendo que a presença contínua pode inibir o crescimento da raiz (Singh et al., 2008). Para
Borchetia et al. (2009), a padronização do meio de cultura com uso de reguladores de
crescimento correto é fundamental para otimizar o crescimento e a resposta dos explantes,
sendo que o padrão de desenvolvimento dos explantes é grandemente influenciado pela
concentração e balanço entre as substâncias acrescentadas ao meio de cultura.
A aclimatização é considerada a fase final da micropropagação, sendo uma fase crítica
devido às mudanças súbitas das condições ambientais, passando da condição in vitro para ex
vitro. Nessa fase as plântulas passam de um ambiente onde há baixa umidade para outro que
promove maior transpiração, o que pode ocasionar estresse hídrico, além da passagem de um
estado heterotrófico para autotrófico (Malosso et al., 2008). A diminuição de perdas durante a
fase de aclimatização e a obtenção de mudas com maior qualidade fisiológica pode ser
possível através do desenvolvimento de um sistema de enraizamento mais eficiente (Damiani
et al., 2009). Pré-tratamentos para promover a fotossíntese, estimular o funcionamento de
estômatos e reduzir a umidade relativa durante o cultivo, podem determinar a sobrevivência
de um maior número de plantas durante o transplante.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito dos reguladores de crescimento na
multiplicação e enraizamento in vitro de P. angulata e posterior aclimatização das mudas
obtidas.
45
MATERIAL E MÉTODO
Para a multiplicação in vitro de Physalis angulata L. foram utilizados como explantes
segmentos nodais com aproximadamente 1,0cm de comprimento (Figura 1B) provenientes de
plantas germinadas in vitro, com 20 dias de idade (Figura 1A). Os explantes foram extraídos
em câmara de fluxo laminar e inoculados imediatamente em tubos de ensaio contendo 15 mL
de meio de cultura Wood Plant Medium (WPM), definido por Lloyd & McCown (1980),
suplementados com 3% de sacarose e solidificados com 0,7% de ágar. O pH do meio foi
corrigido para 5,7 ± 0,1 (utilizando-se KOH ou HCl 0,1N), antes da autoclavagem.
A
B
Figura 1. Plântula de Physalis angulata L. germinada in vitro em meio WPM, com 20 dias de
idade (A) e segmento nodal utilizado como explante na etapa de multiplicação in vitro (B).
Feira de Santana, BA, 2011.
Avaliou-se o efeito da adição de diferentes concentrações da citocinina 6benzilaminopurina (BAP) (0,0; 1,33; 2,66; 3,99μM), com base nas concentrações utilizadas
por Chaves et al. (2005) para a multiplicação in vitro de Physalis peruviana. Cada tratamento
constou de quatro repetições com vinte e cinco tubos por parcela, em delineamento estatístico
inteiramente casualizado. Após 30 dias de inoculação avaliou-se o número de brotações por
46
explante (NB), comprimento médio das brotações (CR) e o número de folhas por brotação
(NF).
Em virtude dos resultados obtidos com a utilização de BAP, onde não se obteve uma
elevada taxa de multiplicação, bem como um alongamento ideal para os brotos, um novo
experimento foi conduzido, avaliando-se o efeito combinado da citocinina BAP com a auxina
ácido naftalenoacético (ANA). No segundo experimento também utilizou segmentos nodais
como fonte de explante, o mesmo tipo de meio de cultura e as mesmas condições de cultivo
utilizadas no primeiro experimento. Avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de BAP
(0,0; 0,444; 0,888; 1,332μM) associado a diferentes concentrações de ANA (0,0; 0,537;
1,074; 1,611μM), em todas as combinações possíveis. Cada tratamento constou de quatro
repetições com vinte e cinco tubos por parcela, em delineamento estatístico inteiramente
casualizado, totalizando 16 tratamentos. Após 30 dias de inoculação avaliou-se o número de
brotações por explante, comprimento médio das brotações e o número de folhas por brotação.
Em virtude do alongamento reduzido das brotações obtidos no segundo experimento,
um terceiro experimento foi conduzido, visando à obtenção de plantas aptas para a fase de
enraizamento in vitro dessa espécie. Neste experimento utilizou-se o mesmo tipo de explante
e de meio de cultura, bem como as mesmas condições de cultivo dos experimentos anteriores.
Avaliou-se o efeito indutivo de diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,33; 2,66; 3,99μM)
por um período de oito dias de cultivo (“Pulsos” de BAP), quando os explantes foram
transferidos para um novo meio de cultura isento de reguladores de crescimento. Em cada
tratamento foram utilizadas quatro repetições, com vinte e cinco tubos por parcela, em
delineamento estatístico inteiramente casualizado. Após 22 dias de cultivo nesse novo meio
de cultura foi avaliado o número de brotações por explante, o comprimento médio das
brotações e o número de folhas por brotação.
As plantas obtidas do melhor tratamento do terceiro experimento de multiplicação in
vitro foram transferidas para meio de enraizamento, onde foi testado o meio de cultura WPM,
suplementado com 3% de sacarose e 0,7% de ágar, com o pH ajustado em 5,7 ± 0,1 antes da
autoclavagem. Foi avaliado o efeito de diferentes concentrações do ácido indolbutírico (AIB)
(0, 4,92; 9,84; 14,76; 19,68μM). Os brotos foram mantidos em sala de crescimento a
temperatura de 25°C ± 2°C, sob radiação fotossintética ativa de 30µmol-2 s-1m-2 e fotoperíodo
de 16 horas. Trinta dias após a inoculação foram avaliados o número de raízes e o
comprimento médio das raízes.
Plantas obtidas do melhor tratamento de enraizamento foram submetidas ao processo
de aclimatização, removendo os resíduos de meio de cultura com lavagens sucessivas em
47
água corrente e posterior plantio em copos plásticos, com capacidade para 300 mL, contendo
terra vegetal. As plantas foram cobertas com uma garrafa tipo pet com tampa para a
manutenção da umidade relativa no microambiente e mantida em casa de vegetação a 70% de
luminosidade durante a aclimatização. Durante esse período, a tampa da garrafa pet foi
desenroscada no 7º dia, visando a redução da umidade relativa e retirada totalmente no 16º
dia. A garrafa foi retirada no 30º dia (Figura 2). Após esse período foi avaliado o percentual
de sobrevivência das mudas.
A
B
C
D
Figura 2. Esquema da aclimatização das plantas enraizadas in vitro. (A) 1º dia na casa de
vegetação – garrafa pet tampada; (B) 7º dia – garrafa pet desenroscada; (C) 16º dia – tampa
retirada; (D) 30º dia – garrafa pet retirada.
Os dados obtidos das variáveis analisadas, nos diferentes experimentos, foram
submetidos à análise de variância (ANAVA) testando-se as médias pelo teste de Tukey ou
Scott Knott em nível de 5% de significância para os fatores qualitativos e análise de regressão
polinomial para os fatores quantitativos, utilizando o software SISVAR (Ferreira, 2003).
Os resultados obtidos nesse trabalho indicaram efeitos significativos das diferentes
concentrações de BAP sobre o percentual de explantes responsivos, número de folhas por
planta e comprimento da parte aérea de Physalis angulata L (Anexo 5). A menor
concentração de BAP (1,33μM)), possibilitou a maior taxa de indução de brotos adventícios
(2,84 brotos por explante) em relação ao tratamento controle e às demais doses testados (2,66
e 3,99μM) (Tabela 1).
Resultados semelhantes aos obtidos nesse trabalho foram verificados por Chaves et al.
(2005), que obtiveram aumento do número médio de brotações em explantes de Physalis
peruviana na concentração de 1,33μM de BAP. Rodrigues et al. (1999) afirmam que meios
48
contendo formulações básicas diluídas têm possibilitado melhores resultados para
multiplicação das mais diversas espécies. Segundo Preece (1995), a diminuição da
concentração dos reguladores de crescimento nos meios de cultura é uma tendência mundial,
e muitas pesquisas estão sendo realizadas com esta finalidade. Entretanto, a concentração
recomendada varia consideravelmente entre os diferentes laboratórios que trabalham com
micropropagação. Liu et al. (1988), trabalhando com cultivar de abacaxi Red Spanish,
observaram que a maior proliferação de brotos ocorreu em meio MS líquido suplementado
com 0,3 mg L-1 de BAP, enquanto Marciani-Bendezú et al. (1990) e Kiss et al. (1995)
obtiveram as maiores taxas de multiplicação de brotos de abacaxizeiro quando utilizaram
respectivamente 4,5 e 5 mg L-1 do referido fitorregulador. Segundo Macêdo et al. (2003) essas
discrepâncias de resultados se devem provavelmente a diferenças varietais, bem como a
diferentes protocolos utilizados.
Tabela 1. Média do número de brotos por planta, número de folhas por planta e comprimento
da parte aérea (CPA) de Physalis angulata L. induzidos a partir de segmentos nodais, em
meio WPM na presença de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP). Feira de
Santana, BA, 2011.
Concentrações de BAP
(μM)
0
1,33
2,66
3,99
CV (%)
Característica de crescimento das plantas
Número de brotos
Número de folhas
CPA
por planta
por planta
(cm)
0,88b*
8,46b
12,12a
2,84a
10,66a
2,18b
vitrificação
vitrificação
vitrificação
vitrificação
vitrificação
vitrificação
13,81
6,86
4,57
*Médias seguidas de diferentes letras nas colunas diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%
de probabilidade de erro.
