jacqueline cortinhas monteiro - PPGBAIP
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jacqueline cortinhas monteiro - PPGBAIP
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES TNF-α E INTERLEUCINA-10 EM MULHERES INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1), NA CIDADE DE BELÉM, PARÁ. JACQUELINE CORTINHAS MONTEIRO BELÉM – PARÁ. 2013 JACQUELINE CORTINHAS MONTEIRO PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES TNF-α E INTERLEUCINA-10 EM MULHERES INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1), NA CIDADE DE BELÉM, PARÁ. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado BELÉM – PARÁ 2013 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto Evandro Chagas Monteiro, Jacqueline Cortinhas. Prevalência da infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) e avaliação de polimorfismos nos genes TNF-a e Interleucina-10 em mulheres infectadas pelo Vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV 1), na cidade de Belém, Pará / Jacqueline Cortinhas Monteiro. – Belém, 2013. 97 f.: il; 30 cm Orientador: Dr. Luiz Fernando Almeida Machado Tese (Doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, 2013. 1. Câncer de colo uterino. 2. Polimorfismo genético. 3. Papilomavírus humano. 4. Citocinas. I. Machado, Luiz Fernando Almeida, orient. II. Universidade Federal do Pará. III. Título. CDD: 616.99466 1 JACQUELINE CORTINHAS MONTEIRO PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES TNF-α E INTERLEUCINA-10 EM MULHERES INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV1), NA CIDADE DE BELÉM, PARÁ. Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como pré-requisito para a obtenção do grau de Doutor em Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado Laboratório de Virologia, ICB-UFPA Banca Examinadora: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto Laboratório de Virologia, ICB-UFPA Profa. Dra. Hellen Thais Fuzii Laboratório do Núcleo de Medicina Tropical-UFPA Dr. Rodrigo Vellasco Duarte Silvestre Laboratório de Papilomavírus, IEC Prof. Dr. Dra. Rosimar Neris Feitosa Laboratório de Virologia, ICB-UFPA Prof. Dr. Ricardo Ishak (Suplente) Laboratório de Virologia, ICB-UFPA Belém, 07 de novembro de 2013 2 EPÍGRAFE “Pedi força e vigor; Deus me mandou dificuldades para me fazer forte. Pedi sabedoria; Deus me mandou problema para resolver. Pedi prosperidade; Deus me deu energia e cérebro para trabalhar. Pedi coragem; Deus me mandou situações para superar. Pedi amor; Deus me mandou pessoas com problemas para eu ajudar. Pedi favores; Deus me deu oportunidades. Não recebi nada do que queria, Recebi tudo o que precisava, Minhas preces foram atendidas.” 3 À minha amada família: Antonio Carlos Monteiro, Nazaré do Socorro Cortinhas Monteiro, Diego Henrique Cortinhas Monteiro e Carlos Henrique Sousa Monteiro. À todas as mulheres participantes do estudo, pela confiança que me foi dada na realização desta pesquisa. 4 AGRADECIMENTOS A tarefa de reconhecer a ajuda que lhe foi prestada, sem dúvida, é muito difícil! Para muitos o sentimento de gratidão surge apenas quando essa ajuda é física... para mim, este sentimento vai muito além deste plano material. Por isso, inicio agradecendo ao meu Deus, todo poderoso e misericordioso, pela oportunidade dada a cada dia; por todas as maravilhas que Tens operado em minha vida; por ter colocado pessoas tão especiais em meu convívio e agora, pela permissão em concluir mais este trabalho. Ao programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários e ao Programa Nacional de DST e AIDS do Ministério da Saúde Brasileiro que possibilitaram o desenvolvimento desta pesquisa. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro disponibilizado através da concessão de bolsa durante todo o desenvolvimento deste trabalho. A todas as participantes desta pesquisa sem as quais a realização deste trabalho jamais teria sido possível. À equipe da Unidade de Referência em Doenças Infecto-Parasitárias Especiais, especialmente a enfermeira Drª Ilze Pamplona, por toda sua colaboração e amizade, pelo carinho desinteressado e boa-vontade em ajudar as mulheres que buscavam atendimento. Aos meus professores, Dr Ricardo Ishak, Drª Marluísa Ishak, Drª Mihoko Tsutsumi, Drª Vânia Azevedo, Drª Rosimar Feitosa, Drª Antonia Vieira e Dr Antonio Vallinoto. Queridos professores, agradeço-lhes por terem dividido comigo o seu conhecimento; por toda confiança e incentivo oferecido durante a minha vida acadêmica; pela amizade e companheirismo nos momentos de dificuldade. Muito obrigada pelos bons exemplos de ética e profissionalismo. Que Deus continue abençoando a cada um de vocês! Ao professor Dr. Luiz Fernando Machado, orientador deste trabalho e um grande amigo. Agradeço-lhe pelo voto de confiança cedido ainda na minha graduação, quando aceitou me ter como aluna de PIBIC. Nestes anos de orientação (PIBIC, Mestrado e Doutorado) e de convívio, você me proporcionou um profundo aprendizado, refletido não somente na vida acadêmica, mas na minha vida de modo geral. Que Nosso Mestre Jesus preserve a sua simplicidade e multiplique ainda mais a sua vontade de ajudar o próximo. A toda equipe do Laboratório de Virologia que me ajudaram de forma direta ou indireta na realização desta pesquisa. Em especial aos meus queridos amigos (Felipe, Rogério, Leonardo, Mike, Layla, Carol, Di Paula, Samara, Erica, Ethienne, Sandra, Renata, Larissa, Bárbara, Glenda e Altair) que há anos acompanham a minha caminhada, colorindo meus dias com as cores da solidariedade e carinho. Aos meus amigos da Seção de Virologia do Instituto Evandro Chagas, especialmente ao Dr Fernando Tavares, Dr Ana Wanzeler e Jaínara Alves, que me receberam de braços abertos no momento da posse em cargo público; pela compreensão e incentivo na conclusão 5 deste trabalho. Ao Dr Rodrigo Vellasco, não somente, pela ajuda prestada na finalização desta pesquisa, mas também pela amizade oferecida. A todos os meus familiares, avós, tios, primos, padrinhos, que sempre torceram por mim e que foram fundamentais para que eu conseguisse alcançar meus objetivos. Ao meu fiel amigo, Bruno Damasceno, que já é praticamente da família, pelo apoio e companheirismo. Ao meu irmão, Diego Henrique e ao meu sobrinho-filho Carlos Henrique, por toda alegria, amor e carinho dividido durante a minha vida. Pelo abraço e sorriso sincero que nunca me permitiu desanimar. E aos meus tão amados e queridos pais, Antonio Carlos e Socorro Monteiro, por terem aceitado, com muito amor, a missão que Deus lhes deu, de me gerar e educar dentro das leis morais divinas. Vocês são a prova viva da imensidão e generosidade do amor que Deus tem por mim. Mesmo sem eu merecer, Ele me concedeu a oportunidade de conviver com vocês, anjos que iluminam a minha vida. Obrigada por terem me dado essa família maravilhosa. Obrigada pelo apoio incondicional nos momentos de alegria e também e nos momentos de dificuldades. Talvez, nessa vida eu não consiga lhes retribuir tudo o que fizeram por mim. Mas, saibam que serei eternamente grata por todo amor, carinho, paciência, amizade e compreensão que a mim vocês dedicaram. E como eu sempre digo: Essa vitória não é apenas minha, mas também de vocês, pois hoje estou apenas colhendo aquilo que em mim vocês plantaram... 6 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS........................................................................................ 8 LISTA DE TABELAS E QUADROS .............................................................. 9 RESUMO ....................................................................................................... 11 ABSTRACT ............................................................................................. 12 1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 13 1.1 O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1)........................... 13 1.2. O PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)......................................................... 14 1.2.1Classificação e Morfologia........................................................................... 15 1.2.2 Organização Genômica do HPV................................................................ 16 1.2.3 Replicação do HPV...................................................................................... 19 1.2.4 Patogênese da Infecção pelo HPV.............................................................. 21 1.2.5 Proteínas E6 e E7 do HPV e oncogênese................................................... 23 1.2.6 Resposta imunológica frente à infecção pelo HPV................................... 25 1.2.7 Associação entre os polimorfismos nos genes TNF-α e IL-10 e a infecção pelo HPV.................................................................................................. 28 1.2.7.1 Fator de Necrose Tumoral alpha (TNF-α)................................................ 28 1.2.7.2 Interleucina-10 (IL-10)................................................................................. 30 1.2.8 Polimorfismos nos genes de citocinas e a co-infecção HPV/HIV.............. 31 1.2.9 Prevalência da Infecção pelo HPV............................................................... 32 1.2.10 Infecção pelo HPV e Câncer Cervical........................................................ 35 1.2.11 Diagnóstico, Tratamento e Prevenção da Infecção pelo HPV................. 36 1.3 OBJETIVOS....................................................................................................... 38 1.3.1 Objetivo Geral................................................................................................ 38 1.3.2 Objetivos Específicos..................................................................................... 38 2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 39 2.1 ASPECTOS ÉTICOS.......................................................................................... 39 2.2 POPULAÇÃO EXAMINADA........................................................................... 39 2.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS...................................... 40 2.4 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR..................................................... 41 2.4.1 Extração de DNA........................................................................................... 41 2.4.2 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR).................................. 41 2.4.3 Eletroforese do material amplificado........................................................... 43 7 2.4.4 Determinação dos polimorfismos................................................................. 43 2.4.5 Genotipagem do HPV.................................................................................... 43 + - 2.5 NÍVEIS DE LINFÓCITOS TCD4 /CD8 E CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HIV-1................................................................................................................. 44 2.6 INFERÊNCIA ESTATÍSTICA.......................................................................... 44 3. RESULTADOS..................................................................................................... 45 3.1 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA.................................. 45 3.2 PREVALÊNCIA DO HPV E CITOLOGIA ONCÓTICA................................. 48 3.3 PERFIL EPIDEMIOLÓGICO DO GRUPO CO-INFECTADO HIV/HPV....... 53 3. 4 NÍVEIS DE LINFÓCITOS TCD4+/CD8- E CARGA VIRAL......................... 57 3. 5 FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS............................................. 61 4. DISCUSSÃO....................................................................................................... 65 5. CONCLUSÕES.................................................................................................. 73 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 75 APÊNDICE I........................................................................................................... 92 APÊNDICE II......................................................................................................... 94 ANEXO I................................................................................................................. 96 ANEXO II............................................................................................................... 97 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Morfologia do HIV............................................................................. Página 14 Figura 2 - Árvore filogenética dos Papilomavírus............................................... 15 Figura 3 - Microscopia eletrônica do HPV........................................................... 16 Figura 4 - Organização genômica do HPV........................................................... 17 Figura 5 - Ciclo replicativo do HPV no epitélio.................................................... 21 Figura 6 - Associação da proteína E7 do HPV-16 com a proteína pRb da célula hospedeira............................................................................................................. Figura 7 - Resposta Imunológica à infecção pelo HPV....................................... 25 27 Figura 8 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene TNF-α................................................................................................................. 29 Figura 9 - Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene IL-10 ........................................................................................................................ 30 Figura 10 - Distribuição dos sinais apresentados pelas mulheres portadoras do HIV, no momento da coleta de material da cérvice uterina...................................................................................................... 48 Figura 11 - Distribuição dos microrganismos encontrados na citologia de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012............................................................................................... 50 Figura 12 - Teste de genotipagem Linear Array HPV mostrando infecções simples e múltiplas............................................................................................................ 52 9 LISTA DE TABELAS E QUADROS Página Quadro 1 – Proteínas codificadas pelas ORF dos papilomavírus e suas funções........... 18 Quadro 2 - Classificação dos HPV de acordo com o seu potencial oncogênico............. 22 Quadro 3 – Iniciadores utilizados na reação de PCR...................................................... 42 Quadro 4- Condições de amplificação dos fragmentos alvo........................................... 42 Quadro 5- Enzimas de restrição utilizadas para identificação dos polimorfismos nos genes de IL-10 (-1082 A/G) e TNF-α (-308 A/G)............................................................ 43 Tabela 1- Características demográficas das mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012......................................................................................................................... 45 Tabela 2- Distribuição das variáveis de utilização de drogas no grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012.................................................................................. 46 Tabela 3 - Características epidemiológicas do grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012..................................................................................................... 47 Tabela 4 - Prevalência da infecção pelo HPV em função do resultado citológico do grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012................................................ 49 Tabela 5- Prevalência da infecção pelo HPV no grupo de mulheres portadoras do HIV, com alterações citológicas benignas, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012................................................................................... 50 Tabela 6- Prevalência do HPV nos diferentes graus de lesão intra-epitelial identificado em mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012................................................ 51 Tabela 7- Distribuição dos genótipos de HPV identificados em mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012.......................................................................................................... 52 Tabela 8- Distribuição dos genótipos de HPV identificados no grupo de mulheres com infecção por múltiplos genótipos, portadoras do HIV atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012.................................................................. 53 Tabela 9- Características demográficas das mulheres co-infectadas com HPV/HIV, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012................ 54 Tabela 10- Distribuição das variáveis de utilização de drogas no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012........................................................................... 55 10 Tabela 11- Distribuição das variáveis de comportamento sexual do grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012........................................................................... 56 Tabela 12- Distribuição das variáveis histórico de IST e verruga genital no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012............................................................. 