UNIVERSIDADE NILTON LINS INSTITUTO NACIONAL DE

Transcrição

UNIVERSIDADE NILTON LINS
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA
EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DA Piper aduncum L NO CONTROLE DE
PARASITAS MONOGENÉTICOS (PLATHYHELMINTHES: MONOGENOIDEA) E
PARÂMETROS FISIOLÓGICOS DO PIRARUCU, Arapaima gigas SCHINZ 1822
MARIETA NASCIMENTO DE QUEIROZ
Manaus, Amazonas
Julho, 2012
MARIETA NASCIMENTO DE QUEIROZ
EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DA Piper aduncum L NO CONTROLE DE
PARASITAS MONOGENÉTICOS (PLATHYHELMINTHES: MONOGENOIDEA) E
PARÂMETROS FISIOLÓGICOS DO PIRARUCU, Arapaima gigas SCHINZ 1822
ORIENTADORA: ELIZABETH GUSMÃO AFFONSO
Dissertação apresentada a UniNilton
Lins/INPA como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Aquicultura
Manaus, Amazonas
Junlho, 2012
iii
Q42
Queiroz, Marieta Nascimento.
Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L no controle de parasitas
monogenéticos (Plathyhelminthes: Monogenoidea) e parâmetros fisiológicos do
pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 / Marieta Nascimento de Queiroz. –
Manaus: UNL / INPA, 2012.
83. 30 cm.
Dissertação (Mestrado em Aquicultura) – Universidade Nilton Lins / Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, 2012.
Orientadora: Elizabeth Gusmão Affonso
1. Fitoterapia. 2. Fisiologia. 3. Parasitologia. I. Título. II. Universidade Nilton Lins /
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.
CDU 639.3.09
Sinopse:
O estudo verificou o efeito do extrato aquoso de Piper aduncum L sobre os
parâmetros fisiológicos de pirarucu Arapaima gigas e avaliou sua eficácia sobre os
parasitos monogenéticos dessa espécie.
Palavras-chave:
Fitoterapia, hematologia, parasitologia, peixes.
iv
DEDICATÓRIA
Dedico
meus
pais
esta
conquista
Raimunda
e
Queiroz e aos meus irmãos
aos
Romeu
v
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos mediada pelo Edital Nº 025/2010
durante o período de realização do mestrado.
A Universidade Nilton Lins e ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela
oportunidade através do curso de Pós-graduação em Aquicultura, pela
disponibilidade da infraestrutura para a realização deste trabalho.
À pesquisadora Dra. Elizabeth Gusmão Affonso, pela orientação, dedicação e
compreensão
diante
às
minhas
dificuldades
e,
principalmente,
pela
oportunidade e confiança durante o desenvolvimento deste trabalho.
À pesquisadora Dra. Cleusa Suzana Oliveira de Araújo, pela sugestão sobre
fitoterápicos, amizade, apoio e, principalmente, por me apresentar o mundo da
parasitologia de peixes.
Ao M.Sc. Eduardo Akifumi Ono, pelo auxílio concedido durante os experimentos e
pela disposição em compartilhar seus conhecimentos.
À Coordenação de Tecnologia e Inovação (COTI) e ao Laboratório de Fisiologia
Aplicada à Piscicultura (LAFAP), do INPA.
Aos colegas César Oishi, pelo auxílio nas análises estatísticas, Elenice Martins
Brasil, Irenice Filagrana, Renata Silva, Márcio Quara, Iracimar Batista do
Carmo, Aline Alcântara, aos irmãos Alyson e Eduardo Carvalho (B1 e B2),
Sanny Maria Sampaio Andrade, Patrícia Castro e Gabriela Viana pela
colaboração nas análises laboratoriais.
Às coordenadoras do curso em Aquicultura, Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e
Val e Dra. Elizabeth Gusmão Affonso, pela dedicação e empenho para o
desenvolvimento e consolidação do curso em Aquicultura, na Amazônia.
À Ione Castro, secretária do PPG-Aquicultura pela simpatia, paciência e dedicação.
À banca da aula de qualificação Dra. Andréia Belém Costa (UFAM), Dra. Cleusa
Suzana Oliveira Araújo (UNINILTONLINS) e Dr. Luis Inoue (Embrapa-Am), e
aos referis, Dr. Acilino do Carmo Canto (UNINILTON LINS), Dr. Marcos
Tavares Dias (Embrapa-AP), Dr. Gilberto Pavanelli (UEM) pelas sugestões.
À Dra. Cleusa Suzana Oliveira de Araújo por ter cedido o Laboratório Zoologia
Aplicada (UNINILTON LINS).
Aos colegas da turma PPG-AQUI 2010, pelo companheirismo, e pelos bons
momentos compartilhados, Aline Alcântara, Alyson e Eduardo Carvalho,
vi
Izamilde Carvalho, Gabriela Viana, Patrícia Castro, Valéria Sobral e Joana
Paula e PPG-AQUI 2011, Renata Maria da Silva, Mary Anne B. Silva e Sônia
Rosana Oliveira dos Santos.
À minha família, meus irmãos, meus sobrinhos que sempre estiveram ao meu lado,
me apoiando, à minha querida mãe Raimunda, pelo apoio e incentivo nesta
fase de minha vida.
vii
RESUMO
monogenéticos (Plathyhelminthes: Monogenoidea) e parâmetros fisiológicos
do pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822
Visando contribuir com os estudos sobre o uso de fitoterápicos na aquicultura,
principalmente em espécies nativas como o pirarucu Arapaima gigas, o presente
estudo avaliou, in vitro, a toxicidade do extrato aquoso da pimenta de macaco, Piper
aduncum L nos monogenéticos de pirarucu, e determinou concentrações como
referência para tratamentos de alevinos de pirarucus em banhos terapêuticos
(Capítulo 1). A partir dessas informações avaliou-se a eficácia do extrato no controle
dos monogenéticos das brânquias do pirarucu em banhos curtos (0,5 h) e longos (24
h), e seus efeitos sobre as variáveis sanguíneas (Capítulo 2). No teste in vitro, foi
avaliado o efeito de 40, 60, 80, 100 e 120 ml/L do extrato em monogenéticos durante
três horas de exposição. O extrato causou 100% de mortalidade dos parasitas em
100 e 120 ml/L, após duas horas, enquanto em 80 ml/L após três horas exposição.
Para 40 e 60 ml/L do extrato, a mortalidade foi de 90% após três horas de
exposição. A partir desses resultados, as respostas fisiológicas do pirarucu foram
avaliadas em banhos com 40, 60, 80 e 100 ml/L do extrato e um controle (sem
extrato), durante 24 h, sendo analisados o hematócrito (Ht), a concentração de
hemoglobina ([Hb]), o número de eritrócitos (RBC), a concentração de hemoglobina
corpuscular média (CHCM), a hemoglobina corpuscular média (HCM), o volume
corpuscular médio (VCM), a glicose e as proteínas plasmáticas totais. Foi observada
redução significativa (p<0,05) no Ht e 16,6% de mortalidade dos pirarucus na
concentração 100 ml/L. No capítulo 2, foram testadas tres concentrações do extrato
(0, 40, 60 e 80 ml/L) e um grupo controle (sem extrato), em banhos de curta (0,5 h) e
longa duração (24 h) e avaliados os parâmetros sanguíneos e a carga parasitária.
Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa na redução da
carga parasitária dos peixes expostos em banhos por 0,5 horas e houve aumento da
hemoglobina [Hb] em 40 ml/L. No banho longo (24 h), todas as concentrações
apresentaram redução da carga parasitária, entretanto 80 ml/L causou o melhor
resultado com 80,16% de eficácia. Nos banhos curtos (0,5) e longos (24 h), houve
uma tendência na redução dos valores de Ht e RBC. Ao contrário [Hb], HCM e
CHCM e glicose plasmática demonstraram elevação. Os resultados indicaram que
concentrações inferiores a 80 ml/L do extrato, testadas neste estudo, não altera a
homeostase fisiológica do pirarucu além de apresentar eficácia contra Dawestrema
cycloancistrium e D. cycloancistrioides.
Palavras-chave: Fitoterapia, fisiologia, hematologia, parasitologia, peixes.
viii
ABSTRACT
Effect of aqueous extract of Piper aduncum L in the control of parasitic
monogeneans
(Plathyhelminthes:
Monogenoidea)
and
physiological
parameters of the pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822
Aiming to contribute to studies on the use of herbal medicines in aquaculture, mainly
native species like the arapaima (Arapaima gigas), the present study evaluated the in
vitro toxicity of aqueous extract of pepper jack (Piper aduncum L) in monogeneans
pirarucu, and determined as reference concentrations treatments of fingerlings
pirarucus in therapeutic baths (Chapter 1). From this information, the effectiveness of
the extract was evaluated in control of monogeneans on the gills of pirarucu baths
short (0.5 h) and long (24 h), and their effects on blood variables (Chapter 2). In vitro
test, the effect of 40, 60, 80, 100 and 120 ml/L of the extract was evaluated in
monogeneans for three hours exposure. The extract caused 100% mortality of the
parasites in 100 and 120 ml/L after two hours, while 80 ml/L after three hours
exposure. To 40 to 60 ml/L of the extract, the mortality was 90% after three hours of
exposure. From these results, the physiological responses of arapaima in baths were
evaluated at 40, 60, 80 and 100 ml/L of the extract and a control (without extract) for
24 h, and analyzed the hematocrit (Ht), the concentration of hemoglobin ([Hb]), the
number of erythrocytes (RBC), the mean corpuscular hemoglobin concentration
(MCHC), the mean corpuscular hemoglobin (MCH), the mean corpuscular volume
(MCV), glucose and total plasma proteins. A significant reduction (p<0.05) in Ht and
16.6% mortality of pirarucus concentration in 100 ml/L. In Chapter 2, three extract
concentrations (0, 40, 60 and 80 ml/L) were tested and a control group (without
extract) in baths short (0.5 h) and long term (24 h) and evaluated blood parameters
and parasitic load. The results showed no significant difference in reducing the
parasite load of fish exposed in baths for 0.5 hours and increased hemoglobin ([Hb])
in 40 ml/L. In long bath (24 h), all concentrations had reduced parasite burden,
however, 80 ml/L caused the best result with 80.16% efficiency. In short baths (0,5)
and long (24 h), there was a tendency in reduction in hematocrit and RBC values.
Unlike [Hb], MCH and MCHC and plasma glucose showed an increase. The results
indicated that concentrations of less than 80 ml/L of extract tested in this study, does
not alter the physiological homeostasis of pirarucu besides showing efficacy against
Dawestrema cycloancistrium and D. cycloancistrioides.
Keywords: herbal medicine, physiology, hematology, parasitology, fish.
ix
SUMÁRIO
do pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822............................................................. vii
RESUMO................................................................................................................... vii
do pirarucu Arapaima gigas Schinz 1822.............................................................. vii
ABSTRACT.............................................................................................................. viii
Effect of aqueous extract of Piper aduncum L in the control of parasitic
monogeneans
(Plathyhelminthes:
Monogenoidea)
and
physiological
parameters of the pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 .................................. viii
SUMÁRIO .................................................................................................................. ix
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
2. REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 8
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 20
3.1 Geral ............................................................................................................... 20
3.2 Específicos ...................................................................................................... 20
CAPITULO 1 ............................................................................................................. 21
Toxicidade do extrato aquoso da Piper aduncum L em monogenéticos e nos
parâmetros sanguíneos de pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 ................... 21
RESUMO................................................................................................................... 21
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 23
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 25
2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes ............................................................... 25
2.2 Aquisição e preparo da solução estoque de P. aduncum ............................... 25
2.3 Exposição in vitro dos monogenéticos ao extrato de P. aduncum .................. 26
2.4 Exposição dos peixes ao extrato de P. aduncum............................................ 26
2.5 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros sanguíneos ..................... 27
2.6 Monitoramento da qualidade da água ............................................................. 27
2.7 Análises estatísticas ........................................................................................ 27
3. RESULTADOS ...................................................................................................... 28
3.1 Toxicidade do extrato de P. aduncum sobre os monogenéticos (in vitro) ....... 28
x
3.2 Efeitos da toxicidade aguda do extrato de P. aduncum nos parâmetros
sanguíneos de A. gigas ......................................................................................... 28
3.3 Qualidade da água dos aquários .................................................................... 31
4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 32
5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 37
6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 37
CAPITULO 2 ............................................................................................................. 49
Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L, no controle de monogenéticos
em pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822 ............................................................ 49
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 51
2. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 52
2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes ............................................................... 52
2.2 Aquisição e preparação da solução estoque de P. aduncum ......................... 53
2.3 Banhos com a P. aduncum ............................................................................. 53
2.4 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros hematológicos ................. 53
2.5 Análises parasitológicas e eficácia do tratamento ........................................... 54
2.6 Monitoramento da qualidade da água ............................................................. 54
2.7 Análises estatísticas ........................................................................................ 55
3. RESULTADOS ...................................................................................................... 55
4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 59
5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 62
6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 63
CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 72
1
1. INTRODUÇÃO
O potencial do Brasil como produtor aquícola mundial vem se confirmando
com as últimas estatísticas (2010), cuja produção foi de 479.399 toneladas (MPA,
2012). Dessas, 63,4% são tilápia (Oreochromis niloticus Linnaeus 1758) e carpas
comum (Cyprinus carpio Linnaeus 1758); capim (Ctenopharyngodon idella Cuvier e
Valenciennes 1844); prateada (Hypophthalmichthys molitrix Cuvier & Valenciennes
1844); cabeça grande (Aristichthys nobilis Richardson 1845) enquanto as espécies
nativas, tambaqui (Colossoma macopomum Cuvier 1818), pacu (Piaractus
mesopotamicus Holmberg1887) e o híbrico tambacu (P. mesopotamicus x C.
macropomum), representaram 24,6% da produção nacional. O crescimento na
produção de espécies nativas se deve aos investimentos em pesquisa e tecnologias,
e a previsão para os próximos anos é que, além dessas, outras espécies da
ictiofauna brasileira passarão a contribuir com o desempenho nacional da
aquicultura (Kubitza et al. 2007; MPA 2012). Além dos investimentos no setor, os
estados da região Centro-Oeste e Norte do país contribuirão, significativamente,
com a produção de espécies nativas, onde ocorre a proibição no cultivo de espécies
exóticas.
