Efeitos do exercício físico associado ao - Pós
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Efeitos do exercício físico associado ao - Pós
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos: estudo experimental com ratas ovariectomizadas. Roberta Carminati Shimano Orientador: Prof. Dr. João Paulo Mardegan Issa Ribeirão Preto 2013 ROBERTA CARMINATI SHIMANO Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos: estudo experimental com ratas ovariectomizadas Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciência da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor. Área de Concentração: Ciência da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor. Orientador: Prof. Dr. João Paulo Mardegan Issa. VERSÃO CORRIGIDA Ribeirão Preto 2013 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO OU PESQUISA DESDE QUE CITADA A FONTE. NOTA: Versão corrigida da Tese. A versão original se encontra disponível na Unidade que aloja o Programa. FICHA CATALOGRÁFICA Shimano, Roberta Carminati Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos: estudo experimental com ratas ovariectomizadas. Ribeirão Preto, 2013. 94p; 30cm Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/usp. Área de concentração: Ciência Aplicadas ao Aparelho Locomotor. Opção: Reabilitação. Orientador: Issa, João Paulo. 1.Osteopenia. 2.Ovariectomia. 3.Exercício Físico. 4.Risedronato. Obs.: A versão original encontra-se na Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. FOLHA DE APROVAÇÃO Roberta Carminati Shimano. Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos: estudo experimental com ratas ovariectomizadas. Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor. Área de Concentração: Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor. Opção: Reabilitação. Aprovado em: _____/_____/_____ Banca Examinadora Prof. Dr.______________________________________________________________________________________________________ Instituição:___________________________________________________________________________________________________ Julgamento:__________________________________ Assinatura:__________________________________________________ Prof. Dr.______________________________________________________________________________________________________ Instituição:___________________________________________________________________________________________________ Julgamento:__________________________________ Assinatura:__________________________________________________ Prof. Dr.______________________________________________________________________________________________________ Instituição:___________________________________________________________________________________________________ Julgamento:__________________________________ Assinatura:__________________________________________________ AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar a Deus, que sempre esteve ao meu lado, iluminando minhas decisões, dando-me forças para continuar acreditando que este dia chegaria. A minha mãe, Maria Aparecida, e minha madrinha “mãe’’, Maria Teresa, pelo amor incondicional, exemplo de força, com as palavras e gestos que me deram segurança para seguir o caminho que escolhi. A minha irmã Renata, o grande apoio na minha vida, aos sorrisos que me alegram, conselhos, amor, carinho e amizade incomparável. Ao meu querido namorado, Bill Rocha, pela compreensão, amizade, companheirismo e paciência, oferecendo a mim sua tranquilidade e seu amor, e sonhando junto comigo os planos do futuro. Ao meu Professor, Dr. João Paulo Mardegan Issa, meu orientador, exemplo de ética, competência e serenidade, pela confiança e por seu empenho em ajudar. Ao professor, Dr. Antônio Carlos Shimano, pela oportunidade, confiança e pela constante disponibilidade em me ajudar. Ao professor, Dr. José Batista Volpon, pelo exemplo de dedicação e profissionalismo, por disponibilizar o acesso ao laboratório e os recursos indispensáveis à realização do experimento. Ao professor, Dr. Edilson Ervolino, pelos ensinamentos e ajuda para que a imunoistoquímica fosse realizada. Aos funcionários do Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Francisco Mozzocato, Rita Cossalter, Maria Teresinha, Luís Henrique, Carlos Alberto Moro, Reginaldo Trevilato e a Lu, pelo auxílio, amizade e convívio agradável. À iniciação científica, Taiane Paliologo, pelo comprometimento, ajuda e dedicação para que esse projeto fosse realizado. Aos meu novos e grandes amigos feitos na pós graduação, Patrícia Moura e Rodrigo Andraus, por todo carinho, ensinamento e amizade dedicada. Aos doutorandos e amigos, Ana Paula Macedo, Maurício Falcai e Bruna Kotake, pela imensa ajuda, apoio e conhecimento que foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho. Ao amigo Rodrigo Okubo, que me incentivou no começo de tudo, pela ajuda e atenção. Aos colegas da Pós graduação, Jorge Imori, Vitor, Thiago Rochetti, Bruno Cimatti, Maria Júlia Paulo, Ariane Zamarioli, Mariana Butezllof, Mariana Fukuda, Débora Tafarel, Miliane Gonzaga, Hildemberg Santiago, Takae kitabatake, Gabriela Yanagihara e Aline Goulart pela amizade e agradável convivência durante o curso. Aos funcionários e colegas do laboratório de Odontologia, sempre atenciosos. As minhas amigas de coração e toda vida, Laiz Sousa, Gabriela Rosa, Lara Carneiro, Inaê Ferreira, Bruna Morgado, Bianca Pavan e Juliana Cohen por todos os conselhos valiosos, apoio, carinho, principalmente dos últimos meses. Ao Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. À CAPES pelo apoio financeiro. RESUMO SHIMANO, R.C. Efeitos do exercício físico associado ao risedronato em ossos osteopênicos: Estudo experimental com ratas ovariectomizadas. 2013. 94f. Dissertação (Mestrado)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Introdução: Alguns tratamentos já foram desenvolvidos objetivando a prevenção e tratamento de perda da massa óssea; reposição hormonal, bisfosfanatos e atividades físicas. Há discussões sobre o melhor método profilático e terapêutico da osteoporose. Com isso, objetivou-se avaliar os efeitos do exercício físico associado ao medicamento risedronato como meio profilático e terapêutico em ossos osteopênicos de ratas submetidas à ovariectomia. Para isso foram utilizadas 48 ratas Wistar, divididas em 8 grupos experimentais: ovariectomizados e sedentárias por 12 semanas (OVX); ovariectomizado e as 12 semanas seguintes administrado risedronato (OVXM); ovariectomizados e treinamento físico na esteira durante 12 semanas (OVXC); ovariectomizados e as 12 semanas seguintes administrado risedronato associado com o treinamento físico na esteira (OVXCM); submetidos à cirurgia simulada e sedentários por 12 semanas (SHAM); submetidos à cirurgia simulada, e as 12 semanas seguintes administrado risedronato (SHAMM); submetidos à cirurgia simulada, seguida de treinamento físico na esteira durante 12 semanas (SHAMC); submetidos à cirurgia simulada, e as 12 semanas seguintes administrado risedronato associado com treinamento físico na esteira (SHAMCM). Todos os grupos, após 12 semanas, foram eutanasiados. Após o procedimento experimental, as tíbias foram dissecadas e submetidas ao ensaio mecânico de flexão de três pontos, histologia e densitometria óssea. Os dados foram analisados por testes estatístico com nível de significância 5%. Os resultados em relação ao peso, os animais ovariectomizados ganharam um aumento de peso significativamente maior que os dos grupos SHAMs. Obtivemos como resultado do ensaio mecânico em relação a rigidez, o grupo SHAMM com valores inferiores ao OVXM (p=0,001); na força máxima, os grupos SHAMM também com valores inferiores ao OVXM e OVXCM (p=0,002), na densitometria global não apresentou diferença estatística entre os grupos, já na densitometria proximal, o grupo OVX com valores inferiores a SHAMM e SHAMCM (p<0,000), na análise histológica de colágeno tipo I o grupo SHAMM com valores inferiores aos grupos OVX e OVXCM (p=0,001), no colágeno tipo III o grupo OVX teve valores inferiores aos grupos SHAMC e SHAMCM (p<0,001); na quantificação de microarquitetura de trabeculado ósseo o grupo OVX obteve valores inferiores aos SHAMC, OVXM, SHAMCM e OVXCM e os grupos OVXCM e SHAMCM tendo resultados superiores ao SHAM, SHAMM e OVXC (p<0,001) e a imunoistoquímica, a imunomarcação para OPG, foi maior no grupo SHAMCM, no RANKL e no TRAP, o grupo OVX se destacou. Conclui-se que o exercício físico e o medicamento, altera para melhor as propriedades biomecânicas dos ossos de ratas ovariectomizadas. O medicamento risedronato não tem benefícios na prevenção primária. O medicamento foi mais eficaz em relação a corrida nos grupos ovariectomizados, e quando juntos, os tratamentos foram mais eficazes. Palavra chave: Osteopenia, Osteoporose, Ovariectomia, Risedronato e Exercício Físico. ABSTRACT SHIMANO, C.S. Effects of physical exercise associated with risedronate in osteopenic bone: An experimental study with ovariectomized rats. 2013. 94f. Thesis- Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013 Introduction: Some treatments have been developed aiming at the prevention and treatment of bone loss, hormone replacement bisfosfanatos and physical activities. There are discussions about the best prophylactic and therapeutic treatment of osteoporosis. Thus, this study aimed to evaluate the effects of physical exercise associated with the drug risedronate as a prophylactic or therapeutic osteopenic bones of rats subjected to ovariectomy. For this we used 48 Wistar rats were divided into 8 groups: ovariectomized sedentary for 12 weeks (OVX), ovariectomized and 12 weeks following administered risedronate (OVXM); ovariectomized and physical training on the treadmill for 12 weeks (OVXC); ovariectomized and 12 weeks following administered risedronate associated with physical training on the treadmill (OVXCM); underwent sham surgery and sedentary for 12 weeks (SHAM); undergoing sham surgery, and 12 weeks following administered risedronate (SHAMM); undergoing surgery simulated, followed by physical training on the treadmill for 12 weeks (SHAMC); undergoing sham surgery, and 12 weeks following administered risedronate associated with physical training on the treadmill (SHAMCM). All groups after 12 weeks were euthanized. After the experimental procedure, the tibias were dissected and subjected to mechanical testing of three-point bending, histology and bone densitometry. Data were analyzed by statistical tests with significance level of 5 %. The results in terms of weight, the increase ovariectomized animals gained weight significantly higher than the shams groups. Obtained as a result of mechanical test hardness compared to the group SHAMM with values lower than the OVXM (p=0.001), in the maximum strength also SHAMM groups with lower values than the OVXM and OVXCM (p=0.002) in the overall density not statistical difference between the groups, since the proximal densitometry, the OVX group with lower values and Shamm SHAMCM (p<0.000), histological analysis of collagen type I group SHAMM with values lower than OVXCM and OVX groups (p=0.001), type III collagen in the OVX group had lower values than SHAMC and SHAMCM groups (p<0.001) in the quantification of trabecular bone microarchitecture of the OVX group obtained lower values than SHAMC, OVXM, SHAMCM and OVXCM groups, and OVXCM and SHAMCM groups having better results than the SHAM, SHAMM and OVXC groups (p<0.001); and immunohistochemistry, immunostaining for OPG was higher in SHAMCM group in RANKL and TRAP, the OVX group stood out. We conclude that physical exercise and medication changes for the better biomechanical properties of the bones of ovariectomized rats. The drug risedronate has benefits in primary prevention. The drug was more effective compared to the ovariectomized animals race and when together were more effective treatments. Keyword: Osteopenia, Osteoporosis, Ovariectomy, Risedronate and Exercise. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Tricotomia da região ventral...................................................................... 33 Figura 2. Incisão reta transversal............................................................................... 33 Figura 3. Localização do Ovário............................................................................... 33 Figura 4. Retirada do Ovário..................................................................................... 33 Figura 5. Sutura......................................................................................................... 33 Figura 6. Animal Ovariectomizado........................................................................... 33 Figura 7. Distribuição dos Grupos Experimentais..................................................... 35 Figura 8. Esteira motorizada Insight (Modelo EP – 131).......................................... 36 Figura 9. Metodologia de preparo do medicamento.................................................. 37 Figura 10. Foto do posicionamento do osso para o exame de densitometria............ 39 Figura 11. Densitometria e a área de varredura da tíbia............................................ 40 Figura 12. Tíbia posicionada na Máquina Universal de ensaio (EMIC® - 10000N). 41 Figura 13. Fotomicrografias evidenciando o aspecto histológico das trabéculas ósseas nos grupos SHAM (A), OVX (B), SHAMC (C), OVXC (D), SHAMM (E), OVXM (F), SHAMCM (G), OVXCM (H). Coloração: H&E……………………. 