57 Tabela 13- Distribuição do número de mulheres co-infectadas HPV/HIV que havia iniciado a TARV..................................................................................................... 58 Tabela 14- Distribuição dos níveis de LTCD4+/CD8- no grupo de mulheres coinfectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012.......................................................................... 59 Tabela 15- Distribuição dos níveis de LTCD4+/CD8- em função do resultado citológico no grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012........................ 59 Tabela 16- Distribuição dos níveis de carga viral plasmática do HIV-1 no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012............................................................... 60 Tabela 17-Distribuição dos níveis de carga viral plasmática do HIV-1 em função do resultado citológico no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012.... 60 Tabela 18- Distribuição da frequência genotípica e alélica dos genes TNF-α e IL-10 do grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012................................................................................... 62 Tabela 19- Distribuição da frequência genotípica do TNF-a entre mulheres portadoras do HIV com citologia normal e com alterações pré-malignas, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012............................................................. 63 Tabela 20- Distribuição da frequência genotípica do IL-10 entre mulheres portadoras do HIV com citologia normal e com alterações pré-malignas, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012............................................................. 64 11 RESUMO Muitos estudos têm demonstrado maior prevalência da infecção pelo HPV em pacientes infectados pelo HIV, bem como a associação desta infecção com a ocorrência de lesões precursoras do câncer do colo do útero. A persistência da infecção pelo HPV, em mulheres portadoras do HIV, parece estar relacionada com os níveis de LTCD4+/CD8-, carga viral plasmática do HIV-1 e ocorrência de polimorfismos nos genes de citocinas. Sendo assim, o presente estudo visou determinar a prevalência da infecção pelo HPV e investigar a ocorrência dos polimorfismos genéticos G-308A TNF-α e A-1082G IL-10, em mulheres portadoras do HIV-1. No período de abril de 2010 a dezembro de 2012 foram colhidos espécimes cervicais de 184 mulheres portadoras do HIV-1 que se submeteram a realização do PCCU, na UREDIPE, Entretanto, apenas 169 mulheres foram elegíveis para a pesquisa. De cada participante foi coletada duas amostras cervicais, uma destinada à análise citológica e a outra destinada à análise por biologia molecular. A pesquisa de HPV foi realizada através da técnica Nested-PCR, empregando-se os iniciadores MY09/11 e GP5+/6+. A genotipagem do HPV foi realizada com o emprego do kit LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. A determinação dos polimorfismos genéticos foi realizada por meio da PCR e posterior análise de fragmentos de restrição por digestão enzimática. A prevalência da infecção pelo HPV foi de 63,3%. O HPV16 foi detectado em 40,4% dos casos, seguido do HPV-52 (12,8%). A infecção pelo HPV foi predominante no grupo de mulheres esfregaço citológico livre de alteração pré-maligna e, mais prevalente nas mulheres em idade reprodutiva, solteiras, com baixo nível de escolaridade e que utilizavam preservativos nas relações sexuais. Observou-se associação entre a infecção pelo HPV e as variáveis independentes: uso de preservativo, múltiplos parceiros sexuais e história pregressa de IST. As análises das frequências alélicas e genotípicas mostraram que o alelo TNF-α*A e o genótipo TNF-α AA apresentaram distribuição semelhantes independente da infecção pelo HPV. Já o alelo IL-10*G e o genótipo IL-10 GG exibiu frequências maiores no grupo sem HPV. Não se observou diferenças estatísticas entre as frequências alélicas e genotípicas e a infecção pelo HPV, tão pouco com os diferentes graus de lesão intra-epitelial. A alta prevalência do HPV encontrada no estudo corrobora com outros achados descritos na literatura. A predominância da infecção em mulheres com citologia livre de alteração prémaligna reforça a ideia de que a infecção é, em sua maioria, assintomática. Neste estudo, os polimorfismos genéticos não mostraram associação com a infecção pelo HPV e nem com as lesões intra-epiteliais. 12 ABSTRACT Several studies have shown a higher prevalence of HPV infection in HIV-infected patients, as well as association of that infection with occurrence of cancer precursor lesions of the cervix . The persistence of HPV infection in HIV-infected women seems to be related to the levels of CD4+/CD8-, HIV-1 viral load and occurrence of polymorphisms in cytokine genes. Thus, this study aimed to determine the prevalence of HPV infection and to investigate the occurrence of genetic polymorphisms G-308A TNF-α and G-1082A IL 10 in HIV-infected women. From April 2010 to December 2012 cervical specimens were collected from 184 women with HIV-1 who underwent of PCCU in UREDIPE, being, only 169 eligible for the study. Form each participant were collected two cervical samples, one for cytological analysis and other for molecular biology analysis. The HPV survey was conducted by nested PCR technique, using primers MY09/11 and GP5+/6. HPV type was defined by using the commercial kit LINEAR ARRAY HPV Test Genotyping. The determination of genetic polymorphisms was performed by PCR and subsequent analysis of restriction fragments by enzymatic digestion. The prevalence of HPV infection was 63,3 %. HPV-16 was detected in 40,4 % of cases, followed by HPV-52 (12.8%). HPV infection was predominant in the group of women without cytological abnormality and more prevalent in women of reproductive age, unmarried, low education level and who used condoms during sexual intercourse. It was observed an association between HPV infection and independent variables, such as condom use, multiple sexual partners and history of STIs. The analysis of allele and genotype frequencies showed that the allele TNF-α*A and TNF-α AA genotype showed similar distribution independent of HPV infection. While allele IL-10*G and IL-10 GG genotype exhibited higher frequencies in the group without HPV infection. There was no statistical difference between the allele and genotype frequencies and HPV infection, nor with different degrees of intraepithelial lesion. The high prevalence of HPV found in the study corroborates other findings in the literature. The prevalence of infection in women without cytological abnormality reinforces the idea that the infection is mostly asymptomatic. In this study, genetic polymorphisms were not associated with HPV infection or with intraepithelial lesions. 13 1. INTRODUÇÃO 1.1 O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1) O HIV-1 foi identificado na década de 1980 e três anos depois foi associado à Síndrome da Imunodeficiência Adquirida – AIDS (Gallo et al.,1984 Levy et al., 1984). Inicialmente, a infecção por este vírus estava restrita ao grupo de homens com práticas homossexuais, nos Estados Unidos da América (EUA), os quais apresentavam infecções oportunistas por Pneumocystis carinii (CDC, 1981), atualmente denominado Pneumocystis jirovecii. A infecção pelo HIV-1 apresenta distribuição universal. De acordo com dados da UNAIDS, até o final de 2011, cerca de 34 milhões de pessoas estavam infectadas com este agente (UNAIDS, 2012). No Brasil, no período entre os anos de 1980 à junho de 2012, foram notificados 656.701 casos de AIDS, dos quais mais de 50% foram identificados na região sudeste, ao passo que na região Norte foram registrados 13.998 casos (Brasil, 2012). O HIV-1 pertence à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus (ICTV, 2011). Morfologicamente, o HIV-1 é caracterizado como um vírus esférico, de capsídeo com simetria icosaédrica e envelopado. No envelope viral, estão inseridas as glicoproteínas de superfície (gp120) e as glicoproteínas transmembrana (gp41), importantes para o processo de interação da partícula viral com o receptor CD4 da célula hospedeira (Turner & Summers, 1999). O genoma viral possui cerca 10 kilobases (Kb) de tamanho e é constituído de duas cópias de RNA de fita simples, com polaridade positiva, associado a um complexo de nucleoproteína (proteína do nucleocapsídeo - p7) e a três enzimas virais essenciais: protease, transcriptase reversa e integrase (Turner & Summers, 1999; Figura 1). O genoma apresenta três genes estruturais: gag, pol e env, e seis genes regulatórios: tat (transativador); rev (regulador de expressão); vif (fator de infectividade viral); nef (fator negativo); vpr e vpu (Llewelyn, 1994). A região gag é responsável pela síntese das proteínas da matriz (MA, p17), do capsídeo (CA, p24) e do nucleocapsídeo (NC, p9 e p6). A região env, por sua vez, é responsável pela síntese das glicoproteínas gp 120 (superfície) e a gp 41 (transmembrana). Já a região pol origina as enzimas virais protease, transcriptase reversa e a integrase (Luciw, 1996). 14 Figura 1 - Morfologia do HIV (Adaptado de http://webs.wichita. edu/mschneegurt/biol103/lecture15/lecture15.html). A transmissão do HIV-1 pode ocorrer através do contato com fluídos corpóreos infectados, uma vez que este vírus tem sido detectado em vários fluídos biológicos, tais como sêmen, secreção vaginal, plasma, saliva, urina e leite materno (Lewelyn,1994; Delwart et al., 2000). Entretanto, a transmissão sexual permanece como modo de transmissão predominante e corresponde a cerca de 85% de todas as infecções pelo HIV-1 (Simon et al., 2006). A transmissão de homem para mulher é, aproximadamente, duas vezes mais eficiente do que a transmissão de mulher para homem (Guinan & Hardy, 1987). Outras formas de transmissão do vírus é pela via parenteral - a qual envolve, principalmente, pessoas que tem exposição ocupacional à sangue contaminado; e a via vertical de mãe para filho, a qual pode ocorrer no momento do parto ou de forma intrauterina (Newell, 1998; Delwart et al., 2000; Khare, 2005). 1.2 O PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) Os papilomavírus foram descritos pela primeira vez em 1930, por Richard Shope em um grupo coelhos (Shope & Hurst apud Howley & Lowy, 2007). Esses vírus podem desenvolver infecções em várias espécies de vertebrados, tais como felídeos, bovinos, 15 primatas humanos e não-humano. Em 2002, Tachezy et al. identificaram o vírus em espécies aviárias. Apesar de ser espécie-específicos (Campo, 2002; Zheng & Baker, 2006), os papilomavírus são muito semelhantes em sua estrutura física e organização genômica (Scheurer et al., 2005) e, por isso, são agrupados dentro da família Papillomaviridae (ICTV, 2012). 1.2.1Classificação e Morfologia O Papilomavírus humano (HPV) infecta a superfície epitelial, podendo ocasionar o desenvolvimento de lesões benignas proliferativas na pele, nas mucosas e no trato genital (Finnem et al., 2003). A infecção genital por estes vírus é uma das Infecções Sexualmente Transmissíveis (IST) de maior incidência e prevalência no mundo (Magi et al., 2002; Nadal et al., 2006; Hossne, 2008; Wright et al., 2009). O HPV pertence à família Papillomaviridae, a qual compreende 16 gêneros compostos por tipos de papilomavírus de origem humana e animal. Quatro destes gêneros são constituídos exclusivamente por HPV: Betapapillomavirus, Gammapapillomavirus, Mupapillomavirus e Nupapillomavirus (ICTV, 2012), sendo que cerca de 90% dos HPV já caracterizados estão agrupados nos gêneros Alphapapillomavirus e Betapapillomavirus (Figura 2). Figura 2- Árvore filogenética dos papilomavírus (ICTV, 2012). 16 O maior grupo de HPV é representado pelo gênero Alphapapillomavirus, no qual encontra-se os tipos de HPV capazes de infectar a mucosa oral e anogenital do homem e também de primatas (Ramoz et al., 2002) que , assim como os Nupapillomavirus, podem causar lesões benignas e malignas (ICTV, 2012). Os Betapapillomavirus são tipicamente associados a infecções cutâneas assintomáticas em seres humanos, à exceção em indivíduos imunodeprimidos, os quais desenvolvem a epidermodisplasia verruciforme (EV) e em pacientes com câncer de pele não-melanoma (De Villiers et al., 2004). Os membros dos gêneros Gammapapillomavirus e Mupapillomavirus causam lesões em seu hospedeiro, as quais se distinguem, histologicamente, pela presença de corpos de inclusões intracitoplasmáticas, espécie-específicos (ICTV, 2012). Morfologicamente, os papilomavírus são caracterizados como vírus não envelopados e que, apresentam cerca de 55 nanômetros (nm) de diâmetro (Figura 3). O capsídeo possui simetria icosaédrica e envolve o genoma viral que consiste em dupla fita de DNA circular, com, aproximadamente, 8.000 pares de bases (pb) nucleotídicas. Mais de 100 genótipos de HPV foram isolados e identificados a partir da análise completa das sequências de DNA dos mesmos (ICTV, 2012). Figura 3- Microscopia eletrônica do HPV (Fonte: Belda Jr, 2000). 1.2.2 Organização Genômica do HPV O genoma do HPV consiste de oito a nove sequências de leitura aberta (Open Reading Frames - ORF) e compreende três regiões conhecidas como região precoce (early region- E) com, aproximadamente, 4kb de tamanho, região tardia (late region- L), com 3 kb e a região 17 controladora (Long Control Region - LCR), com 1 kb (Kenneth, 1996; Zielinski et al., 2003; Münger et al., 2004; Figura 4). Região controladora (LCR) ~1Kb Região tardia (L) ~3Kb Região precoce (E) ~3Kb Figura 4 – Organização genômica do HPV (Fonte: Adaptado de Tyring, 2000). A região precoce ocupa mais de 50% do genoma do vírus e apresenta seis ORF (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) que se traduzem individualmente em proteínas. Os genes precoces estão envolvidos na regulação da expressão gênica viral, na replicação do DNA viral e na transformação celular durante o estado epissomal (Heino et al., 2000). A proteína E1 é uma fosfoproteína de 70 a 80 kilodaltons (KDa), a qual possui atividade de DNA helicase dependente de Adenosina tri-fosfato (ATP). Ela também contém domínios de ligação com DNA, domínios de ligação com a proteína E2, bem como um domínio catalisador (Hughes & Romanos, 1993). A proteína E2 é uma fosfoproteína com três domínios funcionais. O domínio Nterminal contém, aproximadamente, 220 aminoácidos e atua como um transativador. O segundo domínio, o C-terminal, contém cerca de 90 aminoácidos e, em sua forma dimérica, pode ligar-se ao DNA do hospedeiro. O terceiro domínio é a região de dobradiça entre os outros dois domínios (Tyring, 2000). A proteína E2 liga-se ao LCR e reprime a transcrição de E6 e E7 (McBride et al., 1991). A proteína codificada por E1 facilita a ligação da proteína E2 na região promotora. No caso das células malignas, a razão E1/E2 muda quando o vírus integra-se ao cromossomo da célula hospedeira e a repressão da transcrição de E6 e E7 é perdida (Shirasawa et al., 1987). 18 Alguns estudos utilizando a deleção ou mutagênese sítio-dirigida tem permitido a atribuição de funções específicas para as diversas ORF viral. Em síntese, proteínas codificadas pelas ORF E5, E6 e E7 são responsáveis pela mudança dos promotores virais. A função da proteína E4 ainda está para ser determinada, mas ela é, predominantemente, o produto das fases precoce e fases tardia da infecção viral e pode modular mudanças estruturais no citoplasma das células infectadas (Peh et al., 2002, Stoler, 2003), as quais incluem perturbações na rede de citoqueratina, resultando na coilocitose (Roberts et al., 1994; Doorbar et al., 2000). A proteína E5 é uma proteína hidrofóbica associada à membrana, a qual está associada à ativação do receptor do fator de crescimento epidérmico, resultando na estimulação do crescimento celular (Howley, 2006). As prováveis funções das ORF estão ilustradas no Quadro 1. Quadro 1 – Proteínas codificadas pelas ORF dos papilomavírus e suas funções. Proteínas Funções E1 Replicação do DNA, atividade DNA helicase dependente de ATP E2 Regulação da transcrição e auxílio na replicação do DNA E3 Não está elucidado E4 Proteína citoplasmática abundante em verrugas Destruição dos filamentos de queratina E5 Transformação. Impede a regulação negativa dos receptores ativados E6* Transformação. Degradação da p53 e ativação transcricional da telomerase celular E7* Transformação. Ligação e inativação da pRb. Interfere na duplicação do centrômero, resultando em aneuploidia. E8 Não está elucidado L1 Síntese das grandes proteínas do capsídeo L2 Síntese das pequenas proteínas do capsídeo * Proteínas superexpressas em tipos de HPV associados a câncer (Fonte: Adaptado de Howley, 2006). 19 A região tardia do genoma dos papilomavírus, corresponde a 40% do genoma do vírus. Situa-se após a região precoce e apresenta as ORF L1 e L2, importantes na tradução das grandes e pequenas proteínas do capsídeo, respectivamente (Danos et al., 1982). A região LCR contém promotores não-codificadores de proteínas, porém possui elementos envolvidos na replicação do DNA, bem como vários fatores de transcrição ligados a sítios, que são importantes na regulação da RNA-polimerase II celular iniciado a partir da transcrição de promotores virais precoces e promotores tardios (Zheng & Baker, 2006). O promotor E6, assim como um ou mais promotores específicos no LCR é comum entre os tipos de HPV. A multiplicidade dos promotores é o diferencial entre os tipos, e os diferentes splicing permitem a origem de muitos RNA mensageiros (mRNA) diferentes (Turek, 1994). 