Dentre as espécies nativas com alto potencial para a piscicultura brasileira
destaca-se o pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822, um Osteoglossiforme da família
Arapaimatidae Ferraris 2003, endêmico da região amazônica. Essa espécie está
entre os maiores representantes da ictiofauna que habita as águas doces do mundo,
apresenta hábito alimentar carnívoro, respiração aérea obrigatória e chama a
atenção pelo seu enorme potencial de crescimento (Fontenele, 1948; Val e
Honczarick 1995; Imbiriba 2001; Cavero et al. 2003; Pereira-Filho et al. 2003).
Tem sido, por muito tempo, importante fonte de alimento para os habitantes
da Amazônia. Apresenta elevado valor econômico e tem sido explorado desde o
século XVIII (Menezes 1951). Porém, a intensa exploração do pirarucu provocou um
acentuado declínio nos seus estoques ao ponto de ser, atualmente, considerada
quase extinta em algumas regiões e sobre-explorada em outras. Em resposta à
sobre-pesca dos estoques naturais, as autoridades governamentais proibiram a
pesca do pirarucu no Amazonas, estando esta restrita apenas aos planos de manejo
comunitário de lagos apoiados pelos órgãos ambientais estaduais e federais.
Há registros sobre o potencial e as experiências do cultivo desta espécie
desde a década de 40, onde são ressaltadas as suas características biológicas e
2
zootécnicas, além do elevado valor mercantil e como alimento na região amazônica
(Bard e Imbiriba 1986; Fontenele 1948; Ono et al. 2004; Ono 2005; 2011; SEBRAE
2010; Roubach et al. 2003; Venturieri e Bernardino 1999). Segundo Ono et al. (2004)
e Ono (2011); o pirarucu apresenta, do ponto de vista da piscicultura intensiva, uma
série de características positivas, como: rápido crescimento e tolerância ao
adensamento em ambientes tropicais; respiração aérea obrigatória, aproveitando o
ar diretamente da atmosfera, ficando independente do oxigênio dissolvido na água;
fácil adaptação ao alimento balanceado; carne branca, magra, de alta qualidade e
livre de espinhas intramusculares; elevado rendimento de filé (> 45%), superando o
rendimento dos peixes atualmente cultivados no país; elevado valor de mercado,
sobretudo no mercado internacional.
Embora nos últimos anos os estudos sobre a criação do pirarucu tenham sido
intensificados, a falta de domínio sobre a reprodução, a produção de alevinos, as
técnicas de cultivo, a nutrição e as condições gerais de saúde, ainda dificulta sua
criação e precisa ser superada (Ono et al. 2004; Ono 2005, 2011; Roubach et al.
2003).
Ono (2011) descreve que a baixa sobrevivência (10 a 20%) do pirarucu
ocorre, principalmente, na fase de alevinagem, devido às altas infestações de
parasitos. Segundo o autor, doenças em peixes de cultivo são causadas,
principalmente, pelas práticas de manejo incorretas, além de aspectos envolvendo
altas densidades de estocagem e má alimentação, que tem como principal
consequência a degradação da qualidade da água. Com isso, é desfeito o equilíbrio
da relação hospedeiro/parasito/ambiente e, consequentemente, surgem infestações
massivas, responsáveis pelas elevadas mortalidades (Ranzani-Paiva et al. 2000;
Moraes e Martins 2004; Pavanelli et al. 2008). Dentre os principais patógenos
responsáveis pelas injúrias em peixes cultivados destacam-se os monogenéticos.
Estudos sobre parasitos de pirarucu em sistemas de cultivo ainda são insipientes,
entretanto, diagnóstico realizado na Amazônia Central tem comprovado que os
monogenéticos são causadores de doenças em pirarucu por Araújo et al. (2009a,b)
e Gomes et al. (2012a).
Os monogenéticos, uma das classes dos Plateyhelminthes, são, na sua
grande maioria, ectoparasitos que se encontram nas brânquias, narinas e superfície
do corpo de peixes marinhos e de água doce (Buchmann e Bresciani 2006; Thatcher
2006; Pavanelli et al. 2008; Eiras et al. 2010; Noga 2010). Esses parasitos
3
apresentam um elevado grau de especificidade parasitária em relação ao
hospedeiro, embora algumas espécies sejam capazes de parasitar um grande
número de hospedeiros (Thatcher 2006; Pavanelli et al. 2008).
Todos os monogenéticos são hermafroditas, não necessitam de hospedeiros
intermediários e são na sua grande maioria ovíparos. Os Gyrodactylidae são
vivíparos e não passam pela fase de oncomiracídio (Thatcher 2006; Eiras et al.
2010, Noga 2010). As famílias Dactylogyridae e Gyrodactylidae são as mais
importantes, devido ao número de espécies, a vasta distribuição geográfica, e ao
impacto econômico que podem causar, não só em peixes de cultivo, mas também
em populações naturais (Thatcher 2006).
No Brasil há registro de mais 300 espécies de monogenéticos, sobretudo da
família Dactylogyridae (Thatcher 2006). Para o pirarucu são descritas quatro
espécies específicos de monogenéticos: Dawestrema cycloancistrioides Kritsky,
Boeger e Thatcher (1985); Dawestrema cycloancistrium Price e Nowlin (1967) e
Dawestrema punctatum Kritsky Boeger e Thatcher (1985) e Dawestrema sp. (Eiras
et al. 2010).
Com a expansão da aquicultura no Brasil, começam a surgir os problemas
sanitários, onde, atualmente, já são percebidos tanto em pisciculturas de grande
porte, como também nas pisciculturas familiares. Estudos do diagnóstico
epidemiológico, relativo à prevalência de parasitos de ocorrência comum em
pisciculturas têm sido realizado por diversos autores, entre outros, Tavares-Dias et
al. (2001a) registrou a ocorrência de monogenéticos, crustáceos, mixosporídeos,
Piscinoodinium pillulare e Trichodina sp. num levantamento parasitário em peixes de
"pesque-pagues" em Franca, São Paulo, Brasil; Braccini et al. (2008) a ocorrência de
monogenéticos e Trichodina sp. em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) cultivadas
em tanques-rede nos rios do Corvo e Guairacá, PR; Lizama et al. (2007) uma alta
incidência parasitária por monogenéticos e crustáceos, em peixes de três
pisciculturas no Estado de São Paulo.
Martins et al. (2000, 2002a) num diagnóstico em estabelecimentos de criação
e manutenção de peixes no estado de São Paulo, por um período de 5 e 2 anos,
respectivamente, os monogenéticos foram os parasitos mais abundantes, seguidos
dos protozoários Ichthyophthyrius multifilis e Piscinoodinium pillulare, crustáceo
Lernaea cyprinacea, tricodinídeos e mixosporídeo Henneguya piaractus. No
Nordeste brasileiro, bactérias Streptococcus dysgalactiae nos anos 90, causaram
4
mortalidade em cultivos de peixes marinhos, principalmente do gênero Seriola e da
tilápia do Nilo, O. niloticus (Figueiredo 2009a) nos anos 90; e Wissella sp.,
responsável pela septicemia hemorrágica em truta arco-íris em Oncorhynchus
mykiss (Figueiredo 2009b).
Na Amazônia, com o crescimento da aquicultura, estudos epidemiológicos e
de monitoramento para diagnósticos das infecções parasitárias têm sido realizados
(Malta et al. 2001; Varella et al. 2003; Andrade et al. 2006; Tavares-Dias et al. 2006;
Araújo et al. 2009a; França et al. 2011). Recentemente, Gomes et al. (2012a, b)
realizaram um levantamento sobre diagnóstico de enfermidades de peixes de cultivo
nas pisciculturas do estado do Amazonas e verificaram que, independente do
sistema de criação e do tamanho do empreendimento, as espécies cultivadas
apresentaram uma alta incidência parasitária, principalmente por monogenéticos.
Segundo Campos (2011), as pisciculturas brasileiras são carentes em
diagnosticar problemas sanitários em seus cultivos, pois, com raras exceções, não
existem laboratórios que possam emitir um diagnóstico rápido e recomendações
eficientes para o controle de enfermidades, principalmente em regiões mais
distantes.
Os estudos que avaliam a eficácia e os efeitos secundários de drogas
utilizadas no combate às enfermidades parasitárias, principalmente para espécies
nativas, ainda são escassos (Pavanelli et al. 2008), sendo estes descritos por Onaka
et al. (2003); Lopes (2005); Chagas et al. (2006), Affonso et al. (2009); Maciel
(2009); Silva et al. (2009a); Schalch et al. (2009); França et al. (2011); Tavares-Dias
et al. (2011). Com isso, surge a preocupação com o uso indiscriminado de produtos
químicos veterinários no controle de enfermidades, pois estes podem ser tóxicos ao
organismo, acumular resíduos químicos nos tecidos dos peixes, além da
contaminação dos ambientes aquáticos (Holmstrom et al. 2003; FAO 2010;
Figueiredo 2011).
De acordo a Agência Reguladora de Alimentos e Produtos Farmacêuticos dos
Estados Unidos da América, o uso de compostos sintéticos na aquicultura depende
de testes prévios para a definição de dosagens, evitando-se, assim, aplicações de
quimioterápicos que alterem outros elos da cadeia alimentar no ambiente aquático
(FDA 2007). No Brasil, não há uma legislação específica para o uso desses
compostos na aquicultura, com apenas um registro de produto para esta finalilidade,
o antibiótico Aquaflor* 50% Premix. É importante destacar que os produtos de uso
5
veterinário devem ter, obrigatoriamente, registro específico no Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), e o seu uso deve ser feito
respeitando a Portaria Ministerial n.º 48, de 12 de maio de 1997.
Para minimizar o uso de compostos químicos na aquicultura, surgem os
produtos alternativos, como, por exemplo, pró e pré-bióticos (Fabregat 2006),
imunoestimulantes (Chitmanat 2002; Portz 2006; Menezes et al. 2006; Affonso et al.
2007; Aride et al. 2010) e plantas com propriedades medicinais.
Há milhões de anos as plantas são utilizadas pelos homens pela importância
que estas possuem a saúde humana e para os animais. Um dos primeiros relatos
para o uso de plantas medicinais data de 2.600 a.C., para as civilizações
mesopotâmicas. Na medicina egípcia, 700 drogas foram documentadas no “Ebers
Papyrus” em 1.500 a.C. civilizações antigas que habitavam a China, Índia e Norte da
África, utilizavam plantas no tratamento de diversas doenças. A Grécia Antiga
contribuiu de forma significativa para o desenvolvimento do uso das plantas. A partir
das classificações feitas por Theophrastus (300 a.C.) naturalista conhecido como pai
da Botânica. Dioscorides, físico grego (100 d.C.), foi um dos mais importantes
representantes na ciência das drogas vegetais. Também Galeno (130-200 d.C.)
praticou e ensinou farmácia e medicina com base no uso de plantas, com cerca de
30 publicações sobre as plantas (Newman et al. 2000). Antigas civilizações do
mundo Oriental, como as culturas chinesa e hindu, são tradicionais no uso de ervas.
O conhecimento dos povos tradicionais a cerca das plantas no tratamento de
enfermidades, representa a base da fitoterapia moderna e oferece pressupostos
para pesquisas e produção de novos medicamentos pelas indústrias farmacêuticas.
No Brasil há uma vasta tradição no uso popular de plantas medicinais. Uma
justificativa para o aumento do uso de plantas medicinais é a disponibilidade de
matéria prima vegetal na extração de compostos farmacologicamente ativos ou
como precursores de medicamentos a base de plantas. As variações químicas
estruturais são por vezes inviáveis de serem reproduzidas sinteticamente no
laboratório, pela complexidade estrutural, alto custo, e ainda por apresentarem
características e efeitos diferentes quando comparado ao extrato vegetal após a
industrialização.