58 Figura 14. Padrão de imunomarcação de TRAP, RANKL e OPG. A: Fotomicrografia evidenciando um osteoclasto TRAP positivo (seta preta). B: Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto RANKL positivo (seta azul). C: Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto OPG positivo (seta vermelha). Abreviações e símbolos: bt, trabécula óssea……………………………………… 59 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Protocolo de Treinamento Físico em Esteira.......................................... 36 Tabela 2. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da Rigidez pela análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.................................................................................................................... 49 Tabela 3. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima da Força Máxima pela análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.................................................................................................................... 50 Tabela 4. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da densidade óssea pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.................................................................................................................... 52 Tabela 5. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima, da densidade óssea da área proximal pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM..................................................................................................... 53 Tabela 6. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima do colágeno tipo I pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, 55 OVXCM...................................................................................................... Tabela 7. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínimo, máximo do colágeno tipo III pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, 56 OVXCM...................................................................................................... Tabela 8. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima, da quantificação do trabeculado ósseo, pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM.................................................................... 57 LISTA DE GRÁFICOS Grafico 1. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos SHAMs, obtenção da reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento...... 46 Grafico 2. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos OVXs, obtenção da reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento...... 47 Gráfico 3. Análise da Rigidez (N/mm) para os diferentes grupos experimentais..... 48 Gráfico 4. Análise da Força Máxima (N) para os diferentes grupos experimentais. 50 Gráfico 5. Análise da Densitometria óssea total (g/cm2) para os diferentes grupos experimentais.............................................................................................................. 51 Gráfico 6. Análise da Densitometria óssea proximal (g/cm2) para os diferentes grupos experimentais.................................................................................................. 53 2 Gráfico 7. Análise do colágeno tipo I (μm ) para os diferentes grupos experimentais.............................................................................................................. 54 Gráfico 8. Análise do colágeno tipo III (μm2) para os diferentes grupos experimentais.............................................................................................................. 56 Gráfico 9. Análise da quantificação do trabeculado ósseo (μm2) para os diferentes grupos experimentais.................................................................................................. 57 Gráfico 10. Mediana dos valores da Imunomarcação para OPG.............................. 59 Gráfico 11. Mediana dos valores da Imunomarcação para RANKL......................... 60 Gráfico 12. Mediana dos valores da Imunomarcação TRAP.................................... 61 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ANOVA- Análise de variança CEUA- Comissão Ética Uso de Animais cm- Centímetros DMO- Densidade Mineral Óssea EDTA- Ácido Etilenodiamino Tetra-acético FMRP- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto g- Gramas GL- Gay Lussac: quantidade em mililitros de álcool absoluto contida em 100 mililitros de mistura hidro-alcoólica. m/min- Metros por minutos ml- Mililitro mm- Milímetros N - Newton o - Graus o C – Temperatura (graus Celsius) OMS- Organização Mundial de Saúde OPG- Osteoprotegerina OVX- Ovariectomia OVXC- Ovariectomia e corrida OVXCM- Ovariectomia, corrida e medicamento OVXM- Ovariectomia e medicamento PTH- Hormônio da paratireóide RANK- Receptor ativador do fator nuclear kB RANKL- Ligante do receptor SHAM- Cirurgia simulada SHAMC- Cirurgia simulada e corrida SHAMCM- Cirurgia simulada, corrida e medicamento SHAMM- Cirurgia simulada e medicamento TRAP- Fosfotase ácida resistente ao tartarato USP- Universidade de São Paulo μm – Micrômetros SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 15 1.1 Tecido Ósseo................................................................................................... 16 1.2 Remodelação Óssea......................................................................................... 17 1.3 Osteopenia e Osteoporose .............................................................................. 18 1.4 Modelo Experimental de osteopenia em ratas............................................... 20 1.5 Atividade física................................................................................................ 21 1.6 Risedronato...................................................................................................... 24 1.7 Medidas de mensuração óssea....................................................................... 25 2. OBJETIVO............................................................................................................ 28 2.1Objetivo Primário............................................................................................. 28 2.2Objetivo Secundário......................................................................................... 28 3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................ 30 3.1 Animais experimentais.................................................................................... 31 3.2 Procedimento experimental............................................................................. 31 3.2.1 Técnica Cirúrgica.................................................................................. 31 3.2.1.1 Ovariectomia............................................................................. 32 3.2.1.2 Sham.......................................................................................... 34 3.3 Grupos experimentais...................................................................................... 34 3.4 Técnica de Treinamento Físico........................................................................ 35 3.5 Administração do Risedronato........................................................................ 37 3.6 Peso Corpóreo................................................................................................. 38 3.7 Análise da estrutura óssea............................................................................... 38 3.8 Densidade mineral óssea................................................................................. 38 3.9 Análise mecânica............................................................................................. 40 3.10 Histologia...................................................................................................... 41 3.10.1 Processamento Histológico................................................................. 41 3.10.2 Análise Microscópica.......................................................................... 42 3.10.2.1 Quantificação das fibras colágenas tipo I e III..................... 42 3.10.2.2 Quantificação de trabeculado ósseo..................................... 42 3.11 Técnica imunoistoquímica............................................................................. 43 3.11.1 Análise do padrão de imunomarcação das amostras submetidas à imunoperoxidase............................................................................................. 43 3.12 Análise Estatística......................................................................................... 44 4. RESULTADOS..................................................................................................... 45 4.1 Avaliação Clínica............................................................................................ 46 4.2 Peso corpóreo.................................................................................................. 46 4.3 Ensaio Mecânico............................................................................................. 47 4.3.1 Rigidez................................................................................................... 48 4.3.2 Força Máxima........................................................................................ 49 4.4 Densitometria.................................................................................................. 51 4.4.1. Densitometria Óssea Global................................................................. 51 4.4.2 Densitometria Óssea Área Proximal..................................................... 52 4.5 Análise Histológica......................................................................................... 53 4.5.1.Colágeno tipo I...................................................................................... 54 4.5.2 Colágeno tipo III.................................................................................... 55 4.5.3 Quantificação da microarquitetura do trabeculado ósseo na região proximal da tíbia............................................................................................. 56 4.6 Padrão de imunomarcação............................................................................... 58 4.6.1 OPG....................................................................................................... 59 4.6.2 RANKL................................................................................................. 60 4.6.3 TRAP..................................................................................................... 60 5. DISCUSSÃO......................................................................................................... 62 6. CONCLUSÃO....................................................................................................... 70 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 72 ANEXO...................................................................................................................... 93 INTRODUÇÃO Introdução | 16 1. INTRODUÇÃO 1.1 Tecido Ósseo O tecido ósseo é o principal constituinte do esqueleto, é um tipo especializado de tecido conjuntivo composto por células e material extracelular mineralizado, a matriz óssea. As células que constituem esse tecido são os osteócitos que se localizam em cavidades ou lacunas no interior da matriz, os osteoblastos, produtores de parte orgânica da matriz responsáveis pela aposição óssea; e os osteoclastos, células gigantes, móveis e multinucleadas, que reabsorvem o tecido ósseo, tomando parte dos processos de remodelação dos ossos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). O osso está em constante atividade, não só no esqueleto imaturo, onde o crescimento e desenvolvimento são rapidamente perceptíveis; mas também no esqueleto maduro, com os constantes e equilibrados processos de formação e reabsorção (RESNICK et al., 1995). Nos indivíduos, a arquitetura dos ossos, em sua maioria, é semelhante, sendo composta de osso do tipo trabecular e do tipo cortical (MUNDY, 2000). No trabecular, as trabéculas de tecido ósseo mineralizado se interconectam formando uma rede resistente a cargas mecânicas, e de maneira contínua são remodeladas nas superficies endosteais, os espaços vazios entre estas são preenchidos pela medula óssea (KALFAS, 2001), já para o cortical, a sua forma é compacta circunscrevendo o osso trabecular e ajudando na manutenção da integridade estrutural (UDDO, 2002). O osso cortical é predominate no esqueleto apendicular, com distribuição concêntrica em volta de canais centrais que possuem o sistema harvesiano, sendo constituído por vasos sanguíneos, linfáticos, nervos e tecido conjuntivo (CORONHO et al., 2001). O esqueleto é constituído por 80% de tecido cortical e 20% tecido trabecular (RAMALHO; CASTRO, 1999). O osso trabecular está presente nas vertebras, crânio, pélvis e epífise de ossos longos; já o cortical é predominante à porção medial dos ossos longos (CAMPOS, 2003). O tecido ósseo é multifuncional (DUCY et al., 2000), entre as inúmeras funções temos a manutenção do nível sanguíneo de cálcio, fornecimento de suporte mecânico para tecidos moles e de alavanca para a ação muscular, dando abrigo e proteção para o cérebro e a medula espinhal (HARADA; RODAN, 2003). Introdução | 17 Conforme Raiz (1999) e Bland (2000), o tecido ósseo pode ser influenciado pela dieta, estímulos físicos e fatores genéticos. Os hormônios, fatores de crescimento, citocinas e comunicação celular, são controladores do metabolismo ósseo. 