NUPEB - Diss

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NUPEB - Diss

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
EFEITO DA OVARIECTOMIA SOBRE O BALANÇO
AUTONÔMICO CARDÍACO DE RATAS
SUBMETIDAS À DESNUTRIÇÃO PROTEICA
Ouro Preto 2010
F738e
Fortes, Luis Henrique Santos.
Efeito da ovariectomia sobre o balanço autonômico cardíaco de ratas submetidas à
desnutrição proteica [manuscrito] / Luis Henrique Santos Fortes. – 2010.
xxix, 119 f.: il., tabs., grafs.
Orientador: Prof. Dr. Luciano Gonçalves Fernandes.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica estrutural e Fisiológica.
1.
Batimento cardíaco - Teses. 2. Desnutrição - Teses. 3. Rato como animal de laboratório Teses. 4. Ovários - Cirurgia - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 616.12-008.3:612.621.1
Catalogação: [email protected]
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
EFEITO DA OVARIECTOMIA SOBRE O BALANÇO
AUTONÔMICO CARDÍACO DE RATAS SUBMETIDAS À
DESNUTRIÇÃO PROTEICA
AUTOR: Luís Henrique Santos Fortes
ORIENTADOR: Prof. Dr. Luciano Gonçalves Fernandes
Dissertação apresentada ao programa de
Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em
Ciências
Federal
Biológicas
de
Ouro
da
Preto,
Universidade
como
parte
integrante dos requisitos para obtenção do
título de Mestre, em Ciências Biológicas,
área
de
concentração:
Estrutural e Fisiológica.
Ouro preto 2010
Bioquímica
Este trabalho
foi realizado
no
Laboratório de Fisiologia
Cardiovascular do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, com o auxílio do CNPq, FAPEMIG e UFOP.
iii
“... Mestre como eu faço para me tornar sábio?
- É preciso fazer boas escolhas meu filho.
- Mas como faço para ter boas escolhas, mestre?
- Para fazer boas escolhas, é preciso experiência meu filho.
- E como adquirir experiência?
- Más escolhas, “filho”.
"O insucesso é apenas uma oportunidade para recomeçar de
novo com mais inteligência."
(Henry Ford)
iv
Dedicatória
v
A minha mãe, por toda luta para que eu pudesse
lutar por meus sonhos. Ao meu Pai por todo
empenho e amor durante todo esse tempo.
Aos amigos, por tanto me ajudarem nessa
conquista. A minha namorada, por sempre
acreditar que tudo iria dar certo. Ao Ensino
público por me dar essa grande oportunidade.
vi
Agradecimentos
vii
Agradecer, demonstrar gratidão, reconhecimento, importância.......Um simples
termo que o real significado pode ser muito mais complexo, ao mostrar uma gama de
sentimentos envolvidos. Então, agradeço a:
A Deus, por ser tão generoso e me permitir viver e encontrar pessoas que tanto me
fizeram crescer, e por estar sempre caminhado ao meu lado fazendo com que meus
sonhos se tornem real.
A meus pais e melhores amigos, Isabel Santos Fortes e Eustáquio Omar Fortes, pelo
grande amor, carinho e apoio fantástico durante todos esses anos de estudo. Sei que
sempre continuarão me apoiando.
Aos meus irmãos Marcelo Santos Fortes e Isabela Santos Fortes pelo grande
amizade, amor e carinho.
Ao meu amor, minha vida, minha namorada, minha amiga Thaylane Silveira de
Oliveira, pelo grande carinho, amor e por tanto confiar em mim durante esses anos que
estou longe de casa.
Ao meu primo André Lana, por ser o grande amigo que é, e ter estado sempre disposto
a me ajudar quando necessitei.
Ao meu orientador Prof. Dr. Luciano Gonçalves Fernandez, pela amizade pelos
ensinamentos, por aceitar fazer parte desse meu caminho me ajudando em momentos de
dúvida.
Ao Prof. Dr . Deoclécio Alves Chianca Júnior, por abrir as portas do laboratório e me
dar essa grande oportunidade.
Ao Prof. Leonardo Máximo Cardoso, pelos ensinamentos e grande ajuda nos
momentos de dúvida.
À grande amiga Arlete Rita Penitente, por toda confiança que teve em mim, por
acreditar que eu conseguiria mesmo quando eu mesmo achava o contrario, por abrir as
portas de um novo caminho e por todo incentivo, muito obrigado.
Ao Professor MSc. Aureliano Claret da Cunha pela incondicional ajuda e paciência
na hora que precisei e por sua amizade.
Ao Sr. Paulo Luciano “Seu Paulo”, por ser o grande amigo que é. Por quebrar tantas
vezes meu “galho” quando precisei fugir do trabalho ou chegar atrasado.
Ao amigo e companheiro de UFOP Miltinho, que estava sempre lá, sempre ajudando
com os animais.
À Aparecida Trópia (Cida), pela grande assistência e disposição prestada.
viii
À Miriam que disponibilizou várias vezes seu tempo pra me ensinar e esclarecer
dúvidas.
Ao pessoal do LAPAC, Cássio e Adão, pela grande ajuda e atenção.
Aos amigos do LFC, Alisson, Alessandro, Aline Resende, Arthur, Fabiana,
Nathalia, Lílian, Manoel, Márcio, Tchalton, Gabriel, Marcela (Toc), Aline,
Alessandra e Vanessa pelos ótimos momentos de convivência.
À Fernanda (Baju) e à Mara (Maravilha) pela grande amizade, estavam sempre ali,
prontas pra ajudar, sempre que precisava de alguma coisa. Muito obrigado por toda
ajuda e pelos ótimos momentos durante esse tempo.
À Marcela Libertino pelo grande laço de amizade e pela imensa ajuda prestada.
Aos amigos do mestrado Ana Paula, Paula, Amanda, Sonaly, Karina. Aos
professores e colegas do NUPEB pelo grande apoio.
Aos grandes amigos Leonardo (Tedy), Lawrence (Pantufa), Victor (Vivi),
Guilherme (Guiguizudo) e Ricardo (Zé Mayer), por todo o companheirismo e
amizade.
Enfim, a todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a
realização deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos a todos vocês.
ix
Sumário
x
1.
2.
3.
INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 2
1.1
Desnutrição ................................................................................................................... 2
1.2
Aspectos fisiológicos do ciclo reprodutivo feminino .................................................... 6
1.3
Desnutrição e ciclo reprodutivo .................................................................................... 9
1.4
Pós-menopausa e Hipertensão arterial ........................................................................ 11
1.5
Variabilidade da Frequência Cardíaca ........................................................................ 15
OBJETIVOS ....................................................................................................................... 22
2.1
Objetivo Geral ............................................................................................................. 22
2.2
Objetivos específicos................................................................................................... 22
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 24
3.1
Modelo animal – desnutrição proteica ........................................................................ 24
3.2
Composições das dietas.................................................................................................. 24
3.3 Protocolos para cirurgia de ovariectomia ......................................................................... 26
3.4 Registros da pressão sistólica (PAS) e Frequência Cardíaca (FC) por Pletismografia de
cauda. 26
3.5 Preparo e implante das cânulas arteriais, venosas e eletrodos para ECG........................ 29
3.6 Registro da Pressão Arterial e do Eletrocardiograma (ECG) .......................................... 32
3.7 Protocolo experimental: Avaliação do controle autonômico da frequência cardíaca. ..... 33
3.8 Preparação das Drogas utilizadas .................................................................................... 35
3.9 Coletas e analise das amostras para análise bioquímica e Hormonal. ............................... 36
3.10 Constatação do ciclo estral, coloração e captura das imagens ....................................... 37
3.11 Análise dos dados ........................................................................................................... 38
3.12 Análises da Frequência Cardíaca (FC) e Pressão Arterial Média (PAM) ...................... 38
3.13 Análise do Tônus autonômico cardíaco ........................................................................ 39
3.14 Análise do Índice autonômico cardíaco (IAC) .............................................................. 40
3.15
Analise da variabilidade da Frequência Cardíaca no Domínio da Frequência. ............ 40
3.16 Análise estatística .......................................................................................................... 42
4. RESULTADOS .................................................................................................................. 44
4.1 Efeito da ovariectomia e desnutrição sobre o peso corporal dos animais. ....................... 44
4.2 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre o acumulo de gordura intra-abdominal ..... 45
4.3 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre a ciclicidade estral .................................... 46
4.4 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre os parâmetros bioquímicos e hormonais..... 46
4.4.1 Lipídeos séricos ......................................................................................................... 46
4.4.2 Proteínas séricas ....................................................................................................... 48
4.4.3- Estradiol .................................................................................................................... 50
4.5 Efeitos temporais da desnutrição e ovariectomia sobre pressão arterial Sistólica e
frequência Cardíaca avaliada pelo método de Pletismografia de cauda.................................. 51
4.6
Efeito da desnutrição e ovariectomia sobre FC e PAM basais medidos pelo método
direto (cateterização). .............................................................................................................. 54
xi
4.7
Balanço Autonômico ................................................................................................... 56
4.7.1 Efeitos do bloqueio vagal (Metil-atropina) sobre os níveis de PAM e FC................ 56
4.7.2
Efeitos do bloqueio farmacológico do sistema nervoso simpático realizado com
Beta-bloqueador (metoprolol) sobre a PAM e FC .............................................................. 59
4.7.4
Avaliação do Índice Autonômico Cardíaco (IAC) .............................................. 65
4.7.5
Análises do tônus autonômico cardíaco .............................................................. 66
4.7.6
Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre a razão entre as potências do
espectro de FC ..................................................................................................................... 68
5.
DISCUSSÃO. .............................................................................................................. 70
6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO ........................................................................................... 83
7. PERSPECTIVAS ............................................................................................................... 85
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................ 89
9.
APÊNDICE ............................................................................................................... 106
xii
Lista de Figuras
xiii
Figura 1- Variação hormonal do ciclo estral em ratas (Buffet & Bouchard, 2001). ...... 8
Figura 2- Variação hormonal do ciclo menstrual em mulheres (Buffet e Bouchard,
2001). ................................................................................................................................ 9
Figura 3- Exemplo de um segmento de intervalo de ondas sucessivas R-R. ................. 20
Figura 4- Representação da janela de visualização do software Chart® durante um
registro de medida indireta de FC e pressão arterial. A seta indica o primeiro pico de
sinal após o desinflar da bomba. As linhas: representando o sinal pulso (A), inflar de
inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) observa-se a interrupção do sinal de
frequência cardíaca com o inflar da bomba. ................................................................. 28
registro de medida indireta de FC e pressão arterial. As linhas representando; o sinal
de pulso (A), inflar de inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) Período entre
chaves e retângulo vermelho, demonstrando período tomado como Frequência
cardíaca .......................................................................................................................... 29
Figura 6- Imagem representativa de um conector Rj45 ................................................ 30
Figura 7- (A)Local de dissecação do trígono femoral e (B)Isolamento da artéria e veia
femoral e
inserção dos cateteres .............................................................................. 31
Figura 8- Desenho esquemático do implante de eletrodos para aquisição dos sinais
eletrocardiográficos. ...................................................................................................... 32
Figura 9- Representação da janela de visualização do software Kananda® durante o
registro eletrocardiográfico e de pressão arterial. As linhas representam o
xiv
eletrocardiograma (1º.), pressão arterial pulsátil (2º.), frequência cardíaca (3º.) e
pressão arterial media (4º.). ........................................................................................... 33
Figura 10- Esquema dos protocolos experimentais adotados. ...................................... 35
Figura 11- Imagem representativa da metodologia adotada para coleta de secreção
vaginal utilizada pra confecção dos esfregaços. (a,b,c) com auxílio de uma pipeta de 20
µl preenchida com salina (NaCl 0,9%), a qual foi injetada dentro do canal vaginal e em
seguida aspirado. (d) marcação na cauda dos animais para identificação de cada um
durante todo o experimento. (e) lâminas confeccionadas da secreção aspirada e
analisadas em microscópio óptico na objetiva de 40x. .................................................. 38
Figura 12- Esquema demonstrativo do duplo bloqueio farmacológico com metilatropina (A) e metoprolol (P) para obtenção da frequência cardíaca intrínseca (FCI),
tono vagal (TV) e simpático (TS) cardíaco. ................................................................ 39
Figura 13- Imagem de exemplo da janela de análise de série batimento a batimento no
domínio do tempo do software cardioseries V.1.0. ........................................................ 41
Figura 14- Figura representativa de um sinal simulado no domínio do tempo e sua
transformação para o domínio da frequência. O sinal é composto de um componente
oscilatório correspondente às Ondas de Mayer (0,5 Hz) e outro às Ondas de Hering (2
Hz). A transformação pela Transformada Rápida de Fourrier discrimina os dois
principais componentes em frequência que constituem o sinal. ................................ 41
Figura 15- Efeitos da ovariectomia de desnutrição sobre o ganho de peso (g) dos
animais após procedimento cirúrgico. Valores numéricos mostram média ± EPM.
Barras seguidas de letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de
Bonferroni para p< 0,05. ............................................................................................... 44
xv
Figura 16- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre o acumulo de gordura intraabdominal em ratas, peso (g). Valores numéricos mostram média ± EPM. Barras
seguidas de letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni
para p< 0,05. .................................................................................................................. 45
Figura 17- Figura representativa de um esfregaço vaginal na fase cíclica do diestro,
obtida em microscópio óptico com aumento de 40 x. (L) indica forte presença de
leucócitos (Marcondes et al., 2002). .............................................................................. 46
Figura 18- Efeito da ovariectomia e desnutrição sobre o lipidograma de ratas. Para
cada fração lipídica em questão, médias seguidas por letras diferentes apresentam
diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ......................................... 48
Figura 19- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre as concentrações das
proteínas plasmáticas por grupos (mg/dL). Para cada fração proteica em questão,
médias seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de
Figura 20- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre as concentrações
plasmáticas de estradiol por grupos (pg/mL). Valores numéricos representam média ±
EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste
de Bonferroni para p< 0,05............................................................................................ 50
Figura 21- Figura ilustrativa do Efeito temporal da restrição proteica e ovariectomia
sobre a PAS e frequência cárdica, aferidos durante cinco meses.................................. 53
Figura 22- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre níveis Basais de FC (A) e
PAM (B) nos grupos Controles (Sham, OVX) e Desnutridos (Sham, OVX). Valores
numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes
apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ..................... 55
xvi
Figura 23- Efeitos do bloqueio farmacológico com anticolinérgico (metil-atropina)
sobre a FC (A) e PAM (B) dos grupos Controle (Sham e OVX), Desnutrido (Sham e
OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste
de Bonferroni para p< 0,05............................................................................................ 58
Figura 24- Efeitos do bloqueio farmacológico com β1-bloqueador (metoprolol) sobre a
FC (A), e PAM (B) nos Grupos Controle (Sham e OVX), Desnutridos (Sham e OVX).
Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de
Figura 25- Efeito do duplo bloqueio farmacológico com anticolinérgico metil-atropina
e β1-bloqueador metoprolol sobre a FC (A) e PAM (B) nos grupos controles (Sham e
OVX) e desnutridos (Sham e OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam
diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ......................................... 64
Figura 26- Efeito do duplo bloqueio farmacológico sobre o ∆ de variação da FC dos
Grupos Controle (Sham e OVX), Desnutridos (Sham e OVX). Valores numéricos
representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença
estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ......................................................... 65
Figura 27- Índice Autonômico Cardíaco dos grupos controle (Sham e OVX) e
desnutrido (Sham e OVX). Valores numéricos representam média ± EPM. Barras
seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni
para p< 0,05. .................................................................................................................. 66
Figura 28- Tônus simpático (A) e parassimpático (B) dos grupos Controles e
Desnutridos. Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras
diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05...... 67
xvii
Figura 29- Relação dos espectros de FC (LF/HF) dos grupos Desnutridos e Controles.
Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes
apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ..................... 68
Lista de Tabelas
xviii
Tabela 1- Composição química da dieta para desnutrição experimental (g/100g de
dieta) ............................................................................................................................... 25
Tabela 2- Os valores representam média ± EPM da média por grupos experimentais.
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL), lipoproteína de alta densidade (HDL),
colesterol total (CT), Triglicérides (TRIG), Lipoproteína de muito baixa densidade
(VLDL). ........................................................................................................................... 47
Tabela 3- Valores médios ± EPM das concentrações séricas (g/dL) das Proteínas
Plasmáticas por grupos. ................................................................................................. 49
Tabela 4- Valores médios ± EPM de FC (bpm), durante 5 meses pelo método de
plestimografia de cauda por grupos experimentais. ...................................................... 52
Tabela 5- Valores médios ± EPM de PAS (mmHg), durante 5 meses pelo método de
plestimografia de cauda por grupos experimentais. ...................................................... 52
Tabela 6- Parâmetros Cardiovasculares, FC (bpm) e PAM (mmHg), Os valores
representam média ± EPM da média nos grupos controles e desnutridos na situação
basal e após bloqueio farmacológico com metil-atropina. ............................................ 57
Tabela 7- Parâmetros Cardiovasculares, FC (bpm) e PAM (mmHg) Os valores
basal e após bloqueio farmacológico com metoprolol................................................... 60
basal e após duplo bloqueio farmacológico. .................................................................. 63
Tabela 9-Valores unitários de peso para cada animal ao final de 28 semanas (Gramas).
...................................................................................................................................... 106
Tabela 10- Acumulo de Gordura intra-abdominal, valores por animal (Gramas) ..... 106
Tabela 11- Concentrações plasmáticas de LDL (mg/dL). ........................................... 107
Tabela 12- Concentrações plasmáticas de HDL (mg/dL). ........................................... 107
Tabela 13- Concentrações séricas de Colesterol total (CT) ........................................ 107
xix
Tabela 14- Concentrações séricas de Triglicérides (Trig) .......................................... 108
Tabela 15- Concentrações séricas de lipoproteína de muita baixa densidade (VLDL)
...................................................................................................................................... 108
Tabela 16- Concentrações séricas de Proteínas totais (g/dL). .................................... 108
Tabela 17- Concentrações séricas de albumina (g/dL) ............................................... 109
Tabela 18- Concentrações séricas de globulina (g/dL). .............................................. 109
Tabela 19- Valores de FC (BPM e PAS( mmHg), durante 5 meses pelo método de
plestimografia de cauda ............................................................................................... 109
Tabela 23- Níveis basais de PAM (mmHg) nos diferente grupos de estudo ................ 111
Tabela 24- Níveis basais de FC (BPM) nos diferentes grupos de estudo. ................... 112
Tabela 25- FC (BPM) antes e após administração de metil-atropina
nos grupos
controles. ...................................................................................................................... 112
Tabela 26- PAM antes e após administração de metil-atropina nos grupos controles.
...................................................................................................................................... 113
Tabela 27- FC (BPM) antes e após administração de metil-atropina nos grupos
desnutridos ................................................................................................................... 113
Tabela 28- PAM (mmHG) antes e após administração de metil-atropina nos grupos
desnutridos ................................................................................................................... 114
xx
Tabela 29- FC (BPM) antes e após administração de metoprolol nos grupos controles.
...................................................................................................................................... 114
Tabela 30-
PAM (mmHg) antes e após administração de metoprolol nos grupos
controles ....................................................................................................................... 115
Tabela 31- FC (BPM) antes e após administração de metoprolol nos grupos
desnutridos ................................................................................................................... 115
Tabela 32- PAM (mmHg) antes e após administração de metoprolol nos grupos
desnutridos ................................................................................................................... 116
Tabela 33- FC (BPM) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos controles.
...................................................................................................................................... 116
Tabela 34- PAM (mmHg) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos
controles. ...................................................................................................................... 117
Tabela 35- FC (BPM) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos
desnutridos. .................................................................................................................. 117
Tabela 36- PAM (mmHg) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos
desnutridos. .................................................................................................................. 118
Tabela 37- LF e HF durante o período basal e razão LF/HF dos grupos controles... 118
Tabela 38- LF e HF durante o período basal e razão LF/HF dos grupos desnutridos.
...................................................................................................................................... 119
xxi
Lista de Abreviaturas
xxii
FAO
Food and Agriculture Organization
ONU
Organização das Nações Unidas
OMS
Organização Mundial da Saúde
LH
Hormônio Luteinizante
FSH
Hormônio folículo estimulante
PRS
Prolactina
GnRH
Hormônio Liberador da Gonadotrofina
IMC
Índice de Massa Corporal
PA
Pressão Arterial
PAM
Pressão Arterial Média
PAS
Pressão Arterial Sistólica
FC
Frequência Cardíaca
ECG
Eletrocardiograma
Bpm
Batimentos por minuto
COL
Colesterol Total
TRIG
Triglicérides
HDL
Lipoproteína de alta densidade
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
VLDL
Lipoproteína de muito baixa densidade
ET-1
Endotelina 1
SNC
Sistema Nervoso Central
SNA
Sistema Nervoso Autonômico
OVX
Ovariectomizado
Sham
Cirurgia Fictícia
SHAM
Cirurgia Fictícia
COVX
Controle ovariectomizado
CSham
Controle Sham
DSham
Desnutrido Sham
DOVX
Desnutrido ovariectomizado
IL-1
Interleucina 1
IL-6
Interleucina 6
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
NO
Oxido Nítrico
ECA
Enzima conversora da angiotensina
xxiii
ANG I
Angiotensina I
ANG II
Angiotensina II
VFC
Variabilidade da Frequência Cardíaca
IAC
Índice Autonômico Cardíaco
Kg
Quilogramas
g
Gramas
cm
Centímetros
mmHg
Milímetros de mercúrio
Kcal
Quilocalorias
LF
Low Frequency – Componente parassimpático do espectro da
variabilidade da FC
HF
High Frequency – Componente simpático do espectro da variabilidade da
Frequência Cardíaca
UFOP
Universidade Federal de Ouro Preto
LFC
Laboratório de Fisiologia Cardiovascular
Pg
Pico gramas
xxiv
Resumo
xxv
Doenças cardiovasculares (DCV) aparecem como a principal causa de morte de
homens e mulheres na idade adulta. A literatura relata haver diferenças sexo específicas
na incidência de DCV, principalmente em mulheres na pós-menopausa e jovens com
perda da função ovarina, sugerindo assim, cardioproteção atribuída ao estrógeno.