Nos tratamentos com as maiores concentrações de BAP (2,66 e 3,99 μM) verificou-se
intensa vitrificação em 100% das plantas, que se apresentaram muito pequenas, agrupadas e
hiperhidratadas. Segundo Aldoli et al. (2007), a vitrificação é uma reação de
hipersensibilidade às condições de estresse do meio de cultura, interferindo na fotossíntese,
respiração e transpiração das plantas. Para esses autores as plantas vitrificadas são
caracterizadas por apresentarem baixos níveis de lignina e celulose, baixa resistência da
49
parede celular, redução da dominância apical, hipertrofia celular, folhas e caules intumescidos
e quebradiços e caules mais curtos.
Para Ziv (1991) altos níveis de BAP levam a desordens anatômicas, morfológicas e
fisiológicas nos tecidos de plantas cultivadas in vitro. Entretanto, o mecanismo de ação da
citocinina no processo da vitrificação é pouco compreendido (Bornman & Vogelmann, 1984;
Kataeva et al., 1991; Williams & Taji, 1991), podendo ser causado por um ambiente com alto
potencial hídrico e/ou uma atmosfera de elevada umidade relativa no interior dos frascos.
Autores, como Gaspar et al. (1984), citam ainda a possibilidade dos reguladores provocarem
um estresse com o posterior desencadeamento da síntese de etileno. Este último seria o
responsável pelas alterações observadas na morfogênese anormal ao nível de parede celular.
Schuch & Peters (2002) em trabalho com regeneração de brotações de macieira
(Malus domestica, Borkh.), utilizando thidiazuron (TDZ) em maiores concentrações também
observaram vitrificação. Cuzzuol et al. (1995) também verificaram em trabalho com cravo
(Dianthus caryophyllus L.) in vitro que o aumento da concentração de BAP ocasionou maior
vitrificação dos explantes.
Para o número de folhas por brotação, a concentração de 1,33μM de BAP também
promoveu melhor resultado, induzindo maior média de folhas por planta (10,66) em relação
ao tratamento controle (8,46) e aos tratamentos com 2,66μM e 3,99μM de BAP, os quais
vitrificaram (Tabela 1). Resultados semelhantes foram verificados no trabalho com amoreira–
preta, onde Villa et al. (2005) obtiveram maior número de folhas com a menor concentração
de BAP. Santana et al. (2006) também verificaram decréscimo do numero médio de folhas na
maior concentração de BAP trabalhando com Ocimum basilicum, do mesmo modo que
Nachtigal et al. (1995) estudando a espécie Actinidia deliciosa. Já Machado et al. (2006)
trabalhando com porta enxerto de videira obtiveram maior número de folhas por brotação no
tratamento controle quando comparado aos tratamentos utilizando BAP.
Para o comprimento da parte aérea o tratamento controle induziu a maior média
(12,12cm), mostrando que a presença de BAP tem grande influência sobre a redução do
tamanho das brotações (Tabela 1). Manfio et al. (2006) analisando o efeito de BAP e ácido
indolbutírico (AIB) na propagação in vitro de baunilha (Vanilla planifolia) também
observaram que na ausência da citocinina BAP essa espécie apresentou maior média de
alongamento dos brotos, e que quanto maior foi à concentração de BAP utilizada, menor foi o
comprimento das brotações. Segundo Santana et al. (2006), a redução do tamanho das
brotações na presença de BAP no meio é considerada comum, uma vez que as citocininas
induzem brotações pela divisão celular, aumentando o número de células e reduzindo o
50
tamanho destas. Esses autores avaliando o efeito do BAP na micropropagação de manjerição
(Ocimum basilicum) também obtiveram brotações mais alongadas na ausência de BAP.
Na análise dos dados obtidos no experimento com a utilização de BAP e ANA para a
multiplicação in vitro de Physalis angulata, constatou-se através da análise de variância
efeitos significativos dos tratamentos em todos os parâmetros avaliados (Anexo 6). Para a
variável número de brotos por planta obteve-se a maior média (2,20) com a utilização da
concentração 1,33μM de BAP sem a utilização de ANA, não sendo detectada diferenças
estatísticas entre esse tratamento e os que se utilizou essa mesma concentração de BAP
associada a 0,53 e 1,07μM de ANA (Tabela 2). Para o número de folhas a concentração
1,33μM de BAP sem adição de ANA também determinou a maior média (10,74) não
diferindo estatisticamente do tratamento controle e do tratamento onde foi usado 0,44μM de
BAP isoladamente. Para variável comprimento da parte aérea, verificou-se que o tratamento
controle promoveu a maior média (12,22cm), tendo diferença significativa sobre os demais
tratamentos (Tabela 2).
Oliveira et al. (2001) trabalhando com multiplicação in vitro de bilimbi (Averrhoa
bilimbi) verificaram que a maior média de brotos por planta ocorreu nos tratamentos na
presença de BAP e ausência de ANA. Pinto et al. (1994), trabalhando com Kielmeyera
coriacea (Spruce) Mart., também obtiveram a maior taxa de multiplicação com as
concentrações de 0,5 e 1,0 mg L-1 de BAP isoladamente. Arello & Pinto (1993), estudando
esta mesma espécie, verificaram que na concentração de 0,1 mg L -1 de BAP o número de
brotações produzidas tende a aumentar à medida que as concentrações de auxina decrescem, e
chegam a atingir valores máximos quando ANA está ausente no meio, o que demonstra o
papel essencial das citocininas na indução de brotações nessas espécies.
Um maior número de folhas por planta também foi verificado por Beduhn et al. (2004)
trabalhando com Mentha pulegium, em que a presença de 2,0 mg L-1 de BAP na ausência de
ANA promoveu a formação de 13,12 pares de folha por planta. Nascimento et al. (2008)
também obtiveram melhores resultados com uso de 1,0 mg L-1 de BAP na indução de
brotações em Eugenia pyriformis produzindo, em média, 13,5 folhas por brotação.
Os resultados obtidos nesse trabalho para o comprimento da parte aérea demonstra que
o uso do BAP mesmo na presença de ANA reduz consideravelmente o comprimento das
brotações (Tabela 2). Resultados semelhantes foram encontrados em outras espécies por
autores como Beduhn et al. (2004) trabalhando com Mentha pulegium, Chee & Poll (1989) e
Mhatre et al. (2000) com Vitis vinifera.
51
Tabela 2 – Média do número de brotos por planta (NB), número de folhas por planta (NF) e
comprimento da parte aérea (CPA) de Physalis angulata L. induzidos a partir de segmentos
nodais cultivados em meio WPM na presença de diferentes concentrações de 6benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacetico (ANA). Feira de Santana, BA, 2011.
BAP (μM)
ANA (μM)
0,0
0,44
NB
0,88
1,33
0,0
1,04cA*
1,18cA
1,78bA
2,20aA
0,53
1,26bA
1,16bA
1,24bB
2,02aA
1,07
1,06bA
1,1bA
1,0bB
1,84aA
1,61
1,32aA
1,0aA
1,5aA
1,16aB
CV (%)
22,70
NF
0,0
9,7aA
9,8aC
8,0bA
10,74aA
0,53
5,02bC
7,6aB
8,56aA
7,82aB
1,07
4,82bC
6,0aB
3,86bB
6,06aB
1,61
7,22aB
6,24aB
5,22aB
6,52aB
CV (%)
18,72
CPA (cm)
0,0
12,22Aa
1,8cA
1,42cA
2,24bA
0,53
0,72bB
2,18aA
1,82aA
2,24aA
1,07
0,66bB
1,62aA
1,62aA
1,5aB
1,61
1,0bB
1,56aA
1,6aA
1,92aA
CV (%)
17,42
*Médias seguidas de mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem
entre si pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade de erro.
Nesse trabalho foi observado que a utilização de ANA isoladamente ou em interação
com BAP, sobretudo na concentração de 0,888μM do BAP induziu uma elevada taxa de
formação de calos nos explantes (Figura 3). Esses resultados são compatíveis com os obtidos
52
por Silveira et al. (2001) que observaram que o uso dessa auxina em concentração de 0,5µM
foi determinante para a maior indução de calos em explantes de macieira (Malus sp.), o que,
para esses autores, se traduz em efeito indesejável, quando o objetivo é a multiplicação de
clones. Entretanto, apesar da formação de calos ampliar a possibilidade de variação
somaclonal nas plantas obtidas, sua formação tem sido considerada como uma fase para a
indução de raízes, podendo favorecer o enraizamento dos brotos e até mesmo eliminar essa
Percentagem de
explantes com calos
fase do protocolo de micropropagação.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,444
0,888
1,332
BAP (μM)
0
0,537
1,074
1,611
Figura 3. Percentagem de explantes com calos em Physalis angulata L. aos 30 dias de cultivo
em meio de cultura WPM suplementado com 0,0; 0,44; 0,88; 1,33μM de 6-benzilaminopurina
(BAP) associado a 0,0; 0,53; 1,07 e 1,61μM de ácido naftalenoacetico (ANA).
A análise de regressão dos valores obtidos demonstrou significância para todos os
tratamentos testados. A análise indicou um comportamento linear crescente para o número de
brotações por explante quando se utiliza meio de cultura suplementado com 1,33μM de BAP
na ausência de ANA (Figura 4A), evidenciando que a utilização de concentrações um pouco
maiores maiores de BAP isolado poderão induzir um maior número de brotos por explante,
aumentando assim a taxa de multiplicação in vitro dessa espécie (Figura 4A).