As pesquisas envolvendo extratos ou substâncias puras de plantas para o
controle e a prevenção de doenças de organismos aquáticos vêm demonstrando sua
eficácia em várias partes do mundo. Ekanem et al. (2004) avaliaram o efeito do
6
extrato metanólico de sementes de Piper guineense sobre parasitas monogenéticos
de Carassius auratus auratus. Liu et al. (2010) descreveram a eficácia do extrato de
sementes da Semen pharbitidis contra Dactylogyrus intermedius em Carassius
auratus. Wu et al. (2010) verificaram potencial anti-helmíntico em Radix Bupleuri
chinensis contra Dactylogyrus intermedius de Carassius auratus. Li et al. (2011)
estudaram o efeito de Chelidonium majus L de peixes ciprinídeos contra
Dactylogyrus intermedius, responsáveis por grandes prejuízos e na reprodução de
peixes ornamentais.
Figueiredo (2011) destacou a importância de alguns fitoterápicos aplicados na
aquicultura no país, tais como: goji (Lycium sp.) testado na tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus) com propriedade imunoestimulante e bactericida; alho
(Allium sativum), para a truta arco-íris (O. mykiss) e para a tilápia do Nilo, excelente
imunoestimulante, confere resistência a parasitos e estimula o apetite; alecrim
(Rosmarinus officinalis), para a tilápia do Nilo, tem efeito imunoestimulante e
bacterioestático. Martins et al. (2002b), reduziram em 95% a infestação por
monogenéticos Anacanthorus penilabiatus em pacus (P. mesopotamicus) com o uso
do alho (A. sativum) na ração. Cruz (2005) obteve 89% de efetividade no controle de
Anacanthorus penilabiatus em pacu (P. mesopotamicus) utilizando extrato aquoso
de folhas de nim (Azadirachta indica). Silva et al. (2009b) avaliaram a eficácia do
extrato aquoso de folhas secas de Terminalia catappa em juvenis de tambaqui
parasitados por monogenéticos e pelos protozoários Ichthyophthirius multifiliis e
Piscinoodinium pillulare.
Apesar destes estudos, o uso de fitoterápicos para profilaxia e tratamento de
doenças na piscicultura brasileira ainda é incipiente, principalmente por ser
considerado o país detentor da maior biodiversidade de plantas do planeta.
Uma planta da região amazônica que vem sendo estudada por suas
propriedades medicinais é a Piper aduncum da família Piperaceae, conhecida como
pimenta de macaco. Essa planta possui alto teor (2,5 a 4%) de óleo essencial, com
elevada concentração de éter fenílico dilapiol, cerca de 97% (Bernard et al. 1995;
Maia et al. 1998). Na literatura é descrito que o óleo essencial da P. aduncum
apresenta propriedades inseticida, fungicida, bactericida, acaricida, larvicida,
moluscicida e parasiticida (Nair e Burke 1990; Maia et al. 1998; Estrela et al. 2006;
Bastos e Albuquerque (2004); Fazolin et al. 2005; 2007; Lobato et al. 2007; Flores et
al. 2009) e tem sido utilizada tanto na terapia humana (Bastos 1997; Morandim et al.
7
2002; Gaia et al. 2004) quanto na medicina veterinária (Silva et al. 2009c). Em
peixes, espécie do mesmo gênero, a P. guineense possui alta eficácia no controle
de parasitas monogenéticos de goldfish (Carassius auratus auratus) (Ekanem et al.
2004). Entretanto, apesar de sua ampla utilização como fitoterápico, a eficácia da
Piper aduncum no controle de patógenos em peixes ainda não foram estudadas.
Os estudos envolvendo novos fármacos para o tratamento de patógenos em
peixes, devem, além da avaliação de sua eficácia, passar por testes de toxicidade,
tanto do organismo alvo como não-alvo, os quais podem ser realizados em
condições laboratoriais (USEPA 2002; Grisolia 2005) Em geral, durante esses
testes, são avaliadas nos organismos alterações comportamentais, fisiológicas,
bioquímicas,
histológica
e
genotóxicos
(Ferreira
2004).
Além
disso,
são
indispensáveis para regulamentar o desenvolvimento, fabricação ou liberação de
substâncias (Rand 2008).
Mudanças ambientais ou qualquer modificação que proporcione desconforto,
aos organismos podem causar estresse. Estes são induzidos a emitir respostas à
nova condição, que serão refletidas conforme a intensidade e a duração do agente
estressor (Barton 1997; Morgan e Iwama 1997; Urbinati e Carneiro 2004). As
respostas ao estresse são divididas em primárias, secundárias e terciárias
(Wedemeyer 1996; Urbinati e Carneiro 2004). As respostas primárias são mediadas
pelo sistema neuroendócrino e culminam com a liberação instantânea para a
circulação dos hormônios do estresse, catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e,
posteriormente, os corticosteroides (principalmente o cortisol). As respostas
secundárias
compreendem
os
efeitos
metabólicos,
hematológicos,
osmorregulatórios e cardiorrespiratórios mediados por esses hormônios (TavaresDias et al. 2001b; Urbinati e Carneiro 2004). As respostas terciárias afetam o animal
como
um
todo,
provocando
modificações
nos
padrões
comportamentais,
prejudicando o crescimento, o sucesso reprodutivo e diminui a resistência a doenças
(Urbinati e Carneiro 2004).
A importância dos parâmetros fisiológicos na avaliação de substâncias
naturais em organismos aquáticos tem sido demonstrada nos trabalhos de Farah et
al. (2006), testando o extrato de folhas de nim em Channa punctatus; Winkaler et al.
(2007), no extrato aquoso de folhas de neem para Prochilodus lineatus e Kavitha et
al. (2011), no extrato de sementes de Moringa oleifera em Cyprinus carpio.
8
Em vista do exposto, e pela relevância do pirarucu para a piscicultura
brasileira, pretende-se, com este trabalho, contribuir com os estudos sobre
fitoterápicos, utilizando, principalmente, plantas da biodiversidade amazônica, que
apresentem eficácia no tratamento de doenças de peixes nativos. Assim, neste
estudo, foram avaliadas a toxicidade e a eficácia da P. aduncum em pirarucus sob
condições laboratoriais.
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3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar o efeito do extrato aquoso de pimenta de macaco, Piper aduncum, no
controle de parasitos monogenéticos em juvenis de pirarucu, Arapaima gigas.
3.2 Específicos
Capítulo 1:
1) Avaliar, in vitro, a toxicidade de diferentes concentrações do extrato aquoso
da P. aduncum em monogenéticos de pirarucu e;
2) Determinar a toxicidade das concentrações do extrato aquoso da P.
aduncum em juvenis de pirarucu.
Capítulo 2:
3) Avaliar a eficácia do extrato aquoso da P. aduncum no controle de
monogenéticos parasitas das brânquias do pirarucu em banhos curtos (0,5 h) e
longos (24 h), sob condições laboratoriais e;
4) Avaliar o efeito da P. aduncum sobre as variáveis sanguíneas do pirarucu.
21
CAPITULO 1
Toxicidade do extrato aquoso da Piper aduncum L em monogenéticos e nos
parâmetros sanguíneos de pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822
RESUMO
Este estudo avaliou os efeitos tóxicos do extrato aquoso de folhas de P. aduncum L
sobre os monogenéticos (in vitro) e as respostas fisiológicas dos pirarucus expostos
a diferentes concentrações deste fitoterápico. No teste in vitro, foi avaliado o efeito
das concentrações de 40, 60, 80, 100 e 120 ml/L do extrato em monogenéticos de
brânquias de pirarucus durante três horas de exposição. Os resultados desses
testes demonstraram 100% de mortalidade dos parasitas em 100 e 120 ml/L do
extrato, após duas horas de exposição, enquanto em 80 ml/L após três horas. Para
40 e 60 ml/L do extrato, a mortalidade foi de 90% após três horas de exposição. A
partir desses resultados, as respostas fisiológicas de pirarucu foram avaliadas em
banhos com 40, 60, 80 e 100 ml/L do extrato da P. aduncum e um controle (sem
extrato), durante 24 h, sendo analisados o hematócrito (Ht), a concentração de
hemoglobina ([Hb]), o número de eritrócitos (RBC), a concentração de hemoglobina
corpuscular média (CHCM), a hemoglobina corpuscular média (HCM), o volume
corpuscular médio (VCM), a glicose e as proteínas plasmáticas totais. Foi observada
redução significativa (p<0,05) no Ht. Os neutrófilos foram diferentes nas três maiores
concentrações (60, 80 e 100 ml/L) e os eosinófilos em 40 ml/L, em relação ao
controle. A mortalidade foi de 16,6% dos pirarucus na concentração 100 ml/L. Os
resultados sugerem que concentrações abaixo de 80 ml/L do extrato de P. aduncum
podem ser utilizadas sem causar danos a homeostase fisiológica dessa espécie.
Palavras-chave: fitoterápico, parasita, peixe, toxicidade.
22
CHAPTER 1
Toxicity of aqueous extract of Piper aduncum L in monogeneans and blood
parameters of pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822
ABSTRACT
This study evaluated the toxic effects of aqueous extract of leaves of P. aduncum L
on monogeneans (in vitro) and the physiological responses of pirarucus exposed to
different concentrations of this herbal. In in vitro tests, we evaluated the effect of
concentrations of 40, 60, 80, 100 and 120 ml/L of the extract in the gills of
monogeneans pirarucus during three hours of exposure. The results of these tests
showed 100% mortality of the parasites in 100 and 120 ml/L of the extract after two
hours exposure, while 80 ml/L after three hours. To 40 to 60 ml/L of the extract, the
mortality was 90% after three hours of exposure. From these results, the
physiological responses of arapaima in baths were evaluated at 40, 60, 80 and 100
ml/L of the extract of P. aduncum and a control (without extract) for 24 h, and
analyzed the hematocrit (Ht), the hemoglobin concentration ([Hb]), the number of
erythrocytes (RBC), the mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), the
mean corpuscular hemoglobin average (MCH), the mean corpuscular volume (MCV),
glucose and total plasma proteins. A significant reduction (p<0.05) in Ht. Neutrophils
were different at the three highest concentrations (60, 80 and 100 ml/L) and in
eosinophils in 40 ml/L, compared to the control. Mortality was 16.6% pirarucus
concentration of 100 ml/L. The results suggest that concentrations below 80 ml/L of
the extract of P. aduncum can be used without adversely affecting the physiological
homeostasis of this kind.
Keywords: herbal medicine, parasite fish toxicity.
23
1. INTRODUÇÃO
O pirarucu (Arapaima gigas), a espécie mais emblemática da ictiofauna
amazônica e apesar de excelentes características para criação intensiva, ainda
apresenta uma produção em cativeiro pouco expressiva (10,4 t em 2010) se
comparada às outras espécies nativas, (Ministério da Pesca e Aquicultura-MPA,
2012). Isso se deve aos vários obstáculos relacionados à sua produção em larga
escala, sendo a baixa oferta de alevinos a mais significativa, devido à falta de
domínio sobre as técnicas de reprodução induzida (Ono 2011). Além disso, estudos
realizados pelo SEBRAE (Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas
Empresas), de 2007 a 2010, e Ono (2011) identificaram diversas dificuldades na
cadeia produtiva do pirarucu na região Norte, como mão de obra qualificada, manejo
alimentar incorreto, cuidado com os juvenis e com a qualidade de água, além de alta
incidência parasitária, sobretudo de monogenéticos, que são responsáveis pelos
baixos índices de sobrevivência (10 a 20%) de juvenis com tamanho inferior a 15 cm
(Ono 2011).
A maioria dos estudos relacionados aos parasitos de pirarucu foi realizada em
ambiente natural (Malta 1982; Kritsky et al. 1985; Thatcher 2006; Gomes et al. 2006;
Feijó et al. 2008; Santos et al. 2008; Menezes et al. 2011). Os primeiros
levantamentos parasitários em pirarucus, em ambiente de cultivo, são descritos por
Silva et al. (2008), Araújo et al. (2009a; 2009b) e Andrade et al. (2011), na Amazônia
Central. Para prevenir possíveis infestações dos peixes por patógenos em
ambientes de cultivo, as Boas Práticas de Manejo (BPM) é a forma mais
recomendada. Entretanto, em situações de enfermidades parasitárias, o tratamento,
na maioria das vezes, é feito com o uso de produtos químicos (ex. formol,
permanganato de potássio, verde de malaquita, triclorfon, sulfato de cobre
praziquantel, albendazol e mebendazol), tanto em forma de banhos quanto
adicionados à ração (Pavanelli et al. 2008; Noga 2010). Para o pirarucu, os estudos
relacionados ao tratamento de parasitos ainda são escassos, sendo descrito na
literatura o potencial anti-helmíntico do cloreto de sódio (NaCl), formalina e
mebendazol, aplicados em forma de banhos longos contra
monogenético
Dawestrema sp. (Cavero et al. 2002; Andrade et al. 2009).
