Suzana Alves da Silva - ICES

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA
Programa de Pós-Graduação em Medicina – Cardiologia
Transplante Autólogo de Células
Mononucleares da Medula Óssea para Pacientes
com Cardiomiopatia Isquêmica Crônica:
Correlação do Fenótipo Celular com a Evolução
Clínica.
Suzana Alves da Silva
Orientadores:
Prof. Dr. Aristarco G. Siqueira Filho
Prof. Dr. Radovan Borojevic
Prof. Dr. Hans Jürgen Fernando Dohmann
Rio de Janeiro, RJ
2006
Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula
Óssea para Pacientes com Cardiomiopatia Isquêmica Crônica:
Correlação do Fenótipo Celular com a Evolução Clínica.
Suzana Alves da Silva
Orientadores:
Prof. Dr. Aristarco G. Siqueira Filho
Prof. Dr. Radovan Borojevic
Prof. Dr. Hans Jürgen Fernando Dohmann
Dissertação de mestrado submetida ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação em
Medicina, área de concentração em Cardiologia, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre em
Cardiologia.
Aprovada em ___ de __________de_____ .
Banca Examinadora:
__________________________________________________________________
Prof. Sergio Salles Xavier
__________________________________________________________________
Profa. Maria Isabel Doria Rossi
__________________________________________________________________
Prof. Cantídio Drumond Neto
Rio de Janeiro, RJ
Março, 2006
SILVA, Suzana A.
Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula Óssea para Pacientes com
Cardiomiopatia Isquêmica Crônica: Correlação do Fenótipo Celular com as Variáveis Clínicas
Analisadas / Suzana Alves da Silva. Rio de Janeiro, UFRJ, Faculdade de Medicina, 2006.
xiii, 132 p., il.
2006.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina,
1.Terapia Celular 2.Células-Tronco 3.Angiogênese Fisiológica 4.Insuficiência Cardíaca
Congestiva 5.Isquemia Miocárdica 6.Cardiologia – Tese. I. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina. II. Título
iv
A aqueles que lutam pela
construção de uma sociedade mais
ética e justa para todos.
v
Agradecimentos
Chegamos ao final de mais uma longa jornada. Uma luta que se iniciou lá no
jardim de infância e que resultou numa graduação em um curso de medicina. Muitas
pessoas foram importantes e decisivas nesta caminhada. O apoio da minha família, o
exemplo de vida dos meus pais, o carinho dos meus avós, meus irmãos Marcelo e
Rosane, primos e tios me ajudaram a construir toda uma história. Ensinaram-me a
compartilhar os mais belos sentimentos.
Também existe um espaço para você, aqui, meu Amor! Obrigada André, pelo
carinho, compreensão e apoio!
Algumas outras pessoas também foram muito especiais. Para todas estas pessoas
eu deixo aqui a minha gratidão. Dentre elas eu destaco o Prof. Rogério José dos Santos
Reis. Foi quem me ensinou os primeiros passos dentro do campo apaixonante da
cardiologia. Seu espírito crítico, inovador, sua paixão pelo conhecimento e pelo bem ao
próximo despertaram em mim a curiosidade pela pesquisa clínica. O desejo não só pela
cardiologia, mas também pelo desenvolvimento do conhecimento científico, e por
atravessar os limites da ciência surgiram ali. Foram nas discussões clínicas, nos
atendimentos ambulatoriais e de enfermaria cuidadosamente supervisionados por ele,
nas discussões clínicas pelos corredores do Hospital Gafrée-Guinle, que o surgimento
de diferentes idéias, capazes de responder questionamentos clínicos até então sem
resposta, era instigado. Rogério foi e é muito mais que um mestre. Além de um grande
mestre, um grande amigo.
A minha grande amiga Dra Adna do Nascimento Lima, companheira de vida.
Dr. Marcello Bittencourt, Dr. Luis Eduardo Drumond e Dr. Gustavo Gouveia,
foram os principais responsáveis por minha decisão de fazer a residência em cardiologia
na Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro. A invejável competência profissional
deles foi fundamental naquela que eu considero uma das melhores escolhas da minha
vida.
Ao longo desta jornada conheci outras pessoas maravilhosas, motivadoras.
Dentre elas não poderia deixar de destacar o Prof. Dr. Cantídio Drumond Neto, por
quem tenho enorme admiração. Chefe da Sexta enfermaria de Cardiologia da Santa
Casa de Misericóridia do Rio de Janeiro, assessorado pela Dra Lílian Soares da Costa e
pelo Dr. Marcelo Montera, sempre exigiu de seus residentes nada mais, nada menos,
que a excelência. Sempre ofereceu carinho, motivação, apoio e reconhecimento.
Sentimentos de um Mestre, quase um Pai, compartilhados com todos os que estão a sua
volta. A filosofia de sua enfermaria de cardiologia, de incentivo a pesquisa e raciocínio
clínico perspicaz, sempre me motivou a buscar o que havia além da aparência dos fatos.
Ao Dr. Marcelo Montera e ao Dr. Fernando Oswaldo Dias Rangel,
coordenadores da Residência em cardiologia da Sexta enfermaria da Santa Casa de
Misericóridia do Rio de Janeiro / Hospital Pró-Cardíaco, cuja postura de Mestres
exigentes, perfeccionistas, exigiu de todos que se formaram por esta residência, um
raciocínio crítico fundamentado em conhecimento amplo e profundo.
vi
À Dra. Helena Cramer, pelo companheirismo e espírito crítico. É uma amiga que
eu admiro muito.
À Dra. Andréa Dornelles e à Dra. Mônica Mathias, que foram minhas “R3”
durante a residência em Cardiologia na Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro.
Representam para mim o verdadeiro exemplo de motivação, garra e enorme capacidade
de luta para modificar a realidade, muitas vezes cruel. São exemplos de amizade,
generosidade, humanidade, perseverança e vontade de vencer.
Não poderia deixar de aproveitar esta oportunidade para destacar minha enorme
gratidão ao Dr. Hans Fernando Dohmann. Foi quem abriu espaço para a residência em
cardiologia no Hospital Pró-Cardíaco; foi quem criou, idealizou e consagrou o Projeto
Célula Tronco. Foi quem, certo e belo dia, durante a residência em cardiologia no
Hospital Pró-Cardíaco, olhou para mim e me deu uma chance. Trouxe para mim a
oportunidade de trabalhar com a pesquisa em todas as suas fases; trouxe para o Estado
do Rio de Janeiro a demonstração de que a parceria público-privada é possível e pode
resultar em um ganho enorme, não somente para os profissionais de saúde, mas também
para toda a população. Ele simboliza uma mistura de sonho, fantasia, inovação, escolha,
esperança, motivação, vontade, obstinação, convicção, teimosia, respeito, alegria,
confiança, amizade, suporte, sensibilidade, inteligência, sabedoria e experiência,
sentimentos e qualidades que me fizeram acreditar, lutar e vencer. Não tenho palavras
para expressar o quanto o admiro e o quanto me orgulho por fazer parte da sua equipe.
Descrever o Dr. Hans Fernando Dohmann, a dimensão da sua pessoa, está além da
minha capacidade. Minha eterna gratidão a você Hans, um ser humano admirável.
Minha gratidão também ao Dr. André Luis Silveira Sousa, pela amizade e pelo
suporte em todas as etapas da pesquisa. Foi quem, junto com toda a equipe, fez este
projeto “acontecer”. Ao Dr. Emerson Perin, Dr. James Willerson e ao Dr. Guilherme
Silva, pelo auxílio no desenvolvimento deste projeto.
À Dra. Andréa Haddad; Dr. Fabio Tuche e Dr. Rodrigo Carvalho. Obrigada por
vocês serem o que são e por representarem o que representam para mim e para a equipe.
A toda a equipe do Projeto Célula-Tronco, especialmente à Ana Cristina Reis,
que além de grande companheira e amiga, foi uma pedra angular na viabilização deste
projeto. Obrigada Aninha por seu entusiasmo, sua dedicação, sua competência e seu
profissionalismo. À Alcione Braga, que embora tenha sido admitida na equipe
posteriormente ao início deste projeto, contagiou a todos com sua ética e
profissionalismo. À Rosalia (Gonzalez Martinez de Cerqueira Joaquim...), que também
chegou depois, mas que rapidamente conquistou toda a equipe com sua ternura.
Eficiência é o seu lema! À Rita Weiler e Alessandra Borges, pela organização inicial
deste projeto e agendamento dos pacientes.
À Christine Rutterford, sempre presente e companheira, responsável pela análise
dos questionários de qualidade de vida de todos os pacientes.
À Dra. Cíntia Miguel Peixoto e Dr. Gustavo Michelstaedter Rodrigues, pela
análise dos eletrocardiogramas de todos os pacientes.
Ao Dr. Ivan Maia e sua equipe, pela realização e análise dos exames de Holter
de 24 horas e ECG-AR.
vii
À Dra. Maria Claudia, ao Dr. Roberto Magalhães, ao Dr. Ângelo Maiolino e Dr.
Edmilson, pela coleta do material de medula óssea neste estudo.
À incansável equipe do Prof. Dr. Radovan Borojevic, responsável pelo preparo
das células da medula óssea e avaliação de histopatologia: Profa. Dra. Maria Isabel
Rossi; Dr. Hamilton Junior; Dr. Hélio Dutra; Dra. Rosana Bizon e Profa. Dra. Christina
Takyia.
Ao Prof. Dr. Ronir Raggio; Prof. Dr. Antonio Cláudio da Nobrega e ao Dr.
Bernardo Tura, pelas orientações quanto à metodologia e análise estatítica desta
dissertação.
À Dra. Ellen Barroso, Dr. Mario Amar e Dr. Joaquim Coutinho, pelo
encaminhamento de vários pacientes em fila de transplante cardíaco no estado do Rio de
Janeiro, entre os quais seis foram incluídos neste protocolo de pesquisa.
Minha gratidão a todos os setores, do Hospital Pró-Cardíaco, representados por
seus chefes de serviço, secretárias, rotinas médicas e demais integrantes do corpo
clínico, pelo comprometimento com este projeto de pesquisa, que por natureza é
multidisciplinar. Destaco aqui os nomes do Dr. Luís Antonio Carvalho, Dr. Nelson
Mattos, Dr. André Feijó, Dr. Constantino Gonzáles, Dr. Carlos Henrique Eiras Falcão e,
especialmente, ao Dr. André Sousa, Dr. Rodrigo Verney Castello Branco e Dr. João
Alexandre Assad, pela análise dos resultados e pelos procedimentos de intervenção
(NOGA e angiografia); Dr. Roberto Esporcatte; Dr. Fernando Rangel; Dr. Ricardo
Mourille; Dr. Luís Antonio de Almeida Campos; Dr. Renato Vieira Gomes; Dr. Marco
Aurélio Fernandes; Dr. Pedro Nogueira; Dr. Alexandre Rouge Felippe; Dr. Antonio
Sabino; Dr. Daniel Filho e Dr. Ronaldo Veigni, pelo acompanhamento dos doentes na
fase intra-hospitalar; Dr. Luciano Belém; Dr. Arnaldo Rabischoffiski; Dr. Julio
Tolentino; Dra. Fernanda Nogueira pela análise dos ecocardiogramas de todos os
pacientes; Dr. Cláudio Tinoco Mesquita, Dr Adair, pelos exames de cintilografia; Dr.
Evandro Tinoco Mesquita; Dr. André Volschan; Dra. Mônica Araújo, pelo atendimento
dos pacientes no setor de emergência durante o seguimento do estudo; Dr. Amarino
Junior, pela realização dos exames de ressonância cardíaca; Dr. Ricardo Viváqua; Dr.
Salvador Serra e Dra. Valeria Rubin pelos exames de ergometria de todos os pacientes;
Ana, do laboratório lâmina, pela coleta dos exames laboratoriais e armazenamento de
amostras; Dra. Ângela Carrano, pela coleta do BNP.
À Enf. Solange Teitelroite; pelo profissionalismo e comprometimento com este
projeto. À Enf. Francimar Tinoco; ao Enf. Ângelo Dettogni de Oliveira; à Enf. Ana
Lúcia de Albuquerque e aos demais integrantes da equipe de enfermagem da unidade
coronariana; unidade de pós-operatório, unidade semi-intensiva, unidade de curta
permanência e emergência do Hospital Pró-Cardíaco, pelo brilhante desempenho,
fundamental, no acompanhamento intra-hospitalar dos pacientes.
Aos acionistas e diretores do Hospital Pró-Cardíaco por terem acreditado neste
projeto, no trabalho da equipe e viabilizado todas as condições necessárias ao sucesso
do mesmo.
Aos meus orientadores Prof. Dr. Radovan Borojevic; Prof. Dr. Aristarco
Siqueira e Prof. Dr. Hans Jürgen Dohmann.
viii
“It is a common sense to take a method and try it: if it fails, admit it frankly and try
another. But above all try something.”
Franklin Roosevelt
ix
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIAÇÕES...................................................................................................................... x
RESUMO .................................................................................................................................................. xi
ABSTRACT ............................................................................................................................................. xii
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS................................................................................................................ 1
1. FUNDAMENTOS............................................................................................................................... 2
1.1.
Terapia Celular .......................................................................................................................... 4
1.2.
Células-Tronco .......................................................................................................................... 5
1.3.
Células-Tronco Adultas.............................................................................................................. 6
1.4.
Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Cardiomiócitos ............................... 6
1.5.
Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Células Endoteliais......................... 7
1.6.
Fatores de Crescimento e Angiogênese....................................................................................... 8
1.7.
Doença Arterial Coronariana Aguda........................................................................................... 9
1.8.
Cardiomiopatia Isquêmica Grave.............................................................................................. 11
1.9.
Fenótipos Celulares.................................................................................................................. 13
2. HIPÓTESES ..................................................................................................................................... 15
3. OBJETIVOS PRINCIPAIS E SECUNDÁRIOS.............................................................................. 16
4. METODOLOGIA............................................................................................................................. 17
4.1.
Desenho do estudo ................................................................................................................... 17
4.2.
Alocação/Avaliação/Acompanhamento dos pacientes ............................................................... 17
4.3.
Critérios de Inclusão ................................................................................................................ 17
4.4.
Critérios de Exclusão ............................................................................................................... 18
4.5.
Eventos Adversos..................................................................................................................... 18
4.5.1.
Eventos adversos maiores.................................................................................................... 18
4.5.2.
Eventos adversos menores ................................................................................................... 19
4.5.3.
Efeitos adversos maiores e menores relacionados aos outros procedimentos que compõem
este protocolo ..................................................................................................................................... 19
4.6.
Fase de Seleção........................................................................................................................ 19
4.7.
Fase de Tratamento .................................................................................................................. 20
4.7.1.
Mielograma – Punção da Medula Óssea ............................................................................... 20
4.7.2.
Preparo do Aspirado Medular Seletivo ................................................................................. 21
4.7.3.
Efeitos adversos................................................................................................................... 21
4.7.4.
Período do Implante ............................................................................................................ 21
4.8.
Fase de seguimento .................................................................................................................. 22
4.9.
Análise dos Dados.................................................................................................................... 23
4.10.
Análise Estatística.................................................................................................................... 23
4.11.
Cronograma do Estudo............................................................................................................. 24
5. EXPLICITAÇÃO DE COMO OS ASPECTOS ÉTICOS FORAM CONTEMPLADOS............... 25
6. RESULTADOS FINAIS ................................................................................................................... 26
7. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 41
7.1.
Segurança e Exeqüibilidade...................................................................................................... 41
7.2.
Angiogênese ............................................................................................................................ 41
7.3.
Cardiomiogênese...................................................................................................................... 42
7.4.
Fenótipos celulares e correlação com as variáveis clínicas analisadas........................................ 44
7.5.
O número de injeções, a concentração da solução contendo células da medula óssea e a área
de distribuição destas células no miocárdio isquêmico: estão adequados? ................................................ 47
7.6.
Limitações ............................................................................................................................... 48
8. CONCLUSÕES ................................................................................................................................ 50
9. CONCLUSÃO FINAL...................................................................................................................... 51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................... 52
ANEXOS .................................................................................................................................................. 64
x
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AC
AC133+
Ad5FGF5
BNP
CCSC
Classification
CD
CD34+
CMMO
CPE
CTMO
%DPMR50
atividade
ECG-AR
ELL
FE
FGF
HGF
HIF
IAM
Lin-ckit +
NYHA
PCR-t
PET-FDG
Glucose
phVEGF
SCF
SF-36
SPECT
SUS
TACMMO
TDPMR
VDF
VEGF
VEGFR
VSF
– Anticorpo
– Células com expressão do antígeno CD133, reconhecido pelo AC133
– Vetor de adenovírus humano carreando o gen para expressão de FGF5
– do inglês, Brain Natriuretic Peptide.
– do inglês, Canadian Cardiovascular Society Angina Severity
– do inglês, Cluster of Differentiation
– Células com expressão do antígeno CD34
– Células Mononucleares da Medula Óssea
– Célula Projenitora Endotelial
– Células-Tronco da Medula Óssea
– Percentual de Defeito de Perfusão Miocárdica em Repouso com
de 50% (fibrose), pela cintilografia miocárdica de perfusão
– Eletrocardiograma de Alta Resolução
– Encurtamento Linear Local (NOGA)
– Fração de Ejeção
– do inglês, Fibroblast Growth Factor
– do inglês, Hepatocyte Growth Factor
– do inglês, Hypoxia-Inducible Factor
– Infarto Agudo do Miocárdio
– Células de linhagem hematopoiética negativa, com expressão do
receptor ckit para SCF
– do inglês, New York Heart Association
– Proteína C Reativa, titulada
– do inglês, Positron Emission Tomography – 18Fluor-2Deoxy-D– Vetor de DNA plasmidial carreando VEGF
– do inglês, Stem Cell Factor
– do inglês, 36-Item Short-Form Health Survey Questionnaire
– do inglês, Single Photon Emission Computed Tomography
– Sistema Único de Saúde
– Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula Óssea
– Total de Defeito de Perfusão Miocárdia Reversível (isquemia), em
percentual, pela cintilografia miocárdica de perfusão
– Volume Diastólico Final
– do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor
– do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor
– Volume Sistólico Final
xi
RESUMO
Objetivo: Este estudo tem por objetivo avaliar a exeqüibilidade e a segurança do
Transplante Autólogo, transendocárdico, de Células Mononucleares da Medula Óssea
(TACMMO), para pacientes com cardiomiopatia isquêmica terminal e correlacionar os
diferentes fenótipos, do “pool” total de células monononucleares da medula óssea
(CMMO) injetadas, com a melhora relativa das variáveis clínicas analisadas.
Métodos: Vinte e um pacientes foram incluídos neste estudo prospectivo (os 14
primeiros pacientes, grupo tratado; os 7 últimos pacientes, grupo controle). Inicialmente
todos os indivíduos foram submetidos à avaliação clínica e laboratorial, questionário de
qualidade de vida (SF-36 e Minnessota), teste ergométrico, ecocardiograma,
cintilografia miocárdica, ECG-AR e Holter de 24 horas. As CMMO foram isoladas,
lavadas e diluídas em salina 0,9%, contendo albumina humana, para injeção
transendocárdica, por meio do cateter MyoStar® NOGA, no grupo tratado.
Imediatamente antes do procedimento, os pacientes do grupo tratado foram submetidos
a uma angiografia inicial seguida de mapeamento eletromecânico, para identificação da
área de miocárdio viável a ser tratada (voltagem unipolar 6,9 mV e encurtamento
linear local 12%). Os exames não invasivos foram repetidos em todos os pacientes ao
final de 2; 6 e 12 meses de acompanhamento. Os pacientes do grupo tratado foram
submetidos à nova angiografia e mapeamento eletromecânico ao final de 4 meses de
seguimento. A melhora relativa destas variáveis clínicas foi correlacionada com o
percentual, número total e densidade das CMMO injetadas e seus fenótipos, através do
teste rho de Spearman (p 0,05).
Resultados: Os fatores de risco e demais características clínicas não diferiram
significativamente entre os grupos na avaliação inicial. Não foram observados eventos
adversos maiores relacionados ao TACMMO. Ao final de 1 ano de seguimento houve
redução significativa da área isquêmica na imagem de perfusão nuclear (p = 0,01).
Também foi observado melhora significativa dos sintomas de angina (p = 0,002) e de
insuficiência cardíaca (p = 0,01), assim como, da capacidade funcional, pelo teste
ergométrico (p = 0,03). O total de células viáveis e os fenótipos CD45lo, HLADR-,
ckit +CD45-, CD14+, CD19+, CD34+, CFU-F e CFU-GM se correlacionaram
positivamente com a melhora de algumas variáveis clínicas analisadas, enquanto que as
células CD56+ se correlacionaram negativamente. As células CD4+, CD8+ e CD19- se
correlacionaram de forma ambígua com tais variáveis.
Conclusão: Este estudo demonstra a exeqüibilidade e a segurança da realização de
injeções transendocárdicas de CMMO em pacientes com cardiopatia isquêmica
associada a grave disfunção ventricular. Os efeitos observados em curto prazo foram
mantidos até 12 meses de seguimento. Houve correlação significativa dos fenótipos
celulares com as variáveis clínicas analisadas. É possível que haja um efeito parácrino,
em longo prazo, das células injetadas, mas as funções específicas de tais células, no
processo de reparo tissular, ainda precisam ser elucidadas.
xii
ABSTRACT
Objective: This study aims to assess the safety and feasibility of Autologous,
transendocardial, Bone Marrow Mononuclear Cells Transplantation (ABMMCT) in
patients with end-stage ischemic cardiomyopathy and correlate the different cells
phenotypes of the total pool of bone marrow mononuclear cells (BMMC) injected with
the relative improvement of analyzed clinical variables.
Methods: Twenty-one patients were enrolled in this prospective study (first 14 patients
forming the treated group and the last 7 patients forming the control group). Initially all
patients underwent clinical and laboratorial assessment, quality of life questionnaire
(SF-36 e Minnessota), ramp treadmill test, echocardiogram, myocardial scintigraphy,
SA-ECG e 24 hour Holter. BMMC were isolated, washed and diluted in saline with
albumin for injection, using MyoStar® NOGA catheter, in treated group. Just before
procedure, treated patients underwent to initial angiography followed by
electromechanical mapping in order to identify areas of viable myocardium (unipolar
voltage 6.9 mV e linear local shortening 12%) for cells treatment. Non invasive
tests were reassessed after 2; 6 and 12 months of follow up in all patients. Angiography
and electromechanical mapping were repeated only in treated group at 4 months. The
relative improvement of these clinical variables was correlated to percentage, total
number and density of BMMC injected and their different phenotypes, through
Spearman’s rho test (p 0.05).
Results: Demographic data and other clinical characteristics did not differ between
groups in the initial evaluation. No major adverse events related to ABMMCT were
observed. At the end of 12 month follow up, a reduction in the ischemic area was
observed on nuclear perfusion imaging (p = 0.01). It was also observed a significant
improvement on symptoms of angina (p = 0,002) and congestive heart failure (p =
0.01), as well as, functional capacity, by ramp protocol (p = 0.03). The viable cells and
the cells fenotype CD45lo, HLADR-, ckit +CD45-, CD14+, CD19+, CD34+, CFU-F and
CFU-GM were positively correlated to the clinical improvement of some analyzed
clinical variables, while the cells CD56+ were negatively correlated to it. The CD4+,
CD8+ and CD19- cells were ambiguously correlated to those variables.
Conclusion: This study showed that transendocardial injections of BMMC are safe and
feasible in patients with ischemic heart disease associated to severe ventricular
dysfunction. The effects observed in the short term were maintained up to twelve month
follow up. There was significant correlation between cells phenotype and analyzed
clinical variables. It is possible that these cells maintain a long term paracrine effect on
myocardium, however, the specific functions of these cells on tissue repair process still
need to be elucidated.
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
Vários estudos recentes vêm demonstrando, de forma cada vez mais consistente,
que células originadas na medula óssea participam intensamente da regeneração de
várias estruturas do sistema cardiovascular. Apesar dos diversos estudos experimentais
e clínicos publicados até o momento, do implante de diferentes tipos de células
originadas da medula óssea no miocárdio isquêmico, através de múltiplas técnicas de
injeção, ainda se desconhecem os mecanismos de regeneração tecidual observado com
os métodos desenvolvidos.
Este estudo tem por objetivo, portanto, avaliar a correlação do fenótipo celular
do “pool” total de células mononucleares da medula óssea que foram injetadas por via
percutânea, transendocárdica, utilizando o cateter de injeção NOGA MyoStar Cordis,
em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica grave terminal, com as variáveis
clínicas analisadas. Esta informação pode ter um potencial único de sugerir o papel de
algumas células neste processo de reparo tecidual no sentido de otimizá-lo ou retardá-lo.
Esta correlação é baseada nos resultados do “Estudo prospectivo, randomizado,
para avaliar a segurança e a exeqüibilidade do Transplante Autólogo, transendocárdico,
de Células Mononucleares da Medula Óssea (TACMMO) em pacientes com cardiopatia
isquêmica grave terminal, com a perspectiva de reduzir a área de fibrose e melhorar a
perfusão miocárdica em relação ao grupo controle”, que foram previamente publicados13
e encontram-se nos anexos II, III e IV, desta dissertação. Sumariamente, foram
incluídos 21 pacientes distribuídos em 2 grupos: grupo tratado = 14 e grupo controle =
7. O acompanhamento clínico foi realizado durante o período de 12 meses com
aplicação de dois questionários de qualidade de vida (Minnessota e SF-36) e realização
de ECG, ecocardiograma, teste ergométrico, Holter 24 horas, ECG-AR
(Eletrocardiograma de alta resolução), cintilografia miocárdica com estresse
farmacológico com dipiridamol, avaliação laboratorial incluindo dosagens de PCRt
(Proteína C Reativa titulada) e BNP (do inglês Brain Natriuretic Peptide), ao final de 2;
6 e 12 meses de acompanhamento e coronariografia com ventriculografia esquerda e
mapeamento eletromecânico (NOGA) ao final de 4 meses de seguimento.
As seguintes variáveis foram selecionadas para a correlação celular: os escores
de pontos dos questionários de qualidade de vida (Minnessota e SF-36); fração de
ejeção (FE – Simpsom); volume sistólico final (VSF – Simpsom); volume diastólico
final (VDF – Simpsom); pico de VO2 (teste ergométrico pelo protocolo de rampa);
percentual de extra-sístoles ventriculares (ESV – Holter de 24 horas); duração do QRS
(dQRS – ECG-AR); total de defeito de perfusão miocárdica reversível (TDPMR) e
percentual de defeito de perfusão miocárdica em repouso, com atividade de 50%
(%DPMR50 – cintilografia miocárdica de perfusão) e BNP, ao final de 2; 6 e 12 meses
de acompanhamento; FE (angiografia esquerda); encurtamento linear local (ELL) e
voltagem unipolar (mapeamento eletromecânico – NOGA) ao final de 4 meses de
seguimento.
-1 Universidade Federal do Rio de Janeiro
1. FUNDAMENTOS
A insuficiência cardíaca, que tem entre suas causas mais freqüentes a
cardiomiopatia isquêmica, é um mal epidêmico neste início de século. Esta
doença afeta de 2 a 4 milhões de pessoas nos Estados Unidos (EUA) e cerca de
15 milhões de pessoas ao redor do planeta.4 No Brasil, segundo dados do
DATASUS, a insuficiência cardíaca gera mais de 300.000 internações/ano,
sendo a quarta maior causa de internação hospitalar (2,77% de todas as
internações feitas em 2005).5 Este total representa cerca de 26% de todas as
internações por doenças circulatórias, com uma mortalidade hospitalar de
6,39%.5
Da mesma forma que no Brasil, a insuficiência cardíaca nos EUA é a
principal causa de internação entre os pacientes com mais de 65 anos.4 Após
uma internação hospitalar, a sobrevida gira em torno de 1,47 anos para os
homens e 1,39 anos para as mulheres.6 Os casos mais graves correspondem a
10% do total da população com insuficiência cardíaca.6 Além da alta
mortalidade (18% em 30 dias 42% em 1 ano e 75% em 5 anos),4 esses casos
consomem uma grande quantidade dos recursos do sistema de saúde. Mais de
R$ 6 bilhões foram gastos em 2005 pelo Sistema Único de Saúde (SUS) com
internações hospitalares, sendo que cerca de R$ 230 milhões (3,4% do total)
foram destinados às internações por insuficiência cardíaca.5
Face ao aumento da expectativa de vida no mundo ocidental nas últimas
décadas, a incidência de insuficiência cardíaca vem aumentando. Além disso,
devido à evolução do tratamento do Infarto Agudo do Miocárdio (IAM), a taxa
de mortalidade relacionada a essa doença vem diminuindo e, como
conseqüência, ocorre um aumento da população de pacientes que têm como
seqüela a insuficiência cardíaca.4
O aprimoramento das diversas técnicas de revascularização miocárdica,
sejam percutâneas ou cirúrgicas, permitiu resultados cada vez mais efetivos
quanto à qualidade de vida, morbidade e mortalidade de coronariopatas, agudos
ou crônicos. Contudo, apesar do impacto positivo destes procedimentos, há
pacientes que, por limitações individuais, não podem se beneficiar de recursos
terapêuticos com este nível de efetividade.7 Entender as características clínicas
desta população é fundamental para que se possa identificar e desenvolver
alternativas capazes de suprir suas necessidades específicas.