1.2 Remodelação Óssea O processo de remodelação óssea é contínuo (RIGGS, 2000), explicado pela deposição e reabsorção de material na estrutura óssea, em taxas relativamente baixas. Na remodelação, a reabsorção é seguida de formação óssea em ciclos constantes orquestrados pelas células do tecido ósseo. Em situações fisiológicas normais, a reabsorção e a formação são fenômenos acoplados e dependentes, e o predomínio de um sobre o outro pode acarretar ganho ou perda de massa óssea (HANLEY, 2000). A remodelação acontece no osso cortical e no trabecular, sendo mais intensa no trabecular, pela sua disposição e função de trabéculas ósseas (SARAIVA; LAZARETTI-CASTRO, 2002). Há um sistema de comunicações entre as linhagens celulares de osteoclastos e osteoblastos para uma adequada remodelação óssea. A reabsorção de osso velho pelos osteoclastos, seguida de formação de osso novo pelos osteoblastos são processos estreitamente relacionados. (FERNANDES et al., 1996). Os fatores que controlam a reabsorção óssea não estão totalmente elucidados. Acredita-se em que a ativação da reabsorção óssea, é um processo controlado por fatores locais (bioquímicos e físicos) e sistêmicos (hormônio paratireoideo, calcitonina e hormônios sexuais). O desequilíbrio das atividades dos osteoblastos e osteoclastos geram alterações ósseas, levando anormalidades esqueléticas, gerando aumento ou diminuição da massa óssea (KONG et al., 1999). Segundo Aires (2008), até a idade aproximada de 40 anos, a homeostase se mantém; porém, a partir daí, é possível verificar um discreto predomínio de reabsorção sobre a formação óssea, caracterizando um estado osteopênico fisiológico. Nas mulheres esse estado desfavorável é mais intenso, pois ocorre redução dos níveis estrogênio que a pós menopausa gera. O estrogênio controla, nos osteoblastos, a expressão que codifica o colágeno tipo I, a fosfatase alcalina, a osteopontina, osteocalcina e a osteonectina (OKAZAKI et al., 2002). Outra função do estrógeno é aumentar a diferenciação dos osteoblastos e estimular a síntese e Introdução | 18 a mineralização da matriz óssea (TOMKINSON et al., 1998; LIEL et al., 1999; BLAND, 2000), além de estimular a apoptose dos osteoclastos, manter os osteócitos viáveis, ocorrendo na sua deficiência aumento da taxa de apoptose dessas células (TOMKINSON et al., 1997; D’AMELIO et al., 2008). Nas mulheres, após a menopausa ocorre um desquilíbrio entre os processos de reabsorção e remodelação óssea. Os osteoblastos estão ativos; porém, não são capazes de reconstruir completamente as cavidades ósseas reabsovidas pelos osteoclastos, com isso, inicia-se o aumento da perda óssea (NECO, 1994). Acredita-se em que a deficiência do hormônio estrogênio seja o principal risco para osteoporose em mulheres na menopausa, esse tipo de osteoporose é associado à má absorção intestinal de cálcio, redução da síntese de vitamina D ativa e balanço negativo de cálcio graças à redução na secreção de estrogênio (KOBAYASHI et al., 2002; ZHANG et al., 2008). 1.3 Osteopenia e Osteoporose Segundo alguns autores a osteopenia é a diminuição da massa óssea, causada pela retirada de cálcio, podendo ter como consequência a osteoporose (VARGAS et al., 2003; RENA, 2005). A osteoporose e osteopenia, são diferentes estágios de doença do sistema ósseo, caracterizadas por redução da massa óssea e deterioração da estrutura do tecido ósseo, levando a maior fragilidade do osso (OMS). A Organização Mundial da Saúde, usando a relação entre densidade mineral óssea e risco de fratura, propôs a definição de osteoporose: “densidade mineral óssea igual ou menor à 2,5 desvios-padrão da densidade mineral óssea média para mulheres adultas saudáveis”. A osteopenia pode ser diagnosticada quando a densidade mineral óssea entre 1 e 2,5 desviospadrão abaixo da média para mulheres adultas saudáveis. Porém, a utilização de outros indicadores para o monitoramento da osteoporose e da osteopenia é recomendado, além da densidade mineral óssea, como os parâmetros bioquímicos séricos e urinários (OMS). Outra definição para osteoporose utilizada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) é, “doença esquelética sistêmica caracterizada por redução de massa e deterioração microarquitetural do tecido ósseo, como consequência o aumento da fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura.” Introdução | 19 A osteoporose é uma patologia óssea sistêmica que se caracteriza por um desequilíbrio entre reabsorção e formação, tendo como consequência o aumento da fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura (GODDARD; KLEEREKOPER, 1998). Inicialmente a osteoporose é assintomática, as manifestações clínicas aparecem quando a perda é de 30% a 40% do conteúdo mineral, por isso alguns autores definem como “doença traiçoeira”. Considerada uma doença multifatorial, inúmeras variáveis podem causar a evolução do quadro osteoporótico (CARNEIRO, 1996; SZEJNFELD, 1997). Classificam-se a osteoporose em primária, que são as formas senil e pós-menopáusica, consideradas involucionais (FERNANDES et al., 1996); e a secundária, geralmente relacionada a outras doenças ou fatores de origem endócrino-metabólicas, reumatológicas, renais, neoplásicas, uso de medicações e digestivas, que interferem no equilíbrio do cálcio. A incidência menor é na osteoporose secundária, onde alguma doença é determinante; os casos restantes devem-se a variedade involucional ou primária (RIGGS, 1987). É grande a atenção dada a osteoporose da mulher por atingir um terço da população feminina após a menopausa (GAUMET et al., 1996). A osteoporose em mulheres acima de quarenta anos pode ser decorrente da privação hormonal pós-menopausa, juntamente com a diminuição da atividade física praticada nessa faixa etária (SMITH; GILLIGAN, 1989). Após a menopausa, a perda óssea é predominante trabecular, seguindo-se para cortical (BANDEIRA et al., 2000). Nota-se que durante toda sua vida, as mulheres perdem aproximadamente 50% do osso trabecular e 35% do osso cortical obtidos no pico de massa óssea (TURNER; SIBONGA, 2001). Acredita-se em que entre os 40 anos e a menopausa, as mulheres diminuem aproximadamente 0,3% a 0,5% de sua massa de osso cortical por ano, após a menopausa, esse número é de 2% a 3% ao ano (LUCASIN JUNIOR; LIMA, 1994). Barger-Lux e Recker (2002), afirmam que no osso trabecular a atividade metabólica e a superfície óssea são maiores; porém, a perda óssea associada à ocorrência de fraturas não é uma perda desproporcional de osso trabecular, pois sua massa total é apenas de 20%. A densidade mineral óssea na osteoporose chega a ser 30% menos que em mulheres saudáveis, mesmo que a perda seja de 50% da massa óssea trabecular, isso significaria apenas 10% de perda óssea total. Com a redução na secreção de estrogênios, após a menopausa, é possível observar por meio de marcadores químicos, que a formação óssea aumenta nas mulheres 40%, contra um aumento aproximado de 90% na reabsorção. Gaumet-Meunier e colaboradores (2000), Analisaram o papel da deficiência dos esteroides sexuais na gênese da osteoporose humana, Introdução | 20 observou-se que a predisposição genética, sedentarismo, a deficiência de vitamina D e as disfunções tireoidianas constituem fatores de risco para a doença (ROSS, 1996; HEANEY, 1996). Em decorrência do alto número de pessoas acometidas pela osteoporose por várias partes do mundo, essa patologia é considerada um problema de saúde pública (ZERBINI, 1998), gerando impacto na qualidade de vida e na independência dos indivíduos acometidos (FORBACH; SANTOS, 1994). O custo social e familiar em virtude das fraturas osteoporóticas são altos, sendo que o custo econômico que acompanha essas fraturas também é elevado. O número de pessoas afetadas é grande, sendo caro e longo o tratamento a que são submetidas (FERNANDES et al., 1996). 1.4 Modelo experimental de osteopenia em ratas Há décadas, os ratos têm sido utilizados nas pesquisas experimentais avaliando a osteoporose, e contribuições relevantes têm sido alcançadas com seu uso como modelo desde o final da década de 1950 (SZEJNFELD, 2000). Para estudos dos mecanismos reguladores do metabolismo do cálcio, como a osteoporose, o rato é bastante utilizado, por constituir um modelo de estudos que é possível verificar a perda de massa óssea (HODGKINSON, 1979). Kalu (1991), demostrou que em ratas o crescimento até os seis meses de idade é rápido. Verifica-se o aumento contínuo do comprimento, peso, densidade e quantidade de cálcio no fêmur de 1 a 3 meses de idade, após esse período, o crescimento se torna mais gradual. A ovariectomia é uma cirurgia de retirada dos ovários, muito utilizada para induzir os efeitos da menopausa em animais por reduzir a secreção do hormônio estrogênio (BONNET et al., 2007; FUCHS et al., 2007). É um procedimento experimental adotado em grande frequência nos animais pelos efeitos similares aos humanos, demonstrados pela perda de massa óssea encontrada nas mulheres pós-menopáusicas (KALU, 1991; THOMPSON et al., 1995). Autores afirmaram que a ovariectomia resulta em perda óssea tanto nas ratas como nas mulheres, devido as diversas semelhanças entre os mecanismos patofisiológicos. Nas duas espécies a perda óssea acontece mais rapidamente após a deficiência de estrógeno e é caracterizada pelo aumento do turnover ósseo, reabsorção maior que a formação. Em ambas, a perda óssea é maior no tecido trabecular que no cortical, as alterações na microarquitetura Introdução | 21 óssea são similares também, caracterizada por danos à arquitetura do tecido trabecular, gerando perda de minerais. Thompson e seus colaboradores (1995), observaram que após duas semanas de ovariectomia, é possível verificar diminuição significativa do volume do osso trabecular da região proximal da tíbia de ratas devido à perda de trabéculas individuais e afinamento ósseo. Alterações essas que enfraquecem e diminuem a resistência do osso (MATTILA, 1999; WHO, 1998). Nesse procedimento, a retirada dos ovários gera a deficiência do hormônio estrogênio, responsável pelo aumento da atividade osteoblástica (GUYTON, 1991). Da mesma forma com que os hormônios ovarianos, os íons de cálcio (Ca 2+ ) são indispensáveis na homeostase óssea e exercem grande importância no equilíbrio ósseo (QUEIROZ, 1994). Kalu (1991) e Turner (2001), salientam que a perda óssea do rato ovariectomizado deve ser ponderado como uma osteopenia, e não osteoporose. Com a ovariectomia, os ratos apresentam uma perda óssea bifásica, ou seja, a fase inicial de perda maior é até os 100 dias, procedida de um período intermediário de relativa estabilização do osso trabecular em um nível osteopênico, passado 270 dias, uma fase lenta de perda óssea ocorre, com queda da quantidade de osso trabecular (KALU, 1991; EGGERMANN et al., 2005). 1.5 Atividade física Estudos afirmam que a prevenção da osteoporose é o melhor tratamento, já que as condições normais do osso não são recuperadas quando um quadro de osteoporose já está instalado; porém, a prevenção e o diagnóstico precoce da osteoporose são fundamentais para a efetividade do tratamento (DRAKE et al., 2005). O objetivo desse tratamento é que se restaure a massa óssea para que o risco de fratura seja significativamente reduzido (CARVALHO, 2001). Um dos métodos profiláticos mais estudados para analisar ou prevenir a atrofia muscular e perda da massa óssea é o exercício físico (MATHEY et al., 2002; TUKKANEN et al., 1994; VAN DER WIEL et al., 1995). A atividade física regular tem consequências na estrutura do osso, no tamanho, forma e densidade, aumentando assim, a resistência mecânica. Essa melhoria da resistência óssea está ligada a um aumento na formação óssea (BONNET et al., 2007). Introdução | 22 Estudos em humanos (CHIEN et al., 2000; BERGSTRÖM et al., 2008) e em animais (HONDA et al., 2003; HUANG et al., 2008), apresentaram que o exercício aumenta a densidade mineral, massa e força óssea (HART et al., 2001). O aumento da atividade contrátil do sistema musculoesquelético leva adaptações no aparelho locomotor, sendo dependente do tipo de exercício realizado (BOOTH; THOMASON, 1991). Segundo Topp et al., (2002), o aumento da atividade física regular melhora a capacidade funcional de todos os sistemas do corpo; porém, a redução ou a ausência de exercício gera modificações estruturais e distúrbios funcionais (MELLEROWICZ; MELLER, 1979). Autores afirmam que a tensão mecânica imposta pelo exercício é um estímulo para formação óssea e possui função importante para minimizar a perda óssea em mulheres pósmenopausa (BARENGOLTS et al., 1994) e em ratas ovariectomizadas (HONDA et al., 2003). Martin (2007) relata que a remodelação óssea é determinada pela forma com que é requisitada, ou seja, os ossos que sofrem maiores deformações, impacto ou compressão, teriam melhor adaptação, adquirindo maior massa óssea. Diversos tipos de programas de exercícios são investigados em relação aos efeitos no tecido ósseo. Iwamoto e colaboradores (2005), estudaram o exercício aeróbico, a corrida, que apresentou vantagens para densidade minral óssea; outros pesquisadores estudaram os benefícios da natação na massa óssea em