O uso de compostos químicos em criações de organismos aquático tem
crescido nos últimos anos em todo mundo, com o objetivo de aumentar a produção e
evitar as doenças. Entretanto, esses compostos possuem alto poder residual e
24
podem contaminar os peixes, o homem e o ambiente (Holmstrom et al. 2003; FAO,
2010; Figueiredo 2011). Em função disso, existem várias restrições quanto ao uso
desses compostos, não somente na aquicultura, como em outros setores de
produção animal. No Brasil, o uso de qualquer fármaco de uso veterinário deve ter,
obrigatoriamente, registro específico no Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA).
Uma
alternativa
que
tem
se
mostrado
viável
na
aquicultura de alguns países é o uso de fitoterápicos que, ao contrário dos produtos
químicos, são biodegradáveis, apresentam baixa toxicidade, são de fácil acesso e
seguros para o homem e para o ambiente (Maximiano et al. 2005). Apesar disso,
existe a preocupação quanto ao uso de fitoterápicos destinados ao tratamento de
doenças parasitárias em peixes, devido ao potencial tóxico que estas substâncias
podem causar ao organismo do animal (Figueiredo 2011). Dessa forma, são
necessárias pesquisas que possam contribuir com o desenvolvimento de novos
produtos para fins preventivos e de tratamento de doenças em organismos
aquáticos.
A região amazônica é a maior fonte da biodiversidade vegetal do planeta, o
que a tornar um grande potencial para os estudos sobre fitoterápicos de interesse na
aquicultura, além do vasto conhecimento das populações tradicionais sobre o uso de
plantas medicinais (Di Stasi e Hiruma-Lima 2002). Uma planta que ocorre
naturalmente na Amazônia e que tem se mostrado bastante promissora para
diversas finalidades é a Piper aduncum L, da família Piperácea, cujo gênero possui
mais de 140 espécies (Maia et al. 1998). Seu óleo essencial tem mostrado eficácia
no controle de microrganismos de importância econômica para agricultura, por
apresentar propriedades inseticida, fungicida, bactericida, acaricida, larvicida,
moluscicida e parasiticida (Bastos 2004; Estrela et al. 2006; Fazolin et al. 2007; Silva
et al. 2007) e pelo seu uso na terapia humana (Magalhães 2010) e na medicina
veterinária (Silva et al. 2009a). Além disso, possui importância econômica e
tecnológica devido à presença de importantes precursores capazes de sintetizar
outras substâncias como alcalóides, fenilpropanoides, lignanas, neolignanas,
terpenos, pironas, amidas, amidas insaturadas como miristicina e dillapiol, derivados
de ácido benzóicos, cromenos e avonóides (Burke e Nair 1986; Orjala 1993; Parmar
et al. 1997).
Uma vez que as substâncias desta planta já foram caracterizadas, e sua
eficácia farmacológica na medicina veterinária tem sido comprovada em alguns
25
estudos, a Piper aduncum parece bastante promissora para uso na aquicultura. O
teste de toxicidade é um dos primeiros passos para o estudo da eficácia terapêutica
de fármacos contra diferentes organismos patogênicos e seus efeitos adversos nos
hospedeiros (Xie et al. 2008; Das et al. 2009; Suvetha et al. 2010; Kumar et al.
2011). Além da taxa de sobrevivência, os parâmetros sanguíneos tem sido
importante ferramenta na identificação de condições estressantes para os peixes
frente à exposição de produtos potencialmente tóxicos (Affonso et al. 2002; 2009;
Fajer-Ávila et al. 2003; Maciel 2009; Tavares-Dias et al. 2011).
Assim, este estudo teve como objetivo avaliar in vitro os efeitos tóxicos do
extrato aquoso de P. aduncum nos parasitos monogenéticos e a influência de
diferentes concentrações e tempos de exposição deste fitoterápico nas respostas
fisiológicas de pirarucu.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes
Os juvenis de pirarucu (24,9 ± 4,4 g) foram adquiridos de uma piscicultura
comercial localizada em Santarém, PA e transportados, via aérea, para a Estação
Experimental de Aquicultura da Coordenação de Tecnologia e Inovação (COTI) do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) em Manaus, AM. Durante 20
dias, os peixes foram aclimatados em tanques de polietileno com capacidade para
500 L, com fluxo contínuo de água de poço artesiano e aeração constante. Os
parâmetros físicos e químicos da água foram avaliados durante todo o experimento,
conforme item 2.6. Os peixes foram alimentados com ração comercial com 45%
proteína bruta ad libitum, quatro vezes ao dia.
2.2 Aquisição e preparo da solução estoque de P. aduncum
Folhas de P. aduncum foram coletadas nas dependências do horto da
Universidade Nilton Lins, Manaus, AM, entre 8 e 10 h, no período de dezembro de
2010 a março de 2011. As folhas foram selecionadas, lavadas e secas em estufa a
45 ± 0,5 ºC por 72 h. Após a secagem, o material foi triturado em um moinho
(Tecnal, Tipo Willy-TE 650), e mantido sob baixa temperatura (aproximadamente 10
ºC) (Prista et al. 1981), e ao abrigo da luz até a preparação dos extratos.
26
Para preparar o extrato aquoso, foram utilizados 10 g das folhas trituradas em
um litro de água destilada (10:1000 m/v) (Silva et al. 2009b). Após homogeneização
da suspensão com o auxilio de um bastão de vidro, esta foi mantida em repouso por
uma hora. Utilizou-se o um filtro de nylon para a separação das partículas vegetais.
2.3 Exposição in vitro dos monogenéticos ao extrato de P. aduncum
Para avaliar a toxicidade do extrato aquoso de P. aduncum, foram realizados
testes in vitro. Para isso, foram utilizadas cinco concentrações do extrato aquoso
(40, 60, 80, 100 e 120 ml/L) e um controle (0=sem adição do extrato). Estruturas
branquiais de três pirarucus, naturalmente parasitados, foram retiradas e seus arcos
individualizados em placas de Petri (Eiras et al. 2006). Em cada arco 20
monogenéticos foram selecionados visualmente e observados a cada 15 minutos
num estereomicroscópio da Zeiss® (Fajer-Ávila et al. 2003). Todas as concentrações
foram realizadas em duplicatas, num tempo total de exposição de três horas.
2.4 Exposição dos peixes ao extrato de P. aduncum
Após o período de aclimatação, cinco grupos com 18 peixes (24,9 ± 4,4 g)
foram distribuídos em 15 aquários de vidro com capacidade para 60 L. De acordo
com os resultados obtidos nos experimentos in vitro, descrito no ítem 2.3, foram
utilizadas as concentrações de 40, 60, 80 e 100 ml/L do extrato aquoso da P.
aduncum, acompanhado por um grupo controle (sem adição do extrato), por 24
horas, conforme determinado para testes de toxicidade aguda. Durante este período,
não houve troca de água, a oxigenação foi realizada por aeradores, e mantido o
fotoperíodo de 12 h. Todas as concentrações foram testadas em triplicata e o
bioensaio foi realizado segundo recomendações da USEPA (2002) e ABNT (2004).
Ao final das 24 horas de exposição, foram retirados três peixes de cada
aquário para coleta de sangue e posterior análise dos parâmetros fisiológicos, como
descrito no item 2.5. Durante o período experimental, foram observados e
registrados a sobrevivência e o comportamento dos peixes (perda de equilíbrio,
natação errática, frequência respiratória e alteração de coloração da pele), e
monitorada a qualidade da água dos aquários.
27
2.5 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros sanguíneos
Amostras de sangue foram coletadas, por punção da veia caudal, utilizando
seringas de 3 mL rinsadas com EDTA a (10%) e armazenadas sob refrigeração a 4
°C. O sangue total foi destinado às seguintes determinações: hematócrito (Ht), pelo
método de microhematócrito, contagem de eritrócitos (RBC) usando câmara de
Neubauer® em solução de Natt e Herrick (1952); concentração de hemoglobina
([Hb]) pelo método da cianometahemoglobina. Os índices hematimétricos, volume
corpuscular médio (VCM), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM)
e hemoglobina corpuscular média (HCM) foram calculados a partir dos valores de Ht,
RBC e [Hb], segundo Wintrobe (1934).
O plasma sanguíneo, obtido por centrifugação do sangue total, foi destinado à
análise da glicose plasmática (mg/dL) pelo método enzimático-colorimétrico de
glicose oxidase e as proteínas plasmáticas totais (PPT – g/dL) pelo método de
biureto. Essas análises foram realizadas em espectrofotômetro UV/Visível (BIOPLUS
2000).
A determinação de trombócitos totais (μL/L), leucócitos totais (μL/L) e
leucometria específica (número de cada tipo de leucocitário em μL/L) foi realizada
em extensões sanguíneas coradas com uma combinação May Grunwald-Giemsa
Wright
(Tavares-Dias
e
Moraes
2003)
e
as
contagens
totais
seguiram
recomendações de Ishikawa et al. (2008).
2.6 Monitoramento da qualidade da água
Foram determinadas, durante o experimento, as seguintes variáveis físicas e
químicas da água: oxigênio dissolvido (OD), temperatura e condutividade elétrica,
com o auxílio de um oxímetro digital da YSI, modelo 85/10, pH com pHmetro digital
da YSI, modelo 60/10. A concentração de amônia total (NH 3 + NH4+), segundo
Verdouw et al. (1978), nitrito (NO2-), gás carbônico (CO2) segundo Boyd e Tucker
(1992), sendo modificado, utilizando seringas de 10 ml, para evitar o contato das
amostras de água com o ar.
2.7 Análises estatísticas
Os parâmetros sanguíneos dos pirarucus e o monitoramento da água dos
aquários, após 24 h de exposição foram comparados mediante análise de variância
(ANOVA) de dois fatores (tempo de exposição e concentrações), seguido pelo teste
28
de Tukey, quando as diferenças foram significativas a 5% de probabilidade (Zar
1999).
3. RESULTADOS
3.1 Toxicidade do extrato de P. aduncum sobre os monogenéticos (in vitro)
Na tabela 1 está representada a mortalidade dos monogenéticos nas
diferentes concentrações de extrato de P. aduncum e tempo de exposição. As
concentrações de 100 e 120 ml/L de extrato, após 2 horas de exposição, causaram
100% de mortalidade dos monogenéticos. Após 3 horas, 100% dos monogenéticos
morreram em 80 ml/L, enquanto em 40 e 60 ml/L do extrato causou a morte de
apenas 90% dos parasitas. No grupo controle, 25% dos monogenéticos morreram
ao final do período de exposição (Tabela 1).
Tabela 1. Mortalidade in vitro de monogenéticos de brânquias de A. gigas em diferentes
concentrações do extrato aquoso de P. aduncum após 2 h e 3 h de exposição.
Mortalidade dos monogenéticos (%)
Concentrações
(ml/L)
2 horas
3 horas
0 (controle)
40
60
80
100
120
0
75
75
75
100
100
25
90
90
100
100
100
3.2 Efeitos da toxicidade aguda do extrato de P. aduncum nos parâmetros
sanguíneos de A. gigas
As alterações comportamentais foram observadas após uma hora de
exposição, nas concentrações de 40, 60 e 80 ml/L, os animais apresentaram
letargia, tanto em relação ao grupo controle quanto aos submetidos a 100 ml/L de
extrato, e não houve mortalidade. Já os animais submetidos a 100 ml/L do extrato
apresentaram hiperatividade, concentração nas proximidades da área de aeração,
aumento na frequência respiratória, seguida de exaustão e dificuldade de emersão
29
que permaneceram por, aproximadamente, três horas, com morte de três animais
(16,6%), tabela 2.
Tabela 01. Porcentagem de mortalidade e sobrevivência de A. gigas em diferentes
concentrações do extrato aquoso de P. aduncum após 12 h e 24 h de exposição.
Tempo de
exposição
12 h
24 h
Concentrações
(ml/L)
Mortalidade
(%)
Sobrevivência
(%)
Mortalidade
(%)
Sobrevivência
(%)
0
0
100
0
100
40
0
100
0
100
60
0
100
0
100
80
0
100
0
100
100
16,6
83,4
16,6
83,4
Após 24 h de exposição em diferentes concentrações do extrato de P.
aduncum, os pirarucus não demonstraram alteração nos valores dos parâmetros
sanguíneos,
exceto
para
o
hematócrito,
cujos
valores
médios
foram
significativamente diferentes (p<0,05) em 40, 60, 80 ml/L comparados ao grupo
controle. Nessas concentrações, os valores de eritrócito e concentração de
hemoglobina demonstraram uma tendência na redução dos valores (Tabela 3).
30
Tabela 3. Parâmetros sanguíneos de pirarucus, A. gigas, expostos a diferentes
concentrações do extrato aquoso de P. aduncum por 24 horas. Hb= hemoglobina, RBC=
número de eritrócitos, HCM= hemoglobina corpuscular média, CHCM= concentração de
hemoglobina corpuscular, VCM = volume corpuscular médio. Média ± desvio padrão.