Do aspecto clínico, em termos gerais, estes pacientes são caracterizados
pela presença de doença coronariana de longa duração, geralmente com história
clínica de múltiplas revascularizações, precordialgia grave e incapacitante, e
disfunção sistólica do ventrículo esquerdo.7
Cerca de 90% destes indivíduos já foram submetidos a, no mínimo, um
procedimento cirúrgico de revascularização, sendo que aproximadamente a
metade deles já realizou mais do que 3 procedimentos percutâneos. Após esta
realização sucessiva de técnicas de revascularização, o paciente geralmente
alcança um estágio avançado de doença. Este estágio é caracterizado por:
artérias de pequeno calibre, muitas vezes mantidas por extensa rede de colaterais
insuficientes para gerar perfusão miocárdica adequada; anatomias complexas,
muitas vezes envolvendo enxertos arteriais e/ou venosos, com dificuldade de
acesso percutâneo; presença de doença arterial periférica concomitante
inviabilizando o uso de enxertos arteriais para revascularização ou o acesso dos
cateteres de angioplastia; presença de doença aterosclerótica coronariana grave
no leito distal, que atenuam os potenciais benefícios dos procedimentos de
revascularização.7
Estes pacientes são, na maior parte dos casos, do sexo masculino e
encontram-se entre a sexta e a sétima décadas da vida. Noventa e um por cento
deles já sofreram IAM. A mesma proporção apresenta angina classe III ou IV
da classificação da Sociedade Canadense de Cardiologia (CCSC, do inglês
Canadian Cardiology Society Anginal Severity Classification) e, da mesma
forma, cerca de 95% destes pacientes encontra-se em classe funcional III ou IV
da classificação da Associação do Coração de Nova Iorque (NYHA, do inglês
New York Heart Association). A FE média destes pacientes é de 49,5 ± 16,4%.
Nesses pacientes com estágio avançado de doença os custos chegam a ser de 8 a
30 vezes maiores que nos pacientes com classe funcional II.8
O intenso consumo de medicamentos é também uma realidade na vida
desses pacientes. Quase todos tomam nitratos e 60 a 80% usam betabloqueadores associados a inibidores da enzima de conversão do
angiotensinogênio a angiotensina, além de diuréticos. Cerca de um terço
utilizam digital regularmente e mais de 70% usam bloqueadores dos canais de
cálcio. Os sintomas freqüentes, somados ao uso expressivo de medicamentos,
geram além de uma piora na qualidade de vida dos pacientes, um elevado
consumo dos recursos do sistema de saúde.8
Há enorme preocupação com este subgrupo de coronariopatas graves,
uma vez que seu número cresce progressivamente como produto dos melhores
resultados obtidos com os procedimentos de revascularização e com os novos
medicamentos utilizados para prevenção secundária.
Neste sentido, vários fármacos foram aprovados para o uso clínico como
os inibidores da enzima conversora do angiotensinogênio a angiotensina e os
inibidores dos receptores do tipo I de angiotensina II. Da mesma forma, velhos
fármacos tiveram suas indicações expandidas, tais como os beta-bloqueadores;
outros tiveram sua indicação ratificada tais como os diuréticos antagonistas da
ação da aldosterona.8-10 Além disso, outras técnicas foram desenvolvidas e como
exemplo podemos citar a cardiomioplastia, a cirurgia de Randas Batista, o
transplante cardíaco e o implante do coração artificial. Todas representam
alternativas em uso clínico para minorar os sintomas da insuficiência cardíaca.11
Várias estratégias terapêuticas vêm sendo testadas, da mesma forma,
para o tratamento da angina refratária crônica, tais como o uso intermitente ou
em longo prazo de uroquinase; neuroestimulação;7, 12-14 revascularização
transmiocárdica por laser, radiofreqüência ou mecânica;15 e neoangiogênese
através do implante de fatores de crescimento endoteliais.16, 17 Nenhuma destas
técnicas, no entanto, a despeito de alguns anos de desenvolvimento, demonstrou
efetividade no sentido de alterar o mau prognóstico destes pacientes, de forma a
justificar seu emprego clínico.7, 12-14, 18
Já no final do século passado, pesquisadores dedicados à área de
oncologia começaram a focar suas atenções em um processo biológico até então
pouco estudado: o processo de angiogênese.
Não demorou para que pesquisadores que lidam com doenças isquêmicas
começassem a aplicar o aprendizado deste processo no sentido de desenvolver
técnicas terapêuticas voltadas para estas doenças. Neste período, predominam
dois nomes: Jeffrey Isner et al19, 20 e Asahara et al.21, 22 Estes pesquisadores
iniciaram a era biológica da terapêutica da doença isquêmica. Para tal,
desenvolveram a terapia gênica, no sentido de aumentar a expressão de gens
produtores de fatores de crescimento envolvidos no processo angiogênico.21, 23-25
Mais recentemente, alternativas relacionadas à terapia celular começaram
a se desenvolver. Nos últimos dois anos alguns estudos, in vitro e in vivo, têm
sido publicados sugerindo o potencial do uso de células-tronco com esta
finalidade. O transplante autólogo de células satélites do músculo esquelético
surgiu como uma opção para o tratamento destes pacientes. Da mesma forma, o
TACMMO tem demonstrado in vitro e in vivo, potencial terapêutico.26
Portanto, um segundo capítulo começou a ser escrito já neste início de
século XXI, o da terapia celular voltada para o estímulo ao processo
angiogênico.
1.1.
Terapia Celular
O implante de células para o tratamento de doenças cardiovasculares
encontra-se sob investigação em vários centros no mundo. Várias linhagens
celulares têm sido investigadas em modelos experimentais27-31 e as primeiras
séries de casos em humanos já foram descritas na literatura.32-36 Atualmente a
maioria dos estudos em humanos se concentra em células de origem adulta e
autóloga, em oposição ao uso de células de origem embrionária. Duas fontes de
células foram utilizadas em humanos até o momento: a musculatura esquelética
(origem dos mioblastos)34 e a medula óssea (fonte de células-tronco nos
adultos).36, 37
O uso de células-tronco para o tratamento de doenças cardiovasculares
tem enorme potencial.
Vários estudos in vitro e in vivo demonstraram que as células
mononucleares da medula óssea (CMMO) podem se diferenciar em
cardiomiócitos e vasos.22, 38-45 O implante de células-tronco originadas na
medula óssea (CTMO) foi capaz de melhorar a contração e a perfusão
miocárdica em modelos animais de infarto miocárdico e isquemia crônica.28, 42,
46, 47
Em humanos, a segurança do implante de CMMO durante a cirurgia
cardíaca foi descrita no Japão,48 na Alemanha49, 50 e na Argentina.51
O uso de CMMO, por infusão intracoronariana, pós-IAM foi relatado em
algumas séries de casos52 e alguns estudos controlados.35, 36, 53-55 Também foi
relatado em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica secundária a um IAM
antigo.52, 56 Os resultados de tais estudos, fase I/II, sugerem redução da área de
necrose após IAM, nos pacientes submetidos à terapia celular, e redução
significativa do volume sistótico final do ventrículo esquerdo com conseqüente
melhora da FE do ventrículo esquerdo nestes pacientes.32, 35, 52-57
A segurança do transplante autólogo, transendocárdico, de CMMO
também foi demonstrada em pacientes com cardiopatia isquêmica grave.28, 58, 59
1.2.
Células-Tronco
As células-tronco se caracterizam por serem células indiferenciadas,
capazes de se auto-regenerarem, e de se diferenciarem em diversas linhagens
celulares. Estas células podem ter origem embrionária ou adulta.
De acordo com a sua capacidade de auto-renovação e diferenciação as
células-tronco podem ser classificadas como totipotentes, pluripotentes ou
multipotentes: 60-62
Ø Células totipotentes têm a capacidade de gerarem sozinhas um novo
embrião, incluindo as células do sincício trofoblasto que vão dar origem à
placenta. O embrião, o zigoto e as células descendentes imediatas,
resultantes das duas primeiras divisões celulares após a formação do zigoto,
são as únicas células consideradas totipotentes.
Ø Células pluripotentes podem proliferar-se indefinidamente in vitro sem se
diferenciar, mas também podem diferenciar-se em diferentes linhagens
celulares se as condições de cultivo das células forem modificadas. Elas são
capazes de dar origem a qualquer uma das células oriundas de uma das três
camadas germinativas do embrião, com exceção da placenta e suas
estruturas de sustentação. As células oriundas da camada interna do
blastocisto 5 dias após a fertilização, tipicamente as células-tronco
embrionárias, são pluripotentes. Recentemente várias evidências indicam
que algumas células-tronco adultas também possuem esta propriedade.
Ø Células multipotentes têm menor capacidade de diferenciação e são,
portanto, capazes de dar origem a uma pequena quantidade de linhagens
celulares específicas de acordo com o sítio tecidual em que se encontram.
Entretanto, uma vez removidas de sua localização usual, tais células podem
se transdiferenciar em outras linhagens celulares compatíveis com o novo
ambiente em que as mesmas se encontram.
Vários trabalhos na década de 90 utilizaram um outro tipo celular para
aplicação cardíaca: as células satélites do músculo esquelético em transplantes
celulares para corações submetidos às lesões criogênicas ou isquêmicas.
Embora, ao contrário do que se observou com mioblastos cardíacos fetais e
células-tronco medulares, não foi descrito o estabelecimento de junções
comunicantes entre as células satélites transplantadas e o miocárdio.
Naturalmente, o fato das células transplantadas não estabelecerem comunicação
elétrica com os cardiomiócitos é preocupante pois pode resultar no
desenvolvimento de focos arrítmicos.
-5 -
Universidade Federal do Rio de Janeiro
O implante de mioblastos nas áreas de fibrose, durante a cirurgia de
revascularização do miocárdio, foi a primeira descrição de terapia celular em
humanos para tratamento de doenças cardíacas.34 O comportamento
eletrofisiológico destas ilhas de músculo esquelético em meio a fibrose e o
acoplamento destas novas células com os cardiomiócitos nativos é fonte de
pesquisas e, provavelmente, está relacionado ao desenvolvimento das arritmias
ventriculares malignas que foram descritas por alguns centros europeus.63 O
mesmo não foi observado com as células-tronco da medula óssea.
1.3.
Células-Tronco Adultas
Na década de 60 foi descoberto que organismos adultos têm a capacidade
de auto-regenerarem determinados tecidos como a pele, o epitélio intestinal e
principalmente o sangue, que tem suas células constantemente destruídas e
renovadas, num complexo e finamente regulado processo de proliferação e
diferenciação celular. Durante muitas décadas estudou-se o processo de
hematopoiese (processo de produção das células sanguíneas) a partir de célulastronco multipotentes, localizadas no interior dos ossos, que são capazes de dar
origem a células progressivamente mais diferenciadas e com menor capacidade
proliferativa. As células-tronco da medula óssea, células-tronco multipotentes,
geram as linhagens progenitoras mielóide e linfóide, que terminam por dar
origem a todos os nove tipos celulares presentes no sangue, de hemácias a
linfócitos. O processo de renovação celular é tão intenso que diariamente 213
novas células sanguíneas entram na circulação.64 É verdadeiramente assombroso
que o organismo consiga manter um processo proliferativo tão exuberante sob
controle, impedindo, em circunstancias normais, que o número de células
produzidas exceda o necessário e que as células liberadas na circulação estejam
no estágio correto de diferenciação.
A noção de que vários tecidos e órgãos do corpo humano, como o fígado,
músculo esquelético, pâncreas, e sistema nervoso, tem um estoque de célulastronco, com uma capacidade limitada de regeneração tecidual após injúria, é
razoavelmente recente. Ainda mais recente é a idéia de que as células-tronco
presentes nestes vários órgãos são não apenas multipotentes, no sentido de que
podem gerar as células constitutivas daquele órgão específico, mas também
pluripotentes, no sentido de que também podem gerar células de outros órgãos e
tecidos. Obviamente, a possibilidade de utilizar as próprias células de indivíduos
adultos resolveria simultaneamente os dois principais problemas enfrentados
pela bioengenharia: a rejeição imunológica relacionada aos transplantes
heterólogos e as objeções ético-religiosas relacionadas ao uso de material fetal.
O primeiro relato incontestável, desta propriedade das células-tronco adultas, foi
feito, em 1998, por um grupo de cientistas italianos que estudaram a regeneração
do músculo esquelético por células derivadas da medula óssea.65
1.4.
Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Cardiomiócitos
Estudos in vitro demonstraram que as células mononucleares da medula
óssea podem se diferenciar em cardiomiócitos, através da detecção de atividade
-6 -
elétrica espontânea e de receptores funcionais adrenérgicos e muscarínicos.
Embora os trabalhos de Makino et al45 e Tomita et al66 tenham utilizado
condições de cultivo dos aspirados de medula óssea que favorecem a seleção de
células do estroma, em nenhum dos dois trabalhos os autores se preocuparam
com uma caracterização fenotípica mais exata do(s) tipo(s) celular(es) que
era(m) capaz(es) de se diferenciar em cardiomiócitos em cultura.
Estudos in vivo foram conduzidos em modelos experimentais com ratos,
cães e porcos e em modelos de corações normais, pós-IAM e crioinjúria. Orlic
et al demonstraram, através de estudos em camundongos, que células da medula
óssea injetadas na borda de áreas do miocárdio infartadas se transformavam em
cardiomiócitos.41 Jackson et al demonstraram que após o IAM células marcadas
da medula óssea em ratos povoavam a área das bordas do Infarto.38 Toma et al
demonstraram que células mesenquimais da medula óssea de humanos,
transplantadas em corações normais de ratos,
transformavam-se em
43
cardiomiócitos. Estes resultados foram reproduzidos em modelos suínos de
IAM onde cardiomiócitos juntamente com novos vasos, originados de células da
medula óssea, foram identificados.42 Numa série de casos de análise
histopatológica de autópsias de coração de mulheres submetidas a transplante de
medula óssea de doadores homens, Deb et al observaram a presença de
cardiomiócitos com cromossomas XY, ou seja, cardiomiócitos com origem na
medula óssea.67 Outros estudos já haviam descrito a origem extra-cardíaca de
novos cardiomiócitos,65, 68-70 mas este foi o primeiro a identificar a medula óssea
como fonte de novos cardiomiócitos, revolucionando assim o conceito até então
vigente de que não há regeneração da musculatura cardíaca.
1.5. Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Células
Endoteliais
Alternativas têm sido desenvolvidas baseadas na noção conceitual de que
as células endoteliais e as células-tronco hematopoiéticas derivam de um
precursor comum: o hemangioblasto.21, 71 Portanto, o paradigma de que as
células endoteliais eram geradas por replicação de células endoteliais maduras
foi revolucionado. Asahara et al observaram que grande parte das células
envolvidas no processo de angiogênese tinha origem na medula óssea.21 Mais
ainda, possibilitaram a descoberta de que há vasculogênese na vida adulta, ou
seja, que ocorre surgimento de novos vasos na vida adulta e não somente a
replicação de capilares a partir de vasos já existentes, conceito que responde por
angiogênese. Após esta publicação, muitas outras se seguiram confirmando
estes resultados.71-80
As células progenitoras endoteliais (CPE), originadas na medula óssea,
poderiam ser identificadas como CD34+ (CD, do inglês cluster of differentiation)
e VEGFR2+ (VEGFR, do inglês Vascular Endothelial Growth Factor Receptor),
embora outros marcadores como o AC133+ e CD31+ tenham sido descritos.
Durante a isquemia tecidual, com a queda dos níveis de oxigênio, ocorre
aumento da produção de HIF-1 (do inglês Hypoxia Growth Factor-1), que por
sua vez desencadeia o aumento de vários fatores de crescimento, mais
notadamente o VEGF (do inglês Vascular Endothelial Growth Factor). O
aumento de VEGF é o principal estímulo para a mobilização das células da
medula óssea, assim como o principal sinal para o “homing” destas células nos
tecidos isquêmicos e sua posterior diferenciação em células endoteliais em
estruturas tubulares.81 A aplicação de VEGF para a neovascularização
terapêutica mobiliza as CPE.82
Shintani et al estudaram pacientes com IAM submetidos à angioplastia
primária com sucesso e observaram significativa elevação das CPE originadas
da medula óssea, que apresentaram pico sérico no sétimo dia pós-IAM. Os
níveis de CPE tiveram relação com os níveis séricos de VEGF (r=0,35;
p=0,01).83 Kocher et al sugeriram que a neovascularização que ocorre
naturalmente após o IAM seria insuficiente para suprir os miócitos ainda vivos,
sob risco, resultando em perda progressiva de tecido viável, extensão do infarto
e substituição da musculatura por fibrose. Uma maior oferta de CPE poderia
potencializar a formação de novos vasos na área infartada (vasculogênese) ou a
proliferação de vasos a partir da vasculatura preexistente (angiogênese). A
neoangiogênese resultaria em diminuição da apoptose dos miócitos
hipertrofiados na região perinfarto e, conseqüentemente, diminuição da
deposição de colágeno e remodelamento cardíaco, o que resultaria em melhora
sustentada da função cardíaca.47
A utilização de células originadas da medula óssea em experimentos de
neovascularização já conta com literatura consistente. Já foram utilizados
modelos de isquemia miocárdica aguda e crônica em diferentes animais,
utilizando a via intracoronariana, via transendocárdica e a via transepicárdica.22,
28, 46, 47, 84-91
Em todos estes estudos, o implante de CTMO foi capaz de melhorar a
contração e a perfusão miocárdica.28, 42, 46, 47, 92 Modelos de membro isquêmico
em animais também foram bem sucedidos na neovascularização utilizando
células da medula óssea.85, 88
1.6.
Fatores de Crescimento e Angiogênese
As implicações terapêuticas dos fatores de crescimento angiogênicos
foram identificadas pelos estudos pioneiros de Folkman et al há 2 décadas.93
Investigações posteriores estabeleceram a possibilidade da utilização de
formulações de fatores de crescimento angiogênico recombinantes com o
objetivo de desenvolver ou aumentar a rede de colaterais em modelos animais de
isquemia crônica miocárdica ou de membro. Esta nova estratégia foi
denominada angiogênese.94 Diversos estudos experimentais utilizando proteína
recombinante ou transferência gênica de VEGF, FGF-2 (FGF, do inglês
Fibroblast Growth Factor) e HGF (do inglês Hepatocyte Growth Factor) foram
realizados.95
Transfecção gênica em seres humanos utilizando DNA carreando VEGF
(phVEGF) foi inicialmente realizada para o tratamento de pacientes com
isquemia grave de membros, com sucesso.96, 97 Três pacientes com dor em
repouso e tratados com 1000 µg de phVEGF evoluíram com melhora
sintomática e do fluxo arterial para o membro tratado após 1 ano de seguimento.
Com o aumento da dose para 2000 µg houve evidência angiográfica e
-8 -
histológica de neoformação vascular.96, 97 Posteriormente, injeção direta
intramiocárdica de phVEGF-A165 foi realizada com sucesso em 5 pacientes
portadores de doença coronariana sem possibilidade de revascularização
(Losordo et al, 1999).98 N. Sarkar et al encontraram resultados semelhantes em
7 pacientes portadores de angina refratária crônica e submetidos a injeções
transepicárdicas de CMMO através de minitoracotomia, indicada
exclusivamente para este objetivo em um estudo de fase 1 publicado em 2001.99
Com base nos resultados do estudo de N. Sarkar et al,99 foi iniciado o
estudo multicêntrico EUROINJECT ONE 100 com desenho duplo cego,
randomizado e controlado por placebo. Outros 3 estudos controlados por placebo
foram publicados nos Estados Unidos. O primeiro em 2001, realizado por Peter
Vale et al, em 6 pacientes com angina refratária, submetidos à injeção
transendocárdica por cateter, guiada por NOGA, de phVEGF-2 em 3 pacientes
do grupo tratado e de placebo em 3 pacientes do grupo controle, com crossover
do grupo controle para o grupo tratado 3 meses após a randomização inicial.101
Em 2002 foi publicado o segundo estudo de terapia gênica em humanos
(AGENT), randomizado, duplo cego e controlado por placebo, em pacientes
com angina estável classe canadense II e III. A infusão do gen do fator de
crescimento de fibroblasto (FGF, do inglês Fibroblast Growth Factor) foi feita
por via intracoronariana, utilizando adenovírus como vetor (Ad5-FGF5) em 79
pacientes (19 receberam placebo), com melhora dos sintomas e da contratilidade
do ventrículo esquerdo no grupo tratado.102 Posteriormente, no mesmo ano, foi
publicado o terceiro estudo randomizado, duplo cego, controlado por placebo,
com dose escalonada de phVEGF em 18 pacientes e de placebo em 9 pacientes,
que foram submetidos a injeções transendocárdicas, também por meio de cateter
NOGA de injeção.103
Estes estudos experimentais em animais e estes ensaios clínicos têm duas
implicações: primeiro, sugerem que o mecanismo fundamental pelo qual a
neovascularização aumenta o desenvolvimento da rede de colaterais é através do
fornecimento de citoquina suplementar a indivíduos que devido à idade
avançada, diabetes, hipercolesterolemia e outras circunstâncias ainda não
definidas, são incapazes de aumentar a expressão de citoquinas em resposta a
isquemia tecidual; segundo, a administração de citoquina claramente representa
somente um aspecto da intervenção terapêutica.
Independentemente de quanto de citoquina é administrado, a população
de células endoteliais residentes têm uma capacidade máxima de resposta a um
determinado nível de fator de crescimento vascular, que pode constituir um fator
limitante potencial para estratégias de neovascularização de tecidos isquêmicos.
1.7.
Doença Arterial Coronariana Aguda
O primeiro relato de caso do uso de CMMO foi realizado na Alemanha
pelo Dr Bodo Strauer em agosto de 2001, que realizou a injeção de CMMO por
via intracoronariana em um paciente após IAM com segurança.32 Na primeira
série de casos de transplante de células por via intra-coronariana, pós-IAM,
Strauer et al selecionaram 10 pacientes com IAM tratados por angioplastia
-9 -
primária tardia (12 horas). Entre os critérios de inclusão não constaram avaliação
viabilidade miocárdica na área infartada ou FE do ventrículo esquerdo.
Os pacientes foram submetidos ao transplante de células entre o 5º e 9º
dia após o IAM. As células foram injetadas pelo lúmen de um balão de
angioplastia, o qual foi insuflado no local da lesão responsável pelo IAM, e o
número médio de células foi de 28+22 x 106, fracionadas em 6 a 7 injeções. Os
procedimentos foram realizados com segurança em todos os pacientes. Ao final
de 3 meses os pacientes apresentaram melhora da contratilidade miocárdica na
área infartada, assim como redução do VSF do ventrículo esquerdo (redução de
18%), sugerindo um efeito benéfico no remodelamento cardíaco. Na análise da
perfusão em repouso com tálio houve redução da área com defeito de perfusão
miocárdica em 26%.36
No estudo TOPCARE, também realizado na Alemanha, o uso de CMMO
(n=9) e células-tronco selecionadas do sangue periférico (n=11), por infusão
intracoronariana 4 dias após o IAM, em pacientes tratados por angioplastia
primária, sugeriu redução da área de necrose miocárdica ao final de 4 meses.
Neste estudo aberto, não randomizado, houve aumento de 15% de captação com
Flúor-18 (F-fluoro-deoxi-D-glicose) na área de miocárdio infartado, pela
tomografia com emissão de pósitrons (PET-FDG). Paralelamente, houve
significativa redução de 25% no volume sistótico final do ventrículo esquerdo,
associado à melhora da FE. Houve melhora da contratilidade regional, mesmo
nos pacientes que não tiveram critérios de viabilidade miocárdica ao
ecocardiograma com dobutamina.35
Em outubro de 2004 Schachinger et al publicaram os resultados finais do
acompanhamento de 1 ano do estudo TOPCARE-AMI. Cinqüenta e nove
pacientes com IAM foram randomizados para tratamento com células-tronco
selecionadas do sangue periférico (n = 30) ou CMMO (n = 29), transplantadas,
por infusão intracoronariana, 4.9±1.5 dias pós-IAM. Houve aumento
significativo da FE e diminuição do volume sistóico final do ventrículo esquerdo
em ambos os grupos tratados, além de redução da área de infarto e ausência de
hipertrofia reativa nas imagens de ressonância magnética cardíaca ao final de 1
ano. Este estudo demonstrou a segurança do tratamento intracoronariano com
ambos os tipos celulares.57
Wollert et al publicaram o primeiro estudo clínico randomizado,
controlado, simples cego, do implante intracoronariano de CMMO para 60
pacientes (30 no grupo tratado com CMMO) 4,8 ± 1,3 dias pós-IAM com supra
de ST. A FE do ventrículo esquerdo aumentou de 51.3% para 52% no grupo
controle e de 50.0% para 56.7% no grupo tratado (p = 0.0026). Esta melhora da
função sistólica do ventrículo esquerdo foi devida principalmente à melhora da
contratilidade nos segmentos do miocárdio adjacentes a área infartada.53
Em julho de 2004 Chenn et al publicaram os resultados do primeiro
estudo controlado, randomizado, com desenho duplo-cego, do implante
intracoronariano de células mesenquimais derivadas da medula óssea autóloga,
em 69 pacientes pós-IAM tratados por angioplastia primária. Os pacientes foram
randomizados para o grupo tratado por injeção intracoronariana de células
mesenquimais (n = 34) e para o grupo controle submetido à injeção
intracoronariana de solução salina (n = 35). No seguimento de 3 meses houve
- 10 Universidade Federal do Rio de Janeiro
diminuição significativa do defeito de perfusão miocárdica, medido pela
cintilografia (SPECT), de 32 ± 11% para 13 ± 5% no grupo tratado comparado
ao grupo controle (P < 0.05), e melhora da contratilidade global e segmentar
pelo ecocardiograma com doppler tecidual no grupo tratado em relação ao grupo
controle (P < 0.05). Chenn et al também utilizaram mapeamento eletromecânico
nos pacientes do grupo tratado. Houve melhora do ELL e da voltagem
unipolar.55
Ruan et al repetiram o mesmo tipo de procedimento em 20 pacientes com
IAM anterior submetidos a angioplastia primária com sucesso, em um estudo
duplo-cego. Neste caso foi injetado o pool total de células mononucleares da
medula óssea autóloga, por via intracoronariana, em 9 pacientes randomizados
para o grupo tratado. Houve melhora da FE e dos volumes cavitários ao final de
6 meses de seguimento.54
Mais recentemente, Janssens et al publicaram os resultados do terceiro
estudo controlado, randomizado, duplo-cego, do tranplante autólogo,
intracoronariano, de CMMO 1 dia após IAM com supra de ST tratado por
angioplastia primária com sucesso.104 Neste estudo não houve melhora
significativa da contratilidade global do ventrículo esquerdo no grupo tratado em
relação ao grupo controle, mas houve melhora significativa do metabolismo
celular e da contratilidade segmentar nas áreas de miocárdio tratadas com
células-tronco da medula óssea.