Alta relação citocinina/auxina tem sido usada para a proliferação de brotos de algumas
espécies com resultados satisfatórios, como é o caso do pau-santo (Kielmeyera coriacea)
(Martius) estudado por Arello & Pinto (1993), na qual a concentração de 5,0 mg L-1 de BAP
associado com 0,1 mg L-1 de ANA promoveu a formação de maior número de brotos a partir
de segmentos nodais. Para esses autores o efeito benéfico do BAP na multiplicação de
53
brotações relaciona-se com a influência deste regulador de crescimento na divisão celular e na
Número de brotos por planta..
liberação das gemas auxiliares inibidas pela dominância apical.
2,5
2
-ANA(0,00μM) y = 0.9189x + 0.9380 R2 = 95,41%
1,5
▪ANA(0,537μM) y = 1.115x2-0.954x+1.286 R2= 97,22%
1
♦ANA(1,074μM) y = 1.014x2-0.846x+1.114 R2= 87,57%
●ANA (1,611μM) y = -3.160x3+6.290x2-2.890x+1.320
R2 = 100%
0,5
0
0
0,44
0,88
1,33
BAP (μM)
Número de folhas por planta..
0
0,53
1,07
12
10
8
6
4
2
0
0
0,44
0,88
1,33
Comprimento da parte
aérea (cm)
0,53
♦ANA(0,00μM) y = 12,262x3 - 21.152x2 + 7.199x + 9.700
R2 = 100%
▪ANA(0,537μM) y = -4.210x2 + 7.716x + 5.016
R2 = 100%
xANA(1,074μM) y= 14.585x3 - 27.848x2 + 12.147x + 4.820
R2 = 100%
●ANA (1,611μM) y = ns
B
BAP (μM)
0
A
1,61
1,07
1,61
14
12
10
8
6
4
2
0
●ANA(0,00μM) y =14.254x2-25.815x+11.778 R2 = 95,20%
▪ANA(0,537μM) y = -1.318x2-2.702x + 0.850 R2= 77,32%
xANA(1,074μM) y = -1.369x2-2.391x + 0.702 R2= 94,53%
♦ANA (1,611μM) y = 0.630x + 1.100 R2 = 89,42%
0
0,44
0,88
1,33
BAP (μM)
0
0,53
1,07
C
1,61
54
Figura 4. Número de brotos por planta (A), número de folhas por planta (B) e comprimento
da parte aérea (C) de Physalis angulata L. induzidos a partir de segmentos nodais cultivados
em meio de cultura WPM suplementado com diferentes concentrações 6-benzilaminopurina
(BAP) e ácido naftalenoacetico (ANA).
Para o número de folhas por planta, o modelo matemático mais representativo foi o
polinomial (Figura 4B). Para os tratamentos sem a adição de ANA, onde se obteve as
melhores médias para esse parâmetro, a análise indicou uma equação de 3º grau, na qual se
verifica os maiores valores em baixas concentrações de BAP ou em concentrações acima de
1,33μM desse regulador. Para o comprimento da parte aérea, a análise de regressão indicou a
equação quadrática como a mais representativa para os tratamentos sem a adição de ANA,
com um coeficiente de determinação de 95,2%, onde o maior comprimento foi obtido sem a
adição de BAP (Figura 4C).
Os resultados obtidos no terceiro experimento de multiplicação in vitro de Physalis
angulata demonstrou um aumento significativo no número de brotações por planta, número
de folhas por planta e comprimento dos brotos quando comparadas aos experimentos
anteriores (Figura 5), sendo os melhores resultados obtidos com pulsos de 2,66μM de BAP,
que promoveu uma média de 6,05 brotos por plnata e 23,57 folhas por planta. De modo
semelhante aos resultados obtidos nos experimentos anteriores, o tratamento controle induziu
o maior comprimento da parte aérea (13,50cm), contudo, as demais concentrações de BAP
testadas, com essa metodologia, promoveram um alongamento maior dos brotos em relação
aos resultados obtidos nos experimentos anteriores
A
B
C
D
Figura 5. Aspecto das brotações provenientes de segmentos nodais de Physalis angulata L.,
após 30 dias de cultivo em meio WPM, após serem submetidos a pulso de oito dias com 6benzilaminopurina (BAP) nas concentrações de 0,0 (A); 1,33 (B); 2,66 (C); 3,99 (D) μM.
55
Flores et al. (2009) trabalhando com Pfaffia glomerata verificaram que o subcultivo
do material em meio isento de citocininas favoreceu o crescimento das plantas, mesmo
observando que o comprimento da maioria dos brotos foi inferior ao registrado no material
cultivado na ausência de citocinina. Flores et al. (2007) trabalhando com Pfaffia tuberosa
concluíram que o cultivo de segmentos nodais dessa espécie em meio suplementado com 1
µM de TDZ seguido do subcultivo dos brotos em meio MS isento de reguladores vegetais é
uma metodologia viável para a micropropagação. Segundo Radmann et al. (2009), o tempo
de permanência dos explantes no meio de indução de brotações é fator importante para o
crescimento das mesmas, visto que o tamanho das brotações oriundas da fase de multiplicação
é fator determinante para a etapa de enraizamento.
A análise de regressão dos dados obtidos no 3º experimento indicou o modelo
quadrático como o mais representativo para todas as variáveis analisadas. Observou-se maior
número de brotações com aumento nas concentrações de BAP, sendo que, pela estimativa da
equação de regressão, a resposta foi positiva até 2,26μM, induzindo uma média de 4,72 brotos
por planta (Figura 6A). A partir dessa concentração, houve decréscimo na resposta para esta
variável. Para número médio de folhas a equação obtida indicou que a indução máxima se deu
na presença de 2,20μM de BAP com media de 19,84 folhas por planta, tendendo a decréscimo
em concentrações maiores (Figura 6B). Para variável comprimento da parte aérea a equação
indicou que a maior média (13,50cm) é obtida sem a adição de BAP (Figura 6C).
56
A
Figura 6. Número de brotos por planta (A), número de folhas por planta (B) e comprimento
da parte aérea (C) de plantas de Physalis angulata L. com 30 dias de cultivo em meio de
cultura WPM, a partir de segmentos nodais submetidos a pulsos com diferentes
concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) durante oito dias.
57
O uso de “pulso” de reguladores de crescimento na cultura de tecidos é pouco
relatado, principalmente quando o explante não se trata de órgãos embriogênicos, tendo maior
uso na indução de rizogênese (Flygh, 1993; Kovac, 1993; Shekhawat et al., 1993; Deora;
Shekhawat, 1995; Das Prakash, Sarin, 1999; Purohit; Singhvi, 1998).
Budimir e Stokjicic (2004) trabalhando com Pinus heldreichii utilizaram hipocótilos e
cotilédones como explantes, tendo como tratamento doses crescentes de BAP (0,0; 1,0; 2,5;
5,0; 10,0; 50,0 e 100,0 mg L-1) fornecidas como “pulso” durante 1 hora. Após duas semanas
de cultivo em meio sem reguladores de crescimento já era notável o desenvolvimento das
gemas nos tratamentos onde BAP se fazia presente, principalmente na concentração de 50,0
mg L-1. Das Prakash & Sarin, (1999) fizeram o uso de “pulsos” (1 mg L-1 de BAP) durante
dias alternados, verificando uma multiplicação de 8 brotos por plântula de Litchi chinesis
Sonn. em 7 semanas de cultivo. Mathur e Nadgauda, (1999) utilizando a concentração de 400
mg L-1 de BAP durante 30 minutos conseguiram uma capacidade de indução de embriões de
Pinus wallichiana, 3,78 por explante em comparação ao controle. Para Drake et al. (1997) o
método de “pulso” (100 mg L-1 de BAP por 2 horas) na multiplicação vegetativa de Picea
sitchensis foi mais eficaz que o uso de reguladores de crescimento no meio de cultura durante
todo o período do cultivo in vitro.
No enraizamento in vitro de P. angulata foi verificado que a auxina utilizada (AIB)
promoveu resultados satisfatórios visto que 100% dos brotos enraizaram. A análise de
variância comprovou efeito significativo para o número de raízes por broto e comprimento da
maior raiz. Para a variável número de raízes por brotação os resultados obtidos demonstraram
a efetividade da auxina AIB na indução da rizogênese, entretanto, não foram detectadas
58
diferenças estatísticas entre os resultados obtidos com as diferentes concentrações desse
regulador. Contudo, foi observado que a adição de AIB no meio de cultura não foi essencial
ao enraizamento, demonstrando a facilidade da espécie P. angulata nessa etapa do processo
de micropropagação. Em culturas de Pistacia vera (Tilkat et al., 2009), Quercus
semecarpifolia (Tamta et al., 2008), Alibertia edulis (Silva et al., 2008) e Asparagus
racemosus (Bopana; Saxena, 2008) mantidas em meio de cultura sem regulador vegetal, os
níveis endógenos de auxinas não foram suficientes para promover a rizogênese. Segundo
Souza e Pereira (2007), o processo de iniciação da formação de raízes adventícias é regulado
pela relação quantitativa entre os níveis de auxina e citocinina na planta, sendo esses teores
endógenos variantes para cada genótipo.
Verificou-se nesse experimento que os níveis de AIB adicionados ao meio de cultura
tiveram influência significativa sobre o comprimento da maior raiz nas brotações. A maior
média (12,87cm) foi obtida na presença de 14,76μM de AIB, diferindo estatisticamente dos
resultados obtidos nos outros tratamentos. Os menores comprimentos de raízes foram
verificados nas plantas mantidas em meio de cultura sem a adição de AIB e com a menor
concentração testada (4,92 μM).
