actinomycetes amycolatopsis methanolica and streptomyces

REGULATION OF GLUCOSE METABOLISM IN THE
ACTINOMYCETES AMYCOLATOPSIS METHANOLICA
AND STREPTOMYCES COELICOLOR A3(2)
The study described in this thesis was performed in the Department of
Microbiology of the University of Groningen, The Netherlands. The research was
supported by JNICT (Portugal grants Ciência BD-808-IF-90 and Praxis
XXI-BD-2798/94) and the Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology
Institute (GBB).
RIJKSUNIVERSITEIT GRONINGEN
REGULATION OF GLUCOSE METABOLISM IN THE
ACTINOMYCETES AMYCOLATOPSIS METHANOLICA AND
STREPTOMYCES COELICOLOR A3(2)
Proefschrift
ter verkrijging van het doctoraat in de
Wiskunde en Natuurwetenschappen
aan de Rijksuniversiteit Groningen
op gezag van de
Rector Magnificus Dr. F. van der Woude
in het openbaar te verdedigen op
vrijdag 7 februari 1997
des namiddags te 4.15 uur
door
Alexandra Maria da Costa Rodrigues Alves
geboren op 5 december 1965
te Lissabon
Promotor
Prof. dr. L. Dijkhuizen
Voorwoord
Nog één dag en dan gaat mijn boekje naar de drukker. Het is wel een spannend
moment. Alles moet nog een keer bekeken worden om te voorkomen dat er (nog meer)
foutjes achter blijven. Het bedenken van de verplichte stellingen en natuurlijk het
schrijven van dit voorwoord; de meeste gelezen bladzijde van het hele proefschrift. Juist
daarom is deze bladzijde zo belangrijk.
Gedurende mijn promotie onderzoek heb ik het geluk gehad om veel mensen te
ontmoeten die enthousiast waren over mijn werk en van wie ik veel heb geleerd. De
resultaten hiervan zijn o.a. in dit proefschrift te zien.
Ten eerste wil ik mijn promoter Lubbert Dijkhuizen bedanken voor de mogelijkheid
die hij mij gegeven heeft om bij Microbiële Fysiologie een promotie onderzoek uit te
voeren. Lubbert, heel erg bedankt voor jou interesse in mijn werk en ook voor het geduld
dat nodig was om mijn manuscripten (weer) te corrigeren. Het heeft jou zeker veel tijd
gekost. Bedankt.
Zonder de financiële steun van JNICT (Portugal) was ik nooit aan dit promotie
onderzoek begonnen. Ik wil daarom de beoordelings comissie van JNICT bedanken voor
de goede beoordeling van mijn aanvraag.
Mijn speciale collega’s (en vrienden!) Teresa en Hans. Teresa, ik heb altijd genoten
van het samen kletsen over allerlei dingen en soms ook over het werk. Jij bent, vooral in
het begin, heel belangrijk voor mij geweest toen ik nog niet helemaal aangepast was aan
de Nederlandse cultuur.
Hans, vanaf het begin heb je mij altijd gesteund in het werk (goede tips) en je bent
een goede vriend die altijd klaar stond om mij te helpen. Jij had altijd tijd om te luisteren
naar mijn verhaaltjes. Ik wens jou dan ook veel succes in Boston met je nieuwe baan als
post-doc. Gedurende deze periode heb ik heel veel leuke mensen ontmoet bij de vakgroep
Microbiologie. Ik wil iedereen bedanken die een bijdrage heeeft gegeven aan de
totstandkoming van dit proefschrift en met name: Douwe, Grace, Erik, Henk H., Nico,
Joost, Grietje en Marion (mijn eerste collega’s) Maria, Henk B., Anja, Edmund en Erwin
(de andere groep!), Mark T., Marc M., Mark G., Dirk, Bart, Gert-Jan A., Gert-Jan S.,
Ray, Wim M., Wim V., Johan, Gerda, Harm, Robert vd G., Robert H., Hans Hu., Jan,
Meis, Richard, Klaas Nico, Hans W., Loraine, Laurence, Nathalie, Simon, Rachel,
Chiara, Philip, Charles, Michel, Kees, Michael, Gerda, Charles, Theo, Irma, Manny, Peter
Q., Heleen, Sacha, Gerda, Onno, Geertje, Yasuhiro en verder Jos, Tiny, Mieke, Petra,
Bea, Carla (bedankt voor de ondersteuning in de niet-microbiologische dingen die toch
onmisbaar zijn).