Extrato de P. aduncum (ml/L)
Parâmetros
Hematócrito (%)
0
40,60±2,5a
40
31,60±4,4b
60
33,00±8,2b
80
33,80±4,2b
100
36,63±2,2ab
Hb (g/dL)
11,60±1,3
9,70±1,9
9,90±2,3
10,10±1,3
11,00±0,9
RBC(x106 cél/μL)
2,26±0,37
1,88±0,49
1,84±0,49
1,69±0,27
1,79±0,38
HCM (pg)
52,80±12,0
52,89±9,1
54,60±7,7
61,40±14,0
64,00±12,5
CHCM (%)
28,60±3,4
30,70±4,3
30,20±1,9
30,60±7,4
30,20±2,2
VCM (fL)
183,5±26,8 172,5±23,1 181,8±29,6 208,3±39,9
199,1±30,5
Glicose (mg/dL)
90,7±34,4
96,0±16,8
86,9±12,7
88,7±18,4
96,2±30,7
Proteína (g/dL)
1,86±0,31
1,63±0,18
1,59±0,27
1,72±0,26
1,91±0,26
Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes dentro do mesmo
tempo de exposição (p< 0,05).
Em relação à análise dos leucócitos e trombócitos, houve diferença
significativa apenas (p<0,05) no número de neutrófilos nas três maiores
concentrações (60, 80 e 100 ml/L) e nos eosinófilos em 40 ml/L, comparados com o
grupo controle (tabela 4).
Tabela 4. Trombometria total, leucometria total e leucometria específica absoluta (número
de células/μL) de A. gigas submetidos a diferentes tratamentos com P. aduncum após 24 h
de exposição (teste de tolerância) CGE = célula granulocítica especial. Médias ± desvio
padrão.
Concentrações (ml/L)
Parâmetros
Controle (0)
40
60
80
100
Trombócitos
96,67±19,01
81,78±7,00
93,42±20,41
80,46±7,67 100,93±16,51
Leucócitos
129,30±2,32
106,31±1,87
90,55±1,88
74,72±1,93
90,15±1,83
Linfócitos
46,82±5,27
36,55±2,36
34,65±16,44
33,23±11,2 34,57±12,22
Monócitos
57,75±20,47
48,56±6,77
47,53±5,05
36,80±9,14
51,11±6,19
Neutrófilos
22,34±5,62a
16,71±4,60a
6,029±3,98b
2,06±1,26b
3,37±2,37b
a
b
a
a
Eosinófilos
0,74±0,34
4,17±0,96
0,40±0,19
1,03±0,84
0,19±0,19a
CGE
1,63±0,51
0,312±0,47
1,94±1,02
1,59±0,51
0,89±0,88
Letras diferentes significam diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos e o grupo controle
31
3.3 Qualidade da água dos aquários
As variáveis físicas e químicas da água dos aquários, com exceção da
condutividade elétrica, não apresentaram diferenças estatísticas significativas
(p>0,05) entre as diferentes concentrações do extrato de P. aduncum durante 24 h
de exposição (Tabela 4).
Tabela 5. Parâmetros físico-químicos da água dos aquários após 24 h de exposição de
pirarucus, A. gigas a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum OD=
oxigênio dissolvido; pH= potencial hidrogeniônico, CO2= gás carbônico Média ± desvio
padrão.
Concentração de P. aduncum (ml/L)
Parâmetros
0
40
60
80
100
6,98±0,28
7,36±0,24
OD (mg/L)
7,64±0,03
7,38±0,03
7,30±0,09
Temperatura (°C)
25,63±0,05
25,80±0,00
25,80±0,10 25,87±0,06
25,90±0,17
pH
7,64±0,02
7,56±0,04
7,54±0,01
7,45±0,05
CO2 (mg/L)
10,83±1,44
10,10±0,00
10.50±0,00 10,20±0,01
10,83±1,44
Amônia (mg/L)
2,01±0,02
1,92±0,00
1,83±0,01
1,79±0,00
Nitrito (mg/L)
0,104±0,009
0,117±0,013
0,100±0,02 0,102±0,29
7,42±0,03
1,82±0,03
0,153±0,07
Significância (p< 0,05)
A condutividade elétrica da água apresentou aumento proporcional às
concentrações do extrato, cuja variação entre o controle (0= sem adição do extrato)
e 100 ml/L, após uma hora de exposição dos peixes, foi 28,1 ± 1,09 a 84,3 ± 5,0
µS.cm-¹ e em 24 horas foi 62,0 ± 2,00 a 107,3 ± 4,36 µS.cm-¹ (Figura 1).
Foi observada após uma hora do início dos experimentos, a formação de
bolhas na água dos aquários, sendo mais intensa naqueles com maiores
concentrações do extrato de P. aduncum.
32
120
b
24 h
Condutividade µS-¹
100
80
60
40
a
20
0
Controle
100
Concentrações de P. aduncum ml/L
Figura 1. Variação da condutividade elétrica da água dos aquários entre o controle e a maior
concentração do extrato durante 24 h de exposição de A. gigas. Letras diferentes significam médias
estatisticamente diferentes (p<0,05).
4. DISCUSSÃO
Uma característica na escolha de determinada planta para fins terapêuticos,
além de sua eficácia farmacológica comprovada, é ser uma espécie de baixa
toxicidade aos peixes (Maciel et al. 2002; Fonsêca 2005).
Os testes de toxicidade têm sido uma técnica utilizada para avaliar produtos
com o objetivo de estabelecer limites toleráveis pelos organismos vivos (Rand 2008).
Por meio desses testes, é possível determinar o tempo e a concentração em que o
produto testado é potencialmente prejudicial, sendo, portanto, diretamente
relacionados. Por exemplo, em altas concentrações e em curto tempo de exposição,
o produto pode ser prejudicial, e, ao contrário, baixas concentrações em tempos
longos podem produzir efeitos crônicos sub-letais ou mesmo letais durante longos
períodos (Rand 2008).
Testes in vitro são comuns em ensaios farmacológicos de substâncias
químicas, os quais contribuem com os testes de toxicidade in vivo. Ekanem et al.
(2004) avaliaram1,5 e 2,0 mg/L do extrato de sementes de P. guineense in vitro,
verificaram que estas podem causar 80 e 100% de mortalidade dos parasitas de
brânquias em Carassius auratus auratus; Sitjà-Bobadilla et al. (2006), avaliaram o
efeito da água destilada, formalina, limoseptic®, peróxido de hidrogênio (100 ppm 30 min), cloro (60 ppm - 1 H), e praziquantel (PZQ) (50 ppm - 30 min) in vitro e in
33
vivo no tratamento contra ovos, larvas e adultos de Sparicotyle chrysophrii, um
parasita de Sparus aurata L, as larvas foram mais sensíveis aos testes in vitro que
os adultos; Smith et al. (2012), testaram concentrações (1.5 μg/mL e 200 μg/mL) in
vitro de praziquantel sobre Cardicola forsteri helmintos de Thunnus maccoyii, com
respostas em menos de cinco minutos.
No presente estudo, os testes in vitro com extrato aquoso de folhas, de P.
aduncum demonstraram que esta possui atividade anti-helmíntica contra os
monogenéticos, identificados aqui como Dawestrema cycloancistrium e D.
cycloancistrioides, em brânquias de pirarucu, e que são dose e tempo-dependentes.
Uma vez que vários compostos estão presentes numa planta, e de acordo
com a caracterização química já descrita na literatura para P. aduncum, além de
outros estudos sobre o efeito antiparasitário realizados (Belzile et al. 2000; Flores et
al. 2009), é possível que a mortalidade dos parasitos tenha ocorrido pela ação dos
compostos secundários como o fenilpropanóide dilapiol ou ainda pela ação conjunta
dessa lignina e outros compostos como o sarizan e safrol, por apresentarem em
suas estruturas o grupo metilenodioxidofenil (Mukerjee et al. 1979; e Bernard et al.
1995), considerados importantes inibidores de monooxigenases dependentes de
citrocromo P450 (Omura e Sato 1964). Enzimas microssomais (citocromo P450) são
responsáveis
pelas
reações
de
biotransformação,
ou
desintoxicação
de
xenobióticos, quando inibidas aumentam o efeito tóxico dos compostos ativos.
Dessa forma, acredita-se que no presente estudo a inibição parasitária tenha
ocorrido por esses mesmos princípios.
Os testes in vitro são importantes indicadores e da eficácia de fármacos
contra determinado patógeno. Entretanto, estes não são suficientes para definir a
eficácia do produto em peixes (Figueiredo 2011). O fato de determinada substância
apresentar efeito parasiticida, bactericida e outros, não comprova que esta será
absorvida pelo organismo do animal, atóxica para o peixe chegará ao órgão
infectado e auxiliará na eliminação do patógeno (Figueiredo 2011). Isso porque,
existem algumas barreiras naturais, como por exemplo, a produção de muco pelos
peixes, e fatores abióticos.
Testes de toxicidade e efeitos tóxicos devem ser realizados quando se estuda
a eficácia de uma nova planta. Neste caso, o animal deve estar em perfeitas
condições de saúde para que seja avaliado se a planta causa ou não efeitos
deletérios (Figueiredo 2011).
34
Hematologia, bioquímica e histologia são áreas da fisiologia amplamente
utilizadas como importantes ferramentas para auxiliar na avaliação e diagnóstico do
estado de saúde de organismos aquáticos em bioensaios realizados com
substâncias naturais (Osman et al. 2010; Hirazawa et al. 2011). Isto porque, sob
condições de estresse, os animais podem alterar estes parâmetros como uma
resposta para manter a homeostase fisiológica. Esta adaptação é tolerada por certo
tempo e, se persistir, pode levar a exaustão e até a morte do animal (WendeelarBonga1997; Barton 2002).
Como resposta ao estresse, as alterações nos parâmetros hematológicos
podem indicar a ocorrência de hemoconcentração ou hemodiluição (Houston et al.
1996). A hemoconcentração pode ser uma estrtégia para aumentar a capacidade de
transporte de oxigênio do sangue sob situações de elevada demanda de energia
(Carvalho e Fernandes 2006; Trenzado et al. 2008). Entretanto, agentes estressores
que podem comprometer a absorção do ferro, a malformação ou hemólise dos
eritrócitos, a inibição da síntese de hemoglobina, a competição pelo sítio de ligação
do oxigênio podem causar uma hemodiluição ou anemia nos peixes, dessa forma,
reduzindo a capacidade de transporte de oxigênio do sangue (Heath 1995; TavaresDias e Moraes 2004, Das et al. 2009).
No presente estudo, os efeitos de diferentes concentrações do extrato de P.
aduncum em juvenis de pirarucus induziram alterações nos valores de hematócrito
em relação ao controle. Tais alterações pode ser uma consequência na diminuição
do número e não no tamanho dos eritrócitos, como verificados pelos valores de RBC
e VCM (Tabela 3). Por outro lado, a diminuição na concentração de Hb nas
concentrações mais baixas da P. aduncum (40 e 60 ml/L) é, embora não acentuada,
uma resposta à hemólise dos eritrócitos. Entretanto, em altas concentrações do
fitoterápico, parece ocorrer à síntese da Hb, como pode ser sugerido pelos valores
de HCM e CHCM. Apesar das alterações citadas, estas não devem ter sido a causa
da mortalidade de 16,6% dos peixes em 100 ml/L do extrato de P. aduncum.
Alterações nos parâmetros hematológicos causadas pelo efeito de extratos
vegetais tem sido descritas pos diversos autores, Kavitha et al. (2011) estudaram o
efeito tóxico do extrato de Moringa olerifera, em Cyprinus carpio, cujos valores de
RBC, Hb e Ht diminuiram, provavelmente, devido a hemólise dos eritrócitos causada
pelo extrato da planta. Entretanto, Osman et al. (2010), avaliaram o efeito do extrato
de folhas Cydonia oblonga Miller na diminuição do efeito da radiação ultravioleta em
35
Clarias gariepinus, o extrato foi capaz de impedir a destruição da hemoglobina dos
peixes exposto a UVB, devido a ação de polifenóis contido na planta que podem
interagir com a bicamada da membrana dos eritrocitos, diminuindo a fluidez e a
difusão de radicais livres (Chaudhuri et al. 2007), enquanto os peixes expostos a
UVB somente, sofreram redução de RBC, Hct e Hb. Ao contrário, o extrato de
Nigella sativa sobre a resposta imune Oncorhynchus mykiss causou aumento Hct
(Dorucu et al. 2009).
Alterações nos leucócitos e trombócitos sanguíneos podem ser utilizadas
como ferramenta para avaliar o estado de saúde dos peixes frente a fatores
ambientais, visto que estas alterações ocorrem em resposta aos danos causados
por agentes agressores (Tavares-Dias et al. 2011). Os resultados encontrados neste
estudo mostraram redução no número de neutrófilos nos peixes nas maiores
concentrações do extrato e aumento dos eosinófilos na menor concentração testada.