Desnutrição proteica é caracterizada como uma síndrome multifatorial de condições
patológicas decorrentes de um desequilíbrio pelo aporte alimentar insuficiente podendo
afetar o funcionamento dos processos fisiológicos do organismo. Vários são os fatores
que exercem modulação sobre o início da fase púbere, tais como, mecanismos
intrínsecos de oscilações hormonais, ações inibitórias de neurotransmissores do sistema
nervoso central (SNC) sobre o funcionamento do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal,
bem como fatores extrínsecos, sendo o estado nutricional um fator importante para o
desencadeamento púbere. Assim, a desnutrição pode alterar a síntese e liberação de
estrógenos, levando a cardioproteção diminuída em mulheres desnutridas. Objetivamos
nesse trabalho, avaliar em ratas Fisher, normonutridas e desnutridas, os efeitos da
ovariectomia, sobre a pressão arterial, modulação autonômica cardíaca bem como
outros parâmetros potenciais na gênese de doenças cardiovasculares, como perfil
lipídico, proteico e acúmulo de gordura intra-abdominal. Ratas Fisher com 90 dias,
normonutridas ou desnutridas, foram submetidas à ovariectomia (OVX) ou cirurgia para
retirada fictícia dos ovários (Sham) e divididas em grupos Controle Sham (Csham),
Controle OVX (COVX), Desnutrida Sham (DSham) e Desnutrida OVX (DOVX). Antes
das cirurgias de OVX, realizou-se o primeiro registro de pressão arterial sistólica (PAS)
e frequência cardíaca (FC) por pletismografia de cauda, sendo estes parâmetros aferidos
durante 4 meses após OVX. Dois dias antes da eutanásia dos animais, foram
implantados eletrodos, para registros eletrocardiográficos (ECG), e cateteres femorais
para registro de FC, PAM direta, administração de drogas e coleta de amostras
sanguíneas. Após o registro basal de ECG as ratas receberam metil-atropina (5 mg/kg)
seguida de metoprolol (4 mg/kg), ou na ordem inversa. No dia seguinte, foram coletadas
amostras sanguíneas e os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO2. Os
intervalos entre sucessivas ondas R do ECG foram determinados, e séries batimento a
batimento, de FC foram geradas. Para análise da variabilidade da FC (HRV), as séries
de FC tiveram seu espectro calculado pela transformada rápida de Fourier, e integrados
em bandas de baixa (LF: 0,2 - 0,75 Hz) e alta frequência (HF: 0,75 - 3 Hz). As ratas
desnutridas (Sham e OVX) ao final do 5º mês tiveram uma maior PAS quando
comparadas ao grupo controle (Sham e OVX), (145,6 ± 1,4; 151,4 ± 8 vs. 133,5 ± 1,5;
xxvi
118,6 ± 5 mmHg), bem como maior FC (426 ± 7 ; 409,7 ± 15,3 vs. 378,8 ± 11,3; 377,4
± 10 bpm). Pelo registro direto, ratas desnutridas apresentaram FC elevada em relação
ao grupo controle (DSham 461 ± 13; DOVX 453,6 ± 14,5 vs. CSham 392,7 ± 14,5;
COVX 373,04 ± 14,36 bpm). Ratas CSham apresentaram menor resposta simpática
(bradicardia após metoprolol: 35, 2 ± 0,21 vs. COVX 68,3 ± 5; DSham 91,7 ± 5,3;
DOVX 69, 6 ± 8,2 bpm). A PAM não foi afetada pela OVX ou desnutrição. O índice
autonômico cardíaco proposto por Goldberger em 1999 mostrou-se alterado nos
diferentes grupos, mas com maior evidência nos grupos COVX (0,85 ± 0,03) e DSham
(0,73 ± 0,03) e DOVX (0,74 ± 0,02). A razão entre as potencias do espectro nas bandas
LF e HF (LF/HF) mostrou-se elevada nos grupos desnutridos quando comparado aos
grupos controles (DSham 0,73 ± 0,09; DOVX 0,71 ± 0,09 vs. CSham 0,47 ±0,04 ;
COVX 0,45 ± 0,03). Nos espectros de FC a banda de LF é fortemente associada à
modulação simpática cardíaca, enquanto que a de HF, à atividade vagal sobre o coração.
Assim, a razão LF/HF dos espectros de FC é considerada um forte indicador de balanço
simpatovagal cardíaco. A análise sobre os parâmetros bioquímicos mostrou uma
elevação nas concentrações de lipoproteínas plasmáticas (LDL) nos grupos COVX,
DSham e DOVX quando comparado ao grupo CSham (57,1 ± 3,2; 61,1 ± 5,3; 62,2 ±
5,6 vs. 30,7 ± 3,6 mg/dL) bem como colesterol total (93,3 ± 4,7; 88.3 ± 8,7; 96.1 ± 6,3
vs. 70,5 ± 4,6 mg/dL). As frações proteicas mostraram-se diminuídas nos grupos
desnutridos quando comparado ao grupo controle: Proteínas totais (6,38 ± 0,35; 6,65 ±
0,14 vs. 5,2 ± 0,12; 5,32 ± 0,08 g/dL); Albumina (4,54 ± 0,12; 4,62 ± 0,10 vs. 2,54 ±
0,08; 2,38 ± 0,10 g/dL): Globulina (3,69 ± 0,17; 3,90 ± 0,14 vs. 2,31 ± 0,11; 2,42 ± 0,10
g/dL). Os animais COVX apresentaram um maior acúmulo de gordura intra-abdominal
quando comparado aos CSham (16,47 ± 0,79 g vs. 11,13 ± 0,49 g) contudo, não foram
observadas diferenças nos animais DSham ou DOVX (0,67 g ± 0,09 vs. 1,48 ± 0,26 g).
Os resultados apresentados mostram que a OVX não foi capaz de promover
modificações autonômicas em ratas controle e desnutridas, mas a desnutrição foi
apropriada em promover uma disfunção simpatovagal. Além disso, tanto a OVX quanto
a restrição proteica foram eficazes em causar alteração no perfil lipídico e distribuição
de gordura em ratas, proporcionando risco de eventos cardiovasculares.
xxvii
Abstract
xxviii
Cardiovascular diseases (CVD) show up as the main cause of death in men and
women into adulthood. The literature reports significant sex-specific differences in
CVD incidence, particularly in postmenopausal and young women with ovarian
function loss, suggesting cardioprotection attributed to estrogen. Protein malnutrition is
characterized as a multifactorial syndrome of pathological conditions caused by an
imbalance of insufficient food intake, which can affect the physiological processes in
the body. There are many factors that exert modulation in the beginning of puberty,
such as, intrinsic mechanisms of hormonal variations, inhibitory action of
neurotransmitters in central nervous system (CNS) on the operation of the gonadalpituitary-hypotalamic, as well as extrinsic factors. Thus, nutritional state is a major
factor for puberal triggering. Additionaly, malnutrition can change estrogens synthesis
and release strongly, leading a decrease cardioprotection in undernourished women. In
this work, we aimed to evaluate, in female Fisher rats, normotensive, wellnourished and
undernourished, the ovariectomy effect on the blood pressure, cardiac autonomic
modulation, such as others potential parameters in the genesis of the cardiovascular
diseases, as the lipid and protein profile and intra-abdominal fat accumulation. Ninetyday-old female Fisher rats, wellnourished and undernourished, were submitted to
ovariectomy (OVX) or sham surgery for ovaries removal (Sham). They were divided
into Sham Control group (ShamC), OVX Control (OVXC), Sham Undernourished
(ShamU) and OVX Undernourished (OVXU). Before the OVX, it was perfomed the
systolic blood pressure (SBP) and heart rate (HR) record by tail plestimography. These
parameters were measured during four months after OVX. Two days before the
sacrifice
of
animals,
the
electrodes
were
implanted,
in
order
to
obtain
electrocardiography record (ECG), and catheters were implanted in femoral vessels to
get direct FC and PAM record, drugs administration and blood sample collection. After
the ECG basal record, the female rats received methyl-atopine (5 mg/kg) followed by
metoprolol (4 mg/kg), or in reverse order. The Day after, it was collected blood sample
and the animals were sacrificed in CO2 chamber. The intervals between successive R
waves of ECG were determined, and beat to beat series of HR were generated. For HR
variability analysis (HRV), the HR series had its spectrum calculated by Fourrier fast
transform and integrated into bands of low (LF: 0.2 - 0,75 Hz) and high frequency (HF:
0.75 - 3 Hz). The undernourished female rats (Sham e OVX), at the end of fifth month,
had a higher SBP when compared with the control group (Sham e OVX), (145.6 ± 1.4;
151.4 ± 8 vs. 133.5 ± 1.5; 118.6 ± 5 mmHg), as well as higher HR (426 ± 7 ; 409.7 ±
xxix
15.3 vs. 378.8 ± 11.3; 377.4 ± 10 bpm). For the direct record, undernourished rats
showed high HR in relation to the control group (ShamU 461 ± 13; OVXU 453.6 ± 14,5
vs. ShamC 392.7 ± 14.5; OVXC 373.04 ± 14.36 bpm). ShamC animals showed smaller
sympathetic effect (bradycardia after metoprolol: ShamC 35. 2 ± 0,21 vs. OVXC 68.3 ±
5; ShamU 91.7 ± 5.3; OVXU 69. 6 ± 8,2 bpm). The MAP was not affected by OVX or
malnutrition. The cardiac autonomic index proposed by Goldberger, in 1999, was
changed in the different groups, but it was more evident into OVXC group (0.85 ±
0.03), ShamU (0.73 ± 0.03) and OVXU (0.74 ± 0.02). The ratio between LF and HF
(LF/HF) spectrum power showed high into undernourished groups when compared with
control groups (ShamU 0.73 ± 0.09; OVXU 0.71 ± 0.09 vs. ShamC 0.47 ±0.04 ; OVXC
0.45 ± 0.03). In HR spectrum, the LF band was strongly associated with cardiac
sympathetic modulation, and HF, with parasympathetic activity to the heart. Thus, HR
spectrum ratio LF/HF is considered an important and solid indicator of cardiac
sympathetic-vagal balance. The biochemical parameters analysis showed an increase of
plasma lipoproteins concentration (LDL) in OVXC, ShamU and OVXU groups when
compared with ShamC group (57.1 ± 3.2; 61.1 ± 5.3; 62.2 ± 5.6 vs. 30.7 ± 3.6 mg/dL),
such as total cholesterol (93.3 ± 4.7; 88.3 ± 8.7; 96.1 ± 6.3 vs. 70.5 ± 4.6 mg/dL). The
protein fractions were decreased in undernourished group in relation to control group:
Total protein (6.38 ± 0.35; 6.65 ± 0.14 vs. 5.2 ± 0.12; 5.32 ± 0.08 g/dL); Albumin (4.54
± 0.12; 4.62 ± 0.10 vs. 2.54 ± 0.08; 2.38 ± 0.10 g/dL): Globulin (3.69 ± 0.17; 3.90 ±
0.14 vs. 2.31 ± 0.11; 2.42 ± 0.10 g/dL). The OVXC animals showed higher intraabdominal fat accumulation in relation to ShamC (16.47 ± 0.79 g vs. 11.13 ± 0.49 g).
However, no difference was observed into ShamU or OVXU (0.67 g ± 0.09 vs. 1.48 ±
0.26 g).
These results show that OVX cannot promote autonomic changes in
wellnourished and undernourished female rats, but malnutrition promotes a
sympathetic-vagal dysfunction. Moreover, as OVX much as protein restriction were
effective in changing the lipid profile and fat distribution in female rats, increasing the
cardiovascular events risk.
xxx
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
1
INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Desnutrição
Os efeitos da privação alimentar e da fome vêm sendo observados desde épocas
remotas e sendo descritos através dos tempos. Em 1928, inquéritos realizados em
diferentes países, pela antiga liga das nações, divulgaram relatórios sobre as condições
alimentares no mundo demonstrando que mais de 2/3 da humanidade viviam em
permanente estado de fome (Castro, 1965).
Em 1974, durante a realização da Conferencia mundial sobre Alimentação,
realizado pela Food and Agriculture Organization (FAO), órgão pertencente às Nações
Unidas (ONU), os governos participantes defenderam o direito inalienável de todo
homem, mulher ou criança estarem livres do risco de fome e da desnutrição para o
desenvolvimento de suas necessidades físicas e mentais, de acordo com o conceito de
Segurança Alimentar. Com a proposta os governantes esperaram uma redução de 50%
do número de desnutridos no mundo até 2015 (Domene et al., 2003).
Com bases em estudos nutricionais realizados em todos os continentes, Food
and Agriculture Organization of the United Nations (FOOD, 2001), relatou que embora
em termos percentuais, tenha havido decréscimo na incidência de desnutrição entre
1990 e 1999, em números absolutos 623,7 milhões de pessoas nesses continentes ainda
são acometidas por essa carência nutricional.
Em 2002, no Segundo Fórum Mundial de Alimentação, constatou-se que o
número de desnutridos diminui em 8 milhões a cada ano. Para alcançar os objetivos
propostos pelos governantes em 1974, à taxa de redução deveria ser de pelo menos 22
milhões por ano. Dados como estes, mostram que todas as medidas tomadas até agora
foram de pequeno impacto para a real diminuição do número de desnutridos no mundo
(Domene et al., 2003).
Mais recentemente, dados estimados pela FAO em 2008, mostraram que o
aumento do número de pessoas desnutridas de 2003 para o ano de 2007 foi de 75
milhões, sendo que no ano de 2007 existiam no mundo aproximadamente 923 milhões
de pessoas afetadas pela desnutrição, e a cada 5 segundos, morre uma pessoa no mundo
devido a alguma carência nutricional. Mostrando que, em pleno século 21, a
2
INTRODUÇÃO
insegurança alimentar mesmo não sendo nova aparece como um problema que
assombra diversas nações.
Em 2010, segundo a FAO, é observada uma queda em 98 milhões de pessoas
desnutridas no mundo, significando 9,6% no total de subnutridos, em grande parte
devido ao crescimento da economia em países em desenvolvimento. Mesmo assim o
número de pessoas que sofre de alguma carência nutricional ainda é relativamente alto.
Mesmo com toda evolução no combate a fome e desnutrição, dados mostrados
pela WHO em agosto de 2010, na resolução de Joannesburg, mostram com grande
preocupação que a desnutrição continua a ser uma das principais causas de morte e
incapacidade para as crianças: 1 em cada 3 mortes, e 20% dos anos perdidos de vida
saudável são atribuíveis à desnutrição em todas as suas formas.
Desnutrição proteico-calórica é definida pela Organização Mundial da Saúde
como uma síndrome multifatorial de condições patológicas decorrentes de um
desequilíbrio pelo aporte alimentar insuficiente, transporte ou utilização de nutrientes
(por exemplo, proteínas, iodo ou cálcio) por células do organismo para assegurar o
crescimento e manutenção de funções especificas do organismo (Sawaya et al.,2003).
Muitas vezes o inadequado aproveitamento biológico dos alimentos ingeridos é
motivado por alguns tipos de doenças, em particular infecciosas e parasitarias bem
como um quadro de síndrome de má absorção (Monteiro, 2003).
No ano de 2006 foi estabelecida uma nova definição para desnutrição, sendo
caracterizada por uma condição fisiológica anormal causada por deficiência, excessos
ou desequilíbrios na ingestão de calorias, proteínas ou outros nutrientes (ONU, 2006).
Este novo conceito abrangerá não só a falta, mas também o excesso alimentar (Comitê
Permanente de Nutrição – Ctherini Bertine, 2006), englobando com isso outro grande
problema de saúde pública nos dias atuais, a obesidade.
Assim, existem três tipos básicos de alterações dietéticas: 1) diminuição da
quantidade total de alimentos, ou seja, fome, também chamada de desnutrição calórica
total. A nível severo, este tipo de desnutrição foi denominada marasmo; 2) alteração na
composição dos alimentos consumidos, ou seja, alteração da qualidade da dieta. O que
pode provocar um tipo de desnutrição severa, chamada kwashiorkor; 3) aumento na
quantidade de alimento ingerido acima das necessidades para a sobrevivência do
organismo, ou seja obesidade (Sawaya, 2003).
A desnutrição do tipo kwashiorkor, pode ser caracterizada pela deficiência de
proteína encontrada principalmente no leite materno, além de vitaminas e sais minerais
3
INTRODUÇÃO
em um primeiro momento, e mais tarde na carne, que é um tipo de alimento mais caro
sendo extremamente raro na mesa de populações mais pobres, estas se alimentando
principalmente a base de carboidratos, (Mendonça, 2003; Voltarelli et al., 2008). Em
primeira instancia vê-se um quadro de fadiga, irritabilidade, letargia, incluindo diarreia,
anemia e retardamento motor. Não tratada, a doença evolui, a imunidade do paciente cai
e o corpo apresenta edema. Em quadros graves, pode ocorrer deficiência mental e
morte. Mesmo tratada, a criança que teve kwashiorkor dificilmente atinge altura e peso
normais (Mendonça, 2003).
Este tipo de desnutrição é considerado como forma mais letal de má nutrição e
tem um papel muito importante em pelo menos metade das mortes anuais de crianças no
mundo em desenvolvimento. Dados mostrados pela Organização mundial da saúde
(OMS) em 2007 mostram que esta forma de desnutrição afeta uma em cada quatro
crianças em todo o mundo: 150 milhões (26,7%) estão com baixo peso e 182 milhões
(32,5 %) têm desenvolvimento retardado. Relata-se que 55% das mortes infantis em
países em desenvolvimento estão associadas à desnutrição, sendo que 12,2 milhões de
mortes anuais de crianças menores de 5 anos, 6,6 são causadas pela desnutrição. De
acordo com a OMS, a alimentação inadequada de recém-nascidos e crianças são
responsáveis por um terço dos casos de desnutrição (WHO, 2007). No Brasil a
prevalência de desnutrição em crianças menores de 5 anos de idade, aferida pela
proporção de crianças com déficit de crescimento, foi 7% em 2006 (Pesquisa Nacional
de Demografia e Saúde, 2009).
A palavra proteína deriva do grego “protéios”, que significa o que tem
prioridade. Essa palavra tem um real sentido, já que de fato são elas as macromoléculas
mais importantes das células. As proteínas são compostos orgânicos com uma estrutura
complexa, resultante da união de inúmeros aminoácidos. Dos vinte aminoácidos que
constituem as proteínas, nove são considerados essenciais, ou seja, não são sintetizados
pelo organismo e devem ser adquiridos através da dieta. Esses compostos possuem
funções vitais para os organismos, atuando de forma versátil, ou seja, possuindo
diversificadas funções. As proteínas participam da estrutura dos tecidos (função
estrutural), atuam como agentes reguladores das atividades biológicas (função
enzimática) resultam em hormônios (função hormonal), atuam no combate a agentes
estranhos ao organismo (função de defesa), além de servirem como fontes de
aminoácidos (função nutritiva) (Lehninger, 2005).
Baseado nisso, a desnutrição
4
INTRODUÇÃO
proteica é altamente prejudicial ao organismo, uma vez que as proteínas fornecem
aminoácidos que regulam e cumprem funções fisiológicas e metabólicas no organismo.
Tendo por base que estudos sobre desnutrição proteica em humanos são mais
observacionais do que experimentais, vê-se a necessidade da avaliação através de
modelos animais controlados de acordo com a intensidade da desnutrição e o tempo de
exposição (Giacomelli & Marçal-Natali, 1999). O rato, então, torna-se o modelo
experimental mais utilizado nestes estudos devido às vantagens que apresenta, tais
como fácil manejo, alta capacidade de adaptação aos diferentes protocolos de
desnutrição, além de possuir metabolismo acelerado, sendo este, de alta relevância uma
vez que permite investigações experimentais rápidas, principalmente daqueles
distúrbios promovidos pela desnutrição apenas tardiamente no ser humano (Bello et al.,
2005).
Existem hoje, varias metodologias pra induzir desnutrição em ratos. Alguns
autores adotam o aumento do número de filhotes da ninhada durante o período de
aleitamento, levando à competição pelo leite materno, diminuindo a disponibilidade de
nutrientes para cada animal individualmente (Chase & MC Khann, 1969; Bell e Slotkin,
1988). Outro método utilizado é através da redução do conteúdo proteico oferecido à
fêmea durante o período de amamentação dos filhotes (Pedrosa & Moraes Santos,
1987). Em outros trabalhos, essa desnutrição é promovida durante a gestação, com
redução do teor de proteínas oferecido às fêmeas (Tonkiss et al., 1998). E ainda, com a
diminuição do conteúdo proteico da dieta após o desmame (Benade et al., 1993).
Todas as metodologias citadas anteriormente são eficazes em promover um
quadro de desnutrição em diferentes fases. No Laboratório de Fisiologia Cardiovascular
(LFC) é adotado há alguns anos como modelo experimental para a desnutrição, a
redução na oferta de proteínas após o desmame (Trópia et al., 2001; Oliveira et al.,
2004; Bezerra, 2009).
Experimentos têm mostrado que a desnutrição seja ela pré- ou pós-natal pode
levar a diversas alterações fisiopatológicas, tais como baixo peso ao nascer, crescimento
retardado, alterações metabólicas, modificação na composição de lipoproteínas
plasmáticas, alterações na hematopoese com baixa produção de novas células com
grande parte apresentando-se anormais, surgimento de diabetes, obesidade, alterações
nos níveis de pressão arterial, hipertrofia glomerular, aterosclerose e um
comprometimento
morfofuncional
com
modificações
no
comportamento
e
5
INTRODUÇÃO
aprendizagem (Lucas et al., 1997; Lucas, 1998; Monteiro, 2003; Almeida e Mello,
2004).
Dados do LFC mostram um aumento do tônus vasomotor simpático em animais
submetidos a um modelo de desnutrição proteica pós-desmame (Trópia et al., 2001). Os
estudos ainda sob o mesmo modelo animal mostraram alterações nos valores basais de
frequência cardíaca (FC) e pressão arterial média (PAM), além do aumento da
variabilidade desses parâmetros, quando analisados em intervalos de noventa minutos,
no domínio do tempo (Oliveira et al., 2004). Loss et al. (2007) demonstraram uma
perturbação da homeostase cardiovascular decorrente da desnutrição. Nesse trabalho
foram mostradas alterações no ganho do barorreflexo antes e após bloqueios
autonômicos além de alteração no período de latência da resposta barorreflexa. Gomide
et al. (2007), relatou ainda que, existe uma importante interação entre o sistema reninaangiotensina e o sistema simpático vasomotor. Foi evidenciada uma hiperatividade do
eixo renina-angiotensina na gênese da pressão arterial em animais desnutridos. Martins
(2007) explanou através da análise da variabilidade da FC no domínio da frequência um
aumento da atividade eferente simpática e redução da atividade eferente parassimpática
após bloqueio autonômico em ratos submetidos à desnutrição proteica, sugerindo uma
disfunção autonômica cardíaca nesses animais. Bezerra (2009) confirmou ainda que a
desnutrição
proteica
pós-desmame
promove
prejuízos
na
regulação
reflexa
cardiopulmonar, com atenuação das respostas hipotensoras e bradicárdicas produzidas
por administração de fenilbiguanida e, ainda, ratos desnutridos apresentam uma menor
queda da atividade simpática após ativação do reflexo Bezold-Jarisch.
1.2 Aspectos fisiológicos do ciclo reprodutivo feminino
Os ratos (e todos os outros modelos animais) podem ser utilizados como uma
poderosa ferramenta de estudo e com possibilidade de aplicação em representações
humanas, contanto que, as diferenças anatômicas e fisiológicas do desenvolvimento
biológico devam ser levadas em consideração (Quinn, 2005).
A utilização de animais experimentais para o estudo do ciclo reprodutivo
feminino é conhecida há muitos anos. Como ratas possuem ciclos reprodutivos curtos,
são animais ideais para verificar alterações que ocorrem durante o ciclo reprodutivo
6
INTRODUÇÃO
(Sportiniz et al., 1999; Marcondes et al., 2001). Esses animais apresentam ciclo estral
regular, que se caracteriza por mudanças morfológicas nos ovários, útero e vagina
(Mendonça et al., 2002).