Para o número de raízes por brotação a análise de regressão indicou um
comportamento quadrático em função das concentrações de AIB utilizadas. O valor estimado
máximo do número de raízes (5,87) tende a ocorrer quando se adiciona 14,54μM de AIB ao
meio de cultura (Figura 7A). Concentrações do regulador superior a esta tendem a
desfavorecer a quantidade de raízes em P. angulata. Esses resultados são semelhantes aos
encontrados por Iapichino e Airò (2008), em Metrosideros excelsa, e por Du e Pijut (2008),
em Fraxinus pennsylvanica, em que constataram uma média de 2,8 raízes/broto quando
inoculados em meio de cultura contendo cerca de 1,0 mg L -1 de AIB. Já para framboeseira
‘Batum’ uma média de 1,82 raízes/broto foi reportada por Leitzke, Damiani e Schuch (2009),
quando o explante foi inoculado em meio WPM independente da concentração de AIB
utilizada.
Com relação ao comprimento da maior raiz, a análise de regressão também indicou um
comportamento quadrático em função das concentrações de AIB utilizadas. O maior valor
estimado foi de 10,97cm, quando o meio de cultura foi suplementado com 16,73μM de AIB
(Figura 7 B).
59
Figura 7. Número de raízes por brotação e comprimento da maior raiz de Physalis angulata
L. inoculados em meio de cultura WPM suplementado com diferentes concentrações de ácido
60
indolbutírico (AIB), aos 30 dias de cultivo. (A) número de raízes por brotação e (B)
comprimento da maior raiz.
O resultado encontrado para a espécie em estudo foi bastante superior ao reportado por
Damiani e Schuch (2009), no qual as raízes de Vaccinium spp. não ultrapassaram 1,0 cm de
comprimento em meio de cultura WPM suplementado com 1,84 mg L-1 de AIB. Em
framboeseira ‘Batum’ e amoreira-preta ‘Xavante’, as raízes não atingiram 1,0 cm de
comprimento independente da concentração de AIB acrescida ao meio de cultura WPM
(Leitzke, Damiani, Schuch, 2009). Ao passo que as raízes de Fraxinus pennsylvanica (Du;
Pijut, 2008) e de Searsia dentata (Prakash; Staden, 2008) atingiram 3,0 e 3,5 cm de
comprimento, respectivamente, em meio de cultura suplementado com 1,0 e 2,0 mg L-1 de
AIB.
Durante a aclimatização, verificou-se 100% de sobrevivência das plantas, o que
demonstra a plasticidade fenotípica dessa espécie, suportando bem a transição do ambiente in
vitro para o ex vitro. Contrariamente, Hoffmann et al. (2001) verificaram que em macieira a
sobrevivência das plantas entre 7 e 21 dias da aclimatização caiu para 85%, em virtude do
estresse sofrido na transferência das plantas do do ambiente in vitro para a casa de vegetação.
Segundo Ziv e Chen (2008), a baixa taxa de sobrevivência de algumas espécies, durante a
aclimatização, deve-se a deficiente vascularização dos tecidos localizados entre a parte aérea e
a radicular das plantas regeneradas in vitro. Os resultados obtidos nesse trabalho sugerem a
boa formação do sistema vascular da espécie P. angulata após todas as etapas de
micropropagação, bem como do aparato estomático e fotossintético, o que possibilitou uma
elevada taxa de sobrevivência.
CONCLUSÕES
A concentração de 1,33μM de BAP possibilita a formação de maior número de brotos
em Physalis angulata, embora estes sejam pouco alongados. Concentrações maiores que
2,66μM de BAP tendem a causar vitrificação nas brotações. A associação de ANA com BAP
não possibilita respostas satisfatórias à multiplicação in vitro dessa espécie, havendo
formação de calos na maioria dos tratamentos onde ANA estava presente. O uso de “pulso”
com 2,66μM de BAP por oito dias é um procedimento eficaz para multiplicação in vitro de
Physalis angulata. O AIB é eficiente no aumento do número de raízes por brotação dessa
espécie sendo que a concentração de 14,76μM possibilita o maior comprimento nas raízes. As
plantas obtidas in vitro são facilmente aclimatizadas.
61
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67
CAPÍTULO 3
68
CALOGÊNESE E CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, BIOQUÍMICA E
FITOQUÍMICA DE CALOS DE PHYSALIS ANGULATA L.
DANILO MARCELO SANTOS PEREIRA1; LENALDO MUNIZ DE OLIVEIRA2; ANGELICA
MARIA LUCCHESE3; JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA4; VIRGÍNIA DE JESUS
NUNES5
- [email protected]; 3Professora titular da Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031460, Feira de Santana-BA, Brasil - [email protected]; 4Engenheiro agrônomo – Dr. Professor
Titular, DCBIO, Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária, 44031-460, Feira de SantanaBA, Brasil - [email protected]; 5Graduanda - Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Universitária,
44031-460, Feira de Santana-BA, Brasil - [email protected];
3
Artigo a ser submetido à Revista Sitientibus
69
RESUMO
(Calogênese e caracterização morfológica, bioquímica e fitoquímica de calos de Physalis
angulata L.) - O cultivo in vitro tem sido amplamente utilizado para a micropropagação de
plantas e, mais recentemente, como alternativa para a produção de substâncias bioativas de
interesse industrial. O cultivo de células em meio líquido tem sido a forma mais recomendada
para produção de substâncias de interesse, sendo o cultivo de calos o ponto de partida para
obtenção das culturas. O presente estudo teve por objetivo induzir a formação de calos
friáveis de Physalis angulata L., por ser esse o tipo ideal para início de cultivos celulares em
meio líquido. Em todos os experimentos foi utilizado meio de cultura MS solidificado com
0,7% de ágar, suplementado com 3% de sacarose e mantidos no escuro após inoculação. No
primeiro experimento foram usados segmentos foliares inoculados em meio com todas as
combinações possíveis de 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D) (0,0; 9,0; 22,0; 36,0µM) e 6benzilaminopurina (BAP) (0,0; 9,0; 18,0; 36,0µM), procedendo-se a caracterização
morfológica, bioquímica e fitoquímica dos calos obtidos. No segundo experimento foram
utilizados segmentos internodais, avaliando-se isoladamente o efeito de diferentes
concentrações de picloram (0,0; 5,0; 10,0; 15,0; 20,0μM) e ácido naftalenoacético (ANA)
(0,00; 8,05; 16,11; 24,16; 32,22μM). Todos os calos obtidos no primeiro experimento foram
compactos, contudo, nos tratamentos com balanço favorável a auxina 2,4D verificou-se a
formação de massa celular com aparência friável apenas na periferia destes calos. Verificouse 100% de indução de calos nas maiores concentrações testadas de ANA, com maior
porcentagem de calos friáveis no tratamento com 32,22μM. Picloram não foi eficiente na
indução de calos friáveis. Os calos com textura compacta apresentaram maior teor de
proteínas totais e menor de açúcares solúveis totais. Verificou-se a presença de fisalina D em
calos e em folhas e raízes de plantas cultivadas in vitro.
Termos para indexação: Reguladores de crescimento, meio de cultura, cultivo de células.
70
ABSTRACT
(Callus formation and morphological, biochemical and phytochemical callus cultures of
Physalis angulata L.) - The in vitro has been widely used for plant micropropagation, and
more recently as an alternative for the production of bioactive substances of industrial
interest. The cultivation of cells in liquid medium has been the most recommended way to
produce substances of interest, and culture of callus the starting point for obtaining the
cultures. This study aimed to induce the formation of friable callus Physalis angulata L.,
because this is the ideal type for initiation of cell cultures in liquid medium. In all experiments
we used MS medium solidified with 0.7% agar supplemented with 3% sucrose and kept in the
dark after inoculation. In the first experiment were used leaf segments were inoculated with
all possible combinations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D) (0.0, 9.0, 22.0, 36.0 mM)
and 6-benzylaminopurine (BAP) (0.0, 9.0, 18.0, 36.0 mM), proceeding to morphological,
biochemical and phytochemical of callus. In the second experiment internodal segments, to
evaluate separately the effect of different concentrations of picloram (0.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0
mM) and naphthaleneacetic acid (NAA) (0.00 , 8.05, 16.11, 24.16, 32.22 mM). All callus was
compact in the first experiment, however, the treatments with the auxin balance in favor 2.4 D
verified the formation of cell mass that looks just crispy on the periphery of these calluses.
There was 100% of induction at higher concentrations of NAA, higher percentage of friable
callus in the treatment with 32.22 mM. Picloram was not effective in induction of friable
callus. The calli with compact texture had higher protein content and lower soluble sugar
content. There was the presence of physalin D in callus and leaves and roots of plants
cultivated in vitro.
Index terms: Growth regulators, culture media, cell culture.
71
INTRODUÇÃO
Plantas pertencentes à família Solanaceae tem sido cultivada pelo homem a milhares
de anos, tendo como membros mais conhecidos o tomate (Solanum lycopersicum L.), a batata
(Solanum tuberosum L.), as pimentas (Capsicum spp.), a berinjela (Solanum melongena L.), o
jiló (Solanum gilo Raddi) e o fumo (Nicotiana tabacum L.) (Souza e Lorenzzi, 2008). Mais
recentemente, o gênero Physalis vem sendo alvo de grande interesse, tanto para consumo dos
seus frutos in natura quanto para produção de substâncias de valor farmacológico, como
flavonóides e esteróides (Tomassini et al., 2000; Chaves et al., 2005; Silva e Agra, 2005).