1.2.3 Replicação do HPV O alvo da infecção pelo HPV são as células que compõem o epitélio estratificado (Kenneth, 1996; Doorbar, 2005). Esse tecido é composto por camadas finas de células nãodivididas em vários estágios de diferenciação terminal, com a camada superior sendo a mais diferenciada. Apenas células da camada mais inferior deste tecido (as células basais) se proliferam (Doorbar, 2005). Apesar do ciclo replicativo do HPV começar com a infecção de uma célula basal, ele só se conclui quando as células infectadas chegam às camadas superiores do epitélio (Hoffman et al., 2006). Para iniciar uma infecção, os papilomavírus devem ser capazes de se ligar a receptores presentes na superfície de sua célula-alvo, e, depois, serem transportados através da membrana para o citoplasma (Longworth & Laminis, 2004). Acredita-se que o receptor para a entrada do vírus seja a integrina-α6, situada na camada basal (Evander et al., 1997; McMillian et al., 1999). O DNA viral será transportado para o núcleo a fim de iniciar a transcrição gênica e a replicação do DNA (Zhou et al., 1995). O ciclo replicativo do papilomavírus depende do programa de diferenciação do epitélio escamoso e envolve vários eventos, tais como a amplificação do genoma, a expressão de genes tardios e a montagem da partícula viral (Kenneth, 1996). A análise do DNA dos papilomavírus, em tecidos de verrugas, sugere que a replicação do DNA viral pode ser dividida em três fases: fase inicial da infecção, fase proliferativa das células basais e fase de replicação vegetativa (Del Vecchio et al., 1992). 20 Na fase inicial da infecção, o genoma viral se estabelece como DNA epissomal (cromossomo extra) tornando-se estável (Doorbar, 2005). O padrão de expressão dos genes virais nestas células não está bem definido, porém, sugere-se que, geralmente, as proteínas virais E1 e E2 são expressas para manter o DNA viral como um epissoma (Wilson et al., 2002), bem como para facilitar a separação correta do genoma durante a divisão celular (You et al., 2004). Um número baixo de cópias (50 a 100 cópias) do epissoma é replicado em conjunto com os cromossomos das células basais do epitélio escamoso (Del Vecchio et al., 1992). Na fase de proliferação das células do epitélio inferior, as células da camada basal se dividem e algumas células-filhas permanecem na camada inferior, na qual o número de cópias do genoma viral mantém-se relativamente estável através de vários ciclos de divisão celular. Outras células-filhas migram para a parte superior do epitélio, onde iniciam a diferenciação terminal e disseminam o vírus a todas as outras “células–irmãs” (Watt, 1998; Scheurer et al., 2005; Figura 5). As células diferenciadas contêm pouca ou nenhuma maquinaria replicativa, portanto o vírus é incapaz de se propagar se as células estiverem em diferenciação terminal (McMurray et al., 2001). Durante a infecção pelo HPV ocorre a expressão da proteína E7 (e, provavelmente, E6) por estas células, o que estaciona e bloqueia a progressão do ciclo celular, dessa forma retardando a diferenciação terminal normal (Sherman et al., 1997). A presença do vírus provoca anormalidades morfológicas nas células infectadas, tais como papilomatose, paraceratose e coilocitose (Lowy & Schiller, 2006). Como os queratinócitos infectados sofrem diferenciação terminal, o DNA viral sofre replicação vegetativa, na qual é amplificado milhares de cópias por célula infectada. Os genes tardios que codificam as proteínas do capsídeo viral são expressos subsequentemente e as partículas infecciosas são formadas (Kenneth, 1996). Nos HPV-2, HPV-11 e HPV-16 este processo ocorre na metade da camada basal superior, devido ao aumento da atividade do promotor tardio, o qual está localizado na ORF E7 e a sua regulação conduz ao aumento da expressão de proteínas envolvidas na replicação do DNA viral (E1, E2, E4 e E5) sem afetar diretamente a expressão de E6 e E7, necessárias para a entrada da célula na fase S (Peh et al., 2002). A amplificação do genoma viral requer a expressão de todos os produtos dos genes precoces, incluindo E4 e E5, cujos papéis na replicação ainda não são totalmente conhecidos (Fehrmann et al., 2003). 21 Figura 5 - Ciclo replicativo do HPV no epitélio (Fonte: Adaptado de Lowy & Schiller, 2006). 1.2.4 Patogênese da Infecção pelo HPV A infecção pelo HPV tem início quando o vírus penetra na superfície epitelial através de abrasões ou microtraumas pré-existentes no tecido, ocasionando uma infecção de duração variável, que pode ou não estar associada ao desenvolvimento de lesões benignas proliferativas, clinicamente aparentes, ou de verrugas na pele, nas mucosas e no trato genital (Scott et al., 2001; Finnem et al., 2003). A ocorrência da infecção no tecido epitelial e nas mucosas permite dividir o HPV em tipo cutâneo ou mucoso (Sanclement & Gill, 2002). O tipo cutâneo é o mais prevalente na população e está associado à ocorrência de verrugas comuns, principalmente, aquelas localizadas na palma das mãos e planta dos pés (Rácz, 2004). Alguns HPV do tipo cutâneo também são encontrados em indivíduos que estão imunodeprimidos (Zielinski et al., 2003). O tipo mucoso está relacionado, principalmente, com a infecção de células basais do epitélio estratificado escamoso e células metaplásicas da junção escamo-colunar do colo do útero. O tipo mucoso é ainda classificado em alto risco, risco intermediário e baixo risco, de acordo com a sua associação com câncer cervical (Muñoz et al., 2003; Scheurer et al., 2005; Quadro 2). 22 Quadro 2 - Classificação dos HPV de acordo com o seu potencial oncogênico. Potencial Oncogênico Alto-Risco Tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 Risco-Intermediário 26, 53, 66 Baixo-Risco 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 Os tipos de HPV de baixo risco mais comuns são o HPV-6 e o HPV-11, detectados com maior freqüência em verruga genital benigna (Dunne & Markowitz, 2006; Garnett & Duerksen- Hughes, 2006). Entre os tipos de alto risco, os HPV-16, HPV-18, HPV-31 e HPV45 são encontrados com freqüência em carcinoma de células escamosas cervicais, respondendo por quase 80% dos casos (Bosch et al., 2002), sendo que o HPV-16 e o HPV-18 são responsáveis por 50% e 20% dos casos em todo o mundo, respectivamente (Clifford et al., 2003; Dueñas-González et al., 2005). O HPV-18 é o tipo mais prevalente em adenocarcinoma cervical (55%), seguido pelo HPV-16 (32%) e HPV-45 (10%) (Tyring, 2000; Zielinski et al., 2003; De Villiers et al., 2004; Bernard, 2005; Zheng & Baker, 2006). A infecção por tipos de alto risco pode causar doenças de baixo-grau (lesão escamosa intraepitelial de baixo-grau, LSIL), a qual se manifesta pela inibição da diferenciação normal da terceira camada do epitélio (Longworth & Laminis, 2004). A lesão pode permanecer em baixo-grau, regredir ou progredir para a displasia severa ou lesão escamosa intraepitelial de alto-grau (HSIL). Este último estágio pode persistir ou pode iniciar a invasão da membrana basal adjacente levando a metástase (McMurray et al., 2001). Segundo Longworth e Laminis (2004), os HPV podem ainda infectar o epitélio glandular da endocervix, resultando em neoplasias endócrinas, como o adenocarcinoma in situ ou adenocarcinoma invasivo. O período de incubação da infecção viral varia de algumas semanas para, possivelmente, até mais de 18 meses, no entanto, na maioria dos indivíduos infectados o vírus raramente produz lesões clinicamente aparente (Sonnex, 1998), podendo a infecção pelo HPV ser assintomática, subclínica ou clínica. Em infecções assintomáticas não ocorrem alterações citológicas, embora o DNA viral possa ser detectado por técnicas de biologia molecular (Burd, 2003). A infecção subclínica caracteriza-se por uma infecção sintomática, porém, as lesões só podem ser encontradas com a utilização de um colposcópio ou por meio de exame 23 microscópico, mas não com exame visual. A infecção clínica caracteriza-se pela presença de lesões que são visíveis e o paciente pode apresentar sintomas (Tyring, 2000). A transmissão do HPV pode ocorrer por meio do contato sexual, não-sexual (Ault, 2001) e materno fetal (Ruffin et al., 2006). Acredita-se que a transmissão do HPV seja, predominantemente, por via sexual já que o HPV genital-mucoso está ausente na maioria das mulheres que não possui vida sexual ativa (Gall, 2001; Shimada et al., 2007). O HPV é muito resistente ao calor (Roden et al., 1997), e a transmissão pela via não-sexual (por fômites) também pode ocorrer, como em caso de exposição prolongada a peças íntimas compartilhadas e contaminadas (Burd, 2003). O risco de transmissão aumenta quando as verrugas genitais estão presentes uma vez que elas refletem a infecção produtiva do HPV (Gall, 2001). Os principais fatores de risco para a aquisição da infecção pelo HPV genital-mucoso envolvem o comportamento sexual, o que sugere que a atividade sexual constitui o principal fator de risco para a infecção pelo HPV (Koutsky, 1997). Sellors et al. (2003) em um estudo realizado em Ontário, Canadá, identificaram a idade (faixa etária entre 15 e 24 anos), o número de parceiros sexuais e a história de DST como fatores de risco para a aquisição da infecção pelo HPV em mulheres e, nos homens, o não-uso de preservativo (Kataja et al., 1993). Além disso, em um estudo envolvendo mulheres brasileiras atendidas pelo Sistema Único de Saúde (SUS) das cidades de São Paulo, Campinas e Porto Alegre, Roteli-Martins et al. (2007) encontraram uma associação significativa entre a idade precoce da primeira relação sexual e a aquisição da infecção pelo vírus. Embora eficaz em prevenir a disseminação de muitos agentes sexualmente transmissíveis, o uso de preservativo pode não proteger adequadamente os indivíduos em exposição ao HPV, tendo em vista que o HPV pode ser transmitido pelo contato labial, escrotal, anal ou pelo contato com tecidos infectados que não são protegidos pelo preservativo (Burd, 2003). É difícil avaliar com precisão o papel dos preservativos na prevenção da infecção pelo HPV e o desenvolvimento de complicações clínicas de infecções. 1.2.5 Proteínas E6 e E7 do HPV e oncogênese Os HPV estão envolvidos no desenvolvimento de várias lesões epiteliais malignas diferentes (Duensing et al., 2000). O estado físico do DNA viral em lesões benignas e malignas é diferente. Na primeira, o DNA permanece circular em uma forma epissomal, na 24 qual a E2 regula a expressão das proteínas E6 e E7. Nas lesões malignas, o DNA se integra a sítios cromossomais da célula hospedeira (Brenna & Syrjänen, 2003). A integração do genoma viral ocorre aleatoriamente no cromossomo celular sendo que neste evento as ORF E6 e E7 são preservadas e a ORF E2 é perdida, desregulando a expressão de E6 e E7 (Bechtold et al., 2003), o que sugere que a expressão de E6 e E7 é importante para o fenótipo de invasão celular (Van Tine et al., 2004, Pett et al., 2006; Narisawa-Saito & Kyiono, 2007). Nos HPV de alto risco, as proteínas E6 e E7 podem se ligar a proteínas reguladoras do ciclo celular (produtos de genes supressores de tumor), estimulando a progressão deste (Münger et al., 2001). A E6, por exemplo, liga-se com alta afinidade à proteína p53, degradando-a, enquanto que a E7 se associa e inativa a proteína retinoblastoma (pRb), ocasionando instabilidade genética (Herrington, 1995; Brenna & Syrjänen, 2003; Scheurer et al., 2005) e, subsequentemente, a imortalização e transformação da célula hospedeira (Howley, 2006). Além disso, E6 interage com uma série de proteínas diferentes que medeiam o percurso da apoptose e a estabilidade cromossômica regulam a transcrição, organização epitelial, polaridade celular, proliferação e controle da célula infectada (Garnett & DuerksenHughes, 2006). Interações de E6 com estas diferentes proteínas contribuem para a eficácia global da E6 na promoção da oncogenicidade do HPV (Tungteakkhun & Duerksen-Hughes, 2008). No decurso da infecção pelo HPV-16 a associação da E7 com membros da família da pRb está bem caracterizada (Werness et al., 1990; Jung et al., 2004). A pRb é um regulador negativo do ciclo celular que normalmente se associa a fatores de transcrição da família E2F, fazendo com que a célula entre na fase S (Figura 6) (Brenna & Syrjänen, 2003). A ligação da proteína E7 com a pRb desloca o E2F, independente da presença de fatores de crescimento externos, e conduz à expressão de proteínas necessárias para a replicação do DNA celular (Doorbar, 2006). 25 Figura 6 - Associação da proteína E7 do HPV-16 com a proteína pRb da célula hospedeira. Um estudo realizado por Duensing et al. (2000) demonstrou que lesões genitais malignas, pré-invasiva ou invasiva, associadas à infecção pelo HPV-16 apresentam anormalidades nos centrômeros, as quais contribuem para a ocorrência de mitoses anômalas, bem como para a instabilidade genética, resultando em aneuploidia. Em contraste, as células expressando genes E6 ou E7 de HPV-6 de baixo risco não mostraram tais anormalidades. 1.2.6 Resposta imunológica frente à infecção pelo HPV A primeira barreira contra as infecções virais é a queratina da pele, e quando esta é rompida as células de Langerhans presentes na derme podem capturar o agente invasor, dando inicio a uma resposta imunonológica inata, a qual é mediada por interferon (IFN) tipo I e células natural killer (NK), (Lorenzi & Coelho-Castelo, 2011). Outro mecanismo de defesa efetivo é a resposta mediada por células T, as quais podem exercer sua função através da citotoxicidade mediada por células T CD8+ (CTL célula T citotóxica), promovendo destruição da célula infectada, ou pela secreção de citocinas que irão ativar macrófagos para destruir o agente intracelular (Abbas et al., 2008). 26 As citocinas são proteínas solúveis, secretadas por células do sistema imunológico, que ajudam na regulação de uma resposta imunológica, auxiliando e regulando a ação de outras células (Ramos, 2009), agindo de forma autócrina ou parácrina. Algumas citocinas possuem ainda propriedades pleiotrópicas, como no caso da IL-10 que apresenta diversas atividades biológicas. O passo inicial para o reconhecimento do HPV pelo organismo, bem como os fatores determinantes para o estabelecimento da infecção e a ocorrência de displasia de baixo grau (LSIL; NIC I) não são completamente conhecidos (Pinto et al., 2002; Kirkpatrick et al., 2004; Scheurer et al., 2005). Sabe-se que a infecção pelo HPV se inicia nas células basais da camada epitelial, porém o vírus não ultrapassa a membrana basal, sendo assim a resposta imunológica primária ocorre através de mecanismos existentes nesta camada, ou seja, através da imunidade inata (Stanley et al., 1999). Em seguida ocorre uma resposta mediada por anticorpos das classes IgM e IgG, ao longo dos meses, e em um último momento há a participação da imunidade celular (Passos et al., 2008). Entretanto, como a replicação do HPV na camada basal é baixa, não ocorre lise celular e nem inflamação, inicialmente, não há estímulo do sistema imunológico e, o vírus permanece dentro da célula sem ser reconhecido. O escape do HPV dos mecanismos de defesa da imunidade inata atrasa a ativação da resposta imunológica adaptativa, e pode representar o crescimento das células infectadas, persistência viral, progressão da doença ou transformação maligna (Scott et al., 2001). A resposta imunológica celular, principalmente, a que é regulada por linfócitos TCD4+, parece ter papel importante na cura da infecção por HPV. A prevalência de alterações celulares pré-neoplásicas é alta em pessoas com comprometimento imunológico, como transplantados renais ou indivíduos infectados com HIV-1 (Mosciki, Kelly & Ellenberg, 2001; Sasadeuz et al., 2001; Staley, 2001). Segundo Gonçalves & Donadi (2004), a infecção cervical pelo HPV causa, aparentemente, uma disfunção imunológica local, promovendo uma redução na concentração de células apresentadoras de antígenos (APC) e de linfócitos T e um aumento na concentração de macrófagos. Acredita-se que a presença de macrófagos seja um indutor de regressão da lesão uma vez que eles possuem papel importante no controle negativo da transcrição de genes que sintetizam as proteínas E6 e E7 do HPV, além de exercer ação antitumoral nas células infectadas (Scott et al., 2001). 27 Macrófagos e monócitos liberam citocinas como interferon alfa (IFN-alfa), beta (IFNbeta) e gama (IFN-gama), fator de necrose tumoral (TNF) e várias interleucinas em resposta ao reconhecimento do HPV (Figura 7). Essas citocinas também atuam como quimioatrativos, pois monócitos ativados seguindo o gradiente de citocinas chegam ao local da infecção pelo HPV (Pereyra et al., 2000; Cox et al., 2003). Com isso, as células dendríticas (Langerhans) capturam o antígeno no epitélio, se deslocam para os nódulos linfáticos e, apresentam antígenos na sua superfície. Figura 7 – Resposta Imunológica à infecção pelo HPV (Fonte: Adaptado de Passos et al., 2008). Após a apresentação de antígeno, CTL são ativadas, multiplicam-se e chegam ao local da infecção ocasionada pelo HPV (Pereyra et al., 2000; Cox et al., 2003). No local da infecção, a resposta imunológica desenvolvida pode ser do tipo Th-1 (pró-inflamatória), a qual inclui a interleucina-2 (IL-2), o Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e o Interferon-gama (IFN-γ); e também do tipo Th-2 (anti-inflamatório), envolvendo a IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL10 e IL-13 (Gonçalves & Donaldi, 2004). Uma mudança acentuada no perfil de produção de citocinas Th1 para Th2 tem sido observada em pacientes com NIC e com infecção extensa pelo HPV (Clerici et al., 1997), sugerindo que a resposta das citocinas para a infecção pelo HPV pode ser influente na determinação da evolução da doença. Entretanto, não há consenso 28 na literatura sobre o padrão da produção das citocinas em resposta à infecção cervical pelo HPV. Parece existir tendência em mudar o padrão da resposta das citocinas para o tipo Th2 à medida que a lesão se agrava, mas ainda existem controvérsias. De acordo com Nicol e colaboradores (2005) pacientes com lesão HPV induzida que apresentam um perfil Th1 de citocinas têm melhor desfecho clínico quando comparadas as pacientes com perfil Th2. 