O ciclo estral tem a duração média de 4 a 5 dias e sendo caracterizado por quatro
fases bem definidas: proestro, estro, metaestro e diestro, os quais podem ser
determinados pelos tipos celulares observados por um esfregaço vaginal (Freeman,
1988; Marcondes et al., 2002).
Proestro é a fase onde os níveis de hormônios gonadotrópicos, Luteinizante
(LH), Prolactina (PRL) e folículo estimulante (FSH), estão elevados e a estimulação do
ovário é máxima, o que se traduz num aumento progressivo na produção dos
estrógenos, fenômeno observado indiretamente pela proliferação do epitélio vaginal.
Isso confere ao esfregaço um grande número de células nucleadas pequenas, poucas
células cornificadas e tipos celulares intermediários, sendo característica dessa fase a
ausência quase total de leucócitos, sendo que a ovulação ocorre na noite desse dia
(Freeman, 1994). O estro corresponde à fase em que a fêmea está receptiva ao macho
(Marcondes, 2002). Nessa fase é observado um aumento máximo no grau de
cornificação do epitélio, o que reflete altos níveis estrogênicos, especialmente se
comprados ao de progesterona. A grande maioria das células apresentam-se cornificadas
e não se observa presença de células nucleadas ou de leucócitos, sendo esta fase pósovulatória. O metaestro e o diestro são fases não férteis do ciclo, caracterizadas pela
presença predominante de leucócitos e muco (Marcondes et al., 2002).
Além dos tipos celulares, os níveis hormonais também podem ser responsáveis
pela determinação da ciclicidade estral. Sendo observado durante a fase fértil níveis
elevados de estradiol, progesterona, FSH e LH. Na fase não fértil estes hormônios
encontram-se diminuídos, (Fink, 1988; Merrian e Silberstein, 2000; Buffet e Bouchard,
2001).
Apesar de não apresentar sangramento vaginal, os mecanismos neuroendócrinos
envolvidos no processo reprodutivo assemelham-se muito ao da mulher. Sendo a
menstruação um processo diferente.
A menstruação é a descamação periódica e cíclica do endométrio progestacional
acompanhada de perda sanguínea devido à ruptura de pequenos vasos sanguíneos, que
ocorre caso não se dê a fecundação do ovócito II, marcando o início de um novo ciclo.
Tem seu início com a menarca, por volta dos 10 a 13 anos de idade, e tem seu último
7
INTRODUÇÃO
evento, a menopausa, por volta dos 45 a 50 anos, tendo uma duração média de 28 dias,
com uma variação de 25 a 30 dias (Silberstein & Merriam, 2000).
O ciclo reprodutivo da mulher, diferentemente do que acontece em ratas, é
composto por duas fases: Uma fase folicular e uma lútea. A primeira fase, folicular,
dura em média 10 a 14 dias sendo caracterizado pela maturação de um folículo ovariano
sob, estimulo do hormônio FSH. Assim, o folículo ovarino inicia secreção de estrógeno
que tem um importante papel no estímulo da proliferação do endométrio. A segunda
fase, lútea, dura de 12 a 14 dias. Nesta fase, sob concentrações máximas de estrógenos,
tem-se a liberação de LH pela hipófise, terminando a maturação folicular com
consequente ovulação, sendo marcante também nesta fase, altas concentrações de
progesterona. (Goldmam et al., 2009). Uma vez o óvulo não sendo fecundado, o corpo
lúteo regride em 9 a 11 dias. (Buffet & Bouchard, 1998). Após esta fase os níveis
séricos de estradiol e progesterona diminuem consideravelmente acarretando na
degeneração e descamação do endométrio provocando assim a hemorragia menstrual
(Robert et al., 2007; Buffet & Bouchard, 2001) .
Um normal funcionamento do ciclo menstrual requer uma coordenada atividade
do hipotálamo com a secreção de hormônio liberador da gonadotrofina coriônica
(GnRH); glândula Pituitária com a secreção dos hormônios glicoproteicos LH e FSH
que por sua vez controlam o
ovário na liberação dos hormônios como estradiol,
progesterona, inibina e ativina e outros moduladores ovarianos, regulando assim, a
maturação folicular, ovulação, formação do corpo lúteo (Silberstein & Merriam, 2000;
Buffet e Bouchard, 2001) . Oscilações dos níveis hormonais em ratas e em mulheres são
demonstradas nas Figuras 1 e 2.
Figura 1- Variação hormonal do ciclo estral em ratas (Buffet & Bouchard, 2001).
8
INTRODUÇÃO
Figura 2- Variação hormonal do ciclo menstrual em mulheres (Buffet e Bouchard,
2001).
Durante o ciclo estral de ratas, o hormônio estradiol é encontrado em altas
concentrações atingindo um pico máximo durante o proestro, tornando a cair no final do
estro, permanecendo em concentrações mínimas até o final do metaestro e diestro
(Richard, 1986).
A progesterona pode ser encontrada em concentrações mais elevadas durante o
metaestro, começando a diminuir até o diestro (Richard, 1986). Durante o proestro sua
concentração diminui consideravelmente com a chegada da ovulação, ainda no estro,
recupera o seu pico máximo, decaindo em seguida para começar a apresentar uma
elevação dos níveis plasmáticos novamente entre o estro e o metaestro (Richard, 1986).
1.3 Desnutrição e ciclo reprodutivo
A puberdade pode ser definida como o período da vida do indivíduo, entre a
infância e a idade adulta, quando se atinge a plenitude das funções reprodutivas. É nesta
fase de maturação que começam a surgir os caracteres sexuais secundários que vão
desenvolvendo-se pela crescente ação hormonal, aceleração do crescimento corporal,
gônadas com capacidade de produzir espermatozoides ou oócitos, aptos a fertilização,
além da ocorrência de alterações comportamentais. A primeira menstruação, chamada
menarca, é um importante marco biológico marcando o início da fase final da
9
INTRODUÇÃO
puberdade. Como é um sinal muito evidente, muitos autores a considera como o fim da
fase púbere (Trench & Santos, 2005)
Tanto em animais como em seres humanos vários são os fatores que exercem
modulação sobre o inicio da fase púbere, tais como, mecanismos intrínsecos de
oscilações hormonais, ações inibitórias de neurotransmissores do sistema nervoso
central (SNC) sobre o funcionamento do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal bem como
fatores extrínsecos, sendo o estado nutricional um fator importante para o
desencadeamento púbere (Warren et al., 1983; Kaplowitz, 2008).
É bem conhecido na literatura que a puberdade de um indivíduo esta relacionada
com a aquisição de determinada massa corporal como evidenciado pelo retardo púbere
nos estados de desnutrição, como também, o ganho excessivo de peso com grande
aumento no índice de massa corporal (IMC) podendo antecipar a puberdade em alguns
anos (Lee et al, 2007). Tanto a desnutrição como uma redução severa no tecido adiposo
parece estar relacionada com atraso da menarca ou mesmo em quadros de amenorreia
observados em atletas de alto desempenho (Baker, 1985). Frisch et al. (1980; 1081)
também observaram que uma diminuição moderada de peso bem como uma perda
significativa da massa gordurosa pode atrasar a menarca em até 10 anos. Sob condições
especiais de uso de medicamentos ou trauma, o início dos ciclos ovulatórios podem
sofrer um atraso por mais de 20 anos (Feigelman et al., 1987).
Além disso, mulheres adultas com baixo peso (10 a 15% do peso ideal), e
também com perda de peso acentuada, como observado em quadros de anorexia
nervosa, bulimia, apresentam um estado e amenorreia primaria ou secundária (Frisch,
1990; Fricsh et al, 1996). Esta subsequente amenorreia observada, esta ligada a uma
disfunção hipotalâmica. O eixo pituitário gonadal esta inalterado, sugerindo que este
tipo de amenorreia é adaptativa prevenindo uma gravidez que seria inviável (Frisch,
1971; Vigersky et al., 1977; Frisch et al, 1996). Mulheres com esse tipo de amenorreia
hipotalâmica apresentam tanto mudanças qualitativas como quantitativas na secreção de
gonadotrofinas, LH, FSH e também o estrógeno. Os níveis séricos de LH, FSH e
estradiol apresentam-se diminuídos, e a resposta do LH para GnRH mostra-se
diminuída em direta correlação com a perda de peso (Warren et al., 1975; Vigersky et
al., 1977). Experimentos realizados em macacos mostraram que um simples dia em
“jejum” foi capaz de provocar a supressão na secreção de LH e testosterona em macho
da espécie, (Cameron, 1993).
10
INTRODUÇÃO
Alguns estudos mostram que o ciclo estral de ratas pode sofrer alterações de
acordo com vários fatores: como idade, estação do ano, origem do animal bem como as
condições alimentares (Mendonça et al., 2002).
Uma menor ingestão alimentar
prejudica a função reprodutiva em fêmeas de mamíferos. A ovulação natural do ciclo
estral acaba não acontecendo, a puberdade é atrasada e os pesos dos ovários tornam-se
diminuídos (Sue Lintern-Moore & Everitt, 1978).
Diversos estudos realizados em humanos e animais têm evidenciado que
agressões nutricionais, independente do tipo, durante períodos sensíveis de
desenvolvimento (fetal, neonatal ou infância) podem causar consequências posteriores
através de um mecanismo conhecido como “programação epigenética” (Baker, 1985;
Barker, 1993).
1.4 Pós-menopausa e Hipertensão arterial
O climatério é a fase da vida da mulher em que ocorre a transição do período
reprodutivo, ou fértil, para o não reprodutivo, devido à diminuição dos hormônios
sexuais produzidos pelos ovários. Já a menopausa, é basicamente a soma de duas
palavras gregas, mês e fim, sendo definido como o último ciclo menstrual da mulher
assim como a menarca é caracterizado como o primeiro (Trench & Santos, 2005). Nesta
fase os ovários, naturalmente deixam de funcionar, e a produção de estrogênio pelas
células foliculares dos ovários diminui, e consequentemente se produzem no organismo,
diversas mudanças fisiológicas, algumas resultantes da cessação da função ovariana
(OMS, 1996). Entretanto, a menopausa pode ser ainda resultante de ovariectomia
bilateral cirúrgica, realizada na mulher ainda em idade fértil (Bassam, 1999).
A OMS considera que uma mulher encontra-se na pós-menopausa após ausência
de menstruação durante 12 meses consecutivos, o que normalmente ocorre entre 45 e 50
anos (OMS, 1996). Atualmente, a maioria dos países ocidentais experimentou uma
melhoria na atenção à saúde o que se traduz num aumento da expectativa de vida, com
isso, espera-se que a mulher passe mais de um terço de sua vida na fase pós-menopausa
(Botrel et al., 2000).
Mesmo com a melhora da atenção a saúde, a literatura mostra que as doenças
cardiovasculares são uma das principais causas de óbito na sociedade moderna (Botrel
et al., 2000). Essa incidência de doenças cardiovasculares ocorre temporalmente de
maneira diferente entre os sexos. A morbiletalidade no sexo feminino apresenta uma
11
INTRODUÇÃO
maior incidência após a menopausa, e principalmente em mulheres jovens com perda da
função gonadal (Kannel et al., 1976; Reckelhoff, 2001).
Ao longo dos anos, muitos estudos têm mostrado diferenças sexo especificas na
incidência de doenças cardiovasculares, e os estrógenos têm sido considerados os
principais colaboradores para essa dissimilaridade (Fismam et al., 2002). Essas
contendas são observáveis ainda no período pós-púbere persistindo durante
adolescência e fase adulta (Himmelmann et al., 1994; Yong et al., 1993). Embora seja
um ponto de muita discussão e controvérsia, muitos estudos têm demonstrado que em
todos os grupos étnicos, homens apresentam um maior risco de doença renal e
cardiovascular quando comparados com mulheres de mesma idade na pré-menopausa
(Reckelhoff, 2001). Além disso, trabalhos utilizando-se da técnica de registro
ambulatorial da pressão arterial por 24 horas têm mostrado que a PA é mais elevada nos
indivíduos do sexo masculino do que feminino em idade pareada. Contudo, após a
menopausa essa diferença é revertida, com a prevalência da elevação da PA sendo
maior na mulher do que no homem de mesma idade (Wiinlberg et al., 1995; Khoury et
al, 1992; Burt et al., 1995). Além disso, grandes estudos populacionais, como o estudo
Framinghan mostram que o risco de infarto agudo do miocárdio é 2,6 vezes mais alto
em mulheres pós-menopáusicas do que pré-menopáusicas (Kannel et al., 1976).
As razões para essas diferenças sexuais da PA ainda não estão muito bem
esclarecidas. Muitos trabalhos têm sugerido, mas não provado, que os estrógenos são
responsáveis pela menor PA em mulheres jovens. Dados sobre a flutuação da PA
durante as fases do ciclo menstrual podem defender essa hipótese. Chapman et al.
(1997), em um estudo de mudanças hemodinâmicas associadas com o ciclo menstrual
mostrou uma menor PA durante a fase lútea, que é a fase de concentrações mais elevada
de estradiol, do que durante a fase folicular. Entretanto, observações opostas também já
foram relatadas, com uma elevação da PA durante a fase lútea (Dunne et al., 1991).
Durante o período gestacional tanto estradiol quanto progesterona encontram-se
elevados, apresentando taxas séricas de 50 até 100 vezes os níveis basais de mulheres
não gravidas e a pressão arterial encontra-se diminuída durante esse período (August,
1990).
Embora os mecanismos pelos quais os estrógenos exerçam sua função
cardioprotetora não estejam bem esclarecidos, existem várias linhas de pensamento
acerca do assunto. Por exemplo, pesquisas têm mostrado que os estrógenos apresentam
uma marcante modulação sobre os níveis de lipídeos e lipoproteínas circulantes
12
INTRODUÇÃO
(Aloysio, 1999). Mulheres na pós-menopausa apresentam uma elevação significativa
dos níveis séricos de colesterol total (CT), triglicérides (TRIG), lipoproteína de baixa
densidade (LDL colesterol) e uma diminuição da fração lipoproteína de alta densidade
(HDL colesterol) (Stevenson et al., 1993). A prevalência dessa síndrome metabólica
leva a um perfil lipídico mais aterogênico com aumento da oxidação de LDL’s levando
ao aparecimento de obesidade central (intra-abdominal) (Carr, 2003). A terapia de
reposição hormonal tem sido empregada, e é capaz de reverter essas alterações
(Grodstein, 1996). O declínio da função ovariana após a menopausa está associado com
o aumento espontâneo de moléculas pró-inflamatórias como a interleucína 1 e 6 (IL-1,
IL-6 ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Pfeilschifter et al., 2002).
Outras linhas de pesquisa levam em consideração as alterações provocadas
diretamente sobre o sistema vascular (Koh, 2002; Tostes, 2003). Trabalhos mostram
que a menopausa esta associada ao dano endotelial e atenuação da vasodilatação
dependente do endotélio (Kublickiene et al., 2005). A diminuição dos níveis de óxido
nítrico (NO) tem sido observada, visto que o estradiol através de receptores específicos
no endotélio e célula muscular lisa tem uma ação modulatória sobre a síntese de NO. A
disfunção endotelial e redução do NO pode também estimular a síntese e liberação de
endotelina (ET-1), resultando em um aumento do tônus vasoconstrictor, estimulando a
liberação e atividade de fatores de crescimento, resultando na hiperplasia da
musculatura lisa e migração dentro da íntima resultando no aumento das moléculas próinflamatórias (Liuzzo, 1994; Koh, 2002). O estradiol é capaz de atenuar vasoconstricção
dependente de ET-1 em artérias coronárias in vitro e in vivo, (Tostes et al., 2003).
Outros trabalhos têm também demonstrado que o estrógeno pode modular a ação da ET1 através da expressão gênica de seus receptores e em contrapartida mulheres tratadas
com reposição hormonal apresentaram diminuição dos níveis séricos de ET-1 e seus
receptores (Saitta et al., 2001).
Outro sistema no qual o estrógeno tem uma importante participação é o sistema
renina angiotensina (SRA). É observada elevação na expressão gênica e nos níveis
séricos de angiotensinogênio em resposta ao estradiol, e tanto a terapia de reposição
hormonal (TRH) quanto o uso de contraceptivos promovem um aumento de seus níveis,
(Fischer et al., 2002; Tostes et al., 2003). Outro fato interessante é a influência sobre os
níveis de renina plasmática. O estradiol é capaz de promover aumento nos níveis de
renina plasmática bem como o de angiotensina I (Ang I). Contudo, sabe-se que a Ang I
é convertida por uma enzima produzida nos pulmões, enzima conversora da
13
INTRODUÇÃO
angiotensina (ECA), em Angiotensina II, que é um agente vasoconstrictor e induz a
proliferação da vasculatura. Com isso, há de se pensar que haveria um aumento de
resistência vascular periférica com consequente elevação da PA. Pesquisadores
acreditam que é através deste mecanismo que alguns anticoncepcionais podem causar
elevação da PA. Em contrapartida, alguns ensaios mais recentes, fazendo uso de novas
tecnologias, como radioimunoensaio, apresentam dados diferentes, mostrando que em
mulheres os níveis de renina são inferiores quando comparados com homens, e em
mulheres na pré-menopausa ou pós-menopausa que recebem Terapia de Reposição
Hormonal (TRH) os níveis de renina diminuem consideravelmente quando comparados
com mulheres pré- e pós menopáusicas que não receberam o tratamento, ( Schunkert et
al., 1997). Outro fato a se considerar é que o estrógeno é capaz de suprimir a atividade
da ECA, com isso promovendo uma significante redução nos níveis de Ang II
(Schunkert et al., 1997; Fischer et al, 2002). Tanto em animais como em seres humanos
a deficiência estrogênica pode levar a um aumento na expressão de receptores do tipo
AT1, (Laborde et al, 2004; Harrisson-Bernard et al., 2003). Harrison-Bernade et al.
(2003) e Labord et al. (2004) mostraram em um experimento com ratas OVX, que a
diminuição de estradiol circulante promoveu uma maior expressão de receptores AT1.
Em contrapartida, o tratamento com TRH é eficaz em promover a diminuição na
expressão desses receptores em diferentes tecidos, como vasos, rins, adrenal e aumento
nas ações da Angiotensina (1-7). A Ang (1-7) apresenta efeitos opostos dos das Ang II,
promovendo uma vasodilatação dependente do NO e também facilitando o reflexo
pressoreceptor (Ferrario et al., 1997). Brosnihan et al.(1999) em um estudo com ratas
OVX, observou que em tratamento preventivo com TRH houve uma redução de
atividade da ECA acompanhado de uma queda nos níveis de Ang II com um
subsequente aumento nos níveis de Ang (1-7).
Pode ainda existir alterações sobre a vasoatividade, com aumento da atividade
do sistema nervoso simpático levando a um aumento do tônus vascular e consequente
elevação da pressão arterial, (He et al., 1998 ; Dantas, 2001; Czarnecka et al., 2009).
Receptores de estrógeno têm sido identificados em centros cerebrais envolvidos com a
regulação cardiovascular, como por exemplo, área pré-óptica, núcleo paraventricular,
núcleo supraóptico, núcleo do tracto solitário, ventrolateral da medula e área postrema
(Pelletier et al., 1988; Simoniam, 1997). Xiao – Rui He et al. (1998) demonstrou em um
experimento realizado com ratas OVX que a administração de estradiol resultou em
uma redução gradual da FC, atividade do nervo renal e splâncnico dentro de 20 minutos
14
INTRODUÇÃO
quando comparados com animais que receberam veículo, mostrando uma inibição da
atividade simpática promovida pelo estradiol. Mulheres sob TRH na pós-menopausa
apresentam uma diminuição na frequência de disparo de um nervo simpático,
constituindo outro mecanismo de efeitos benéficos do estradiol (Vongpatanasin et al.,
2001). A deficiência de estradiol promove ainda um aumento da sensibilidade simpática
barorreflexa (Minson et al., 2000).
Os hormônios sexuais femininos, principalmente os estrógenos, apresentam
inúmeros efeitos sobre o sistema cardiovascular, podendo conferir cardioproteção.
Considerando essa proteção conferida pelo estradiol, há de se destacar que a sua
redução, seja no período pós-menopausa, por outros motivos de supressão hormonal ou
decorrentes de um estado nutricional inadequado, pode significar um grande aumento na
incidência de patologias cardiovasculares.
1.5 Variabilidade da Frequência Cardíaca
Na prática clínica são utilizados diversos marcadores para estimar as condições
de saúde de um indivíduo bem como estimar o risco de acontecimentos cardiovasculares
através de reflexos gerais e específicos.
Com avanço dos tempos e o desenvolvimento de novas tecnologias temos
testemunhado o reconhecimento e a importante relação entre o sistema nervoso
autonômico e mortalidade decorrentes de eventos cardiovasculares, incluindo morte
súbita (Task Force, 1996).
O sistema nervoso autônomo (SNA) exerce um poderoso efeito modulador sobre
o sistema cardiovascular em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Este é formado
por uma gama de neurônios aferentes e eferentes que fazem a conexão entre o sistema
nervoso central (SNC) e os órgãos efetores. O SNA é considerado uma via bineuronal,
por apresentar um braço simpático e outro parassimpático, possuindo um neurônio préganglionar (colinérgicos) localizados no SNC que inervam gânglios (por exemplo,
gânglio simpático, para- ou pré-vertebral) e outro pós-ganglionar, que são redes
neuronais periféricas apresentando neurônios motores que controlam o musculo liso e
outros alvos viscerais. Desse modo, consistem em duas vias paralelas e diferentemente
reguladas (Guyenet, 2006), que exercem funções opostas em algumas situações, por
exemplo, no controle da frequência cardíaca, na musculatura gastrintestinal, mas não
15
INTRODUÇÃO
exercem ações opostas em outras situações como em relação às glândulas salivares e o
musculo ciliar.
O coração então, esta sob influência direta dos dois sistemas, simpático (por
todo o miocárdio) e parassimpático (para o nodo sinusal, miocárdio atrial, e nódulo
atrioventricular) (Rabe, 2007). Esta modulação simpática e parassimpática é fortemente
influenciada por informações oriundas dos barorreceptores, quimiorreceptores, sistema
respiratório, sistema vasomotor sistema termorregulador e do sistema renina
angiotensina aldosterona. Com isso, é possível aceitar que o coração não funciona de
uma forma regular em seus batimentos, e, portanto alterações na FC, definidas como
Variabilidade da Frequência cardíaca (VFC), dentro de um padrão de normalidade,
indicam habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos bem
como compensar desordens induzidas por doenças (Rejandra, 2006: Vanderlei, 2009;
Marães, 2010).