No início dos anos 70 foram identificadas e caracterizadas, nesse grupo de plantas,
moléculas denominadas fisalinas, em referência ao nome científico da planta. Quimicamente
as fisalinas são denominadas de lactonas sesquiterpênicas esteroidais e são caracterizadas
como moléculas de estrutura complexas (Tomassini et al., 2000). Pesquisas realizadas pela
Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) no Rio de Janeiro e em Salvador, têm demonstrado o
grande potencial das fisalinas para produção de antiiflamatórios, com ação até 30 vezes mais
potentes que os antiinflamatórios hoje conhecidos. A elevada ação deve-se ao fato das
fisalinas apresentarem estrutura molecular bastante semelhante à dos glicocorticóides,
hormônios produzidos pelo organismo que regulam a atividade do sistema imune e servem de
base para a produção industrial da dexametasona e hidrocortisona.
Apesar do elevado potencial para composição de medicamentos, ainda persistem
dificuldades para produção comercial dessas substâncias, principalmente devido ao baixo teor
de fisalinas nas folhas e frutos. Nesse contexto, as técnicas de cultura de tecidos vegetais, têm
sido consideradas ferramentas promissoras, tanto para propagação em larga escala de
variedades melhoradas para produção de fisalinas quanto para produção desses metabólitos
72
via cultivo de células em condições controladas, abrindo novas perspectivas para exploração
sustentável desses recursos genéticos vegetais. O cultivo de células em meio líquido ou
suspensão celular é o método mais recomendado para produção de substâncias in vitro, pois
permite uma elevada taxa de multiplicação celular associada à possibilidade de automação,
com a utilização de biorreatores (Figueiredo et al., 2007). Entretanto, para obtenção de
suspensões celulares a indução de calos friáveis representa o ponto de partida, pois suas
células são facilmente dispersas em meio líquido e apresentam maior taxa de divisão celular.
A caracterização morfológica e bioquímica dos calos pode evidenciar as mudanças
que ocorrem nas diferentes fases da calogênese, fornecendo dados importantes relacionados
ao processo morfogenético in vitro de tecidos vegetais. Além disso, pode auxiliar na
identificação de fatores que desencadeiam mudanças fisiológicas nos explantes, como a
aquisição da friabilidade ou desenvolvimento de embriões somáticos. A caracterização
fitoquímica, por sua vez, pode indicar a possibilidade ou não da exploração de substâncias de
interesse em células e tecidos cultivados in vitro.
Assim, o objetivo deste trabalho foi induzir calos friáveis de Physalis angulata,
caracterizando-os quanto aos aspectos morfológicos, bioquímicos e fitoquímicos, visando
posterior estabelecimento de suspensões celulares dessa espécie.
MATERIAL E MÉTODO
Para a indução de calos foram utilizados como explantes segmentos foliares, com
aproximadamente 0,5 cm2, provenientes de plântulas de Physalis angulata L. estabelecidas in
vitro a partir de sementes. Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15 mL
de meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com 3% de sacarose, 2,4diclorofenoxiacético (2,4D) e 6-benzilaminopurina (BAP), nas concentrações de 0,0; 9,0;
22,0; 36,0µM e 0,0; 9,0; 18,0; 36,0µM, respectivamente, em todas as combinações possíveis.
Cada tratamento constou de quatro repetições com cinco tubos por parcela, em delineamento
estatístico inteiramente casualizado. O meio de cultura foi solidificado com 0,7% de ágar e o
pH do meio foi corrigido para 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem. Após inoculação os tubos
foram mantidos no escuro em sala de crescimento à temperatura de 25 ± 3ºC por um período
de 45 dias. Decorrido esse tempo, os calos obtidos foram avaliados quanto à morfologia
externa, a textura e a coloração.
Tipos morfologicamente distintos de calos, provenientes dos diferentes tratamentos,
foram utilizados para a quantificação dos teores de proteínas totais (PT), aminoácidos livres
(AL), açúcares solúveis totais (AST) e açúcares redutores (AR). Os tipos morfológicos
73
analisados foram: compacto e marrom, compacto e verde e friável na periferia com coloração
branca. Para quantificação bioquímica os extratos foram obtidos conforme metodologia
descrita por Nogueira et al. (2007). Três gramas de cada tipo de calo foram homogeneizados
em graal, adicionando-se 12 mL de água destilada, sendo, em seguida, transferidos para tubos
de centrífuga. As amostras permaneceram a 40°C em banho-maria por 30 minutos e foram
centrifugadas a 4800g por 10 minutos a 25°C. O sobrenadante foi recolhido e armazenado sob
refrigeração para posterior análise. A quantificação dos AST foi realizada por refratometria;
dos AR pelo método do DNS (Miller, 1959), utilizando glicose como padrão; da PT e dos AL
pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951), utilizando-se soro de albumina bovina (BSA)
como padrão. Para obtenção dos aminoácidos totais livres foi realizada a precipitação das
proteínas com o reagente de Folin-Ciocalteau, deixando-se apenas os aminoácidos livres em
solução.
Em virtude dos resultados obtidos no experimento com 2,4D e BAP, onde não se foi
observado calos totalmente friáveis, novos experimentos foram conduzidos, avaliando-se o
efeito isolado das auxinas picloram e ácido naftalenoacético (ANA), utilizando-se segmentos
internodais com aproximadamente 0,5cm como explantes e as mesmas condições de cultivo
utilizadas no experimento anterior. Foram testadas diferentes concentrações de picloram (0,0;
5,0; 10,0; 15,0; 20,0μM) e de ANA (0,0; 8,05; 16,11; 24,16; 32,22μM). As concentrações
utilizadas foram baseadas no trabalho de Pereira et al. (2006), que verificaram a formação de
calos friáveis em discos caulinares de Physalis sp. Cada tratamento constou de cinco
repetições com quatro tubos por parcela, em delineamento estatístico inteiramente
casualizado. Decorridos 45 dias avaliou-se a taxa de calogênese, a morfologia externa, a
textura e a coloração dos calos obtidos.
Os dados obtidos em todos os experimentos foram submetidos à análise de variância
(ANAVA) testando-se as médias pelo teste de Tukey a 5% de significância para os fatores
qualitativos e regressão polinomial para os fatores quantitativos, utilizando o software
SISVAR (Ferreira, 2003).
Para avaliar a ocorrência de fisalinas nos calos friáveis obtidos procedeu-se a
cromatografia em camada delgada. Para efeito de controle, verificou-se também a ocorrência
de fisalinas em extrato obtido da parte aérea de plantas cultivadas em condições ex vitro (casa
de vegetação), da parte aérea de plantas estabelecidas in vitro na ausência de reguladores de
crescimento, da parte aérea de plantas mantidas in vitro na presença de reguladores de
crescimento e da raiz de plantas mantidas in vitro na presença de reguladores de crescimento.
74
As amostras utilizadas para a análise cromatográfica foram submetidas à metodologia
descrita por Soares et al. (2003), sendo secas em estufa a 40ºC até peso constante, utilizandose 10g por amostra. As amostras foram trituradas em liquidificador industrial para aumentar a
superfície de contato com o solvente e posteriormente foram preparados extratos pelo
processo de maceração em metanol, com auxílio de ultrasson, onde o solvente foi removido
posteriormente por destilação à pressão reduzida utilizando um rotaevaporador. O extrato
bruto obtido foi mantido em dissecador até peso constante, sendo, em seguida, diluído em
10mL de metanol e depois acrescido 20mL de solução de acetato de chumbo (2,5g em 20mL
de água destilada) em agitação por 2 horas para redução da quantidade de taninos. Em seguida
o extrato foi filtrado e particionado em funil de separação e extraído três vezes com 20mL de
clorofórmio totalizando 60mL. Posteriormente a solução foi seca em sulfato de magnésio
anidro e o filtrado foi concentrado ate secura e peso constante determinando a seguir o perfil
cromatográfico por camada delgada.
Para obtenção do perfil cromatográfico foi utilizado 50 mg do extrato dissolvido em
10 mL de metanol, que foram aplicados como auxilio de pipetador em placa cromatográfica
com base de alumínio revestida com sílica gel ativadas em estufa a 100ºC por uma hora. Após
a eluição em cuba cromatográfica de vidro com diferentes sistemas de solventes, foi escolhido
diclorometano e acetona (8:2) como o mais adequado para os extratos obtidos. Para
determinação dos grupos de compostos presentes na amostra, a cromatoplaca eluida foi
revelada com Reagente de Anisaldeído-Ácido Sulfúrico (AS), utilizando-se pulverizador de
vidro contendo cerca de 10mL da solução, acoplado a um compressor para aspersão de
volume suficiente para borrifamento da placa, em seguida, a placa foi aquecida a 100ºC por
10min em estufa de renovação e circulação de ar.
A análise de variância revelou significância estatística para a interação dupla BAP x
2,4D para todas as variáveis analisadas (Anexo 8). As maiores taxas de indução de calos em
segmentos foliares de Physalis angulata foram verificadas na concentração de 36µM de 2,4D
independentemente da concentração de BAP utilizada. Nos tratamentos sem adição da
citocinina BAP e da auxina 2,4D ou em baixas concentrações desses reguladores não foi
observada a indução de calos em segmentos foliares dessa espécie.
Apesar das melhores taxas de calogênese terem sido verificadas na concentração de
36µM de 2,4D a análise de regressão não identificou uma equação significativa para o efeito
das doses de BAP dentro dessa concentração de 2,4D. Por outro lado, a análise de regressão
75
indicou efeito quadrático para concentrações de BAP nas demais concentrações de 2,4D. O
ponto máximo de indução, segundo as equações obtidas, ocorreu quando o meio de cultura foi
suplementado com 18µM de BAP associado a 22,61µM de 2,4D (Figura 1).