1.2.7 Associação entre os polimorfismos nos genes TNF-α e IL-10 e a infecção pelo HPV 1.2.7.1 Fator de Necrose Tumoral alpha (TNF-α) O Fator de Necrose Tumoral alpha (TNF-α), descrito em 1975 (Carswell et al., 1975), é o principal mediador da inflamação aguda, sendo responsável por muitas das complicações sistêmicas de infecções severas (Barth et al., 1996). Esta citocina tem um amplo espectro de atividades biológicas, em vários tipos de células e tecidos (Oh et al., 2000), sendo considerada uma potente citocina pró-inflamatória, associada à destruição de células tumorais (Pennica et al., 1984). É produzida por diversos tipos celulares, sendo secretada, principalmente, por macrófagos ativados (Kirkpatrick et al., 2004). Atuando em sinergia com IL-1 e IL-6, o TNF-α é importante para a compreensão das conseqüências da infecção e da imunopatologia que pode acompanhar as respostas imunológicas mediada por células (Roitt et al., 2002). Em indivíduos sadios, o TNF-α é praticamente indetectável. Entretanto, níveis séricos desta citocina são detectáveis em pacientes com doenças inflamatórias ou infecciosas (Bradley, 2008). Em infecções pelo HPV esta citocina está relacionada com o controle da infecção, através da indução da apoptose tanto nas células infectadas como nas tumorais (Igansi, 2009). Na epiderme, o TNF-α é produzido pelos queratinócitos, tendo como função promover o aumento do número de células APC. Entretanto, em infecções pelo HPV ocorre a diminuição na síntese desta citocina e, consequentemente há uma redução na capacidade de apresentação de antígenos (Peixoto, 2006). O gene TNF-α está localizado na região p21.3 do cromossomo 6 e, é constituinte do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), dentro da região HLA classe III (Kirkpatrick et al., 2004; Duarte et al., 2005). A ocorrência de polimorfismos de uma única base na região promotora do gene TNF é biologicamente importante, pois pode alterar os 29 níveis de produção desta citocina e, consequentemente pode, influenciar a progressão da doença (Kroeger et al., 1997; Wilson et al., 1997). Estudos recentes têm descrito três polimorfismos na região promotora do TNF-α humano (Figura 8), envolvendo a substituição de guanina por adenosina em alelos raros, nas posições: -238 (D’Alfonso et al., 1994; Pociot et al., 1995), -308 (Nedospasov et al., 1991; Wilson et al., 1992; Uldalova et al., 1993) e 488 (D’Alfonso et al., 1996; Jongeneel et al., 1996). Figura 8- Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene TNF-α (Fonte: Adaptado de Posch et al., 2003). Dados literários indicam que o processo de carcinogênese está associado à capacidade do hospedeiro em produzir níveis elevados desta citocina (Calhoun et al., 2002; Duarte et al., 2005). A capacidade de produzir níveis diferentes (baixo, médio e alto) de TNF-α é determinada geneticamente, podendo ser influenciada pela presença do polimorfismo G/A na região promotora. No que se refere ao HPV, a presença do alelo G no polimorfismo -308 confere ao indivíduo um fenótipo de baixa produção desta citocina, estando relacionado com a ocorrência de lesões cervicais de baixo grau, LSIL e NIC I (Fernandes et al., 2008). O alelo A por sua vez está associado à alta produção de TNF-α (Brinkman et al., 1996; Fanning et al., 1997). Alguns estudos relatam que o desenvolvimento de lesões cervicais de alto grau (HSIL), do tumor maligno e de câncer cervical invasivo está relacionado com a propensão genética do hospedeiro em produzir níveis elevados de TNF-α (Demeter et al., 1997; Gallagher et al., 1997) e que a presença do alelo raro A nessa região pode aumentar em 2 vezes a transcrição gênica (Wilson et al., 1997; Kroeger et al., 1997). 30 1.2.7.2 Interleucina-10 (IL-10) A IL-10 é uma citocina pleiotrópica, produzida principalmente por células TCD4+, macrófagos, células B e, em outras condições por células Th1 e pelos queratinócitos (Guimarães et al., 2011). Esta citocina exerce uma atividade tanto imunosupressiva quanto imunoestimulante na imunidade celular (Bolpetti et al., 2010). Ela atua inibindo a produção de citocinas de perfil Th-1, tais como TNF-α, IFN-γ e IL-2 e IL-12 (Matsuda et al., 1994; Peterson et al., 1998), através do bloqueio das funções dos macrófagos (Farzaneh et al., 2006) e, dessa forma interfere na ativação dos linfócitos T citotóxicos e células NK. Além de interferir na resposta imune, a IL-10 estimula a expressão gênica do HPV, induzindo a transcrição da proteína precoce do HPV-16 (Arany et al., 2002). A IL-10 também pode exercer um efeito inibidor na produção de IL-12, a qual tem um papel chave na resposta imunológica contra neoplasias. Em alguns casos de câncer de colo uterino foi observado níveis elevados de IL-10 nas células tumorais (Clerici et al., 1998). O gene IL-10 contém 5 éxons, está localizado no cromossomo 1q31-32 e, é altamente polimórfico (Figura 9). Cinco polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) funcionais foram descritos, os quais incluem duas repetições dinucleotídicas de citosina e adenina e três bialélicos na região promotora, nas posições -1082, -819 e -592 (Stanczuck et al., 2001). Figura 9- Representação esquemática da localização de polimorfismos do gene IL-10 (Fonte: Adaptado de Tso et al., 2005). Os polimorfismos na região promotora parecem ter aplicabilidade clínica, já que alguns alelos podem determinar a produção de níveis baixos (AA), intermediários (AG) e altos (GG) desta citocina (Tonini, 2009). Acredita-se que a presença do alelo A na posição 1082 esteja associada à produção de baixo níveis de IL-10, pois estudo avaliando este polimorfismo relatou que mulheres portadoras do alelo G parecem estar predispostas 31 imunogeneticamente a produzir níveis elevados de IL-10. Além disso, a freqüência do alelo -1082*A IL-10 foi menor no grupo de mulheres com câncer cervical (Stanczuck et al., 2001). Outro estudo, realizado na cidade de Ribeirão Preto (São Paulo) evidenciou que pacientes infectadas com o HPV-16, portadoras de alelos associados à baixa produção da IL10, apresentaram níveis intralesionais significantemente maiores quando comparados com as pacientes que não possuíam o HPV-16. Sugerindo que a infecção pelo HPV pode ser um importante fator para a instalação e progressão de lesões cervicais (Fernandes et al., 2004). 1.2.8 Polimorfismos nos genes de citocinas e a co-infecção HPV/HIV Os polimorfismos nos genes de citocinas podem contribuir como marcadores para a identificação de indivíduos com predisposição ao desenvolvimento de câncer de colo uterino, pois muitos estudos têm demonstrado a associação dos polimorfismos das citocinas TNF-α, Il-10, IL-6 e IFN-γ com o desenvolvimento do câncer cervical (Stanczuk et al., 2001; Roh et al., 2002; Stanczuk et al. 2003; Govan et al., 2003). Entretanto, poucos são os estudos avaliando a relação destes polimorfismos na co-infecçção HPV/HIV. Em pacientes imunodeficientes, incluindo indivíduos infectados com o Vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) e em modelos animais, a deficiência na imunidade celular está associada à persistência da infecção pelo HPV e o desenvolvimento de câncer cérvico-uterino (Shrestha et al., 2007). Segundo Sun-Kuie e colaboradores (2004), mulheres co-infectadas com HPV/HIV tendem a desenvolver mais lesões cervicais de baixo grau (LSIL) e de alto grau (HSIL) em relação às mulheres imunocompetentes infectadas com HPV. Alguns estudos sugerem que o aumento da persistência da infecção pelo HPV e das lesões intra-epiteliais, seja decorrente da fraca resposta do sistema imunológico (Araújo et al., 2005; Zimmermmann et al., 2006), já que a infecção pelo HIV ocasiona uma perda progressiva de LTCD4+ , e também uma redução na contagem de células de Langerhans no local da infecção (Nadal et al., 2006). A carga viral plasmática do HIV constitui um importante marcador da infecção por este vírus, sendo útil no prognóstico da doença e monitoramento da eficácia do tratamento antirretroviral. Supõe-se que a alta concentração de partículas virais circulantes leve a maior replicação do vírus e, consequentemente maior destruição dos LTCD4+, resultando numa resposta imunológica local deficiente. Dessa forma, acredita-se que a persistência da infecção pelo HPV seja inversamente proporcional ao 32 número de LTCD4+ e diretamente proporcional à carga viral do HIV, podendo ainda sofrer influencia da TARV (Palefsky et al., 2006, Jalil et al., 2009; Ogoina et al., 2013). Fernandes e colaboradores (2005) investigaram amostras de biópsias de mulheres portadoras do HIV e verificaram que as infectadas com HPV-16 exibiram níveis aumentados de IFN-γ e IL-10, quando comparados com as amostras negativas para o HPV-16, enquanto que as amostras infectadas com HPV-18 apresentaram uma diminuição dos níveis de TNF-α e IFN-γ. Ainda entre indivíduos portadores do HIV, o haplótipo GCC no promotor IL-10 foi associado com redução da taxa de depuração do HPV-16, HPV-18 e qualquer tipo de alto risco, mas não em HPV de baixo risco. O haplótipo GCC da IL-10 tem sido associado com a produção de, relativamente, altos níveis IL-10, podendo inibir citocinas como IL-2, TNF-α, IL-4, IL-6 e IL-12 que estão envolvidas na modulação do perfil da resposta Th1-Th2; reduzir regulação da expressão de moléculas do MHC classe I e classe II, ou induzir a transcrição do promotor precoce do HPV, oferecendo todos os potenciais contribuintes para a duração da infecção pelo HPV em indivíduos imunodeprimidos (Shrestha et al., 2007). 1.2.9 Prevalência da Infecção pelo HPV O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) estima que, pelo menos, metade de todas as pessoas sexualmente ativas no mundo será infectada pelo HPV em algum momento das suas vidas, enquanto que, no mínimo, 80% das mulheres adquirem uma infecção pelo HPV até os 50 anos de idade (CDC, 2004). A prevalência da infecção pelo HPV pode variar muito de acordo com a população estudada. Adolescentes que são sexualmente ativas têm as mais altas taxas de prevalência e as taxas de infecção pelo HPV incidente, com mais de 50 % tendo infecções dentro de 2 a 3 anos após o início da atividade sexual (Moscicki, 2007). Mulheres portadoras do HIV-1 também apresentam uma elevada prevalência da infecção pelo HPV e, geralmente, apresentam infecções com múltiplos genótipos (Minkoff et al., 1998). Em um estudo conduzido em Zambia, na África, a prevalência entre participantes portadoras do HIV foi de 80%, enquanto que em pacientes soronegativos para o HIV-1 a prevalência foi de 55%. Infecções com múltiplos genótipos foram identificadas em 11,4%, sendo que 7,1% foi observado em pacientes portadoras do HIV (Ng’andwe et al., 2007). 33 Um estudo realizado por Smits e colaboradores (2005), utilizando amostras de urina de homens infectados com HIV, em Amsterdam, Holanda, verificou uma prevalência de 39,4%, sendo que 41% possuíam infecção por múltiplos genótipos, onde o HPV-52 foi o mais prevalente. Nos homens não-infectados pelo HIV a prevalência foi 9,6% e destes, três participantes possuíam genótipos múltiplos. Na Mongólia, Garland e colaboradores (2001) examinaram um grupo de mulheres atendidas em uma clínica de doenças sexualmente transmissíveis (DST) e constataram que 36% destas mulheres apresentavam infecção pelo HPV, sendo que destas 44% apresentavam infecção com genótipos oncogênicos. Um estudo envolvendo 272 mulheres atendidas no Hospital Ramon e Cajal, em Madri, detectou uma prevalência da infecção pelo HPV equivalente a 77,94% da população estudada, na qual os HPV-16 e/ou HPV-18 foram detectados em 33,02% dos casos (Chacón et al., 2007). Nos Estados Unidos, Peyton e colaboradores (2001) encontraram uma prevalência de 39,2% do HPV em mulheres atendidas em uma clínica ginecológica, na qual a prevalência dos tipos de alto risco, baixo risco e tipos não caracterizadas foi 26,7%, 14,7% e 13%, respectivamente. Em Varsóvia, na Polônia, foi identificada uma prevalência de 16,6% na população feminina em geral. Dentre as mulheres que não apresentavam anormalidades citológicas, a prevalência foi de 14,4%, já entre as mulheres com alterações citológicas houve uma prevalência de 65,7%, onde o HPV-16 foi o mais prevalente (25,7%) (Bardin et al., 2007). Na Itália, um estudo conduzido entre a população de mulheres assintomáticas identificou uma prevalência de 15,9%, onde o HPV-16 foi o mais prevalente (Centurioni et al., 2005). Na Ásia, Bao e colaboradores (2007) observaram uma prevalência global de 85,9%, dentre as mulheres que apresentavam lesão do tipo HSIL, LSIL ou citologia normal a prevalência foi de 81,0%, 72,9% e 14,4%, respectivamente. Em mulheres profissionais do sexo no Japão, Ishi e colaboradores (2000) observaram uma prevalência da infecção pelo HPV correspondente a 62,1% da população examinada. No Brasil, entre os anos de 1997 e 1998, 19,1% das mulheres encarceradas na Penitenciária Feminina de São Paulo estavam infectadas pelo HPV (Lopes et al., 2001). Nesse mesmo Estado, Levi e colaboradores (2002) verificaram a prevalência do HPV em mulheres 34 portadoras do HIV e constataram a infecção em 98% da população estudada, na qual o HPV-6 foi o genótipo mais prevalente, sendo observado em 39,2% dos pacientes, seguido dos HPV51 (31,9%), 11 (26,0%), 18 (24,0%), e 16 (22,5%). A análise de amostras cervicais de mulheres investigadas para o câncer de cervical na cidade de São Paulo (Rama et al., 2008) demonstrou uma prevalência de 17,8% da infecção genital por HPV de alto risco, com uma predominância dos casos em mulheres com idade abaixo de 25 anos e um novo aumento entre as mulheres com idade superior a 55 anos. Na cidade do Rio de Janeiro, Pereira e colaboradores (2007) observaram uma prevalência de 75,6% entre as mulheres atendidas pelo Serviço de Patologia Cervical do Hospital Universitário Antonio Pedro. Na Cidade de Porto Alegre, Igansi (2005) encontrou uma prevalência do HPV correspondente a 28,4% da população investigada. No nordeste brasileiro, Soares e colaboradores (2003) observou uma prevalência de 26% entre as mulheres com idade reprodutiva. Na região Norte do país, vários estudos de prevalência da infecção pelo HPV em amostras cervicais tem sido desenvolvidos. Na cidade de Belém, Pará, Noronha e colaboradores (1999) descreveram uma prevalência de 65,78% da infecção em um grupo de mulheres com lesões cérvico-uteirna. No ano de 2009, Monteiro analisou 162 amostras cervicais de mulheres assintomáticas para o HPV e constatou uma prevalência global de 18,52%, onde a maior prevalência da infecção (49,38%) foi observada no grupo de mulheres com esfregaço cervical livre de qualquer alteração citológica. Em mulheres, com idade entre 18 e 28 anos, do município de Tomé-Açu (Pará), Prazeres (2011) detectou o vírus em 6,94% da população examinada. Já em estudo conduzido na Amazônia Oriental Brasileira, Pinto e colaboradores (2011) identificaram o vírus em 14,6% dos espécimes analisados. Neste mesmo ano, na cidade de Belém, estudo desenvolvido em mulheres submetidas ao PCCU constatou a infecção pelo HPV em 12,4% dos casos (Noronha et al., 2011). Em 2012, Plácido avaliou amostras de mulheres da população geral e mulheres encarceradas em uma penitenciária do município de Ananideua (Pará) e detectou o HPV em 15% e 10,5% das amostras investigadas, respectivamente. A infecção genital pelo HPV pode não ser clinicamente aparente em homens. Della Torre et al. (1992) analisaram 64 amostras de conteúdo uretral de homens que tinham 35 parceiras portadores do HIV, onde o DNA do HPV foi detectado em 14 casos (21%). Um estudo semelhante realizado na cidade de São Paulo identificou uma prevalência de 25,9% dentre as amostras analisadas (Giraldo et al., 2008). 1.2.10 Infecção pelo HPV e Câncer de colo uterino Os HPV de alto risco são encontrados em mais de 90% dos casos de câncer cérvicouterino (Del Mistro, 2006; Chacón et al., 2007). Este tipo de câncer é uma das principais causas de morte por câncer entre as mulheres no mundo (Brasil, 2012). No Brasil, de acordo com Instituto Nacional de Câncer (INCA), no ano de 2012 espera-se 17.540 casos novos de câncer de colo do útero, com um risco estimado de 17 casos a cada 100 mil mulheres. Segundo o mesmo boletim, à exceção do câncer de pele nãomelanoma, a região Norte do país representa a área de maior incidência (24/100mil mulheres) para este câncer . Espera-se que no Estado do Pará, neste mesmo ano, sejam registrados 810 novos casos, sendo 250 registrados na capital do Estado (Brasil, INCA, 2011). Esses dados colocam o estado do Pará como uma área de elevada prevalência para o câncer cérvicouterino. Muitos estudos epidemiológicos têm, consistentemente, demonstrado que mais de 90% dos cânceres cervicais pode ser atribuído a tipos específicos de HPV (Del Mistro, 2006; Chacón et al., 2007). Um estudo conduzido entre mulheres com câncer cervical invasivo na Itália, demonstrou que 91,7% estavam infectadas pelo HPV, onde o HPV-16 e o HPV-18 estavam presentes em 75,0% dos casos (Del Mistro et al., 2006). No Norte da Tailândia, Siriaunkgul et al. (2008) investigaram a presença de HPV em amostras de biópsias de pacientes com carcinoma epidermóide invasivo e constataram que 96% das amostras apresentavam infecção pelo vírus, na qual 78,1% possuíam infecção com único genótipo, sendo o HPV-18 o mais comum, representando 64,4% dos casos. A investigação da distribuição dos genótipos em pacientes com câncer cervical em Zhejiang, Província da China, demonstrou que o HPV estava presente em 95% dos casos de câncer cervical (Hong et al., 2007). 