Um dos primeiros estudos contendo informações de que o sistema
cardiovascular, ao ser modulado pelo sistema simpático e parassimpático, era capaz de
modificar a VFC, foi observado no sofrimento fetal à concomitância de distúrbios nos
intervalos R-R entre batimentos cardíacos (Hon & Lee, 1965; Gaziano e Freeman,
1977). Vários estudos na literatura demonstram haver uma importante associação entre
diminuição da VFC e morte súbita, como também foi mostrado em pacientes pósinfartados haver uma forte diminuição da VFC (Wolf et al., 1978). Nos últimos anos
tem surgido na literatura uma significante correlação entre o risco de desenvolver
arritmias letais e sinais de aumento da atividade simpática e, ou diminuição da atividade
parassimpática. Assim, a VFC constitui um potente e independente indicador de
mortalidade cardiovascular. Todas essas observações encorajam pesquisadores a
desenvolverem novos marcadores quantitativos da atividade autonômica (Task Force,
1996).
Como constituir um melhor índice para estabelecer o balanço Simpatovagal?
Existem varias maneiras de se avaliar o SNA, sendo de formas diretas e indiretas. Um
registro direto da atividade de neurônio autonômicos, como velocidade de condução e
amplitude dos picos de atividade elétrica neural, requer dissecação de fibras nervosas
superficiais, tornando esta metodologia inviável na prática clínica. Já metodologias
indiretas baseiam-se na aplicação de um estimulo quantificável e a observação da
resposta fisiológica do órgão alvo de um reflexo autonômico conhecido, ou utilizando-
16
INTRODUÇÃO
se drogas que interfiram direta ou indiretamente sobre a atividade do SNA,
(Hainsworth, 1990; Castro, 1992).
Uma das maneiras de se avaliar o balanço autonômico cardíaco é através de
bloqueio farmacológico do sistema nervoso simpático e parassimpático. Ao se induzir
essa situação obtém-se a frequência intrínseca do coração, essa, determinada pela
velocidade de despolarização do nodo sinoatrial, ou também chamada de ondas de
intervalo R-R. A Figura 3 mostra um exemplo de um intervalo R-R. Quando a
influência vagal é predominante para o coração, a frequência cardíaca é menor que a
frequência cardíaca intrínseca. Já quando a fração simpática prevalece, o que é
observado é uma elevação da Frequência cardíaca, apresentando-se em valores mais
altos que a Frequência cárdica intrínseca (Goldberger, 1999).
Goldberger (1999) propôs um índice para avaliar o balanço autonômico
simpático-parassimpático. Este índice (Vagal-simphathetic Effect), também conhecido
como Índice Autonômico Cardíaco (IAC), é definido como a razão entre o intervalo RR basal (antes do bloqueio farmacológico) e o intervalo R-R intrínseco (após bloqueio
farmacológico). Valores de IAC que presentam-se maiores de 1 mostram a existência de
um predomínio de atividade vagal sobre o coração, e valores que se mostrem inferiores
a 1 caracterizam um predomínio de atividade simpática. Para que o índice seja
amplamente aceito é necessário que obedeça a alguns critérios: 1) o índice deve variar
amplamente e similarmente entre indivíduo em resposta a diferentes estímulos
autonômicos; 2) indivíduos submetidos às mesmas condições autonômicas devem
apresentar uma variabilidade mínima do índice entre si; 3) a resposta do índice às várias
condições autonômicas devem refletir alterações do estado fisiológico e ter uma
interpretação significativa. Este deve fornecer ainda, informações do efeito resultante do
sistema nervoso simpático e parassimpático (Goldberger, 1999). Apesar de ser uma
ótima maneira de se estimar o balanço autonômico, essa metodologia torna-se limitada
na prática clínica, por haver a necessidade da realização de bloqueios farmacológicos do
SNA.
Algumas formas que não apresentam necessidade de administração de fármacos
bloqueadores são descritas. Por exemplo, técnicas em que as alterações sobre o balanço
autonômico são observadas durante modificações graduadas do ângulo de inclinação ao
qual o paciente é submetido, partindo de uma posição em decúbito para a posição
ortostática. Tal modificação induz, por exemplo, através principalmente do baroreflexo,
ativação simpática e inibição vagal provocando elevação da FC, aumento do
17
INTRODUÇÃO
inotropismo, e vasoconstricção periférica cujo, resultado em pacientes saudáveis, é um
discreto aumento da PAM e diastólica, e pouca ou nenhuma alteração na PAS (Wieling
et al., 1985; Montano et al., 1994; Bootsma et al., 1994).
Outra metodologia utilizada para avaliar o balanço autonômico é a manobra de
Valsalva. Esta foi inicialmente descrita como uma forma de expelir pus do ouvido
médio para nasofaringe através da realização de um esforço respiratório contra uma
resistência fixa ou fossas nasais e boca fechadas (Nishimura & Tajik, 1985). Esta
manobra provoca uma sequência de respostas hemodinâmicas que, por sua vez induzem
flutuações da atividade autonômica para o coração e vasos sanguíneos, mediadas pelo
sistema barorrefexo arterial (Elisberg et al. , 1953; Liang & Liu, 2006).
As possibilidades oferecidas por novas técnicas computadorizadas para
quantificar pequenas oscilações das variáveis cardiovasculares (batimento a batimento),
em particular a um eletrocardiograma (intervalo R-R) aumentam a visão de que essas
oscilações rítmicas poderiam gerar alguns discernimentos dentro dos mecanismos
regulatórios neurais que operam em organismos íntegros, os quais estão submetidos a
grandes variações na vida cotidiana.
Avanços na bioengenharia e no processamento de sinais biológicos têm
permitido inúmeras possibilidades de novos procedimentos terapêuticos não invasivos,
bem como o aumento da capacidade de diagnóstico, especialmente na área
cardiovascular (Ribeiro, 1992; 2005).
Nos últimos anos, a análise da variabilidade de frequência cardíaca tem trazido
possibilidades reais de observação e compreensão dos mecanismos extrínsecos do
controle do ritmo cardíaco em situações fisiológicas e patológicas (Ribeiro, 1992;
2005).
Existem várias metodologias para analisar a VFC. Uma dessas metodologias e a
análise da VFC no domínio da frequência. Os fenômenos que apresentam certo grau de
ritmicidade podem ser caracterizados por meio da obtenção do espectro de potência das
ondas senoidais nas frequências que compõem os ritmos, no domínio do tempo. Com
isso, para executar esse procedimento, vê-se necessário transformar os ritmos do
domínio do tempo para o domínio da frequência através de procedimentos matemáticos.
A transformada rápida de Furrier (FFT) torna-se uma excelente ferramenta para
obtenção da densidade espectral da potência (Rajendra et al., 2006).
Métodos no domínio da frequência permitem analisar individualmente o sistema
nervoso autônomo, simpático e parassimpático, em várias situações fisiológicas e
18
INTRODUÇÃO
patológicas e sua relação com outros sistemas que também interferem na VFC,
(Rajendra et al., 2006).
Fazendo uso da FFT, Akselhold et al., (1981) provaram que a análise espectral
da VFC poderia ser utilizada como um método quantitativo para avaliar flutuações na
FC. A densidade espectral pode ser obtida por meio da análise de sucessivas séries de
intervalos R-R obtidos a partir de um sinal eletrocardiográfico. Esse espectro de
potência, geralmente é dividido em três principais regiões: Banda de muito baixa
frequência (VLF) 0,0033 Hz a 0,04 Hz; Banda de baixa frequência (Low frequencyLF) de 0,04 a 0,15 Hz expressa a intensidade de modulação simpática sobre o coração;
bandas de alta frequência (High frequency- HF) 0,15 a 0,4 Hz, que são devidas à
modulação vagal sobre o nódulo sinoatrial. Já em ratos estes componentes espectrais
são encontrados em frequências diferentes que variam de 0,20 a 0,75 Hz (LF) e 0,75 a
2,5 Hz (HF) (Dias da Silva et al., 2001).
A normalização dos dados é frequentemente utilizada para minimizar a
influência da banda de muito baixa frequência. Essa normalização pode ser realizada
através da razão entre as potências de cada um dos componentes HF e LF pelo espectro
total da potência, subtraindo o VLF e multiplicando o valor resultante por 100
(Malliani, 1999). Em palavras mais simples, é feito o cálculo percentual de cada
componente em relação ao espectro total.
A variabilidade da FC representa um dos mais promissores marcadores da
atividade autonômica. A importância clínica deste parâmetro no domínio da frequência
tornou-se evidente no fim da década de 1980 quando ficou confirmado que a
variabilidade da frequência cardíaca era um forte e independente fator de prognóstico de
mortalidade após infarto agudo do miocárdio (Task Force, 1996).
Cada vez mais a utilização da FC e de sua variabilidade, pode viabilizar uma
ferramenta para o uso cotidiano da prática clínica, aprimorando o desenvolvimento de
ferramentas de coleta e analise dos sinais eletrocardiográficos especialmente dos
intervalos R-R. Como a determinação da FC depende da interação entre atividade
simpática e parassimpática e de propriedades das células marca passo cardíacas, a
utilização dessa técnica pode levar à determinação da regulação autonômica tônica de
uma maneira não invasiva (Pagani et al., 1986; Marães, 2010).
19
INTRODUÇÃO
Figura 3- Exemplo de um segmento de intervalo de ondas sucessivas R-R.
Fonte: http://medicblogreloaded.files.wordpress.com/2007/08/ecg.png
20
OBJETIVOS
21
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito da desnutrição e ovariectomia sobre o balanço autonômico cardíaco
em ratas.
2.2 Objetivos específicos
•
Avaliar temporalmente os valores de PAS e FC
• Avaliar os níveis basais de pressão arterial e frequência cardíaca, antes da
ovariectomia e por 4 meses após o processo cirúrgico.
• Avaliar a participação do componente simpático sobre a manutenção dos níveis
basais de frequência cardíaca de ratas controle e desnutridas após privação dos
hormônios estrogênicos.
• Avaliar a participação do componente parassimpático sobre a manutenção dos
níveis basais de frequência cardíaca de ratas controle e desnutridas após privação
dos hormônios estrogênicos.
•
Avaliar o perfil lipídico e proteico em ratas desnutridas
•
Avaliar o ganho de peso e acúmulo de gordura intra-abdominal dos animais após
ovariectomia.
•
Avaliar o efeito da desnutrição sobre a ciclicidade estral de ratas Fisher
22
MATERIAIS E MÉTODOS
23
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1
Modelo animal – desnutrição proteica
Para a realização deste trabalho foram utilizadas ratas Fischer, fornecidas pelo
Laboratório de nutrição experimental da escola de Nutrição, UFOP-MG. Os
procedimentos experimentais seguiram os critérios de ética em experimentação animal,
aprovados pela comissão de ética da instituição no protocolo 2009/10. Após período de
reprodução foram mantidas em um biotério próprio anexo ao Laboratório de Fisiologia
Cardiovascular com todos os procedimentos seguindo também as normas recomendadas
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Após o desmame, realizado com 28 dias, 56 fêmeas foram divididas em quatro
grupos experimentais: Controle Sham (CSham) e Controle OVX (COVX), que
passaram a receber uma dieta comercial Labcil/Socil® contendo 15% de proteína, e
grupos Desnutridos Sham (DSham) e Desnutridos OVX (DOVX), que receberam dieta
experimental de desnutrição contendo 6% de proteína durante 55 dias, para que os
animais pudessem ser considerados adultos jovens, onde teve início o experimento,
prorrogando-se a dieta por mais 28 semanas, totalizando 279 dias ou 40 semanas de
experimento, com animais controle pesando entre 190 e 200 gramas e animais
desnutridos pesando ente 80 e 90 gramas. Os animais foram mantidos durante todo
experimento em regime de temperatura controlada (23±°1C) e ciclo de 12 horas claro e
12 horas escuro e com livre acesso à agua e comida.
3.2 Composições das dietas
As dietas ofertadas aos grupos experimentais diferiram apenas em seu teor
proteico. A ração dada aos animais do grupo controle foi do tipo comercial Labcil/Socil
® que apresenta 15% de proteína. A ração da dieta imposta aos animais do grupo
desnutrido foi preparada no LFC a base de compostos semi-purificados (Tabela 1).
24
Tabela 1- Composição química da dieta para desnutrição experimental (g/100g de
dieta)
1
Ingredientes
Desnutrido
Proteína (Caseína)
6
Amido de milho
79
Óleo de soja
8
Mistura de sais¹
5
Mistura de vitaminas2
1
Fibra (celulose)
1
Teor calórico
422 Kcal
Mistura de sais minerais ( g/kg de mistura): NaCl – 139,3/ KI – 0,79/ MgSO4.7H2O- 57,3/ CaCO3381,4 / MnSO4.H2O – 4,01 / FeSO4.7H2O – 27,0 / ZnSO4.7H2O – 0,548 / CuSO4.5H2O – 0,477 /
CoCl2.6H2O – 0,023 / KH2PO4 – 389,0.
2
Mistura de Vitaminas (g/Kg de Mistura): Acetato de retinol 2.000.000 IU / Colecalciferol –
200.000IU / Ácido p-aminobenzóico – 10,00 / I-Inositol – 10,00 / Niacina – 4,00 / Pantotenato de
cálcio – 4,00 / Riboflavina – 0,80 / Tiamina HCL – 0,50 / Ácido fólico – 0,20 / Biotina – 0,04 /
Vitamina B12 – 0,003 / Sacarose – q.s.p 1000 / Colina - 200,0 / α-Tocoferol – 10.000IU
Devido à natureza do animal, apresentando dentes que apresentam a
característica de crescer intermitentemente, destinados a roer, neste trabalho optou-se
em alterar a forma que a ração desnutrida que foi dada aos animais, da forma de pó,
para o formato de pellets. Com isso esperava-se melhor alimentação dos animais e com
menor perda de peso durante o tempo de tratamento.
Para produção dos pellets da ração, foi preparada uma solução do Polímero
Polivinilpirrolidona a 10% em álcool absoluto. Esta solução foi misturada na proporção
de 115ml para cada 250g da ração em pó. Dessa mistura foram feito os pellets que
secavam com auxilio de um ventilador por 48 horas para garantir total remoção do
álcool.
25
3.3 Protocolos para cirurgia de ovariectomia
Para a realização da cirurgia de ovariectomia dos animais, estes com
aproximadamente 85 dias de vida, foram utilizados Ketamina [0,1ml/100g de peso, via
intraperitoneal (IP), (Vetbrands, São Paulo, Brasil)] e xilasina [0,02ml/100g de peso, via
IP (Agener União, São Paulo, Brasil)] na concentração (ketamina: 80mg/kg ; Xilazina:
7mg/kg). Os flancos direito e esquerdo foram tricotomizados e assepsiados. Com o
animal em decúbito lateral, fez-se uma pequena incisão através da pele e da musculatura
abdominal entre o bordo superior da coxa e a última costela. Através desse orifício, o
ovário foi identificado e exteriorizado. Realizou-se um ponto de ligadura das tubas
uterinas e artérias ováricas, a fim de evitar sangramentos excessivos, e então foi
realizado a remoção dos ovários. As tubas uterinas forram reposicionadas dentro do
abdome, e realizada a sutura local. Os animais foram transferidos para uma gaiola
individual sobre uma manta térmica para minimizar os efeitos hipotérmicos provocados
pelo anestésico.
3.4 Registros da pressão sistólica (PAS) e Frequência Cardíaca (FC)
por Pletismografia de cauda.
Para tal procedimento, após a realização do esfregaço vaginal para constatação
da fase estral em que o animal se encontrava (Proestro, fase escolhida para registros) os
animais foram colocados dentro de um tubo cilíndrico de acrílico, contendo frestas para
ventilação do animal, onde permaneciam por alguns minutos para adaptação ao novo
ambiente. Passado o período de adaptação, as ratas foram aquecidas e ventiladas
adequadamente para o registro de PAS e FC.
Após acondicionamento do animal no tubo de acrílico, este tinha sua cauda
exteriorizada sendo adicionado um manguito de borracha na região proximal da cauda
conectado
a
um
esfingomomanômetro
programado
para
inflar
e
desinflar
automaticamente em intervalos periódicos de aproximadamente 40 segundos. Próximo
ao manguito foi colocado, junto à cauda, um transdutor de sinal com auxílio de um
velcro, para que o eletrodo não se soltasse com eventuais movimentos dos animais. Este
transdutor captava os sinais e os enviava para um computador onde eram registrados. O
26
sinal captado foi enviado a um amplificador de sinais, RTBP 2000 Rat Tail Blood
Pressure System For Rats and Mice (Kent Scientific Corporation) e conectado a um
conversor analógico digital PowerLab/400 (ADInstruments, Austrália). A comunicação
de dados entre o PowerLab e o computador se dá através de um cabo conectado a uma
placa SCSI onde o software Chart for Windows® gerava os registros de pulso, pressão
da bomba e frequência cardíaca a partir dos dados enviados pelo amplificador de sinais
e conversor analógico digital. Após início do registro, quando o sinal se tornava
constante, sem interrupções, era retirado o aquecimento do animal, com o intuito de
evitar um superaquecimento.
Utilizando-se a pletismografia de cauda para o registro de pressão arterial
sistólica, após o inflar do manguito de borracha adicionado à cauda, tem-se a perda dos
sinais de pulso de FC, e concomitantemente, com o desinflar do manguito observa-se o
retorno dos sinais de pulso de FC, como pode ser observada a Figura 3 e Figura 4.
Diante disso, tem-se como PAS, o primeiro sinal (pico) ocorrido após o ciclo de inflar e
desinflar do manguito.
Para análise da PAS, foram tomados dez valores de primeiro sinal (Figura 4) após o
ciclo inflar/desinflar e considerado como valor relativo à PAS a média desses valores.
Para os valores de FC foram adquiridos dez intervalos de dez segundos entre os ciclos
inflar desinflar (Figura 5), e obteve-se a média desses valores, considerando então este
valor médio como o valor relativo à FC.
Os registros de PAS e FC foram realizados mensalmente sempre no dia
correspondente a fase estral do proesto.
27
A
B
C
registro de medida indireta de FC e pressão arterial. A seta indica o primeiro pico de
sinal após o desinflar da bomba. As linhas: representando o sinal pulso (A), inflar de
inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) observa-se a interrupção do sinal de
frequência cardíaca com o inflar da bomba.
28
A
B
C
registro de medida indireta de FC e pressão arterial. As linhas representando; o sinal de
pulso (A), inflar de inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) Período entre chaves
e retângulo vermelho, demonstrando período tomado como Frequência cardíaca
3.5 Preparo e implante das cânulas arteriais, venosas e eletrodos para
ECG
Para preparação das cânulas destinadas ao implante femoral, foi utilizado tubos
de Polietileno PE-50 (Clai Adams, Parsipanny, NJ, EUA), soldados a tubos de
polietileno PE-10 (mesmo fabricante), com dimensões ajustadas de acordo com o
tamanho do animal. Antes do procedimento de implante das cânulas, estas foram
lavadas com solução de salina e preenchidas com solução de salina+heparina (125 U.I.),
para evitar a posterior formação de trombos no interior das cânulas vindo assim a
prejudicar o sinal de registro. A extremidade livre do PE-50 foi obstruída com um pino
de metal. Terminado o preparo das cânulas, os animais foram anestesiados com
isoflurano (na proporção de 2 a 2,5%/2L de O2, por via aérea). Após a tricotomia da
região inguinal e parede anterior externa do tórax realizou-se a assepsia dessas regiões.
Através de uma pequena incisão na região inguinal, o trígono femoral foi exposto
(Figuras 7 A e B), os vasos femorais identificados e separados do nervo femoral. Após a
29
identificação, as cânulas foram implantadas através destes até a aorta abdominal e veia
cava inferior. Em seguida, as cânulas foram exteriorizadas no dorso do animal com
auxilio de um pequeno tubo de metal (Trocater), para permitir o registro e a
administração de drogas com livre movimento. Terminado o procedimento os locais de
incisão foram suturados.
Concluído o processo de cateterização, foram realizados os implantes dos
eletrodos para o registro do ECG na região previamente tricotomizada no tórax.
Na
fabricação dos eletrodos para os registros eletrocardiográficos foram utilizados
conectores RJ45 (Figura 6) de quatro pinos crimpados a fios de cobre rígido.
Figura 6- Imagem representativa de um conector Rj45
Para o implante, foi realizada uma incisão longitudinal de aproximadamente três
cm na região do esterno, entre a musculatura peitoral. Através da incisão no dorso do
animal os fios determinados como 1 e 2, foram transpassados subcutanemente abaixo da
axila esquerda do animal, tomando cuidado com os vasos dessa região, e foram
suturados junto à musculatura peitoral do animal, sendo que o fio 1 foi suturado junto
ao terço lateral do músculo peitoral esquerdo e o fio 2, suturado junto ao terço lateral do
músculo peitoral direito, com os dois fios fazendo uma linha reta na horizontal,
formando uma derivação do triângulo de Einthoven. O fio três remanescente do eletrodo
não transpassado para a região peitoral, foi fixado junto à musculatura da região dorsal
do animal, funcionando assim, como um fio terra, demonstrado na Figura 8.
Encerrada a cirurgia, os animais receberam o Pentabiótico Veterinário Pequeno
Porte (Fort DodgeÒ, São Paulo, Brasil), administrado por via intramuscular profunda na
pata posterior direita para cobertura antibiótica profilática. As ratas foram
acondicionadas em gaiolas individuais e mantidas sobre manta térmica a fim de evitar o
efeito hipotérmico provocado pela anestesia até a passagem completa do efeito da
30
droga. Posteriormente, os animais foram mantidos na sala de experimentos sob
condições de temperatura, luminosidade e níveis de ruído controlados até o momento
dos experimentos. Também durante esse período, os animais receberam alimentação de
acordo com o protocolo previamente estabelecido e água purificada ad libidum.
A
B
.
Figura 7- (A)Local de dissecação do trígono femoral e (B) Isolamento da artéria e
veia femoral e
inserção dos cateteres
31
Figura 8- Desenho esquemático do implante de eletrodos para aquisição dos sinais
eletrocardiográficos.
3.6 Registro da Pressão Arterial e do Eletrocardiograma (ECG)
O animal cateterizado e com eletrodos implantados dois dias antes do registro,
foi levado à sala de registros. Antes da conexão do animal ao equipamento e início do
registro, foi administrada salina heparinizada (125 U.I.) na cânula implantada na artéria
femoral do animal, com o objetivo de impedir a formação de pequenos coágulos que
pudessem vir a obstruir a cânula, prejudicando assim, o sinal de registro durante o
experimento. A cânula foi conectada a um transdutor de pressão (STATHAM P23DB®)
que por sua vez foi conectado à placa de aquisição Akilah 4. O eletrodo de ECG foi
conectado ao mesmo sistema de aquisição que, por sua vez, estava conectado a um
32
computador através de um cabo USB. O registro foi captado através do software
Kananda® em uma frequência de amostragem de 1000 Hz. A partir do registro da
pressão arterial pulsátil foi calculada a pressão arterial média, e a partir do registro de
ECG, foi calculada a frequência cardíaca. Um exemplo da janela de aquisição do
software Kananda ® está representada na Figura 10.
Figura 9- Representação da janela de visualização do software Kananda® durante o
registro eletrocardiográfico e de pressão arterial. As linhas representam o
eletrocardiograma (1º.), pressão arterial pulsátil (2º.), frequência cardíaca (3º.) e pressão
arterial media (4º.).