O estudo ASTAMI,105 ainda não publicado, não demonstrou benefício do
TACMMO por via intracoronariana quanto aos desfechos clínicos e de função
sistólica do ventrículo esquerdo no seguimento de 6 meses. Neste estudo aberto,
100 pacientes foram randomizados ou para o grupo controle (n=50) ou para o
grupo tratado com CMMO, 4-8 dias após IAM com supra de ST tratado por
angioplastia primária com sucesso. Os resultados deste estudo diferem de todos
os outros apresentados até o momento.
Bartunek et al publicaram em 2005 os resultados do estudo randomizado,
aberto, do transplante intracoronariano de 12,6±2.2 milhões de células CD133+,
cerca de 12 dias após o diagnóstico de IAM.106 Este estudo demonstrou que este
procedimento é exeqüível e pode estar relacionado à melhora da contratilidade
ventricular e da perfusão miocárdica no grupo tratado. Entretanto, houve elevada
incidência de reestenose coronariana no grupo submetido à injeção de células em
relação ao grupo controle.
1.8.
Cardiomiopatia Isquêmica Grave
Estudos iniciais foram realizados em pacientes portadores de cardiopatia
isquêmica grave com indicação de cirurgia de revascularização miocárdica
incompleta. Hamano et al foram o primeiro grupo de pesquisadores a relatar os
resultados do transplante intra-miocárdico de CMMO durante a cirurgia de
revascularização do miocárdio numa série de cinco pacientes, no Japão. Três dos
5 pacientes tratados obtiveram melhora da perfusão miocárdica nos territórios
injetados,48 confirmando os resultados de estudos experimentais prévios, em
modelos caninos, de que não houve nenhuma alteração prejudicial nos corações
- 11 -
submetidos a injeção de células-tronco. Estes resultados foram confirmados por
um segundo estudo em humanos, conduzido por Stamm et al, na Universidade
de Rostock, Alemanha.49 Neste estudo 6 pacientes foram submetidos ao
tratamento per-operatório com injeções transepicárdicas de células-tronco da
medula óssea, em áreas de fibrose miocárdica, também evidenciando a
segurança do procedimento e a melhora da perfusão miocárdica em 5 dos 6
pacientes, no seguimento de 3-9 meses.
Em 2004 este mesmo grupo da universidade de Rostock publicou os
resultados deste mesmo tipo de procedimento em 12 pacientes com diagnóstico
de IAM há mais de 10 dias. As injeções de células AC133+ foram novamente
realizadas nas bordas da área de miocárdio acinético, durante o procedimento de
revascularização miocárdica. Houve melhora dos volumes cavitários e da FE do
ventrículo esquerdo.50
Gowdak et al realizaram procedimento semelhante em 10 pacientes,
portadores de cardiopatia isquêmica grave, submetidos a revascularização do
miocárdio incompleta. Cerca de 130 milhões de CMMO foram injetadas nas
áreas isquêmicas do miocárdio não passíveis de revascularização. Este
procedimento se mostrou seguro no seguimento de 1 mês.107
Patel et al também demonstraram a segurança desta técnica em 20
pacientes, com grave disfunção ventricular, que foram submetidos à cirurgia de
revascularização miocárdica incompleta, sem circulação extracorpórea. Dez
pacientes foram submetidos à injeção transepicárdica de células CD34+ nas áreas
não revascularizáveis do miocárdio e 10 pacientes foram seguidos como
controles. Houve melhora da função sistólica do ventrículo esquerdo no
seguimento de 6 meses.51
Poucos centros de pesquisa realizaram TACMMO em pacientes
portadores de cardiopatia isquêmica terminal, sem possibilidade de
revascularização miocárdica, seja percutânea ou cirúrgica. Tse et al representam
o primeiro grupo de pesquisadores a realizar TACMMO por via percutânea,
utilizando cateteres NOGA de injeção, em pacientes portadores de cardiopatia
isquêmica terminal. Estes autores observaram redução da área de isquemia à
ressonância magnética de perfusão (de 8,8% para 5,0%; p=0,004) após 3 meses,
bem como melhora da contratilidade regional nas áreas de miocárdio submetidas
às injeções de CMMO.58
Fucks et al representam o segundo grupo de pesquisadores que
investigaram a segurança e a exeqüibilidade do TACMMO por via
transendocárdica em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica grave, sem
possibilidade de revascularização.108 Mais recentemente Beeres et al repetiram
este procedimento numa série de 22 pacientes com angina grave (CCSC III ou
IV) apesar do tratamento para doença coronariana obstrutiva na dose máxima
tolerada. Foram injetados cerca de 100 milhões de CMMO, distribuídas em
11±2 injeções transendocárdicas, na área de miocárdio hibernante. No
seguimento de 3 meses houve redução da área de isquemia pela cintilografia
miocárdica com estresse farmacológico com dipiridamol, assim como melhora
dos sintomas de angina.59
A via intracoronariana tem sido testada como uma alternativa às vias de
injeção transepicárdica e transendocárdica nesta população de pacientes com
doença coronariana grave, em sua maioria, multivascular. Strauer et al
submeteram 18 pacientes portadores de cardiopatia isquêmica secundária a
infarto do miocárdio antigo, variando de 5 meses a 8 anos, ao transplante
intracoronário de CMMO (IACT-Study). Este estudo demonstrou além da
segurança do procedimento, regeneração do metabolismo celular na área
infartada. Este achado foi corroborado pela melhora da contratilidade global e
seguimentar do ventrículo esquerdo nos pacientes tratados em relação ao grupo
controle.56
O estudo mais recente foi realizado por Blatt et al, utilizando injeção
intracoronariana de CMMO em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica
grave sem opção de terapia de revascularização miocárdica. Foram estudados 6
pacientes com classe funcional da New York Heart Association III ou IV, apesar
do tratamento clínico pleno, e que apresentavam FE < 35% pelo ecocardiograma
de estresse com dobutamina. No seguimento de 4 meses houve melhora clínica e
funcional. A FE aumentou significativamente de 25% ± 7% para 28% ± 8% (p
= .055).52
Além dos estudos citados acima, um grupo da universidade de Tel Aviv
em parceria com pesquisadores do Hospital Chao Phya, Bangkok, Tailândia,
realizaram o implante intracoronariano de 25 milhões de CPE cultivadas por 24
horas a partir de uma amostra de sangue periférico, em uma série de 17
pacientes portadores de angina crônica refratária ao tratamento clínico na dose
máxima tolerada. No seguimento de 3 meses houve melhora dos sintomas e da
capacidade de exercício.109
1.9.
Fenótipos Celulares
O fenótipo dos diferentes tipos celulares é definido pela presença de
proteínas específicas na superfície da membrana da célula. Tais proteínas são
identificadas através de anticorpos monoclonais que se ligam a estas proteínas,
ditas antígenos de superfície, identificando-as. Uma nomenclatura internacional,
com o objetivo de classificar os diversos anticorpos monoclonais utilizados em
todo mundo, para identificação de leucócitos, foi proposta em 1982 no “1st
International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation
Antigens (HLDA)”, em Paris. Esta nomenclatura foi denominada “Clustter of
Diffetentiation (CD)” e é a nomenclatura universalmente utilizada para
caracterização de diversos tipos celulares.110 Desde 1982 mais de 250 CD foram
identificados e a leitura destes antígenos de superfície é feita por citometria de
fluxo. Os sinais “+”e “-” são utilizados para indicar a presença ou ausência de
determinada molécula CD nas frações celulares analisadas. Células
CD34+CD19-, por exemplo, expressam na sua superfície a molécula CD34 mas
não a CD19.110
As CMMO, bem como as CTMO, podem ser caracterizadas, portanto, de
acordo com os seus marcadores de superfície, suas funções e proteínas que
expressam.26
- 13 -
A maioria dos estudos experimentais e clínicos, até o momento, tem
utilizado ou o “pool” total de CMMO ou fenótipos específicos destas células
mononucleares, tais como a sub população de células aderentes (células
mesenquimais);111 CPE;112 Lin-Ckit +; 41, 113 CD133+49, 106 ou CD34+.58, 108, 114-116
Nenhum destes estudos, entretanto, foi capaz de determinar qual ou quais destes
fenótipos celulares são essenciais para esse processo de regeneração, e de que
forma estas células interagem entre si e com o micro-ambiente lesado.
Uma vez que ainda se desconhecem os mecanismos de regeneração
tecidual observado com esta técnica, esta informação pode ter um potencial
único de sugerir o papel singular ou sinérgico destas células durante o reparo
tissular, no sentido de otimizá-lo ou retardá-lo.
2. HIPÓTESES
2.1. O transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea, para
área de miocárdio hibernante, através da liberação percutânea intramiocárdica, é um procedimento exeqüível e seguro, em pacientes com
insuficiência cardíaca isquêmica terminal.
2.2. Os diferentes fenótipos celulares se correlacionam com o comportamento
das variáveis clínicas analisadas.
3. OBJETIVOS PRINCIPAIS E
SECUNDÁRIOS
3.1.Objetivos Principais:
3.1.1.
Identificar e quantificar a ocorrência de eventos adversos graves durante
o procedimento de implante do material medular do “pool” total de
Células Mononucleares da Medula Óssea (CMMO) para área de
isquemia miocárdica crônica, bem como durante os 360 dias
subseqüentes, em relação ao grupo controle.
3.1.2.
Correlacionar os diferentes fenótipos celulares com a melhora relativa
das seguintes variáveis clínicas: escores de pontos dos questionários de
qualidade de vida (Minnessota e SF-36); FE e volumes sistólico e
diastólico finais (ecocardiograma pelo método de Simpson), pico de VO2
(teste ergométrico pelo protocolo de rampa); percentual de extra-sístoles
ventriculares (Holter de 24 horas); duração do QRS (ECG-AR);
reversibilidade total e %DPMR50; BNP, ao final de 2; 6 e 12 meses de
acompanhamento e FE (coronariografia com ventriculografia esquerda);
ELL e voltagem unipolar (mapeamento eletromecânico – NOGA) ao
final de 4 meses de seguimento.
3.2.Objetivos Secundários:
3.2.1.
Avaliação da capacidade funcional pela medida do pico de VO2, por
meio do teste ergométrico convencional (protocolo de rampa), antes e
nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o TACMMO em relação ao
grupo controle.
3.2.2.
Comparação da área de viabilidade miocárdica baseada na avaliação da
perfusão através da cintilografia miocárdica antes e nos seguimentos de
2; 6 e 12 meses após o TACMMO em relação ao grupo controle.
3.2.3.
Avaliação da função sistólica global do ventrículo esquerdo pelo
ecocardiograma e pela quantificação sérica dos níveis de BNP circulante
antes e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o implante do “pool”
total e CMMO, em relação ao grupo controle.
3.2.4.
Avaliação da melhora clinica através da quantificação dos sintomas
relacionados à isquemia miocárdica e insuficiência ventricular esquerda,
por meio da CCSC e NYHA de 2; 6 e 12 meses após o implante do
“pool” total de CMMO, em relação ao grupo controle.
3.2.5.
Avaliação dos índices de melhora da qualidade de vida através da
aplicação dos Questionários de Qualidade de Vida SF-36117 e
Minnessota,118, 119 antes e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o
implante do “pool” total de CMMO, em relação ao grupo controle.
- 16 -
4. METODOLOGIA
A metodologia deste estudo foi previamente relatada2 e encontra-se no Anexo II
desta dissertação. Segue abaixo, um breve sumário dos métodos utilizados neste
estudo.
4.1.Desenho do estudo
Estudo prospectivo, controlado, não randomizado e aberto.
4.2.Alocação/Avaliação/Acompanhamento dos pacientes
Vinte e um pacientes oriundos de serviços terciários de cardiologia, da rede de
assistência pública e privada, foram incluídos neste estudo prospectivo (os 14
primeiros pacientes, grupo tratado; os 7 últimos pacientes, grupo controle).
Inicialmente todos os indivíduos foram submetidos à avaliação clínica e laboratorial,
teste ergométrico, ecocardiograma, cintilografia miocárdica e Holter de 24 horas. As
CMMO foram isoladas, lavadas e diluídas em salina 0,9% para injeção
transendocárdica em áreas de miocárdio viável no grupo tratado, (15 injeções de 0,2
ml). Todos os pacientes foram reavaliados ao final de 2; 6 e 12 meses de
acompanhamento.
4.3.Critérios de Inclusão
4.3.1. Doença arterial coronariana crônica com defeito de perfusão
reversível detectado pela cintilografia miocárdica (SPECT);
4.3.2. FE do ventrículo esquerdo < 40%;
4.3.3. Inelegibilidade para revascularização miocárdica percutânea ou
cirúrgica, avaliada pela coronariografia;
4.3.4. Termo de consentimento livre e esclarecido assinado.
A inelegibilidade para os procedimentos de revascularização miocárdica
cirúrgica ou percutânea foi determinada por 2 comitês: um comitê cirúrgico composto
por 2 cirurgiões cardiovasculares e um cardiologista clínico, e um comitê
intervencionista formado por 2 cardiologistas intervencionistas e um cardiologista
clínico.
4.4.
Critérios de Exclusão
4.4.1.
Dificuldade em obter acesso vascular para procedimentos
percutâneos;
4.4.2.
História de neoplasia ou outra co-morbidade prévia ou
concomitante que pudesse ter impacto na sobrevida em curto
prazo deste paciente;
4.4.3.
Arritmias ventriculares malignas;
4.4.4.
Aneurisma do ventrículo esquerdo;
4.4.5.
Anormalidades laboratoriais inexplicadas;
4.4.6.
Tecido ósseo com aspecto radiológico anormal;
4.4.7.
Doença hematológica primária;
4.4.8.
IAM nos 3 meses prévios a inclusão no protocolo;
4.4.9.
Presença de trombo intraventricular;
4.4.10.
Instabilidade hemodinâmica no momento do procedimento;
4.4.11.
Fibrilação atrial;
4.4.12.
Qualquer condição que, no julgamento do investigador, pudesse
colocar o paciente em risco.
4.5.Eventos Adversos
Foram monitorados os eventos adversos maiores relacionados ao ato do
implante do material transplantado bem como à ação no organismo deste mesmo
material. Para tal finalidade os
pacientes foram submetidos aos seguintes exames
complementares seriados: ecocardiograma, eletrocardiograma e avaliação
laboratorial, além de Holter de 24 horas. Todos estes exames foram realizados na fase
intra-hospitalar, pós-procedimento de injeção e nos seguimentos de 2; 4; 6 e 12 meses.
4.5.1.
Eventos adversos maiores
Efeitos adversos maiores relacionados ao implante do material transplantado e
à ação deste material no organismo
_
Morte.
_
Ruptura miocárdica com necessidade de drenagem.
_
Formação de pseudo-aneurisma indicando ruptura miocárdica.
_
Arritmias ventriculares graves (taquicardia ventricular sustentada, fibrilação
ventricular).
- 18 -
_
Síndrome de resposta inflamatória sistêmica Tipo 4, de acordo com a
classificação de Gell e Coombs.120
_
Morbidade secundária ao desenvolvimento de tecidos não cardíacos.
_
Infarto Agudo do Miocárdio.
_
Acidente Vascular Cerebral por Embolia.
_
Necessidade de revascularização.
_
Hospitalização por angina e/ou insuficiência cardíaca.
4.5.2.
Eventos adversos menores
Eventos adversos menores provavelmente não relacionados ao implante do
material transplantado ou à ação deste material no organismo foram relatados em 2 dos
14 pacientes submetidos ao transplante de CMMO.2
Eventos adversos menores relacionados ao implante do material transplantado
e à ação deste material no organismo.
_
Derrame pericárdico que não necessite drenagem.
_
Arritmias ventriculares não consideradas graves (taquicardia ventricular não
sustentada, extrassístoles ventriculares).
_
Constatação de desenvolvimento de tecidos não cardíacos, porém sem
morbidade aparente ao paciente.
_
Síndrome de resposta inflamatória Tipos 1, 2 ou 3, de acordo com a
classificação de Gell e Coombs.120
_
Agravamento dos sintomas de angina ou insuficiência cardíaca, sem
necessidade de internação hospitalar.
4.5.3.
Efeitos adversos maiores e menores relacionados aos outros
procedimentos que compõem este protocolo
Todos os outros procedimentos realizados neste protocolo foram de uso clínico
rotineiro, com seus efeitos adversos bem determinados e aceitos pela sociedade.
4.6.Fase de Seleção
Os pacientes que preencheram os critérios de inclusão/exclusão e que assinaram
o termo de consentimento livre e esclarecido foram submetidos aos seguintes exames:
4.6.1.
Avaliação laboratorial de seleção do paciente para o protocolo de
pesquisa: coagulograma; hepatograma; lipidograma e sorologias para
hepatites B e C; HIV I e II e LUES (VDRL e FTAabs);
- 19 -
4.6.2.
Avaliação laboratorial completa incluindo hemograma completo com
contagem de plaquetas; dosagens de uréia, creatinina, glicose, sódio,
potássio, assim como Proteína C Reativa titulada (PCRt) e BNP (do
inglês Brain natriuretic peptide);
4.6.3.
Troponina I; CK-MB massa e PCRt dosados seriadamente, imediatamente
após e 6; 12; 24 e 48 horas após o procedimento de injeção;
4.6.4.
Holter de 24 horas;
4.6.5.
Teste ergométrico, pelo protocolo de rampa, com medida do consumo de
O2;
4.6.6.
Cintilografia Miocárdica (SPECT) com estresse farmacológico com
dipiridamol;
4.6.7.
Ecocardiograma transtorácico;
4.6.8.
Exame físico completo, incluindo exame neurológico detalhado, a fim de
estabelecer a condição clínica e neurológica inicial;
4.6.9.
Anamnese.
Todos os pacientes que foram incluídos no protocolo estavam há, pelo menos, 1
mês com o tratamento medicamentoso na dose máxima tolerada, no momento da
inclusão no protocolo.
4.7.Fase de Tratamento
Ao completar os testes da fase inicial, os 14 primeiros pacientes foram alocados
no grupo tratado e os 7 seguintes, no grupo controle.
O grupo controle não foi submetido ao aspirado de medula óssea bem como não
foi submetido aos procedimentos da fase de transplante, descritos abaixo:
O TACMMO foi constituído pela punção da medula óssea para retirada do
material medular, seguida do preparo do material para gerar o aspirado medular seletivo
e posterior implante na área miocárdica a ser tratada.
4.7.1.
Mielograma – Punção da Medula Óssea
Cerca de 4 horas antes da injeção, transendocárdica, de células mononucleares,
50 ml de aspirado da medula óssea foram obtidos da crista ilíaca posterior, dos
pacientes alocados no grupo tratado, sob anestesia local associada à sedação/analgesia.
4.7.2.
Preparo do Aspirado Medular Seletivo
As células mononucleares foram isoladas pelo gradiente de Ficoll-Paque Plus®
(Amersham Biosciences®), exaustivamente lavadas com salina heparinizada contendo
albumina humana 5%, e posteriormente filtradas através de uma peneira de nylon de
100 ìm para remover os agregados celulares. Uma pequena fração da suspensão de
células foi utilizada para citometria e avaliação da viabilidade celular pelo método de
exclusão, utilizando azul de trypan, com demonstração de viabilidade celular superior a
90% (96,2±4,9%), garantindo a qualidade da suspensão. 121-125
A caracterização dos marcadores de diferenciação leucocitária, por citometria de
fluxo, e a avaliação funcional também foram realizadas em uma fração das células
obtidas. A capacidade clonogênica dos progenitores hematopoiéticos foi avaliada pelas
unidades formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos, conforme previamente
descrito. 121-125 Culturas de bactérias e fungos das preparações de células clinicamente
utilizadas foram realizadas.
4.7.3.
Efeitos adversos
⇒ Reação ao anestésico empregado;
⇒ Fratura em ossos muito porosos ou com fibrose acentuada;
⇒ Osteomielite no local da punção;
⇒ Hemorragia local;
⇒ Penetração óssea com danos a estruturas subjacentes, particularmente em
esterno, em virtude de dispormos de cerca de 1cm de espessura na altura
do segundo interespaço desse osso no adulto.
4.7.4.
Período do Implante
⇒ Grupo Tratado
Os pacientes alocados no grupo tratado foram transferidos para o laboratório de
intervenção cardiovascular, cerca de 3 horas antes do início do procedimento, para
realização de coronariografia e ventriculografia esquerda seguida de mapeamento
eletromecânico, a fim de identificar áreas de miocárdio viável definidas como voltagem
unipolar preservada (> 6,9 mV) e atividade mecânica diminuída (ELL < 12%). As
injeções transendocárdicas, com o cateter NOGA MyoStar® Cordis, foram realizadas
em pontos com estas características.
Cada ponto de injeção foi cuidadosamente avaliado antes das injeções,
utilizando-se os seguintes critérios: 1) posição perpendicular do cateter na parede do
ventrículo esquerdo; 2) excelente estabilidade do cateter (“Loop Stability” < 4mm) e 3)
presença de extra-sístole ventricular à exteriorização da agulha no miocárdio. Foram
realizadas 15 injeções de 0,2ml cada (1 milhão de CMMO/0,1ml).
⇒ Grupo Controle
Os pacientes do grupo controle foram submetidos à mesma avaliação da fase
inicial, excetuando-se os procedimentos invasivos (coronariografia e mapeamento
eletromecânico, aspiração da medula óssea e injeção das células mononucleares no
miocárdio).
Para comparação, foram realizados os mesmos exames laboratoriais de controle
pós-procedimento, descritos acima para o grupo tratado, além de um Holter de 24 horas.
4.8.Fase de seguimento
Após o procedimento, todos os pacientes foram submetidos à avaliação
laboratorial incluindo hemograma completo, dosagem sérica de uréia, creatinina e
PCRt. Os pacientes receberam alta hospitalar 48 horas após o procedimento, na ausência
de eventos adversos.
No momento da alta hospitalar, os pacientes foram orientados quanto à
possibilidade de sinais ou sintomas de síndrome infecciosa. Eles deviam verificar a
temperatura axilar diariamente, durante as duas primeiras semanas e reportar qualquer
alteração ao investigador. O acompanhamento médico foi feito em 1, 2, 4, 6, e 8
semanas após o procedimento, e em seguida mensalmente até o final de 6 meses. Uma
última consulta clínica foi realizada ao final de 12 meses de seguimento. Durante as
consultas, foi realizado um exame neurológico detalhado a fim de avaliar possíveis
tromboembolismos cerebrais. Avaliação laboratorial completa, idêntica àquela realizada
na fase inicial, incluindo dosagens de PCRt e BNP foi repetida em 2; 6 e 12 meses após
a realização do procedimento.
Os pacientes fizeram Holter de 24 horas antes do procedimento, nas 24 horas
pós-procedimento de injeção e em 2; 6 e 12 meses após, a fim de detectar possível
arritmia ventricular ou distúrbio de condução.
ECG-AR também foi realizado antes do procedimento e nos seguimentos
subseqüentes, de 2 e 6 meses após o procedimento de injeção.
A avaliação precoce da função do VE foi realizada imediatamente após o
procedimento, em 2, 4, 6 e 8 semanas, e em 4; 6 e 12 meses, através de
ecocardiograma, com o intuito de se detectar possíveis efeitos das células na
integridade miocárdica, assim como detectar derrame pericárdico/pericardite.
Avaliação da função ventricular através das medidas da FE e dos volumes cavitários
do VE (método de Simpson) foi realizada antes do procedimento e nos seguimentos
de 2; 6 e 12 meses após o procedimento de injeção.
O pico de VO2 foi determinado por teste ergométrico (protocolo de rampa)
antes do procedimento de injeção e após 2; 6 e 12 meses.
A cintilografia miocárdica foi repetida em 2; 6 e 12 meses. O
acompanhamento invasivo, incluindo coronariografia; ventriculografia esquerda e
mapeamento eletromecânico (NOGA MyoStar Cordis), foi repetido 4 meses após o
procedimento.
A avaliação da qualidade de vida (QDV) foi feita através dos questionários SF36 (36-Item Short-Form Health Survey Questionaire) e Minnesota (Minnesota Living
With Heart Failure Questionnaire) em 2; 6 e 12 meses após o procedimento de injeção.
4.9.Análise dos Dados
Um comitê de segurança foi estabelecido para a revisão dos dados. Os exames
de cintilografia miocárdica, ecocardiograma, Holter, teste ergométrico e coronariografia
foram analisados de forma independente por examinadores experientes.
4.10.Análise Estatística
As diferenças nas características demográficas, entre os grupos, foram avaliadas
através do teste qui-quadrado. Teste exato de Fisher, teste T e teste de Mann-Whitney
foram utilizados para as variáveis discretas, contínuas com distribuição simétrica e
contínuas com distribuição assimétrica, respectivamente. A comparação das mudanças
ocorridas entre a fase inicial e o seguimento de 2; 6 e 12 meses no grupo tratado e no
grupo controle foi feita através do teste ANOVA para medidas repetidas. A avaliação
das mudanças ocorridas ao longo do seguimento de 6 e de 12 meses do grupo tratado
em relação ao grupo controle foi feita através do modelo ANOVA para medidas
repetidas, incluindo a interação entre os dois grupos, com análise Pos hoc de KruskalWallis para variáveis não paramétricas e para variáveis contínuas com distribuição
assimétrica. Análise Pos hoc com correção de Bonferroni foi realizada para variáveis
contínuas, com distribuição normal. Um valor de p<0.05 foi considerado
estatisticamente significativo.
A correlação dos fenótipos celulares com as variáveis contínuas com
distribuição assimétrica, obtidas a partir das variáveis clínicas analisadas, foi realizada
através da correlação para variáveis não paramétricas, rho de Spearman. Para esta
correlação foram utilizados os valores iniciais das variáveis selecionadas e o percentual
de variação de tais variáveis com relação ao valor inicial. Portanto, utilizou-se a
seguinte fórmula:
I Para variáveis cuja relação com melhora se faz por aumento progressivo dos
seus valores utilizou-se: (Valor em 4 meses – Valor Inicial)*100 / Valor Inicial
ex.: FE; ELL; Voltagem Unipolar; Pico de VO2; escore de pontos SF-36
II Para variáveis cuja relação com melhora se faz pela diminuição progressiva
dos seus valores utilizou-se: (Valor Inicial – Valor em 4 meses)*100 / Valor
Inicial
ex.: VDF; VSF; RT; %DPMR50; BNP; % ESV; dQRS; escore de pontos
Minnessota
4.11. Cronograma do Estudo
Procedimentos
Inicial
Intra-Hospitalar - Pós Seguimento
Procedimento
semanal
0h 6h 12h 24h 48h 1ª
Avaliação Clínica
X
X
X
Avaliação Laboratorial
Completa*
X
X
X
CK-massa; Troponina I
X
X
X
PCRt
X
X
X
Avaliação laboratorial
de Seleção
X
ECG
X
ECG-AR
X
Holter de 24 horas
X
X
Ecocardiograma**
X
X
SPECT***
X
Teste Ergométrico
X
Coronariografia e
Ventriculografia
Mapeamento
Eletromecânico
Avaliação de Qualidade
de Vida
X
X
X
X
Total de
Proced
Seguimento Mensal
2a
4a
1º
2º
3o
4o
5o
X
X
X
X
X
X
X
6o 12º
X
X
X
13
X
X
6
6
X
X
X
6
1
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
16
X
X
X
X
X
5
X
X
13
X
X
X
4
X
X
X
4
X
X
X
X
3
X
X
2
X
X
2
X
X
*Hemograma completo; glicose; ureia; creatinina; sódio; potássio. BNP (do inglês, Brain Natriuretic Peptide) foi dosado
somente antes do procedimento de injeção e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o procedimento.
**O Ecocardiograma uni e bidimensional com Doppler foi realizado em todas as consultas de seguimento com o objetivo
de se detectar possíveis eventos tais como pericardite ou derrame pericárdico provocados ou pelo procedimento de
injeção ou pela ação do material medular transplantado. A quantificação da função ventricular através da medida da FE e
dos volumes cavitários pelo método de Simpson, para fins deste estudo, foi realizada apenas 2; 6 e 12 meses após o
procedimento de injeção.
***SPECT, do inglês Single Photon Emission Computed Tomography.
X
X
4
5. EXPLICITAÇÃO DE COMO OS
ASPECTOS ÉTICOS FORAM
CONTEMPLADOS
5.1.