36 1.2.11 Diagnóstico, Tratamento e Prevenção da Infecção pelo HPV A citologia oncótica constitui a ferramenta de escolha para o rastreamento da infecção pelo HPV e detecção precoce de casos de cânceres de colo uetrino (Jung et al., 2004). Entretanto, este método é empregado como um teste de triagem, na qual se detecta alterações sugestivas da infecção pelo HPV, tais como a coilocitose, caracterizada por um halo prerinuclear e a discariose – presença de células alargadas, com núcleo irregular (Munro, 1992). Devido à associação existente entre a infecção pelo HPV e o câncer cervical, a análise citológica pelo Método de Papanicolaou tornou-se imprescindível na triagem do câncer de colo uterino. Por isso, a partir de 1998 o Governo Federal Brasileiro instituiu o PCCU nas unidades básicas do Sistema Único de Saúde, através da implantação, em todo o país, do Programa Viva Mulher (Programa Nacional de Controle de Câncer de Colo do Útero e Mama), sendo a nomenclatura baseada no Sistema de Bethesda de 1988 a terminologia empregada nos laboratórios de citopatologia ligados ao SUS. Desde então, esse método de rastreio reduziu em 50% a mortalidade por câncer cervical nos últimos 30 anos (Jung et al., 2004). Esse sistema foi desenvolvido para refletir uma compreensão avançada da neoplasia cervical e introduzir um diagnóstico histológico descritivo e uma terminologia uniforme. O sistema classifica as anormalidades das células escamosas em quatro categorias: (i) célula atípica de significado indeterminado – ASCUS; (ii) lesão intraepitelial escamosa de baixo grau – LSIL; (iii) lesão intraepitelial de alto grau – HSIL e (iv) carcinoma de células escamosas (Burd et al., 2003). Em mulheres com alterações celulares sugestivas de infecção pelo HPV, faz-se necessário o emprego de métodos com elevada sensibilidade e especificidade para a detecção do vírus. A identificação do DNA viral por métodos de biologia molecular, em especial a Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR) e Captura Híbrida tem sido referida por vários pesquisadores (Finan et al., 2001). A Captura Híbrida é uma técnica capaz de detectar o DNA do HPV, permitindo a identificação dos tipos virais em alto e baixo risco. Indiretamente essa técnica prediz o risco de evolução das lesões para o câncer cervical (Novaes et al., 2006). No Brasil, este exame não 37 é rotineiro, sendo solicitado, geralmente, por médicos de clínicas ginecológicas privadas, já que esse exame é bem mais caro que os exames citológicos convencionais. As lesões provocadas pelo HPV, geralmente, não são acompanhadas por um processo inflamatório, não causam dor e tendem a ser eliminadas espontaneamente pelo organismo. Portanto, o tratamento basicamente consiste na remoção da lesão, sendo frequentemente classificados em cirúrgicos ou não cirúrgicos. Os tratamentos cirúrgicos incluem a eletrocirurgia, excisão cirúrgica, crioterapia e cirurgia a laser. O tratamento não cirúrgico inclui o uso de podofilina, interferon e ácido bi ou tri-cloro-acético (Burd, 2003). As medidas preventivas contra o HPV envolvem a redução dos riscos para a aquisição da mesma e o desenvolvimento de vacinas. Por fazer parte do grupo de IST, a prevenção da transmissão sexual do HPV envolve, basicamente, a utilização do preservativo masculino. Com o reconhecimento da associação entre a infecção pelo HPV e o câncer cervical, na década de 1990, muitos estudos se empenharam no desenvolvimento de vacinas preventivas (Mansi, 2007), baseadas na indução de anticorpos neutralizantes contra as grandes e pequenas proteínas do capsídeo, L1 e L2 do HPV (Kim et al., 2008). Atualmente, duas vacinas fabricadas usando a tecnologia de DNA recombinante, contendo antígenos da proteína L1 do capsídeo do HPV (Lowy & Schiller, 2006), as quais estão disponibilizadas comercialmente. Entretanto, essas vacinas não são eficazes na eliminação de infecção pré-existente ou de doenças neoplásicas relacionadas ao HPV. A primeira vacina contra a infecção pelo HPV a ser disponibilizada, em 2006, no Canadá, foi a Gardasil (Dawar et al., 2007). Trata-se de uma vacina quadrivalente que oferece proteção contra os tipos de baixo risco, HPV-6 e HPV-11, responsáveis por 90% das verrugas genitais – e contra os de alto risco, HPV-16 e HPV-18, os quais estão associados com 70% de cânceres cervicais (Merck Frosst, 2006). Também está disponibilizada, comercialmente, outra vacina bivalente (Cervarix), a qual oferece proteção apenas contra o HPV-16 e o HPV-18 (Harper et al., 2004). 38 1.3 OBJETIVOS 1.3.1 Objetivo Geral Descrever a prevalência da infecção pelo HPV, bem como verificar a associação entre a infecção genital pelo HPV e polimorfismos nos genes de citocinas TNF-α e IL-10 e os diferentes graus de lesão intra-epitelial em mulheres portadoras do HIV-1, no estado do Pará. 1.3.2 Objetivos Específicos Descrever as características sócio-demográficas e epidemiológicas mulheres portadoras do HIV-1; Definir a prevalência da infecção genital pelos diferentes tipos de HPV na população examinada; Descrever a frequência de lesões cervicais entre as mulheres examinadas; Descrever a frequência genotípica dos polimorfismos de G-308A TNF-α e A-1082G IL-10; Descrever as possíveis associações entre as variáveis sócio-demográficas, epidemiológicas, as lesões cervicais, níveis de LTCD4+/CD8-, carga viral plasmática do HIV e os polimorfismos de IL-10 e TNF-α com ocorrência de infecção pelo HPV. 39 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 ASPECTOS ÉTICOS Foi realizado um estudo de prevalência de base populacional do tipo observacional transversal, no qual as informações epidemiológicas foram obtidas em um único momento. Em obediência às resoluções nº 196/96 e 347/05 do Conselho Nacional de Saúde, a qual trata das diretrizes e normas regulamentares da pesquisa envolvendo seres humanos, o presente projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Ciências da Saúde, da UFPA (Anexo 1). Todas as participantes foram orientadas a cerca dos objetivos do trabalho sendo que, aquelas que concordaram em participar assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 1) e responderam a um questionário epidemiológico (Apêndice 2), a fim de se obter informações demográficas, sociais e comportamentais de cada participante. 2.2 POPULAÇÃO EXAMINADA A população estudada foi composta de mulheres portadoras do HIV-1, com diagnóstico previamente confirmado, e que fazem acompanhamento clínico na Unidade de Referência de Doenças Infecto-Parasitárias Especiais (UREDIPE), localizada na cidade de Belém, Pará. As amostras foram coletadas por demanda espontânea, adotando os seguintes critérios de inclusão: (i) ser portador do HIV (ii) ter amostras cervicais satisfatórias para a análise; (iii) ter ou já ter tido vida sexualmente ativa; e (iv) aceitar participar da pesquisa. A coleta de material biológico foi realizada na própria unidade de referência, no período de março de 2010 à dezembro de 2012, em sala reservada ao setor de exame preventivo de câncer de colo do útero (PCCU). O cálculo do tamanho amostral (N=150) foi feito com base na prevalência estimada do HPV em mulheres brasileiras portadoras do HIV-1, em torno de 58%, com uma estimativa de erro de 4% e o poder do teste de 80%, sendo realizado com o auxílio do programa BioEstat 5.3 (Ayres et al., 2011). 40 2.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS No período de março de 2010 a dezembro de 2012 foram coletadas amostras cervicais de 184 mulheres que buscaram atendimento no setor de PCCU na UREDIPE. A princípio foram coletadas duas amostras cervicais de cada participante: uma destinada à confecção da lâmina para a análise citológica e a outra conduzida à análise por biologia molecular para a pesquisa de HPV e de polimorfismos nos genes de citocinas. Para a coleta de material cervical, a mulher foi disposta em posição ginecológica, com posterior introdução de espéculo vaginal, estéril e descartável. Inicialmente, observaram-se as características do colo uterino. Em seguida, procedeu-se com a coleta de material destinado à análise. Para a análise citológica, foram colhidos materiais provenientes da ectocérviceutilizando-se a espátula de Ayres- e da endocérvice, com o auxílio de escovinha endocervical. Após a coleta, a fixação do material foi realizada em álcool a 96%. Depois de fixados, os esfregaços foram encaminhados para análise citológica. As lâminas confeccionadas foram coradas pelo Método de Papanicolaou e analisadas no Laboratório Central do Estado do Pará (LACEN-PA) por profissional especializado na área de citopatologia. Os resultados citológicos emitidos foram classificados de acordo com a Nomenclatura Brasileira para Laudos Citopatológicos Cervicais (Brasil, 2006). Neste manual, consideram-se dois tipos de amostras para análise: convencional e em meio líquido. Independente do tipo, a amostra deve passar por uma avaliação pré-analítica e de adequabilidade. O diagnóstico descritivo envolve os limites citológicos de normalidade do material examinado, a ocorrência de alterações benignas (inflamação, reparação, metaplasia escamosa imatura, atrofia com inflamação, radiação) e a ocorrência de alterações prémalignas ou malignas (atipias de significado indeterminado- escamosa, glandular e de origem indefinida-; Lesão intra-epitelial de baixo grau- LSIL; Lesão intra-epitelial de alto grauHSIL; carcinoma in situ). As amostras cervicais que foram submetidas à análise por Biologia Molecular foram coletadas com o auxílio de escovas endocervicais e, acondicionadas em frascos contendo 2 mL de Solução Salina Tamponada (PBS). Após a coleta, as amostras foram transportadas ao Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFPA, onde foram registradas e estocadas a -20ºC até o momento de uso. 41 2.4 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2.4.1 Extração de DNA Todas as amostras coletadas foram submetidas à extração de DNA total a partir de células de descamação do epitélio estratificado (amostra cervical) de acordo com o protocolo do método de extração fenol-clorofórmio, o qual é realizado em três etapas: lise de hemácias; lise de leucócitos e precipitação de proteínas. 2.4.2 Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (PCR) Após a extração de DNA, as amostras cervicais foram submetidas à reações de PCR a fim de amplificar um segmento da ORF L1 do HPV (450 pares de base), de IL-10 (190pb) e TNF-α (107pb). Os iniciadores envolvidos na reação estão descritos no Quadro 3. A reação de amplificação do segmento alvo do HPV ocorreu através do sistema de Nested-PCR, empregando-se os pares de iniciadores consenso MY09/11 (1ª etapa) e GP05+/06+ (2ª etapa). Em cada reação foi utilizado um volume final de 50 μL contendo 200 ng de DNA extraído; 200 μM de cada dNTP; 10 pmol de cada iniciador; 50 nM de KCL, 2,5 mM de MgCl2; 10 mM de Tris-HCl pH 8.3 e 1 U de Taq polimerase (Demath et al., 2010). Nas amplificações dos fragmentos alvo dos genes de citocinas foi utilizado um volume final de 50 μL para amplificação do gene TNF-α e 25 μL para IL-10. Ambas as reações, contendo 200 ng de DNA extraído; 200 μM de cada dNTP; 5 pmol de cada iniciador; 50 nM de KCL, 2,5 mM de MgCl2; 10 mM de Tris-HCl pH 8.3 e 1 U de Taq polimerase. Todas as amplificações foram realizadas no equipamento Termociclador Peltier Thermal Cycler (Biocycler, USA). As condições de amplificação de cada fragmento alvo está descrita no Quadro 4. 42 Quadro 3 – Iniciadores utilizados na reação de PCR. Iniciadores Seqüência 5’-3’ Gene MY09 L1 5´-CGTCCMAARGGAWACTGATC-3´ MY11 L1 5´-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3´ GP5+ L1 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC- 3’ GP6+ L1 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3 TNF-α -308F TNF-α 5′-AGGCAATAGTTTTGAGGGCCAT -3′ TNF-α -308R TNF-α 5′-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG -3′ IL-10 -1082F IL-10 A-1082G 5′-TCTGAAGAAGTCCTGATGTC -3′ IL-10 -1082R IL-10 A-1082G 5′-CTCTTACCTATCCCTACTTCC -3′ Quadro 4- Condições de amplificação dos fragmentos alvo. N° de ciclos Sistemas HPV (ORF L1) TNF-α IL-10 Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Etapa 2-4 95°C 95°C 56°C 72°C 40 ciclos 5 min 1 min 1 min 1min 95°C 95°C 60°C 72°C 5 min 30 seg 30 seg 30 seg 94°C 94°C 60°C 72°C 2 min 1 min 1 min 1 min Etapa final 72°C 10 min 35 ciclos 72°C 10 min 40 ciclos 72°C 10 min 43 2.4.3 Eletroforese do produto amplificado Os produtos da PCR foram visualizados após eletroforese (100 V/45 minutos) em gel de agarose a 2% (HPV) e a 3% (genes de interleucinas) utilizando tampão TAE 1x, contendo 6μL de Syber-Safe (INVITROGEN, OREGON, U.S.A.), mediante a utilização de transiluminador com fonte de luz ultravioleta. 2.4.4 Determinação dos polimorfismos Os produtos de PCR dos genes de interleucinas foram submetidos à reação de digestão enzimática com endonucleases de restrição específicas para cada fragmento (Quadro 5) e foram visualizados após eletroforese em gel de agarose a 3% (TNF-α) e 4% (IL-10). As reações de digestão foram realizadas de acordo com a temperatura ótima de ação de cada enzima e tempo específico. Quadro 5- Enzimas de restrição utilizadas para identificação dos polimorfismos nos genes de IL-10 (-1082 A/G) e TNF-α (-308 A/G). Sistema Enzima Fragmentos gerados Temperatura / tempo TNF-α -308 NCo-I G:87pb e 20pb 37°C- 5horas A: 107pb IL-10 -1082 MnL-I G: 93pb, 65pb e 32pb 37°C- 4horas A: 125pb e 65pb 2.4.5 Genotipagem do HPV As amostras positivas para o HPV foram encaminhadas ao Laboratório de Papilomavírus do Instituto Evandro Chagas para realização da genotipagem viral através do kit comercial LINEAR ARRAY HPV Genotyping Teste (Roche), seguindo as recomendações do fabricante. 44 A técnica detecta 37 genótipos de HPV que infectam o trato anogenital (HPV-6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 69,70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39, CP6108). Consiste na hibridização do DNA viral obtido em PCR com a sonda marcada em tira reagente e, baseia-se em cinco etapas: preparação da amostra, amplificação do DNA alvo por PCR, hibridização do produto amplificado com sondas oligonucleotídicas e detecção dos produtos híbridos por determinação colorimétrica. 2.5 QUANTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS TCD4+/CD8- E CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HIV-1 As informações sobre níveis de LTCD4+/CD8- e carga viral plasmática do HIV-1 foram obtidas por meio do acesso ao Sistema de Controle de Exames Laboratoriais da Rede Nacional de Contagem de TCD4+/CD8- e Carga Viral (SISCEL). Nos casos de pacientes com mais de uma contagem registrada no sistema, considerou-se como referência a contagem feita no período mais próximo ao da data de coleta das amostras cervicais. 2.6 INFERÊNCIA ESTATÍSTICA As informações clínicas, laboratoriais, sociais, demográficas e comportamentais dos pacientes envolvidos no trabalho, coletadas por meio do questionário, foram depositadas em banco de dados montado no programa Access da plataforma Windows. Os resultados de prevalência do HPV em pacientes portadores do HIV-1 foram correlacionados com as informações epidemiológicas coletadas por meio das entrevistas através do teste de Regressão Logística Múltipla. Os resultados da pesquisa de polimorfismos nos genes de interleucinas foram correlacionados entre si e também com os tipos de lesão intraepitelial empregando-se o teste G (Williams) e Exato de Fisher. Todos os testes foram executados com auxílio do programa BioEstat 5.3 (Ayres et al., 2011). 45 3. RESULTADOS 3.1 CARACTERISTICAS DA POPULAÇÃO ESTUDADA Do total de mulheres envolvidas no presente estudo (N=185), 16 mulheres não atenderam aos critérios de inclusão, devido à ausência de questionário epidemiológico, ocorrência de amostras insatisfatórias para análise de biologia molecular, recusa em assinar o TCLE. Sendo assim, apenas 169 mulheres foram elegíveis para a pesquisa. A média de idade das mulheres incluídas na pesquisa foi de 36,6 anos, variando entre 19 e 66 anos. A análise do questionário epidemiológico revelou que 45,5% (77/169) das mulheres eram casadas ou vivia em uma relação de união estável; 49,7% (84/169) haviam cursado somente o Ensino Fundamental, enquanto que apenas 8 mulheres (4,7%) referiram estar cursando o Ensino Superior (Tabela 1). Tabela 1 – Características demográficas das mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Variáveis demográficas Número de mulheres Idade 19-28 anos 29-38 anos 39-48 anos 49-58 anos > 59 Não informado* Total Estado Civil Solteira/separada/viúva Casada/união estável Não informado* Total Escolaridade Ensino Fundamental Ensino Médio Ensino Superior Não informado* Total * Não computado para análise estatística Porcentagem (%) 34 71 41 12 05 06 169 20,1 42,0 24,3 7,1 3,0 3,5 100 90 77 02 169 53,2 45,6 1,2 100 84 76 08 01 169 49,7 45,0 4,7 0,6 100 46 No que se refere ao etilismo, 56,8% (96/169) das mulheres negou consumo de bebidas alcoólicas. Assim como, a maioria se autodeclarou como não fumante (77,5% ;131/169) e não usuário de drogas (84%; 142/169), Tabela 2. No grupo de mulheres usuárias de drogas (15/169), observou-se que a maconha foi relatada em 60% (9/15) dos casos. Tabela 2 – Distribuição das variáveis de utilização de drogas no grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Variáveis Número de mulheres Etilismo Sim Não Não informado* Total Tabagismo Sim Não Não informado* Total Drogas ilícitas Sim Não Não informado* Total * Não computado para análise estatística Porcentagem (%) 70 96 03 169 41,4 56,8 1,8 100 36 131 02 169 77,5 21,3 1,2 100 15 142 12 169 8,9 84,0 7,1 100 A análise das variáveis epidemiológicas e de comportamento sexual revelou que o início da atividade sexual no grupo estudado ocorreu antes dos 15 anos de idade (46,7%; 79/169). Observou-se ainda que a maioria das mulheres se autodeclararam heterossexuais (97,0%; 164/169), ser sexualmente ativa (74,0% 125/169) e ter parceiro fixo (66,9% 113/169). O uso regular de preservativo durante as relações sexuais foi referido por 55,6% (94/169) das mulheres. A prática de sexo anal foi constatada em 44,4% (75/169) dos casos, dos quais 44,0% (33/75) referiram o uso de preservativo nessas práticas (Tabela 3). 