3.7
Protocolo experimental: Avaliação do controle autonômico da
frequência cardíaca.
Aproximadamente 2 horas antes do registro os animais foram levados para a sala
onde foi realizado o experimento afim de uma melhor adaptação do animal à sala de
registros.
A avaliação do controle autonômico da frequência cardíaca no coração foi
realizada após bloqueio farmacológico do sistema nervoso parassimpático e simpático
com drogas anti-colinérgicas e beta-bloqueadoras (Maeda et al., 1995, Negrão et al.,
1992, De Angelis et al.,1999,2000).
33
Após esse período, o animal foi conectado ao equipamento, sendo esperados
alguns minutos para adaptação do animal ao ambiente. Ao término desse período, foi
realizado o registro por um período de 20 minutos para avaliação dos parâmetros
cardiovasculares basais.
Transcorrido o tempo de aquisição basal, foi iniciada a administração dos
bloqueadores farmacológicos com o intuito de avaliar os componentes, autonômico
simpático e, ou parassimpático cardíaco. Para essa observação foi administrado em
parte dos animais, após o registro basal, injeção endovenosa de um anticolinérgico
(Brometo de Metil-atropina 5mg/Kg), para bloqueio do braço parassimpático para o
coração, registrando o animal por mais 20 minutos. Passado esse tempo foi realizada a
injeção de um beta-bloqueador (Metoprolol 2mg/Kg) com objetivo de bloquear o braço
simpático para o coração. O registro continuou por mais 20 minutos, onde se obteve
dados para avaliação dos parâmetros cardiovasculares sem a interferência do sistema
autonômico para o coração. O grupo restante dos animais foi submetido ao mesmo
protocolo experimental, mas com as drogas sendo administradas na ordem invertida,
sendo primeiro administrado Metoprolol (2mg/KG) e após os 20 minutos Metil-atropina
(5mg/Kg). Assim, os parâmetros cardiovasculares sobre o bloqueio simpático ou
parassimpático pôde ser avaliado separadamente. A Figura 10 mostra um esquema do
protocolo adotado.
Período de
adaptação
Salina
Metil-atropina
Metoprolol
2horas
20 minutos
20 minutos
Basal
Salina
20 minutos
Bloqueio
Parassimpático
20 minutos
Duplo
Bloqueio
34
Período de
adaptação
Salina
Metoprolol
Metil-atropina
2horas
20 minutos
20 minutos
20 minutos
20 minutos
Basal
Salina
Bloqueio
simpático
Duplo
Bloqueio
Figura 10- Esquema dos protocolos experimentais adotados.
3.8 Preparação das Drogas utilizadas
Solução Salina 0,9%: A solução veículo foi preparada dissolvendo-se 9,0 g de
NaCl em q.s.p. 1000,0 ml de água destilada.
Ketamina+ Xilasinas: Solução preparada pela adição de 2 mL de Xilazina 2%
(p/v) a 10 mL de Ketamina 10% (p/v). Utilizada da seguinte forma: dose (ketamina:
80mg/kg ; Xilazina: 7mg/kg ) e volume (0,1mL/100g de animal; i.m.).
Metil-atropina: a solução foi preparada dissolvendo-se 50,0 mg de metil
atropina em q.s.p. 10 ml de salina, de modo que a concentração final fosse de 5 mg/ml.
A solução foi protegida da luz para evitar degradação, acondicionada em tubos de
polietileno Eppendorf e armazenadas a 20º C até o momento do uso.
Metoprolol: A solução de metoprolol foi preparada dissolvendo-se 20,0 mg de
tartarato de metoprolol em q.s.p 10,0 ml de salina, de modo que a concentração do
metoprolol na solução fosse de 2 mg/ml. A solução foi protegida da luz para evitar
degradação, acondicionada em tubos de polietileno Eppendorf e estocada em freezer 20ºC.
35
3.9 Coletas e analise das amostras para análise bioquímica e
Hormonal.
Para as coletas de amostras sanguíneas foram realizados dois procedimentos
distintos de acordo com a disponibilidade do cateter anteriormente colocado nos vasos
femorais para aquisição de registros. Quando os cateteres não apresentavam
entupimento, os animais foram anestesiados e a amostra era recolhida através deste.
Quando os cateteres apresentavam obstruídos, após anestesia, foi realizada punção da
veia cava inferior, e procedia-se a coleta. Coletava-se 2 ml de sangue em seringa de 5
ml previamente preenchidas com 25µl de anticoagulante EDTA (11g/dL e Metilorange
2 mg/dL). As amostras colhidas foram levadas a centrífuga em rotação de 5000 rpm por
quatro minutos, para separação do plasma. Após coleta das amostras, os animais foram
sacrificados em câmara de CO2 para posterior retirada e pesagem dos órgãos: coração,
útero, rins, fígado e gordura intra-abdominal.
As amostras para a realização das dosagens hormonais e bioquímicas foram
sempre coletadas durante a fase do ciclo reprodutivo que compreende o próestro, que é
a fase de maior concentração de estrógeno, a fim de minimizar alterações nos resultados
por influência das modificações nas concentrações hormonais plasmáticas durante as
diferentes fases do período estral. Os animais OVX e desnutridos tiveram as amostras
coletadas sem dia específico, por não apresentarem ciclos estrais característicos.
Para dosagens das frações lipídicas, foi utilizado kit de determinação
quantitativa do tipo Enzimático-Colorimétrico com fator clareante de lípides (LCF) da
(Human do Brasil).
Dosagem das proteínas totais foi utilizado kit de determinação do método
colorimétrico da marca Bioclin.
Para dosagem de HDL, foi utilizado kit para determinação do Colesterol HDL
por metodologia enzimática-colorimétrica direta, Analisa (Gold Analisa Diagnostica
Ltda).
Determinações de Albumina sérica foi feita utilizando kit comercial da
metodologia VBC (verde de Bromocresol), da marca Human do Brasil.
Dosagens de estradiol foram realizadas pela metodologia de Elisa de
competição, (Human do Brasil).
36
Todas as dosagens bioquímicas foram realizadas de maneira automatizada com
auxílio do aparelho CM200 ®Winer.
3.10 Constatação do ciclo estral, coloração e captura das imagens
A determinação da ciclicidade foi realizada por meio de um esfregaço vaginal.
Para efetuar a coleta do material, foi feito o uso de uma pipeta automática de 20µl e
solução salina. Fazendo-se uso da pipeta com uma ponteira, foram introduzidos 20 µl da
solução salina na vagina do animal e este sendo aspirado novamente em um movimento
de lavagem. Após a coleta, o material foi transferido para lâminas histológicas e
espalhados sobre sua superfície com auxílio da ponteira. Para coloração das lâminas
obtidas foi utilizada a técnica de coloração hematoxilina eosina (HE). O ciclo estral das
ratas foi determinado usando o esfregaço e sendo fundamentado na análise do tipo e
quantidade de células descamadas, do índice acidófilo, da infiltração de leucócitos e da
presença de muco.
37
Figura 11- Imagem representativa da metodologia adotada para coleta de secreção
vaginal utilizada pra confecção dos esfregaços. (a,b,c) com auxílio de uma pipeta de 20
µl preenchida com salina (NaCl 0,9%), a qual foi injetada dentro do canal vaginal e em
seguida aspirado. (d) marcação na cauda dos animais para identificação de cada um
durante todo o experimento. (e) lâminas confeccionadas da secreção aspirada e
analisadas em microscópio óptico na objetiva de 40x.
3.11 Análise dos dados
Foi utilizado o mesmo software Kananda ® de aquisição dos registros para fazer
a conversão destes para o formato TXT (arquivos de texto). Depois de efetuada a
conversão foram utilizados os programas Chart5 (ADInstruments, Austrália) e
Cardioseries v1.0 para análise dos registros.
3.12 Análises da Frequência Cardíaca (FC) e Pressão Arterial Média
(PAM)
Para realização das análises da FC e PAM basal, foi calculada a media de 10
minutos do registro antes da injeção de qualquer droga. Após administração do
38
anticolinérgico metil-atropina, foi esperado um período de 5 minutos, e então avaliado a
média de um intervalo de 5 minutos para os valores de FC e PAM. Posterior à injeção
do beta-bloqueador metoprolol, esperou-se mais 5 minutos e então feita à coleta de
dados de 5 minutos do registro para FC e PAM. Realizado o duplo bloqueio foi obtido o
valor correspondente à Frequência Cardíaca Intrínseca (FCI).
3.13 Análise do Tônus autonômico cardíaco
O valor de frequência cardíaca atingida após administração de cada droga foi
considerado a resposta máxima de variação da frequência cardíaca após a
administração. A frequência cardíaca intrínseca foi considerada como sendo a
frequência cardíaca obtida após o duplo bloqueio farmacológico. O tônus vagal foi
considerado como sendo a diferença entre a frequência cardíaca intrínseca e a
frequência cardíaca mínima atingida após o bloqueio com Metoprolol. O tônus
simpático foi considerado como sendo a diferença entre a frequência cardíaca máxima
obtida após o bloqueio com Metil-atropina e a frequência cardíaca intrínseca.
Figura 12- Esquema demonstrativo do duplo bloqueio farmacológico com
metil-atropina (A) e metoprolol (P) para obtenção da frequência cardíaca intrínseca
(FCI), tono vagal (TV) e simpático (TS) cardíaco.
39
3.14 Análise do Índice autonômico cardíaco (IAC)
Para realização do cálculo do IAC foi avaliada a razão entre a média de um
período de 5 minutos de intervalo R-R basal do eletrocardiograma com a média de 5
minutos de intervalo R-R após realização do duplo bloqueio farmacológico com metilatropina e metoprolol.
3.15
Analise da variabilidade da Frequência Cardíaca no Domínio da
Frequência.
Para realizar a análise espectral da variabilidade da frequência cardíaca,
intervalos entre sucessivas ondas R do ECG foram determinadas, e séries, batimento a
batimento de frequência cardíaca (FC) foram geradas.
Para gerar as séries temporais, batimento a batimento, o registro formado no
software de aquisição Kananda® foi convertido em um formato (txt.) e exportado para o
software Chart 5 For Windows (ADInstruments, Australia). Após exportação, foi
realizada contagem dos picos de sucessivos intervalos R-R em um intervalo de 10,
minutos, gerando a série temporal em pontos de 100 ms usando uma frequência de
interpolação de 10 Hz. A série batimento a batimento foi exportada para o software de
análise Cardioseries V1.0. Então, as séries interpoladas foram divididas em segmentos
de 512 pontos (51,2s). Antes do cálculo da densidade do poder espectral, os segmentos
foram inspecionados visualmente e segmentos que apresentavam ruídos foram
desconsiderados. A janela Hamming foi utilizada com intuito de minimizar efeitos
secundários e o e seu espectro foi calculado pela transformada rápida de Fourier (FFT),
que requer intervalos iguais de tempo, e integrados em bandas de baixa (LF: 0,2 - 0,75
Hz) e alta frequência (HF: 0,75 - 3 Hz).
40
Figura 13- Imagem de exemplo da janela de análise de série batimento a batimento no
domínio do tempo do software cardioseries V.1.0.
Mayer
0,5Hz
Hering
2 Hz
Tempo (s)
Tempo (s)
Sinal
Espectro
Tempo (s)
Freq. (Hz)
Figura 14- Figura representativa de um sinal simulado no domínio do tempo e sua
transformação para o domínio da frequência. O sinal é composto de um
componente oscilatório correspondente às Ondas de Mayer (0,5 Hz) e outro às
Ondas de Hering (2 Hz). A transformação pela Transformada Rápida de Fourrier
discrimina os dois principais componentes em frequência que constituem o
sinal.
41
3.16 Análise estatística
Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão das médias (EPM) e
valores de P < 0,05 foram considerados significativos. O programa GraphPad Prism
5.00 (Graphpad Inc.) foi usado para as análises estatísticas. O teste de análise de
variância (ANOVA TWO WAY) seguido de pós-teste de Bonferroni, foram
devidamente
aplicados
para
análise
estatística
dos
dados
coletados.
42
RESULTADOS
RESULTADOS
43
RESULTADOS
4. RESULTADOS
4.1 Efeito da ovariectomia e desnutrição sobre o peso corporal dos
animais.
Todos os animais submetidos à cirurgia de retirada dos ovários sobreviveram ao
procedimento.
Como podem ser notados na Figura 15, os animais pertencentes ao grupo COVX
apresentaram um ganho de peso aumentado (46,71% em relação ao peso inicial de
194,1 ± 3) enquanto que o grupo CSham mostrou um aumento inferior (19,78% em
relação ao peso inicial de 201,8 ± 5), perfazendo um diferença de 26, 9% no ganho
ponderal.
Analisando os animais desnutridos, tanto DSham quanto DOVX não
apresentaram ganho de peso ao final das 28 semanas (após cirurgia). Os resultados
mostram que os animais que receberam dieta com restrição proteica apresentaram ganho
de peso significativamente menor, mostrando se 2,6 vezes inferior. Resultados
mostrados na Figura 16.
a
89, 8 ± 7,9
Ganho dePeso (g)
100
80
60
b
39, 6 ± 2,3
40
20
c
c
4,8 ± 2,8
8,2 ± 2,8
0
Controle Sham (n=13)
Desnutrido Sham(n-7)
Controle OVX (n=13)
Desnutrido OVX (n=7)
Figura 15- Efeitos da ovariectomia de desnutrição sobre o ganho de peso (g) dos
animais após procedimento cirúrgico. Valores numéricos mostram média ± EPM.
Barras seguidas de letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de
Bonferroni para p< 0,05.
44
RESULTADOS
4.2 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre o acumulo de gordura
intra-abdominal
A Figura 17 mostra que o procedimento cirúrgico de remoção dos ovários
promoveu um acúmulo de gordura intra-abdominal nos animais COVX quando
comprados aos animais CSham. Em animais desnutridos, observou-se que a OVX não
promoveu retenção de gordura intra-abdominal. Porém, a restrição proteica imposta aos
animais, causou uma importante redução nos valores de gordura intra-abdominal em
Gordura Intra-abdominal (g)
ambos os grupos desnutridos quando comparados aos controles.
20
a
16,4 ± 0,7
15
b
11,1 ± 0,4
10
5
c
c
0,67 ± 0,09
1,4 ± 0,2
0
Controle Sham (n=7)
Desnutrido Sham (n=6)
Controle OVX (n=7)
Figura 16- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre o acumulo de gordura intraabdominal em ratas, peso (g). Valores numéricos mostram média ± EPM. Barras
seguidas de letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni
para p< 0,05.
45
RESULTADOS
4.3 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre a ciclicidade estral
Através dos esfregaços vaginais realizados durante 30 dias consecutivos, podese constatar que a restrição proteica imposta fez com que os animais desnutridos
apresentassem uma forte alteração na ocorrência das fases características de seu ciclo
reprodutivo. Os animais desnutridos permaneceram estáveis em uma única fase do ciclo
durante todos os dias em que foram realizados os esfregaços, o diesto. Fase esta,
caracterizada pela presença de muco e leucócitos como demonstrado na Figura 18.
Todos os animais submetidos ao procedimento cirúrgico de OVX também
deixaram de apresentar ciclicidade estral, ficando estes animais estáveis em uma só fase
de seu ciclo reprodutivo, o diestro.
Figura 17- Figura representativa de um esfregaço vaginal na fase cíclica do diestro,
obtida em microscópio óptico com aumento de 40 x. (L) indica forte presença de
leucócitos (Marcondes et al., 2002).
4.4 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre os parâmetros
bioquímicos e hormonais
4.4.1 Lipídeos séricos
Como pode ser observado na Tabela 2 e na Figura 19, tanto o procedimento de
OVX quanto a dieta de desnutrição imposta aos animais foram capazes de promover
alterações nas concentrações de lipoproteínas plasmáticas
46
RESULTADOS
As concentrações de LDL mostraram-se aumentadas nos grupos COVX, DSham
e DOVX quando comparadas ao grupo CSham. Não foi observada diferença entre os
animais dos grupos desnutridos.
Pode ser notado, que a análise das concentrações de CT também revelaram
aumento em suas concentrações nos grupos COVX, DSham e DOVX quando
comparados ao grupo CSham. Mais uma vez não faram vistas diferenças entre os
grupos desnutridos.
A análise das concentrações de triglicérides mostrou uma redução em seus
valores no grupo Dsham em relação aos demais grupos que não apresentaram
diferenças.
Tabela 2- Os valores representam média ± EPM da média por grupos experimentais.
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL), lipoproteína de alta densidade (HDL),
colesterol total (CT), Triglicérides (TRIG), Lipoproteína de muito baixa densidade
(VLDL).
Grupos
Frações lipídicas
CSham
COVX
DSham
DOVX
LDL*
30,7 ± 3,6b
57,1 ± 3,2a
61,1 ± 5,3a
62,2 ± 5,6a
HDL*
29,3 ± 2,2a
24,7 ± 2,2a
20,0 ± 1.543a
23,3 ± 1,6a
CT*
70,5 ± 4,6b
93,3 ± 4,7a
88.3 ± 8,7a,b
96.1 ± 6,3a
TRIG*
69,8 ± 10,4a
55,8 ± 10,3a
39,3 ± 9,4b
52,2 ± 4,6a
VLDL*
13,9 ± 2,1a
11,1 ± 2,0a
7,3 ± 2,0a
10,4 ± 0,9a
*Nas linhas, médias seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo
teste de Bonferroni para p< 0,05.
47
RESULTADOS
150
a a
mg/dl
100
b
a
50
a a
a
a
a
a
b
b
0
LDL
HDL
COL
TRIG
VLDL
Controle Sham (n=7)
Controle OVX (n=7)
Figura 18- Efeito da ovariectomia e desnutrição sobre o lipidograma de ratas.
Para cada fração lipídica em questão, médias seguidas por letras diferentes
apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.
4.4.2 Proteínas séricas
Como pode ser observado na Tabela 3 e Figura 20, o procedimento de OVX não
promoveu modificações nas concentrações plasmáticas das proteínas nos diferentes
grupos estudados.
As análises dos dados obtidos mostraram que a restrição proteica imposta aos
animais foi capaz de promover uma redução nas concentrações plasmáticas das frações
proteicas analisadas.
48
RESULTADOS
Tabela 3- Valores médios ± EPM das concentrações séricas (g/dL) das Proteínas
Plasmáticas por grupos.
Frações Proteicas
Grupos
Proteína Total
Albumina
Globulina
CSham
6,38 ± 0,35a
4,54 ± 0,12a
3,69 ± 0,17a
COVX
6,65 ± 0,14a
4,62 ± 0,10a
3,90 ± 0,14a
DSham
5,2 ± 0,12b
2,54 ± 0,08b
2,31 ± 0,11b
DOVX
5,32 ± 0,08b
2,38 ± 0,10b
2,42 ± 0,10b
Médias seguidas por letras diferentes por fração proteica (colunas), apresentam
diferenças estatísticas diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.
8
a
6
a
b
b
g/dl
a
a
a
4
b
b
a
b
b
2
0
Proteina total Albumina
Globulina
Controle Sham (n=7)
Controle OVX (n=7)
Figura 19- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre as concentrações das
proteínas plasmáticas por grupos (mg/dL). Para cada fração proteica em questão, médias
para p< 0,05.
49
RESULTADOS
4.4.3- Estradiol
Como pode ser observada na Figura 20, a análise dos resultados mostram que a
cirurgia de OVX nos animais que receberam a dieta controle foi capaz de gerar reduções
nas concentrações plasmáticas de estrógeno.
Nos animais que receberam a dieta de desnutrição, a cirurgia de OVX não
interferiu nas concentrações séricas de estradiol. Entretanto, estes animais tanto OVX
ou não, apresentaram redução nas concentrações plasmáticas de estradiol.
250
E s tra dio l p g/m L
a
200
189 ± 5
150
100
50
b
26 ± 1,5
b
32,1 ± 1,2
b
28,4 ± 1
0
Controle Sham (n=7)
Controle OVX (n=7)
Figura 20- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre as concentrações plasmáticas
de estradiol por grupos (pg/mL). Valores numéricos representam média ± EPM. Barras
para p< 0,05.
50
RESULTADOS
4.5
Efeitos temporais da desnutrição e ovariectomia sobre pressão
arterial Sistólica e frequência Cardíaca avaliada pelo método de
Pletismografia de cauda
Para os valores referentes à FC, animais desnutridos independente do grupo,
DSham ou DOVX não apresentaram variações ao longo do tempo, mas tiveram os seus
valores aumentados quando comparados aos animais que compreendem os grupos
controles, não sendo observada diferenças entre os grupos desnutridos. (Tabela 4). Para
os animais controles, a FC não modificou ao longo do tempo, e não houve diferenças
entre os grupos CSham e COVX.
Os valores apresentados na Tabela 5 mostram que a OVX não causou alterações
na PAS ao longo do tempo no grupo COVX. Para o grupo CSham, o tempo originou
modificações nos valores de PAS no quarto e quinto mês quando comparado aos valores
iniciais. Comparando os dois grupos controles entre si, o grupo CSham apresentou
valores de PAS maiores no quarto e quinto mês quando comparados ao grupo COVX.
Para o grupo dos animais desnutridos, a OVX também não provocou
modificações pressóricas ao longo do tempo. Entretanto, a desnutrição proteica
acarretou em elevações na PAS tanto no grupo DSham quanto no grupo DOVX em
todos os meses de registro quando comparados aos grupos controles. Ao longo do
tempo houve diferença nesses valores, apenas no grupo DSham no quinto mês quando
comprado ao início do experimento. Entre os grupos desnutridos não houve diferença
quando comparados entre si (Tabela 5).
A análise da comparação entre os animais que receberam dieta controle e os que
ingeriram dieta carente em proteínas mostrou que os animais que pertencem ao grupo
dos desnutridos têm PAS elevada quando comparados aos grupos que receberam a dieta
de desnutrição em todos os meses de registo pressórico.
A Figura 22 ilustra os valores apresentados nas Tabelas 4 e 5. Não sendo
consideradas diferenças significativas.
51
RESULTADOS
Tabela 4- Valores médios ± EPM de FC (bpm), durante 5 meses pelo método de
plestimografia de cauda por grupos experimentais.
Tempo
CSham
COVX
DSham
DOVX
1º. Mês
371,0 ± 5,7b B
370,2 ± 7,3b B
433,1 ± 2,4a A
446,1 ± 7,1a A
2º. Mês
365,8 ± 7,7b B
369,4± 9,4b B
433,7± 23,6a A
399,7 ± 13,6a A
3º. Mês
363,8 ± 4,9b B
368,3 ± 7,2b B
470,5 ± 8,2a A
469,1 ± 17,2a A
4º. Mês
369,2 ± 4,9b B
376,4 ± 8,6b B
444,1± 7,8a A
440,5 ± 9,6a A
5º. Mês
378,9 ± 11,3b B
377,4 ± 10b B
425,9 ± 7a A
409,7 ± 15,3a A
Médias seguidas por letras diferentes nas apresentam diferença significativas pelo teste
de Bonferroni para p< 0,05. Letras maiúsculas comparam grupos nas colunas, ao longo
do tempo, e letras minúsculas comparam grupos horizontalmente intergrupos.