Dos aspectos de bioética
Todas as ações deste protocolo foram norteadas pelas regulamentações
vigentes no território nacional, seguindo as normas da resolução 196/96 do
Conselho Nacional de Saúde / Ministério da Saúde, sob a coordenação da
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Estes projetos foram amplamente
discutidos pela Comissão Científica e pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital Pró-Cardíaco. Foram posteriormente aprovados pela Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) sob o registro 2613.
5.2.
Consentimento pós-informação
Todos os pacientes foram completamente informados sobre o conteúdo
da pesquisa conforme previsto na resolução 196/96 do Conselho Nacional de
Saúde / Ministério da Saúde. Duas cópias do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido foram, portanto, lidas e assinadas pelo paciente, o qual recebeu uma
das vias do mesmo.
5.3.
Comitês de Gerenciamento do Estudo
O estudo foi gerenciado por uma série de comitês que compuseram o
corpo executivo. Cada um destes comitês foi responsável por uma dimensão do
estudo, interagindo entre si com a finalidade de garantir alto padrão de qualidade
científica e acordo com os princípios de bioética vigentes. As funções,
composição e especificação de cada um dos comitês encontram-se no Anexo I
desta dissertação.
6. RESULTADOS FINAIS
Os resultados deste primeiro braço do projeto de pesquisa foram
publicados1, 2, 126, 127 e encontram-se disponíveis nos Anexos II, III e IV desta
dissertação.
De modo sucinto podemos ressaltar que não foi identificado nenhum
efeito adverso grave relacionado ao procedimento proposto, objetivo primário do
estudo. Não foram identificados quaisquer dados sugestivos de lesão muscular
significativa secundária às injeções, bem como, não houve desenvolvimento de
nenhum tecido estranho aos tecidos que compõem a estrutura cardíaca. Não
foram identificadas arritmias ventriculares graves importantes, nem reação
inflamatória secundária ao transplante.
Ao contrário, os pacientes do grupo tratado evoluíram com melhora dos
sintomas anginosos, bem como daqueles relacionados à insuficiência cardíaca.
No teste ergométrico a melhora do desempenho dos pacientes foi significativa, o
que não foi observado no grupo controle, que se manteve estável durante o
período de seguimento. Quando submetidos a uma análise quantitativa,
realizada pela cintilografia miocárdica, houve uma redução da carga isquêmica
de 15% para cerca de 5% da área do ventrículo esquerdo. Esta melhora de
perfusão resultou numa melhor atividade sistólica do ventrículo esquerdo com
melhora da FE. Todas estas alterações não foram observadas no grupo controle.
Não houve diferenças quanto às características clínicas entre os grupos.
Os pacientes foram tratados de acordo com a diretriz brasileira de cardiologia
para o tratamento de insuficiência cardíaca.128 Todos os pacientes utilizaram
inibidores da enzima conversora de angiotensinogênio (IECA) ou inibidores do
receptor de angiotensina. Setenta e um por cento dos pacientes do grupo tratado
e 50% dos pacientes do grupo controle estavam em uso de betabloqueadores.
Não houve diferença no uso de nitratos, IECA, beta bloqueadores ou diuréticos
nos 6 meses de seguimento.1
As características da população celular estão descritas na tabela 1. Foram
injetadas 40.6 ± 12.51 x 106 CMMO / paciente. A viabilidade celular foi acima
de 95% (96.2±4.97%), garantindo a qualidade da suspensão de células. As
culturas de fungos e bactérias foram negativas.
O tempo total do procedimento de injeção foi de 81 ± 19 minutos. Os
mapas eletromecânicos contaram com 92 ± 16 pontos.
Tabela 1 – Análise quantitativa dos diferentes fenótipos celulares, do "pool" total de células
mononucleares da medula óssea injetadas.
População Celular e Fenótipo
Percentual de
Células Injetadas
(%)
No de Células
Injetadas (x 106)
100%
96,4 ± 4,97
40,60 ± 12,51
39,03 ± 11,92
Densidade
de Células
Injetadas*
No Cel x 103 /
mm2
29,57 ± 18,07
27,99 ± 15,64
2,59 ± 1,31
0,98 ± 0,580
0,77 ± 0,78
0,10 ± 0,05
0,040 ± 0,018
0,28 ± 0,02
0,26 ± 0,28
0,105 ± 0,131
0,12 ± 0,17
Células Mononucleares da Medula Óssea
Células Mononucleares da Medula Óssea Viáveis
Células Progenitoras Hematopoiéticas
(CD45loCD34+)
Células Progenitoras Hematopoiéticas Precoces
(CD45loCD34+HLA-DR-)
+
-
Células Progenitoras Hematopoiéticas (ckit CD45 )
Células Progenitoras Hematopoiéticas
(CD45loCD34+CD19-)
1,93 ± 1,03
0,71 ± 0,413
0,45 ± 0,30
+
+
+
+
28,4 ± 10,8
11,2 ± 6,510
7,32 ± 3,42
+
+
+
+
Células T CD8 (CD45 CD3 CD8 )
14,9 ± 5,97
5,76 ± 2,860
4,11 ± 2,63
+
11,28 ± 4,88
4,29 ± 1,980
3,15 ± 2,27
9,97 ± 4,04
4,34 ± 1,760
3,02 ± 1,75
1,15 ± 0,53
Percentual de
colônias
0,55 ± 0,290
No. Colônias
(%)
(Unidades)
0,016 ± 0,02
7,78 ± 10,09
0,36 ± 0,21
No. Colônias
Injetadas
Unidades /
mm2
0,0055 ±
0,0071
2,2 ± 1,5
719,57 ± 385
0,57 ± 0,55
Células T CD4 (CD45 CD3 CD4 )
+
Células B (CD45 CD19 )
+
+
Monócitos (CD45 CD14 )
+
+
Células NK (CD45 CD56 )
Avaliação Funcional
UFC-F (Unidade Formadora de Colônia de
Fibroblastos)
UFC-GM (Unidade Formadora de Colônia de
Granulócitos e Macrófagos)
* Área de Injeção = 1778 ± 1144 mm2 e Número de Injeções = 14,86 ± 1,96
Não houve complicações maiores relacionadas ao procedimento. Um
paciente apresentou um episódio transitório de congestão pulmonar que foi
tratado com diuréticos e dobutamina. Nenhuma arritmia sustentada foi
observada durante o procedimento. Não foi detectado caso algum de derrame
pericárdico nos exames seriados de ecocardiografia realizados nas 48 horas após
o procedimento. Todos os pacientes tiveram alta hospitalar 48 horas após o
procedimento de injeção conforme previsto no protocolo.
Um paciente do grupo controle morreu 2 semanas após a entrada no
estudo, por morte súbita, e não foi incluído na análise. Um paciente do grupo
tratado morreu na 14a semana de seguimento, por morte súbita precedida por
precordialgia de forte intensidade. Os familiares recusaram a necrópsia. Porém
um segundo paciente do grupo tratado faleceu 11 meses após o implante, devido
a um AVE hemorrágico, sendo este submetido à autópsia.127 Os resultados do
estudo histopatológico, do coração deste paciente, foram publicados e
encontram-se disponíveis no anexo V desta dissertação.
Os pacientes do grupo tratado apresentaram menos sintomas de
insuficiência cardíaca, pela classificação NYHA, e angina, pela CCSC, após 12
meses de seguimento, quando comparados ao grupo controle (p = 0,01 e 0,002,
respectivamente).
Não houve incidência de arritmias ventriculares graves na análise pelo
Holter de 24 horas realizado nas 24 horas imediatamente após o procedimento e
nos seguimentos de 2 e 6 meses. Houve uma tendência à redução no número de
extra-sístoles ventriculares de 4.445±8.512/24h para 941±1.244/24h (p = 0,08)
mantendo este padrão até o 6o mês de seguimento. O percentual de extrasístoles ventriculares variou não significativamente de 3,8±6,8% para 0,9±1,14%
em 2 meses e para 0,95±1,28% em 6 meses.
No acompanhamento de 12 meses, dentre todos os valores laboratoriais,
somente os níveis séricos de creatinina variaram entre o grupo controle e o grupo
tratado. Os níveis séricos de creatinina aumentaram significativamente no grupo
controle, quando comparados ao grupo tratado (p = 0,04). Os níveis de PCRt na
avaliação inicial e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses não apresentaram
diferença significativa entre os 2 grupos (p = 0,4). Houve aumento dos níveis
séricos de BNP no grupo controle em relação ao grupo tratado, no seguimento
de 6 meses (p = 0,003)1, com uma tendência a manutenção deste resultado ao
final de 12 meses (p = 0,08).
Na avaliação inicial a geometria ventricular diferiu significativamente
entre os grupos. O grupo controle apresentou volumes sistólico e diastólico
finais menores (p < 0,001) assim como uma FE inicial maior (p = 0,054).2 No
entanto, no seguimento de 6 meses a FE diminuiu de forma significativa no
grupo controle (p = 0,05), o que não aconteceu no grupo tratado. Os volumes
cavitários se mantiveram inalterados em ambos os grupos.1 Esta diferença
significativa entre os grupos não foi mais observada ao final de 12 meses de
seguimento (Anexo III).
O pico de VO2 foi semelhante entre os 2 grupos na avaliação inicial e
ocorreu aumento significativo após 2 meses de seguimento, no grupo tratado (de
17,96±8,78 para 23,40±8,30, p = 0,01), que se manteve aos 6 meses
(24,20±7,50; p = 0,05) e aos 12 meses de seguimento (25,1±8,7; p = 0,03), em
relação ao grupo controle (Anexo III).
O tamanho do TDPMR (isquemia) e o %DPMR50 (cicatriz) foram
semelhantes entre os grupos na avaliação inicial. Não houve variação do
%DPMR50 em 2; 6 ou 12 meses, em ambos os grupos. No grupo tratado houve
redução absoluta, significativa, de 10% do TDPMR (p = 0,022) ao final de 2
meses (redução relativa de 73%) diferindo de forma significativa em relação ao
grupo controle. Ao final de 6 meses, esta redução absoluta da área isquêmica
perdeu 4% do seu impacto inical, porém, mantendo uma redução absoluta (em
relação à avaliação inicial) de 6%, bem como uma diferença significativa em
relação ao grupo controle (p = 0,05).1 Esta melhora da área isquêmica foi
mantida ao final de 1 ano de seguimento (p =0,01), apesar de uma piora
progressiva, lenta, observada a partir do 6º mês de acompanhamento (Anexo III).
O conjunto de melhoras relatadas se refletiu na qualidade de vida
relacionada à saúde, de forma que tanto no questionário SF-36, quanto no
Questionário de Minnesota (específico para sintomas de insuficiência cardíaca),
demonstrou-se melhora significativa nos respectivos índices, durante o período
de seguimento.
Foi possível, portanto, observar uma melhora expressiva da QDV,
baseada no escore total de pontos do questionário de Minnessota, variando de
46,5±18,7% para 29,7±17,4; 19,2±15,5 e 23,9±17%, no grupo tratado e de
49,7±23 para 42,9±21; 64,6±19,7 e 51,6±28,5, no grupo controle, ao final de 2;
6 e 12 meses de seguimento, respectivamente (p = 0,04). O mesmo padrão
evolutivo foi observado com o escore resumido de pontos do questionário de
qualidade de vida SF-36, variando de 50,3±21 para 69,2±18,5; 75,7±19,3 e
72,9±24,6 no grupo tratado e de 47,9±23,8 para 56,6±25; 35,2±18,4 e 50,2±24,4
no grupo controle, ao final de 2; 6 e 12 meses de seguimento, respectivamente (p
= 0,02). Estes dados estão representados graficamente nas figuras 1 e 2,
respectivamente.
A área de distribuição das CMMO se correlacionou negativamente com a
melhora relativa do ELL, 4 meses após o procedimento de injeção. Os resultados
da correlação, do percentual total e da densidade de células mononucleares
injetadas, com as variáveis clínicas selecionadas estão descritos nas tabelas de 2
a 14.
O perfil do fenótipo celular entre os pacientes que mantiveram melhora
sustentada da isquemia ao final de 1 ano e os pacientes que não apresentaram a
mesma evolução favorável, foi significativamente diferente e está representado
na na figura 3 e tabela 15. Estes dois grupos foram clinicamente semelhantes
(tabela 16).
A melhora sustentada da isquemia foi definida como diminuição da área
de isquemia em pelo menos 4 pontos percentuais ao final de 1 ano, em relação
ao valor inicial.
Figura 3 – Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível,
avaliada pela cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT) ao
longo do seguimento de 1 ano, nos pacientes submetidos ao
TACMMO**.
Paciente 1
Total de Defeito Miocárdico Reversível
Paciente 3
45
Paciente 4
40
Paciente 5
35
Paciente 6
30
%
Paciente 2
Paciente 7
25
Paciente 8
20
....
15
Paciente 10
10
Paciente 11
5
Paciente 12
0
Inicial
2 meses
6 meses
1 ano
Paciente 13
Paciente 14
*As linhas em vermelho representam os pacientes que não apresentaram melhora sustentada da isquemia
ao longo de 1 ano de seguimento após o TACMMO. As linhas em azul representam os pacientes que
mantiveram melhora sustentada da isquemia ao longo de 1 ano de seguimento.
**TACMMO: Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula Óssea.
Tabela 2 – Correlação do percentual, total e densidade de células viáveis com o percentual de melhora
relativa das variáveis clínicas analisadas
Variáveis Clínicas
% de melhora relativa
% ESV 2 meses
ELL 4 meses
Volt U 4 meses
Isquemia* 6 meses
Fibrose** 6 meses
BNP 6 meses
Pico de VO2 6 meses
Fibrose 1 ano
% de células viáveis
rho de Spearman (p)
ns
ns
0,52 (0,03)
0,6 (0,04)
0,64 (0,03)
0,72 (0,01)
Num de células viáveis
rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
0,7 (<0,01)
ns
ns
Densidade de células viáveis
rho de Spearman (p)
0,66 (0,02)
0,54 (0,02)
ns
ns
ns
ns
ns
0,75 (<0,01)
ns
ns
0,60 (0,03)
ns
ESV: Extra-sístoles ventriculares; ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); BNP do inglês
Brain Natriuretic Peptide; ns: não significativo (p > 0,05)
* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).
** Fibrose avaliada pelo Percentual de Defeito de Perfusão Miocárdica em Repouso, com atividade de 50%, na cintilografia
miocárdica de perfusão (SPECT).
Tabela 3 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células CD45lo com o percentual
de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas
% melhora relativa
dQRS 6 meses
% de CD34+CD45lo
rho de Spearman (p)
0,49 (0,06)
Num de CD34+CD45lo
rho de Spearman (p)
0,56 (0,04)
Densidade de CD34+CD45lo
rho de Spearman (p)
ns
dQRS: duração do QRS
Tabela 4 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células HLADR- com o
percentual de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas
% melhora relativa
dQRS 2 meses
dQRS 6 meses
Isquemia* 1 ano
% de CD34+HLADRrho de Spearman (p)
ns
0,58 (0,04)
0,62 (0,05)
Num CD34+HLADRrho de Spearman (p)
0,64 (0,03)
ns
ns
Densidade de CD34+HLADRrho de Spearman (p)
ns
ns
0,54 (0,05)
dQRS: duração do QRS; ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 5 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células ckit +CD45- com o
% melhora relativa
Pico de VO2 2 meses
Isquemia* 2 meses
VDF 1 ano
VSF 1 ano
% ckit+CD45rho de Spearman (p)
Num de ckit+CD45rho de Spearman (p)
Densidade de ckit+CD45rho de Spearman (p)
0,90 (0,04)
ns
0,90 (0,04)
ns
0,8 (0,05)
0,98 (<0,01)
0,8 (0,05)
0,90 (0,04)
0,8 (0,05)
Ns
Ns
0,9 (0,04)
VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 6 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células TCD4+ com o percentual
% melhora relativa
VSF 2 meses
VDF 2 meses
ELL 4 meses
Volt U 4 meses
Isquemia 6 meses
Pico de VO2 6 meses
Isquemia* 1 ano
Fibrose** 1 ano
% de CTCD4+
rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
0,48 (0,05)
ns
Num de CTCD4+
rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
0,75 (<0,01)
(-0,78 (<0,01))
Densidade de CTCD4+
rho de Spearman (p)
(-0,56 (<0,04))
(-0,45 (<0,05))
0,65 (0,02)
ns
ns
ns
ns
0,68 (0,02)
ns
(-0,61 (<0,05))
0,85 (<0,01)
0,67 (0,01)
ns
ns
VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ELL: Encurtamento Linear Local
(NOGA); Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)
** Fibrose avaliada pelo Percentual de Defeito de Perfusão Miocárdica em Repouso, com atividade de 50%, na cintilografia
miocárdica de perfusão (SPECT).
Tabela 7 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células TCD8+ com o percentual
% melhora relativa
VSF 2 meses
VDF 2 meses
% ESV 2 meses
dQRS 2 meses
ELL 4 meses
VSF 6 meses
% de CTCD8+
rho de Spearman (p)
(-0,6 (0,02))
(-0,54 (0,04)
ns
ns
ns
ns
Num de CTCD8+
rho de Spearman (p)
(-0,6 (0,02)
(-0,52 (0,05)
ns
(-0,56 (0,05)
0,56 (0,05)
(-0,66 (0,02)
Densidade de CTCD8+
rho de Spearman (p)
(-0,64 (0,01))
(-0,51 (0,03))
0,59 (0,04)
(-0,48 (0,05))
0,78 (<0,01)
(-0,55 (0,04)
Pico de VO2 6 meses
0,6 (0,03)
ns
0,84 (<0,01)
Pico de VO2 1 ano
0,54 (0,03)
ns
0,62 (0,03)
VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ESV: Extra-sístoles
ventriculares; dQRS: duração do QRS; ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 8 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células CD19+ com o percentual
% melhora relativa
ELL 4 meses
Isquemia 1 ano
% de CD19+
rho de Spearman (p)
ns
ns
Num de CD19+
rho de Spearman (p)
ns
0,69 (0,03)
Densidade de CD19+
rho de Spearman (p)
0,53 (0,04)
ns
ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)
% melhora relativa
BNP 2 meses
VDF 6 meses
% de CD14+
rho de Spearman (p)
ns
0,58 (0,04)
Num de CD14+
rho de Spearman (p)
ns
ns
Densidade de CD14+
rho de Spearman (p)
0,63 (0,03)
ns
BNP, do inglês Brain Natriuretic Peptide; VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)
% melhora relativa
dQRS 2 meses
Volt U 4 meses
ELL 4 meses
Isquemia* 6 meses
Minnessota 6 meses
SF-36 6 meses
Minnessota 1 ano
SF-36 1 ano
% de CD56+
rho de Spearman (p)
-0,57 (0,05)
ns
ns
-0,82 (0,02)
-0,71 (0,05)
-0,64 (0,04)
-0,76 (0,03)
-0,69 (0,06)
Num de CD56+
rho de Spearman (p)
ns
0,7 (0,04)
-0,58 (0,05)
-0,80 (0,02)
-0,71 (0,05)
-0,64 (0,04)
-0,76 (0,03)
-0,69 (0,06)
Densidade de CD56+
rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
dQRS: duração do QRS; Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); SF-36: questionário de
qualidade de vida SF-36; ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 11 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CD19- com o percentual
% melhora relativa
%ESV 2 meses
BNP 2 meses
FE 4 meses
Volt U 4 meses
Isquemia 6 meses
VSF 6 meses
Isquemia* 1 ano
Pico de VO2 1 ano
% de CD34+CD19rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
Num de CD34+CD19rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
0,86 (0,01)
-0,74 (0,06)
ns
-0,74 (0,06)
ns
Densidade de CD34+CD19rho de Spearman (p)
0,71 (0,04)
0,9 (0,04)
-0,82 (0,02)
ns
ns
-0,75 (0,05)
ns
0,75 (0,05)
ESV: Extra-sístoles ventriculares; BNP, do inglês Brain Natriuretic Peptide; FE: Fração de Ejeção (angiografia); Volt U: Voltagem
Unipolar (NOGA); VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 12 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CFU-GM com o
% melhora relativa
dQRS 2 meses
dQRS 6 meses
% CFU-GM
rho de Spearman (p)
ns
ns
Num de CFU-GM
rho de Spearman (p)
0,65 (0,02)
0,56 (0,04)
Densidade de CFU-GM
rho de Spearman (p)
ns
ns
dQRS: duração do QRS; ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 13 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CFU-F com o
% melhora relativa
VSF 2 meses
VDF 2 meses
Minnessota 2 meses
VDF 1 ano
% CFU-F
rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
ns
Num de CFU-F
rho de Spearman (p)
0,43 (0,06)
0,55 (0,03)
0,87 (<0,01)
0,66 (0,04)
Densidade de CFU-F
rho de Spearman (p)
ns
ns
ns
0,59 (0,037)
VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 14 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CD34+ com o
% melhora relativa
Isquemia* 2 meses
dQRS 2 meses
FE 4 meses
Volt U 4 meses
% CD34+
rho de Spearman (p)
ns
0,52 (0,08)
ns
ns
Num de CD34+
rho de Spearman (p)
0,75 (0,05)
0,52 (0,08)
Ns
0,77 (0,036)
Densidade de CD34+
rho de Spearman (p)
0,75 (0,05)
ns
0,94 (0,005)
ns
dQRS: duração do QRS; FE: Fração de Ejeção (angiografia); Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)
Tabela 15 – Diferenças no fenótipo celular entre os pacientes que apresentaram, ou não,
melhora sustentada da isquemia miocárdica, avaliada pelo TDPMR (cintilografia miocárdica
de perfusão - SPECT) ao final de 1 ano de seguimento
Área de injeção
% de Células CD34+HLA-DRNum de CT CD4+
Num de CT CD8+
Num de Células CD19+
Num de UFC-GM
Densidade de CD34+HLA-DRDensidade de UFC-GM
Sem Melhora
Sustentada da
Isquemia ao Final de 1
ano
N=7
Média ± DP
2345± 1374
0,08 ± 0,05
14,7 ± 7,36
7,29 ± 3,05
5,71 ± 1,24
487 ± 184
0,01 ± 0,01
0,23 ± 0,06
Melhora Sustentada
da Isquemia ao Final
de 1 ano
N=7
Média ± DP
1270 ± 440
0,12 ± 0,03
7,77 ± 3,11
4,23 ± 1,72
3,07 ± 1,67
952 ± 402
0,05 ± 0,02
0,91 ± 0,61
p
Mann-Whitney
0.073
0.05
0.05
0.07
0.014
0.03
0.002
0.001
TDPMR: Percentual do Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível pela cintilografia miocárdica; DP: Desvio Padrão
Tabela 16 - Características clínicas entre os pacientes que apresentaram, ou não, melhora
sustentada da isquemia miocárdica, avaliada pelo TDPMR (cintilografia miocárdica de
perfusão - SPECT) ao final de 1 ano de seguimento
Melhora
P (Mannsustentada da
N Media
DP
Whitney)
isquemia
Idade
Não
7
61,00
10,39
Sim
7
52,86
7,84
0,125
FE (ventriculografia esquerda)
Não
6
18,33
9,83
Sim
7
21,43
9,08
0,474
Não
6
5,05
4,71
Sim
7
4,44
2,57
0,775
Voltagem unipolar (NOGA)
Não
6
10,03
2,01
Sim
7
10,36
3,71
0,886
TDPMR (Cintilografia de perfusão) Não
6
11,33
15,03
Sim
7
18,86
14,70
0,562
DPMR50% (Cintilografia de
Não
6
40,00
10,02
perfusão)
Sim
7
41,43
12,77
0,565
Pico de VO2_Inicial
Não
7
16,91
9,27
Sim
7
19,00
8,83
0,565
FE (ecocardiograma)
Não
7
28,00
4,69
Sim
7
32,00
5,97
0,249
VSF (ecocardiograma)
Não
7
145,14
37,84
Sim
7
148,43
68,96
0,749
VDF (ecocardiograma)
Não
7
201,14
46,56
Sim
7
221,57
101,98
0,949
BNP
Não
6
210,50
209,85
Sim
5
450,80
496,60
0,361
% ESV
Não
7
1,11
1,81
Sim
5
7,64
9,54
0,167
Duração do QT
Não
7
61,88
14,40
Sim
7
70,67
26,31
0,406
Duração do QRS
Não
7
139,29
25,00
Sim
6
136,17
18,87
0,836
Escore de pontos resumido do
Não
6
47,63
22,27
SF36
Sim
7
52,60
21,55
0,474
Escore de pontos do questionário Não
6
51,33
22,84
de Minnessota
Sim
7
42,29
14,83
0,283
DP: desvio padrão; FE: fração de ejeção; ELL: encurtamento linear local; TDPMR: percentual total de
defeito de perfusão miocárdica reversível; DPMR50%: defeito de perfusão miocárdica em repouso com
atividade de 50%; VSF: volume sistólico final; VDF: volume diastólico final; BNP: do inglês Brain
Natriuretic Peptide; ESV: extra-sístole ventricular.
ELL (NOGA)
7. DISCUSSÃO
7.1.
Segurança e Exeqüibilidade
Os resultados deste estudo sugerem que o transplante autólogo de células
mononucleares da medula óssea através de injeções transendocárdicas, em
pacientes com grave disfunção ventricular, é uma técnica segura e exeqüível,
tanto em curto prazo 2 quanto em sua evolução de 12 meses.3
Diversos estudos clínicos vêm demonstrando a segurança e a
exeqüibilidade deste procedimento em pacientes com cardiopatia isquêmica
grave,28, 49-52, 56, 58 levantando, cada vez mais, a possibilidade de uma nova opção
de tratamento para esta população de pacientes, até o presente, considerada “fora
de possibilidade terapêutica”.
Apesar dos avanços obtidos na última década, na área de ciência básica,
com relação a esta nova modalidade terapêutica, diversas questões permanecem
sem resposta. Pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes a esta maquinaria
celular, através dos quais a terapia com células da medula óssea pode resultar em
melhora cardíaca efetiva. Quatro questões merecem atenção imediata:
1. Qual é ou quais são os tipos ideais de células para que haja recuperação
funcional efetiva? Em havendo, esta recuperação funcional está relacionada à
regeneração miocárdica ou de outros componentes do tecido cardíaco
(interstício, sistema de condução, sistema vascular, etc)?
2. Qual é o número ideal de células que deve ser utilizado para este tipo de
terapia?
3. Qual deve ser a concentração ideal de células por volume de solução que deve
ser aplicada em cada ponto de injeção transendocárdica?
4. Qual deve ser o número máximo de injeções por tratamento?
A resposta a tais perguntas é fonte de intensa investigação em todo o
mundo e talvez possa ser encontrada dentro dos capítulos de angiogênese;
cardiomiogênese; entendimento do papel das células da medula óssea injetadas e
seus diferentes fenótipos celulares e suas correlações com as variáveis clínicas
estudadas.
7.2.
Angiogênese
Estudos em modelos pré-clínicos embasam a possibilidade de
neovascularização de tecidos isquêmicos com o transplante de CMMO.
Observou-se em ratos que as células da medula óssea são capazes de gerar
- 41 -
angiogênese, demonstrado por dados funcionais e histopatológicos.129 Outros
grupos obtiveram resultados semelhantes, incluindo Fuchs et al 28 e Kawamoto
et al90 que estudaram porcos com isquemia miocárdica crônica induzida por
implante de constritores na coronária, e que, a seguir, foram submetidos ao
transplante de CMMO. Os animais foram submetidos à análise histopatológica
1 mês após o procedimento. Os autores observaram melhora da perfusão
miocárdica relacionada ao desenvolvimento de novos vasos.28, 90
Os resultados deste estudo demonstram que houve melhora significativa
da perfusão e do ELL, pelo mapeamento eletromecânico, na área de miocárdio
tratada, assim como melhora da FE e do VSF do ventrículo esquerdo, sem
melhora do VDF.1-3 Tais achados sugerem um melhor desempenho contrátil das
áreas viáveis e não o surgimento de novas áreas viáveis. Uma vez que as células
foram injetadas somente em áreas de miocárdio isquêmico, é razoável imaginar
que aquele meio (micro) ambiente oferecesse forte sinalização angiogênica para
as células transplantadas, como, por exemplo, pela presença do Fator de Hipóxia
Tecidual (HIF-1, do inglês “hipoxia inducible factor”) gerando Fator de
Crescimento Vascular Endotelial (VEGF, do inglês “vascular endothelial
growth factor”).