animais ovariectomizados, onde houve um aumento da densidade mineral óssea e mudanças histomorfométricas, sugerindo aumento da atividade óssea e melhora das propriedades mecânicas em relação ao gurpo não exercitado (HART et al., 2001; MELTON et al, 2004); Umemura et al., (2008), utilizaram saltos verticais, observando maior densidade mineral óssea nos grupos treinados. O exercício aeróbico, como a corrida na esteira, vem sendo estudado afim de definir melhor os seus efeitos nos ossos (IWAMOTO et al., 1999; IWAMOTO et al., 2005; HUANG et al., 2008; SIMÕES et al., 2008). Na corrida, a formação óssea acontece de forma compensatória pela força mecânica sofrida pelos ossos (NOTOMI et al., 2000). Experimentos apresentam que corrida gera um efeito osteogênico em ratos machos jovens (BOURRIN et al., 1995; HUANG et al., 2008) e fêmeas (HAGIHARA et al., 2005); contudo, segundo Barengolts e seus colaboradores (1993) em ratas ovariectomizadas os efeitos dos exercícios parecem estar diminuídos. Nos estudos de Van der Watiel et al., (1995) animais que realizaram exercícios com alguma sobrecarga, obtiveram ganhos na massa óssea quando comparados com os que correram sem sobrecarga. Introdução | 23 Em contrapartida Peng et al., (1997), relataram que o treinamento em esteira promoveu uma redução da perda óssea trabecular de -51,7% para -32,2% e melhorou a carga máxima de 77,1N para 86,5N em ratas ovariectomizadas quando comparadas com as quais não realizaram exercício. Estudos com ratas ovariectomizadas, utilizando a esteira têm prevenido a perda de peso do fêmur e da tíbia, levando um aumento dos parâmetros de formação óssea, como a taxa de aposição óssea e formação, e diminuíndo a reabsorção (BARENGOLTS et al., 1993; BARENGOLTS et al., 1994). Alguns autores relataram efeitos sistêmicos de atividade física em ratos (OCARINO et al., 2007; SAKAKURA et al., 2001). Ocarino et al., (2007) concluíram que atividade física diária em esteiras sem inclinação, consegue reverter os sinais de osteopenia em todo esqueleto, além de aumentar a quantidade de osso trabecular e cortical nas vértebras, e também, aumentou a espessura dos ossos nasais, ou seja, a atividade física repondo a quantidade de massa óssea, direta ou indiretamente. Sakakura et al., (2001) também demonstraram os efeitos benéficos da atividade física não apenas na tíbia osteopênica de ratos, mas também, mudanças diferenciais no processo condilar de mandíbulas destes animais, propondo haver uma possível ativação osteogênica sistêmica através do exercício físico. Inúmeros estudos são apresentados na literatura buscando correlacionar a osteoporose com mulheres sob deficiência hormonal, dentre esses estudos, destaca-se o de Genaro et al., (2006), onde através de um estudo clínico realizado com 320 mulheres no período pós-menopausa, avaliaram a combinação dos seguintes fatores, exercícios físicos, terapia de reposição hormonal e administração de cálcio. Fazendo-se uma avaliação após 12 semanas, observaram que mulheres submetidas a atividade física e reposição hormonal apresentaram melhores resultados de densidade óssea. Muito discutida na literatura é a duração do exercício, que é importante para prevenir e tratar a osteoporose. Pesquisadores afirmaram que o exercício de intensidade moderada e de tempo não muito prolongado para mulheres pós-menopausa apresentam maiores benefícios em relação aos exercícios de longa duranção como a maratona, que podem levar a uma redução da densidade mineral óssea (HAGIHARA et al., 2005). A prática regular de exercícios físicos influencia a manutenção das atividades normais ósseas, sendo assim vem sendo indicada no tratamento da osteoporose (OCARINO, 2006). Gali (2001), afirma que a atividade física mesmo apresentando o benefício primário que é evitar a perda óssea gerada pela inatividade, que diminui o risco de fraturas, não deve ser recomendada como substituta do tratamento medicamentoso apropriado. Porém, a relação Introdução | 24 entre exercícios físicos e osteoporose tem gerado discussões entre os pesquisadores, buscando melhor conhecimento sobre intensidade, frequência e duração dos exercícios utilizados como método de prevenção e tratamento da osteoporose. Há uma carência em protocolos de atividade física bem definidos, determinando tipo, tempo, frequência e a duração de exercícios específicos, sendo assim a escolha do programa de condicionamento físico para a prevenção e/ou tratamento se torna difícil (NAVEGA et al., 2003). 1.6 Risedronato De acordo com a literatura, terapias farmacológicas para a prevenção e/ou tratamento da osteoporose, representam importantes pontos a serem avaliados no campo da saúde pública, em que a meta principal é impedir a perda adicional de tecido ósseo e diminuir a chance de ocorrer fraturas ósseas. São inúmeras as opções farmacológicas para o tratamento e/ou prevenção da osteoporose como: calcitonina, raloxifeno, fluoride, bisfosfonatos, suplementos de cálcio e vitamina D (IQBAL, 2000). Sambrook e Leong, (1997), afirmam que grande parte das medicações estabelecidas para a osteoporose agem para prevenir a perda óssea adicional, ou seja, apenas um pequeno aumento da densidade óssea é observado. Atualmente, os bisfosfonatos, têm como objetivo inibir a reabsorção óssea. Acrescentando cadeias laterais ao grupo amino ou por meio de substituições cíclicas, especificamente aquelas contendo nitrogênio no anel heterocíclico, como no Risedronato, a atividade antirreabsortiva pode ser melhorada (SZEJNFELD, 2000; CASTRO et al., 2004; NANCOLLAS et al., 2006). A farmocinética dos bisfosfonatos possui propriedades comuns entre si. A absorção intestinal é pequena (<1 a 10%), e é inibida por cálcio ou outros íons bivalentes que capturam o bisfosfonato. Rapidamente são eliminados da circulação (meia-vida de 1 a 2 horas), e a ligação ao mineral ósseo é de 20 a 60 %, o restante é eliminado pela urina (COMPSTON, 1994; SZEJNFELD, 2000; RODAN; RESZKA, 2003). A meia-vida dos bisfosfonatos nos ratos ainda causa discussões e divergências entre alguns autores. Alguns acreditam em que o tempo de permanência dos bisfosfonatos no organismo é duradouro, podendo permanecer dez anos ou mais, dependendo da velocidade da Introdução | 25 remodelação do tecido (SZEJNFELD, 2000; STEPENSKY et al., 2003), outros relatam que a meia vida é de três a doze meses para os bisfosfonatos (KOIVUKANGAS et al., 2003). Os bisfosfonados são frequentemente utilizados no tratamento de inúmeras doenças ósseas, destacando-se entre eles está o risedronato, considerado um dos mais potentes disponíveis no mercado (SZEJNFELD, 2000). O risedronato pertence a terceira geração de bisfosfonatos, é um piridil bisfosfonato com potência mil vezes maior que a do etidronato como agente antirreabsortivo (WOO; ADACHI, 2001), prescrito para prevenção e tratamento da osteoporose pós-menopausa, osteoporose induzida por corticosteróides em homens e mulheres e também da Doença de Paget (RISEDRONATE, 2001). O Ácido Risedrônico (1-hidroxi-2-[3-piridinil] etilideno ácido bisfosfônico) cuja, fórmula molecular é C7H11NO7P2 e de peso molecular 283,11 g/mol, é uma nova geração de bisfosfonato piridinil. É um agente altamente antirreabsortivo, que se liga a hidroxiapatita no osso e inibe a reabsorção óssea mediada por osteoclastos diminuindo a renovação óssea, e a atividade osteoblástica e a mineralização são preservadas (SIESTSEMA et al., 1989; PIAI, 2005). Segundo Mortensen et al., (1995) e Watts et al., (2004), o risedronato apresenta um grande potencial de ação, melhor tolerância em sua administração por via oral e menores efeitos colaterais quando comparados a outras substâncias da mesma classe. Além disso, esse medicamento possui alta afinidade pelo tecido ósseo e alta potência de antirreabsorção, segundo Sietsema e seus colaboradores (1989). 1.7 Medidas de mensuração óssea A Organização Mundial da Saúde, afima que os estudo com animais devem ser avaliados com a realização de análises histomorfométricas do osso e resistência óssea, por meio de ensaios biomecânicos. A análise direta permite quantificação da microarquitetura óssea e, por ser de caráter invasivo, o uso desta técnica em humanos é limitado (MOTILLA, 2004). Para avaliação clínica de agente usados na prevenção ou no tratamento da osteoporose pós-menoupasa, Thompson e colaboradores (1995), afirmam que a utilização de modelos animais específicos é de extrema importância. Ponderando que, estudos realizados reconhecem que não há modelo animal que imite exatamente as condições humanas de osteoporose (THOMPSON et al., 1995; THORNDIKE & TURNER, 1998), os modelos Introdução | 26 experimentais em animais, são essenciais para fornecer informação sobre a qualidade e estrutura óssea que não seria obtida em pacientes de triagem clínica. Os modelos animais de osteoporose são, portanto, agentes imprescindíveis para se obter uma mensuração eficaz e segura da qualidade óssea (THOMPSON et al., 1995). As propriedades mecânicas dos ossos, na osteoporose, podem ser afetadas e o osso se rompe com cargas menores (EINHORN, 1992). Os ossos possuem propriedades plásticas e elásticas. Na primeira, o osso absorve a energia que é imposta sendo reversível, o que significa que a deformação acontece, mas volta a sua forma normal, a elástica acontece quando a carga imposta excede a capacidade, e a deformação se torna permanente (SEEMAN et al., 2008). Os ensaios mecânicos podem ser destrutivos ou não. Os destrutivos há ruptura ou inutilização do material, alguns exemplos são os de compressão, flexão, tração, torção e fadiga (SOUZA, 1974). O ensaio de flexão de 3 pontos em específico é bastante indicado para testar a região com predominância de osso cortical, sendo assim, o comportamento desse tecido é refletido nos resultados (MOSEKILDE, et al., 1998). A OMS considera a densitometria óssea realizada por raio-X de dupla energia padrão ouro para o diagnóstico da osteoporose, sendo assim, o número de densitometrias cresceu consideravelmente (WHO, 1994). A densitometria óssea consite em analisar pacientes com doença metabólica óssea, de verificar a severidade dessa perda óssea, quais são os riscos de fraturas e de um acompanhamento com evolução dos tratamentos (NECO, 1994). Pesquisadores concluíram que o risco de fraturas se relaciona com a medida de densidade mineral óssea, com isso, essa metodologia tem se destacado para aplicação clínica. Porém, a utilização da densidade mineral óssea como instrumento único de avaliação não é suficiente, sendo necessária a aplicação de outros parâmetros como qualidade óssea e propriedades estruturais do osso (DEVAREDDY, 2006). Embora termo “qualidade óssea” seja vago; é empregado para referir caracteristícas do osso que incluem microarquitetura óssea, número e volume de trabéculas, espessura do tecido cortical e composição mineral (HERNANDEZ; KEAVENY, 2006). A matriz colágena influência as propriedades mecânicas do osso pelo grau de mineralização, ou seja, pela quantidade de cristais de hidroxiapatita de cálcio depositada entre as fibras colágenas. A massa do tecido ósseo e sua rigidez são determinantes para resistência óssea. A rigidez é determinada pela fase mineral, e a matriz de colágeno contribui especialmente para aumenta a capacidade do osso e absorver energia sem romper (GUADALUPE-GRAU et al., 2009). Turek (1991) afirma que a alta concentração de Introdução | 27 colágeno da fase orgânica favorece o osso a resistir a tensões de tração, já na fase inorgânica dá a capacidade ao osso a resistir as tensões de compressão. A análise histomorfométrica do osso é imprescindível para estudos ósseos, para analisar a remodelação óssea e avaliar a qualidade óssea em animais submetidos a algum tratamento (WHO, 1998). No estudo quantitativo do esqueleto de pacientes com osteoporose, é importante observar a microarquitetura óssea, que é considerada um fator de risco para fragilidade óssea podendo ser avaliada parcialmente, por meio das medidas da ultrassonometria óssea e indiretamente por marcadores bioquímicos da remodelação óssea (PINHEIRO; SZEJNFELD, 2001). Receptor ativador do fator nuclear kB (RANK), receptor ativador do fator nuclear kappa-B ligante (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) são reguladores importantes dos ostoclastos e no metabolismo ósseo. RANKL interage com seu receptor RANK que se encontra nos osteoclastos, células indiferenciadas e células dendríticas ativando os sinais NFkβ e serina/treonina quinase PKB/Akt que estão ligados com o processo de diferenciação, proliferação e apoptose celular. Segundo Baud’Huin e colaboradores (2007), a razão RANKL/OPG, podem ser utilizados como marcador biológico de prognóstico em patologias ósseas, como oteoporose, espondilite, aquilosante, artite reumatoide, tumores ósseos benignos e fraturas ósseas, podendo também, a razão ser utizada para avaliação de novas drogas contra doenças ósseas e terapia para patologias ósseas. Anormalidades na razão RANKL/OPG têm sido observadas na patogênese da osteoporose pós-menopausa, artrite reumatoide, doença de Paget, doenças periodontal, metastases óssea entre outras (HOFBAUER; HEUFELDER, 2001). Pesquisadores propõem que a concentração de RANKL e OPG no meio ambiente ósseo pode determinar o potencial osteoclástico local (HUANG et al., 2000), visto que a expressão de RANKL e OPG é coordenada para regular a reabsorção e densidade óssea, por controlar o estado de ativação dos osteoclastos (BOYLE; SIMONET; LACEY, 2003; ANANDARAJAH, 2009). Com isso, é de grande importância, que as pesquisas abordando reabsorção óssea devam analisar o sitema RANK-RANKL-OPG (GALLAGHER, 2008), já que essas moléculas são fatores importantes na regulação do metabolismo ósseo (HUANG et al., 2000; CROTTI et al., 2003; TAY et al., 2004; ANANDARAJAH, 2009). OBJETIVO Objetivo | 29 2. OBJETIVO 2.1 Objetivo Primário O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos do exercício físico (Corrida) associado ou não ao medicamento risedronato como meio profilático e/ou terapêutico em ossos osteopênicos de ratas submetidas à ovariectomia. 