Tabela 5- Valores médios ± EPM de PAS (mmHg), durante 5 meses pelo método de
plestimografia de cauda por grupos experimentais.
Tempos
CSham
COVX
DSham
DOVX
1º. Mês
111,7 ± 1,8b B
117 ± 3b B
129,3 ± 3,8a B
137,1 ± 1,2a A
2º. Mês
111,5 ± 2,5b B
119,3 ± 3,2b B
130,5 ± 6,1a B
139,8 ± 5,6a A
3º. Mês
118,3 ± 2,4b B
119,4 ± 2,9b B
134,7 ± 1,5a B
143,9 ± 1,8a A
4º. Mês
128,1 ± 1,7b A
119,2 ± 3,5b B
137,4 ± 2,4a B
136,5 ± 2,2a A
5º. Mês
133,5 ± 1,5b A
118,7 ± 5,1b B
145,6 ± 1,4a A
151,5 ± 8,1a A
Médias seguidas por letras diferentes apresentam diferença significativas pelo teste de
Bonferroni para p< 0,05. Letras maiúsculas comparam grupos nas colunas, ao longo do
tempo, e letras minúsculas comparam grupos horizontalmente intergrupos.
52
RESULTADOS
PAS (mmHg)
180
160
140
120
5
ês
4
M
M
ês
3
ês
M
M
Controle Sham (n=7)
Controle OVX (n=7)
550
500
450
400
350
5
M
ês
4
M
ês
3
ês
M
ês
M
ês
M
2
300
1
Frequência Cardiaca (bpm)
M
ês
ês
2
1
100
Controle Sham (n=7)
Controle OVX (n=7)
Figura 21- Figura ilustrativa do Efeito temporal da restrição proteica e ovariectomia
sobre a PAS e frequência cárdica, aferidos durante cinco meses.
53
RESULTADOS
4.6
Efeito da desnutrição e ovariectomia sobre FC e PAM basais
medidos pelo método direto (cateterização).
Não foram observadas diferenças nos valores de PAM entre os grupos estudados.
Entretanto, a analise dos dados mostram aumento nos níveis basais de FC nos grupos
DSham e DOVX em relação aos grupos CSham e COVX durante o quinto mês de
experimento. Os resultados estão representados na Figura 23.
54
RESULTADOS
500
400
a
b
392 ± 14
460 ± 13
a
453 ± 14
b
373 ± 14
300
200
100
0
Controle OVX (n=10)
B
as
al
A
B
150
PAM (mmHg)
107,1 ± 2
107,1 ± 3
114,1 ± 4
108,4 ± 3
100
50
0
Controle OVX (n=10)
Figura 22- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre níveis Basais de FC (A) e
PAM (B) nos grupos Controles (Sham, OVX) e Desnutridos (Sham, OVX). Valores
numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam
diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.
55
RESULTADOS
4.7
Balanço Autonômico
4.7.1 Efeitos do bloqueio vagal (Metil-atropina) sobre os níveis de
PAM e FC
Como pode ser observado nos valores apresentados na Tabela 6 e ilustrado na
Figura 24 administração endovenosa do anticolinérgico metil-atropina (5mg/kg)
promoveu uma elevação nos valores da FC do Grupo CSham em relação aos valores
basais (p<0,005). Porém, o bloqueio vagal não evocou aumentos significativos no grupo
COVX.
O bloqueio farmacológico não foi capaz de promover alterações na FC dos
grupos DSham e DOVX.
Não foram observadas alterações sobre os valores de PAM após bloqueio
farmacológico do braço parassimpático nos diferentes grupos estudados (Figura 24 ).
56
RESULTADOS
basal e após bloqueio farmacológico com metil-atropina.
Parâmetros Cardiovasculares
Grupos
FC
Comparação
FC Basal*
Basal
392,7 ± 14,5
B
Metil.
456,9 ± 18,2
Basal
373 ± 14,3
Metil.
382,2 ± 22,4
Basal
461 ± 13,1
Metil.
425,8 ± 23,2
Basal
453,7 ± 14,5
Metil.
431,5 ± 22,4
Comparação
FC Metil. **
Comparação
intra
grupo***
PAM
α
107,1 ± 2,8
β
105,2 ± 2,5
CSham
b
B
107,3 ± 3,7
COVX
a
A
97,8 ± 10,9
109,8 ± 5,8
DSham
a
A
107,9 ± 5,8
108,4 ± 3,8
DOVX
a
106,2 ± 4,9
*Médias acompanhadas de diferentes letras maiúsculas na coluna (Basal) apresentam
diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.**Médias acompanhadas de
diferentes letras minúsculas na coluna (metil) apresentam diferença estatística pelo teste
de Bonferroni para p< 0,05.***Médias acompanhadas por letras gregas diferentes na
coluna (intragrupo) apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p<
0,05.
57
RESULTADOS
Frequência Cardíaca (bpm)
A
500
400
a
b
b
a
a
a,b a,b
b
300
200
100
0
Basal
Metilatropina
Controle Sham (n=10:n=6)
Desnutrido Sham (n=10:n=6)
Controle OVX (n=10:n=6)
Desnutrido OVX (n=10:n=6)
PAM (mmHg)
150
B
100
50
0
Basal
Metilatropina
Controle Sham (n=10:n=6)
Desnutrido Sham (n=10:n=6)
Controle OVX (n=10:n=6)
Desnutrido OVX (n=10:n=6)
Figura 23- Efeitos do bloqueio farmacológico com anticolinérgico (metilatropina) sobre a FC (A) e PAM (B) dos grupos Controle (Sham e OVX),
Desnutrido (Sham e OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam
58
RESULTADOS
4.7.2 Efeitos do bloqueio farmacológico do sistema nervoso simpático
realizado com Beta-bloqueador (metoprolol) sobre a PAM e FC
As análises dos dados na Tabela 7 mostraram que as respostas cardiovasculares
ao bloqueio do sistema nervoso simpático após administração endovenosa de
metoprolol foi uma diminuição da FC no grupo COVX quando comparado ao seu valor
basal (p<0,005) e também quando comparado ao grupo CSham, DSham e DOVX.
Observou-se também redução da FC nos grupos DSham e DOVX quando comparados
aos seus valores basais. Não foram observadas diferenças nos valores de FC do grupo
CSham quando comparado aos seus valores basais. Novamente não foram notadas
alterações na PAM em qualquer um dos grupos em estudo quando comparado aos seus
valores basais ou intergrupos (Tabela 7 e Figura 25).
59
RESULTADOS
Tabela 7- Parâmetros Cardiovasculares, FC (bpm) e PAM (mmHg) Os valores
basal e após bloqueio farmacológico com metoprolol.
Grupos
FC
Comparação
Basal*
Basal
392,7 ± 14,5
B
Metop.
357,5 ± 14,7
Basal
373 ± 14,3
Metop.
304,7 ± 9,3
Basal
461 ± 13,1
Metop.
369,3 ± 18,3
Basal
453,7 ± 14,5
Metop.
384,1 ± 6,2
Comparação
Metop.**
Comparação
intragrupo***
PAM
107,1 ± 2,8
CSham
a
110,6 ± 3,7
B
107,3 ± 3,7
COVX
a
A
104,1 ± 2,2
β
109,8 ± 5,8
α
102,5 ± 7,9
β
108,4 ± 3,8
α
105,1 ± 4,6
DSham
a
A
DOVX
a
*Médias acompanhadas de diferentes letras maiúsculas na coluna (Basal) apresentam
diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.** Médias acompanhadas de
diferentes letras minúsculas nas colunas (Metop.) apresentam diferença estatística pelo
teste de Bonferroni para p< 0,05.***Médias acompanhadas por letras gregas diferentes
na coluna intragrupos apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p<
0,05.
60
RESULTADOS
A
500
a
b
400
a
b
b
b
b
c
300
200
100
0
Basal n=10
Controle Sham
Controle OVX
Metoprolol n=5
Desnutrido Sham
Desnutrido OVX
B
PAM (mmHg)
150
100
50
0
Basal n=10
Controle OVX
Controle Sham
Metoprolol n=5
Desnutrido Sham
Desnutrido OVX
Figura 24- Efeitos do bloqueio farmacológico com β1-bloqueador (metoprolol) sobre a
FC (A), e PAM (B) nos Grupos Controle (Sham e OVX), Desnutridos (Sham e OVX).
Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de
Bonferroni para p< 0,05.
61
RESULTADOS
4.7.3 Efeito do duplo bloqueio farmacológico (metil-atropina e
metoprolol) sobre os níveis de PAM e FC
Os Valores das respostas hemodinâmicas após duplo bloqueio farmacológico,
com metil-atropina e metoprolol, (e vice versa) estão representados na Tabela 10 e
ilustrados nas Figuras 26 A e B. Depois de realizado duplo bloqueio farmacológico, a
FC diminuiu em todos os grupos em relação às suas respectivas situações basais. Não
sendo observadas diferenças significativas entre os grupos após o bloqueio
farmacológico. Para o parâmetro de PAM não foram observadas diferenças após duplo
bloqueio.
A análise do delta (∆) de variação da FC após duplo bloqueio mostrou uma
diferença significativa entre os grupos que receberam a dieta controle e os que
ingeriram dieta carente em proteínas. Estes resultados estão apresentados na Figura 27.
62
RESULTADOS
basal e após duplo bloqueio farmacológico.
Grupos
FC
*Comparação
Basal
Basal
392,7 ± 14,5
B
Duplo
Bloq.
347,3 ± 9,9
Basal
373 ± 14,3
Duplo
Bloq.
317,4 ± 13,1
Basal
461 ± 13,1
Duplo
Bloq.
332,2 ± 11,6
Basal
453,7 ± 14,5
Duplo
Bloq.
337,6 ±11,2
**Comparação
duplo
***Comparação
intragrupo
PAM
α
107,1 ± 2,8
β
105,0 ± 3,1
α
107,3 ± 3,7
β
99,3 ± 5,3
α
109,8 ± 5,8
β
106,8 ± 5,1
α
108,4 ± 3,8
β
102,6 ± 3,04
CSham
a
B
COVX
a
A
DSham
a
A
DOVX
a
*Medias acompanhada de diferentes letras maiúsculas na coluna (Basal) apresentam
diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.**Médias acompanhadas de
diferentes letras minúsculas na coluna (metil) apresentam diferença estatística pelo teste
de Bonferroni para p< 0,05.***Médias acompanhadas por símbolos diferentes na
coluna (BM) apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.
63
RESULTADOS
a
500
400
b
a
b
A
c
d
c
300
200
100
0
Basal
Controle OVX (n=10)
Duplo Bloqueio
B
150
PAM (mmHg)
c
100
50
0
Basal
Controle OVX (n=10
Duplo Bloqueio
Figura 25- Efeito do duplo bloqueio farmacológico com anticolinérgico metil-atropina
e β1-bloqueador metoprolol sobre a FC (A) e PAM (B) nos grupos controles (Sham e
OVX) e desnutridos (Sham e OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam
64
RESULTADOS
0
∆ (bpm)
-50
-45 ± 15
-100
b
- 55 ± 12
b
-116 ± 13
-150
- 127 ± 19
a
a
-200
Controle OVX (n=11)
Figura 26- Efeito do duplo bloqueio farmacológico sobre o ∆ de variação da FC
dos Grupos Controle (Sham e OVX), Desnutridos (Sham e OVX). Valores
numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes
4.7.4 Avaliação do Índice Autonômico Cardíaco (IAC)
A avaliação do índice autonômico cardíaco apresentou-se de forma distinta entre
os grupos estudados, apesar de todos os grupos apresentarem valores inferiores a 1. A
análise dos dados apresentados na Figura 27 mostra redução no IAC dos grupos que
receberam a dieta carente em proteínas (Dsham e DOVX) quando comparado aos
grupos que receberam a dieta controle (Figura 28).
65
RESULTADOS
a
1.0 0,89 ± 0,03
a
0,85 ± 0,03
b
b
0,73 ± 0,03 0,74 ± 0,02
0.8
IAC
*
0.6
0.4
0.2
0.0
Controle OVX (n=10)
Figura 27- Índice Autonômico Cardíaco dos grupos controle (Sham e OVX) e
desnutrido (Sham e OVX). Valores numéricos representam média ± EPM. Barras
para p< 0,05.
4.7.5 Análises do tônus autonômico cardíaco
A análise dos dados apresentados na Figura 29 mostra que o procedimento de OVX
promoveu uma redução no tônus simpático no grupo COVX quando comparado ao grupo
CSham. A OVX não causou aumento do tônus simpático nos animais desnutridos.
Quanto à participação parassimpática, a OVX provocou um aumento do tônus
parassimpático nos animais COVX quando comparado ao grupo CSham. A restrição
proteica promoveu uma redução no tônus parassimpático nos animais pertencentes a
esse grupo.
66
RESULTADOS
A
a,b
150
a,b
a
99 ± 13
∆ FC(bpm)
106 ± 8
100
112 ± 20
b
63 ± 12
50
0
Controle Sham (n=6)
Controle OVX (n=6)
B
c
∆ FC(bpm)
50
35 ± 8
0
-50
-10 ± 18
b
-57 ± 27
-100
a
Controle Sham (n=5)
Controle OVX (n=5)
-74 ± 15
a
Figura 28- Tônus simpático (A) e parassimpático (B) dos grupos Controles e
Desnutridos. Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras
diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05.
67
RESULTADOS
4.7.6 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre a razão entre as
potências do espectro de FC
A Figura 30 mostra razão entre as potencias do espectro de FC nas bandas de LF
e HF (LF/HF) não apresentou diferenças entre o grupo CSham e COVX, mostrando que
a ovariectomia não alterou a relação dos espectros, o mesmo foi observado entre o
grupo DSham e DOVX. Contudo, quando comparado os grupos que receberam a dieta
controle e os grupos que receberam a dieta hipoproteica, a análise dos resultados mostra
que a desnutrição proteica elevou a razão LF/HF dos espectros de FC tanto para o grupo
DSham quanto DOVX.
1.0
a
a
0,73± 0,09
0,71± 0,09
LF/HF
0.8
0.6
b
b
0,47± 0,04 0,45±
0,03
0.4
0.2
0.0
Controle Sham (n=7)
Controle OVX (n=9)
Figura 29- Relação dos espectros de FC (LF/HF) dos grupos Desnutridos e Controles.
Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes
68
DISCUSSÃO
69
DISCUSSÃO
5.
DISCUSSÃO.
Os resultados do presente trabalho demonstram que tanto a desnutrição quanto
OVX em ratas Fisher provocam alterações no metabolismo lipoproteico levando a um
perfil lipídico aterogênico (Figura 18). A OVX induz também, uma retenção elevada de
gordura na cavidade intra-abdominal, um importante fator de risco para doenças
cardiovasculares (Figura 16). Foi observado igualmente que, a desnutrição além de
promover uma redução acentuada no peso corporal dos animais, é capaz de alterar a
ciclicidade estral, induzindo redução dos níveis séricos de estradiol com consequente
cessação dos ciclos estrais. E ainda, ratos desnutridos mostram reduções marcantes nas
concentrações das proteínas plasmáticas, principalmente as de albumina (Figura 19). As
avaliações hemodinâmicas mostraram que a OVX, pode interferir nos efeitos de drogas
bloqueadoras do SNA, metil-atropina e metoprolol, mas não alterou claramente o
balanço autonômico cardíaco nos animais submetidos a tal procedimento (Figuras 23,
24 e 25). Porém, a desnutrição proteica induziu um desequilíbrio do balanço
simpatovagal nos animais submetidos à dieta com baixo teor de proteína, sugerindo
importantes modificações autonômicas neste modelo experimental.
Mesmo com o avanço nos programas de atenção básica à saúde, os investimentos
por partes de fundações de amparo e governos, a desnutrição é ainda hoje considerada
um dos maiores problemas de saúde enfrentados por países em desenvolvimento.
Barker et al. (1995), foram um dos primeiros grupos a levantar a possibilidade da
"origem fetal das doenças na idade adulta". Eles se basearam na hipótese de que a
privação nutricional dentro do útero "programaria" o recém-nascido para uma vida de
escassez. Neste caso, a desnutrição promoveria efeitos irreversíveis. As sequelas da
desnutrição também são visíveis ao longo das gerações, pois uma mãe desnutrida gera
filhos com baixo peso, que por sua vez, se sobreviverem, carregarão as deficiências
nutricionais e transmitirão suas consequências para seus filhos. Entretanto, ainda é
necessário mais estudos para um completo entendimento das alterações provocadas por
essa condição patológica.
Baseando-se nesses fatos, é de fundamental importância o desenvolvimento de
novas metodologias de estudo, como também o desenvolvimento de modelos
experimentais que mimetizem as condições de carência nutricional em seres humanos
para que seja viável um completo entendimento das alterações causadas por essa
70
DISCUSSÃO
síndrome. Experimentos com animais têm permitido cada vez mais esclarecimentos e
são muito importantes para verificar fisiopatologias específicas da desnutrição,
contando que as diferenças anatômicas e fisiológicas do desenvolvimento biológico
devam ser levadas em consideração (Quim, 2005).
No LFC, é utilizado o rato como modelo animal por apresentar metabolismo
acelerado, ciclo reprodutivo curto e ser de fácil manuseio. O modelo de desnutrição
proposto foi baseado na redução do conteúdo proteico da dieta oferecida após o
desmame de 15% para 6%, o que representa uma redução de 60% da proteína ofertada
aos animais. O modelo de desnutrição proteica pós-desmame adotado no LFC é
justificável, visto que ainda hoje, devido principalmente à pobreza, muitas crianças têm
uma alimentação inadequada após amamentação e durante toda infância. Essa
metodologia já vem sendo utilizada por vários autores, e assemelha-se aos métodos
utilizados em outros trabalhos da literatura (Agarwal et al., 1981; Lukoyanov et al..,
2000; Tropia et al., 2001 Ferreira et al., 2003a; Oliveira et al., 2004; Loss et al., 2007;
Bezerra, 2009 ).
A desnutrição do tipo Kwashiorkor pode ser caracterizada pela deficiência de
proteína na dieta, além de vitaminas e sais minerais, onde a alimentação ingerida na
forma de carboidrato é normal (arroz, milho e mandioca, por exemplo; alimentos de
baixo custo), não ocorrendo o mesmo com a ingestão de fontes alimentares ricas em
proteínas (como por exemplo, a carne bovina e/ou de aves; alimento de custo elevado)
(Mendonça, 2003).
No presente trabalho, foi observado que após aproximadamente 40 semanas de uma
dieta carente em proteínas, mas isocalórica em relação à dieta ofertada aos grupos
controles, os animais pertencentes aos grupos desnutridos apresentaram uma redução
média de 67% em seu peso corporal (Figura 16). Muitos outros trabalhos, com modelos
experimentais ao longo dos anos, têm afirmado que a deficiência em proteínas ou
mesmo a restrição alimentar pré-natais causam retardo no crescimento fetal. Em
animais, a desnutrição proteica crônica imposta a várias gerações, resultou em
diminuição marcante do peso ao nascer, tamanho de órgãos, maturação sexual,
comportamento e padrões de aprendizagem. De uma maneira ampla, o baixo peso ao
nascer, a redução do peso e baixa estatura nos anos seguintes pode ser utilizado como
um indicador básico de desnutrição (Stewart, 1975; Benade et al., 1993; Lucas, 1998;
Galdino, 2000).
71
DISCUSSÃO
Quando se leva em consideração o ganho de peso dos animais durante o período
experimental, os animais COVX apresentaram um significativo ganho de peso (46,71%)
quando comparado ao grupo CSham (19,78%) (Figura 16), destacando o grande
acúmulo de gordura intra-abdominal nos animais OVX. O grupo DOVX, por sua vez,
não apresentou ganho significativo de peso quando comparado ao DSham, como
também não mostrou aumento do corpo adiposo intra-abdominal (Figura 17).
Os
grupos desnutridos apresentaram ganho de peso inferior, cerca de 2,6 vezes quando
comparado aos grupos controles. No entanto, a ausência do ganho de peso observada
nos grupos desnutridos corrobora com dados da literatura que sugerem que o baixo teor
proteico, provavelmente, não disponibiliza aminoácidos suficientes para que o
organismo possa ter seu desenvolvimento ideal (Lucas, 1998). É importante ressaltar na
literatura, que a deficiência dos hormônios ovarianos, em especial os estrógenos,
favorece o surgimento de obesidade central (adiposidade intra-abdominal), a qual pode
desencadear diversas complicações metabólicas e elevar o risco de patologias
cardiovasculares, e que a TRH é capaz de reverter esse quadro (Tchernof & Poehlman,
1998; Geary & Asarian, 1999; Toth et al., 2000), concordando com os achados deste
estudo, em que os animais COVX apresentaram maior peso e maior retenção de gordura
intra-abdominal (Figura 16 e 17). Diante dos dados mostrados, é possível afirmar que a
dieta composta de 6 % de proteína (caseína) foi eficaz em promover a desnutrição
experimental e que a remoção dos ovários foi capaz de gerar alterações metabólicas
induzindo ao aumento de peso dos animais.
Nesta pesquisa, os achados sobre a influência da OVX e da desnutrição sobre a
ciclicidade estral de ratas foram similares. O ciclo reprodutivo de ratas é caracterizado
por quatro fases distintas: proestro, sendo uma fase em que há o predomínio de células
nucleadas pequenas no esfregaço com ausência quase que total de leucócitos; estro,
apresentando grande número de células cornificadas não havendo presença de células
nucleadas e leucócitos; metaestro e diestro são fases não férteis apresentando pouca
diferença entre elas, existindo um predomínio quase que total de leucócitos e muco no
esfregaço. Todo o ciclo possuindo uma duração média de quatro dias (Long & Evans
1922; Freeman, 1988; Marcondes et al. 2002). Para identificar e caracterizar cada fase
do ciclo pode ser feito uma lâmina histológica contendo um esfregaço vaginal, onde, de
acordo com a citologia será determinado em qual fase do ciclo o animal se encontra, em
concordância com os tipos celulares observados (Long & Evans, 1922; Marcondes et
al., 2002).
As análises diante de esfregaços realizados durante 30 dias consecutivos
72
DISCUSSÃO
mostraram que após OVX ocorre cessação da ciclicidade estral, ficando este
estacionado na fase diestro, com diminuição significativa nas concentrações de estradiol
plasmático, tanto para animais desnutridos como controles (Figura 18 e Figura 21).
Interessantemente, os animais pertencentes ao grupo DSham, isso é, aqueles que não
sofreram a remoção dos ovários, também apresentaram parada da ciclicidade estral no
diestro, e diminuição significativa nas concentrações séricas de estradiol (Figura 21).
Estas análises concordam com dados da literatura que relatam que após OVX, tanto
humanos quanto animais, deixam de apresentar ciclos estrais e menstruais. E em
situações de carência nutricional ocorre a interrupção dos ciclos estrais que leva a
inviabilidade de ocorrência de prenhez (Fortepiane et al., 2002; Frisch et al., 1990;
1996).
Com isso, pode-se inferir que a indução de um estado de desnutrição em ratas com
consequente perda de peso e tecido adiposo, induziu um estado de anestro secundário.