Em relação à morfologia dos calos, verificou-se que a utilização de BAP em
concentrações acima de 9µM associado ou não à auxina 2,4D induziu a formação de calos
compactos com coloração variando entre as cores branca, verde e marrom. Apenas nos
tratamentos nos quais se utilizou 36µM de 2,4D na ausência de BAP ou 9µM de BAP
associado a 22µM de 2,4D foram verificadas porcentagens acima de 50% de calos com
textura friável, embora esta característica tenha sido observada apenas na periferia dos
Porcentagem de indução de calos
mesmos (Tabela 1).
90,0
80,0
70,0
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
-10,0
0
9
18
36
BAP (µM)
0
9
22
36
♦2,4D (0,00μM) y = 0.00224x2-0.03798x+0.0436 R2 = 98,79%
▪2,4D (9,00μM) y = -0.003143x2+0.1705x-0.3490 R2 = 65,52%
●2,4D (22,00μM) y = -0.0052x2+0.2385x+0.1854 R2 = 89,38%
■2,4D (36,00μM) y = ns
Figura 1. Porcentagem de calos formados em Physalis angulata L., em meio com diferentes
concentrações de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) associado a diferentes níveis de 6benzilaminopurina (BAP).
O início da formação dos calos ocorreu aos oito dias após a inoculação,
independentemente da concentração utilizada dos reguladores de crescimento. Verificou-se
inicialmente o aumento de tamanho e alargamento dos tecidos, seguido da proliferação de
tecidos do calo. Esse comportamento foi observado por Shrivastava et al. (2006), estudando a
espécie Cássia senna L. Para Silveira et al. (2004), esse intumescimento e aumento do
tamanho dos explantes possivelmente se devem à presença de reguladores de crescimento,
que estimulam a divisão e o alongamento da célula. Segundo Costa et al. (2010) a adição de
76
reguladores de crescimento ao meio de cultura e um balanço adequado entre estes são
importantes para desencadear processos organogenéticos em diversas espécies, como
evidenciado em P. angulata.
Pal et al. (2006), estudando a organogênese a partir de fragmentos de hipocótilo e
cotilédones de Curcubita pepo L. verificaram que calos friáveis e nodulares com aspecto
branco e leitoso apresentaram potencial organogênico, enquanto que calos de aparência
esponjosa ou muito compacta e de cor marrom não apresentavam essa capacidade.
Tabela 1 – Porcentagem do aspecto e coloração de calos de Physalis angulata L. induzidos a
partir de segmentos foliares na presença de diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina
(BAP) e ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D). Feira de Santana-BA, 2011.
Concentrações
(μM)
BAP
2,4D
0,0
0,0
0,0
9,0
0,0
22,0
0,0
36,0
9,0
0,0
9,0
9,0
9,0
22,0
9,0
36,0
18,0
0,0
18,0
9,0
18,0
22,0
18,0
36,0
36,0
0,0
36,0
9,0
36,0
22,0
36,0
36,0
Característica dos calos
Textura do calo (%)
Cor (%)
compacto
---------20
------30
60
---60
55
70
100
60
65
80
friável
---------80
------70
40
---40
45
30
---40
35
20
branco
---------55
------70
70
---40
------40
30
25
15
marrom
---------30
------30
30
------55
65
---30
25
60
verde
---------15
---------------60
45
35
60
40
50
25
Os resultados observados nesse trabalho corroboram com os obtidos por Hall & Zeroni
(1980), que também verificaram que altas concentrações de 2,4D em relação à BAP
favorecem a friabilidade de calos. Nogueira et al. (2007) estudando a calogênese em explantes
foliares de murici-pequeno (Birsonimia intermedia Juss.) verificaram que a área coberta por
calos foi significativamente maior quando os explantes foram inoculados na presença das
77
citocininas thidiazuron (TDZ) ou BAP associado a 2,4D, evidenciando que a presença desta
auxina é importante no processo de calogênese. Tao et al. (2002) também observaram alta
porcentagem de calos em segmentos foliares da espécie Citrus grandi com a utilização de
altas concentrações de 2,4D, entretanto, os calos apresentaram consistência friável. Já Techato & Rungnoi (2000), induziram a embriogênese somática em segmentos foliares de
Azadirachta excelsa Jack, utilizando diferentes fontes de auxinas associadas ao BAP, obtendo
maior proliferação de calos com alta taxa de embriões somáticos quando o BAP foi
combinado com a auxina 2,4D.
Segundo Pescador et al. (2000), a friabilidade do calo é favorecida por uma alta
relação auxina/citocinina, bem como pela adição de componentes orgânicos ao meio nutritivo.
Para esses autores à indução de calos friáveis é indispensável para a obtenção de suspensões
celulares, pois estes apresentam células arredondadas e com características mais
meristemáticas, que se dispersam facilmente em meio líquido.
A análise bioquímica dos calos revelou que o teor de PT, AL, AST e AR variou
significativamente nos diferentes tipos morfológicos de calos obtidos nesse trabalho. Os calos
com textura compacta apresentaram maior teor de PT que os calos com textura mais friável,
indicando ser esse um parâmetro importante, para a obtenção de calos com características
ideais para o estabelecimento de culturas celulares em meio líquido. Já em relação aos AL a
situação foi inversa, onde os calos compactos apresentaram menor teor que os calos mais
próximos da friabilidade (Tabela 2).
Os resultados obtidos na análise bioquímica sugerem maior utilização de aminoácidos
livres para a síntese de proteínas em calos com textura compacta ou um aumento no
catabolismo de proteínas à medida que o calo adquire maior friabilidade. Para Santiago
(2003), o teor de proteínas em calos estar relacionado à maior absorção do nitrogênio
fornecido pelos sais de amônio e de nitrato presentes no meio de cultura, influenciado pela
presença de citocininas, o que pode justificar a maior proporção de calos com textura
compacta, obtidos nesse trabalho, em meio de cultura suplementado com BAP em
concentrações superiores a 18,0μM. Um dos principais nutrientes com o qual as citocininas
interagem é o nitrogênio, existindo várias evidências de que esse regulador vegetal ativa a
enzima nitrato redutase (Samuelson e Larsson, 1993), enzima chave na absorção de
nitrogênio.
Os calos com textura compacta apresentaram menor teor de AST e maior teor de AR
em relação aos calos com aparência mais friável (Tabela 2). Esses resultados sugerem um
maior consumo de AST para síntese de compostos complexos que direcionam a morfogênese
78
dos calos mais compactos ou uma menor absorção da sacarose presente no meio de cultura
por esse tipo de calo. Para Serra et al. (2000) a reduzida atividade metabólica dos calos
compactos reflete na baixa taxa de absorção de sacarose do meio de cultura.
Os resultados indicam que a manipulação do teor de açúcares solúveis e de
aminoácidos livres no meio de cultura poderá ser utilizada para indução de calos friáveis,
aptos para o estabelecimento de culturas de células em meio líquido.
Tabela 2 - Teores de proteína total (PT), aminoácidos livres (AL), açúcares solúveis totais
(AST) e açúcares redutores (AR) obtidos em calos morfologicamente distintos de Physalis
angulata L., cultivados em meio MS. Feira de Santana-BA, 2011.
Tipo de calo
PT
mg g MF-1
AL
mg g MF-1
AST
mg g MF-1
AR
mg g MF-1
Compacto e
marrom
2,996a*
0,837b
3,3b
5,189a
Compacto e
verde
1,11b
0,782c
2,5c
4,254b
Friável e
branco
0,803c
1,441a
5,0a
4,107c
*Médias seguidas por letras diferentes nas colunas diferem significativamente pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade de erro.
A suplementação do meio de cultura com picloram mostrou efeito significativo para
todas a variáveis analisadas (Anexo 9), induzindo a formação de calos em todas as
concentrações utilizadas, sendo que os calos obtidos apresentaram-se indiferenciados e com
coloração heterogênia, variando entre as cores marrom e amarela.
No entanto, não foi
verificada em qualquer tratamento a indução de calos friáveis, o que difere dos resultados
obtidos por Pereira et al. (2006), que induziram a formação desse tipo de calo em segmentos
caulinares de Physalis sp. utilizando essa mesma fonte de auxina e nas mesmas concentrações
testadas nesse trabalho.
A análise de regressão para o efeito do picloram sobre a formação de calos indicou o
modelo quadrático como o mais representativo (Figura 2). Após derivação da equação obtida
pode-se verificar que aumento na concentração de picloram até 14,82μM promoveram
aumento crescente na porcentagem de formação de calos, sendo a maior porcentagem de
79
formação de calos obtida nessa concentração, equivalente a 95%. Os resultados observados
nesse trabalho são corroborados pelos obtidos por Flores et al. (1998) com duas cultivares de
morangueiro (Fragaria e Ananassa), onde observaram a formação de calos em todos os
tratamentos suplementados com picloram, sendo a maior intensidade de calogênese obtida
com 10,5μM dessa auxina. Segundo Hagen et al. (1990) o picloram é eficiente na indução de
calos de várias espécies, entretanto, no presente trabalho o sucesso na calogênese não foi
Porcentagem de indução de calos
acompanhado da textura friável, necessária para o estabelecimento de suspensões celulares.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
2
y = -0.0154x +0.4565x+0.3485 R = 82,16%
0
5
10
15
20
Picloram (μM)
Figura 2. Porcentagem de calos formados em segmentos internodais de Physalis angulata L.
em meio de cultura MS suplementado com diferentes concentrações de picloram.