Portanto, neste estudo, a melhora da perfusão miocárdica observada nas
áreas de miocárdio tratadas com CMMO, pode ter como um de seus mecanismos
a angiogênese.
7.3.
Cardiomiogênese
A idéia de que o coração é um órgão sem capacidade de autoregeneração tem sido posta em cheque por estudos recentes que demonstraram
um grande número de cardiomiócitos em mitose em corações adultos.130-132
Autópsia de corações de pacientes falecidos por insuficiência cardíaca
demonstrou que a proporção de miócitos em mitose é baixa, 0,015% a 0,08%,
mas deixou evidente que existe uma proliferação de cardiomiócitos em corações
adultos, embora, ineficiente para um mecanismo de reparo tecidual efetivo.130, 131
A origem destas células em processo de divisão, no miocárdio, também é
incerta. Entretanto, a possibilidade de que estas células em divisão sejam de
origem extracardíaca é sugerida por estudos de pacientes submetidos a
transplantes heterólogos de doadores do sexo oposto.
A biópsia de corações femininos em receptores do sexo masculino
evidenciou cardiomiócitos com cromossoma Y.69, 130, 133 Dado que tais células
podem se diferenciar em tecido cardíaco, duas origens potenciais têm sido
sugeridas: na primeira, as células teriam origem na medula óssea, de onde elas
seriam liberadas em baixas taxas num processo de regeneração contínua ou em
resposta a uma lesão aguda; na segunda hipótese, estas células representariam
uma população de células-tronco residentes cardíacas.
O isolamento de células lin-ckit + e Sca1+ de tecido cardíaco,131, 134
fortaleceu a última hipótese, no entanto, de acordo com evidências mais
recentes, as duas hipóteses parecem ser verdadeiras. Oh et al também relataram
a existência de células progenitoras residentes cardíacas.135 Diferente das células
- 42 -
lin-ckit +Sca1+ de Beltrami et al,134 estas células são lin-ckit -Sca1+. Células-tronco
residentes cardíacas também foram isoladas de pacientes submetidos à cirurgia
de troca de valva aórtica estenosada. Análise do material de miomectomia do
trato de saída do VE, demonstrou grupos de células lin-ckit +Sca1+, coexpressando marcadores de cardiomiócitos GATA-4 e MEF2 (do inglês,
myocyte-specific enhancer factor 2), sugerindo a existência de células-tronco
residentes cardíacas em processo de transição para cardiomiócito.136 Estudos
posteriores a partir de tecido cardíaco humano corroboram não só a existência
dessas células, mas também a capacidade das mesmas de adotarem o fenótipo de
cardiomiócito maduro in vivo137 e in vitro138, na ausência de fusão celular.
Embora as células residentes cardíacas não expressem marcadores de
superfície de linhagem endotelial ou hematopoiética, existe a possibilidade de
que tais células possam ser derivadas da medula óssea.27, 65, 69, 134, 135
Células da medula óssea lin-, ou seja, que não expressam marcadores de
diferenciação na superfície, mas ckit +, ou seja, que expressam SCF-1 (do inglês,
stem cell factor), quando injetadas diretamente no músculo cardíaco, melhoram
a função sistólica do VE.41 Além disso, através de técnicas de
imunofluorescência foi possível demonstrar que estas células primitivas,
derivadas da medula óssea, durante o processo de diferenciação passam a
expressar marcadores de cardiomiócitos, sugerindo que tais células são capazes
de regenerar a musculatura cardíaca. Tais achados foram confirmados por
estudos subseqüentes.38, 134, 139
Entretanto, outras técnicas também demonstraram que existe um
processo de fusão das células da medula óssea com as células locais e que esta
fusão poderia justificar a expressão dos marcadores de cardiomiócitos pelas
células da medula óssea, trazendo a tona o fato de que o processo de
transdiferenciação talvez possa ser mais limitado do que o demonstrado pelos
estudos iniciais.135, 140-144 Dois outros estudos, publicados mais recentemente,26,
145
que utilizaram técnicas genéticas para marcação celular ao invés de
imunofluorescência, corroboraram esta teoria e trouxeram uma outra linha de
raciocínio relacionada a melhora da função cardíaca observada no estudo de
Orlic et al,41, 139, 146 talvez justificada pela formação de novos vasos com
conseqüente aumento do aporte sanguíneo, ao invés de transdiferenciação em
cardiomiócitos.26, 145
Embora os resultados clínicos preliminares em pacientes com IAM,
recente
e crônico,56 sugiram uma redução na área de fibrose
após terapia com células mononucleares de medula óssea por via
intracoronariana, os dados de angiografia, cintilografia e mapeamento
eletromecânico deste estudo sugerem melhora da função contrátil do ventrículo
esquerdo secundária a angiogênese e não cardiomiogênese.1-3 Além do fato
destes pacientes não terem apresentado melhora do defeito em repouso, na
cintilografia, bem como da voltagem unipolar, pelo mapeamento
eletromecânico, o que sugeriria um possível efeito miogênico, houve melhora
significativa da perfusão e do ELL, pelo mapeamento eletromecânico, na área de
miocárdio tratada, assim como melhora da FE e do VSF do ventrículo esquerdo,
sem melhora do VDF.1-3 Tais achados sugerem um melhor desempenho contrátil
das áreas viáveis e não o surgimento de novas áreas viáveis.
35, 36, 53, 54, 57, 104, 111
Além disso, o estudo histopatológico do nono paciente deste estudo, que
evoluiu para o óbito 11 meses após o procedimento de injeção, demonstrou um
aumento da densidade capilar na área de implante associada a uma hipertrofia da
parede vascular com hiperplasia de pericitos, células murais e da adventícia.
Algumas destas células adquiriram estruturas do citoesqueleto, dos
cardiomiócitos, e proteínas contráteis.49, 51, 111 É possível, portanto, que a
melhora clínica observada nestes pacientes, já no segundo mês de
acompanhamento, se deva a um processo de angiogênese mais do que de
cardiomiogênese. Tal suposição está em concordância com os resultados dos
estudos pré-clínicos.147 É também possível que a interação das CMMO com
células-tronco residentes cardíacas, demontradas em estudos recentes,137, 138
possa ser responsável pelo surgimento tardio (11 meses após o procedimento de
injeção) de células miofibroblastoides, com características de cadiomiócitos.
Cardiomiogênese, portanto, pode ser um evento tardio no processo de reparo do
tecido miocárdico lesado. Sua demonstração neste estudo não foi possível
provavelmente porque as CMMO foram primariamente injetadas em áreas de
miocárdio hibernante. O estudo histopatológico do coração deste paciente,
entretanto, demonstrou que existem células móveis na área de fibrose, e que
estas células parecem “caminhar” no sentido da árvore de distribuição vascular,
resultante de um processo angiogênico em meio à fibrose.
7.4.
Fenótipos celulares e correlação com as variáveis clínicas analisadas
Pouco se sabe sobre como as células da medula óssea melhoram a função
cardíaca ou quais são os fenótipos celulares envolvidos. As evidências sugerem
que existe um processo de neoformação vascular, neoformação de
cardiomiócitos e um efeito parácrino. As evidências também sugerem que a
quantidade de cardiomiócitos novos produzidos pelo processo de regeneração é
incapaz de, por si só, explicar os efeitos clínicos observados.
A maioria dos estudos clínicos publicados até o momento, de fase I/II,
tem utilizado o “pool” total de células mononucleares da medula óssea e alguns
poucos estudos, populações específicas de células mesenquimais, CPE, CD34+
ou AC133+.41, 112, 139, 146 As células mononucleares da medula óssea contêm uma
variedade de células progenitoras, incluindo as células-tronco hematopoiéticas;
as células satélites ou pericitos e as células mesenquimais ou células do estroma
da medula óssea. As células-tronco hematopoiéticas expressam os antígenos de
superfície CD34+ ou CD133+ em seres humanos e compõem, normalmente,
cerca de 1-2% do total de células mononucleares da medula óssea em adultos
normais.41, 139, 146 A população de pacientes deste estudo, que foi submetida ao
aspirado de medula óssea, apresentou 3,8±2% de células CD34+ do total de
células mononucleares. De forma bastante interessante tais células, quando
analisadas em conjunto, não apresentaram qualquer correlação significativa com
as variáveis clínicas analisadas, porém quando a mesma análise foi feita de
forma individualizada as células CD34+CD45lo, célula progenitoras
hematopoiéticas, e as células CD34+HLADR-, ditas células progenitoras
hematopoiéticas precoces, apresentaram correlação significativa com a duração
do QRS medida ao final de 2 e 6 meses de seguimento, respectivamente. Além
disso, as células progenitoras hematopoiéticas precoces (CD34+HLADR-)
- 44 -
apresentaram correlação significativa com a melhora da isquemia miocárdica,
avaliada pela cintilografia miocárdica, ao final de 1 ano de seguimento.
As células ckit +CD45-, que são as células lin- com expressão do receptor
do SCF-1, se correlacionaram com a diminuição dos volumes cavitários do
ventrículo esquerdo ao final de 1 ano, corroborando com a teoria de que tais
células podem influenciar no remodelamento reverso do miocárdio.148 Além
desse possível papel tardio, tais células também apresentaram uma correlação
positiva, significativa, com a melhora da capacidade funcional e da isquemia
miocárdica ao final de 2 meses de seguimento.
O receptor ckit é um membro da família tirosina cinase de receptores e é
ativado pelo SCF/kit ligante. A ativação deste receptor resulta em múltiplas vias
de sinalização envolvendo mobilização celular, proliferação celular e
antiapoptose.149-151 Células da medula óssea lin-ckit + atuam sobre diversas
populações celulares alvos, tais como células-tronco e progenitoras
hematopoiéticas, mastócitos e células Natural Killer. Ayach et al152 demonstrou
que o transplante de células da medula óssea lin-ckit+ em camundongos resultou
em melhora da função cardíaca, diminuição da apoptose, aumento da
angiogênese, aumento da mobilização de células da medula óssea e aumento da
atividade das células Natural Killer precocemente após IAM.152 Entretanto,
neste estudo, as células Natural Killer (células CD56+), com atividade
citotóxica, apresentaram correlação negativa com a maioria das variáveis
analisadas (duração do QRS; ELL; Isquemia e escores de qualidade de vida).
São necessários estudos posteriores para que se possa esclarecer o significado
deste achado.
Atividade parácrina “antiapoptótica” resultante da sinalização promovida
pelos receptores cKit ativados, tem sido atribuída à regulação positiva da via de
sinalização AKT, citoprotetora, nas células-alvo.151, 153 A ativação de tal via
pode explicar a maior sobrevida de células endoteliais e miócitos, observada no
estudo de Ayach et al.152 Infiltração de células da medula óssea mobilizadas ou
células residentes, cKit +, podem ter contribuído para esta atividade parácrina.
Resultados semelhantes foram observados após injeção de células-tronco
mesenquimais em área de miocárdio infartado, com redução do tamanho do
infarto.154 Cerca de 70% das células CD34+, derivadas da medula óssea, são
cKit + e este fato talvez justifique a relação destas células com o processo de
neovascularização.47, 155, 156
Quando se observou o comportamento das células linfocíticas, CD4+ e
CD8+, resultados controversos foram obtidos. Houve correlação negativa com
algumas variáveis analisadas (volumes cavitários ao final de 2 e 6 meses e
isquemia ao final de 6 meses e 1 ano) e correlação positiva com outras (ELL e
Voltagem Unipolar ao final de 4 meses, assim como melhora da área de cicatriz
miocárdica e capacidade de exercício ao final de 6 meses e 1 ano). É interessante
notar que as células T CD8+ são predominantemente citotóxicas, enquanto que
as células T CD4+ podem ser subdividas em dois subgrupos celulares de células
T helper, Th1 e Th2. As células CD4+ Th1 secretam interferon-ã e ativam
macrófagos, dirigindo, portanto, uma resposta imunoinflamatória. São as células
implicadas em algumas doenças auto-imunes, incluindo-se a miocardite autoimune. As células Th2 secretam predominantemente, e em grande quantidade,
interleucina antiinflamatória (IL-10) e, em pequena quantidade, interleucinas
inflamatórias (IL-2; IL-4; IL-5; e TGF-â) sendo, portanto, consideradas c élulas
imunomoduladoras. Alguns grupos consideram que tais células também
estimulam as células endoteliais a secretarem VEGF, através de sinalizações
utilizando CD40, em reposta a isquemia.28, 49-52, 58
As células CD19-, ou seja, todas as células mononucleares da população
de células injetadas, com exceção das células B, também se correlacionaram de
forma ambígua com tais variáveis clínicas, fortalecendo a hipótese de que
existem células que talvez participem desse processo de reparo retardando-o, e
de que existem outras células, que talvez devam ter a concentração aumentada,
que participam desse processo ampliando-o.
Os linfócitos B (células CD19+) se correlacionaram positivamente com o
ELL ao final de 4 meses e com a melhora da isquemia ao final de 1 ano de
seguimento, sugerindo um efeito parácrino de tais células sobre o processo de
regeneração do miocárdio, precoce e tardio.
Os monócitos (células CD14+), de forma interessante, correlacionaram-se
positivamente com a melhora dos níveis séricos de BNP ao final de 2 meses e
com a diminuição do VDF do VE ao final de 6 meses, também corroborando a
hipótese de que talvez haja uma possível interação parácrina destas células com
o processo de reparo tissular. Os monócitos (células CD14+) são importantes
mediadores da resposta inflamatória durante a arteriogênese e são células
secretoras de uma larga variedade de citoquinas tais como VEGF, MCP-1, FGF1 e FGF-2, além de também secretarem óxido nítrico. São, portanto, células
importantes no processo de angiogênese e reparo tissular.59
As unidades formadoras de colônia de fibroblastos (CFU-F), que
grosseiramente representam as células mesenquimais, se correlacionaram
positivamente com a melhora dos volumes cavitários e dos sintomas de
insuficiência cardíaca ao final de 2 meses de seguimento. Uma correlação
positiva entre a densidade dessas células e o VDF, ao final de 1 ano de
seguimento também foi observado. Estes resultados são corroborados por
diversos estudos, clínicos e pré-clínicos, que têm utilizado células
mesenquimais, expandidas em cultura, para regeneração miocárdica,
demonstrando melhora da função contrátil do VE.157 Da mesma forma, as
unidades formadoras de granulócitos (CFU-GM), também se correlacionaram
positivamente com diversas variáveis clínicas analisadas, sugerindo que tais
células talvez possam participar desse processo de regeneração tissular por
atividade parácrina. As CFU-GM são precursoras das células CD34+ e, portanto,
esta correlação positiva e significativa pode ter sido o resultado de uma
correlação indireta com estas células progenitoras.
De forma bastante interessante não houve correlação de nenhum dos
fenótipos avaliados com aumento do número de extra-sístoles ventriculares até
um ano de seguimento, mais uma vez corroborando os dados clínicos publicados
até o momento de que não houve indução de arritmia maligna em nenhum dos
pacientes estudados.158
7.5. O número de injeções, a concentração da solução contendo células da medula
óssea e a área de distribuição destas células no miocárdio isquêmico: estão
adequados?
Em resposta as perguntas 2; 3 e 4, o número de injeções ventriculares se
correlacionou de forma negativa com as variáveis que medem função
ventricular, sugerindo que apesar do pequeno calibre da agulha de injeção
transendocárdica e do pequeno volume de solução injetada (0,2 ml) por ponto, o
número excessivo de injeções ventriculares pode promover mais agressão
miocárdica do que reparo. Tal afirmativa é corroborada pelo fato de que em um
subgrupo de 5 pacientes, com características semelhantes a estes, onde foi
injetado 5,9 ± 1,6 ml de solução, contendo 120,4 ± 24 milhões de CMMO,
distribuída em 29 ± 7,8 pontos de injeção, não houve melhora do ELL ou da
voltagem unipolar no seguimento de 4 meses, assim como das outras variáveis
relacionadas à função ventricular (dados não publicados).
Beers et al recentemente apresentaram, no congresso “American Heart
Association” de 2005, os resutados do transplante transendocárdico de 100
milhões de CMMO distribuídas na área de miocárdio isquêmico, através de 11 ±
2 injeções, em uma série de 22 pacientes, com cardiopatia isquêmica terminal e
angina refratária.159 Estes autores demonstraram além de melhora dos sintomas
de angina, aumento significativo da FE e redução do VSF do ventrículo
esquerdo, com manutenção do VDF, ao final de 3 meses de seguimento. Estes
resultados são semelhantes ao que foi demonstrado no seguimento de 2 meses
deste estudo.
Nesta série de 5 pacientes, relatada acima, que foi submetida ao
tratamento com um número de CMMO, semelhante ao do estudo de Beers et al,
distribuídas não em 11 ± 2, (ou 14,8 ± 2 injeções como neste estudo), mas em 29
± 7,8 pontos de injeção, em uma área de miocárdio de 4.317 ± 1.433 mm2 (2,43
vezes maior que a área de distribuição das células, neste estudo), tal efeito
significativo não foi observado (dados não publicados). Nestes 5 pacientes, o
percentual de defeito reversível na cintilografia variou de 23,8% ± 39% para
22,6% ± 29% e o percentual de defeito de captação em repouso variou de 36,4%
± 13% para 34,8% ± 14% no seguimento de 2 meses. A FE variou de 35,5% ±
15% para 35,5% ± 13%; o ELL variou de 6,7% ± 3,2% para 7,7% ± 1,8% e a
voltagem unipolar variou de 7,7 mV ± 1,3 mV para 7,5 mV ± 1,7 mV no
seguimento de 4 meses. Tais dados levantam a suposição de que talvez a
concentração da solução de 1 milhão de células para cada 0,1 ml de solução
salina, utilizada pela maioria dos trials clínicos, deva ser aumentada e o número
de injeções limitado a no máximo 20, por procedimento de transplante. Neste
estudo a densidade das células CD34+ apresentou forte correlação com a
melhora da função sistólica do ventrículo esquerdo, fortalecendo a hipótese de
que a concentração de células na solução para injeção deve ser aumentada.
O tamanho da área de injeção também se correlacionou negativamente
com algumas variáveis clínicas. É interessante observar que quando se
comparam os pacientes que apresentaram melhora sustentada da isquemia ao
final de 1 ano de seguimento, com aqueles, dentro do grupo de 14 pacientes, que
não tiveram a mesma evolução favorável, algumas diferenças foram observadas.
Embora o número total de células injetadas nos dois grupos tenha sido
semelhante, assim como a área de isquemia pela cintilografia, no grupo que não
apresentou melhora sustentada da isquemia observou-se uma maior área (mm2)
de distribuição das injeções (2.345 ± 1.374 x 1.270 ± 440; p = 0,07). No grupo
que manteve melhora sustentada da isquemia ao final de 1 ano de seguimento,
observou-se uma população de células mononucleares significativamente, e
coincidentemente, mais enriquecida com células CD34+HLADR- (p=0,05) e
menos enriquecida com céluas CD4+; CD8+ e CD19+ (p < 0,05).
É incontestável o fato de que diversas células da medula óssea exercem
seus efeitos através de mecanismos parácrinos e de que existe um complexo
mecanismo de interação, contato e liberação de sinais entre as células do estroma
da medula óssea e as outras populações celulares, incluindo-se a das células
progenitoras hematopoiéticas. Angiogênese e arteriogênese são processos
complexos que envolvem a participação de múltiplas células e múltiplas
citoquinas. Estas citoquinas agem de forma coordenada pelo tempo, pela
concentração e pela presença de outras citoquinas, através ou de sinergismo ou
de efeito inibitório. Terapia celular utilizando células precursoras em número e
concentrações apropriadas, que secretem tais citoquinas ou sinalizadores de
forma fisiológica, é um objetivo a ser atingido no futuro próximo. Ação
parácrina é o principal mecanismo de ação considerado atualmente. Além disso,
a possibilidade de ativação das células-tronco locais deve ser considerada.
7.6. Limitações
Embora o pequeno número de pacientes e o desenho aberto do estudo
possam justificar diferenças estatísticas observadas na comparação de algumas
variáveis (efeito “Hawthorne”), os dados apresentados sugerem que os
resultados demonstrados podem ser secundários à melhora da perfusão
miocárdica.
Numa população de poucos pacientes com múltiplas variáveis em
análise, há uma probabilidade aumentada de erro tipo á e tipo â nos testes de
correlação linear. Além disso, apesar de termos observado correlações
significativas, positivas e negativas, com algumas variáveis clínicas analisadas,
coincidentemente, seguindo um padrão coerente com os mecanismos conhecidos
de funcionamento dessas células, não é possível inferir qualquer relação causaefeito entre os diferentes fenótipos celulares estudados e as variações clínicas
observadas, o que fortaleceria a hipótese de efeitos parácrinos como principal
mecanismo de ação dessas células.
O pequeno número de pacientes também impediu uma análise estatística
mais acurada, incluindo análise multivariada, que pudesse identificar os perfis
celulares que se correlacionassem de forma independente com as variáveis
clínicas estudadas.
Portanto, não é possível inferir qualquer mecanismo de atuação celular
com base nos dados expostos, uma vez que uma correlação linear significativa
não implica em relação “causa-efeito”. Entretanto, seguindo um raciocínio
coerente com a lógica da biologia de tais células, é possível levantar a hipótese
de que talvez a injeção de células mononucleares negativamente selecionadas,
para as células CD56+; CD19+; CD4+ e CD8+ e enriquecidas com a população de
células aderentes e células CD34+, possam promover um resultado clínico ainda
mais favorável tanto em curto quanto em longo prazo.
8. CONCLUSÕES
8.1. Neste estudo inicial prospectivo, não randomizado, em pacientes com doença
arterial coronária, com grave disfunção ventricular e sem outra opção de
tratamento, não foram observados efeitos adversos graves relacionados ao
procedimento, seja na fase de internação, seja no seguimento de 12 meses.
Neste período de acompanhamento não foi observado deterioração dos
parâmetros mecânicos e de perfusão nas áreas injetadas, assim como não foi
observado qualquer sinal de disfunção do sistema de condução. Um paciente do
grupo tratado faleceu por morte súbita, 14 semanas após o procedimento de
injeção e um segundo paciente, do grupo tratado, faleceu por AVC hemorrágico,
11 meses após o procedimento. Os dois óbitos foram considerados não
relacionados ao procedimento de injeção ou a ação do material medular no
organismo. Houve 1 óbito, por morte súbita, no grupo controle.
8.2.As células viáveis e os fenótipos CD45lo, HLADR-, ckit+CD45-, CD14+,
CD19+, CD34+, CFU-F e CFU-GM se correlacionaram positivamente com a
melhora de algumas variáveis clínicas analisadas, enquanto que as células
CD56+ se correlacionaram negativamente. As células CD4+, CD8+ e CD19- se
correlacionaram de forma ambígua com tais variáveis.
8.3.Houve aumento significativo da medida do pico de VO2 no grupo tratado em
relação ao grupo controle, 2 meses após o TACMMO. Este resultado foi
mantido até 1 ano de acompanhamento.
8.4.Observou-se melhora da isquemia miocárdica no grupo tratado em relação ao
grupo controle, 2 meses após o TACMMO. Esta melhora significativa foi
mantida até 1 ano de acompanhamento, apesar de uma lenta e progressiva piora
da isquemia, observada a partir do 6º mês de seguimento.
8.5.Observou-se melhora significativa da FE do ventrículo esquerdo no grupo
tratado em relação ao grupo controle, no 2º e 6º mês de acompanhamento. Esta
melhora significativa não se sustentou até 1 ano de seguimento. Houve, da
mesma forma, elevação significativa dos níveis séricos de BNP no grupo
controle em relação ao tratado no 2º e 6º mês de acompanhamento. Entretanto,
esta diferença entre os grupos não foi mais observada ao final de 12 meses de
seguimento.
8.6.Os pacientes do grupo submetido ao TACMMO evoluíram com melhora
sustentada dos sintomas de angina e insuficiência cardíaca ao longo dos 12
meses de seguimento, em relação ao grupo controle.
8.7.Observou-se melhora sustentada dos índices dos Questionários de Qualidade de
Vida SF-36 e Minnessota, nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o
procedimento de implante do “pool” total de CMMO, no grupo tratado em
relação ao grupo controle.
9. CONCLUSÃO FINAL
Este estudo demonstra a exeqüibilidade e a segurança da realização de
injeções transendocárdicas de CMMO em pacientes com cardiopatia isquêmica
associada a grave disfunção ventricular. Os efeitos observados em curto prazo
foram mantidos até 12 meses de seguimento.
Houve correlação significativa dos fenótipos celulares com as variáveis
clínicas analisadas, sendo que as células viáveis e os fenótipos CD45lo, HLADR, ckit +CD45-, CD14+, CD19+, CD34+, CFU-F e CFU-GM se correlacionaram
positivamente com tais variáveis, enquanto que as células CD56+ se
correlacionaram negativamente. As células CD4+, CD8+ e CD19- se
correlacionaram de forma ambígua com as variáveis clínicas analisadas. É
possível que haja um efeito parácrino, em longo prazo, das células injetadas, mas
as funções específicas de tais células, no processo de reparo tissular, ainda
precisam ser elucidadas.
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enhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinical
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159. Wickstrom G, Bendix T. The "Hawthorne effect"--what did the original
Hawthorne studies actually show? Scand J Work Environ Health. Aug 2000;26(4):363367.
ANEXOS
Anexo I - Gerenciamento e Financiamento do Estudo
Anexo II – Trabalho publicado na Revista Circulation Abril 2003
Anexo III – Trabalho publicado na Revista Circulation Setembro 2004
Anexo IV – Trabalho publicado na Revista Arquivos Brasileiros de Cardiologia Maio
2005
Anexo V – Trabalho publicado na Revista Circulation Julho 2005
- 64 –
Anexos
ANEXO I - Gerenciamento e Financiamento do Estudo
O estudo foi gerenciado por uma série de comitês que compuseram o corpo
executivo. Cada um destes comitês foi responsável por uma dimensão do estudo,
interagindo entre si, com a finalidade de garantir alto padrão de qualidade científica e
acordo com os princípios de bioética vigentes.
As funções, composições e
especificações, de cada um dos comitês, estão descritas abaixo.
A 1.1 - COMITÊ COORDENADOR
INTEGRANTES: Dr. Hans Fernando Rocha Dohmann, Dr. Radovan Borojevic, Dr.
Antônio Carlos Carvalho, Dra. Suzana Alves Silva, Dr. Hans Jurgen F Dohmann.
Responsável pela coordenação das ações previstas no protocolo de pesquisa.
Supervisionou os diversos comitês e garantiu a interação entre eles para a execução
adequada de suas atribuições. Também foi responsável pela análise dos dados
fornecidos pelo Comitê de Assessoria em Exames Complementares que gerou os
resultados deste estudo.
A 1.2 - COMITÊ ADMINISTRATIVO
INTEGRANTES: Dr. Francisco Eduardo Guimarães Ferreira, Dr. Evandro Ruas, Dr.
Paulo Alves.
Responsável pelo gerenciamento das ações administrativas que garantiram a
execução do protocolo. Garantiu a contratação de serviços quando necessário, a
disponibilização de dados administrativos, bem como qualquer relação jurídica que se
fizesse necessária por relação com este protocolo.
A 1.3 - COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
INTEGRANTES: Dra. Lúcia Pimenta, Dr. Alfredo Potsch, Enf. Ana Lúcia Cascardo.
Responsável pelo cumprimento das ações previstas neste protocolo sob o ponto
de vista da qualidade da metodologia de pesquisa, bem como dos princípios de bioética.
Relacionou-se com a Comissão Nacional de Ética em Pesquisa garantindo a execução
da regulamentação nacional vigente. Recebeu os dados clínicos do Comitê de
Gerenciamento dos Casos a fim de filtrar qualquer informação, ou falta de, que
pudessem ter algum comprometimento ético aos pacientes.
A 1.4 - COMITÊ DE SEGURANÇA
- 65 –
Anexos
INTEGRANTES: Dr. Roberto Esporcatte, Dr. Ricardo Mourille, Dr. Evandro Tinoco
Mesquita, Dr. Luis Antônio Campos, Dr. Antonio Cláudio Nóbrega.