Esses dados corroboram com dados da literatura que relatam que a restrição proteica
durante a gestação ou durante períodos críticos do desenvolvimento levam a uma
disfunção do ciclo reprodutivo em adultos (Wade & Jonnes, 2004; Lee et al., 2007) bem
como a privação alimentar grave na idade adulta acarreta cessação da ciclicidade estral
em ratas (Nakanishi et al., 1976). Outros experimentos com animais relatam ainda
redução da glândula pituitária, ovários e do útero (Tropp & Markus, 2001). Neste
experimento, tanto a OVX quanto a desnutrição promoveram uma redução significativa
no peso uterino, ressaltando que a restrição proteica também provocou redução sobre o
peso dos ovários (dados não mostrados). A privação alimentar na fase adulta em
humanos e perda severa de peso como observado em quadros de bulimia, anorexia
nervosa afetam a taxa de ovulação, o comportamento cíclico, receptividade sexual
levando a um quadro de amenorreia (Tropp & Markus, 2001; Fricsh et al., 1990).
Muitos estudos têm analisado e demonstrado uma correlação entre aumento na
incidência de doenças cardiovasculares após a menopausa como também em quadros de
perda da função ovariana por intervenção cirúrgica ou medicamentosa (Kannel et al.,
1976; Gordon et al., 1978; Rossi et al., 2002). Um dos mecanismos pelo qual a redução
de estrógenos eleva o risco de eventos cardiovascular é por meio de modificações no
perfil lipídico. É sabido que os estrógenos aumentam a síntese hepática do receptor de
LDL (apo-B100) elevando seu catabolismo, e portando, diminuindo os níveis de LDL
circulante. Os estrógenos também agem aumentando a atividade da enzima lipase
lipoproteica assim elevando os níveis de HDL e reduzindo Triglicérides (Kovanen et
73
DISCUSSÃO
al., 1979;
Aloysio et al., 1999). Com isso, a deficiência estrogênica leva a um
desequilíbrio de tal modo, que promoveria elevação dos valores séricos de CT, LDL,
Triglicérides e uma redução nos níveis de HDL, tornando assim um perfil lipídico
aterogênico. Stevenson et al., (1992) em um trabalho com mulheres saudáveis, de idade
entre 18 e 70 anos, relatou que as mulheres que estavam no período pós menopausa
apresentaram um aumento nos níveis séricos de CT, triglicérides de LDL, bem como
uma redução da fração HDL. Já as mulheres que pertenciam ao grupo que não estavam
no pós-menopausa apresentaram valores inferiores. Além disso, pesquisadores têm
observado que a TRH pode minimizar os efeitos da ausência estrogênica sobre os
lipídeos plasmáticos, promovendo redução de LDL, triglicérides e elevando os níveis de
HDL reduzindo o risco de doença cardiovascular (Koh, 2002).
Os achados deste
trabalho mostram que em ratas, a OVX bilateral promoveu uma significativa elevação
nas concentrações séricas de LDL, CT e triglicérides quando comparado ao grupo
CSham, corroborando com os dados apresentados na literatura (Tabela 2 e Figura 19).
Os resultados mostram também que os animais do grupo DOVX bem como o grupo
DSham apresentaram elevações séricas de suas frações lipídicas. É bem documentado
na literatura que a restrição alimentar acarreta em perda significativa de peso,
diminuição no tamanho de órgãos, maturação sexual, comportamento e padrões de
aprendizagem (Stewart, 1975; Benade et al., 1993; Galdino, 2000), como também uma
alteração na ciclicidade estral de ratas, levando á uma diminuição nos níveis circulantes
de estradiol. Baseado nisso, em nosso estudo tanto os animais DOVX como os animais
DSham, por apresentarem redução nos níveis estrogênicos, estariam susceptíveis a
alterações acentuadas em seu perfil lipídico.
Por outro lado, temos um quadro de desnutrição proteica, podendo levar a uma
situação
clínica
conhecida
como
síndrome
MIA
(malnutrition-inflamatory-
atherosclerosis) a partir da hopoalbuminemia. A restrição proteica é claramente uma
potencial causa na redução da síntese hepática de albumina, diminuindo as
concentrações de albumina plasmática (Kaysen et al., 1995). O fígado é o único órgão
que tem a capacidade de síntese da albumina perfazendo 2/3 das proteínas plasmáticas
totais. Quadros de privação alimentar pode causar redução de até 50 % em sua
produção. Essa hipoalbuminemia mostra correlação, do tipo inverso, com os níveis de
colesterol total e LDL produzindo alterações fisiopatológicas no metabolismo lipídico
através da diminuição da pressão oncótica, o que estimula a síntese hepática de
albumina e outras proteínas, inclusive apolipoproteinas, determinando também o
74
DISCUSSÃO
aumento de CT, triglicerídeos e lipoproteína (a) além da diminuição de HDL (Klafke et
al., 2005). Nesta investigação os animais pertencentes ao grupo DOVX e DSham
apresentaram
um aumento significativo nas concentrações séricas de LDL, CT e
triglicérides (Tabela 2 e Figura 19), mostrando correlação negativa com as
concentrações séricas de proteínas totais e albumina, corroborando com os resultados
mostrados na literatura (Klafke et al., 2005). Com isso, pode-se inferir que as alterações
no perfil lipídico do grupo DOVX não é apenas consequência da diminuição dos níveis
de estradiol, mas também somada a alterações provocadas pela ingestão reduzida de
proteínas.
A metodologia de pletismografia de cauda adotada nesse estudo teve o objetivo de
avaliar os níveis de PAS e FC de forma crônica ao logo do tempo experimental, por ser
uma técnica não invasiva, de fácil execução e baixo custo. Os achados durante o tempo
experimental mostram que os animais pertencentes ao grupo COVX não apresentaram
elevação da PAS durante o tempo de experimento, contudo os animais CSham exibiram
elevação da PAS nos dois últimos meses experimentais. De acordo com a literatura
esperava-se o inverso, com uma elevação da PAS no grupo COVX, devido às alterações
causadas pela deficiência estrogênica, como por exemplo, aumento de atividade
simpática, alterações metabólicas nas concentrações de lipoproteínas plasmáticas,
disfunção endotelial com consequente diminuição do agente vasodilatador NO,
alterações no sistema renina angiotensina bem como outras disfunções decorrentes de
níveis diminuídos de estradiol (Stevenson et al., 1993; Koh, 2002; Fischer et al., 2002;
Tostes, 2003;Carr, 2003; Kublickiene et al, 2005). Entretanto, Fortepiane et al. (2004),
em um trabalho realizado com animais espontaneamente hipertensos (SHR) de 18
meses de vida, relatou que os animais OVX exibiram elevação da pressão arterial
média inferior do que as apresentadas pelas ratas Sham. Uma possível resposta para esse
resultado seria o aumento nos níveis plasmáticos de testosterona nos animais Sham.
Neste mesmo trabalho observou-se elevações nos níveis séricos de testosterona nas ratas
Sham, quando comparadas a ratas mais jovens e ratas OVX. Ainda é controverso que as
concentrações de testosterona mudam após a menopausa. Algumas linhas de pesquisa
afirmam haver aumento, mas outras não (Jiroutek et al. 1998; Burger et al., 2002). Não
ficou claro o motivo de não haver mudanças na pressão arterial dos animais OVX,
sabendo que a pressão arterial modifica em mulheres submetidas à ovariectomia
(August & Oparil, 1999). Outro fator que poderia ser responsável pela elevação da PAS
é a elevação da atividade da renina plasmática (ARP). Animais em menopausa natural
75
DISCUSSÃO
apresentam maior ARP do que ratas jovens e ratas OVX mais velhas, (Fortepiane et al.
2004). Apesar de um tempo experimental mais curto, nossos resultados mostram
concordância com algumas pesquisas, relatando uma elevação mais rápida de PAS nos
animais com envelhecimento natural.
Vários trabalhos do LFC confirmam que ratos submetidos a um quadro de
desnutrição proteica em fases iniciais de seu desenvolvimento, apresentam diversas
alterações fisiológicas, como por exemplo, aumento da FC (Martins, 2007; Bezerra,
2009; Albuquerque, 2009; Moura Jr, 2009), e alterações nos níveis basais de PAM
(Tropia et al., 2001; Oliveira et al., 2007). Apesar de se tratar de um modelo animal
diferente, sendo utilizadas fêmeas ao invés de machos, os resultados deste ensaio
mostram haver uma elevação da PAS e da FC das ratas desnutridas quando comparados
aos animais controles, não havendo diferenças entre os animais pertencentes ao grupo
DSham e DOVX. Isso mostra que a OVX no grupo desnutrido não foi capaz de
promover alterações hemodinâmicas em relação ao grupo DSham. Em outro estudo do
LFC, Martins (2007), utilizando-se de manobras farmacológicas, demonstrou um
aumento no tônus simpático e diminuição da participação parassimpática em ratos
desnutridos quando comparados aos ratos controles. Neste estudo, a análise da
variabilidade da FC no domínio da frequência demonstrou um predomínio do tônus
simpático sobre o parassimpático, pois a relação LF/HF dos animais desnutridos se
mostrou aumentada em relação ao controle. Esse desequilíbrio autonômico pode ser
responsável pela elevação da frequência cardíaca encontrada no presente estudo. Outros
trabalhos da literatura também tem relatado que a desnutrição proteica promove
aumento da atividade simpática e diminuição da atividade parassimpática (Leon-Quinto
et al., 1998).
Apesar disso, as medidas realizadas através da metodologia direta, isto é, através de
cateterização da artéria femoral, não foram observadas diferenças na PAM nos
diferentes grupos estudados. Uma possível explicação para a PAM inalterada nos
animais desnutridos, considerando que a PAM é uma variável hemodinâmica, que
depende do debito cardíaco e da resistência vascular periférica e que, como já
mencionado, ratos desnutridos apresentam aumento da atividade simpática, esperandose então um possível aumento da resistência vascular periférica. Contudo, uma possível
queda do débito cardíaco como reflexo da disfunção ventricular já observada nesse
modelo (Alves et al,. 2007), pode ter resultado na não alteração da PAM nesses
animais. Os valores de FC mostraram-se similares entre as duas metodologias,
76
DISCUSSÃO
mostrando-se elevados nos grupos desnutridos quando comparados aos grupos
controles, estando assim em concordância aos trabalhos do LFC, (Martins, 2007;
Bezerra, 2009). Diante disso, podemos afirmar que a OVX, bem como a desnutrição
proteica não foram capazes de promover mudanças na PAM nesse modelo
experimental, entretanto a desnutrição foi eficaz em proporcionar mudanças na PAS dos
animais submetidos a tal dieta.
Perante dados anteriores do LFC fazendo uso de ratos, que descrevem aumento da
FC e PAM basais, atividade simpática vasomotora, atividade do SRA e dados da
literatura mostrando alterações autonômicas decorrentes de uma situação de desnutrição
em diferentes fases do desenvolvimento do animal e após perda das funções ovarianas,
decidimos avaliar o balanço autonômico cardíaco de nossos animais. Porém, é
importante ressaltar que a maioria dos trabalhos realizados no LFC é feito com ratos e
não ratas, e o tempo que os animais são expostos à desnutrição maior. A dificuldade de
encontrar trabalhos sobre desnutrição, em que os modelos animais são fêmeas e o
protocolo mais longo, torna difícil a discussão dos resultados.
Várias pesquisas utilizam protocolos que empregam o bloqueio farmacológico para
avaliar o balanço simpatovagal sobre o coração, sendo esta a mesma metodologia
adotada neste estudo (Ahmed et al., 1994; Convertino & Sather, 2000; Diz e
Jacobowitz, 1984; Goldberger, 1999; Machado & Brody, 1989).
As respostas cardiovasculares ao bloqueio do sistema nervoso simpático após
administração endovenosa do β1-bloqueador, metoprolol, foi uma redução significativa
da FC nas ratas COVX. Interessantemente, no grupo CSham a administração dessa
droga não promoveu alterações significativas da FC. Baseado nisso pode-se inferir que
apesar da OVX não alterar a FC basal, exerceu efeito sobre as respostas evocadas após
administração de metoprolol. Quando analisado os grupos DSham e DOVX, o bloqueio
farmacológico do sistema nervoso simpático, promoveu uma redução significativa da
FC desses animais. Essa redução mostrou-se de tal forma que a FC dos grupos
desnutridos após o bloqueio aproxima-se da FC do grupo CSham, sugerindo fortemente
que os animais submetidos à dieta hipoproteica apresentem um aumento da atividade
eferente simpática para o coração. Esses resultados corroboram dados da literatura que
também demonstram aumento da atividade simpática em animais submetidos a
diferentes protocolos de desnutrição (Phillips & Barker, 1997; Young et al., 1985;
Martins, 2007).
77
DISCUSSÃO
Fazendo uso do anticolinérgico, metil-atropina, para bloquear a porção
parassimpática do SNA, nota-se um aumento na FC do grupo CSham quando
comparado ao grupo COVX que não apresentou alterações após a infusão da droga.
Esse resultado mostra também, que a OVX pode exercer um efeito sobre a FC e na
resposta à administração de metil-atropina (Dias et al., 2010), podendo haver
modificações sobre o sistema nervoso parassimpático. Essa mesma droga quando
aplicada nos grupos DSham e DOVX não foi capaz de promover mudanças
significativas na FC, indicando um prejuízo da participação vagal sobre o
cronotropismo cardíaco em nosso modelo experimental, corroborando com dados
anteriores do LFC (Martins, 2007). Com base nesses resultados podemos entender que
tanto a OVX quanto a desnutrição foram capazes de induzir modificações na resposta a
metil-atropina e metoprolol. Contudo, são resultados de difícil compreensão, visto que
as ratas desnutridas sejam elas do grupo Sham ou OVX, apresentam concentrações
reduzidas de estradiol. Então, há de se esperar que os prejuízos oriundos da desnutrição
somem-se aos danos proporcionados pela deficiência estrogênica levando a um
desequilíbrio ainda maior do controle autonômico cardíaco, ou mesmo um acabe
“sobrepondo” o outro.
Foi avaliada também neste estudo a frequência cardíaca intrínseca (FCI), obtida
após o duplo bloqueio farmacológico do SNA. Machado & Brody (1989) demonstraram
que tanto o aumento da atividade simpática quanto à diminuição da atividade vagal
levam à diminuição da FCI. Após o duplo bloqueio farmacológico, todos os grupos de
estudo tiveram redução significativa nos valores de FC comparado aos seus valores
basais. Entretanto o perfil de variação da FC difere fortemente entre os grupos de
estudo, tendo os grupos desnutridos uma variação de FC muito maior que os grupos
controle.
Não estando claro ainda sobre a existência ou não de alterações autonômicas
decorrentes da OVX, resolveu-se utilizar mais três testes autonômicos para avaliar
modificações oriundas de tal hipótese. O IAC, teste proposto por Golgberger (1999), faz
uso de um artifício matemático, para ponderar o balanço autonômico para o coração.
Este índice é definido como a razão entre o intervalo R-R basal (antes do bloqueio
farmacológico) e o intervalo R-R intrínseco (após duplo bloqueio farmacológico).
Valores de IAC que se apresentam maiores de 1 mostram a existência de um
predomínio de atividade vagal sobre o coração, e valores que se mostrem inferiores a 1
caracterizam um predomínio de atividade simpática. Os resultados, curiosamente
78
DISCUSSÃO
mostraram que tanto os grupos CSham e COVX quanto DSham e DOVX, apresentaram
IAC inferior a 1, mostrando aumento de atividade simpática em todos os grupos de
estudo. Porém, os grupos desnutridos mostraram uma redução ainda mais acentuada do
IAC, revelando que a desnutrição contribui fortemente para elevação da atividade
simpática. A OVX, não proporcionou modificações significativas no IAC nos diferentes
grupos.
É de total conhecimento que elevações na atividade simpática para o coração
pode propiciar um maior risco de morte súbita em seres humanos e ratos devido à
diminuição da VFC, (Judy et al., 1976; Fletcher, 2001; Schultz et al., 2007; Schultz e
Li, 2007). Igualmente, muitos trabalhos mostram haver uma concordância em que
mulheres na menopausa ou com perda ovariana precoce, apresentam elevação da
atividade simpática, bem como perturbações alimentares, como a desnutrição, pode
levar a esse quadro de atividade simpática aumentada (Young et al.,1985(He, 1998;
Dantas, 2001; Sawaya et al., 2003; Czarnecka, 2009).
O coração está sob influência direta dos dois sistemas, simpático (por todo o
miocárdio) e parassimpático (para o nodo sinusal, miocárdio atrial, e nódulo
atrioventricular) (Rabe, 2007). Esta modulação simpática e parassimpática é fortemente
influenciada por informações oriundas dos barorreceptores, quimiorreceptores, sistema
respiratório, sistema vasomotor sistema termorregulador e do sistema renina
angiotensina aldosterona. Com isso, é possível aceitar que o coração não funciona de
uma forma regular em seus batimentos, e, portanto alterações na FC, definidas como
Variabilidade da Frequência cardíaca (VFC), dentro de um padrão de normalidade,
indicam habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos como
também compensar desordens induzidas por doenças (Rejandra et al., 2006: Vanderlei
et al., 2009; Marães, 2010). Nos últimos anos tem surgido na literatura dados que
mostram uma significante correlação entre o risco de desenvolver arritmias letais e
sinais de aumento da atividade simpática e, ou, diminuição da atividade parassimpática.
Assim, a VFC constitui um potente e independente indicador de mortalidade
cardiovascular. Todas essas observações encorajam pesquisadores a desenvolverem
novos marcadores quantitativos da atividade autonômica (Task Force, 1996).
Assim, o segundo teste autonômico foi a análise da variabilidade da FC. A
análise da variabilidade da FC no domínio da frequência tem se mostrado um dos mais
promissores métodos de análise do balanço autonômico cardíaco, inclusive com grande
aplicação na clínica médica. Porém, deve-se ter muito cuidado ao se analisar estes dados
79
DISCUSSÃO
isoladamente, uma vez que já foram descritas situações em que a utilização desta
metodologia não é indicada para se avaliar a atividade simpática e, ou, parassimpática
para o coração (Notarius & Floras, 2001). Por isso é interessante que a análise espectral
não seja utilizada como única fonte de dados para avaliação de balanço autonômico
cardíaco, pelo menos em modelos experimentais ainda não avaliados com essa
metodologia. O poder da banda LF do espectro da FC é amplamente aceito como um
índice de modulação simpática, enquanto que o poder da banda de HF está fortemente
associado com a modulação parassimpática (Task Force, 1996). Por outro lado, há
evidências de que a banda LF do espectro da FC também representa modulação
parassimpática, (Appel et al., 1989). Assim, o poder total das bandas LF ou HF
representa corretamente a modulação autonômica quando apresentados em unidades
normalizadas, ou pela média da razão LF/HF (Montano et al., 1994).
Os resultados deste trabalho mostraram que a OVX não afetou a relação LF/HF
no grupo COVX quando comparado ao grupo CSham, como também não afetou a
relação LF/HF do grupo DOVX comparado ao grupo DSham, sugerindo que a OVX em
ratas Fisher não evoca alterações autonômicas neste modelo experimental. No entanto,
o quadro de desnutrição proteica imposta aos animais foi capaz de provocar uma
elevação da relação LF/HF neste grupo. Esses achados sugerem que uma dieta
composta por 6% de proteína induz um descontrole autonômico, com predominância
simpática e redução da parassimpática, em ratas Fisher de 40 semanas. Em
concordância com esta investigação, Dias (2010) mostrou em ratas Wistar que a OVX
não foi capaz de promover alteração no balanço cardíaco simpatovagal. Mais uma vez,
em anuência ao nosso estudo, dados de Martins (2007), em um trabalho realizado no
LFC com ratos Fisher, reportou que animais submetidos a uma dieta hipoproteica por
um período de 35 dias, apresentam um descontrole do balanço autonômico com uma
prevalência do sistema nervoso simpático sobre o sistema nervoso parassimpático.
Em última análise, objetivou-se avaliar neste estudo o tônus autonômico
cardíaco, com o intúito de aferir a participação individual de cada um dos componentes
do SNA. Apesar de não ter ficado claro, a avaliação destes parâmetros revelou que as
ratas desnutridas apresentaram um maior tônus simpático quando comparadas às ratas
controle, visto que, de acordo com o equilíbrio existente entre simpático e
parassimpático, os animais desnutridos mostram importantes reduções no tônus
parassimpático, logo, o sistema nervoso simpático teria seus efeitos aumentados. A
OVX não modificou o tônus simpático nos animais submetidos à desnutrição proteica.
80
DISCUSSÃO
Porém, no grupo controle, os animais OVX apresentaram tônus simpático menor que
dos animais CSham. Uma possível explicação para esse curioso resultado seria que o
processo de envelhecimento causa um esgotamento do tônus vagal e consequente
aumento da atividade simpática, portanto indivíduos mais velhos possuem uma VFC
mais reduzida (Paschoal, 2006; Loppes, 2007). Além disso, ratas COVX tiveram um
aumento tônus parassimpático quando comparado aos demais grupos. Nossos resultados
se aproximam a dados anteriores do LFC em que ratos submetidos à desnutrição
proteica têm um descontrole da atividade autonômica para o coração, havendo
prevalência do sistema nervoso simpático sobre o sistema nervoso parassimpático.
Tomados em conjunto os resultados dos testes autonômicos desta pesquisa
revelam que a desnutrição proteica imposta a ratas Fisher durante 40 semanas modifica
negativamente o balanço autonômico simpatovagal para o coração havendo um aumento
da atividade simpática e diminuição da atividade parassimpática. Já a analise se a
ausência de estradiol levaria a um desequilíbrio autonômico, os dados obtidos através de
diferentes testes autonômicos, revelaram que a OVX não evocou mudanças
autonômicas marcantes em nossos modelos experimentais. Um problema com o estudo
de alterações autonômicas, e hipertensão decorrentes da redução de estradiol circulante,
é a ausência de um modelo animal bem aceito entre os pesquisadores. Vários são os
modelos animais utilizados, como primatas , ovelhas, coelhos, camundongos e ratos têm
sido muito utilizados, contudo, nenhuns destes modelos apresentam um quadro de
hipertensão pós-menopausa ocorrendo naturalmente, (Reckelhof & Fortepiane, 2004).
Sabemos que muito ainda deve ser feito na tentativa de se elucidar os
mecanismos pato-fisiológicos responsáveis pelas alterações acima mencionadas. Tal
conhecimento poderia fornecer informações cruciais que levariam ao aperfeiçoamento
de métodos de tratamento de distúrbios homeostáticos em pessoas acometidas por
desnutrição protéica e em mulheres na pós-menopausa ou com perda precoce das
funções ovarianas, além de contribuir com os governos de países subdesenvolvidos na
adoção de políticas de saúde mais adequadas.