Diferentemente dos resultados obtidos com picloram, não se verificou a indução de
calos em baixas concentrações de ANA, entretanto, verificou-se que a adição dessa auxina nas
concentrações de 16,11, 24,16 e 32,22μM possibilitou 100% de formação de calos (Anexo
10). Em todos os tratamentos que proporcionaram a calogênese, observou-se a formação de
calos com coloração heterogênea, variando entre o branco e marrom, verificando-se uma
relação direta entre a coloração dos calos e a textura, onde os calos com coloração branca
apresentaram maior tendência à textura friável, enquanto que os calos com coloração marrom
apresentaram-se com textura compacta. A coloração dos calos tem sido utilizada como
indicativo da capacidade embriogênica, sendo que as porções translúcido-brancas ou
80
amareladas dos calos apresentam maior friabilidade e potencial para a formação de embriões
somáticos (Ipekci e Gozukirmizi, 2005; Arunyanart e Chaitrayagun, 2005).
A análise de regressão dos resultados obtidos com a utilização de ANA demonstrou
que o modelo linear crescente é o que mais se ajusta aos resultados obtidos para a taxa de
indução de calos friáveis, demonstrando, dessa forma, que o emprego de concentrações mais
elevadas dessa auxina poderá otimizar a indução desse tipo de calo (Figura 3).
Porcentagem de calos friáveis
60
50
2
y = 0,0648x - 0,1601 R = 89,65%
40
30
20
10
0
-10
0
8,06
16,11
24,17
32,22
ANA (μM)
Figura 3. Porcentagem de calos friáveis formados a partir de segmentos internodais de
Physalis angulata L., em meio de cultura MS suplementado com diferentes concentrações de
ácido naftalenoacético (ANA).
Flores et al. (2006) demonstraram que não houve formação de calos em segmentos
nodais de Pfaffia tuberosa quando foram cultivados em meio MS sem a suplementação de
ANA. Flores e Nicoloso (2007) também encontraram resultados semelhantes em Pfaffia
tuberosa (Spreng.) Hicken, verificando um incremento na área dos explantes coberta por
calos com o aumento da concentração de ANA no meio de cultura. Brown & Charwood
(1990) relatam que, de modo geral, o aumento da concentração dessa auxina promove um
incremento na formação de calos friáveis, enquanto que concentrações mais reduzidas
promovem um aumento na freqüência de calos compactos. No entanto, além do tipo e
concentração de auxina, a consistência dos calos também é influenciada por outros fatores,
como a concentração de citocinina, tipo de explante e, sobretudo, pelo genótipo (Remotti &
Löffler, 1995).
A análise fitoquímica revelou a presença de fisalinas na parte aérea das plantas
cultivadas em condições ex vitro, das plantas estabelecidas in vitro, das plantas cultivadas na
81
ausência de e na presença de reguladores de crescimento (BAP e AIB), nas raízes de plantas
cultivadas in vitro na presença de reguladores (BAP e AIB) e nos calos friáveis analisados,
tendo como padrão para comparação a fisalina D (Figura 4).
A
B
C
D
E
F
Figura 4. Perfil cromatográfico dos extratos de Physalis angulata L. obtidos da parte aérea de
plantas cultivadas em condições ex vitro (casa de vegetação) (A); da parte aérea de plantas
estabelecidas in vitro na ausência de reguladores de crescimento (B); da parte aérea de plantas
mantidas in vitro na presença de reguladores de crescimento (C); da raiz de plantas mantidas
in vitro na presença de reguladores de crescimento (D) e de calos fráveis induzidos com ANA
partir de segmentos nodais (E). A coluna F demonstra o perfil cromatográfico da fisalina “D”
usada como controle.
Os perfis cromatográficos obtidos nas diversas amostras são muito semelhantes ao
obtido na amostra proveniente de plantas cultivadas em condições ex vitro (controle), o que
demonstra a possibilidade de exploração dessse tipo de fisalina em plantas ou suspensões
celulares cultivadas em biorreatores. Flores et al. (2009) também constataram que os perfis
cromatográficos de amostras provenientes de plantas cultivadas in vitro e ex vitro de Pfaffia
glomerata (Spreng.) Pedersen foram similares, não apresentando diferenças marcantes em
relação ao teor de β-ecdisona. Várias pesquisas têm mostrado que as condições impostas
durante o cultivo in vitro podem influenciar na biossíntese e/ou acúmulo de diferentes
metabólitos, inclusive de ecdisteróides (Tomás et al., 1993). No trabalho com Matricaria
82
recutita, Tavano et al. (2009) verificaram que plantas cultivadas in vitro, de modo geral,
apresentaram maior conteúdo de fenóis em comparação com as plantas cultivadas no campo.
Resultados semelhantes foram encontrados por Arikat et al. (2004) que compararam o
rendimento de óleo essencial de plantas in vivo e in vitro de Salvia fruticosa, observando que
as plântulas in vitro apresentaram maior rendimento em relação às plantas in vivo. Já Guedes
et al. (2003), pesquisando óleo essencial de plantas in vivo e in vitro de Hypericum
androsaemum L., mostraram que o conteúdo de óleo essencial obtido a partir de brotos
cultivados in vitro foi seis vezes menor quando comparado com plantas cultivadas in vivo,
sendo que os autores atribuíram este resultado ao fato da imaturidade dos brotos cultivados in
vitro.
Assim há a necessidade de maior estudo dos constituintes químicos presentes em
plântulas in vitro nas diferentes espécies medicinais, sobretudo em Physalis angulata abrindo
espaço a análises quantitativas das fisalinas presentes nos materiais in vitro, principalmente
nos calos friáveis obtidos, visando assim conseguir maior teor desse composto que servirá de
ponto de partida para futuras abordagens biotecnológicas como suspensões celulares e uso de
biorreatores.
CONCLUSÕES
É possível a indução de calos a partir de segmentos foliares de Physalis angulata L.
com a utilização de 2,4D associada ao BAP ou a partir de segmentos internodais com a
utilização de picloram ou ANA; Um balanço hormonal favorável à auxina 2,4-D em relação
ao BAP ou altas concentrações de ANA são necessárias para a indução de calos friáveis nessa
espécie; O picloram não foi eficiente na indução de calos friáveis de Physalis angulata L.
Calos com maior friabilidade apresentam maior teor de aminoácidos livres e de açúcares
solúveis totais. Calos, folhas e raízes de Physalis angulata L. cultivados in vitro produzem
fisalina D.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
● Os meios de culturas MS, MS/2 e WPM testados não afetam de modo diferenciado os
parâmetros da germinação da espécie Physalis angulata L. no ambiente in vitro.
● O uso de “pulsos” de BAP é um procedimento eficaz para multiplicação in vitro de
Physalis angulata.
● As plantas obtidas in vitro são facilmente enzaizadas e aclimatizadas.
● Calos com maior friabilidade apresentam maior teor de aminoácidos livres e de açúcares
solúveis totais.
86
● Calos, folhas e raízes de Physalis angulata L. cultivados in vitro produzem fisalina D.
ANEXOS
87
ANEXO
Análise de variância para variáveis de germinação de Physalis angulata
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Germinação
Opção de transformação: Variável sem transformação ( Y )
-------------------------------------------------------------------------------TABELA DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------MEIO_DE_CU
2
178.666667
89.333333
1.583 0.2576
erro
9
508.000000
56.444444
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
686.666667
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
8.98
Média geral:
83.6666667
Número de observações:
12
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Tempo Médio
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------MEIO_DE_CU
2
1.166667
0.583333
3.500 0.0751
erro
9
1.500000
0.166667
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
2.666667
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
12.25
Média geral:
3.3333333
12
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Velocidade Média
--------------------------------------------------------------------------------
88
TABELA DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------MEIO_DE_CU
2
0.015350
0.007675
9.763 0.0056
erro
9
0.007075
0.000786
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.022425
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
8.56
Média geral:
0.3275000
12
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Velocidade de Germinação
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------MEIO_DE_CU
2
2.000000
1.000000
1.000 0.4053
erro
9
9.000000
1.000000
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
11.000000
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
13.33
Média geral:
7.5000000
12
--------------------------------------------------------------------------------
ANEXO 2
Análise de variância para crescimento inicial 15 dias de Physalis angulata
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Número de Raízes
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
76.166667
38.083333
2.952 0.0624
erro
45
580.500000
12.900000
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
656.666667
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
33.15
Média geral:
10.8333333
48
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Número de Folhas
89
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
4.625000
2.312500
6.852 0.0025
erro
45
15.187500
0.337500
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
19.812500
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
12.73
Média geral:
4.5625000
48
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Comprimento Parte Aérea
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
90.487917
45.243958
79.565 0.0000
erro
45
25.588750
0.568639
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
116.076667
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
13.10
Média geral:
5.7583333
48
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Comprimento da Raiz
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
12.140417
6.070208
7.546 0.0015
erro
45
36.198750
0.804417
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
48.339167
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
13.09
Média geral:
6.8541667
48
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Massa Seca Parte Aérea
--------------------------------------------------------------------------------
90
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000021
0.000011
21.238 0.0004
erro
9
0.000005 5.00555556E-0007
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.000026
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
20.41
Média geral:
0.0034667
12
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Massa Seca Folhas
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000027
0.000014
5.072 0.0335
erro
9
0.000024
0.000003
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.000051
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
24.18
Média geral:
0.0067583
12
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000002 9.30000000E-0007
3.091 0.1013
erro
8
0.000002 3.00909091E-0007
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
10
0.000004
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
29.58
Média geral:
0.0018545
11
--------------------------------------------------------------------------------
ANEXO 3
Variável analisada: Número de Raízes
91
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
222.041667
111.020833
11.410 0.0001
erro
45
437.875000
9.730556
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
659.916667
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
33.88
Média geral:
9.2083333
48
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
65.041667
32.520833
21.384 0.0000
erro
45
68.437500
1.520833
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
133.479167
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
21.53
Média geral:
5.7291667
48
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
480.650417
240.325208
145.359 0.0000
erro
45
74.399375
1.653319
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
555.049792
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
15.88
Média geral:
8.0979167
48
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Comprimento da Raiz
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
92
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
130.852917
65.426458
17.113 0.0000
erro
45
172.043750
3.823194
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
302.896667
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
22.50
Média geral:
8.6916667
48
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000406
0.000203
95.421 0.0000
erro
9
0.000019
0.000002
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.000425
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
18.54
Média geral:
0.0078667
12
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Massa Seca Folhas
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000253
0.000126
60.057 0.0000
erro
9
0.000019
0.000002
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.000272
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
14.92
Média geral:
0.0097250
12
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Massa Seca Raiz
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000002
0.000001
3.177 0.0965
erro
8
0.000003 3.63768939E-0007
93
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
10
0.000005
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
31.29
Média geral:
0.0019273
11
--------------------------------------------------------------------------------
ANEXO 4
Variável analisada: Número de Raízes
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
223.625000
111.812500
13.762 0.0000
erro
45
365.625000
8.125000
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
589.250000
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
30.40
Média geral:
9.3750000
48
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
24.237917
12.118958
5.214 0.0092
erro
45
104.596875
2.324375
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
128.834792
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
18.91
Média geral:
8.0604167
48
--------------------------------------------------------------------------------
94
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
653.970417
326.985208
75.623 0.0000
erro
45
194.574375
4.323875
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
848.544792
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
19.82
Média geral:
10.4895833
48
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Comprimento da Raiz
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
172.661667
86.330833
4.436 0.0174
erro
45
875.718125
19.460403
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
47
1048.379792
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
39.69
Média geral:
11.1145833
48
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000778
0.000389
6.752 0.0162
erro
9
0.000519
0.000058
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.001297
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
42.12
Média geral:
0.0180250
12
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Massa Seca Folhas
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
95
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000034
0.000017
3.227 0.0878
erro
9
0.000047
0.000005
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
11
0.000081
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
14.58
Média geral:
0.0157417
12
--------------------------------------------------------------------------------
Variável analisada: Massa Seca Raiz
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------Meio de cultura
2
0.000018
0.000009
2.249 0.1679
erro
8
0.000031
0.000004
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
10
0.000049
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
74.81
Média geral:
0.0026455
11
--------------------------------------------------------------------------------
Anexo 5: Análise de variância para multiplicação in vitro de Physalis angulata com
diferentes concentrações de BAP.