2.2 Objetivo Secundário Avaliar os efeitos da ovariectomia no ganho de peso de ratas. Avaliar a densidade mineral, propriedades mecânicas, colágeno tipo I e tipo III e microarquitetura óssea dos animais experimentais. Avaliar os marcadores imunoistoquímicos (RANKL, OPG e TRAP). MATERIAIS E MÉTODOS Materiais e Métodos | 31 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Animais experimentais Este projeto foi elaborado de acordo com o "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1996), e foi aprovado pela Comissão de Ética em pesquisa com animais da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, protocolo 099/2011. Foram utilizadas 48 ratas da raça Rattus norvegicus albinus, variedade Wistar, com massa corpórea de 150 a 180 gramas, que corresponde à fase jovem. Os animais foram adquiridos junto ao Biotério Central da Coordenadoria do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e alojados no Biotério do Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP com período de antecedência à cirurgia para que ocorra adaptação ao meio. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas com ciclos de dia / noite de 12 / 12 horas, com umidade controlada, recebendo água e alimentação padrão. A temperatura foi controlada (21 1 C). Os animais foram pesados individualmente todas as semanas do experimento em balança eletrônica. Ao final do experimento, as ratas foram submetidas à eutanásia através de uma dose excessiva (2 ml para cada 100g do animal) de anestésico Hidrato de Cloral, em seguida, as tíbias foram retiradas, limpas das partes moles. 3.2 Procedimento experimental 3.2.1 Técnica Cirúrgica Os animais foram submetidos à cirurgia após um período de adaptação. Materiais e Métodos | 32 3.2.1.1 Ovariectomia A técnica cirúrgica aplicada nesse estudo seguiu a metodologia de Zarrow, Yochim e MacCarthy, (1964). Foi realizada tricotomia na região ventral entre a reborda costal inferior e o início da pelve (Figura 1). Em seguida, realizada antissepsia dessa região com gaze embebida em polivinil-pirrolidona-iodo. Após esses procedimentos, foi realizada uma incisão reta transversal, de aproximadamente 1 cm de comprimento da pele e tecido celular subcutâneo, a cerca de 1 cm da linha mediana (borda medial da incisão) com auxílio de pinça e tesoura pontiaguda (Figura 2). A parede muscular foi divulsionada até que se tivesse acesso à cavidade abdominal, localizando o ovário em meio a uma massa gordurosa e, em seguida, foi realizada a evisceração do corno uterino. A extração dos ovários foram realizadas posteriormente à ligadura da extremidade da tuba uterina, seccionando entre a ligadura e o ovário (Figura 3 e 4). Foi suturada a parede muscular e, em seguida, a pele (Figura 5 e 6). Todo o procedimento foi repetido do lado oposto ao primeiro para a retirada dos dois ovários (SIMÕES, 2008). Após a cirurgia, os animais receberam injeção de antibiótico (40 000 U/kg Penicilina G Procaína IM) (Tezini, 2008). Materiais e Métodos | 33 Figura 1. Tricotomia na região ventral. Figura 2. Incisão reta transversal. Figura 3. Localização do Ovário. Figura 4. Retirada do Ovário. Figura 5. Sutura. Figura 6. Animal Ovariectomizado. Após 72 horas da cirurgia foi iniciado o exercício físico (grupos OVXC e OVXCM) e administração do medicamento (grupos OVXM e OVXCM), para que estes iniciassem antes da instalação da osteopenia decorrente da ovariectomia, que segundo alguns autores os sinais da osteopenia se manifestam em um período de 30 a 60 dias após a ovariectomia (KALU, 1991; TOMKINSON et al., 1998; TEZINI, 2008; SIMÕES, 2008). Materiais e Métodos | 34 3.2.1.2 Sham O procedimento cirúrgico sham consistiu na tricotomia na região ventral entre a reborda costal inferior e o início da pelve, seguida de antissepsia dessa região com gaze embebida em polivinil-pirrolidona-iodo. Após esses procedimentos, foi realizada uma incisão reta transversal, de aproximadamente 1 cm de comprimento da pele e tecido celular subcutâneo, a cerca de 1 cm da linha mediana, com auxílio de pinça e tesoura pontiaguda. A parede muscular foi divulsionada até que se tivesse acesso à cavidade abdominal, localizando o ovário em meio a uma massa gordurosa, após a localização do ovário este foi exposto e depois reinserido no interior da cavidade abdominal e as camadas musculares e cutâneas foram suturadas isoladamente. Obedecendo ao mesmo padrão utilizado nos animais ovariectomizados, o exercício físico (grupos SHAMC e SHAMCM) e administração do medicamento (grupos SHAMM e SHAMCM) iniciaram 72 horas após a cirurgia. 3.3 Grupos experimentais Os animais foram divididos em oito grupos experimentais, sendo seis animais por grupo (FIGURA 7), as caldas foram identificadas individualmente, com marcador permanente, por algarismos romanos. Materiais e Métodos | 35 SHAMCMSubmetidos à cirurgia simulada de Ovariectmia, e as 12 semanas seguintes administrado Risedronato, associado com o treinamento físico na esteira, em seguida eutanasiados. OVX- Submetidos à Ovariectomia, sedentário por 12 semanas, em seguida eutanasiados. SHAMM- Submetidos à cirurgia simulada de ovariectomia e as 12 semanas seguintes, administrado Risedronato, em seguida eutanasiados. SHAMC- Submetidos à cirurgia simulada de Ovariectomia, seguido de treinamento físico na esteira durante 12 semanas, em seguida eutanasiados. OVXC- Submetidos à Ovariectomia, seguido de treinamento físico na esteira durante 12 semanas, em seguida eutanasiados. OVXM- Submetidos à Ovariectomia, e as 12 semanas seguintes, administrado Risedronato, em seguida eutanasiados. 48 Ratos 150 a 180 gramas SHAM- Submetidos à cirurgia simulada, sedentários por 12 semanas, em seguida eutanasiados. OVXCM- Submetidos à Ovariectomia, e as 12 semanas seguintes administrado Risedronato, associado com o treinamento físico na esteira, em seguida eutanasiados. Figura 7. Distribuição dos Grupos Experimentais. 3.4 Técnica de Treinamento Físico O treinamento foi realizado em esteira motorizada Insight (Modelo EP – 131), para ratos, composta por seis baias individuais com a 15 cm, largura interna de 10 cm e comprimento de 50 cm. Painel de controle com regulador de velocidade, chave liga-desliga, mostrador digital para o tempo e a distância percorrida, botões para reiniciar o relógio e odômetro (contador de distância). O exercício foi realizado sem inclinação da esteira. Materiais e Métodos | 36 Figura 8: Esteira motorizada Insight (Modelo EP – 131). O protocolo de treinamento físico foi baseado no estudo de Simões et al., (2008), inicialmente de 10 minutos evoluindo gradativamente até 60 minutos por dia, cinco dias por semana durante 12 semanas (com velocidade de 15m/min nas seis primeiras semanas e 18 m/min, nas demais semanas). A tabela 1 descreve o treinamento físico proposto: Tabela 1. Protocolo de Treinamento Físico em Esteira. Semanas de Treinamento 1 2 Velocidade m/min 15 15 10 20 10 20 10 20 15 30 15 30 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 15 15 15 15 18 18 18 18 18 18 40 60 60 60 60 60 60 60 60 60 40 60 60 60 60 60 60 60 60 60 50 60 60 60 60 60 60 60 60 60 50 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 Duração das sessões (minutos) Materiais e Métodos | 37 3.5 Administração do Risedronato O medicamento risedronato de sódio (Actonel 150mg - Norwich Pharmaceuticals Inc., Norwich, Estados Unidos) foi administrado nos grupos OVXM, OVXCM, SHAMM e SHAMCM. A massa inicial do comprimido de risedronato de sódio foi pesada em balança de precisão (Marte AM- 220) (273 mg). Este foi triturado em cuba de maceração de cerâmica. 91 gramas do comprimido macerado foi pesado em um Becker (100 mL) e neste foi adicionado 50 mL de água destilada com auxílio de uma barra magnética, em um agitador até que o risedronato fosse totalmente solubilizado, obtendo um solução com 1mg/mL de risedronato sódico (Figura 9). Figura 9. Metodologia de preparo do medicamento. Foram administradas quatro doses no total, sendo uma dose por mês (30mg/kg/mês de risedronato de sódio). A administração do medicamento foi realizada na água de beber dos ratos (PIAI, 2005). Para determinar a quantidade de água a ser colocada junto com o medicamento, antes de administrar a primeira dose, foi realizado a quantificação de água ingerida por rato durante 24 horas; determinando assim, a quantidade aproximada de consumo de 12,5 mL/dia. Com isso, a diluição do medicamento na água de beber dos ratos foi realizada conforme a necessidade diária. Assim, de acordo com o peso de cada animal, eram diluídos x mL da solução de risedronato a 1mg/mL em 12,5 mL de água filtrada, para cada animal presente na gaiola. A primeira administração do medicamento foi realizada 72 horas após a cirurgia. Materiais e Métodos | 38 Na noite anterior a administração, a comida foi retirada, para que os animais recebessem o medicamento em jejum. Semanalmente, os animais foram pesados em balança eletrônica para controle do peso corporal e mensalmente os ratos eram realocados nas caixas, onde os ratos com pesos mais aproximados eram colocados juntos, com isso a dose do risedronato era ajustada conforme o peso mensalmente. Os grupos onde o risedronato não foi administrado, foram submetidos ao mesmos protocolos dos grupos risedronato, retirada de comida, pesagens semanais e realocação dos animais pelo peso. 3.6 Peso Corpóreo Foi realizada avaliação do ganho de peso semanal de cada animal. Para isso, os animais foram pesados no dia da realização do procedimento cirúrgico, e, posteriormente, semanalmente até a eutanásia. 3.7 Análise da estrutura óssea Escolhemos aleatoriamente o lado esquerdo para histologia e o direito para densitometria e ensaio mecânico, já que de acordo com Battraw et al., (1996), os pares de tíbia apresentam geometria e comportamento semelhante quando comparados aos seus lados. 3.8 Densidade mineral óssea As tíbias direitas foram limpas das partes moles e identificadas individualmente, em seguida foram envoltas em gaze embebida em solução fisiológica e armazenados em recipientes identificados (grupo e animal) e conservadas a -20°C. Antes da realização da densitometria, as tíbias foram submetidas a protocolo de descongelamento, permanecendo em geladeira por 12h, e depois levado a avaliação densitométrica em temperatura ambiente. Materiais e Métodos | 39 Durante a densitometria a tíbia foi posicionada no centro de forma padronizada em caixa acrílica (10 X 7 x 5 cm), depositado aproximadamente 2 cm de profundidade de água para submergir o osso, desta maneira a água representa partes moles (músculos, tendões). Neste caso, utilizado para aumentar a resolução das imagens, assim como melhorar o contorno ósseo (Figura 10) (FALCAI, 2011). Figura 10. Foto do posicionamento do osso para o exame de densitometria. O exame densitométrico foi realizado em um aparelho de densitometria por raio X (Hologic, Discovery Wi®, Estados Unidos) do Laboratório de Endocrinologia e Ciências de Imagens e Física Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, com os ossos (tíbia) separados das partes moles e posicionados dentro da caixa acrílica. O protocolo utilizado foi específico para pequenos animais, foi utilizada alta resolução (Subregion Hi-Resolution) o programa reconheceu o contorno dos ossos para densidade mineral óssea global e também foi avaliada a densidade mineral óssea da área proximal da tibia (R1) (Figura 11). Os resultados foram expressos em g/cm2. Materiais e Métodos | 40 Figura 11. Densitometria e a área de varredura da tíbia 3.9 Análise mecânica Após a análise densitométrica, utilizou-se os mesmos ossos para avaliar mecanicamente na máquina universal de ensaio (EMIC® - 10000N), do Laboratório de Bioengenharia da FMRP – USP, segundo protocolos previamente utilizados (ABRAHÃO et al., 2006; SIMÕES et al., 2008). Os ensaios das tíbias foram de flexão de três pontos, com distância entre os apoios de 20 mm e 15 mm, respectivamente. Foi utilizada célula de carga de 500 N e velocidade de aplicação de carga de 1 mm/min. Foram obtidos os valores de força máxima (N) e rigidez (N/mm). Materiais e Métodos | 41 Figura 12. Tíbia posicionada na Máquina Universal de ensaio (EMIC® - 10000N). 3.10 Histologia 3.10.1 Processamento Histológico As tíbias do lado direito foram submetidos à análise histológica qualitativa, quantitativa e imunoistoquímica. Esses ossos foram imersos em formol 10% por 24 horas. Em seguida, os espécimes foram descalcificados em EDTA a 0,5M, trocando-se as soluções a cada 2 dias. Após o período de descalcificação, cerca de 30 dias, a ação do ácido foi neutralizada por 24 horas em uma solução de sulfato de sódio a 5%. Em seguida, foram desidratados em série crescente de álcoois: 70% (overnight), 80%, 85%, 90%, 95% e 100% (1 horas em cada concentração). Feito isso, esses blocos ósseos foram colocados em partes iguais de álcool e xilol (overnight) e diafanizados em xilol, com trocas a cada 1 horas, sendo executadas 3 trocas; e em seguida, incluídos em parafina. Materiais e Métodos | 42 3.10.2 Análise Microscópica Para análise microscópica, nas amostras incluídas em parafinas foram realizados cortes seriados de 5µm de espessura, no plano frontal, em micrótomo Leica RM 2165 (Alemanha). 