Os neutrófilos são a primeira linha de defesa contra patógenos e são as primeiras
células a chegarem nos locais de inflamação (Campbell 2004). Em Oreochromis
mossambicus ocorre monocitopenia e a neutropenia devidas à elevada migração e à
atividade fagocítica nas brânquias, fígado e rins, que foram danificados pelo cobre
(Nussey et al. 1995). Essa pode ter sido, a causa da neutropenia neste estudo,
devido aos grandes danos nos tecidos branquiais causados por monogenéticos. Em
mamíferos a produção de eosinófilos está relacionada à doenças alérgicas e
parasitárias.
Em peixes as funções dos eosinófilos ainda não é bem definida,
entretanto em Piractus mesopotamicus (Ranzani-Paiva et al. 1998) Colossoma
macropomum (Ranzani-Paiva et al. 1998) a presença dessas células foi relacionada
a doenças.
A hiperglicemia é outro importante indicador de estresse em peixes em
condicões de campo, pois ajuda a suprir o aumento da demanda energética do
organismo (Jeney et al. 1997; Mazeaud et al. 1977; Benfey e Biron 2000). Esse
parâmetro tem contribuído para avaliar os efeitos adversos de diversos fármacos em
peixes (Borges et al. 2007; Winkaler et al. 2007; Hori et al. 2008; Maciel 2009;
Kavitha et al. 2011). Neste trabalho, os efeitos da P. aduncum não foram suficientes
para aumentar a demanda por glicose o que contribui com a suposição que as
concentrações usadas nos bioensaios são de baixa toxicidade. Esses dados são
corroborados com os valores de proteínas totais obtidos nas diferentes
concentrações testadas.
36
Além da eficácia no tratamento contra patógenos, a P. aduncum tem sido
citada na literatura pelo seu poder calmante, devido a presença de alcaloides que
atuam no sistema nervoso central (Parmar et al. 1997; Lorenzi e Matos 2002). A
análise comportamental confirma que essa planta diminuiu os movimentos dos
peixes, os quais se tornaram mais lentos durante as 24 h de experimento nas
diferentes concentrações testadas. Em geral, os calmantes, além de outros efeitos,
baixam o tônus muscular e altera a coordenação de movimentos. Em 100 ml/L do
extrato aquoso da P. aduncum, esses podem ter sido os sintomas que levaram a
mortalidade de tres indivíduos nas primeiras três horas de experimentos. Segundo
Honczark e Inoue (2009), banhos anestésicos em peixes pulmonados levam ao risco
de afogamento do animal, pois sua absorção, ainda que pouca possa ser suficiente
para impedir que este chegue até a superfície para respirar. Novas pesquisas sobre
as respostas metabólicas do pirarucu podem contribuir para o entendimento sobre o
possível efeito anestésico da P. aduncum.
A qualidade da água dos aquários experimentais, no presente trabalho,
esteve dentro dos limites considerados adequados para peixes da Amazônia
(Kubitza 2003; Ono 2011). Entretanto, durante todo o experimento foram observadas
alterações na condutividade elétrica da água influenciadas, principalmente, pelas
diferentes concentrações de extrato de P. aduncum. Estudos realizados com extrato
de folhas de neem, (Azadirachta indica) em Proclodus lineatus, também
apresentaram aumento significativo na condutividade elétrica da água, com variação
de 162.0 a 1226 µS.cm-¹ (Winkaler et al. 2007).
Os valores de condutividade elétrica da água estão relacionados à presença
de íons dissolvidos na água, entre outros, cálcio, magnésio, potássio, sódio,
carbonato, sulfato, cloreto e o íon amônio, quando encontrado em elevadas
concentrações (Esteves 1998). Nas plantas, parte desses minerais, considerados
macronutrientes (nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio, sódio), adquiridos pelo
processo de nutrição mineral, são encontrados em diferentes concentrações
(Epstein e Bloom 2004). Assim, supõe-se que, o aumento dos valores da
condutividade relacionados ao extrato observados neste trabalho, tenha ocorrido
pelo aumento na concentração desses íons na água. No controle, supõe-se que o
aumento observado, embora menor, tenha ocorrido perda de íons das brânquias
para a água, em função da hiperatividade apresentada pelos peixes no início dos
experimentos.
37
Quanto à formação de bolhas na superfície da água dos aquários, estas
podem ser atribuídas a compostos derivados do metabolismo secundários da P.
aduncum, denominado saponinas. Estas substâncias estão relacionadas com o
sistema de defesa das plantas (Wina et al. 2005). Quando presentes em meio
aquoso apresentam ação detergentes com a formação de espumas na superfície da
água.
5. CONCLUSÃO
As concentrações acima de 80 ml/L do extrato de P. aduncum, testadas neste
estudo, possuem alta toxicidade capaz de matar parasitos monogenéticos
(Dawestrema cycloancistrium e D. cycloancistrioides) de pirarucu in vitro. Entetanto,
concentrações abaixo de 80 ml/L não comprometeram a homeostase fisiológica
desta espécie em 24 h de exposição.
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49
CAPITULO 2
Efeito do extrato aquoso da Piper aduncum L, no controle de monogenéticos
em pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822
RESUMO
O uso de produtos químicos no controle de parasitas na aquicultura pode causar
resistência imunológica nos peixes, tornando-os mais patogênicos, além de
prejudicar a saúde do homem e do ambiente. Uma alternativa é o uso de produtos
naturais, que comparados aos quimioterápicos, são biodegradáveis e de baixa
toxicidade. Este trabalho teve como objetivo avaliara a eficácia do fitoterápico Piper
aduncum L, uma planta de ampla distribuição nos trópicos, sobre os monogenéticos
de pirarucu. Para isso, foram testadas três concentrações do extrato aquoso de P.
aduncum 40, 60 e 80 ml/L e o controle (sem o fitoterápico), em banhos curtos (0,5 h)
e longos (24 h). Além da carga parasitária, foram avaliados os parâmetros
indicadores de estresse: hematócrito, número de eritrócitos, concentração de
hemoglobina, índices hematimétricos, glicose e proteína total plasmática dos peixes
dos diferentes tratamentos. Os resultados demonstraram que não houve diferença
significativa na redução da carga parasitária dos peixes expostos em banhos por 0,5
horas e houve aumento da hemoglobina [Hb] no tratamento 40 ml/L. No banho longo
(24 h), todas as concentrações apresentaram redução da carga parasitária,
entretanto o tratamento com 80 ml/L proporcionou o melhor resultado com 80,16%
de eficácia. As diferentes concentrações de extrato aquoso de P. aduncum em
banhos curtos (0,5) e longos (24 h) apresentou uma tendência na redução dos
valores de Ht e RBC. Ao contrário, [Hb], HCM e CHCM e glicose plasmática
demonstraram uma tendência na elevação de seus valores em 0,5 h, e em 24 h de
exposição. Os resultados indicaram que as maiores concentrações de P. aduncum
testadas causaram maiores alterações nos índices hematológicos, embora as
eficácias obtidas tenham sido altas.
Palavras-chave: Fitoterápico, cultivo, parasitas, peixe.
50
CHAPTER 2
Effect of aqueous extract of Piper aduncum L in controlling monogeneans in
pirarucu, Arapaima gigas Schinz 1822
ABSTRACT
The use of chemicals to control pests in aquaculture can cause immunological
resistance in fish, making them more pathogenic, and harming human health and the
environment. An alternative is the use of natural products that, compared to
chemotherapy, are biodegradable and with low toxicity. This study aimed to assess
the efficacy of herbal Piper aduncum L, a plant widely distributed in the tropics, on
monogeneans pirarucu. For this, three concentrations of aqueous extract of P.
aduncum were tested: 40, 60 and 80 ml/L and the control (without the
phytotherapeutic) in short (0.5 h) and long (24 h) baths. Besides the parasitic load,
the stress indicators were evaluated: hematocrit, number of erythrocytes, hemoglobin
concentration, erythrocyte indices, glucose and total plasma protein fish of different
treatments. The results showed no significant difference in reducing the parasite load
of fish exposed in baths for 0.5 hours and increased hemoglobin [Hb] in the treatment
40 ml/L. In long bath (24 h), all concentrations had reduced parasite burden, however
treatment with 80 ml/L provided the best result with 80.16% efficiency. The different
concentrations of aqueous extract of P. aduncum in short baths (0,5) and long (24 h)
showed a trend in the reduction of hematocrit and RBC values. Rather, [Hb], MCH
and MCHC and plasma glucose showed a trend in the increase of their values at 0.5
h, and 24 h of exposure. The results indicated that the highest concentrations of P.
aduncum tested caused major changes in hematological indices, although the
efficiencies obtained were high.
Keywords: Herbal, farming, pests, fish.
51
1. INTRODUÇÃO
A criação do pirarucu, apesar do grande potencial para a aquicultura
brasileira, têm sido pouco expressiva, cuja produção em 2010 foi cerca de 10,4 t
(Ministério da Pesca e Aquicultura-MPA 2012). A primeira grande barreira para a
produção comercial dessa espécie é a falta de domínio de técnicas de reprodução
induzida, onde a oferta de alevinos depende da desova natural, que pode alcançar
de 3.000 a 5.000 espécimes (Ono 2011). Apesar desse número, apenas 10 a 20%
sobrevivem, principalmente devido as práticas inadequadas, que vão desde o
momento da retirada dos alevinos dos pais, às condições inadequadas de qualidade
da água, treinamento alimentar, má nutrição, alta infestação de parasitos,
principalmente por monogenéticos (Araújo et al. 2009a; Ono 2011). Desde os
primeiros dias de vida, o pirarucu é susceptível a ação dos monogenéticos,
aumentando a carga parasitária com o crescimento do animal (Araújo et al. 2009a).
Os monogenéticos (Filo Platyhelminthes, Classe Monogenoidea), geralmente são
ectoparasitos que habitam as brânquias, pele e nadadeiras do hospedeiro. São
considerados os mais importantes parasitos para a piscicultura, por apresentarem
alta especificidade parasitária, ciclo monóxeno e fácil transmissão (Pavanelli et al.
2008). A intensidade das lesões provocadas por estes parasitos depende do número
de parasitos, da estrutura afetada, da idade e dos fatores genéticos do hospedeiro
(Thatcher 2006; Pavanelli et al. 2008; Woo 2006; Noga 2010). Nas brânquias, esses
parasitas podem causar hipersecreção de muco, hiperplasia celular e fusão de
filamentos das lamelas e no tegumento, as lesões podem ser pouco acentuadas.
Entretanto, os ferimentos causados pelas estruturas de fixação (haptor) facilitam a
entrada de patógenos secundários, como fungos e bactérias (Pavanelli et al. 2008).
Existem vários fármacos descritos na literatura para tratamento de
monogenéticos, dentre eles: albendazol; levamisol; praziquantel (Onaka et al. 2003;
Maciel 2009; Schalch et al. 2009); formalina (Fajer-Ávila et al. 2003) peróxido de
hidrogênio (Mansell et al. 2005); cloreto de sódio e formalina (Silva et al. 2009a);
sulfato de cobre (CuSO4) (Tavares-Dias et al. 2011). Atualmente, o uso desses e de
outros quimioterápicos utilizados no controle de monogenéticos tem sido realizado
de forma incorreta e empírica, visto que não existe uma legislação regulamentadora
no Brasil para registro desses produtos na aquicultura, causando vários prejuízos,
como aumento da resistência dos parasitos aos fármacos, resíduos nos tecidos dos
peixes, contaminação do ambiente aquático e do homem (Campos 2005; Maximiano
52
et al. 2005; FAO 2010). Com isso, surge a necessidade de pesquisas que possam
desenvolver métodos alternativos para o tratamento de enfermidades de peixes na
piscicultura, como o uso de fitoterápicos, que, comparados aos quimioterápicos,
possuem baixo custo, diminui a contaminação ambiental e é seguro ao homem
(Chagas 2004).
Na literatura são descritos os efeitos do uso de alguns fitoterápicos no
controle de doenças de peixes na piscicultura brasileira (Martins et al. 2002;
Winkaler et al. 2005; Cruz 2005; Silva et al. 2009b; Fujimoto et al. 2012). Entretanto,
são necessários mais estudos utilizando, principalmente, plantas da biodiversidade
amazônica, que, apesar da sua potencialidade, ainda é pouco explorada. Alguns
estudos tem avaliado a eficácia da Piperaceae Piper aduncum L, conhecida como
pimenta de macaco, uma planta nativa da região amazônica que possui princípio
ativo contra patógenos de importância econômica na agricultura (Bastos 2004;
Estrela et al. 2006; Fazolin et al. 2007; Silva et al. 2007), na medicina humana
(Magalhães 2010) e na medicina veterinária (Silva 2008). Apresenta alto teor de óleo
essencial (2,5 a 4%), sendo seu componente majoritário o dilapiol (75 a 95 %).