I would like to thank M.J. Bibb. Dear Mervyn, we met each other many times during
this project. You were always very interested and optimistic about the work. I enjoyed
very much my visit to your lab, where I have learned a lot about Streptomyces genetics.
It was a very pleasant time.
I would also like to thank D. Ridgen. Dear Daniel, I appreciate the work that you have
done in modelling the 3D structure of the PPi-PFK protein. I hope that in the future we
will be able to validate it with 3D structures of real crystals.
I also would like to thank prof. H. Santos for the 31P-NMR work and Fritz T. for all
the help in constructing the phylogenetic trees.
De leden van de leescommissie, prof. dr. W. N. Konings, prof. dr. J. J. Beintema en
prof. dr. D.B. Janssen, wil ik bedanken voor de snelle beoordeling van het manuscript.
Naast de mensen op het werk zijn er ook andere mensen belangrijk geweest in deze
periode. Daniela, Lena, Wiek, Miriam, Harm, Truus, Kees, Liliane, Henk, Sjaniek, Sonja
en Peter, bedankt voor de steun en gezelligheid.
Zonder de steun van mijn familie, was deze promotie tijd niet zo leuk geweest. Pai,
Mãe, Sofia, Maria J. bedankt voor alle bezoekjes en telefoontjes die jullie naar mij hebben
gemaakt. Van ver weg hebben jullie altijd op het juiste moment laten zien dat ik niet alleen
ben.Veel liefs.
Ik wil ook graag mijn schoonouders bedanken voor de interesse die ze hebben getoond
in mijn werk.
Lieve Gert-Jan, ik wil zoveel tegen jou zeggen. Jou liefde en steun zijn voor mij de
belangrijkste redenen geweest om deze promotie af te maken. Hoe kan ik jou bedanken?
Met veel liefde. Ik zie een geweldige toekomst voor ons samen. Ik hou erg veel van jou.
Prefácio
Sempre pensei que iria ser mais fácil escrever um prefácio em português, mas falta-me
a inspiração e aquela palavra certa para começar. Este prefácio, pode-se melhor traduzir
por palavras de agradecimento. Vou tentar por este meio agradecer a todas as pessoas ou
instituições que contribuiram de uma ou outra forma para a realização desta tese de
doutoramento.
A concretização do meu doutoramento só foi possivel devido ao financiamento obtido
pela JNICT em Portugal, e ao incentivo dado pelo Prof. N. Van Uden para concorrer a
esta bolsa. Mas, um doutoramento não se consegue só com apoio financeiro, o apoio
familiar é talvez o mais importante. Ao longo destes 5 anos recebi um apoio muito especial
da minha familia não só no que diz respeito ao meu trabalho mas também nos momemtos
de adaptação a uma outra cultura. Obrigado.
Nestes anos de investigação (cerca de 5 anos) houve altos e baixos. Como acontece
com todas as pessoas também eu tive em certos momentos dúvidas sobre as minhas
proprias capacidades. Especialmente nestas ocasiões tive sempre o apoio do meu
orientador prof. Lubbert Dijkhuizen e, desta maneira, consegui ultrapassar os problemas
que fui encontrando pelo caminho. No laboratório da fisiologia microbiana encontrei
muita gente com imenso conhecimento de fisiologia e genética da Amycolatopsis
methanolica. Gert-Jan, Wim Vrijbloed, Hans Hektor, Gerda Hessels, obrigado pelo
interesse que demonstraram no meu trabalho; a vossa ajuda contribuiu para um bom
progresso no meu trabalho.
Ao longo deste período, tive a sorte de trabalhar num laboratório em que existe boa
camaradagem. Nico, Grace, Erik, Henk H., Charles, Peter Q., Ray, Mark T, Klaas Nico,
Hans W., Hans H., Meis, Richard, Jan Kiel, Wim M., Geertje, Onno, Yasuhiro, Dirk,
Bart, Gert-Jan A., Sacha, Harm, Robert H., Robert van de G., Cees, Michael, Michel,
Heleen, Irma, Manny, Theo, Marc M, Loraine, Laurence, Joost, Johan, Chiara, Maria,
Douwe, Henk, Erwin, Anja, Edmund, Mieke, Petra, Bea, Carla, Jos e Tiny e muitos mais
colegas. Espero que continue sempre este bom ambiente.