47 Tabela 3 – Características epidemiológicas do grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Variáveis Número de mulheres Início da vida sexual 10-15 anos 79 16-20 anos 79 21-25 anos 08 > 25 anos 03 Total 169 Opção sexual Heterossexual 164 Homossexual 02 Bissexual 02 Não informado* 01 Total 169 Vida sexualmente ativa Sim 125 Não 43 Não informado* 01 Total 169 Parceiro fixo 113 Sim 46 Não 10 Não informado* 169 Total Uso de preservativo Uso regular 94 Uso esporádico 15 Não usa 47 Não informado* 13 Total 169 Prática de sexo anal Sim 75 Não 72 Não informado* 22 Total 169 * Não computado para análise estatística Porcentagem (%) 46,7 46,7 4,8 1,8 100 97,0 1,2 1,2 0,6 100 74,0 25,4 0,6 100 66,9 27,2 5,9 100 55,6 8,9 27,8 7,7 100 44,4 42,6 13,0 100 48 Durante a coleta do material da cérvice uterina observou-se que 46,7% (79/169) das mulheres apresentaram pelo menos um tipo de sinal no momento do exame, sendo a presença de corrimento de coloração branco-acinzentado o mais prevalente (33%; 26/79), seguido do branco-leitoso (30%) e amarelo-esverdeado (13%), conforme observado na Figura 10. Figura 10- Distribuição dos sinais apresentados pelas mulheres portadoras do HIV, no momento da coleta de material da cérvice uterina. 3.2 PREVALÊNCIA DO HPV E CITOLOGIA ONCÓTICA A análise molecular demonstrou que o HPV estava presente em 107 espécimes cervicais, equivalendo a uma prevalência global de 63,3%. Em relação à análise citológica, constatou-se que duas amostras foram insatisfatórias para análise. Apenas 3,5% (6/169) dos esfregaços cervicais examinados estavam livres de alterações celulares. Em contrapartida, 75,8% (128/169) dos esfregaços apresentavam algum tipo de alteração benigna e 19,5% (33/169) apresentaram alterações pré-malignas. Não foi observada diferença estatística significante entre os resultados citológicos e a infecção pelo HPV (Tabela 4). Dentre as mulheres que apresentaram citologia normal, o HPV esteve presente em 83,3% (5/6) do material examinado. No grupo de mulheres com alteração citológica, este vírus 49 foi detectado em 60,2 % (77/128) dos casos de alteração benigna e em 72,7% (24/33) nas alterações pré-malignas (Tabela 4). Tabela 4- Prevalência da infecção pelo HPV em função do resultado citológico do grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Citologia Geral (%) HPV (+) HPV(-) Normal 06 (3,5%) 05 (83,3%) 01 (16,7%) Alterações benignas 128 (75,8%) 77 (60,2%) 51 (39,8%) Alterações pré-malignas 33 (19,5%) 24 (72,7%) 09 (27,3%) Insatisfatório para análise* 02 (1,2%) 01 (50,0%) 01 (50,0%) 169 107 62 Total p 0,2382 * Não computado para análise estatística. 1 Teste G. No grupo de mulheres com alterações benignas (128/169), a alteração inflamatória associada a microrganismos correspondeu a 70,3% (90/128) dos casos, sendo o HPV detectado em 61 amostras (67,8%). No que se refere às amostras com esfregaço inflamatório inespecífico (29,7%; 38/128), identificou-se o vírus em 16 espécimes (42,1%). A análise dos tipos de alterações benignas identificadas no grupo estudado mostrou associação estatisticamente significante com a infecção pelo HPV, sendo a razão de chance 2,9 vezes maior no grupo que apresentou alterações associadas à presença de algum microrganismo (Tabela 5). 50 Tabela 5- Prevalência da infecção pelo HPV no grupo de mulheres portadoras do HIV, com alterações citológicas benignas, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Citologia Geral HPV(+) HPV(-) p1 (N=128) 0,0099 Alterações benignas Inflamatório+microrganismo 90 (70,3%) 61 (67,8%) 29 (32,2%) Inflamatório Inespecífico 38 (29,7%) 16 (42,1%) 22 (57,9%) 128 77 51 Total 1 Teste Exato de Fisher. Das alterações inflamatórias associadas à presença de microrganismos (n=90), 40% (36/90) correspondiam a achados microbiológicos (lactobacilos, cocos e outros bacilos). Bacilos supracitoplasmáticos, sugestivos de infecção por Gardnerella vaginalis foram relatados em 32,2% (29/90) das mulheres examinadas. Já a presença de Trichomonas vaginalis, bem como achados sugestivos de infecção pelo HPV foi referida em 6% dos casos (Figura11). Figura 11- Distribuição dos microrganismos encontrados na citologia de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. 51 No que se refere às alterações pré-malignas, observou-se que 28 (84,8%) das 33 amostras apresentavam lesão intra-epitelial, sendo 15 (45,4%) de alto grau (HSIL) e 13 (39,4%) de baixo grau (LSIL). A ocorrência de atipia celular de significado indeterminado (ASC-US) foi identificada em 12,1% (6/33) das amostras. Também foi detectado um caso de Carcinoma invasivo (Ca). Porém, não se observou significância estatística entre os diferentes graus de lesão intra-epitelial e a presença do HPV (G=0,3439; p=0,8420; Tabela 6). Tabela 6- Prevalência do HPV nos diferentes graus de lesão intra-epitelial identificado em mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Geral Alterações pré- n=33 (%) HPV (+) HPV(-) p1 malignas 0,8420 ASC-US 04 (12,1%) 03 (75,0%) 01 (25,0%) LSIL 13 (39,4%) 10 (76,9%) 03 (23,1%) HSIL 15 (45,5%) 10 (66,7%) 05 (33,35) CA 01 (3,0%) 01 (100%) -- Total 33 (100%) 24 09 1 Teste G (-- )Valor numérico igual a zero. A genotipagem viral identificou os tipos de HPV em apenas 43,9% (47/107) das amostras. Foram identificados 26 tipos diferentes, sendo que os de maior prevalência foram o HPV-16 (40,4%;19/47), HPV-52 (12,8%; 6/47) e HPV-84 (8,5%; 4/47). A genotipagem parcial do número amostra pode ser decorrente das divergências metodológicas, uma vez que a detecção do HPV foi feita pela metodologia de Nested-PCR enquanto que a genotipagem foi realizada pela técnica Linear Array HPV Genotyping. Observou-se ainda que dentre as amostras genotipadas, 51,0% (24/47) apresentaram infecção por um único genótipo, dos quais o HPV-16 foi encontrado em 37,5% (9/24), seguido do HPV-61 (12,5%; 3/24). As infecções por múltiplos genótipos corresponderam a 52 49% (23/47), sendo o HPV-16 e HPV-52 detectados em 43,5% (10/23) e 21,7% (5/23) dos casos, respectivamente (Tabela 7; Figura 12). Tabela 7- Distribuição dos genótipos de HPV identificados em mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Tipos de infecção Infecção única Tipos de HPV HPV-6, HPV-16; HPV-31; HPV-35; HPV-39; HPV-45; HPV-52; HPV56; HPV-61; HPV-66; HPV-68; HPV-69, HPV-71. HPV-6; HPV-16; HPV-18; HPV-35; HPV-45; HPV-51; HPV-52; HPVInfecção múltipla 53; HPV-54; HPV-58; HPV-59; HPV-61; HPV-62; HPV-66; HPV-69; HPV-70; HPV-71; HPV-72; HPV-73; HPV-81; HPV-83 e HPV-84. Figura 12-Teste de genotipagem Linear Array HPV mostrando infecções simples (imagem à esquerda) e múltiplas (imagem à direita). 53 A classificação das espécies em função do seu potencial oncogênico demonstrou que 72,3% (34/47) das infecções eram por tipos de alto risco; 21,3% eram de baixo risco e 6,4% de risco intermediário. Nas amostras com infecções por múltiplos genótipos observou-se que 39,1% (9/23) apresentavam mais de um genótipo de alto risco (Tabela 8). Tabela 8- Distribuição dos genótipos de HPV identificados no grupo de mulheres com infecção por múltiplos genótipos, portadoras do HIV atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Amostra Genótipo Amostra Genótipo 22417 HPV-16* e 61 23292 HPV-52*, 53, 61 e 70 22435 HPV-6, 72 e 81 23293 HPV-16*, 52*, 62 e 83 22444 HPV-72, 81 e CP6108 23307 HPV-16* e 45* 22447 HPV-16* e 52* 23325 HPV-83 e 69 22456 HPV-16*, 52* e 61 23345 HPV-16* e 72 22485 HPV-16*, 35* e 52 23455 HPV-54 e 71 22517 HPV-16*, 58*, CP6108 23459 HPV-31* e 81 22520 HPV-51*, 66 e 83 23541 HPV-18*, 81 e 84 22526 HPV-58*, 83 e CP6108 23545 HPV-16*, 73* e 84 22527 HPV-52*, 62 e 83 23547 HPV-59* e 62 22556 HPV-45* e 70 23574 HPV-18* e 51* 22557 HPV-16*, 59* e 61 * Genótipo de alto risco. 3.3 PERFIL EPIDEMIOLÓGICO DO GRUPO CO-INFECTADO HIV/HPV A análise do perfil epidemiológico do grupo de mulheres portadoras do HIV, coinfectadas com o HPV, revelou que a infecção foi mais prevalente nas mulheres em idade reprodutiva (64,5%; 69/107), entre 19 e 38 anos, solteiras, separadas ou viúvas (55,1%; 59/107) e com baixo nível de escolaridade (52,3%; 56/107). Observou-se ainda uma redução na prevalência à medida que a idade aumenta, sendo 1,6 a razão de chance de infecção no 54 grupo de mulheres em idade reprodutiva. Não houve relação estatisticamente significativa entre a infecção e as variáveis: idade, estado civil e escolaridade (Tabela 9). Tabela 9- Características demográficas das mulheres co-infectadas com HPV/HIV, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Variáveis demográficas HIV+/HPV (+) N % HIV+/HPV (-) N % Idade 19-28 anos 26 24,3 08 12,9 29-38 anos 43 40,2 28 45,2 39-48 anos 23 21,5 18 29,0 49-58 anos 05 4,7 07 11,3 > 59 04 3,7 01 1,6 Não informado* 06 5,6 Total 107 100 62 100 Estado Civil Solteira/separada/viúva 59 55,1 31 50,0 Casada/união estável 46 43,0 31 50,0 Não informado* 02 1,9 Total 107 100 62 100 Escolaridade ≤8 anos 56 52,3 28 45,2 > 8 anos 50 46,7 34 54,8 Não informado* 01 1,0 Total 107 100 62 100 * Não computado para análise estatística. (1) Razão de chance. OR1 p 1,6 0,2465 1,3 0,2692 1,3 0,4240 No que se refere aos prováveis fatores de risco para a aquisição da infecção pelo HPV, não se observou relação significativa entre o etilismo, tabagismo e uso de drogas ilícitas, tendo em vista que a prevalência da infecção foi maior no grupo que não apresentava esses hábitos (Tabela 10). 55 Tabela 10- Distribuição das variáveis de utilização de drogas no grupo de mulheres coinfectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. HIV+/HPV (-) N % OR1 p Etilismo 41 38,3 29 46,8 Sim 65 60,7 31 50,0 Não 01 1,0 02 3,2 Não informado* 107 100 62 100 Total Tabagismo 24 22,4 12 19,4 Sim 82 76,6 49 79,0 Não 01 1,0 01 1,6 Não informado* 107 100 62 100 Total Drogas ilícitas 11 10,3 04 6,5 Sim 86 80,4 56 90,3 Não 10 9,3 02 3,2 Não informado* 107 100 62 100 Total 1 * Não computado para análise estatística. ( ) Razão de chance. 0,7 0,2953 1,2 0,7996 1,8 0,4911 Variáveis HIV+/HPV (+) N % Em relação ao comportamento sexual, observou-se que, praticamente, metade (50,4%) das mulheres infectadas com HPV tinha iniciado sua vida sexual depois dos 15 anos de idade. A maioria se autodeclarou heterossexual (96,2%; 103/107), ter vida sexualmente ativa (76,6%; 72/107), ter parceiro fixo (69,2%; 74/107) e ter práticas de sexo anal (46,7%; 50/107). Observou-se associação estatisticamente significativa entre a infecção e o uso de preservativo masculino, bem como com o número de parceiros sexuais diferentes no ultimo ano, sendo a chance de infecção 2,6 vezes maior no grupo de mulheres que faziam uso regular do preservativo durante as relações (Tabela 11). 56 Tabela 11- Distribuição das variáveis de comportamento sexual do grupo de mulheres coinfectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. HIV+/HPV(-) N % OR1 p Início da vida sexual 52 48,6 27 43,5 ≤15 anos 54 50,4 35 56,5 >15 anos 01 1,0 Não informado* 107 100 62 100 Total Opção sexual 103 96,2 61 98,4 Heterossexual 01 1,0 01 1,6 Homossexual 02 1,8 Bissexual 01 1,0 Não informado* Total 107 100 62 100 Sexualmente ativa 82 76,6 43 69,4 Sim 24 22,4 19 30,6 Não 01 1,0 Não informado* Total 107 100 62 100 Parceiro fixo 74 69,2 39 62,9 Sim 26 24,3 20 32,3 Não 07 6,5 03 4,8 Não informado* 107 100 62 100 Total Uso de preservativo Uso regular 55 51,4 19 30,6 Uso irregular/não usa 43 40,2 39 62,9 Não informado* 09 8,4 04 6,5 Total 107 100 62 100 Prática de sexo anal Sim 50 46,7 25 40,3 Não 43 40,2 29 46,8 Não informado* 14 13,1 08 12,9 Total 107 100 62 100 N°parceiros/ultimo ano 1 47 55,2 33 92,1 >2 40 44,8 05 7,9 Total 87 100 38 100 * Não computado para análise estatística. (1) Razão de chance. 1,2 0,5961 Variáveis HIV+/HPV (+) N % 0,6 0,9801 1,5 0,3351 1,4 0,3788 2,6 0,0079 0,7 0,4827 0,2 0,0005 57 A ocorrência de infecção pelo HPV foi maior no grupo de mulheres com história pregressa de IST (68,2%; 73/107), sem histórico de verruga genital (65,4%; 70/107) e que fazia terapia antirretroviral. A chance de aquisição da infecção pelo HPV foi 17,6 vezes maior no grupo com história de IST e, 2 vezes maior no grupo com história de verruga genital. Observou-se forte associação entre a aquisição da infecção pelo HPV e história pregressa da IST (Tabela 12). Tabela 12- Distribuição dos variáveis histórico de IST e verruga genital no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Variáveis HIV+/HPV (+) N % HIV+/HPV (-) N % História de IST 73 68,2 07 11,3 Sim 32 29,9 54 87,1 Não 02 1,9 01 1,6 Não informado* 107 100 62 100 Total História de Verruga genital 23 21,5 07 11,3 Sim 70 65,4 42 67,7 Não 14 13,1 13 21,0 Não informado* 107 100 62 100 Total 1 * Não computado para análise estatística. ( ) Razão de chance. OR1 p 17,6 <0,0001 2,0 0,2174 A análise multivariada (Teste de Regressão Logística Múltipla) foi aplicada para todas as variáveis que exibiram um p-valor igual ou inferior a 0,20 na análise univariada. Entretanto, não se observou associação estatística significante entre a infecção pelo HPV e os fatores de risco relacionados, provavelmente isso se deve a perda de informações pelo não preenchimento adequado (completo) do questionário epidemiológico. 3. 4 NÍVEIS DE LINFÓCITOS TCD4+/CD8- E CARGA VIRAL No momento da coleta de material ginecológico 79,3% (134/169) das mulheres já haviam iniciado a Terapia antirretroviral, TARV. Destas, o HPV foi detectado em 75,7% 58 (81/107) das amostras (Tabela 13). Não houve associação entre a infecção pelo HPV e a TARV. Tabela 13- Distribuição do número de mulheres co-infectadas HPV/HIV que havia iniciado a TARV. TARV HIV+/HPV (+) HIV+/HPV (-) N % N % Sim 81 75,7 53 85,5 Não 17 15,9 07 11,3 Não informado* 09 8,4 02 3,2 Total 107 100 62 100 * Não computado para análise estatística. **Teste Exato de Fisher. OR p** 0,6 0,3710 As informações sobre níveis de linfócitos TCD4+/CD8- e carga viral plasmática do HIV-1 foram obtidas por meio do acesso ao Sistema de Controle de Exames Laboratoriais da Rede Nacional de Contagem TCD4+/CD8+ e Carga Viral (SISCEL). Não foi possível obter dados de 23 dos 169 pacientes investigados. A média geral de linfócitos TCD4+/CD8- no grupo examinado foi de 486 células/ml de sangue. Também se avaliou a contagem de linfócitos de TCD4-/CD8+, cuja média correspondeu a 1.016 células/mL de sangue. No que se refere à presença do HPV, observou-se que 29% (31/107) das mulheres infectadas com este vírus apresentavam níveis de LTCD4+/CD8- entre 401 e 600 células/mL de sangue (Tabela 14). Por outro lado, no grupo sem HPV observou-se que 35,5% das mulheres apresentavam níveis mais baixos de LTCD4+/CD8- (entre 201 e 400 células/mL de sangue). Entretanto, não se observou relação estatística entre a infecção e os níveis de LTCD4+/CD8-. 59 Tabela 14- Distribuição dos níveis de LTCD4+/CD8- no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. ≤200 LTCD4+(células/mL) 201-400 401-600 >600 Total p* 0,2607 HPV Positivo 12 (13,6%) 22 (25,0%) 31 (35,2%) 23 (26,2%) 88 (100%) Negativo 05 (8,7%) 14 (24,1%) 17 (29,3%) 58 (100%) 22 (37,9%) * Teste G. Em relação aos resultados de citologia oncótica, 31,6% (37/134) das mulheres com citologia normal/ alteração benigna apresentaram níveis de LTCD4+/CD8- entre 401 e 600 células/mL. No grupo com alteração pré-maligna, a maioria das mulheres tinham níveis entre 200 e 600 células/mL de sangue. Não houve diferença estatística entre os resultados citológicos e os níveis de LTCD4+/CD8- (Tabela 15). Tabela 15- Distribuição dos níveis de LTCD4+/CD8- em função do resultado citológico no grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. ≤200 Citologia Normal/alteração benigna Alteração prémaligna * Teste G. LTCD4+ (células/mL) 201-400 401-600 >600 Total 12 (10,3%) 35 (29,9%) p* 0,8833 37 (31,6%) 33 (28,2%) 117 (100%) 04 (15,4%) 08 (30,8%) 08 (30,8%) 06 (23,0%) 26 (100%) No que se refere à carga viral plasmática do HIV-1, para fins de cálculo da média, considerou-se apenas os resultados acima do limite mínimo de detecção da metodologia empregada, ou seja, acima de 50 cópias de RNA/mL. Sendo assim, a média geral de carga viral foi de 32.559 cópias de RNA/mL. 60 Os níveis de carga viral plasmática do HIV-1 apresentaram distribuição semelhante tanto no grupo infectado com HPV quanto no grupo sem HPV, nos quais observou-se que a maioria das mulheres apresentaram níveis de carga viral plasmática inferior ao limite detectável (<50): 56,8% no grupo com HPV e 63,8% sem HPV (Tabela 16). Em relação aos resultados citológicos, a distribuição também foi semelhante. Não houve diferença estatística significante entre os níveis de carga viral plasmática do HIV-1 e a infecção pelo HPV e os resultados citológicos (Tabela 17). Tabela 16- Distribuição dos níveis de carga viral plasmática do HIV-1 no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. <50 Carga Viral (cópias RNA/mL) 50-10.000 10.000-100.000 >100.000 HPV Positivo 50 (56,8%) 17 (19,3%) Negativo 37 (63,8%) 13 (22,4%) * Teste G. 17 (19,3%) 07 (12,1%) 04 (4,6%) 01 (1,7%) Total p* 0,4969 88(100%) 58(100%) Tabela 17-Distribuição dos níveis de carga viral plasmática do HIV-1 em função do resultado citológico no grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE e submetidas ao PCCU, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Carga Viral (cópias RNA/mL) <50 50-10.000 10.000- >100.000 100.000 Citologia Normal/alteração 72 (61,5%) 23 (19,7%) benigna Alteração pré- 13 (50,0%) 07 (26,9%) maligna * Teste G. Total p* 0,7754 19 (16,2%) 03 (2,6%) 117 (100%) 05 (19,3%) 01 (3,8%) 26 (100%) 61 3. 