Baseada nas informações já existentes sobre a potencialidade farmacológica
desta planta e ainda para contribuir com os avanços sobre os estudos de novos
produtos fitoterápicos, este trabalho avaliou a eficácia da P. aduncum no controle de
monogenéticos de juvenis de pirarucu, naturalmente parasitados, e seus efeitos nas
respostas fisiológicas dos peixes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Aquisição e aclimatação dos peixes
Foram utilizados 144 juvenis de pirarucu com 24,9 ± 4,4 g, provenientes de
uma piscicultura comercial localizada no município de Santarém, PA. Após o
transporte, os peixes foram aclimatados por 20 dias em tanques de polietileno com
capacidade para 500 L de água, abastecido com água de poço artesiano, com fluxo
contínuo e aeração constante. Os peixes foram alimentados com ração comercial
extrusada (45% proteína bruta) ad libitum, quatro vezes ao dia.
Durante este período, amostras de muco foram retiradas dos peixes, para
verificar a presença de parasitos. Para isso, utilizou-se a técnica de raspado com o
auxílio de lâminas e lamínulas no sentido ântero-posterior da superfície externa e
53
das estruturas branquiais (Eiras et al. 2006), onde foi constatada a presença de
parasitos monogenéticos em 100% dos peixes examinados.
2.2 Aquisição e preparação da solução estoque de P. aduncum
Folhas de P. aduncum foram coletadas nas dependências do horto da
Universidade Nilton Lins, Manaus, AM, entre 8 e 10 h, no período de dezembro de
2010 a março de 2011. As folhas foram selecionadas, lavadas e secas em estufa a
45 ± 0,5 ºC por 72 h. Após a secagem, o material foi triturado em um moinho
(Tecnal, Tipo Willy-TE 650), e mantido sob baixas temperaturas (aproximadamente
10 ºC) (Prista et al. 1981), e ao abrigo da luz.
Para elaborar o extrato aquoso foram utilizadas 10 g de folhas trituradas em um litro
de água destilada (10:1000 m/v) (Silva et al. 2009b). Em seguida, realizou-se a
homogeneização da suspensão com o auxilio de um bastão de vidro, seguida de
repouso por uma hora. Após isso, foram filtradas com um filtro de nylon para a
separação das partículas vegetais.
2.3 Banhos com a P. aduncum
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, o qual consistiu de
quatro tratamentos: 0 (controle), 40, 60 e 80 ml/L de extrato aquoso da P. aduncum ,
com seis peixes em cada unidade experimental, totalizando 12 aquários com
capacidade de 60 litros. Durante os banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h), não houve
troca de água e a oxigenação foi mantida por aeradores. As concentrações testadas
foram estimadas pelos resultados obtidos nos testes de toxicidade in vivo, onde foi
avaliada a tolerância do pirarucu ao extrato aquoso, e in vitro, com o uso de
parasitos monogenéticos (capítulo I). Todas as concentrações foram testadas em
triplicata e o bioensaio realizado segundo recomendações da USEPA (2002) e
ABNT (2004).
2.4 Coleta de sangue e determinação dos parâmetros hematológicos
Amostras de sangue foram coletadas, por punção da veia caudal, utilizando
seringas de 3 mL rinsadas com EDTA a (10%) e armazenadas sob refrigeração a 4
°C. O sangue total foi destinado à determinação do hematócrito (Ht /%), pelo método
de microhematócrito; contagem de eritrócitos (RBC-eritrócitos/µL) usando uma
câmara de Neubauer® em solução de Natt e Herrick (1952) e concentração de
54
hemoglobina ([Hb]-g/dl) pelo método colorimétrico da cianometahemoglobina. Os
índices hematimétricos-volume corpuscular médio (VCM-fL), concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM-%) e hemoglobina corpuscular média
(HCM-pg) foram calculados a partir dos valores de Ht, RBC e [Hb], segundo
Wintrobe (1934).
O plasma sanguíneo, obtido por centrifugação do sangue total, foi destinado à
análise da glicose plasmática (mg/dL) pelo método enzimático-colorimétrico de
glicose oxidase e as proteínas plasmáticas totais (PPT–g/dL) pelo método de
biureto. Essas análises foram realizadas em espectrofotômetro UV/Visível (BIOPLUS
2000).
2.5 Análises parasitológicas e eficácia do tratamento
Após a coleta de sangue, cada peixe foi morto por concussão cerebral de
acordo com recomendações da AVMA (2007), para retirada das brânquias, e, em
seguida, acondicionadas em frascos contendo formalina 5% para fixação das
amostras para análises posteriores (Eiras et al. 2006). A contagem do número total
de parasitos monogenéticos por peixe foi realizada em placa de Petri com auxílio de
um estereomicroscópio (Zeis®).
Para identificação das espécies, foram selecionados 100 espécimes de
monogenéticos, e identificados seguindo as instruções de Kritsky (1985) e Thatcher
(2006), tendo como principais estruturas de identificação o haptor e o complexo
copulatório, a partir da técnica desenvolvida por Lim, (2003 apud Eiras et al. 2006).
Os índices parasitários foram calculados de acordo com Bush et al. (1997). A
estimativa da porcentagem de eficácia dos tratamentos foi calculada segundo
Martins et al. (2001) e Onaka et al. (2003), utilizando a expressão matemática:
Eficácia = (média do n° de parasitos do grupo controle – média do n° de parasitos do
grupo tratado) x 100 / média do n° de parasitos do grupo controle.
2.6 Monitoramento da qualidade da água
Foram determinadas, durante o experimento, as seguintes variáveis físicas e
químicas da água: oxigênio dissolvido (OD), temperatura (ºC) condutividade elétrica
(µS) e pH, utilizando sondas multiparamétricas da YSI. As concentrações de amônia
total (NH3 + NH4+) (mg/L) e nitrito (NO2-) (mg/L) pelos métodos colorimétricos de
Verdouw et al. (1978) e Boyd e Tucker (1992) respectivamente. Alcalinidade total,
55
dureza total (CaCO3/L) (mg) foram analisadas por titulação descrita por Boyd e
Tucker (1992) e o gás carbônico (mg/L) segundo Boyd e Tucker (1992) modificado,
utilizando seringas de 10 ml, para evitar o contato das amostras de água com o ar.
2.7 Análises estatísticas
Os resultados de carga parasitária dos peixes, variáveis físicas e químicas da
água e parâmetros sanguíneos foram analisados pela análise de variância (ANOVA)
com medidas repetidas no tempo, seguido pelo teste de Tukey, quando as
diferenças foram significativas a 5% de probabilidade (Zar 1999).
3. RESULTADOS
Os resultados obtidos das variáveis físicas e químicas da água dos aquários,
com exceção da condutividade elétrica, não apresentaram diferenças significativas
(p>0,05) em relação ao grupo controle (sem adição do extrato) (Tabelas 1 e 2).
Entretanto, foi observado aumento significativo (p<0,05) da condutividade elétrica da
água com a adição do extrato na água, após 0,5 h e 24 h de exposição. Nos banhos
curtos (0,5 h) a variação entre o controle (sem adição do extrato) e a maior
concentração do extrato (80 ml/L), foi 35,2 ± 0,55 e 85,7 ± 3,97 µS.cm -1
respectivamente (Figura 1). Em 24 h (banhos longos) a variação foi: 36,02 ± 7,90 e
68,50 ± 12,11 µS.cm-1, entre o controle e 80 ml/L, respectivamente (Figura 1).
180
Condutividade µS-¹
160
140
24 h
b
0,5 h
120
b
100
80
60
40
a
a
20
0
Controle
80
Concentrações de P. aduncum ml/L
Figura 1. Variação da condutividade elétrica da água dos aquários entre o controle e a maior
concentração do extrato durante 0,5 e 24 h de exposição de A. gigas. Letras diferentes significam
médias estatisticamente diferentes (p<0,05).
56
Tabela 1. Variáveis físicas e químicas da água dos aquários, após 0,5 h de exposição de A.
gigas a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum. OD= oxigênio
dissolvido; pH= potencial hidrogeniônico; CO2= gás carbônico; AT=alcalinidade total; DT=
dureza total; AT= amônia total. Média ± desvio padrão.
Concentrações de P. aduncum (ml/L)
Variáveis
OD (mg/L)
Controle
7,14±0,07
40
7,09±0,04
60
7,15±0,13
80
7,12±0,12
Temperatura (°C)
25,43±0,4
25,77±0,2
25,43±0,5
25,67±0,5
pH
6,16±0,19
6,36±0,16
6,19±0,29
6,25±0,28
CO2 (mg/L)
10,16±0,28
10,8±1,4
11,67±1,4
10,83±1,4
AT (mg CaCO3/L)
1,03±0,12
1,15±0,11
1,35±0,16
1,32±0,23
DT(mg CaCO3/L)
0,73±0,28
0,74±0,06
0,7±0,09
0,79±0,05
AT (mg/L)
2,01±0,65
1,53±0,11
1,79±0,31
1,68±0,42
0,020±0,01
0,19±0,30
0,18±0,10
0,018±0,03
Nitrito (mg/L)
Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes (p< 0,05).
Em relação às variáveis sanguíneas, no banho curto (0,5 h), somente a
concentração de hemoglobina em 40 ml/L do extrato de P. aduncum foi
significativamente maior (p<0,05) em relação ao controle (Tabela 3).
Tabela 2. Variáveis físico-químicas da água dos aquários, após 24 h (banho longo) de
exposição de A. gigas a diferentes concentrações do extrato aquoso de P. aduncum. OD=
oxigênio dissolvido; pH= potencial hidrogeniônico; AT=alcalinidade total; DT= dureza total;
AT= amônia total. Média ± desvio padrão.
Concentrações de P. aduncum (ml/L)
Parâmetros
OD (mg/L)
Controle
6,64±0,09
40
6,61±0,16
60
6,54±0,00
80
6,47±0,04
Temperatura (°C)
26,76±0,06
27,11±0,06
27,01±0,12
26,95±0,1
pH
7,01±0,07
6,72±0,055
6,60±0,03
6,54±0,02
CO2 (mg/L)
15,83±1,44
15,00±0,25
16,66±1,44
17,50±1,25
AT (mgCaCO3/L)
1,00±0,03
1,07±0,06
1,25±0,00
1,28±0,075
DT (mg CaCO3/L)
0,70±0,00
0,77±0,00
0,86±0,03
0,99±0,01
AT (mg/L)
1,42±0,36
0,91±0,47
0,86±1,0
0,99±0,19
0,0155±0,15
0,108±0,14
0,069±0,06
0,05±0,01
Nitrito (mg/L)
57
Tabela 3. Parâmetros sanguíneos de A. gigas expostos a diferentes concentrações do
extrato aquoso de P. aduncum por 0,5 horas. RBC= eritrócitos, [Hb]= hemoglobina, HCM=
Hemoglobina corpuscular média, CHCM= concentração de hemoglobina corpuscular média,
VCM= volume corpuscular médio, PT= proteína total. Média ± desvio padrão.
Concentração de extrato de P. aduncum (ml/L)
Parâmetros
0 (controle)
40
60
80
Ht (%)
35,33±5,05
35,83±2,82
33,94±6,16
33,61±5,41
RBC(x106 cl/μL)
2,13±0,21
1,90±0,39
1,85±0,46
1,95±0,53
10,8172±1,94a
11,39± 1,59b
11,01±1,82ab
10,47±1,10
HCM
50,89±8,7
60,72±5,82
61,19±9,04
57,37±14
CHCM (%)
30,56±2,49
31,79±3,74
31,71±1,18
30,77±3,08
VCM (fL)
166,52±24,09
193,94±32,29
193,24±30,79
187,71±58,67
Glicose(mg/dL)
56,43±27,06
61,09±20,71
59,53±12,01
63,96±11,47
1,57±0,27
1,53±0,23
1,48±0,25
1,52±0,30
[Hb] (g/dL)
PT (g/dL)
Letras diferentes na mesma linha indicam médias significativamente diferentes (p< 0,05).
Nos banhos longos (24 h), nenhum dos parâmetros sanguíneos analisados
apresentou diferença significativa (Tabela 4). Entretanto, pode-se observar uma
tendência na redução nos valores de hematócrito e RBC nos peixes expostos aos
banhos com extrato de P. aduncum.
Tabela 4. Parâmetros sanguíneos de A. gigas expostos a diferentes concentrações do
extrato aquoso de P. aduncum por 24 horas. RBC= eritrócitos, [Hb]= hemoglobina, HCM=
Hemoglobina corpuscular média, CHCM= concentração de hemoglobina corpuscular média,
VCM= volume corpuscular médio, PT= proteína total, CT= colesterol total. Média ± desvio
padrão.