3.10.2.1 Quantificação das fibras colágenas tipo I e III Foi realizada a análise histológica quantitativa das fibras colágenas na região da cabeça da tíbia, sendo que para cada animal foram feitos 50 cortes histológicos por bloco por bloco. As lâminas foram coradas com a coloração de Picrosirius red que permite verificar as fibras colágenas do tipo I e III através da birrefringência das fibras no microscópio com luz polarizada, que capta as fibras colágenas do tipo I com cor vermelha ou alaranjada, e as fibras do tipo III na cor verde ou amarela (PEREIRA et al., 1998; ARANHA 2009). Foi realizada a densitometria óptica das fibras colágenas tipo I e III através do programa Axionvision que capta diferentes tonalidades de vermelho e verde e quantifica a somatória das áreas em pixel2 referentes a diferentes fibras sobre a luz polarizada. 3.10.2.2 Quantificação de trabeculado ósseo Foi realizada a análise histológica quantitativa do tecido ósseo trabeculado na região da cabeça da tíbia, sendo que para cada animal foram feitos 50 cortes histológicos por bloco de modo a captar na lâmina histológica a estrutura do osso por completo. Após as colorações específicas, digitalizou-se 12 imagens, tendo portanto um total de 72 imagens por grupo. Após coloração, a análise quantitativa das áreas do osso trabeculado foi realizada através do programa Axionvision (Zeiss, Germany) que capta a imagem reconhecendo a tonalidade azul escuro (coloração do osso espojoso) e quantifica a área em pixel2. Materiais e Métodos | 43 3.11 Técnica imunoistoquímica Os cortes histológicos foram desparafinizados em xilol e hidratados em série decrescente de etanol (100°- 100°- 100°- 90°- 70° GL). A recuperação antigênica foi realizada através da imersão das lâminas histológicas em solução tampão (Diva Decloaker®, Biocare Medical, CA, USA), em câmara pressurizada (Decloaking Chamber®, Biocare Medical, CA, USA), a 95°C, por 10 minutos. Ao término de cada uma das etapas da reação imunoistoquímica as lâminas contendo os cortes histológicos foram submetidas a três lavagens em tampão fosfato salino (PBS) 0,1M, pH 7,4. Os cortes histológicos foram imersos em 3% de peróxido de hidrogênio por 1 hora e, na sequência, em 3% de soro albumina bovino por 12 horas, para o bloqueio da peroxidase endógena e bloqueio dos sítios inespecíficos, respectivamente. Lâminas histológicas contendo amostras de todos os grupos experimentais foram divididas em três lotes, e cada lote foi submetido à incubação com um dos seguintes anticorpos primários: anti-OPG do rato gerado em coelho (1:150; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); anti-RANKL do rato gerado em cabra (1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) e; anti-TRAP do rato gerado em coelho (1:100; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Os anticorpos primários foram diluídos em PBS acrescido de 0,1% Triton X-100 (PBS-TX), durante 24 horas, em câmara úmida. As secções histológicas foram incubadas no anticorpo secundário biotinilado por 2 horas e, na sequência, tratadas com estreptavidina conjugada com a peroxidase da raiz forte (hemo-enzima extraída da Amoracia Rusticana) (HRP) por 1 hora (Universal Dako Labeled (HRP) Streptavidin-Biotin Kit®, Dako Laboratories, CA, USA). Procedeu-se a revelação utilizando-se como cromógeno o 3,3’- tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB chromogen Kit®, Dako Laboratories, CA, USA) e posteriormente contracoloração com Hematoxilina de Harris. Como controle negativo, amostras foram submetidas aos procedimentos descritos anteriormente suprimindo-se a utilização dos anticorpos primários. 3.11.1 Análise do padrão de imunomarcação das amostras submetidas à imunoperoxidase Os cortes histológicos foram analisados sob iluminação de campo claro em microscópio óptico (Optiphot-2, Nikon, Japão) por um investigador que desconhecia os grupos experimentais que estavam sendo analisados. A imunomarcação foi definida como Materiais e Métodos | 44 aquela de coloração acastanhada presente no compartimento citossólico das células. Em cada espécime foram analisadas seis áreas (cada uma com 300µm x 400µm de dimensão), sendo elas: uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro da epífise proximal, uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro da metáfise proximal, duas áreas de tecido ósseo compacto situadas no centro da diáfise, uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro da epífise distal, uma área de tecido ósseo esponjoso situada no centro da metáfise distal. As seis áreas constituíram o campo microscópico de análise. Os critérios para o estabelecimento da imunomarcação foram modificado de Kim et al., (2007). Para a OPG e RANKL foram empregados os seguintes escores: (3) alto padrão de imunomarcação ( 3/4 das células imunorreativas (IR) no campo microscópico), (2) moderado padrão de imunomarcação ( 1/2 das células-IR no campo microscópico), (1) baixo padrão de imunomarcação ( 1/4 das células-IR no campo microscópico) e (0) padrão de imunomarcação nulo (ausência total de células-IR no campo microscópico). Para TRAP foram empregados os seguintes escores: (3) alto padrão de imunomarcação (mais de 15 células imunorreativas (IR) no campo microscópico), (2) moderado padrão de imunomarcação (5 e 10 células-IR no campo microscópico), (1) baixo padrão de imunomarcação (menos de 5 células-IR no campo microscópico) e (0) padrão de imunomarcação nulo (ausência total de células-IR por campo microscópico). Foram quantificadas apenas as células TRAP-positivas com três ou mais núcleos. Os dados para cada animal, e consequentemente para cada grupo experimental, foram estabelecidos como um padrão de imunomarcação (alto, médio, baixo ou ausência de imunomarcação). Esse padrão de imunomarcação foi comparado entre os grupos experimentais. 3.12 Análise Estatística Os resultados foram submetidos ao teste de normalidade para verificar se o comportamento dos dados foi ou não paramétrico. Como o tamanho da amostra foi inferior a 10, utilizou-se o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (ANOVA não paramétrica). Quando houve diferença significativa utilizou-se o teste post hoc de Dunn para especificar as diferenças. Em todas as análises foi adotado o nível de significância de 5% (p 0,05). RESULTADOS Resultados | 46 4. RESULTADOS 4.1 Avaliação Clínica Todos os grupos experimentais completaram o período proposto sem intercorrências. 4.2 Peso corpóreo Para os animais submetidos a cirurgia simulada (SHAMs), aplicação da análise de regressão pelo método dos mínimos quadrados com objetivo de estimar-se um modelo para a relação peso x semana; foi possível obter a equação que descreve o comportamento do peso em relação as semanas de experimento, sendo: Psham: 186,40+16,60 x s (1); onde P= peso do animal e S= semana do experimento. O ajuste da reta ao comportamento do peso é altamente significativo (p<0,001) com R2=0,70, ou seja 70% da variaçãoo do peso é decorrente do tempo (semanas), sendo o intervalo de confiança (95%) para o coeficiente angular da reta (15,38 – 17,81). Não operados: 500 Peso 400 300 200 100 0 2 4 6 8 10 12 14 Semana Grafico 1. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos SHAMs, obtenção da reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento. Resultados | 47 Para os animais ovariectomizados, aplicação da análise de regressão pelo método dos mínimos quadrados com objetivo de estimar-se um modelo para a relação peso x semana; foi possível obter a equação que descreve o comportamento do peso em relação as semanas de experimento, sendo: Povx: 177,8 + 23,74 x s (2); onde P= peso do animal e S= semana do experimento. O ajuste da reta ao comportamento do peso é altamente significativo (p<0,001), com R2=0,76, ou seja, 76% da variação do peso é decorrente do tempo (semanas), sendo o intervalo de confiança (95%) para o coeficiente angular da reta (22,27 – 25,12). Operados: 600 500 Peso 400 300 200 100 0 2 4 6 8 10 12 14 Semana Grafico 2. Relação peso (g) x tempo (semanas) dos grupos OVXs, obtenção da reta estimada do comportamento do peso em relação a semana de experimento. Ao comparar o intervalo de confiança obtidos para os grupos SHAMs e OVXs, constatou-se que não há sobreposição destes e assim, pode-se inferir que a taxa de ganho de peso dos operados é superior a dos não operados. 4.3 Ensaio Mecânico No ensaio mecânico de flexão de três pontos, realizado na tíbia, foram analisadas rigidez e força máxima. Resultados | 48 4.3.1 Rigidez Em relação aos valores da rigidez, após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p=0,012), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, em que os valores da rigidez obtidos com o ensaio mecânico da tíbia, o grupo SHAMM apresentou valores significativamente inferiores ao grupo OVXM (p=0,001). Os outros grupos não apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 3) e na tabela (Tabela 2) os valores obtidos na rigidez (N/mm). Gráfico 3. Análise da Rigidez (N/mm) para os diferentes grupos experimentais. Resultados | 49 Tabela 2. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da Rigidez (N/mm), pela análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Rigidez ((N/mm) Desvio Grupos Média Mediana Mínima Máxima Padrão SHAM α Σ 142,29 139,22 17,39 123,90 171,89 SHAMC α Σ 132,53 128,19 21,20 108,90 164,73 SHAMM α 122,53 123,10 6,79 111,98 132,83 SHAMCM α Σ 146,01 132,88 25,27 126,06 181,59 OVX α Σ 129,80 127,26 15,36 111,05 150,62 OVXC α Σ 145,20 149,43 23,84 111,56 174,53 OVXM Σ 170,40 171,45 11,35 152,01 183,81 OVXCM α Σ 154,46 162,30 22,75 119,53 174,26 α Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p=0,001). 4.3.2 Força Máxima Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p=0,002), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, em que os valores da força máxima obtidos com o ensaio mecânico da tíbia, o grupo SHAMM teve valores inferiores significativamente aos grupos OVXM e OVXCM (p=0,002). Os outros grupos não apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 4) e na tabela (Tabela 3) os valores da força máxima (N). Resultados | 50 Gráfico 4. Análise da Força Máxima (N) para os diferentes grupos experimentais. Tabela 3. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima da Força Máxima (N), pela análise realizada nas tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Força Máxima Grupos Média Mediana SHAM α Σ 76,35 76,50 Desvio Padrão 7,05 SHAMC α Σ 76,36 75,09 SHAMM α 69,62 SHAMCM α Σ Mínima Máxima 68,87 84,85 8,37 67,53 89,14 69,28 4,32 64,70 74,51 80,96 79,40 9,69 66,86 93,58 OVX α Σ 76,16 76,33 7,81 67,95 87,04 OVXC α Σ 85,97 85,62 3,83 80,22 92,07 OVXM Σ 92,73 92,56 6,96 84,07 100,92 OVXCM Σ 90,37 93,22 13,14 73,99 108,19 α Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p=0,002). Resultados | 51 4.4 Densitometria 4.4.1. Densitometria Óssea Global Com análise de kruskal-Wallis não foi observado diferença entre os grupos (p=0,381). Descritos no gráfico (Gráfico 5) e na tabela (Tabela 4) os valores obtidos da densidade em g/cm2, da tíbia de todos os grupos experimentais. Gráfico 5. Análise da Densitometria total (g/cm2) para os diferentes grupos experimentais. Resultados | 52 Tabela 4. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima da densidade óssea (g/cm2), pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Densitometria Total (g/cm2) Grupos SHAM SHAMC SHAMM SHAMCM OVX OVXC OVXM OVXCM Média Mediana 0,19 0,20 0,20 0,20 0,20 0,19 0,20 0,19 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,19 0,20 0,19 Desvio Padrão 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 Mínima Máxima 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,17 0,19 0,18 0,20 0,21 0,22 0,23 0,21 0,19 0,21 0,21 4.4.2 Densitometria Óssea Área Proximal Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p<0,000), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, onde nas análises dos resultados da densitometria óssea proximal da tíbia, encontrou-se valores diferentes da global. Houve diferença estatística, o grupo OVX tendo valores inferiores aos grupos SHAMM, SHAMCM (p<0,001). O gráfico (Gráfico 6) e a tabela (Tabela 5) descrevem os valores obtidos da densidade da área proximal da tíbia em g/cm2, de todos os grupos experimentais. Resultados | 53 Gráfico 6. Análise da Densitometria proximal (g/cm2) para os diferentes grupos experimentais. Tabela 5. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima, da densidade óssea da área proximal (g/cm2) pela análise realizada nas tíbias avaliados nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Grupos SHAM α Σ SHAMC α Σ SHAMM Σ SHAMCM Σ OVX α OVXC α Σ OVXM α Σ OVXCM α Σ Densitometria Proximal (g/cm2) Desvio Média Mediana Padrão 0,24 0,24 0,01 0,24 0,24 0,01 0,25 0,25 0,02 0,25 0,25 0,02 0,19 0,19 0,01 0,21 0,21 0,01 0,22 0,23 0,01 0,21 0,22 0,02 Mínima 0,22 0,22 0,22 0,22 0,18 0,19 0,21 0,17 Máxima 0,25 0,25 0,28 0,27 0,22 0,22 0,23 0,24 α, Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p<0,001). 