81
LIMITAÇÕES DO ESTUDO
82
6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Nosso trabalho apresenta algumas limitações que devem ser consideradas. Por se
tratar de um estudo de uma variável que só se manifesta cronicamente, e a desnutrição
ser uma síndrome de forte impacto sobre a fisiologia corporal, ao longo dos meses de
experimento enfrentamos diversos problemas. Um deles, a perda dos animais referente
ao grupo desnutrido, por alguns fatores que valem ser mencionados:
•
Devido à dieta ofertada anteriormente aos animais apresentarem-se na
forma de pó, estes apresentavam um crescimento exagerado da dentição,
vindo a prejudicar a posterior ingestão de alimento, e o animal vindo a
óbito por inanição.
Com isso vimos a necessidade de buscar uma forma para tornar a ração mais
dura, para melhor alimentação nos animais.
Outra limitação de nosso estudo trata-se do modelo animal escolhido. Segundo a
literatura, os estudos das mudanças fisiológicas decorrentes da diminuição das
concentrações plasmáticas de estradiol, seja por menopausa ou por outro motivo que
leve à perda das funções ovarianas, torna-se difícil devido à ausência de um modelo
animal amplamente aceito entre os pesquisadores. Entretanto, Fortepiane (2004) e
Reckelhoff (2004) acreditam que a linhagem de rato espontaneamente hipertenso (SHR)
seja o melhor modelo para este tipo de estudo porque apresentam cessação bem definida
dos ciclos estrais com diminuição dos níveis estrogênicos e aumento da pressão arterial
média quando comparado ao estado pré-ovariectomia.
83
PERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
84
PERSPECTIVAS
7. PERSPECTIVAS
Devido aos dados bem contraditórios aos diversos testes autonômicos aplicados
em ratas de 40 semanas nesse trabalho, nossa equipe pretende avaliar agora a atividade
autonômica em ratas mais jovens para avaliar se o fator idade gerou as modificações
observadas nesse trabalho.
85
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
86
CONCLUSÃO
7. CONCLUSÃO
A partir da análise e discussão dos resultados encontrados neste trabalho
podemos concluir que:
Redução nas concentrações plasmáticas de estrógenos por ovariectomia leva a
um descontrole do metabolismo das lipoproteínas gerando um uma situação
hiperlipidêmica com elevação sérica principalmente de LDL, aumentando o
risco de doenças cardiovasculares.
Ovariectomia em ratas Fisher de 40 semanas não promove alterações
autonômicas cardíacas no modelo experimental utilizado.
A desnutrição proteica provoca redução significativa no peso corporal dos
animais, e também causa um descontrole do metabolismo lipídico e proteico
levando à hipoalbuminemia e hiperlipidemia que são importantes fatores de
risco para doenças cardiovasculares.
A desnutrição proteica foi capaz de promover alterações autonômicas cardíacas
em ratas Fisher.
Mesmo não causando modificações diretas sobre a atividade autonômica cardíaca, a
redução dos níveis plasmáticos de estradiol é um importante fator de risco para doenças
cardiovasculares.
87
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
88
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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104
APÊNDICE
APÊNDICE
105
APÊNDICE
9.
APÊNDICE
Tabela 9-Valores unitários de peso para cada animal ao final de 28 semanas (Gramas).
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
255
300
100
95
2
249
295
89
98
3
241
280
102
118
4
260
305
90
100
5
251
331
103
103
6
228
298
98
105
7
255
287
102
112
8
215
270
9
250
270
10
253
266
11
250
270
12
198
265
13
238
260
Média ± EPM
241,3 ± 4,9
284,4 ± 5,7
99,14 ± 2,9
104,4 ± 3,02
Tabela 10- Acúmulo de Gordura intra-abdominal, valores por animal (Gramas)
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
11,0462
17,2851
0,7555
0,9565
2
11,0678
14,0304
0,9400
1,9588
3
13,1299
15,2492
0,2398
0,7644
4
12,6545
17,1300
0,8212
1,6683
5
9,6364
13,9346
0,6543
2,4361
6
10,2345
18,6885
0,6435
1,1243
7
10,1234
18,9859
Média ± EPM
11,12 ± 0,49
16,47 ± 0,79
0,67 ± 0,098
1,48 ± 0,26
.
106
APÊNDICE
Tabela 11- Concentrações plasmáticas de LDL (mg/dL).
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
31,40
62,66
46,87
53,25
2
44,36
40,08
51,71
85,00
3
36,16
65,05
72,91
52,14
4
14,74
62,41
85,71
51,75
5
37,10
61,83
62,14
82,26
6
23,80
53,99
59,95
58,26
7
28,00
54,10
48,66
53,20
Média ± EPM
30,7 ± 3,6
57,1 ± 3,2
61,1 ± 5,3
62,2 ± 5,6
Tabela 12- Concentrações plasmáticas de HDL (mg/dL).
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
31,00
26,00
18,00
18,00
2
22,00
35,00
15,00
24,00
3
41,00
16,00
24,00
30,00
4
28,00
20,00
27,00
26,00
5
26,00
28,00
19,00
25,00
6
29,00
25,00
18,00
21,00
7
28,00
23,00
19,00
19,00
Média ± EPM
29,3 ± 2,2
24,7 ± 2,2
20,0 ± 1,5
23,3 ± 1,6
Tabela 13- Concentrações séricas de Colesterol total (CT)
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
69,00
111,00
69,00
79,00
2
82,00
88,00
68,00
121,00
3
70,00
98,00
111,00
93,00
4
50,00
97,00
128,00
85,00
5
86,00
71,00
87,00
118,00
6
62,00
99,00
83,00
92,00
7
75,00
89,00
72,00
85,00
Média ± EPM
70,5 ± 4,6
93,3 ± 4,7
88,3 ± 8,7
96,1 ± 6,3
107
APÊNDICE
Tabela 14- Concentrações séricas de Triglicérides (Trig)
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
57,00
87,00
20,00
22,00
2
16,00
30,00
20,00
53,00
3
88,00
87,00
28,00
57,00
4
81,00
37,00
40,00
36,00
5
101,00
35,00
45,00
55,00
6
66,00
81,00
28,00
67,00
7
80,00
34,00
26,00
63,00
Média ± EPM
69,8 ± 10,4
55,8 ± 10,3
39,3 ± 9,4
52,2 ± 4,6
Tabela 15- Concentrações séricas de lipoproteína de muita baixa densidade (VLDL)
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
11,49
17,33
3,99
7,00
2
3,11
6,04
1,89
10,60
3
17,69
17,42
14,49
11,36
4
16,13
7,45
15,85
7,28
5
20,19
7,05
5,54
11,08
6
13,20
16,27
5,19
13,33
7
16,00
6,75
4,43
12,69
Média ± EPM
13,9 ± 2,1
11,1 ± 2,0
7,3 ± 2,0
10,4 ± 0,9
Tabela 16- Concentrações séricas de Proteínas totais (g/dL).
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
6,70
6,60
4,70
5,00
2
7,10
6,70
5,60
5,40
3
6,80
6,80
5,10
5,20
4
4,80
5,90
5,50
5,60
5
7,50
6,80
5,60
5,40
6
5,60
6,60
5,10
5,60
7
6,20
7,20
5,20
5,10
Média ± EPM
6,38 ± 0,35
6,65 ± 0,14
5,2 ± 0,12
5,32 ± 0,08
108
APÊNDICE
Tabela 17- Concentrações séricas de albumina (g/dL)
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
4,90
4,90
2,80
2,80
2
4,60
4,60
2,50
2,50
3
4,80
4,10
2,70
2,50
4
4,20
4,50
2,40
2,50
5
4,00
4,90
2,20
2,10
6
4,80
4,80
2,80
2,30
7
4,50
4,60
2,40
2,00
Média ± EPM
4,54 ± 0,12
4,62 ± 0,10
2,54 ± 0,08
2,38 ± 0,10
Tabela 18- Concentrações séricas de globulina (g/dL).
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
3,75
3,89
1,95
2,34
2
3,42
4,14
2,70
2,30
3
3,95
3,66
2,20
2,70
4
3,10
3,33
2,65
2,60
5
4,49
3,91
2,45
2,80
6
3,85
3,79
2,00
2,16
7
3,30
4,59
2,27
2,08
Média ± EPM
3,69 ± 0,17a
3,90 ± 0,14a
2,31 ± 0,11b
2,42 ± 0,10b
Tabela 19- Valores de FC (BPM e PAS( mmHg), durante 5 meses pelo método de plestimografia de
cauda
CSham
PAS
FC
Animal
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1
108
106
110
120
134
345
335
343
350
376
2
112
115
118
123
125
362
360
370
365
385
3
112
110
120
131
138
363
360
370
365
367
4
108
105
113
128
133
371
377
370
380
388
5
104
104
115
129
133
389
394
380
390
396
6
118
121
129
130
133
386
349
360
370
417
7
115
116
120
132
136
375
382
350
360
320
111±1
111±2
118±2
128±1
133±1
371±5
365±7
363±4
369±4
Média
± EPM
378
±11
109
APÊNDICE
cauda
COVX
PAS
FC
Animal
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1
112,3
114,8
116,4
113,3
108,3
345,8
342,6
355,7
370,9
385,6
2
119,3
124,3
125,4
128,1
137,2
389,9
399,5
391,6
389,9
390,8
3
110,5
113,1
115,5
119,5
117,9
366,8
365,4
370,3
375,8
372,7
4
121,4
121,3
122,5
120,4
119,1
380,8
369,5
370,8
375,8
395,9
5
106,4
108,6
105,5
102,4
96,5
396,6
406,8
390,9
401,7
405,2
6
130,3
134,6
129,4
124,5
121,4
360,6
354,3
359,8
389,7
366,1
7
118,7
117,9
120,5
128,7
130,0
350,8
347,5
338,8
330,8
325,3
Média
116,9 ±
119,2 ±
119,3
119,1
118,6
370,2
369,4±
368,3
376,4
377,4
± EPM
3,0
3,2
± 2,9
± 3,5
± 5,1
± 7,3
9,4
± 7,1
± 8,6
± 10
cauda
DSham
PAS
FC
Animal
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1
136,3
135,5
138,9
139,4
141,6
435,6
421,9
500,1
402,3
445,4
2
108,8
106,1
130,1
137,1
140,4
422,8
435,6
457,4
433,5
412,6
3
125,6
120,8
131,1
124,3
150,6
432,8
416,5
484,2
465,0
438,9
4
127,7
125,7
140,4
141,2
147,1
429,8
515,6
476,2
453,3
391,4
5
138,7
134,8
132,1
137,1
143,6
431,9
468,5
485,5
448,3
424,3
6
133,6
131,8
134,8
144,1
148,7
434,7
314,2
440,6
453,3
437,9
7
134,6
158,5
135,7
138,7
146,9
443,9
463,3
449,6
452,4
430,7
Média
129,3 ±
130,5 ±
134,7
137,4
145,6
433,1
433,6
470,5
444,0
425,9
± EPM
3.8
6.0
± 1,4
± 2,3
± 1,4
± 2,4
± 23,6
± 8,2
± 7,7
± 7,0
110
APÊNDICE
cauda
PAS
FC
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1º.
2º.
3º.
4º.
5º.
1
132,7
130,9
138,5
141,3
146,9
432,7
386,4
400,9
408,9
352,9
2
134,5
169,3
136,8
134,6
131,7
463,5
396,5
498,5
465,6
391,1
3
139,7
131,1
146,2
124,3
143,5
453,7
388,5
453,5
406,4
389,4
4
135,5
130,4
149,8
137,4
198,5
412,8
342,1
465,9
457,4
482,4
5
136,8
139,3
147,1
138,1
147,1
465,8
459,3
549,0
467,5
401,3
6
142,6
149,2
146,6
141,8
147,6
453,8
401,7
461,9
445,7
421,1
7
137,6
128,0
142,8
137,6
145,6
439,8
423,1
453,5
431,8
429,8
Média
137,1 ±
139,8 ±
143,9
136,4
151,4
446,1
399,7
469,1
440,5
409,7
± EPM
1,2
5,6
± 1,8
± 2,2
± 8,1
± 7,1
±13,5
±17,2
± 9,6
±15,2
DOVX
Animal
Tabela 23- Níveis basais de PAM (mmHg) nos diferente grupos de estudo
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
109,9
118,9
110,9
112,1
2
111,2
109,6
113,1
114,7
3
108,4
110,4
123,4
84,3
4
90,7
109,4
113,7
109,6
5
104,4
77,3
135,2
111,8
6
98,3
99,6
92,1
104,1
7
124,8
113,7
127,8
107,6
8
105,3
108,5
107,5
128,1
9
110,6
108,5
70,8
117,2
10
106,6
116,5
103,4
93,8
Média ± EPM
107,1 ± 2,8
107,4 ± 3,7
114,6± 4
108,4 ± 3,8
111
APÊNDICE
Tabela 24- Níveis basais de FC (BPM) nos diferentes grupos de estudo.
Animal
CSham
COVX
DSham
DOVX
1
483,4
435,1
413,7
476,1
2
413,4
398,9
500,1
444,8
3
402,9
358,7
486,1
355,6
4
316,6
456,1
451,2
479,3
5
386,5
368,5
397,1
412,1
6
374,6
312,6
498,5
460,1
7
376,6
336,6
498,9
476,7
8
344,7
342,1
503,2
498,4
9
396,7
342,1
420,4
508,4
10
431,1
379,6
440,1
424,6
Média ± EPM
392,7 ± 14,5
373,1 ± 14,3
460,9 ± 13,1
453,6 ± 14,5
Tabela 25- FC (BPM) antes e após administração de metil-atropina nos grupos controles.
CSham
COVX
FC metil-
FC Basal
1
483,4
453,5
435,1
427,7
2
413,4
480,4
398,9
418,5
3
402,9
451,6
358,7
406,4
4
316,6
376,2
456,1
406,5
5
386,5
470,2
368,5
348,3
6
374,6
5094
312,6
285,6
7
376,6
336,6
8
344,7
342,1
9
396,7
342,1
10
431,1
379,6
Média ± EPM
392,7 ± 14,5
atropina
456,9 ± 18,2
FC Basal
FC metil-
Animal
373,1 ± 14,3
atropina
382,2 ± 22,4
112
APÊNDICE
Tabela 26- PAM antes e após administração de metil-atropina nos grupos controles.
CSham
COVX
PAM metil-
PAM metil-
Animal
PAM Basal
1
109,9
109,1
118,9
117,8
2
111,2
113,6
109,6
106,6
3
108,4
104,2
110,4
114,5
4
90,7
95,1
109,4
107,2
5
104,4
106,3
77,3
45,2
6
98,3
102,5
99,6
95,7
7
124,8
113,7
8
105,3
108,5
9
110,6
108,5
10
106,6
116,5
Média ± EPM
107,1 ± 2,8
atropina
105,2 ± 2,5
PAM Basal
atropina
107,3 ± 3,7
97,8 ± 10,9
Tabela 27- FC (BPM) antes e após administração de metil-atropina nos grupos desnutridos
DSham
DOVX
FC metil-
FC Basal
1
413,7
324,1
476,1
464,2
2
500,1
435,1
444,8
461,9
3
486,1
443,1
355,6
324,1
4
451,2
464,1
479,3
468,7
5
397,3
456,3
412,1
445,1
6
498,5
359,7
460,1
424,9
7
498,9
497,7
476,7
8
503,2
498,4
9
420,4
508,4
10
440,1
424,6
Média ± EPM
461 ± 13
atropina
425,8 ± 23,2
FC Basal
FC metil-
Animal
453,7 ± 14,5
atropina
431,5 ± 22,4
113
APÊNDICE
Tabela 28- PAM (mmHG) antes e após administração de metil-atropina nos grupos desnutridos
DSham
DOVX
PAM metil-
PAM metil-
Animal
PAM Basal
1
110,9
84,8
112,1
114,3
2
113,1
99,7
114,7
113,9
3
123,4
114,5
84,3
84,8
4
113,7
115,8
109,6
115,1
5
135,2
120,1
111,8
110,5
6
92,1
127,2
104,1
98,5
7
127,8
92,9
107,6
8
107,5
128,1
9
70,8
117,2
10
103,4
93,8
Média ± EPM
109,8 ± 5,8
atropina
107,9 ± 5,8
PAM Basal
atropina
108,4 ± 3,8
106,2 ± 4,9
Tabela 29- FC (BPM) antes e após administração de metoprolol nos grupos controles.
CSham
COVX
Animal
FC Basal
FC metoprolol
FC Basal
FC metoprolol
1
483,4
352,1
435,1
277,5
2
413,4
318,5
398,9
296,7
3
402,9
334,7
358,7
299,6
4
316,6
394,8
456,1
317,1
5
386,5
387,2
368,5
332,4
6
374,6
312,6
7
376,6
336,6
8
344,7
342,1
9
396,7
342,1
10
431,1
379,6
Média ± EPM
392,7 ± 14,5
357,5 ± 14,73
373 ± 14,3
304,7 ± 9,3
114
APÊNDICE
Tabela 30- PAM (mmHg) antes e após administração de metoprolol nos grupos controles
CSham
COVX
Animal
PAM Basal
PAM metoprolol
PAM Basal
PAM metoprolol
1
109,9
121,6
118,9
99,9
2
111,2
98,7
109,6
101,1
3
108,4
114,6
110,4
100,3
4
90,7
108,1
109,4
109,9
5
104,4
109,8
77,3
109,2
6
98,3
99,6
7
124,8
113,7
8
105,3
108,5
9
110,6
108,5
10
106,6
116,5
Média ± EPM
107,1 ± 2,8
110,6 ± 3,7
107,3 ± 3,7
104,1 ± 2,2
Tabela 31- FC (BPM) antes e após administração de metoprolol nos grupos desnutridos
DSham
DOVX
Animal
FC Basal
FC metoprolol
FC Basal
FC metoprolol
1
413,7
388,6
476,1
375,9
2
500,1
411,3
444,8
398,6
3
486,1
339,3
355.6
390,1
4
451,2
337,6
479,3
371,6
5
397,1
412,1
6
498,5
460,1
7
498,9
476,7
8
503,2
498,4
9
420,4
508,4
10
440,1
424,6
Média ± EPM
461 ± 13,1
369,3 ± 18,35
453,7 ± 14,5
384,1 ± 6,2
115
APÊNDICE
Tabela 32- PAM (mmHg) antes e após administração de metoprolol nos grupos desnutridos
DSham
DOVX
Animal
PAM Basal
PAM metoprolol
PAM Basal
PAM metoprolol
1
110,9
121,1
112,1
105,3
2
113,1
106,8
114,7
121,5
3
123,4
73,1
84,3
105,3
4
113,7
106,1
109,6
93,1
5
135,2
105,4
111,8
100,1
6
92,1
104,1
7
127,8
107,6
8
107,5
128,1
9
70,8
117,2
10
103,4
93,8
Média ± EPM
109,8 ± 5,8
102,5 ± 7,9
108,4 ± 3,8
105,1 ± 4,6
Tabela 33: FC (BPM) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos controles.
CSham
COVX
Animal
FC Basal
FC duplo bloq.
FC Basal
FC duplo bloq.
1
483,4
367,7
435,1
323,4
2
413,4
364,1
398,9
335,9
3
402,9
320,4
358,7
336,5
4
316,6
337,4
456,1
369,3
5
386,5
344,3
368,5
337,1
6
374,6
414,8
312,6
218,3
7
376,6
309,5
336,6
332,7
8
344,7
330,5
342,1
332,5
9
396,7
318,8
342,1
305,6
10
431,1
365,1
379,6
281,9
Média ± EPM
392,7 ± 14,5
347,3 ± 9,9
373 ± 14,3
317,4 ± 13,1
116
APÊNDICE
Tabela 34- PAM (mmHg) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos controles.
CSham
COVX
Animal
PAM Basal
PAM duplo bloq.
PAM Basal
PAM duplo bloq.
1
109,9
106,1
118,9
109,3
2
111,2
110,8
109,6
104,4
3
108,4
91,3
110,4
106,7
4
90,7
92,7
109,4
107,5
5
104,4
100,9
77,3
52,9
6
98,3
97,9
99,6
96,9
7
124,8
119,1
113,7
103,5
8
105,3
102,8
108,5
99,4
9
110,6
120,6
108,5
100,9
10
106,6
107,3
116,5
110,8
Média ± EPM
107,1 ± 2,8
105 ± 3,1
107,3 ± 3,7
99,29 ± 5,3
Tabela 35- FC (BPM) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos desnutridos.
DSham
DOVX
Animal
FC Basal
FC duplo bloq.
FC Basal
FC duplo bloq.
1
413,7
277,5
476,1
322,3
2
500,1
317,6
444,8
326,1
3
486,1
304,6
355,6
272,7
4
451,2
347,9
479,3
318,3
5
397,1
386,7
412,1
337,4
6
498,5
281,7
460,1
408,7
7
498,9
368,8
476,7
337,6
8
503,2
366,7
498,4
375,5
9
420,4
376,2
508,4
338,5
10
440,1
311,2
424,6
337,8
Média ± EPM
461 ± 13,1
332,2 ± 11,6
453,7 ± 14,5
337,6 ±11,2
117
APÊNDICE
Tabela 36- PAM (mmHg) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos desnutridos.
DSham
DOVX
Animal
PAM Basal
PAM duplo bloq.
PAM Basal
PAM duplo bloq.
1
110,9
103,8
112,1
108,3
2
113,1
119,6
114,7
113,8
3
123,4
104,6
84,3
104,4
4
113,7
123,5
109,6
103,9
5
135,2
122,6
111,8
95,5
6
92,1
112,6
104,1
94,7
7
127,8
78,6
107,6
98,2
8
107,5
115,7
128,1
120,2
9
70,8
112,5
117,2
98,1
10
103,4
109,9
93,8
88,3
Média ± EPM
109,8 ± 5,8
106,8 ± 5,1
108,4 ± 3,8
102,6 ± 3,1
Tabela 37- LF e HF durante o período basal e razão LF/HF dos grupos controles.
CSham
COVX
Animal
LF(un)
HF(um)
LF/HF
LF(um)
HF(um)
LF/HF
1
24
76
0,32
25
75
0,36
2
33
67
0,57
30
70
0,47
3
24
76
0,34
34
66
0,55
4
35
65
0,56
27
73
0,39
5
49
51
0,45
21
79
0,29
6
28
72
0,61
28
72
0,42
7
43
57
0,46
32
68
0,53
8
35
65
31
69
0,54
9
31
69
34
66
0,52
33,5±2,7
66,4±2,7
29,1±1,4
70,8±1,4
0,45± 0,03
Média ±
EPM
0,47± 0,04
118
APÊNDICE
Tabela 38- LF e HF durante o período basal e razão LF/HF dos grupos desnutridos.
DSham
DOVX
Animal
LF(un)
HF(um)
LF/HF
LF(um)
HF(um)
LF/HF
1
35
65
0,32
16
84
0,36
2
38
62
0,57
48
52
0,47
3
30
70
0,34
28
72
0,55
4
28
72
0,56
26
74
0,39
5
16
84
0,45
34
66
0,29
6
48
52
0,61
50
50
0,42
7
36
64
0,46
29
71
0,53
8
49
51
41
59
0,54
9
14
33
26
50
0,52
32,6±4,08
61,4±4,8
33,1±3,7
64.2±4,04
0,71±0,09
Média ±
EPM
0.73±0,09
119

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