Este Comitê foi responsável por participar da elaboração do protocolo de
pesquisa, pontuar, discutir e considerar todos os aspectos de segurança dos pacientes
relacionados ao protocolo de pesquisa; também foi responsável por monitorar os dados
do estudo e decidir, com autonomia, a continuidade ou não do mesmo; receberam os
resultados dos exames complementares fornecidos pelo Comitê de Assessoria em
Exames Complementares para análise crítica dos resultados e posterior
encaminhamento ao Comitê de Ética em Pesquisa.
Foi Responsável por analisar eventuais casos de óbito, classificando-os.
Este comitë foi notificado pelos investigadores principais de todos os eventos e
intercorrências no decorrer do estudo e foi responsável por acompanhar o
desdobramento dos mesmos.
A 1.5 - COMITÊ DE INTERVENÇÃO CARDIOVASCULAR
INTEGRANTES: Dr. Emerson Perin, Dr. André Luiz Silveira Sousa, Dr. João
Alexandre Assad, Dr. Rodrigo Verney Castelo Branco, Dr. Carlos Henrique
Falcão, Dr. Nelson F. Durval Gomes de Mattos, Dr. Luis Antônio Carvalho, Dr.
Constantino Gonzales Salgado, Dr. André da Fonseca Feijó.
Responsável pelas ações clínicas que envolveram as intervenções cardiovasculares
percutâneas, aí incluídos os transplantes de células por via intracoronariana e os estudos
hemodinâmicos, bem como qualquer intervenção terapêutica que se fizesse necessária
em eventuais complicações dos pacientes.
A 1.6 - COMITÊ DE GERENCIAMENTO DOS CASOS
INTEGRANTES: Auxiliar Administrativo Ana Guimarães; Rita Weiler e Enf.
Patrícia.
Responsável pelo acompanhamento dos pacientes desde a sua internação.
Deviam garantir o recolhimento dos dados de internação, bem como da fase póshospitalar. Tinham por objetivo detectar precocemente qualquer complicação advinda
do estudo.
A 1.7 - COMITÊ DE ARRITMIAS
INTEGRANTES: Dr. Ivan Maia, Dr. Roberto Sá.
Responsável pela detecção, identificação e manuseio de arritmias cardíacas nos
pacientes que participarem deste protocolo.
- 66 –
Anexos
A 1.8 - COMITÊ CLÍNICO
INTEGRANTES: Dra. Suzana Alves da Silva e Dr. Fernando Oswaldo Dias Rangel.
Responsável pelo acompanhamento clínico dos pacientes e por analisar eventuais
casos de óbito, classificando-os.
A 1.9 - COMITÊ DE SELEÇÃO
INTEGRANTES: Dra Suzana Alves da Silva.
Os pacientes candidatos ao estudo foram selecionados para participarem do
protocolo de pesquisa caso não tivessem qualquer outra possibilidade de
revascularização miocárdica, percutânea ou cirúrgica. Esta decisão se baseou: primeiro,
na avaliação do filme de cateterismo, realizado dentro do prazo de no máximo 12 meses
prévios a seleção; segundo, na presença de sintomas de angina e/ou insuficiência
cardíaca congestiva apesar de tratamento medicamento pleno; terceiro, na detecção de
FE do VE < 50% no ecocardiograma ou ventriculografia. Uma vez selecionados para o
protocolo, o filme de cateterismo foi apresentado ao Comitê de Parecer para
Inclusão/Exclusão do paciente no protocolo de pesquisa.
A 1.10 - COMITÊ DE PARECER PARA INCLUSÃO / EXCLUSÃO
INTEGRANTES: Dr. Edson Nunes, Dr. Celso Garcia, Dr. Marco Aurélio Fernandes,
Dr. Luís Antonio Campos, Dr. Pedro Nogueira, Dr. André Luiz Silveira Sousa, Dr.
João Alexandre Assad, Dr. Rodrigo Verney, Dr. André Feijó, Dr. Carlos Falcão,
Dr. Nelson Mattos, Dr. Luis Antonio Carvalho, Dra. Suzana Alves Silva, Dr. Hans
Dohmann, Dr. Fernando Oswaldo Dias Rangel.
Este comitê foi composto por especialistas em cardiologia, clínica e
intervencionista, e por especialistas em cirurgia cardíaca. Foi responsável pelo parecer
que definiu se a anatomia coronariana do paciente era passível de revascularização ou
não. Cada paciente selecionado para o protocolo de pesquisa, pelo Comitê de Seleção,
teve seus exames complementares e filme de caterismo avaliados por uma equipe do
Laboratório de Intervenção Cardiovascular e por uma outra equipe da Unidade de PósOperatório, ambas do Hospital Pró-Cardíaco. A equipe do Laboratório de Intervenção
Cardiovascular foi composta por 1 cardiologista clínico e 2 intervencionistas. A equipe
da Unidade de Pós-Operatório foi composta por 1 cardiologista clínico e 2 cirurgiões
cardíacos, de referência do Hospital Pró-Cardíaco. Cada avaliação foi dada na forma de
parecer.
A 1.11 - COMITÊ DE CIRURGIA CARDÍACA
INTEGRANTES: Dr. Edson Nunes, Dr. Celso Garcia.
Responsável por qualquer parecer ou ação cirúrgica que se fizesse necessária na
vigência de eventual complicação.
- 67 –
Anexos
A 1.12 - COMITÊ DE ASSESSORIA EM EXAMES COMPLEMENTARES
INTEGRANTES: Dr. Cláudio Tinoco Mesquita, Dr. Luciano Belém, Dr. Arnaldo
Rabischoffisky, Dr. Fernanda Belloni Nogueira, Dr. Julio Tolentino, Dr. Ricardo
Viváqua, Dr. Amarino C. Oliveira Junior, Dr. André Sousa, Dr. João Alexandre
Assad e Dr. Rodrigo Verney Castelo Branco.
Este Comitê foi composto por especialistas nos exames complementares descritos
neste protocolo. Foi responsável pela qualidade metodológica dos exames e pela
avaliação dos resultados de forma independente. Cada um destes assessores foi
responsável pelo encaminhamento dos resultados ao Comitê de Segurança, que, após a
respectiva análise, encaminhou os dados para o Comitê de Ética em Pesquisa. Após os
dados terem sido analisados criticamente por ambos os Comitês, o Comitê Coordenador
pode proceder com as análises que geraram os resultados deste estudo.
A 1.13 - ASSESSORIA ONCOLÓGICA
INTEGRANTE: Dr. Carlos Andrade.
Responsável por todas as ações que envolveram oncologia clínica,seja na fase de
seleção, seja em qualquer parecer que se fizesse necessário nas demais fases.
A 1.14 - COMITÊ DE AVALIAÇÃO PSICOLÓGICA E DE QUALIDADE DE VIDA
INTEGRANTE: Psicóloga Christine Rutherford.
Responsável pelo acompanhamento e avaliação psicológica e da qualidade de
vida dos pacientes.
A 1.15 - COMITÊ DE MANIPULAÇÃO CELULAR
INTEGRANTE: Dra Maria Izabel Doria Rossi, Dr. Hélio Dutra.
Responsável pelas ações que envolveram o manuseio, assim como o preparo do
material aspirado da MO para obtenção da solução a ser transplantada.
A 1.16 COMITÊ DE ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
INTEGRANTE: Dra Christina Maeda Takyia, Dr. Radovan Borojevic.
Responsável pelas ações que envolveram a análise histopatológica do paciente
submetido à autópsia.
- 68 –
Anexos
A 1.17 FINANCIAMENTO DO ESTUDO
O estudo foi financiado pelo Hospital Pró-Cardíaco. Os cateteres NOGA de
injeção foram doados pela Cordis® Corporation, Johnson & Johnson company.
- 69 –
Anexos
ANEXO II
Trabalho publicado na Revista Circulation Abril 2003
- 70 –
Anexos
Circulation. 2003 May 13;107(18):2294-302. Epub 2003 Apr 21.
Comment in:
•
Circulation. 2003 May 13;107(18):e9040-2.
Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for
severe, chronic ischemic heart failure.
Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, Mesquita CT, Rossi MI,
Carvalho AC, Dutra HS, Dohmann HJ, Silva GV, Belem L, Vivacqua R, Rangel FO,
Esporcatte R, Geng YJ, Vaughn WK, Assad JA, Mesquita ET, Willerson JT.
Texas Heart Institute at St Luke's Episcopal Hospital, Houston, Tex, USA. [email protected]
BACKGROUND: This study evaluated the hypothesis that transendocardial injections of
autologous mononuclear bone marrow cells in patients with end-stage ischemic heart disease
could safely promote neovascularization and improve perfusion and myocardial contractility.
METHODS AND RESULTS: Twenty-one patients were enrolled in this prospective,
nonrandomized, open-label study (first 14 patients, treatment; last 7 patients, control). Baseline
evaluations included complete clinical and laboratory evaluations, exercise stress (ramp
treadmill), 2D Doppler echocardiogram, single-photon emission computed tomography
perfusion scan, and 24-hour Holter monitoring. Bone marrow mononuclear cells were harvested,
isolated, washed, and resuspended in saline for injection by NOGA catheter (15 injections of 0.2
cc). Electromechanical mapping was used to identify viable myocardium (unipolar voltage > or
=6.9 mV) for treatment. Treated and control patients underwent 2-month noninvasive follow-up,
and treated patients alone underwent a 4-month invasive follow-up according to standard
protocols and with the same procedures used as at baseline. Patient population demographics and
exercise test variables did not differ significantly between the treatment and control groups; only
serum creatinine and brain natriuretic peptide levels varied in laboratory evaluations at followup, being relatively higher in control patients. At 2 months, there was a significant reduction in
total reversible defect and improvement in global left ventricular function within the treatment
group and between the treatment and control groups (P=0.02) on quantitative single-photon
emission computed tomography analysis. At 4 months, there was improvement in ejection
fraction from a baseline of 20% to 29% (P=0.003) and a reduction in end-systolic volume
(P=0.03) in the treated patients. Electromechanical mapping revealed significant mechanical
improvement of the injected segments (P<0.0005) at 4 months after treatment. CONCLUSIONS:
Thus, the present study demonstrates the relative safety of intramyocardial injections of bone
marrow-derived stem cells in humans with severe heart failure and the potential for improving
myocardial blood flow with associated enhancement of regional and global left ventricular
function.
Publication Types:
•
Clinical Trial
•
Controlled Clinical Trial
PMID: 12707230 [PubMed - indexed for MEDLINE]
- 71 –
Anexos
Transendocardial, Autologous Bone Marrow Cell Transplantation for
Severe, Chronic Ischemic Heart Failure
[Clinical Investigation and Reports]
Perin, Emerson C. MD, PhD*; Dohmann, Hans F.R. MD*; Borojevic, Radovan PhD; Silva, Suzana A.
MD; Sousa, Andre L.S. MD; Mesquita, Claudio T. MD, PhD; Rossi, Maria I.D. PhD; Carvalho, Antonio
C. MD, PhD; Dutra, Helio S. PhD; Dohmann, Hans J.F. MD, PhD; Silva, Guilherme V. MD; Belém,
Luciano MD; Vivacqua, Ricardo MD; Rangel, Fernando O.D. MD; Esporcatte, Roberto MD; Geng, Yong
J. MD, PhD; Vaughn, William K. PhD; Assad, Joao A.R. MD; Mesquita, Evandro T. MD, PhD;
Willerson, James T. MD
From the Texas Heart Institute at St Luke’s Episcopal Hospital, Houston, Tex (E.C.P., G.V.S., Y.J.G.,
W.K.V., J.T.W.); Hospital Procardiaco, Rio de Janeiro, Brazil (H.F.R.D., S.A.S., A.L.S.S., C.T.M.,
H.J.F.D., L.B., R.V., F.O.D.R., R.E., J.A.R.A., E.T.M.); Federal University, Rio de Janeiro, Brazil (R.B.,
M.I.D.R., A.C.C., H.S.D.); and Brazilian Millennium Institute for Tissue Bioengineering (H.F.R.D., R.B.,
A.C.C.).
Received March 7, 2003;
revision received March 25, 2003; accepted March 26, 2003.
Correspondence to Emerson C. Perin, MD, 6624 Fannin, Suite 2220, Houston, TX 77030 (e-mail
[email protected]), and Hans F.R. Dohmann, MD, Rua General Polidoro, 192, CEP 22080-000–
Botafogo, Rio de Janeiro, Brazil (e-mail [email protected]).
Guest editor for this article was Valentin Fuster, MD, PhD, Mount Sinai School of Medicine, NY.
This article originally appeared Online on April 21, 2003 (Circulation. 2003;107:r75–r83).
*Drs Perin and Dohmann are co-principal investigators.
Introduction
After myocardial infarction, chronically ischemic (hibernating) myocardium may persist in association
with variable degrees of scar tissue. In most circumstances, native angiogenesis is insufficient to prevent
the resultant remodeling when significant injury occurs. As a consequence, infarct-related heart failure
remains a major cause of morbidity and mortality.
The understanding that vasculogenesis can occur in the adult has led to intense investigation into stem
cell therapy. Several recent experimental studies have confirmed the potential of pluripotential cells in
differentiating into cardiomyocytes and endothelial cells. 1,2 Further evidence from animal models has
confirmed that pluripotential cells from bone marrow improve myocardial function and perfusion in the
setting of ischemic heart disease. 3,4 In addition, recent publications 5,6 have described beneficial effects
of intracoronary infusion of autologous, mononuclear bone marrow in the immediate postinfarction
period in humans. A recent report by Tse et al 7 described improvement in myocardial perfusion and
segmental contractility (as assessed by cardiac magnetic resonance imaging) in ischemic myocardial
segments treated with catheter-based delivery.
The present study addresses primarily the safety of endocardial bone marrow mononuclear cell
(BMMNC) injections and secondarily the hypothesis that endocardial injections of autologous BMMNCs
(ABMMNCs) in patients with end-stage ischemic heart disease may promote neovascularization and may
overcome the failure of the natural myocardial healing process.
Methods
Patient Population
This is a prospective, nonrandomized, open-label study of 21 patients with severe ischemic heart failure
and no other option for standard revascularization therapies. Patients were enrolled sequentially, with the
first 14 patients assigned to the treatment group and the last 7 patients to the control group. In accordance
with the ethics committee’s recommendations, an initial group of 4 patients was enrolled as a safety
study. After 4 months’ follow-up of the initially injected patients (once safety was determined), the
remaining study patients were enrolled. All patients were placed on maximally tolerated medical therapy
at time of enrollment. The following inclusion criteria were required for patient enrollment: (1) chronic
coronary artery disease with reversible perfusion defect detectable by single-photon emission computed
tomography (SPECT); (2) left ventricular (LV) ejection fraction (EF) <40%; (3) ineligibility for
- 72 –
Anexos
percutaneous or surgical revascularization, as assessed by coronary arteriography; and (4) signed,
informed consent. Ineligibility for surgical or percutaneous revascularization procedures was determined
by 2 expert committees: a surgical committee comprising 2 cardiovascular surgeons and a noninvasive
cardiologist, and an interventional committee comprising 2 interventional cardiologists and 1 noninvasive
cardiologist. Patients were not enrolled in the study if any 1 of the following exclusion criteria was met:
(1) difficulty in obtaining vascular access for percutaneous procedures; (2) previous or current history of
neoplasia or other comorbidity that could impact the patient’s short-term survival; (3) significant
ventricular dysrhythmias (sustained ventricular tachycardia); (4) LV aneurysm; (5) unexplained abnormal
baseline laboratory abnormalities; (6) bone tissue with abnormal radiological aspect; (7) primary
hematologic disease; (8) acute myocardial infarction within 3 months of enrollment in the study; (9)
presence of intraventricular thrombus by 2D Doppler echocardiogram; (10) hemodynamic instability at
the time of the procedure; (11) atrial fibrillation; or (12) any condition that, in the judgment of the
investigator, would place the patient at undue risk.
The ethics committee of Pro-Cardiaco Hospital (Rio de Janeiro) and the Brazilian National Research
Ethics Council approved the study protocol.
Baseline Evaluation
Baseline evaluation in the treatment group included a complete clinical evaluation (history and physical),
laboratory evaluation (complete blood count, blood chemistry, C-reactive protein [CRP], brain natriuretic
peptide [BNP], creatine kinase [CK]-MB and troponin serum levels), exercise stress test with ramp
treadmill protocol, 8 2D Doppler echocardiogram, dipyridamole SPECT perfusion scan, and 24-hour
Holter monitoring.
The control group underwent the above-mentioned baseline evaluation except for 24-hour Holter
monitoring, CK-MB, and troponin serum levels.
Periprocedural Evaluation
Patients in the treatment group had serum CRP, complete blood count, CK, troponin, and BNP (only 9
patients) levels measured and an ECG performed just before the procedure. Immediately after the
procedure, another ECG and 2D Doppler echocardiogram were performed, and 24-hour Holter
monitoring was begun. Serum CRP, CK, and troponin levels were also assessed at 24 hours. Patients were
monitored in the cardiac intensive care unit for 48 hours after the injection procedure.
Bone Marrow Aspiration and Isolation of Mononuclear Cells
Approximately 4 hours before the cell injection procedure, bone marrow (50 mL) was aspirated under
local anesthesia from the posterior iliac crest. BMMNCs were isolated by density gradient on FicollPaque Plus (Amersham Biosciences). Mononuclear cells were exhaustively washed with heparinized
saline containing 5% human serum albumin and filtered through 100-µm nylon mesh to remove cell
aggregates. The cells were finally resuspended in saline with 5% human serum albumin for injection. A
small fraction of the cell suspension was used for cell counting and viability testing with trypan blue
exclusion. Cell viability was shown to be >90% (96.2±4.9%), assuring the quality of the cell suspension.
Post-hoc characterization of leukocyte differentiation markers by flow cytometry and functional assays
was done on another fraction of cells. The clonogenic capacity of hematopoietic progenitors was
evaluated by colony-forming assays (granulocyte-macrophage colony-forming unit) as previously
described. 9
A high correlation between granulocyte-macrophage colony-forming units and CD45loCD34+ cells was
seen (Spearman r =0.77, P =0.0012). Fibroblast colony-forming assay was done as previously described
10 to determine the presence of putative progenitor mesenchymal lineages. Bacterial and fungal cultures
of the clinically used cell preparations were performed and proved negative.
Antibodies and Staining Procedure for Fluorescence-Activated Cell Sorter
Analysis
The following antibodies were either biotinylated or conjugated with fluorescein isothiocyanate
(Pharmingen), phycoerythrin (PE), or PerCP: anti-CD45 as a pan-leukocyte marker (clone HI30), antiCD34 as a hematopoietic progenitor marker (clone HPCA-II), anti-CD3 as a pan–T-cell marker (clone
SK7), anti-CD4 as a T-cell subpopulation marker (clone SK3), and anti-CD8 as a T-cell subpopulation
marker (clone SK1) from Becton Dickinson; anti-CD14 as a monocyte marker (clone TUK4), anti-CD19
- 73 –
Anexos
as a pan–B-cell marker (clone SJ25-C1), and anti-CD56 as an NK-cell marker (clone NKI nbl-1), from
Caltag Laboratories (Burlingame, Calif); and anti-HLA–DR (MHC-II, clone B8.12.2) from BeckmanCoulter. The biotinylated antibodies were revealed with Streptavidin PECy7 (Caltag Laboratories). Threecolor immunofluorescence analysis was used for the identification of leukocyte populations in total
nucleated bone marrow cell suspensions. After staining, erythrocytes were lysed with the Becton
Dickinson lysis buffer solution according to the manufacturer’s instructions, and CD45 antibody was used
to assess the percentages of leukocytes in each sample. Data acquisition and analyses were performed on
a fluorescence-activated cell sorter Calibur with CellQuest 3.1 software (Becton Dickinson).
Transendocardial Delivery of ABMMNCs
In the cell-injection treatment group, patients were taken to the cardiac catheterization laboratory [almost
equal to]1 hour before the anticipated arrival of the bone marrow cells from the laboratory. Left heart
catheterization with biplane LV angiography was performed. Subsequently, electromechanical mapping
(EMM) of the left ventricle was performed as previously described. 11 The general region for treatment
was selected by matching the area identified as ischemic by previous SPECT perfusion imaging. The
electromechanical map was then used to target the specific treatment area by identifying viable
myocardium (unipolar voltage >=6.9 mV) 12 within that region. Areas associated with decreased
mechanical activity (local linear shortening <12%, indicating hibernating myocardium) were preferred.
The NOGA injection catheter (Figure 1) was prepared by adjusting the needle extension at 0° and 90°
flex and by placing 0.1 cc of ABMMNCs to fill the needle dead space. The injection catheter tip was
placed across the aortic valve and into the target area, and each injection site was carefully evaluated
before the cells were injected. Before every injection of cells into the LV wall, the following criteria had
to be met: (1) perpendicular position of the catheter to the LV wall; (2) excellent loop stability (<4 mm);
(3) underlying voltage >6.9 mV; and (4) presence of a premature ventricular contraction on extension of
the needle into the myocardium. Fifteen injections of 0.2 cc (mean of 25.5±6.3×106 cells/patient) were
delivered (Figure 2).
Figure 1. The NOGA
[Help with image viewing]
[Email Jumpstart To Image]
- 74 –
Anexos
Figure 2. Injection catheter advanced into the left ventricle through
the aortic valve. The catheter tip is placed against the endocardial
surface (insert) with the needle extended into the myocardium
delivering ABMMNCs.
Myostar injection catheter, with the needle in the extended position (insert).
Two-Month Noninvasive Follow-Up Evaluation
All patients, both treated and control, underwent noninvasive follow-up evaluations at 2 months, which
consisted of a clinical evaluation, ramp treadmill protocol, 2D Doppler echocardiogram, and
dipyridamole SPECT perfusion scan. Patients in the treatment group had repeat 24-hour Holter
monitoring. The ramp treadmill protocol was selected because it is better than standard incremental
protocols in estimating functional capacity in these severely ill patients. 8
The predicted ·Vo2max was used to tailor the patient workload. Treadmill speed was initially 0.5 mph,
and inclination was 0% to 10% with a planned duration of 10 minutes of exercise. 13,14 The
echocardiographic data were analyzed by 2 independent, blinded, experienced observers. Images were
stored digitally and analyzed offline. If a discrepancy between the readings of >5% was noted, a third
blinded observer was called and a consensus achieved. The end-systolic volume (ESV), end-diastolic
volume (EDV), and EF were measured according to standard protocols.
Dipyridamole stress and resting SPECT imaging were performed with the same stress procedure at
baseline and at follow-up. Studies were read by a blinded, experienced observer. Approximately 740
MBq of technetium-99m sestamibi was injected at rest and after stress, with dipyridamole infusion at a
rate of 142 µg/kg of body weight per minute infused for 4 minutes. One hour later, SPECT imaging was
initiated, using a 15% window centered over the 140-keV photopeak. Acquisitions were performed with a
1-detector gamma camera (Ecam, Siemens), acquiring 32 projections over 180° (right anterior oblique
45° to left posterior oblique 45°) (low-energy, high-resolution collimation; 64×64 matrixes; and 35
seconds per projection). Short-axis and vertical and horizontal long-axis tomograms of the left ventricle
were extracted from the reconstructed transaxial tomograms by performing coordinate transformation
with appropriate interpolation. No attenuation or scatter correction was applied. Quantitative SPECT
analysis was performed on an ICON workstation computer (Siemens). The analysis was performed with
the use of a completely automated software package, with the exception of a quality-control check to
verify the maximum count circumferential profiles. The methods for quantitative analysis have been
previously described. 15,16 In brief, processing parameters, including the apical and most basal
tomographic short-axis slices, the central axis of the LV chamber, and a limiting radius for myocardial
count search, were automatically derived. Short-axis tomograms were then sampled by using a maximumcount circumferential profile sampling technique with a cylindrical approach for sampling the body of the
left ventricle and a spherical approach for sampling the LV apex. Comparisons were made to sex-matched
normal limits. 16 Polar map displays and quantitative values were then generated to indicate stress
myocardial perfusion defect extent and severity. 16,17
Four-Month Invasive Follow-Up Evaluation
- 75 –
Anexos
Patients in the control group did not undergo NOGA mapping or repeat LV angiograms at late follow-up
(because of ethics committee recommendations).
Patients in the treatment group had 4-month invasive follow-up evaluations consisting of LV angiograms
and EMM. LV angiography was performed through the femoral approach with the use of a 5F pigtail
catheter. All angiograms were obtained in 2 planes—a 30° right anterior oblique view and a 60° left
anterior oblique view—during a period of stable sinus rhythm. Ventricular volume was not measured
during or after a premature beat. A 40-mm sphere was used as calibration device. LV EDV, ESV, and EF
were calculated by 2 blinded, experienced observers who used the area-length method. 18
EMM was performed according to established criteria 11 with a fill threshold of 15 mm. After the
acquisition of points, postprocessing analysis was performed with a series of filters (moderate setting) to
eliminate inner points, points that do not fit the standard stability criteria (location stability <4 mm, loop
stability <6 mm, and cycle length variation <10%), points acquired during ST-segment elevation, and
points not related to the left ventricle (eg, those in the atrium). A blinded, expert observer used a 12segment bull’s-eye to compare electromechanical values (unipolar voltage and local linear shortening) of
injected segments at baseline and follow-up.
Statistical Analyses
Univariate differences in demographic characteristics (Table 1) between the control and treated groups
were assessed with [chi]2/Fisher’s exact test and t tests for discrete and continuous variables, respectively.
Multivariable logistic regression was also used to determine the independent relationship between each
demographic variable and treatment group. No statistically significant differences between the 2 groups
were found. Because each patient in both groups was used as his or her own control, changes between
baseline and 8 weeks in the control and treated groups were assessed with paired t tests. Logistic
regression analysis was utilized to compare medications (Table 2) at baseline, 8 weeks, and 16 weeks
within the control and treatment groups and between the control and treatment groups.
TABLE 1. Demographics of the Treatment and Control
GroupsValues are mean±SD or percentage of patients.
- 76 –
Anexos
TABLE 2. Percentage of Patients Receiving Selected Cardiac
Medications at Baseline and 8- and 16-Week Follow-Up*P for
comparison of all 3 time periods between treatment and control
groups.
Comparisons of the changes from baseline to 8 weeks in the control and treatment groups were made with
repeated-measures ANOVA. The ANOVA model included the control versus treatment and baseline
versus 8 weeks as factors and also included the interaction between the 2 factors. A probability value
<0.05 was considered statistically significant.
Results
Patient population demographics did not differ significantly between the treatment and control groups
(Table 1). There were no significant differences in [beta]-blocker, ACE inhibitor, or nitrate use between
the 2 groups (Table 2).
Procedural Data
The total procedural time for mapping and injection was 81±19 minutes. Electromechanical maps
comprised an average of 92±16 points. Patients received an average of 15±2 cell injections in a mean of
2±0.7 segments (6 inferior, 14 lateral, 2 anterior, and 5 septal). Each injection of 2 million cells was
delivered in a volume of 0.2 cc. The cell population comprised a mean of 2.44±1.33% CD45loCD34+ cells
(Table 3).
TABLE 3. Characteristics of Bone Marrow Mononuclear Cells
Injected Into the Myocardium*Values are average±SD.*Results for
14 patients in the treatment group, except: CD34+CD45loHLA-DR-,
13 patients; CD45+CD19+, 13 patients; CD45+CD14+, 11 patients;
and CD45+CD56+, 9 patients.
Safety Data
One patient in the control group died 2 weeks after enrollment in the study and was not included in the
analysis. A patient in the treatment group died at 14 weeks, presumably of sudden cardiac death. This
- 77 –
Anexos
patient had onset of severe angina and was found to be in asystole by emergency medical personnel. The
patient had persistent improvement in cardiac function, as assessed by echocardiography. Baseline EF
was 30% by echocardiography and increased to 57% at 2-month follow-up, demonstrating a similar
response as the rest of the treatment group with regard to increased contractile function. In both cases, the
families refused postmortem exams.
There were no major periprocedural complications. One patient had a transient episode of pulmonary
edema that was easily reversed with loop diuretics after the procedure. No sustained arrhythmias were
associated with the injection procedures, nor did any significant arrhythmias occur while the patients were
hospitalized. There were no sustained ventricular arrhythmias found on 24-hour Holter monitoring at
baseline or when repeated after the injection procedure and no significant differences in the number or
percentage of premature ventricular contractions. No postprocedural pericardial effusions were seen on
2D Doppler echocardiograms. All patients were discharged on the third hospital day as per protocol.