Queria aqui tambem agradecer ao M. J. Bibb, H. Santos, D. Ridgen, e L. Hue pelo
excelente contacto que mantivemos e das muitas ideias que nasceram através das nossas
discussões. Posso dizer que trabalhar com vocês foi um grande incentivo.
Agora ainda umas palavras para os meus paranimfos.Teresa e Hans, os meus colegas
favoritos! Sem a Teresa no laboratório, tinha sido de certeza mais aborrecido. Nós as duas
arranjamos sempre tempo para conversar sobre outras coisas para alám da ciência, o que
é muito saudável. O Hans é um colega especial. Geralmente com bom humor e com muita
paciência para ouvir as minhas historias.
No fim queria dizer algumas coisas à pessoa mais especial para mim. Gert-Jan, o teu
envolvimento neste projecto, fez com que eu ganhasse ânimo e autoconfiança no meu
trabalho. Foi tambem aqui que nos conhecemos e que cresceu um amor maravilhoso entre
nós dois. Espero estar sempre ao teu lado durante toda a vida. Assim vale a pena.
Contents
Aim and outline of this thesis
11
Chapter 1
Glucose metabolism in actinomycetes
13
Chapter 2
Enzymes of glucose and methanol metabolism in the
actinomycete Amycolatopsis methanolica
37
Chapter 3
Characterization and phylogeny of the pfp gene of
Amycolatopsis methanolica encoding PPi-dependent
phosphofructokinase
53
Chapter 4
Identification of ATP-dependent phosphofructokinase
as a regulatory step in the glycolytic pathway of the
actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2)
67
Chapter 5
Characterization and physiological role of a novel
ATP-dependent phosphofructokinase from the
methylotrophic actinomycete Amycolatopsis
methanolica
83
Chapter 6
Molecular and biochemical characterization of a
phosphoglycerate mutase isoenzyme from the
methylotrophic actinomycete Amycolatopsis
methanolica
99
Summary and concluding remarks
111
Samenvatting
121
Sumário
125
References
129
9
Aim and outline of this thesis
Actinomycetes constitute the most important group of bacteria producing secondary
metabolites (e.g. antibiotics), of which many are derived from glucose metabolism.
Knowledge of the physiology, biochemistry and genetics of glucose metabolism in
actinomycetes is limited. It is well-known that when growth ceases some intermediates
from glycolysis and TCA cycle accumulate in the cells, which may serve as precursors
for secondary metabolite production. It has been suggested that this represents some kind
of overflow metabolism possibly due to lack of strict control mechanisms in these
pathways.
The aim of this thesis was to characterize enzymes of glucose metabolism and their
regulation in actinomycetes. A nocardioform type of actinomycete, the methanol-utilizing
bacterium Amycolatopsis methanolica, and the genetically best characterized
streptomycete, Streptomyces coelicolor A3(2), were selected for these studies.
Characterization of regulatory enzyme steps in glucose metabolism may identify targets
for further improvement of industrial strains aiming to enhance availability of precursors
from primary metabolism used for production of secondary metabolites. Chapter 1 gives
a general introduction of glucose metabolism in bacteria with emphasis on the (limited)
knowledge available for actinomycetes; antibiotics formed from intermediates at various
positions in the glucose metabolic pathways involved are indicated.
The A. methanolica glycolytic enzymes phosphofructokinase, pyruvate kinase and
phosphoglycerate mutase are characterized in detail in chapter 2. Also data about glucose
and methanol metabolism are presented. The PPi-dependent phosphofructokinase
characterized in chapter 2 has been object of further study in chapter 3, describing the
cloning and sequencing of the pfp gene and phylogeny of the enzyme. The
ATP-dependent phosphofructokinase enzyme from Streptomyces coelicolor A3(2) has
been studied in detail in chapter 4.
In A. methanolica, a second PFK enzyme (ATP-PFK) inducible by growth on C1
substrates has been characterized (chapter 5). The possible physiological roles for the two
PFKs in this organism are discussed. Genetic and biochemical evidence for the presence
of a second phosphoglycerate mutase enzyme in A. methanolica is presented in chapter
6.
11