5 FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS As proporções alélicas e genotípicas observadas e esperadas foram submetidas à análise de desvio das proporções, a qual evidenciou que os grupos examinados estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05). A frequência genotípica do polimorfismo no gene TNF-α (-308) observada no grupo de mulheres portadoras do HIV foi de 74% (GG), 21,9% (AG) e 4,1% (AA), sendo as frequências alélicas 80% para TNFα*G e 20% para TNFα*A. No grupo de mulheres coinfectadas com HPV, a frequência dos genótipos apresentou distribuição semelhante ao grupo de portadoras do HIV, envolvidas no presente estudo: 76,6% (GG), 18,7% (AG) e 4,7% (AA). Não houve diferença estatisticamente significante entre o grupo de mulheres infectadas somente com HIV e o grupo co-infectado. Em relação à pesquisa do polimorfismo no gene IL-10 (-1082), observou-se que as frequências genotípicas entre os grupos co-infectado HIV/HPV e o grupo só portador do HIV apresentou distribuição semelhante. Na população geral, a frequência genotípica foi de 55,6% (AA), 38,5% (AG) e 5,9% (GG), sendo as frequências alélicas 75% IL10*A e 25% IL10*G. No grupo co-infectado a frequência dos genótipos AA, AG e GG foi de 58%, 36,4% e 4,7%, respectivamente. Apesar da distribuição da frequência alélica demonstrar que o alelo G (associado à produção de altos níveis de IL-10) foi mais prevalente no grupo sem infecção pelo HPV (30%), não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos analisados. A distribuição da frequência genotípica e alélica do polimorfismo nos genes de citocinas no grupo investigado é apresentada na Tabela 18. 62 Tabela 18- Distribuição da frequência genotípica e alélica dos genes TNF-α e IL-10 do grupo de mulheres co-infectadas HPV/HIV, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Genes HIV+/HPV (+) N % HIV+/HPV (-) N G p* 1,7351 0,4200 0,3153 0,5744 1,5527 0,4601 1,4464 0,2291 % TNF-α (-308) Frequência genotípica GG AG AA Total Frequência alélica G A Total 82 20 05 76,6 18,7 4,7 43 17 02 69,4 27,4 3,2 107 100 62 100 184 30 86,0 14,0 103 21 83,0 17,0 214 100 124 100 IL-10 (-1082) Frequência genotípica AA AG GG Total Frequência alélica A G Total * Teste G. 63 39 05 58,9 36,4 4,7 31 26 05 50,0 41,9 8,1 107 100 62 100 165 49 80,0 20,0 86 36 70,0 30,0 214 100 214 100 63 No presente estudo, observou-se que o fenótipo secretor de baixos níveis de TNF-α foi mais frequente no grupo de mulheres com citologia normal/ alteração benigna (76,1%; 102/134), quando comparado ao grupo de mulheres com alteração pré-maligna (63,6%; 21/33). Entretanto, não se observou associação entre os genótipos (fenótipos secretores) e os diferentes graus de lesão intra-epitelial (Tabela 19). Tabela 19- Distribuição da frequência genotípica do TNF-a entre mulheres portadoras do HIV com citologia normal e com alterações pré-malignas, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Alteração pré-maligna TNF- α (-308) Genótipo(Fenótipo secretor) GG (Baixos níveis) AG/AA (Altos níveis) Citologia Normal/alteração benigna LGSIL1 HGSIL2 p* 0,2665 102 (76,0%) 32 (23,9%) 134 (100%) Total LGSIL: LSIL, ASCUS, AGUS, NIC I 2 HGSIL: HSIL, NIC II, NIC III e Câncer invasor * Teste G 12 (70,6%) 05 (29,4%) 09 (56,3%) 07 (43,7%) 17 (100%) 16 (100%) 1 No que se refere à pesquisa de polimorfismo no gene IL-10 (-1082), o genótipo que confere o fenótipo secretor de baixos níveis de IL-10 apresentou distribuição semelhante no grupo de mulheres com ou sem alteração citológica pré-maligna (Tabela 21). O genótipo GG (produtor de altos níveis de IL-10) foi mais frequente nas mulheres que não apresentaram alterações pré-malignas, no entanto não houve associação entre o fenótipo secretor e as alterações celulares observadas nos grupos examinados. 64 Tabela 20- Distribuição da frequência genotípica do IL-10 entre mulheres portadoras do HIV com citologia normal e com alterações pré-malignas, atendidas na UREDIPE, no período de abril de 2010 a dezembro de 2012. Alteração pré-maligna IL-10 (-1082) Genótipo (Fenótipo secretor) AG/AA (Baixos níveis) GG (Altos níveis) Citologia Normal/alteração benigna LGSIL1 HGSIL2 0,2665 125 (93,3%) 09 (6,7%) 16 (94,1%) 01 (5,9%) 16 (100%) - 134 (100%) Total LGSIL: LSIL, ASCUS, AGUS, NIC I 2 HGSIL: HSIL, NIC II, NIC III e Câncer invasor * Teste G. 17 (100%) 16 (100%) 1 p* 65 4. DISCUSSÃO No Brasil, de acordo com dados do INCA (2011), o câncer de colo do útero é o segundo tipo de câncer mais incidente entre as mulheres da região Norte do país, com um risco estimado em 17 casos para cada 100 mil mulheres. Muitos estudos têm demonstrado que a infecção pelo HPV de alto risco oncogênico, em especial HPV-16 e 18, esta estritamente relacionada com o desenvolvimento de câncer de colo do útero, com maior chance de desenvolvimento em portadoras do HIV (Bosch et al, 2002). Desde a década de 1998, o Ministério da Saúde Brasileiro instituiu no Sistema Único de Saúde (SUS), o exame citopatológico de prevenção do câncer de colo do útero (PCCU) como estratégia de rastreamento e detecção precoce dos casos, sendo recomendado para mulheres com idade entre 25 e 59 anos. Entretanto, o PCCU não é um exame eficaz na detecção do HPV, uma vez que ele descreve alterações citológicas sugestivas e não patognomônicas da infecção pelo vírus. Sendo assim, as técnicas de biologia molecular constituem ferramentas alternativas e valiosas para detecção precoce e genotipagem do HPV (Brasil, 2012). Dentre o grupo de mulheres infectadas com o HPV, no presente estudo, a média de idade foi de 36 anos. A análise por faixa etária indicou um predomínio da infecção em mulheres em idade reprodutiva, sendo observada tendência à redução da prevalência à medida que a idade aumentava. Dados similares também foram descritos na cidade do Rio de Janeiro (Grinsztejn et al., 2009), no Rio Grande do Sul (Entiauspe et al., 2010) e em Minas Gerais (Corrêa et al., 2011). De acordo com trabalhos descritos na literatura, a infecção pelo HPV ocorre nos dois primeiros anos consecutivos ao inicio da atividade sexual, já que a incidência da infecção têm se mostrado maior em mulheres com idade inferior a 25 anos (Moscicki, 2007; Rama et al., 2008). No presente estudo, sugere-se que a redução na prevalência da infecção no grupo de mulheres com idade superior a 39 anos, seja decorrente da aquisição do matrimônio e, consequente redução no número de parceiros e menor exposição à infecção pelo HPV. Vários fatores epidemiológicos e de saúde reprodutiva têm sido relacionados ao desenvolvimento de câncer de colo do útero, incluindo o HPV, o tabagismo, predisposição genética, número de parceiros sexuais, idade de início da atividade sexual, paridade, abortos e idade de menarca (Brasil, 2012). No que se refere à infecção pelo HPV, à exceção da imunodepressão provocada pelo HIV, a literatura é controversa ao estabelecer os fatores de 66 risco para aquisição da infecção. Nesta pesquisa, a infecção pelo HPV mostrou uma associação com as variáveis independentes: uso irregular de preservativo durante as relações sexuais; múltiplos parceiros sexuais e história de IST. Não houve associação entre a infecção e as demais variáveis envolvidas no estudo. No presente estudo, acredita-se que mesmo o uso regular de preservativo não confira proteção total contra infecção por microrganismo, uma vez que este não promove cobertura total do aparelho reprodutor masculino, deixando que áreas que possam abrigar partículas infecciosas ou lesões subclínicas, no caso do HPV, fiquem expostas durante a atividade sexual. A ocorrência de múltiplos parceiros sexuais é referida como importante fator de risco para a aquisição do HPV, já que quanto maior o número de parceiros maior é a exposição à aquisição da infecção tanto pelo HPV como para outras IST. É sabido que o sistema imunológico inato envolve muitos mecanismos de proteção do tecido vaginal contra a infecção por patógenos ao passo que também garante a sobrevivência da microbiota normal vaginal, a qual constitui um fator importante na produção do ácido lático e peróxido de hidrogênio, inibindo o crescimento de patógenos. A aquisição de IST promove desequilíbrio na microbiota vaginal, alteração de pH, podendo ainda ocasionar lesões no epitélio de revestimento do colo uterino e parede vaginal. Essas alterações podem contribuir para o desenvolvimento de inflamação e a penetração de patógenos, entre eles o HPV. Além da associação observada entre a história pregressa de IST e a infecção pelo HPV, no presente estudo, observou-se que muitas mulheres apresentaram quadros compatíveis de vaginose bacteriana, candidíase e tricomoníase. Sugere-se que o estabelecimento dessas infecções possa estar contribuindo para a aquisição e instalação do HPV. Dados semelhantes foram reportados por Grinsztejn e colaboradores (2009), no qual a análise das variáveis epidemiológicas de mulheres portadoras do HIV-1 no Rio de Janeiro mostrou associação estatisticamente significante entre a infecção pelo HPV, o uso de preservativos e o número de parceiros sexuais no último ano, além do estado conjugal, uso de drogas, idade precoce da atividade sexual e contagem de LTCD4+. Entretanto, esses dados divergem dos achados de Gonçalves e colaboradores (2008), onde a idade foi a única variável associada à infecção pelo HPV em amostras anogenitais de portadoras do HIV. Estudos envolvendo a população geral na região Norte do Brasil, observaram associações epidemiológicas divergentes entre os grupos populacionais examinados. Na Amazônia Oriental Brasileira, observou-se forte associação da infecção pelo HPV, o estado 67 conjugal, uso de preservativos e número de parceiros sexuais na vida e número de parceiros novos no ultimo ano (Pinto et al., 2011). A associação entre a infecção pelo HPV e a faixa etária, foi descrita em mulheres da população geral e carcerárias da região Metropolitana de Belém (Plácido, 2012) e em mulheres do município de Tomé-Açu (Prazeres, 2011). A prevalência global da infecção pelo HPV em mulheres portadoras do HIV-1, investigada no presente estudo, foi de 63,3%, semelhante ao encontrado por Gonçalves et al. (2008) em amostras anogenitais (63,7%) de mulheres portadoras do HIV na cidade de São Paulo, porém, menor do que a encontrada em outro estudo realizado em São Paulo (80%; Levi et al., 2004) e em amostras cervicais de 38 mulheres portadoras do HIV no Rio Grande do Sul (76,3%; Entiauspe et al., 2010), demonstrando que a incidência da infecção pelo HPV é alta na população de mulheres portadoras do HIV. Por outro lado, a taxa de prevalência estimada no presente estudo mostrou-se superior às taxas identificadas em pesquisas envolvendo mulheres da população em geral na região Norte do país. Estudo envolvendo 144 mulheres atendidas no Laboratório de Citopatologia do Hospital Amazônia de Quatro Bocas, no município de Tomé-Açú, Pará, a prevalência da infecção foi de 6,9% (Prazeres, 2011). Na cidade de Belém, Noronha e colaboradores (2011) detectaram o vírus em 12,4% das mulheres submetidas ao PCCU e atendidas na Unidade Materno-Infantil, do Centro de Ciências Biológicas, da Universidade Estadual do Pará (UMI-UEPA). Na Amazônia oriental brasileira, a taxa estimada correspondeu a 14,6% da população investigada (Pinto et al., 2011). A diferença entre as taxas de prevalência do HPV observada no presente estudo e as taxas observadas na população geral pode ser justificada pelas diferentes metodologias para detecção do HPV aplicadas nas pesquisas. No presente estudo, a metodologia aplicada envolveu a técnica Nested-PCR, a qual se mostra mais sensível na detecção do genoma do HPV em amostras com baixo número de cópias do genoma viral. Além do mais, as divergências também podem decorrer da fraca resposta imunológica e pela redução no número de células de Langerhans no local da infecção, ambas decorrentes da imunossupressão promovida pelo HIV (Zimmermmann et al., 2006). Além disso, é importante ressaltar No presente estudo observou-se que 72,3% das infecções de HPV eram causadas por genótipo de alto risco oncogênico. O HPV-16 foi o de maior prevalência (40,4%;19/47) detectada, seguido do HPV-52 (12,8%; 6/47) e HPV-84 (8,5%; 4/47). Esses dados são semelhantes aos encontrados em estudos realizados em outras localidades do país, nos quais o 68 HPV-16 é referido como genótipo de maior prevalência, tanto em mulheres portadoras e não portadoras do HIV (Levi et al., 2004; Gonçalves et al., 2006; Zimmermmann et al., 2008; Mattos et al., 2011). Entretanto, esses achados divergem dos resultados observados em estudo conduzido em mulheres portadoras do HIV, atendidas no Hospital do Rio de Janeiro, no qual a prevalência global do HPV foi de 48%, sendo o HPV-68 o de maior prevalência (47%), seguido do HPV-58 e HPV-39 com taxas de prevalência em torno de 41% e 24%, respectivamente (Grinsztejn et al., 2009). No estado de Minas Gerais, um estudo analisando portadoras do HIV identificou genótipos de alto risco em 70,5% do material examinado, sendo o HPV-6 o de maior prevalência (63,9%; Corrêa et al., 2011). Isto demonstra que o genótipo de alto risco oncogênico mais prevalente varia de acordo com a região ou a população estudada. As diferentes taxas de prevalência da infecção por genótipos de alto risco descrita na população de portadores do HIV podem ser decorrentes das diferentes metodologias de detecção e genotipagem aplicadas nos referidos estudos. A PCR e o sequenciamento automático são referidos na literatura como as técnicas mais eficientes na detecção e genotipagem do HPV, respectivamente. Entretanto, em pacientes com infecções por múltiplos genótipos, como no caso de imunodeprimidos, o sequenciamento não oferece êxito na genotipagem do HPV, sendo recomendado o emprego de outras técnicas de genotipagem alternativas, tais como a Captura Híbrida, Aplicação de enzimas de restrição tipo-específicas ou PCR em tempo real. No presente estudo, utilizou-se kit comercial LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test, e esta metodologia só permitiu a genotipagem, aproximadamente, de 50% das amostras positivas no PCR, sendo assim, não se pode descartar a possibilidade de que a prevalência de alguns tipos de alto risco oncogênico esteja subestimada. A imunossupressão causada pelo HIV parece favorecer a infecção por múltiplos genótipos de HPV, os quais, se forem oncogênicos, podem contribuir para a progressão das lesões intra-epiteliais em neoplasias cervicais. De acordo com Luque e colaboradores (2006) a presença de múltiplos genótipos de HPV em portadoras do HIV, seria um mau indicador de prognóstico nos casos de neoplasia intra-epitelial cervical. Neste estudo, observou-se 49% (23/47) das mulheres apresentavam infecções por múltiplos genótipos e, destas 39,1% apresentavam infecções por mais de um genótipo de alto risco. A infecção por múltiplos genótipos também foi relatada por Gonçalves e colaboradores (2008), na cidade de São Paulo (41,27%); e por Zimmermmann e 69 colaboradores, em Minas Gerais (63,23%). Em estudo conduzido em Minas Gerais, Campos e colaboradores (2005) constatou que a infecção por múltiplos genótipos de HPV no grupo de portadoras do HIV foi de 50%, enquanto que no grupo sem HIV a infecção múltipla foi observada em 32,4%. Na cidade de Belém, Pará, mulheres negativas para o HIV, apresentaram baixa taxa de prevalência (5,7%) por múltiplos genótipos de HPV (Noronha et al., 2011). As altas taxas de infecções por múltiplos genótipos observadas no presente estudo podem ser decorrentes da maior exposição dessas mulheres a práticas sexuais desprotegidas, acrescido ainda da falha do sistema imunológico no reconhecimento de mais tipos de HPV. Estudos têm demonstrado que a prevalência de lesão e neoplasia intra-epitelial cervical é mais alta em mulheres portadoras do HIV quando comparadas à mulheres da população em geral (Minkoff et al., 1998; Levi et al., 2002; Smits et al., 2005; Ng’andwe et al., 2007). Acredita-se que a infecção pelo HIV altere a história natural da infecção pelo HPV, favorecendo uma maior persistência viral do HPV, redução nas taxas de regressão da lesão e, consequentemente a progressão para lesões intra-epiteliais de alto grau ou invasivas (Joshi et al., 2005; Palefsky, 2006). No presente estudo, 79,3% das mulheres analisadas apresentavam esfregaço normal/ inflamatório, enquanto que a prevalência de alterações pré-malignas correspondeu a 19,5%. O HPV foi detectado em 61,2% dos esfregaços com citologia normal/ inflamatório (82/134), em 76,5% (10/13) dos casos de LSIL e 66,7% (10/15) dos casos de HSIL. Esses resultados são semelhantes aos encontrados em estudo envolvendo mulheres com HIV, na cidade de São Paulo, no qual 82% dos esfregaços examinados foram classificados como normal ou inflamatório e 18% como lesão intra-epitelial pré-maligna (Levi et al., 2004). No Rio Grande do Sul, detectou-se o HPV em 60,7% dos casos de citologia normal/inflamatório, em 90% dos casos de LSIL e 100% nos de HSIL (Entiauspe et al., 2010). A maioria das infecções pelo HPV são clinicamente inaparentes ou assintomáticas em indivíduos imunocompetentes. No Rio de Janeiro, a análise de esfregaços cervicais revelou que 68,3% das mulheres infectadas pelo HPV não apresentavam nenhum tipo de alteração citológica/lesão cervical e a infecção por múltiplos genótipos só foi observada em 8,9% dos casos, sendo o HPV-16 o genótipo de maior prevalência, detectada em 28% dos espécimes (Oliveira-Silva et al., 2011). Já em mulheres da população geral no estado do Amazonas, a infecção pelo HPV foi constatada em 97,9% das mulheres com citologia normal, no qual o HPV-16 também foi destacado como o genótipo de maior prevalência (Rocha et al., 2013). 