Concentração de extrato de P. aduncum (ml/L)
Parâmetros
Hematócrito (%)
0 (controle)
37,70±7,75
40
31,95±4,91
60
29,30±8,13
80
30,72±9,50
RBC (x106cél/µL)
1,73±0,45
1,45±0,37
1,35±0,65
1,39±0,41
[Hb] (g/dL)
9,30±2,57
8,39±1,35
8,84±2,55
9,88±2,46
HCM
54,15±9,20
64,33±10,65
55,99±16,56
67,75±13,75
CHCM (%)
26,22±3,01
26,074±3,07
33,22±9,5
33,15±6,59
VCM (fL)
208,41±39,59
249,56±48,36
170,59±38,39
210,32±53,10
Glicose (mg/dL)
49,71±18,62
58,21±22,20
56,67±20,76
64,38±7,82
1,53±0,26
1,41±0,11
1,47±0,19
1,56±0,32
PT (g/dL)
58
O resultado da atividade anti-helmíntica do extrato aquoso de pimenta de
macaco em banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h) para pirarucus infectados por
monogenéticos está representado na tabela 6. Neste estudo, foram identificadas
duas espécies de monogenéticos para pirarucu, Dawestrema cycloancistrium (58%)
e Dawestrema cycloancistrioides (42%). No banho curto (0,5 h), não houve diferença
significativa (p>0,05) entre os tratamentos e a maior concentração do extrato
aquoso, 80 ml/L, apresentou uma baixa eficácia (12,98%) na redução da carga
parasitária em relação ao grupo controle. Não foram observadas mortalidades e nem
sinais de intoxicação nos exemplares expostos aos diferentes tratamentos.
Tabela 6. Porcentagem de eficácia do extrato aquoso de P. aduncum em banhos curtos (0,5
h) e longos (24 h) contra monogenóides de Arapaima gigas.
Tratamento
Eficácia (%)
Eficácia (%)
0,5 h
24 h
Controle
_
_
40 ml/L
9,12
49,47
60 ml/L
24,4
58,4
80 ml/L
12,98
80,16
No banho longo (24 h), o melhor resultado ocorreu em 80 ml/L, com redução
significativa (p<0,05) da carga parasitária em relação ao grupo controle, tendo
80,16% de eficácia. Foi observada uma diminuição significativa (p<0,05) na carga
parasitária dos peixes expostos a diferentes concentrações do extrato aquoso de P.
aduncum em relação ao controle (Figura 1). Os valores médios da intensidade de
parasitos nos tratamentos controle (sem adição do extrato) e 40, 60 e 80 ml/L do
extrato de P. aduncum foram: 346,87 ± 62,7, 148,5 ± 55,7, 174,8 ± 47,1e 68,87 ±
31,16 respectivamente (Figura 1).
59
450
400
a
Abundância
Abundância
350
300
250
b
200
b
150
c
100
50
0
0
40
60
80
Extrato de P.deaduncam
(mg/L)
Concentrações
P. aduncum
ml/L
Figura 2. Abundância de monogenéticos em Arapaima gigas após banhos longos (24 h)
com diferentes concentrações do extrato aquoso de Piper aduncum (p<0,05). 0= controle
(sem o extrato aquoso). Letras diferentes significam diferenças significativas entre as
médias (p<0,05).
4. DISCUSSÃO
Em experimentos de bioensaios, o acompanhamento da qualidade da água,
principalmente em testes de toxicidade, tem sido uma prática comum, devido a
influência das variáveis físicas e químicas da água sobre a biodisponibilidade e
absorção do produto testado (Affonso et al. 2009; Tavares-Dias et al. 2011). A
qualidade da água dos aquários experimentais, no presente trabalho, esteve dentro
dos limites considerados adequados para peixes da Amazônia (Kubitza 2003; Ono
2011). Apesar disto, o aumento da condutividade elétrica da água, observado nos
banhos curtos (0,5 h) e longos (24 h), vem corroborar com os resultados obtidos no
capítulo I, onde pirarucus foram exposto por 24 h a diferentes concentrações do
extrato de P. aduncum (0, 40, 60, 80 e 100 ml/L), cujos valores estiveram entre 28,1
± 1,09 a 107,3 ± 4,36 µS.cm-¹ do controle (sem extrato) ate 100 ml/L de extrato.
Winkaler et al. (2007) registraram aumento da condutividade elétrica da água (162,0
a 1226 μS.cm−1), nos experimentos com extrato de folhas de neem, (Azadirachta
indica) para Prochilodus lineatus durante 24 h de exposição. Cruz (2005) observou
variação na condutividade (0,165 a 0,450 μS.cm −1) em testes com o paration metílico
e azadiractina contida no extrato aquoso de folhas secas de nim (A. indica) no
controle de Anacanthorus penilabiatus em Piaractus mesopotamicus. Uma
60
explicação provável para o aumento da condutividade elétrica na água pode ser
devido a liberação de macronutrientes (nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio,
sódio) diluídos nos extrato das plantas avaliadas.
Um dos pré-requisitos para a classificação de produtos destinados a
aquicultura é avaliar o efeito tóxico que determinadas substâncias provocam nos
peixes (Xie et al. 2008; Das et al. 2009; Suvetha et al. 2010; Kumar et al. 2011).
Uma excelente ferramenta que tem corroborado com estes estudos é o
acompanhamento dos parâmetros sanguíneos utilizados na detecção de alterações
fisiopatológicas em diferentes condições de estresse em peixes (Ranzani-Paiva et
al. 2005; Tavares-Dias e Moraes 2007; Barcellos et al. 2009; Clauss et al. 2008;
Sepici-Dinçel et al. 2009; Osman et al. 2010; Sharma et al. 2010). Assim, o
monitoramento dos parâmetros sanguíneos sob práticas terapêuticas, tem sido uma
ferramenta essencial para detectar alterações fisiológicas importantes para a
homeostase dos peixes (Maciel 2009; Tavares-Dias et al. 2011; Harikrishnan et al.
2011).
No presente trabalho, o pirarucu exposto a diferentes concentrações de
extrato aquoso de P. aduncum em banhos curtos (0,5) e longos (24 h), apresentou
uma tendência na redução dos valores de Ht e RBC. Ao contrário, [Hb], HCM e
CHCM demonstraram uma tendência na elevação de seus valores em 0,5 h,
enquanto os dois últimos parâmetros foram elevados em 24 h de exposição.
Comparativamente, estes valores obtidos em 24 h de exposição ao fitoterápico
corroboram os resultados observados no capítulo 1, onde os peixes foram
submetidos às diferentes concentrações (40, 60, 80 e 100 ml/L) de extrato de P.
aduncum. Resultados similares foram descritos por Kavitha et al. (2011), em
exposição de Cyprinus carpio à Moringa oleífera nas concentrações 80,100,120,140,
160 mg/L, após 96 h de exposição, com redução significativa da Hb, Hct, RBC, e dos
valores MCHC. Resultados diferentes foram encontrados por Winkaler et al. (2007),
em Prochilodus lineatus expostos a diferentes concentrações (0, 2.5, 5.0, 7.5 g L -1)
de extrato de folhas de A. indica após 24 h de exposição, sem alterações do Hct,
porém com aumento da glicose plasmática.
Embora as alterações hematológicas observadas nos pirarucus sob efeito de
diferentes concentrações de P. aduncum sejam pequenas, as variações nos valores
dos parâmetros hemoglobínicos, HCM e CHCM, podem ser uma forma de
compensar a diminuição no número de eritrócitos no sangue dos peixes sob efeito
61
do fitoterápico. Esta é uma resposta adaptativa dos peixes sob condições de
estresse, para maximizar a capacidade de transporte de oxigênio no sangue
(Carvalho e Fernandes 2006; Affonso et al. 2009). Essa capacidade adaptativa dos
peixes tem sido descrita por diversos autores. Assim, Del Rio-Zaragoza et al. (2011)
compararam os parâmetros de sanguíneos de Lutjanus guttatus,
entre peixes
saudáveis e peixes infectados por monogenéticos dactylogyridae, e mostrou que
Hct, contagem de glóbulos brancos, o percentual de trombócitos e eosinófilos foram
significativamente maiores (P<0,05) nos peixes infectados. Em Labeo rohita
submetidos aos quimioterápicos cypermethrin e carbofuran, houve baixos níveis na
contagem de eritrócitos (RBC) concentração de hemoglobina e no percentual de
hematócrito. Em contraste, houve aumento significativo do VCM e HCM em resposta
aos químicos (Adhikari et al. 2004).
A hiperglicemia é outro importante indicador de estresse em peixes, pois
ajuda a suprir o aumento da demanda energética do organismo (Benfey e Biron
2000; Jeney et al. 1997; Mazeaud et al. 1977). Esse parâmetro tem contribuído para
avaliar os efeitos adversos de produtos químicos e naturais em peixes (Borges et al.
2007; Winkaler et al. 2007; Hori et al. 2008; Maciel 2009; Kumar et al. 2011; Kavitha
et al. 2011). Neste trabalho, os efeitos da P. aduncum não foram suficientes para
aumentar a demanda por glicose o que contribui com a suposição que as
concentrações usadas nos bioensaios são de baixa toxicidade. Esses dados são
corroborados com os valores de proteínas totais obtidos nas diferentes
concentrações testadas.
O comportamento dos pirarucus durante a exposição aos diferentes
tratamentos com o fitoterápico não demonstraram sinais de intoxicação e nem
mortalidade de peixes. Esses resultados corroboram com aqueles obtidos no
capítulo 1, cuja dose-resposta de P. aduncum para essa espécie encontra-se em 80
ml/L.
Os resultados de eficácia do extrato aquoso de P. aduncum em banhos curtos
(0,5 h) e longos (24 h) contra monogenéticos de pirarucus demonstraram uma
redução da carga parasitária em todas as concentrações e tempos de exposição
testada. Entretanto, somente em 80 ml/L do extrato de P. aduncum e após 24 h de
exposição, foi verificada o melhor resultado 80,16% de eficácia do fitoterápico contra
os monogenéticos em brânquias de pirarucu. Estes resultados corroboram com os
testes in vitro apresentados no capítulo 1 deste trabalho, pois a concentração de 80
62
ml/L do fitoterápico foi capaz de matar 100% do monogenéticos em três horas de
experimentos.
De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA), Portaria n° 48, de 12/05/1997, através de sua Secretaria da Defesa
Agropecuária, o registro de produtos antiparasitários para mamíferos domésticos só
é possível se sua eficácia não for inferior a 90%. Entretanto, até o momento, não há
na legislação parâmetros para uso em peixes e outros organismos aquático. Em
todo caso, os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que 80 ml/L do
extrato de P. aduncum testado para monogenéticos, identificados como D.
cycloancistrium e D. cycloancistrioides, de pirarucu, em 24 h de exposição, foi
80,16% e, portanto, próximos ao recomendado por esta portaria do MAPA.
Dessa forma, o efeito do extrato de P. aduncum sobre os parasitas de
pirarucu mostrou-se promissor, não apenas por se tratar de um produto natural, mas
também pelas baixas concentrações utilizadas e eficácia encontrada. Entretanto,
estudo da eficácia com outros vegetais sobre parasitas de peixes tem mostrado que
este parâmetro está relacionado com a espécie, tempo de exposição e método
utilizado. O controle de trichodinosis e gyrodactylose em Oreochromis niloticus (48
horas de idade), mostrou que banhos com tres ppt. de óleo de alho durante 1 h,
assim como 300 mg/L-1 de dentes de alho recém esmagados em banhos por tempo
indeterminado impediu completamente a infecção causada pelos dois parasitas
comparados ao grupo de controle (Abd El-Galil e Aboelhadid 2011); Em Astyanax cf.
zonatus, alimentados ad libitum com sementes de abobora causou eficácia (95,26%
e 92,48%) no controle de nematoides do intestino e do estomago. Os alimentados
ad libitum com sementes de mamão promoveu 72% de eficácia no controle de
monogenéticos (Fujimoto et al. 2012); Exposição durante 48 h aos compostos
bruceine A e bruceine D isolados de Brucea javanica, mostraram eficácia notável
contra D. intermedius com percentuais de eliminação de 97% e 91,2% em 1,0 mg/L 1.
5. CONCLUSÃO
Os resultados sugerem que a P. aduncum apresenta eficácia no controle de
parasitos
monogenéticos,
especificamente
para
D.
Cycloancistrium
e
D.
Cycloancistrioides, de pirarucu, após 24 horas de exposição com concentrações
63
máximas de 80 ml/L. Além disso, possui baixa toxicidade nesta fase de
desenvolvimento dos peixes (25 g) sem comprometer sua homeostase fisiológica.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
1) O ponto de partida para o estudo de uma planta com fins terapêuticos é a
existência dos conhecimentos medicinais pelas comunidades tradicionais;
2) Testes de toxicidade in vitro e in vivo são essenciais para avaliar a eficácia
de uma planta nos tratamentos de enfermidades;
3) Conhecer a biologia do peixe é um passo importante na fitoterapia, pois
suas especificidades podem ser influenciadas por substâncias presentes na planta;
4) Apesar da eficácia da P. aduncum no tratamento de monogenéticos de
pirarucu, recomenda-se a realização de novas pesquisas com esta espécie, que
possam contribuir para o entendimento sobre o efeito anestésico deste fitoterápico,
através do uso de frações isoladas da planta, assim como identificar a substância
responsável pela mortalidade dos parasitos;
73
5) Por fim, é importante a continuidade das pesquisas com esta planta a fim
de desenvolver um produto que atenda os requisitos legais (controle de qualidade,
segurança e eficácia) e de baixo custo para o setor aquícola brasileiro.

UNIVERSIDADE NILTON LINS INSTITUTO NACIONAL DE

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