4.5 Análise Histológica Para a quantificação das fibras colágenas tipo I e III analisadas em luz polarizada, na região proximal da tíbia, foram encontrados os seguintes resultados: Resultados | 54 4.5.1.Colágeno tipo I Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p=0,001), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, em que os valores na quantificação de colágeno tipo I, o grupo SHAMM teve valores inferiores significativamente aos grupos OVX e OVXCM (p=0,001). Os outros grupos não apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 7) e na tabela (Tabela 6) os valores do colágeno tipo I (μm2) da tíbia de todos os grupos experimentais. Gráfico 7. Análise do colágeno tipo I (μm2), para os diferentes grupos experimentais. Resultados | 55 Tabela 6. Valores de média, mediana, desvio padrão, mínima e máxima do colágeno tipo I (μm2), α pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Colágeno Tipo I Grupos Média SHAM α Σ SHAMC α Σ SHAMM α SHAMCM α Σ OVX Σ OVXC α Σ OVXM α Σ OVXCM Σ 3485 4327 0 2260464 128032 21275 324814 112231 Mediana 3461 4589 0 9430 44058 12464 0 58714 Desvio Padrão 918 3396 0 5296894 196286 29649 533961 147780 Mínima Máxima 2232 670 0 1344 28295 2637 0 3261 4702 8006 0 13065947 525185 80880 1256862 392979 α, Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p=0,001). 4.5.2 Colágeno tipo III Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p<0,000), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, onde os valores da quantificação de colágeno tipo III, o grupo OVX teve valores inferiores significativamente aos grupos SHAMC e SHAMCM (p<0,001). Os outros grupos não apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si (p>0,05). Descritos no gráfico (Gráfico 8) e na tabela (Tabela 7) os valores do colágeno tipo III (μm2) da tíbia de todos os grupos experimentais. Resultados | 56 Gráfico 8. Análise do colágeno tipo III (μm2) para os diferentes grupos experimentais. Tabela 7. Valores da média, mediana, desvio padrão, mínimo, máximo do colágeno tipo III (μm2), pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais:, SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Colágeno Tipo III Desvio Grupos Média Mediana Mínima Máxima Padrão SHAM α Σ 1627974 1521431 1370977 139969 3183059 SHAMC Σ 5581075 3805434 4193798 2949933 13913829 SHAMM α Σ 1977632 2172150 1131350 20591 3225864 SHAMCM Σ 5721329 5736397 1283521 4046644 7480982 OVX α 243709 202426 112979 147777 459726 OVXC α Σ 1997874 814574 3193980 211737 8495441 OVXM α Σ 1569412 1191799 35972179 502617 8911734 OVXCM α Σ 1817651 1769806 584231 1012499 2689578 α, Σ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p<0,001). 4.5.3 Quantificação da microarquitetura do trabeculado ósseo na região proximal da tíbia Resultados | 57 Após análise de kruskal-Wallis foi observado diferença entre os grupos (p<0,000), assim foi realizado teste post hoc de Dunn, onde os valores obtidos com a quantificação de trabeculado ósseo foi que, o grupo OVX teve valores inferiores significativamente aos grupos SHAMC, OVXM, OVXCM e SHAMCM e os grupos OVXCM e SHAMCM tendo valores superiores a OVXC, SHAM E SHAMM (p<0,001). Descritos no gráfico (Gráfico 8) e na tabela (Tabela 7) os valores da quantificação de trabeculado ósseo (μm2) da tíbia de todos os grupos experimentais. Gráfico 9. Análise da quantificação do trabeculado ósseo (μm2) para os diferentes grupos experimentais. Tabela 8. Valores da média, mediana, desvio padrão, mínima, máxima, da quantificação do trabeculado ósseo (μm2), pela análise realizada nas partes proximais das tíbias avaliadas nos grupos experimentais: SHAM, SHAMC, SHAMM, SHAMCM, OVX, OVXC, OVXM, OVXCM. Quantificação de Trabeculado Desvio Grupos Média Mediana Mínima Máxima Padrão SHAM α Σ 2927869 2879457 413725 2415929 3572918 SHAMC Σ Ψ 4187027 4117012 1137359 2814281 5660927 SHAMM α Σ 2883769 2860683 695807 2094341 3877263 SHAMCM Ψ 5010750 5115909 434078 4236362 5430177 OVX α 2089400 2202432 655652 1063527 2751645 OVXC α Σ 3500474 3481697 326891 3129075 3876625 Resultados | 58 OVXM Σ Ψ 4213986 4238707 912047 2862176 5415415 OVXCM Ψ 5334633 5273666 91846955 4050098 6709022 α,Σ,Ψ símbolos diferentes representam diferenças estatísticas (p<0,001). Figura 13. Fotomicrografias evidenciando o aspecto histológico das trabéculas ósseas nos grupos SHAM (A), OVX (B), SHAMC (C), OVXC (D), SHAMM (E), OVXM (F), SHAMCM (G), OVXCM (H). Coloração: H&E. 4.6 Padrão de imunomarcação A técnica de imunoistoquímica empregada para a detecção de OPG, RANKL e TRAP mostrou alta especificidade na detecção de tais proteínas, a qual foi comprovada pela ausência total de marcação no controle negativo da reação imunoistoquímica. As Resultados | 59 imunomarcações se apresentaram com uma coloração acastanhada confinada ao compartimento citossólico. A imunomarcação para OPG e RANKL foi expressa em osteoblastos e para TRAP foi expressa em osteoclastos (Figura 14). Figura 14. Padrão de imunomarcação de TRAP, RANKL e OPG. A: Fotomicrografia evidenciando um osteoclasto TRAP positivo (seta preta). B: Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto RANKL positivo (seta azul). C: Fotomicrografia evidenciando um osteoblasto OPG positivo (seta vermelha). Abreviações e símbolos: bt, trabécula óssea. 4.6.1 OPG A imunomarcação para OPG (Gráfico 10) foi maior no Grupo SHAMCM. Nos grupos SHAMs prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: moderado em SHAM, moderado em SHAMC, de moderado a alto em SHAMM e, predominantemente alto em SHAMCM. Nos grupos OVX prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: de baixo a moderado em OVX, de baixo a moderado em OVXC, moderado em OVX moderado em OVXCM. Resultados | 60 4 3 2 1 0 SHAM SHAMC SHAMM SHAMCM OVX OVXC OVXM OVXCM Gráfico 10. Mediana dos valores da Imunomarcação para OPG. 4.6.2 RANKL A imunomarcação para RANKL (Gráfico 11) foi maior no grupo OVX. Nos grupos SHAMs prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: moderado em SHAM, moderado em SHAMC, baixo em SHAMM e, baixo em SHAMCM. Nos grupos OVX prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: alto em OVX, de alto a moderado em OVXC, de baixo a moderado em OVXM e, baixo em OVXCM. 4 3 2 1 0 SHAM SHAMC SHAMM SHAMCM OVX OVXC OVXM Gráfico 11. Mediana dos valores da Imunomarcação para RANKL. OVXCM Resultados | 61 4.6.3 TRAP A imunomarcação para TRAP (Gráfico 12) foi maior no Grupo OVX. Nos grupos SHAMs prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: moderado em SHAM, moderado em SHAMC, baixo em SHAMM e, baixo em SHAMCM. Nos grupos OVX prevaleceram os seguintes padrões de imunomarcação: alto em OVX, moderado em OVXC, baixo em OVXM e, baixo em OVXCM. Nos grupos tratados com ácido risedrônico (SHAMM, SHAMCM, OVXM e OVXCM) a presença de osteoclastos arredondados, não acoplados a lacunas de reabsorção e distantes da matriz óssea foi muito comum. 4 3 2 1 0 SHAM SHAMC SHAMM SHAMCM OVX OVXC Gráfico 12. Mediana dos valores da Imunomarcação TRAP. OVXM OVXCM DISCUSSÃO Discussão | 63 5. DISCUSSÃO Neste estudo utilizou-se o modelo experimental de indução à osteopenia através da ovariectomia em ratos Wistar, objetivando avaliar a prevenção e/ou tratamento, com associação de exercícios físicos e o medicamento Risedronato. Segundo Jerome e seus colaboradores (1999), com aumento da expectativa de vida, as doenças crônico-degenerativas, salientam-se como fator limitante de qualidade de vida, entre elas a osteoporose com sua alta frequência se destaca. A literatura aponta que a condição de perda óssea em humanos mais conhecida é a osteoporose pós-menopausa. Vários tratamentos já foram desenvolvidos objetivando a prevenção de perda da massa óssea, como por exemplo a reposição hormonal, o uso de bisfosfonatos e realização de atividades físicas (KALU, 1991). No presente estudo optou-se pelo tratamento preventivo com atividade física (corrida) associando ao uso de um bisfosfonato. O tratamento preventivo da osteoporose é de extrema importância para um tratamento eficaz, conhecendo as condições normais do osso, sabe-se que não é possível recuperá-las com o quadro da patologia já instalado (DRIUSSO, 2000). Assim o tratamento tem objetivo de restaurar a massa óssea de forma que o risco de fraturas seja revertido (CHESTNUT, 1995). Segundo Dequeker (1994), a prevenção é mais fácil a manutenção da massa óssea do que a restauração, sendo assim, este trabalho tem como objetivo a prevenção da osteoporose em ratas susceptíveis. Este estudo, trata-se da prevenção da osteopenia, com isso não foi preciso a espera da instalação do quadro, realizou-se a ovariectomia, e com 72 horas após a cirurgia foi dado início ao tratamento preventivo de doze semanas. Realizou-se a ovariectomia para indução do quadro osteopênico, um modelo já bastante utilizado para estudar mecanismos de ação e terapias aplicáveis no tratamento da osteoporose (KALU, 1989; THOMPSON et al., 1995). A rata ovariectomizada é um excelente modelo experimental, pois as principais características clínicas da deficiência de estrogênio humano nela são encontradas (THOMPSON et al., 1995; GALA et al., 2001; PRIEMEL et al., 2002). A literatura demonstra que após a realização da Ovariectomia, a instalação da osteopenia ocorre em um mês ou menos (KALU, 1991; LI; SHEN; WRONSKI, 1997; THOMPSON et al.; 1995). Quanto a idade dos animais, o início do experimento foi com o peso de 150 a 180 gramas, um animal considerado jovem, pois segundo Thompson e seus colaboradores (1995), a idade é um fator importante nas pesquisas da perda óssea, afirmando que a diminuição óssea que ocorre após a ovariectomia depende da idade do animal, quanto mais jovem, mais rápida essa perda, nos animais mais idosos mais lenta. Discussão | 64 A composição corporal tem importante relação com a densidade mineral óssea. (GNUDI et al., 2007). No presente estudo, todos os animais aumentaram a massa corporal até o final do experimento; contudo, os animais submetidos à ovariectomia ganharam mais peso em relação aos grupos SHAMs. Esses valores conferem corroboram com alguns autores que utilizaram ratas ovariectomizadas e não (LATOUR et al., 2001; RENNO et al., 2007; TROMP et al., 2006; LESPESSAILLES et al., 2009). O aumento de massa corporal para Shinoda e colaboradores (2002), é principalmente resultado da ovariectomia, que leva a baixos níveis hormonais e ao maior acúmulo de gordura pela elevação da ingestão de alimentar. Neto e Fernandes (2001), ressaltam que a obesidade é também um protetor de fraturas, a ação da massa óssea, como fator de energia mecânica aplicada sobre o esqueleto, teria capacidade de estimular a remodelação óssea. Em contrapartida Premaor et al., (2010), afirma que o número de obesos com fraturas está aumentando, embora o excesso de tecido devesse funcionar como “protetor” de fraturas, reduzindo o trauma esquelético após uma queda, isso não ocorre, pois o elevado peso corporal gera um maior impacto na queda, além da força muscular e mobilidade diminuída que aumentam o risco de cair. O modelo e intensidade de exercício a ser utilizado na prevenção da perda da massa óssea, ainda não estão totalmente elucidados. Como protocolo de treinamento neste experimento, seguiu-se o sugerido por Simões et al., (2008), inicialmente é de 10 minutos evoluindo gradativamente até 60 minutos por dia, cinco vezes por semana, durante 12 semanas, a velocidade de 15m/min nas seis primeiras semanas e 18 m/min nas demais. Em relação a duração do exercício, que é de extrema importância, utilizamos um período de adaptação com tempos reduzidos, progredindo para um hora de duração. Pesquisadores têm sugerido que a intensidade moderada e de tempo não prolongado para as mulheres pós-menopáusicas são mais eficientes para o tecido ósseo quando comparados a exercícios extenuantes, que geram uma redução da densidade mineral óssea (HAGIHARA et al., 2005). Gremion et al., (2001) afirma que exercícios de endurance de alto rendimento, pode levar uma perda óssea prematura, explicada pelos efeitos na homeostrase dos hormônios sexuais, gerando uma alteração no ciclo menstrual. A tríade da Atleta, é um exemplo, uma síndrome que consite em distúrbios alimentares, amenorréia e osteoporose, que estão todos inter-relacionados. Entretanto, essa tríade não ocorre apenas em atletas, mas em mulheres ativas que participam de uma série de tipos de exercícios (YEAGER et al., 1993). Alguns autores afirmam que o exercício aeróbico de média intensidade e com sobrecarga são mais eficientes (TROMP et al., 2006; BONNET et al., 2007), porém outros Discussão | 65 defendem que o exercício mais efetivo é o de alto impacto (HONDA et al., 2003; NAGASAWA et al., 2008). Iwamoto e colaboradores (1998), testando diferentes intensidades na esteira, com ratas adultas ovariectomizadas, o exercício moderado (12m/min. 1 h/dia) foi mais eficiente, pois observou um aumento na DMO do fêmur e da tíbia dos animais, e esses ainda apresentaram uma maior força de fratura. Neste estudo, os grupos que utilizaram da corrida como prevenção, nos protocolos apresentados a cima, apresentou valores positivos em relação aos outros, alguns com diferença significativa, outros não. Canali e Kruel (2001) resalta que o exercício leva a formação óssea a longo prazo, pois a absorção intestinal de cálcio é aumentada juntamente com a diminuição de