Two-Month Noninvasive Follow-Up Evaluations
Of all baseline and follow-up laboratory values (Table 4), only serum creatinine and BNP levels varied
between the control and treatment groups at follow-up. Follow-up serum creatinine levels were
significantly elevated in the control group as compared with the treatment group (P =0.03). The levels of
CRP at baseline and follow-up were not significantly different between the two groups (Table 4). There
was a trend toward increased difference of BNP levels at follow-up between the two groups, with higher
levels in the control group (P =0.06).
TABLE 4. Laboratory Values for the Treatment and the Control
GroupsCK-MB indicates myocardial muscle creatine kinase
isoenzyme; NA, not applicable.*After treatment=2 months.
Patients in the treatment group experienced less heart failure and fewer anginal symptoms at the 2-month
follow-up when compared with the control group, by both New York Heart Association (NYHA) and
Canadian Cardiovascular Society Angina Score (CCSAS) distribution (Table 5). Baseline exercise test
variables (METs and ·Vo2max) were similar for the 2 groups. There was a significant increase, however,
in METs and ·Vo2max at follow-up in the treatment group (P =0.0085 and 0.01, respectively). There was
a trend toward improvement when these variables were compared with the control group (P =0.08 for
both variables).
- 78 –
Anexos
TABLE 5. Comparison of Baseline and 2-Month Follow-Up Values
for the Treatment and Control Groups*P values reflect comparison
of the differences between treatment and control groups over time
(see Methods).
Baseline comparison of ESV, EDV, and LVEF between the treatment and control groups revealed
significant differences: The control group had smaller LV volumes (P <0.001) and a trend (P =0.054)
toward higher baseline EF. Cardiac function (measured by EF on echocardiograms) had an absolute
increase of 6% over the 2-month follow-up period in the cell-treated group. In contrast, the mean EF
decreased, although not significantly, in the control group. In addition, when the 2 groups were compared,
the treatment group showed a significant improvement in EF after 2 months (P =0.03). Cardiac geometry,
as assessed by ESV, also improved. A significant fall in ESV (P =0.03) and a trend toward reduction in
EDV (P =0.07) were noted in the treatment group. Volumes remained unchanged within the control
group. When the two groups were compared at follow-up, a significant reduction in ESV was seen in the
treated patients (P =0.04).
Nuclear perfusion imaging studies were similar at baseline for the amount of total reversible defect and
percent of rest defect with 50% activity (scar). Within the control group, there was no significant change
in these two variables at follow-up. Within the treatment group, there was no significant change in rest
defect, with 50% activity at 2-month follow-up, but there was a significant 73% reduction in total
reversible defect (P =0.022; from 15.15±14.99% to 4.53±10.61%). A typical example of resolution of
inferolateral ischemia (baseline to follow-up) in a cell-treated patient is shown in Figure 3 A.
- 79 –
Anexos
Figure 3. A, SPECT polar map at baseline, showing an area of
inferolateral, reversible ischemia in white and nonreversible stress
defect in black (left). Follow-up SPECT at 2 months, showing
complete resolution of ischemic defect and basilar nonreversible
defect with a decrease in nonreversible apical defect (right). B,
Electromechanical maps from the same patient viewed from the
inferior position. Mechanical map at the time of the injection
procedure (left) shows the 15 injection sites in black distributed
along the inferior wall. The follow-up mechanical map at 4 months
(right) shows marked improvement in contractile function in the
injected area.
Four-Month Invasive Follow-Up Evaluations
Results from LV angiography at baseline and 4-month follow-up are shown in Table 6. There was a
sustained improvement in LVEF from baseline, an increase from 20% to 29% at 4 months (31% relative
increase) (P =0.0003) in the treated patients. There was also a continued reduction in ESV (P =0.03) at 4
months. EDV remained unchanged (P =0.1). Control group patients did not have repeat LV angiograms.
TABLE 6. Angiographic and EMM Results for the Treatment
Group at 4 Months’ Follow-Up (n=13)
On EMM, segmental analysis revealed a significant mechanical improvement of the injected segments (P
<0.0005) (Table 6). Significant improvement in mechanical function at the injection site is illustrated by
EMM in Figure 3 B. Unipolar voltage values did not change from baseline to follow-up.
Discussion
The present study describes for the first time ABMMNC transplantation with the use of transendocardial
injections in patients with severe LV dysfunction, end-stage ischemic heart disease, and no other option
for treatment. The results of our study suggest that injection of ABMMNCs is safe and improves
perfusion and myocardial contractility when viable areas of myocardium are targeted.
Wound healing is a multifaceted process that involves complex interactions between inflammatory cells,
cytokines, and a number of extracellular matrix proteins, and the development of new capillaries. Because
the normal reparative mechanisms seem to be overwhelmed when clinically significant myocardial injury
occurs, a logical next step would be to amplify one part of this response artificially by applying stem cells
locally in the setting of ischemia or infarction when a large amount of heart muscle has been injured.
In experimental animals, bone marrow–derived cells have been shown to regenerate areas of infarcted
myocardium and coronary capillaries, 1 thus limiting functional impairment after myocardial infarction.
Transendocardial injection of ABMMNCs has been shown to increase myocardial contractility and
perfusion in swine. 4 Various cell lineages have been used to generate evidence that bone marrow stem
- 80 –
Anexos
cells differentiate into cardiomyocytes, endothelium, and smooth muscle cells. 19 Bone marrow
hemangioblasts add to the development of new vessels, and mesenchymal stem cells can
transdifferentiate into functional cardiomyocytes. 20 Recently, bone marrow–derived cardiomyocytes
were demonstrated in hearts of women who received gender-mismatched bone marrow transplantation. 21
Moreover, bone marrow cellular components secrete a range of cytokines, fibroblast growth factor, and
vascular endothelial growth factor, 22 which are involved in the natural process of angiogenesis.
Endothelial progenitor cells have been implicated in neovascularization associated with postnatal
vasculogenesis and are mobilized to peripheral circulation after acute ischemic events. 23
In the present study, there is preliminary evidence that in humans, bone marrow–derived mononuclear
cells are capable of enhancing perfusion, as shown by significant reductions in reversible stress defects on
SPECT (P =0.02). Bone marrow–derived cells were purposefully injected into areas of hibernating
myocardium. In hibernating areas, the underlying physiological state allows for restoration of myocardial
function if myocardial perfusion is improved. We hypothesize that angiogenesis is the mechanism that
allowed improvement in myocardial function in the patients in our study. Furthermore, we may speculate
that an orchestrated sequence of events that includes not only the presence of the transplanted cells but
also the action of cytokines and growth factors and intricate cell-to-cell interactions may all contribute to
angiogenesis as an end result. Therefore, the resultant localized increase in contractility at cell injection
sites, as seen by a significant increase in mechanical function on EMM, likely occurred as a consequence
of an underlying improvement in perfusion. However, we cannot exclude the possibility that the
injections themselves stimulated new blood vessel growth and enhanced function through the induction of
angiogenic and important growth factors.
The homing process, which results in cell engraftment, may also play a key role in the success of cell
therapy. After acute events, serum vascular endothelial growth factor levels rise significantly, 23 and it is
likely that homing signals may be more intense in acute and subacute ischemic syndromes. In our
patients, all of whom had chronic disease, we opted to perform transendocardial cell-therapy delivery
because we believe that homing signaling may not be as intense and, therefore, might not be optimal for
cell engraftment. It is also likely that a smaller number of cells is required to achieve the desired effect.
EMM technology has been widely confirmed to be accurate for delineating and identifying scarred and
viable myocardium and for differentiating degrees of infarct transmurality. 11,12,24 EMM thus offers a
theoretical benefit over surgical or intracoronary approaches because viability of the site can be
determined before each injection. Injections would then be performed only to targeted, viable areas of
hibernating myocardium. Many treated sites targeted in this study were in areas of totally occluded
epicardial vascular beds, making intracoronary delivery impossible. Furthermore, potential ischemia
provoked by coronary manipulation is avoided. This approved procedure seemed safer for these
chronically ill, high-risk patients because it avoided associated surgical morbidity and mortality.
Tse et al 7 recently demonstrated improvement in myocardial perfusion and segmental contractility after
ABMMNC transendocardial injections. Those results are somewhat similar to results of the present study,
although Tse and colleagues did not see improvement in global EF. The main difference between the
studies is the significant baseline LV dysfunction present in our group (mean EF, 20%) as compared with
a normal mean EF (56.9%) in the Tse study. 7 The preliminary data of Tse and colleagues also suggest
the relative safety of the procedure.
The use of transendocardial delivery proved to be safe in our study, as cellular therapy was successfully
delivered in every case without any major periprocedural events (eg, death, myocardial infarction,
ventricular arrhythmias, cardiac perforation, pericardial effusion, or development of intramyocardial
tumor). Troponin levels increased by a small but significant amount, consistent with delivery via
intramuscular injection (Table 4), but the absolute rise was relatively small biologically. The stability
between levels of CRP in the treatment and control groups suggests that we did not initiate a significant
inflammatory reaction with cell injection.
The major limitations of this study are the small number of patients enrolled and the study design, which
limits conclusions about efficacy. Because of ethics committee concerns, the control group was not
enrolled concurrently with treated patients, did not receive a placebo injection, and did not undergo
invasive follow-up. However, treatment and control groups had similar follow-up up to 2 months. The
benefits seen in this study with cell therapy could be attributable to the placebo effect seen in phase 1
trials. Potential biases include selection bias (eg, tertiary hospital population) and investigator bias when
- 81 –
Anexos
assessing symptoms at follow-up (CCSAS and NYHA class) although echocardiographic, angiographic,
and SPECT studies were read blindly. In addition, smaller LV volumes and a trend toward higher EFs
were present in the control group. However, both groups were matched in terms of demographics,
medication use, baseline laboratory values, functional status classification, treadmill workload, and
·Vo2max. More importantly, similar baseline reversible and fixed ischemic defects were present in both
groups, as one of the most important end points assessed in this study was the amount of reversible
perfusion defect at follow-up. The end point of contractility is more difficult to evaluate in light of the
differences between the groups at baseline; however, changes in opposite directions occurred at followup. In addition, the slightly better LVEFs and smaller hearts should logically have biased results against
the cell-treated group.
Although the mechanisms by which cell therapy confers clinical benefit are not well understood,
correlation between cell phenotype subpopulation analysis and long-term clinical outcomes is beyond the
scope of the present study. Future analyses will be performed in this regard when longer-term follow-up
is available.
The treatment of patients with heart failure has become increasingly important given the growing number
of cases and their economic impact on the healthcare system. 25,26 More aggressive and widespread
therapy in patients with chronic, ischemic heart failure will ultimately lead to a population harboring
more advanced disease with a potential yearly mortality rate as high as 50%. 27 For these patients,
therapeutic options remain limited. The very high-risk nature of the patient population represented in our
study cohort is underscored by the fact that there was a death in both the control and the treatment groups.
However, the significant improvement in LVEF noted in the treatment group on angiographic follow-up
at 4 months (from 20% to 29%) may imply an improved clinical state and, it is hoped, provide some
reduction in risks for the future. 28
Conclusion
In this initial prospective, nonrandomized, open-label study in no-other-option coronary artery disease
patients with LV dysfunction, we noted improvement in symptoms, cardiac function, and perfusion with
transendocardial ABMMNC therapy, without any clinical evidence of significant harm from the
procedure itself. We believe there may be clinical potential for this relatively novel therapy. Further
investigation in a larger, randomized trial is warranted.
Acknowledgments
A NOGA mapping system and catheters were provided by Cordis Corporation (Miami Lakes, Fla).
We thank Rita Weiler, Ana Cristina Reis, RN, and Patricia Souza, RN, for their enthusiastic support and
coordination of the study patients; Cristine Rutherford for the psychological assessment and support of
the patients; David R. Buskohl, Mark Martin, and Jacqueline Grant for their outstanding technical
support; and Marianne Mallia, ELS, for editorial assistance in the preparation of the manuscript.
- 82 –
Anexos
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Key Words: cells; heart failure; ischemia; revascularization; gene therapy
- 84 –
Anexos
ANEXO III
Trabalho publicado na Revista Circulation Setembro 2004
- 85 –
Anexos
Circulation. 2004 Sep 14;110(11 Suppl 1):II213-8.
Improved exercise capacity and ischemia 6 and 12 months after
transendocardial injection of autologous bone marrow
mononuclear cells for ischemic cardiomyopathy.
Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, Silva GV, Mesquita CT, Belem
L, Vaughn WK, Rangel FO, Assad JA, Carvalho AC, Branco RV, Rossi MI, Dohmann HJ,
Willerson JT.
Texas Heart Institute at St. Luke's Episcopal Hospital, .), Houston, Tex, USA.
[email protected]
BACKGROUND: We recently reported the safety and feasibility of autologous bone marrow
mononuclear cell (ABMMNC) injection into areas of ischemic myocardium in patients with endstage ischemic cardiomyopathy. The present study evaluated the safety and efficacy of this
therapy at 6- and 12-month follow-up. METHODS AND RESULTS: Twenty patients with 6and 12-month follow-up (11 treated subjects; 9 controls) were enrolled in this prospective,
nonrandomized, open-label study. Complete clinical and laboratory evaluations as well as
exercise stress (ramp treadmill), 2-dimensional Doppler echocardiography, single-photon
emission computed tomography (SPECT) perfusion scanning, and 24-hour Holter monitoring
were performed at baseline and follow-up. Transendocardial delivery of ABMMNCs was
performed with the aid of electromechanical mapping to identify viable myocardium. Each
patient received 15 ABMMNC injections of 0.2 mL each. At 6 and 12 months, total reversible
defect, as measured by SPECT perfusion scanning, was significantly reduced in the treatment
group as compared with the control group. At 12 months, exercise capacity was significantly
improved in the treatment group. This improvement correlated well with monocyte, B-cell,
hematopoietic progenitor cell, and early hemapoietic progenitor cell phenotypes.
CONCLUSIONS: The 6- and 12-month follow-up data in this study suggest that
transendocardial injection of ABMMNCs in patients with end-stage ischemic heart disease may
produce a durable therapeutic effect and improve myocardial perfusion and exercise capacity.
Publication Types:
•
Clinical Trial
•
Controlled Clinical Trial
- 86 –
Anexos
Improved Exercise Capacity and Ischemia 6 and 12 Months After
Transendocardial Injection of Autologous Bone Marrow Mononuclear
Cells for Ischemic Cardiomyopathy
[Cell Transplantation and Tissue Engineering]
Perin, Emerson C. MD, PhD*; Dohmann, Hans F.R. MD*; Borojevic, Radovan PhD; Silva, Suzana A.
MD; Sousa, Andre L.S. MD; Silva, Guilherme V. MD; Mesquita, Claudio T. MD, PhD; Belém, Luciano
MD; Vaughn, William K. PhD; Rangel, Fernando O.D. MD; Assad, Joao A.R. MD; Carvalho, Antonio C.
MD, PhD; Branco, Rodrigo V.C. MD; Rossi, Maria I.D. PhD; Dohmann, Hans J.F. MD, PhD; Willerson,
James T. MD
From the Texas Heart Institute at St. Luke’s Episcopal Hospital (E.C.P., G.V.S., W.K.V., R.V.C.B.,
J.T.W.), Houston, Tex; Hospital Procardiaco (H.F.R.D., S.A.S., A.L.S.S., C.T.M., L.B., F.O.D.R.,
J.A.R.A., H.J.F.D.), Rio de Janeiro, Brazil; Federal University (R.B., A.C.C., M.I.D.R.), Rio de Janeiro,
Brazil.
Correspondence to Emerson C. Perin, MD, PhD, 6624 Fannin, Suite 2220, Houston, TX 77030 (E-mail
[email protected]), or Hans F.R. Dohmann, MD, Rua General Polidoro, 192, CEP 22080-000
Botafogo, Rio de Janeiro, Brazil (E-mail [email protected]).
*Drs Perin and Dohmann are co-principal investigators.
Introduction
Coronary artery disease (CAD) remains a major cause of morbidity and mortality in the Western world.1
The irreversible loss of cardiomyocytes after myocardial infarction leads to left ventricular (LV)
remodeling and in the end to ischemic heart failure.2 In many patients, the progression of CAD leads to
successive rounds of revascularization therapies that commonly result in an end-stage coronary anatomy
unsuited for further revascularization and associated with LV dysfunction. In recent years, stem cell
transplantation has emerged as a potential modality for the treatment of cardiovascular diseases on the
basis of its possible ability to induce neovascularization and tissue replacement.3–5 Many advances in
understanding stem cell biology have occurred, and there is increasing evidence that cell transplantation
may improve the perfusion and contractile function of the ischemic myocardium.6–12 Accordingly, stem
cell transplantation could be an alternative therapy for CAD patients who have no other standard options
for treatment.
We have recently reported initial safety and feasibility data for autologous bone marrow mononuclear cell
(ABMMNC) injection into areas of ischemic myocardium in patients with end-stage ischemic heart
failure.13 Short-term follow-up showed improvement in perfusion as assessed by single-photon emission
computed tomography (SPECT) and regional contractility.
Despite the accumulating evidence pointing toward a therapeutic benefit of ABMMNC therapy, many
questions remain unanswered: what is the ideal stem cell for therapy, the ideal mechanism of action (ie,
secretion of growth factors and cytokines, cell-to-cell interactions), the lifespan of stem cells within the
myocardium, and the duration of the therapeutic effect. Moreover, there remains concern about the
potential toxicity of such therapy, eg, the possibility of creating a chronic pro-arrhythmic state, proinflammatory state, or both. To help answer these questions, we report here on the safety and efficacy of
ABMMNC injection at 6 and 12 months of follow-up.
Methods
Patient Population
This is a prospective, nonrandomized, open-label study of 23 patients with severe ischemic heart failure
and no other option for standard revascularization therapies. Patients were enrolled sequentially, with the
first 14 patients being assigned to the treatment group and the last 9 patients assigned to the control group.
In accordance with the ethics committee’s recommendations, an initial group of 4 patients was enrolled in
a safety study. After 4 months of follow-up of the initially injected patients (once safety had been
determined), the remaining study patients were enrolled. All patients were placed on maximally tolerated
medical therapy at time of enrollment. The following inclusion criteria were required for patient
enrollment: (1) chronic CAD with reversible perfusion defect detectable by SPECT; (2) LV ejection
- 87 –
Anexos
fraction (EF) <40%; (3) ineligibility for percutaneous or surgical revascularization, as assessed by
coronary arteriography; and (4) signed, informed consent. Ineligibility for surgical or percutaneous
revascularization procedures was determined by 2 expert committees: a surgical committee comprising 2
cardiovascular surgeons and 1 noninvasive cardiologist, and an interventional committee comprising 2
interventional cardiologists and 1 noninvasive cardiologist. Patients were not enrolled in the study if any
one of the following exclusion criteria were met: (1) difficulty in obtaining vascular access for
percutaneous procedures; (2) previous or current history of neoplasia or other comorbidity that could
impact the patient’s short-term survival; (3) significant ventricular dysrhythmias (sustained ventricular
tachycardia); (4) LV aneurysm; (5) unexplained baseline laboratory abnormalities; (6) bone tissue with
abnormal radiological aspect; (7) primary hematologic disease; (8) acute myocardial infarction within 3
months of enrollment in the study; (9) presence of intraventricular thrombus as shown by 2-dimensional
(2D) Doppler echocardiography; (10) hemodynamic instability at the time of the procedure; (11) atrial
fibrillation; and (12) any condition that, in the judgment of the investigator, would place the patient at
undue risk.
The ethics committee of Procardiaco Hospital (Rio de Janeiro) and the Brazilian National Research Ethics
Council approved the study protocol.
Baseline Evaluation
Baseline evaluation in both groups included pertinent laboratory evaluations (complete blood count, Creactive protein [CRP], brain natriuretic peptide [BNP], and serum creatinine levels), functional status
(New York Heart Association and Canadian Cardiovascular Society Angina Score class), exercise testing
(ramp treadmill protocol),14 dipyridamole SPECT perfusion scanning, and 2D echocardiography as
previously described.13 Twenty-four-hour Holter monitoring and signal-averaged electrocardiography
(SAECG) were also performed at baseline.
Bone Marrow Aspiration and Isolation of Mononuclear Cells
Approximately 4 hours before the cell injection procedure, bone marrow (50 mL) was aspirated under
local anesthesia from the posterior iliac crest. ABMMNCs were isolated by density gradient in FicollPaque Plus (Amersham Biosciences). Mononuclear cells were exhaustively washed with heparinized
saline containing 5% human serum albumin and filtered through 100-µm nylon mesh to remove cell
aggregates. The cells were finally resuspended in saline with 5% human serum albumin for injection.
A small fraction of the cell suspension was used for cell counting and viability testing by trypan blue
exclusion. Cell viability was shown to be >90% (96.2±4.9%), assuring the quality of the cell suspension.
Post-hoc characterization of leukocyte differentiation markers by flow cytometry and functional assays
were performed on another fraction of cells. The clonogenic capacity of hematopoietic progenitors was
evaluated by colony-forming assays (granulocyte-macrophage colony-forming unit) as previously
described.15
A high correlation between granulocyte-macrophage colony-forming units and CD45loCD34+ cells was
seen (Spearman r=0.77, P=0.0012). Fibroblast colony-forming unit assays were performed as previously
described 16 to determine the presence of putative progenitor mesenchymal lineages. Cultures of the
clinically used cell preparations were grown and proved negative for bacterial and fungal contamination.
Antibodies and Staining Procedure for Fluorescence-Activated Cell Sorter
Analysis
The following antibodies were either biotinylated or conjugated with FITC (Pharmingen), phycoerythrin,
or PerCP: anti-CD45 as a pan-leukocyte marker (clone HI30), anti-CD34 as a hematopoietic progenitor
marker (clone HPCA-II), anti-CD3 as a pan–T-cell marker (clone SK7), anti-CD4 as a T-cell
subpopulation marker (clone SK3), and anti-CD8 as a T-cell subpopulation marker (clone SK1), from
Becton Dickinson; anti-CD14 as a monocyte marker (clone TUK4), anti-CD19 as a pan–B-cell marker
(clone SJ25-C1), and anti-CD56 as an NK-cell marker (clone NKI nbl-1), from Caltag Laboratories
(Burlingame, Calif); and anti-HLA-DR (MHC-II, clone B8.12.2) from Beckman-Coulter. The
biotinylated antibodies were revealed with streptavidin PECy7 (Caltag Laboratories). Three-color
immunofluorescence analysis was used for the identification of leukocyte populations in total nucleated
bone marrow cell suspensions. After staining, erythrocytes were lysed using the Becton Dickinson lysis
buffer solution according to the manufacturer’s instructions, and CD45 antibody was used to assess the
- 88 –
Anexos
percentages of leukocytes in each sample. Data acquisition and analyses were performed on a Calibur
fluorescence-activated cell sorter equipped with CellQuest 3.1 software (Becton Dickinson).
Transendocardial Delivery of Autologous Bone Marrow Mononuclear Cells
In the cell-injection treatment group, patients were taken to the cardiac catheterization laboratory [almost
equal to]1 hour before the anticipated arrival of the bone marrow cells from the laboratory. Left heart
catheterization with biplane left ventricular angiography was performed. Subsequently, electromechanical
mapping (EMM) of the left ventricle was performed as previously described.17 The general region for
treatment was selected by matching the area identified previously by SPECT perfusion imaging as
ischemic. The electromechanical map was then used to target the specific treatment area by identifying
viable myocardium (unipolar voltage >=6.9 mV) within that region. Areas associated with decreased
mechanical activity (local linear shortening <12%, indicating hibernating myocardium) were preferred.
The NOGA injection catheter was prepared by adjusting the needle extension at 0° and 90° flex and by
placing 0.1 mL of ABMMNCs to fill the needle dead space. The injection catheter tip was placed across
the aortic valve and into the target area, and each injection site was carefully evaluated before the cells
were injected. Before every injection of cells into the LV wall, the following safety criteria had to be met
to assure intramyocardial delivery: (1) perpendicular position of the catheter in relation to the LV wall;
(2) excellent loop stability (<4 mm); (3) maximal needle extension of 6 mm; and (4) presence of a
premature ventricular contraction (PVC) on extension of the needle into the myocardium.
Correlation of Bone Marrow Mononuclear Cell Subpopulation and Improvement
in Reversible Perfusion Defects
For every treated patient, the size of the myocardial area injected (mm2), the absolute cell number
injected, and the concentration of each specific cell phenotype (103 cells/mm2) were calculated and
subsequently correlated with the reduction in total reversible defect as determined by quantitative SPECT
(at baseline versus at 6 months) using exact Pearson moment correlation.
Two-Month, 6-Month, and 12-Month Follow-up Evaluations
All patients, both treated and control, underwent noninvasive follow-up evaluations at 2 and 6 months,
which consisted of a repeat baseline laboratory evaluation, clinical evaluation, dipyridamole SPECT
perfusion scanning, ramp treadmill protocol, 2D echocardiography, repeat 24-hour Holter monitoring, and
SAECG. The same noninvasive follow-up evaluation protocol (except for Holter monitoring and
SAECG) was performed at 12 months. Dipyridamole SPECT imaging studies were performed using the
same stress procedure at baseline and at follow-up, as previously described.13 Studies were read by a
blinded, experienced observer. The predicted Vo2max was used to tailor the patient workload. Treadmill
speed was initially 0.5 mph, and inclination was 0% to 10% with a planned exercise duration of 10
minutes.18
Statistical Analysis
The values of the continuous variables were presented as means and standard deviations; the values of the
categorical variables were presented as percentages. Comparisons between the treated and control groups
and comparisons between the 4 time points (baseline versus 2 months versus 6 months versus 12 months)
were made using repeated-measures ANOVA. P<=0.05 was considered statistically significant.
Results
One patient was lost to follow-up and did not undergo 6-month and 12-month evaluations. Patient
demographics did not differ significantly between the treatment and control groups (Table 1). Neither did
[beta]-blocker, angiotensin-converting enzyme inhibitor, or nitrate use (Table 2).
- 89 –
Anexos
TABLE 1. Demographics of the Treatment and Control Groups
TABLE 2. Percentage of Patients Receiving Selected Cardiac
Medications at Baseline, 2 Months, 6 Months, and 12 Months
Procedural Data
The mean total procedural time for mapping and injection was 81±19 minutes. Electromechanical maps
comprised an average of 89±9 points. Each injection of 2 million cells was delivered in a volume of 0.2
mL.
Safety Data
There were no major periprocedural complications. One patient had a transient episode of pulmonary
edema that was easily reversed with loop diuretics after the procedure. No sustained arrhythmias were
associated with the injection procedures, nor did any significant arrhythmias occur while the patients were
hospitalized. All patients were discharged on the third hospital day as per protocol. As previously
reported, 1 patient in the treatment group died at 14 weeks, presumably of sudden cardiac death. A second
patient died at 11 months, presumably of a neurological cause.
Laboratory Data
White blood cell count (WBC), CRP, BNP, and serum creatinine levels at baseline, 2 months, 6 months,
and 12 months are shown in Table 3. Of all baseline and follow-up laboratory values, only serum
- 90 –
Anexos
creatinine levels varied between the control and treatment groups at follow-up. Follow-up serum
creatinine levels were significantly elevated in the control group as compared with the treatment group
(P=0.04). The levels of CRP and WBC at baseline and follow-up were not significantly different between
the 2 groups. There was a trend toward lower BNP levels in the treatment group at 12-month follow-up
(P=0.08).
TABLE 3. Laboratory Values for the Treatment and Control
Groups at Baseline, 2 Months, 6 Months, and 12 Months
Two-Month, 6-Month, and 12-Month Follow-up Evaluations
At the 2-month follow-up, there was a significant improvement in symptoms (New York Heart
Association and Canadian Cardiovascular Society Angina Score) in the treatment group as compared with
the control group (Table 4). This improvement was maintained at 6 and 12 months in the treatment group
as compared with the control group (Table 4).