Variável analisada: Número de Brotos
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
1
9.604000
9.604000
145.625 0.0000
erro
8
0.527600
0.065950
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
9
10.131600
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
13.81
Média geral:
1.8600000
10
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Número de Folhas
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
96
-------------------------------------------------------------------------------BAP
1
12.122010
12.122010
28.125 0.0007
erro
8
3.448040
0.431005
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
9
15.570050
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
6.86
Média geral:
9.5650000
10
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
1
247.009000
247.009000
2308.495 0.0000
erro
8
0.856000
0.107000
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
9
247.865000
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
4.57
Média geral:
7.1500000
10
--------------------------------------------------------------------------------
diferentes concentrações da interação de BAP x ANA.
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
5.937375
1.979125
20.576 0.0000
ANA
3
1.297375
0.432458
4.496 0.0063
BAP*ANA
9
3.888125
0.432014
4.491 0.0001
erro
64
6.156000
0.096188
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
79
17.278875
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
22.70
Média geral:
1.3662500
80
--------------------------------------------------------------------------------
Análise do desdobramento de BAP dentro de cada nível de:
ANA
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
97
-------------------------------------------------------------------------------BAP
/1
3
4.362000
1.454000
15.116 0.0000
BAP
/2
3
2.428000
0.809333
8.414 0.0001
BAP
/3
3
2.346000
0.782000
8.130 0.0001
BAP
/4
3
0.689500
0.229833
2.389 0.0762
Resíduo
64
6.156000
0.096188
Análise do desdobramento de ANA dentro de cada nível de:
BAP
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------ANA
/1
3
0.298000
0.099333
1.033 0.3827
ANA
/2
3
0.098000
0.032667
0.340 0.7963
ANA
/3
3
1.692000
0.564000
5.864 0.0013
ANA
/4
3
3.097500
1.032500
10.734 0.0000
Resíduo
64
6.156000
0.096188
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Número de Folhas
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
24.135375
8.045125
4.590 0.0057
ANA
3
207.571375
69.190458
39.478 0.0000
BAP*ANA
9
57.980125
6.442236
3.676 0.0009
erro
64
112.168000
1.752625
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
79
401.854875
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
18.72
Média geral:
7.0737500
80
-------------------------------------------------------------------------------Análise do desdobramento de BAP dentro de cada nível de:
ANA
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
/1
3
19.516000
6.505333
3.712 0.0156
BAP
/2
3
35.682000
11.894000
6.786 0.0005
BAP
/3
3
16.593500
5.531167
3.156 0.0303
BAP
/4
3
10.324000
3.441333
1.964 0.1273
Resíduo
64
112.168000
1.752625
-------------------------------------------------------------------------------Análise do desdobramento de ANA dentro de cada nível de:
BAP
--------------------------------------------------------------------------------
98
FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------ANA
/1
3
78.134000
26.044667
14.860 0.0000
ANA
/2
3
45.526000
15.175333
8.659 0.0001
ANA
/3
3
75.346000
25.115333
14.330 0.0000
ANA
/4
3
66.545500
22.181833
12.656 0.0000
Resíduo
64
112.168000
1.752625
-------------------------------------------------------------------------------Variável analisada: Comprimento Parte Aérea
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
53.004500
17.668167
114.311 0.0000
ANA
3
126.233500
42.077833
272.238 0.0000
BAP*ANA
9
367.145500
40.793944
263.932 0.0000
erro
64
9.892000
0.154563
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
79
556.275500
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
17.42
Média geral:
2.2575000
80
ANA
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
/1
3
407.284000
135.761333
878.359 0.0000
BAP
/2
3
7.452000
2.484000
16.071 0.0000
BAP
/3
3
3.222000
1.074000
6.949 0.0004
BAP
/4
3
2.192000
0.730667
4.727 0.0048
Resíduo
64
9.892000
0.154563
-------------------------------------------------------------------------------Análise do desdobramento de ANA dentro de cada nível de:
BAP
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------ANA
/1
3
489.962000
163.320667
1056.664 0.0000
ANA
/2
3
1.170000
0.390000
2.523 0.0648
ANA
/3
3
0.401500
0.133833
0.866 0.4621
ANA
/4
3
1.845500
0.615167
3.980 0.0114
Resíduo
64
9.892000
0.154563
--------------------------------------------------------------------------------
99
diferentes concentrações de pulsos de BAP.
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
59.847500
19.949167
185.574 0.0000
erro
12
1.290000
0.107500
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
15
61.137500
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
11.55
Média geral:
2.8375000
16
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
467.061875
155.687292
32.546 0.0000
erro
12
57.402500
4.783542
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
15
524.464375
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
15.00
Média geral:
14.5812500
16
--------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
319.185000
106.395000
103.927 0.0000
erro
12
12.285000
1.023750
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
15
331.470000
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
17.52
Média geral:
5.7750000
16
--------------------------------------------------------------------------------
100
ANEXO 8
Análise de variância para calogênese de Physalis angulata com diferentes concentrações da
interação de BAP x 2,4D.
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
3
20.237500
6.745833
31.745 0.0000
2,4D
3
90.637500
30.212500
142.176 0.0000
BAP*2,4D
9
30.912500
3.434722
16.163 0.0000
erro
64
13.600000
0.212500
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
79
155.387500
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
29.04
Média geral:
1.5875000
80
2,4D
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------BAP
/1
3
9.600000
3.200000
15.059 0.0000
BAP
/2
3
21.600000
7.200000
33.882 0.0000
BAP
/3
3
19.800000
6.600000
31.059 0.0000
BAP
Resíduo
/4
3
64
0.150000
13.600000
0.050000
0.212500
0.235 0.8713
--------------------------------------------------------------------------------
Análise do desdobramento de 2,4D dentro de cada nível de:
BAP
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------2,4D
/1
3
43.350000
14.450000
68.000 0.0000
2,4D
/2
3
40.800000
13.600000
64.000 0.0000
2,4D
/3
3
28.800000
9.600000
45.176 0.0000
2,4D
/4
3
8.600000
2.866667
13.490 0.0000
Resíduo
64
13.600000
0.212500
--------------------------------------------------------------------------------
ANEXO 9
101
Análise de variância para calogênese de Physalis angulata com diferentes concentrações de
Picloram.
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------PICLORAM
4
46.000000
11.500000
38.333 0.0000
erro
20
6.000000
0.300000
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
24
52.000000
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
21.07
Média geral:
2.6000000
25
--------------------------------------------------------------------------------
ANEXO 10
Análise de variância para calogênese de Physalis angulata com diferentes concentrações de
ANA.
-------------------------------------------------------------------------------FV
GL
SQ
QM
Fc Pr>Fc
-------------------------------------------------------------------------------ANA
4
96.000000
24.000000 1.0E+0009 0.0000
erro
20 0.000000000E+0000 0.00000000E+0000
-------------------------------------------------------------------------------Total corrigido
24
96.000000
-------------------------------------------------------------------------------CV (%) =
0.00
Média geral:
2.4000000
25
--------------------------------------------------------------------------------
102

- RGV - Recursos Genéticos Vegetais

Transcrição

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