sua excreção pela urina e com níveis mais altos de PTH. Alguns pesquisadores (LÓPEZ, 2000; DELMAS, 2000; SAHNI et al., 1993 e MÖNKKÖNEN et al., 1990) afirmam que várias substâncias como cálcio, isoflavonas, ralozifeno e os bisfosfonatos têm sido utilizados para inibição da atividade reabsortiva óssea após a menopausa com efeitos adversos reduzidos ao paciente. Pórem, segundo Sagraves (2003), das substâncias citadas, a diminuição dos riscos de fratura têm sido obtidos somente com o uso dos bisfosfonatos. No presente estudo utilizou-se risedronato de sódio (Actonel), que segundo alguns autores (MORTENSEN et al., 1995; WATTS et al., 2004), têm bom potencial de ação, sua administração oral é tolerável, e os efeitos colaterais quando comparados com os medicamentos da mesma classe são reduzidos. Harris et al., (1999) e Reginster et al., (2000), afirmam que esse medicamento é eficaz no tratamento da osteoporose pós-menopausa, reduzindo risco de fraturas vertebrais já no primeiro ano de tratamento. Quanto a dose do risedronato, há discussões sobre o que seria mais viável e mais eficaz, doses diárias, semanais ou mensais. Segundo Harris et al., (2004), a eficácia e a tolerância do risedronato uma vez por semana comparado com doses diárias foram confirmado em estudo randomizado. Também não apresentaram diferença significativa em relação a efeitos adversos graves ou gastrointestinais; porém, a conveniência da administração foi muito melhorada com dosagens semanais. Os tratamentos em que os intervalos são maiores, são mais propícios à aceitação; as mulheres que utilizam do bisfosfonato semanal têm maiores taxas de adesão e persistência do que aquelas em regimes diários (CRAMER et al., 2007). Com esse conhecimento, foi inevitável o desenvolvimento de doses menos frequentes, doses mensais (DELMAS et al., 2008). Com isso, nesse estudo doses mensais foram administradas, nos valores de 30mg/kg/mês. Discussão | 66 Nas análises de ensaio mecânico e histologia (colágeno tipo I proximal), o grupo SHAMM apresentou valores inferiores a alguns grupos ovariectomizados, com diferença estatística, acredita-se em que a medicação sem a necessidade devida possa ter acarretado prejuízos. A Associação Médica Brasileira, afirma que a medicação desnecessária possa trazer algum benefícios; pórem, pode também trazer prejuízos a saúde do indivíduo, como intoxicação, reações adversas, interações medicamentosas, entre outros. Pereira e colaboradores (2012), avaliaram a eficácia de um outro bisfosfonato, o pamidronato, como prevenção e tratamento da osteoporose, observaram a eficácia do pamidronato em reverter o processo de massa óssea, porém, corroborando com nossos resultados, na prevenção primária não houve benefícios adicionais, além disso a capacidade do osso em suportar o esforço mecânico foi reduzida, concluindo assim que o tratamento preventivo pode prejudicar a resistência óssea. Ito e colaboradores (2005), realizaram um estudo com ratas ovariectomizadas, e afirmaram que grande parte da eficácia do risedronato é explicada pelo aumento da densidade mineral óssea e da massa óssea está ligada também com a capacidade de aumentar a resistência óssea com a alteração da microarquitetura e aumento da conectividade de trabéculas, quando administrado em doses superiores a 0,5 mg/kg, correlacionando com a melhora das propriedades biomecânicas do osso, gerando resultados superiores aos animais SHAMs. Seguindo Hogan et al., (2000), para avaliar as propriedades mecânicas da tíbia devese utilizar o ensaio de flexão de três pontos, já que a tíbia é constituída principalmente por tecido ósseo cortical (BOGLIOLO, 1993), e de acordo com Mosekilde et al., (1998), o ensaio de flexão de três pontos é o mais propício para testar regiões corticais, sugerindo que ensaio biomecânico possivelmente reflete o comportamento desse tecido. Observou-se neste estudo, no ensaio mecânico, com a flexão de três pontos, diferença estatística somente o grupo SHAMM (não operado com medicamento) tendo valores inferiores aos grupos OVXM (operado com medicamento). Os outros grupos não apresentaram diferença estatística quando comparados simultaneamente. As análises densitométricas e histológicas foram realizadas na parte proximal da tíbia, pois segundo alguns autores, a fratura proximal tibial tem incidência aumentada com a idade, com prevalência no sexo feminino (MELTON; RIGGS, (1983); WOOLF; PFLEGER, 2003). Sims e colaboradores (1996), afirmaram que há uma perda óssea considerável na metáfise da tíbia proximal após a ovariectomia. Thompson et al., (1995), afirmaram que as ratas têm perda óssea trabecular na tíbia proximal e em vertebras lombares após a Discussão | 67 ovariectomia por um mecanismos de desequilíbrio da remodelação óssea; em estudos, os achados com 14 dias após a ovariectomia, foi um aumento da remodelação óssea, estreitamento e perda de elementos trabeculares. Kalu (1991), apresenta que com a ovariectomia há uma perda maior no osso trabecular; já no osso cortical as perdas são pequenas, pois a alta reabsorção na região endosteal é compensada pelo crescimento da área periosteal (BILEZIKIAN et al., 1996). Pesquisas mostram que o risco de fratura está diretamente ligado com a medida da densidade mineral óssea, a densitometria tem sido destaque como metodologia para aplicação clínica, conhecida como densitometria óssea, e segundo a OMS é um método padrão para o diagnóstico da osteoporose (WHO, 1994). Na densitometria óssea total não houve diferença estatística entre os grupos, já na densitometria óssea proximal, o grupo OVX, teve valores significativamente inferiores aos grupos SHAMM e SHAMCM, os grupos ovariectomizados em que os tratamentos foram realizados não apresentaram diferença estatística. Lespessailles et al., (2009), também não encontraram diferença significativa no conteúdo mineral ósseo em animais ovariectomizados que treinaram corrida por 12 semanas. Quanto ao medicamento, de acordo com Szejnfeld (2000), doses reduzidas e padronizadas, juntamente com o tempo limitado de administração do medicamento, pode se justificar a ineficácia frente ao reparo não almejado. Robbins (1994) em suas pesquisas, avaliou o efeito do risedronato no reparo ósseo, e também discuti a possibilidade de que o tempo administrado o medicamento ter sido insuficiente para sensibilizar o tecido cortical, que tem resposta mais lenta diante a ovariectomia. McClung (1997), realizou um estudo em humanos, com Risedronato com doses diárias durante dezoito meses, obteve um aumento significativo da densidade mineral óssea. Monteagudo et al., (1997) verificaram que o período de privação de estrógeno de 1 mês após a ovariectomia é suficiente para observar sinais de osteopenia e a perda óssea que se segue por meio da densitometria óssea. Entretanto Søgaard et al., (1997), não observaram diferenças da densidade mineral óssea nas ratas ovariectomizadas em relação a ratas shams. O exame histológico é muito utilizado para avaliar os parâmetros estruturais microscópicos do osso. A utilização dessa ferramenta foi fundamental para determinar as alterações causadas pela ovariectomia e os efeitos do tratamento preventivo realizado. Neste estudo quantificou-se colágenos tipo I e III, pois segundo Junqueira e Carneiro (2004), para a integridade óssea existe uma relação complexa entre o colágeno e os minerais de hidroxiapatita. Alterações das propriedades e na disposição do colágeno podem influenciar na disposição dos minerais, modificando assim a mecânica óssea. Discussão | 68 Conforme Rizk e colaboradores (2008), o estudo do colágeno é importante para avaliar a qualidade e a resistência óssea. Junqueira e Carneiro (2004), diferenciam os colágenos tipo I e III, sendo que o tipo I pode ser encontrado em abundância no osso e está incluído no grupo de fibras colágenas espessas, já o tipo III atribui ao grupo de fibras finas, localiza-se entre as fibras grossas no osso cortical e está em maior concentração no canal de Havers. Na quantificação de colágeno tipo I, o grupo SHAMM apresentou valores inferiores ao esperado, sugerindo que há um aumento da fragilidade óssea quando o risedronato é utilizado sem que haja necessidade. Rizk et al., (2008) afirmam que com a ovariectomia ocorre uma mudança na proporção dos tipos de fibras, aumentando o colágeno tipo III e diminuindo consideravelmente o colágeno tipo I, pesquisadores sugerem que essa alteração pode levar a maior fragilidade óssea. Diferente do que foi encontrado em nosso trabalho, o grupo OVX teve valores inferiores na avaliação do colágeno tipo III, aos grupos SHAMC e SHAMCM, podendo indicar que a corrida associada ou não ao medicamento em grupos não operados aumenta o colágeno tipo III. De acordo com alguns autores (JUNQUERIA; CARNEIRO, 2004; RESNICK et al., 1995), a remodelação óssea não está relacionada com o crescimento, o processo é muito mais lento, ocorre a neoformação óssea no mesmo local da reabsorção, ao contrário da modelação, onde o osso é removido de um local e formado em um local diferente (MANOLAGAS, 2000). No presente estudo, após a coloração, foi utilizada após a captura de imagens histológicas em microscópio para avaliação da microarquitetura do trabeculado ósseo na região proximal da tíbia. Segundo autores (SZEJNFELD, 2000; HARADA; RODAN, 2003), a fase de reabsorção dura em média duas a três semanas e a neoformadora dura cerca de três meses, os dois processos de neoformação e reabsorção óssea, ocorrem de maneira conjugada. Com essa afirmação optamos por um tempo de experimento de três meses, o suficiente para que se torne possível neoformação óssea. O grupo OVX teve valores significativamente inferiores quando se refere a quantificação do trabeculado ósseo, em relação SHAMCM, OVXM, OVXCM e SHAMCM e o grupo OVXCM e SHAMCM com valores superiores aos grupos OVXC, SHAM e SHAMM, sugerindo que o grupo que foi ovariectomizado e tratado preventivamente com corrida e medicamento teve valores positivos, em relação a grupos não ovariectomizados. A descoberta e caracterização do sistema RANKL, OPG e RANK, têm mudado os conceitos relativos ao metabolismo ósseo, levando a um melhor entendimento da patogênese Discussão | 69 das doenças ósseas metabólicas e alavancando novas estratégias terapêuticas. Neste estudo relizou-se a técnica de imunoistoquímica para a detecção de OPG, RANKL e TRAP, apresentando alta especificidade na detecção de tais proteínas. Baud’Huin e seus colaboradores (2007), afirmaram que a razão RANKL/OPG pode ser utilizada como marcador biológico de prognóstico em patologias ósseas, como por exemplo a osteoporose, cooperando para avalição de novas drogas e terapias para as patologias ósseas. Pesquisas apontam que experimentos in vivo demonstraram o RANKL como fator pró-reabsorção, o aumento na expressão do RANKL está relacionado com o aumento da atividade osteoclástica, favorecendo assim a reabsorção (HOFBAUER, 2006; BAUD’HUIN et al., 2007), contudo outros autores afirmam que em condições inflamatórias ocorre maior liberação de RANKL, nem sempre estas células guiaram o processo de reabsorção óssea, sendo que muitas vezes a presença do receptor inibitório OPG influencia decisivamente o processo de reabsorção óssea, sendo assim importante a análise da correlação RANKL e OPG para melhor entendimento do metabolismo ósseo (MENEZES et al., 2008). No presente estudo, na imunomarcação para OPG foi maior no grupo SHAMCM, nos grupos SHAMs no geral foram de alto a moderado; já nos grupos OVXs, de baixo a moderado, já na imunomarcação para RANKL, a inumomarcação foi maior no grupo OVX, no geral observou-se o contrário do OPG, nos grupos SHAMs, foram de baixo a moderado, e no OVXs, de alto a moderado; e por último a imunomarcação para TRAP, onde foi maior no grupo OVX. Nos grupos em que o medicamento foi administrado, a presença de osteoclastos arredondados, não acoplados à lacuna de reabsorção e distante da matriz óssea foi muito comum. No presente estudo, o grupo SHAMM apresentou um declínio de colágeno tipo III e nas propriedades mecânicas, concluíndo que a aplicação do medicamento em ratas normais pode acarretar o desequilibrio ósseo. E nos grupos ovariectomizados observamos melhora dos grupos tratados, porém em algumas análises não foi possível observar alterações significativas. De acordo com os parâmetros avaliados nesse trabalho, fica claro a necessidade de estudos adicionais para a associação exercício físico com um bisfosfonato como tratamento e/ou prevenção. CONCLUSÃO Conclusão | 71 6. CONCLUSÃO Conclui-se que o uso da corrida associado ao medicamento risedronato nos grupos ovariectomizados altera para melhor as propriedades biomecânicas do osso em relação ao grupos SHAMs. O medicamento não apresentou benefícios na prevenção primária. O grupo em que o medicamento risedronato foi administrado, apresentou maiores valores quando comparados com o tratamento corrida, e quando associados os tratamentos os resultados foram ainda melhores nos grupos ovariectomizados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Referências Bibliográficas | 73 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABRAHÃO, G. S.; SHIMANO, A.C.; PICADO, C.H.F. Ação da atividade física sobre as propriedades mecânicas dos fêmures e tíbias de ratas osteopênicas. Acta Ortopédica Brasileira, v. 14, n. 5, p. 242-245, 2006. 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