70 Estudos sugerem que a persistência da infecção pelo HPV seja inversamente proporcional ao número de LTCD4+ e diretamente proporcional à carga viral do HIV, podendo ainda sofrer influencia da TARV (Palefsky et al., 2006, Jalil et al., 2009; Ogoina et al., 2013) No presente estudo, não se observou associação entre os marcadores da infecção pelo HIV e a infecção pelo HPV e, tão pouco entre os diferentes graus de lesão intra-epitelial. Observou-se que 75,7% das infectadas com HPV estavam sob TARV; 86,4% apresentaram níveis de LTCD4+ superior a 200 células/ml e 56,8% exibiram níveis de carga viral abaixo do valor de detecção mínimo do teste empregado (50 cópias de RNA/mL). Esses dados corroboram com outros estudos envolvendo portadoras do HIV no sudeste brasileiro. Côrrea e colaboradores (2011) em estudo conduzido em Minas Gerais, observaram que 75 % das mulheres examinadas apresentavam níveis de LTCD4+ e carga viral superiores a 200 e 400 cópias/ml de sangue, respectivamente. Na cidade do Rio de Janeiro, 46,8% das participantes da pesquisa estavam sob TARV e, aproximadamente, 75% apresentavam níveis de LTCD4+ acima de 200 células/ml de sangue, não sendo evidenciada associação entre as variáveis e a infecção pelo HPV (Grinsztejn et al., 2009). Sendo assim, sugere-se que a TARV esteja sendo eficaz na manutenção de baixos níveis de replicação do HIV, evitando depleção brusca nos níveis de LTCD4+. Entretanto, o efeito da TARV na persistência da infecção pelo HPV ainda não foi caracterizado na literatura, devido à ausência de estudos nesse sentido. A presença da infecção por tipos de HPV de alto risco oncogênico é referida como fator mais importante na transformação celular. Entretanto, alguns estudos têm sugerido o envolvimento de determinados polimorfismos genéticos no desenvolvimento de neoplasias cérvico-uterinas, dentre eles destaca-se a ocorrência de polimorfismos na região promotora dos genes TNF-α, IFN-γ, IL-6 e IL-10. Em relação à população portadora do HIV, há poucos estudos envolvendo a associação desses polimorfismos e a persistência da infecção pelo HPV na progressão das lesões intra-epiteliais. No grupo de mulheres co-infectadas HIV/HPV, envolvidas no presente estudo, a investigação do polimorfismo G-308A TNF-α revelou que o genótipo GG (produtor de baixos níveis desta citocina) foi o mais frequente (76,6%), seguido do AG (18,7%) e AA (4,7%). A distribuição dos genótipos em relação ao resultado citológico indicou maior frequência do genótipo GG tanto no grupo com citologia normal/alteração benigna quanto no grupo com alteração pré-malgina. No que se refere ao grupo com lesões pré-malginas, observou-se que o 71 alelo A foi mais frequente no grupo de mulheres com HSIL (43,7%), porém não foi observada associação entre o polimorfismo e o grau de lesão intra-epitelial. A baixa frequência do genótipo AA (produtor de altos níveis) também foi reportada por Duarte e colaboradores (2005), em Portugal, sendo este genótipo mais frequente em pacientes com carcinoma invasivo do que no grupo controle e associado ao aumento do risco de desenvolvimento de carcinoma. No estudo conduzido na cidade de Porto Alegre (Rio Grande do Sul), a frequência genotípica de AA (35,7%) mostrou-se superior à encontrada no presente estudo, além de referir associação significante entre a presença deste alelo e os diferentes graus de lesão intraepitelial (Igansi, 2009). Entretanto, outros estudos correlacionando os diferentes níveis de produção desta citocina, não observaram diferenças estatísticas em grupos de mulheres saudáveis e com câncer (Stanczuk et al., 2003;Govan et al., 2006). Estudo avaliando a relação entre o polimorfismo A-1082G IL-10 e as variações nos níveis de IL-10 sugere que o genótipo GG esteja relacionado à alta produção desta citocina em pacientes com câncer cérvico-uterino (Turner et al., 1997). No presente estudo, a pesquisa de polimorfismo na região promotora A-1082G IL-10 demonstrou que o alelo A foi o mais frequente (80% e 70%, respectivamente) tanto no grupo infectado com HPV quanto no grupo sem HPV. A distribuição dos genótipos em função do resultado citológico revelou que não houve associação estatística significante entre os genótipos e os diferentes graus de lesão intra-epitelial, tendo em vista que o genótipo secretor de baixos níveis de IL-10 foi o mais frequente em todos os tipos de alteração citológica, apesar de que o presente estudo não realizou a quantificação sérica destas citocinas. A distribuição uniforme do alelo -1082*A IL-10 também foi reportada por Barbisan e colaboradores (2012), não sendo observada associação estatística significante entre a presença do polimorfismo e o desenvolvimento de câncer cervical. Dados discordantes foram reportados por Igansi (2009), na cidade de Porto Alegre, onde a frequência do alelo G correspondeu a 53%, sendo o genótipo AG observado em 49% dos casos. Estudos demonstram que as frequências alélicas e genotípicas destes polimorfismos apresentam distribuições diferentes de acordo com a etnia e grupos populacionais estudados. No estado de Louisiana (EUA), estudo avaliou os polimorfismos de G-308A TNF-α e A1082G IL-10 em indivíduos saudáveis, recém-nascidos, de dois grupos étnicos, africanos/americanos e caucasoides, e constatou diferença significante entre os dois grupos 72 étnicos, sendo as frequências dos polimorfismos -308*A TNF-α e -1082*G IL-10 mais elevada no grupo caucasoides e africanos/americanos, respectivamente (Zabaleta et al., 2008). Ding e colaboradores (2012) observaram associação entre o polimorfismo de -308*A TNF-α e o desenvolvimento de câncer do colo do útero apenas em indivíduos asiáticos e caucasoides, não sendo observada esta associação entre africanos. Sendo assim, sugere-se que as diferentes frequências alélicas descritas no presente estudo podem ser decorrentes do processo de miscigenação observado na população amazônica, uma vez que Santos e colaboradores (1999) ao analisar a contribuição indígena nesta população demonstrou que em mulheres da área urbana de Belém, a contribuição genética desta etnia é estimada em torno de 50%. Além das diferenças étnicas e populacionais, as diferentes frequências alélicas e genotípicas podem estar relacionadas ao tamanho amostral e à metodologia aplicada nos diferentes estudos. Os dados obtidos no presente estudo e os descritos na literatura reforçam a ideia de que a influência dos polimorfismos genéticos nos diferentes graus de lesão intra-epitelial e na infecção pelo HPV ainda é controversa. Sendo assim, faz-se necessário a realização de estudos adicionais, investigando a relação desses polimorfismos em grupos restritos a mulheres em diferentes graus de lesão e a sua correlação com o desenvolvimento de câncer do colo uterino. 73 5. CONCLUSÕES A caracterização do perfil epidemiológico da população envolvida no presente estudo evidenciou que a maioria das mulheres era casada ou vivia em relação de união estável, possuía baixo nível de escolaridade, não eram etilistas e nem usuárias de drogas. Assim como, também havia iniciado a atividade sexual antes dos 20 anos de idade, era sexualmente ativas, usava preservativos durantes as práticas sexuais e tinha história pregressa de IST. A prevalência da infecção pelo HPV no grupo de mulheres portadoras do HIV, atendidas na UREDIPE, mostrou-se elevada quando comparada às taxas descritas na população feminina geral, porém semelhante às taxas reportadas no grupo de mulheres brasileiras portadoras de HIV, sendo a infecção pelo HPV predominante nas mulheres solteiras, em idade reprodutiva e com baixo nível de escolaridade. Observou-se associação significante entre a infecção pelo HPV e as variáveis independentes: uso de preservativo, número de parceiros sexuais no ultimo ano e história pregressa de IST. Entretanto, não foi observada associação estatística entre o resultado citológico e a infecção pelo HPV. Os tipos de HPV caracterizados no presente estudo eram em sua maioria de alto risco oncogênico, sendo o HPV-16 o tipo mais frequente, corroborando com a prevalência descrita nas diferentes regiões brasileiras, independente da presença do HIV-1 nos grupos examinados. A ocorrência de infecções por múltiplos genótipos de HPV em 50% das mulheres infectadas pelo HIV, envolvidas no presente estudo, reforça a ideia de que o HIV-1 promove depressão no sistema imunológico, favorecendo a aquisição da infecção por tipos diferentes de HPV, bem como a reativação ou persistência da infecção. Os marcadores prognósticos da infecção pelo HIV (carga viral e níveis de LTCD4+) não mostraram associação com a infecção pelo HPV, e tão pouco com o resultado da citologia oncótica, sugerindo que a resposta imunológica contra a infecção pelo HPV é predominantemente local. A investigação de polimorfismos evidenciou que alelo selvagem -308*G TNF- α e -1082*A IL-10 foram os mais frequentes no grupo examinado. No grupo co-infectado HIV/HPV as frequências genotípicas observadas para o polimorfismo no TNF-α foram: 76,6% (GG), 18,7% (AG) e 4,7% (AA). Já em relação ao polimorfismo no IL-10 as frequências 74 genotípicas foram: 58,9% (AA), 36,4% (AG) e 4,7% (GG). Não foi observada associação estatística entre os polimorfismos investigados, a infecção pelo HPV e o resultado citológico. 75 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; POBER, J.S. Imunologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Revinter; 2008. 486p. ALAMARTINE, E.; BERTHOUX P.; MARIAT, C.; CAMBAZARD, F.; BERTHOUX, F. Interleukin-10 promoter polymorphisms and susceptibility to skin squamous cell carcinoma after renal transplantation. Journal of Investigate Dermatology, 120: 99-103, 2003. ARANY I, GRATTENDICK KG, TYRING SK. Interleukin 10 induces transcription of the early promoter of human papillomavirus type 16(HPV16) through the 5’- segment of the upstream regulatory region (URR). Antiviral Research, 55: 331-9, 2002. ARAUJO, A.C.L.;, MELO, V.H., CASTRO, L.P.F.; GUIMARÃES, M.D.C.; ALEIXO, A.W.; SILVA, M.L. Associação entre a carga viral e os linfócitos T CD$+ com as lesões intra-epiteliais do colo uterino em mulheres infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana. 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Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetricia, 28 (6): 345-351, 2006. 92 APÊNDICE I TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Título da pesquisa: PREVALÊNCIA E EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) IDENTIFICADO EM ESPÉCIME CERVICAL E ANAL DE PORTADORAS DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) ATENDIDAS EM BELÉM, PARÁ. Instituições envolvidas: Universidade Federal do Pará (UFPA), Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB), Unidade de Referência Especializada em Doenças Infecciosas e Parasitárias Especiais (URE DIPE) e Laboratório de Virologia (UFPA). Esclarecimento da Pesquisa: A pesquisa sobre prevalência e epidemiologia molecular do papilomavírus humano (HPV) identificado em espécime anal e cervical de portadoras do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) de Belém, Pará, desenvolvida com apoio do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da UFPA, tem como objetivo descobrir a prevalência da infecção anal e cervical pelo HPV em mulheres portadoras do HIV-1 atendidas no HUJBB e URE DIPE de Belém, Pará; descrever os tipos de HPV mais frequentes na população examinada e associar os principais fatores de risco para às infecções (anal e cervical) de acordo com a análise das informações obtidas do questionário epidemiológico da participante. Essa pesquisa não oferece riscos às integrantes, pois a coleta dos espécimes será feita por profissional experiente e, além do mais serão utilizados materiais esterilizados descartáveis, como luvas, máscaras e swabs de rayon. Todas as mulheres serão alertadas acerca do objetivo do estudo, quanto o uso de suas amostras e uso das informações epidemiológicas e do prontuário. E, caso alguma paciente não concorde ou desista de participar, esta será automaticamente excluída do trabalho. Não será cobrado, nem será fornecida remuneração em dinheiro ou outra vantagem financeira pela participação neste estudo. Os resultados da pesquisa podem possibilitar um melhor entendimento sobre a prevalência da infecção anal e cervical pelo HPV. A sua participação será de livre e espontânea vontade e informamos também que sua privacidade será assegurada e que você tem plena liberdade de interromper a sua participação no trabalho a qualquer momento, sem qualquer tipo de penalização ou prejuízo. ________________________________________________ Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado (Pesquisador responsável) Biomédico e Professor Adjunto da Universidade Federal do Pará. 93 CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa “PREVALÊNCIA E EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) IDENTIFICADO EM ESPÉCIME CERVICAL E ANAL DE PORTADORAS DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1) ATENDIDAS EM BELÉM, PARÁ” e que me sinto perfeitamente esclarecida acerca do conteúdo da mesma, assim como seus riscos e benefícios. Declaro ainda que, por minha livre vontade, autorizo o uso da minha amostra de swab anal e esfregaço cervical, bem como das informações de meu questionário epidemiológico e meu prontuário, os quais só poderão ser utilizados em relatórios e publicações científicas, desde que sejam respeitadas todas as disposições citadas. Belém, ____ / ______ / _____ ________________________________ Assinatura da participante Nome: ________________________________________________________________ Endereço: _____________________________________________________________ Telefone: ______________________________________________________________ Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Virologia, Fone: (91) 3201-8410 e-mail: [email protected] 94 APÊNDICE II UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS LABORATÓRIO DE VIROLOGIA PROTOCOLO (LABORATÓRIO DE VIROLOGIA): DATA DA COLETA:___/___/___ QUESTIONÁRIO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO Nome: Idade: Naturalidade: Profissão/ocupação: Data de nascimento: ___/______/_____ Estado conjugal: ( ) casada/união estável ( ) solteira ( ) sem informação ( ) divorciada ( ) viúva Escolaridade: ( ) analfabeto ( ) 2º grau completo ( ) 1º grau incompleto ( ) 3º grau incompleto ( ) 1º grau completo ( ) 3º grau completo ( ) 2º grau incompleto ( ) sem informação Fumante: ( ) sim ( ) não ( ) não se aplica ( ) sem informação Uso de bebida álcoolica: ( ) sim ( ) não se aplica ( ) não ( ) sem informação Uso de droga endovenosa: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Qual:__________________________ Histórico familiar de câncer: ( ) sim ( ) não Qual:______________________ Já teve ou tem câncer: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação ( ) sem informação COMPORTAMENTO SEXUAL Opção sexual: ( ) heterossexual ( ) homossexual ( ) bissexual ( ) sem informação Início da vida sexual: ( ) 10-15 anos ( ) 16-20 anos ( ) 21-25 anos ( ) > 25 anos Tem vida sexualmente ativa: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Atualmente, tem parceiro fixo: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação 95 Múltiplos parceiros: ( ) sim (> 5 parceiros) ( ) não ( ) sem informação Nº de parceiro no último ano:__________ Usa preservativo em todas às relações sexuais: ( ) sim ( ) não/às vezes Prática do sexo anal: ( ) sim/poucas vezes ( ) não Usa prevervativo durante o sexo anal: ( ) sim ( ) não Frequência do sexo anal:______vezes/mês Já teve alguma IST: ( ) sim ( ) não Qual:__________________ ( ) sem informação Histórico de lesão benigna anal: ( ) fístula ( ) fissura ( ) abcesso ( ) sem informação Histórico de verruga anal: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Histórico de verruga genital: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação ( ) sem informação ( ) sem informação ( ) sem informação ( ) hemorróida SINTOMATOLOGIA ANAL Verruga(s) anal(is): ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Verruga(s) genital(is): ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Parceiros com sintomas: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Qual:______________________________ LTCD4+ E CARGA VIRAL Terapia antiretroviral: ( ) sim ( ) não ( ) sem informação Linfócito T CD4+:_____________________células/µl ( ) prontuário ( ) laboratório de virologia Carga Viral:_________________________cópias/ml ( ) prontuário ( ) laboratório de virologia Observações:_________________________________________________ Responsável pela coleta/ entrevista:__________________/_________________ 96 ANEXO I 97 ANEXO II