TABLE 4. Comparison of Clinical Values for the Treatment
and Control Groups at Baseline, 2 Months, 6 Months, and 12
Months
Nuclear perfusion imaging studies in the treated and control groups were similar at baseline for the
amount of total reversible defect and percent of rest defect with 50% activity (scar). At the 2-month
follow-up, there was a significant reduction in myocardial ischemia in the treatment group as compared
with the control group (Table 4). This improvement was maintained at 6 and 12 months (P=0.01), despite
worsening of myocardial ischemia in the treatment group (Table 4).
Exercise capacity as assessed by metabolic equivalents and Vo2max was similar between the 2 groups at
baseline. At the 2-month follow-up, there was a significant increase in exercise capacity, as measured in
terms of metabolic equivalents and Vo2, in the treatment group as compared with the control group (Table
4). This significant improvement was maintained at 6 and 12 months, as exercise capacity improved
slightly in the treatment group. There was no statistically significant difference between the 2 groups in
terms of LVEF on the 2D echocardiogram over time (Table 4).
There were no sustained ventricular arrhythmias found by 24-hour Holter monitoring at baseline and
follow-up and no significant differences in the number of PVCs at the 2- and 6-month follow-ups (Table
4). Nor were there significant differences in SAECG parameters at either follow-up (Table 4).
Correlation Between Bone Marrow Mononuclear Cell Subpopulations and
Improvement in Reversible Perfusion Defects
Monocyte, B-cell, hematopoietic progenitor cell, and early hematopoietic progenitor cell subpopulations
correlated with improvement in reversible perfusion defects at 6 months (Table 5). There was also a trend
toward correlation between the fibroblast colony-forming unit subpopulation (progenitor mesenchymal
cell phenotype) and improvement in reversible perfusion defects at 6 months (Table 5).
- 91 –
Anexos
TABLE 5. Correlation of Bone Marrow Mononuclear Cell
Subpopulations and Reduction in Total Reversible Perfusion
Defects
Discussion
The results of our study suggest that injection of ABMMNCs is safe and improves perfusion and exercise
capacity when viable ischemic areas of myocardium are targeted.
Preliminary evidence suggests that bone marrow progenitor cells may be involved in the process of
postnatal physiological organ vascularization.19 Other evidence suggests that bone marrow-derived
progenitor cells may be recruited to participate in the natural healing process that occurs after tissue
injury and vascular trauma.20 Many preclinical studies have shown that the insertion of bone marrow
mononuclear cells into ischemic myocardium can help re-establish tissue vascularization.3,4,6,7
Furthermore, pioneering clinical studies have preliminarily confirmed the therapeutic benefit of bone
marrow mononuclear cell therapy after acute myocardial infarction or in the setting of chronic myocardial
ischemia.8–13
Previous studies have shown that bone marrow cells can differentiate into cardiomyocytes and endothelial
cells in vitro and in vivo.8,21 In theory, ABMMNCs could contribute to neoangiogenesis or myocardial
tissue replacement (or both) and as a consequence improve myocardial perfusion or LV remodeling.
Improvement in tissue vascularization may also result from the ability of bone marrow cells to secrete
angiogenic factors. Additionally, bone marrow cell injections per se could elicit an inflammatory response
that activates an angiogenic process. Although the mechanisms leading to a possible benefit are
incompletely understood, the sustained improvement in perfusion that we have observed in the present
study is intriguing.
The bone marrow mononuclear cell subset, which is quite heterogeneous, comprises mesenchymal stem
cells, hematopoietic progenitor cells, endothelial progenitor cells, and more committed cell lineages such
as natural killer lymphocytes, T lymphocytes, and B lymphocytes. There is much controversy regarding
which stem cell subtype might be responsible for the therapeutic benefit of bone marrow mononuclear
cell transplantation into ischemic myocardium.22 In the present study, several different subpopulations of
ABMMNCs correlated with improvement in myocardial perfusion. The statistical correlation was
excellent for monocytes (r=0.8), good for B cells (r=0.7), and moderate for both hematopoietic progenitor
cells and early hematopoietic progenitor cells (r=0.6). It seems, therefore, that various bone marrow cell
subpopulations may contribute to improved perfusion. More specifically, the present study results suggest
that the bone marrow monocyte subpopulation might have an important role to play in the angiogenic
process. This would be in agreement with preliminary evidence that endothelial progenitor cells are
derived from the monocyte/macrophage subpopulation and that their angiogenic effects most likely result
from growth factor secretion.23 Meanwhile, the contributions of cytokines and growth factors secreted by
monocytes and hematopoietic progenitor cells, the intricacies of cell-to-cell interactions, and the fate of
transplanted cells remain to be defined.
The homing of transplanted cells to the target ischemic area and their engraftment there are thought to be
prerequisites for the therapeutic success of stem cell transplantation.22 The transendocardial route of
delivery was chosen to maximize engraftment. EMM technology has been widely confirmed to be
- 92 –
Anexos
accurate for delineating and identifying scarred and viable myocardium and for differentiating degrees of
infarct transmurality.17 EMM thus offers a theoretical benefit over surgical or intracoronary approaches
because viability of the target site can be determined before each injection. Many treated sites targeted in
this study were in areas of totally occluded epicardial vascular beds, making intracoronary delivery
impossible. Furthermore, the potential for provoking ischemia by coronary manipulation was avoided.
The study population and the prospective assessment of exercise capacity in this study are unique. All
patients had previously had myocardial infarction, had no other revascularization treatment options, and
had compromised LV function (mean LVEF [treatment group], 30%). Whereas most of the studies
described in the literature concern patients with preserved LVEF,9,11,12 our study concerns a high-risk
subgroup within the population of patients with CAD. Thus, our findings might be of potential
significance.
The transendocardial injection of ABMMNCs significantly improved exercise capacity, heart failure, and
angina symptoms at the 2-month follow-up. Symptomatic improvement was significant and the increase
in exercise capacity was sustained at 6 and 12 months, with the treatment group steadily improving and
the control group remaining stable over time. In addition to the improved exercise capacity, the treatment
group also showed a trend toward a lower mean BNP level at 12 months when compared with the control
group (740 versus 507 pg/mL, respectively). BNP levels have been shown to be an important prognostic
marker in heart failure patients.24 Heart failure patients with a Vo2max of <14 mL/kg per minute also
have a higher long-term mortality.18,25 Thus, the increase in Vo2max (from 17.3 mL/kg per minute to
25.1 mL/kg per minute) and the trend toward improvement in BNP levels that were observed in the
treated group at 12 months will be important if confirmed by larger studies.
The short-term safety of transendocardial injection of ABMMNCs 13 or filtered ABMCs 26 into ischemic
myocardium has been demonstrated. However, the question of whether cell transplantation increases the
potential for malignant arrhythmias has also been raised.5 ABMMNCs appear to offer the advantage of
electrical stability because data from the present study showed no malignant arrhythmias on any 24-hour
Holter monitoring studies, no change in the number of PVCs after ABMMNC injection, and no change in
SAECG parameters. Neither serum CRP levels nor WBC counts were elevated at 6 and 12 months after
transendocardial injection of ABMMNCs, suggesting that the injected cells did not elicit any important
inflammatory response despite their potential for producing growth factors, cytokines, and other
proinflammatory substances.
The major limitations of this study are the small number of patients enrolled and the study design, which
limits any conclusions about efficacy. Because of ethics committee concerns, patients in the control group
were not enrolled concurrently with treated patients and did not receive a placebo injection. However,
treatment and control groups have had similar follow-up schedules up to 12 months. The benefits of cell
therapy seen in this study could be attributable to the placebo effect seen in phase I trials. Potential biases
include selection bias (eg, tertiary hospital population) and investigator bias, although SPECT, Holter
monitoring, and treadmill studies were read blindly and both groups were matched in terms of
demographics, baseline laboratory values, treadmill workload, and Vo2max. Similar reversible and fixed
ischemic defects were present in both groups at baseline. In addition, the present study population was
relatively young when compared with heart failure patients normally seen in clinical practice. This might
limit the implications of the present study results because it is now known that the function of progenitor
cells is age-dependent.27
Conclusion
In this initial prospective, nonrandomized, open-label study in patients with CAD, LV dysfunction, and
no other revascularization treatment options, sustained improvement in exercise capacity and myocardial
perfusion was noted 6 months and 12 months after transendocardial ABMMNC therapy, without any
clinical evidence of significant harm from the procedure itself. Further investigation in larger, randomized
trials is warranted.
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Anexos
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Key Words: cells; heart failure; ischemia; revascularization; gene therapy
- 95 –
Anexos
ANEXO IV
Trabalho publicado na Revista Arquivos Brasileiros de Cardiologia Maio 2005
- 96 –
Anexos
Arq Bras Cardiol. 2005 May;84(5):360-6. Epub 2005 May 24.
[Sustained improvement in symptoms and exercise capacity up to
six months after autologous transendocardial transplantation of
bone marrow mononuclear cells in patients with severe ischemic
heart disease]
[Article in Portuguese]
Dohmann HF, Perin EC, Borojevic R, Silva SA, Souza AL, Silva GV, Assad JA, Rossi MI,
Mesquita CT, Dohmann HJ.
Hospital Pro-Cardiatico, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
[email protected]
OBJECTIVE: This study aimed at assessing the effects of autologous transendocardial
transplantation of bone marrow mononuclear cells (ATTBMMC) on symptoms, exercise
capacity, myocardial perfusion and contractility in patients with severe ischemic heart disease
during a 6-month follow-up period. METHODS: This prospective study comprised 21 patients
as follows: the first 14 patients forming the treated group, and the last 7 patients forming the
control group. Initially, all patients underwent clinical and laboratory assessment, treadmill
testing, echocardiography, myocardial scintigraphy, and 24-hour Holter. The bone marrow
mononuclear cells (BMMC) were isolated, washed, and diluted in 0.9% saline solution for
transendocardial injection in areas of viable myocardium in the treated group, (15 0.2-mL
injections). All patients were reassessed in the end of 2 and 6 months of follow-up. RESULTS:
The demographic data and other characteristics did not significantly differ between the groups in
the initial evaluation. No major adverse events related to the ATTBMMC were observed. In the
end of 6 months, a reduction in the ischemic area was observed on nuclear perfusion imaging
(P=0.05), as was a significant improvement in symptoms, functional capacity, and left
ventricular overall function. CONCLUSION: This study showed that transendocardial injections
of BMMC are safe in human beings with ischemic heart disease associated with severe
ventricular dysfunction. The effects observed in the short run were maintained up to the sixth
month of follow-up.
Publication Types:
•
Clinical Trial
- 97 –
Anexos
Artigo Original
Melhora Sintomática e da Capacidade de Exercício Após o Transplante
Autólogo, Transendocárdico, de Células Mononucleares da Medula Óssea em
Pacientes com Cardiopatia Isquêmica Grave, Sustentada até o Sexto Mês de
Evolução
Sustained Improvement in Symptoms and Exercise Capacity up to Six MonthsAfter Autologous
Transendocardial Transplantation of Bone Marrow Mononuclear Cells in Patients With Severe
Ischemic Heart Disease
Hans Fernando R. Dohmann, Emerson C. Perin, Radovan Borojevic, Suzana A. Silva, Andre L.
S. Souza, Guilherme V. Silva, João A. R. Assad, Maria I. D. Rossi, Claudio T. Mesquita, Hans J.
Dohmann
Rio de Janeiro, RJ – Houston, TX - USA
Hospital Pró-Cardíaco, Universidade Federal do Rio de Janeiro,Texas Heart Institute, CAPES do Brasil
Correspondência: Hans Fernando R. Dohmann. Av. N. Sra. de Copacabana, 2/602 - 22010-120 - Rio de Janeiro,
RJ
E-mail: [email protected]/[email protected]
Recebido em 28/06/2004 - Aceito em 11/02/2005
Palavras-chave: células • insuficiência cardíaca • isquemia • revascularização • terapia gênica
Key words: cells • heart failure • ischemia • revascularization • gene therapy
Introdução
Em função do aprimoramento das diversas técnicas de revascularização miocárdica, percutâneas ou cirúrgicas,
permitir resultados cada vez mais efetivos quanto à redução da morbidade e mortalidade de coronariopatas
agudos e crônicos, o número de pacientes com cardiomiopatia isquêmica cresce progressivamente e é
responsável por mais da metade de todas as internações por insuficiência cardíaca, gerando no Brasil, segundo
dados do DATASUS, mais de 400.000 internações/ano.1
A taxa de mortalidade entre os pacientes com cardiomiopatia isquêmica é elevada e torna-se ainda maior no
subgrupo de pacientes com insuficiência cardíaca, superando a taxa de 30% ao ano.2 Devido à elevada
morbidade e mortalidade, estes casos consomem uma grande quantidade dos recursos do sistema de saúde.
Entender as características clínicas desta população é fundamental para que possamos identificar e desenvolver
novas técnicas capazes de suprir as necessidades desta parcela de pacientes.
Várias estratégias terapêuticas vêm sendo testadas para o tratamento tanto dos secundários à disfunção
ventricular quanto daqueles secundários ao déficit perfusional, crônico e refratário às técnicas disponíveis de
revascularização miocárdica. Estas estratégias incluem o uso intermitente ou em longo prazo de uroquinase;3-5
neuroestimulação;6 revascularização transmiocárdica por laser, radiofreqüência ou mecânica;7-12 e
neoangiogênese através do implante de fatores de crescimento endoteliais.13-20 Nenhuma destas técnicas, no
entanto, a despeito de alguns anos de desenvolvimento, demonstrou efetividade, no sentido de alterar o mau
prognóstico destes pacientes, de forma a justificar seu emprego clínico rotineiro.7-12
Mais recentemente, alternativas relacionadas à terapia celular começaram a ser desenvolvidas. Vários estudos
recentes vêm sugerindo que células originadas na medula óssea também participam intensamente da regeneração
de várias estruturas do sistema cardiovascular.
O implante de células para o tratamento de doenças cardiovasculares encontra-se sob investigação em vários
centros no mundo. Várias linhagens celulares têm sido investigadas em modelos experimentais21-26 e as
primeiras séries de casos em humanos já foram descritas.27-31
Duas fontes de células foram utilizadas em humanos até o momento: a musculatura esquelética (origem dos
mioblastos)29 e a medula óssea (fonte de células tronco nos adultos).31,32
É consistente na literatura internacional, a utilização de células originadas da MO em experimentos de
neovascularização utilizando a via intracoronariana, a transendocárdica e a transepicárdica. Em modelos
experimentais de isquemia miocárdica aguda e crônica,22,33-43 o implante de (CMMO) células mononucleares de
medula óssea foi capaz de melhorar a contração e a perfusão miocárdica.22,41,42,44,45 Tais resultados foram
reproduzidos em estudo clínicos recentes, de fase 1, em humanos.30,31,46-49, incluindo nossa publicação anterior
quando avaliamos a segurança deste procedimento.50
Este estudo tem por objetivo avaliar a evolução clínica até seis meses após o TACMMO, sob a hipótese de que
este tratamento é capaz de promover neovascularização e, conseqüentemente, resultar em melhora sintomática e
da capacidade de exercício em pacientes com cardiopatia isquêmica grave, sem indicação para outras alternativas
de revascularização.48
Métodos
Estudo prospectivo, não randomizado, de 21 pacientes com cardiopatia isquêmica grave e sem outra opção de
terapia de revascularização miocárdica, percutânea ou cirúrgica. A metodologia detalhada deste estudo foi
publicada recentemente.50
Os critérios de inclusão foram: (1) doença arterial coronariana crônica com defeito de perfusão reversível
detectado pela cintilografia miocárdica (SPECT); (2) fração de ejeção (FE) do ventrículo esquerdo (VE) < 40%;
(3) inelegibilidade para revascularização miocárdica percutânea ou cirúrgica, avaliada pela coronariografia; (4)
termo de consentimento livre e esclarecido assinado. A inelegibilidade para procedimentos de revascularização
miocárdica cirúrgica ou percutânea foi determinada por 2 comitês: um comitê cirúrgico composto por 2
cirurgiões cardiovasculares e um cardiologista clínico, e um comitê intervencionista formado por 2
cardiologistas intervencionistas e um cardiologista clínico. Os critérios de exclusão foram: (1) dificuldade em
obter acesso vascular para procedimentos percutâneos; (2) história de neoplasia ou outra co-morbidade prévia ou
concomitante que pudesse ter impacto na sobrevida em curto prazo deste paciente; (3) arritmias ventriculares
malignas; (4) aneurisma do VE; (5) anormalidades laboratoriais inexplicadas; (6) tecido ósseo com aspecto
radiológico anormal; (7) doença hematológica primária; (8) infarto agudo do miocárdio nos 3 meses prévios a
inclusão no protocolo; (9) presença de trombo intraventricular; (10) instabilidade hemodinâmica no momento do
procedimento; (11) fibrilação atrial; ou (12) qualquer condição que, no julgamento do investigador, pudesse
colocar o paciente em risco.
Os sintomas de angina e insuficiência cardíaca seguiram a Classificação da Sociedade Canadense de Cardiologia
(CSCC) e da Associação do Coração de Nova Iorque (NYHA, do inglês “New York Heart Association”),
respectivamente.
As seguintes avaliações foram realizadas: Teste ergométrico (protocolo de rampa), com utilização do pico de
VO2 para avaliação do consumo máximo de oxigênio; ecocardiograma uni e bidimensional com Doppler,
utilizando a técnica de Simpson; cintilografia miocárdica com estresse farmacológico com dipiridamol, dosagem
de peptídeo natriurético cerebral (BNP, do inglês “Brain Natriuretic Peptide”), eletrocardiograma e avaliação
clínica.
Os pacientes do grupo tratado foram submetidos à avaliação invasiva através de coronariografia, ventriculografia
esquerda e mapeamento eletromecânico imediatamente antes do procedimento de injeção e 4 meses após. O
sistema NOGA (Cordis) foi utilizado para o mapeamento eletromecânico com o objetivo de identificar a área
de miocárdio viável (voltagem unipolar > 6.9 mV) e guiar a injeção da solução de células mononucleares.
Os pacientes do grupo controle foram submetidos somente aos exames não invasivos descritos neste protocolo.
Ambos os grupos tratado e controle foram submetidos à reavaliação no seguimento de 2 e 6 meses, utilizando os
mesmos procedimentos realizados na avaliação inicial. Cabe ressaltar que todos os pacientes estavam com o
tratamento clínico pleno, na dose máxima tolerada, no momento da inclusão no protocolo, sendo que 50% dos
pacientes do grupo controle e 70% dos pacientes do grupo tratado estavam em tratamento com betabloqueador
no início do protocolo (p=NS) (Tabela II).
Aspiração, isolamento das células mononucleares da medula óssea
Cerca de 4 horas antes da injeção transendocárdica de células mononucleares, 50ml de aspirado da medula óssea
foram obtidos da crista ilíaca posterior dos pacientes alocados no grupo tratado, sob anestesia local associada à
sedação/analgesia. As células mononucleares foram isoladas pelo gradiente de Ficoll (Amersham
Biosciences), exaustivamente lavadas com salina heparinizada contendo albumina humana 5% e posteriormente
filtradas através de uma peneira de nylon de 100 µm para remover os agregados celulares. Uma pequena fração
da suspensão de células foi utilizada para citometria e avaliação da viabilidade celular pelo método de exclusão
utilizando azul de trypan, com demonstração de viabilidade celular superior a 90% (96,2+4,9%), garantindo a
qualidade da suspensão.
A caracterização dos marcadores de diferenciação leucocitária por citometria de fluxo e a avaliação funcional
também foi realizada em uma fração das células obtidas. A capacidade clonogênica dos progenitores
hematopoiéticos foi avaliada pelas unidades formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos, conforme
previamente descrito.51 Culturas de bactérias e fungos das preparações de células clinicamente utilizadas foram
realizadas.
Implante das células mononucleares da medula óssea
Os pacientes alocados no grupo tratado foram transferidos para o laboratório de intervenção cardiovascular cerca
de 3 horas antes do início do procedimento, para realização de coronariografia e ventriculografia esquerda
seguida de mapeamento eletromecânico, a fim de identificar áreas de miocárdio viável definidas como voltagem
unipolar preservada (>6,9 mV) e atividade mecânica diminuída (encurtamento linear local <12%).52,53 As
injeções transendocárdicas, com o cateter NOGA MyoStar®, foram realizadas em pontos com estas
características.
Cada ponto de injeção foi cuidadosamente avaliado antes das injeções, utilizando-se os seguintes critérios: 1)
posição perpendicular do cateter na parede do ventrículo esquerdo; 2) excelente estabilidade do cateter (“Loop
Stability” < 4mm) e 3) presença de extra-sístole ventricular à exteriorização da agulha no miocárdio. Foram
realizadas 15 injeções de 0,2ml cada (25.5± 6.3x106 células/paciente).
Análise estatística
As diferenças nas características demográficas, entre os grupos, foram avaliadas através do teste qui-quadrado.
Teste exato de Fisher e Teste T foram utilizados para as variáveis discretas e contínuas, respectivamente. A
comparação das mudanças ocorridas entre a fase inicial e o seguimento de 2 e 6 meses no grupo tratado e no
grupo controle foi feita através do teste ANOVA para medidas repetidas. A avaliação das mudanças ocorridas ao
longo do seguimento de 6 meses do grupo tratado em relação ao grupo controle foi feita através do modelo
ANOVA para medidas repetidas, incluindo a interação entre os dois grupos, com análise Pos hoc de KruskalWallis para variáveis não paramétricas e para variáveis contínuas com distribuição assimétrica. Análise Pos hoc
com correção de Bonferroni foi realizada para variáveis contínuas, com distribuição normal. Um valor de p<0.05
foi considerado estatisticamente significativo.
Bioética
O Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo seres humanos do Hospital Pró-Cardíaco e a Comissão Nacional de
Ética em Pesquisa (CONEP) aprovaram o protocolo de pesquisa.
Resultados
Não houve diferenças quanto às características clínicas entre os grupos (tabela I). Os pacientes foram tratados de
acordo com a diretriz brasileira para o tratamento de insuficiência cardíaca.54 Todos os pacientes utilizaram
inibidores da enzima conversora de angiotensina (IECA) ou inibidores do receptor de angiotensina. Setenta e um
por cento dos pacientes do grupo tratado e 50% dos pacientes do grupo controle estavam em uso de
betabloqueadores. Não houve diferença no uso de nitratos, IECA, beta bloqueadores ou diuréticos nos 6 meses
de seguimento, conforme demonstrado na Tabela II e Figura 1.
As características da população celular estão descritas na Tabela III. A viabilidade celular foi acima de 95%
(96.2±4.9%), garantindo a qualidade da suspensão de células. As culturas de fungos e bactérias foram negativas.
O tempo total do procedimento de injeção foi de 81 ± 19 minutos. Os mapas eletromecânicos contaram com 92
± 16 pontos.
Não houve complicações maiores relacionadas ao procedimento. Um paciente teve um episódio transitório de
congestão pulmonar que foi tratado com diuréticos e dobutamina. Nenhuma arritmia sustentada foi observada
durante o procedimento. Não foi detectado caso algum de derrame pericárdico nos exames seriados de
ecocardiografia realizados nas 48 horas após o procedimento. Todos os pacientes tiveram alta hospitalar 48 horas
após o procedimento de injeção conforme previsto no protocolo.
Um paciente do grupo controle morreu 2 semanas após a entrada no estudo e não foi incluído na análise. Um
paciente do grupo tratado morreu na 14a semana de seguimento por morte súbita, precedida por precordialgia de
forte intensidade. Os familiares recusaram a necrópsia.
Os pacientes do grupo tratado apresentaram menos sintomas de insuficiência cardíaca e angina após 2 e 6 meses
de seguimento quando comparados ao grupo controle (p = 0,0001 e 0,008, respectivamente).
Não houve incidência de arritmias ventriculares graves na análise pelo holter de 24h realizado nas 24 horas
imediatamente após o procedimento e nos seguimentos de 2 e 6 meses. Houve uma tendência à redução no
número de extra-sístoles ventriculares de 4.445+8.512/24h para 941+1.244/24h (p = 0,08) mantendo este padrão
até o 6o mês de seguimento. O percentual de ESV variou não significativamente de 3,8±6,8% para 0,9±1,14%
em 2 meses e para 0,95±1,28% em 6 meses.
No acompanhamento de 6 meses, dentre todos os valores laboratoriais (Tabela IV), somente os níveis séricos de
creatinina variaram entre o grupo controle e o grupo tratado. Os níveis séricos de creatinina aumentaram
significativamente no grupo controle quando comparados ao grupo tratado (p = 0,02). Os níveis de PCRt na
avaliação inicial e no seguimento de 2 e 6 meses não apresentaram diferença significativa entre os 2 grupos
(p=0,8). Houve aumento dos níveis séricos de BNP no grupo controle em relação ao grupo tratado, no
seguimento de 6 meses (p = 0,003).
Na avaliação inicial a geometria ventricular diferiu significativamente entre os grupos. O grupo controle
apresentou volumes sistólico e diastólico finais menores (p < 0,001) assim uma FE inicial maior (p = 0,054). No
entanto, no seguimento de 6 meses a FE diminuiu de forma significativa no grupo controle (p = 0,05), o que não
aconteceu no grupo tratado. Os volumes cavitários se mantiveram inalterados em ambos os grupos.
O pico de VO2 foi semelhante entre os 2 grupos na avaliação inicial e ocorreu aumento significativo após 2
meses no grupo tratado (de 17,96±8,78 para 23,40±8,30, p = 0,01), que se manteve (24,20±7,50) aos 6 meses de
seguimento (p = 0,05), o que não foi observado no grupo controle (Tabela V). Esta variação do pico de VO2 não
foi suficiente para gerar diferença estatística significativa na interação entre os grupos tratado e controle ao final
de 6 meses de seguimento.
O tamanho do total de defeito de perfusão reversível (TDPR) (isquemia) e o percentual de defeito de perfusão
em repouso (PDPR) com 50% de atividade (cicatriz) foi semelhante entre os grupos na avaliação inicial. Não
houve variação do PDPR 50% em 2 ou 6 meses, em ambos os grupos. No grupo tratado houve redução absoluta,
significativa, de 10% do DPRT (p = 0,022) ao final de 2 meses (redução relativa de 73%) diferindo de forma
significativa em relação ao grupo controle. Ao final de 6 meses, esta redução absoluta da área isquêmica perdeu
4% do seu impacto inical, porém, mantendo uma redução absoluta (em relação à avaliação inicial) de 6% (tabela
V), bem como uma diferença significativa em relação ao grupo controle (p=0,05). Na Figura 2 está ilustrado um
exemplo de resolução da isquemia ínfero-lateral em um paciente tratado.
Discussão
Este estudo descreve pela primeira vez a evolução de médio prazo (6 meses) de pacientes submetidos ao
transplante transendocárdico com células autólogas mononucleares da medula óssea por meio de injeções
transendocárdicas em pacientes com grave disfunção ventricular. Estes resultados sugerem que a injeção de
CMMOs é uma terapia segura, tanto no curto prazo 50, quanto em sua evolução de 6 meses.
Existem estudos em modelos experimentais na literatura que embasam a possibilidade da neovascularização em
tecidos isquêmicos com o transplante de CMMO. Nosso grupo demonstrou em ratos a capacidade de células da
medula óssea gerarem um processo angiogênico, o que ficou demonstrado através de dados funcionais e
histopatológicos.55 Outros grupos obtiveram resultados semelhantes, incluindo Fuchs e Kawamoto que
estudaram porcos com isquemia miocárdica crônica induzida por implante de constritores na coronária e que a
seguir foram submetidos ao transplante de CMMO. Os animais foram avaliados antes de 1 mês, incluindo a
análise histopatológica, e os autores observaram melhora da perfusão miocárdica relacionada ao
desenvolvimento de novos vasos.22,40 Portanto, neste estudo, a melhora da perfusão miocárdica observada nas
áreas injetadas no grupo de pacientes tratados pode ter como um de seus mecanismos a angiogênese. Embora
não descrito nos resultados, a maioria dos pacientes referiu melhora dos sintomas a partir da segunda semana, o
que só pôde ser demonstrado em 8 semanas conforme o desenho do estudo.
A demonstração objetiva da melhora de perfusão é fundamental quando estamos lidando com técnicas de
angiogênese, as quais contam com dados da literatura demonstrando serem altamente suscetíveis a efeito
placebo.13-19 Recentemente foram descritos relatos de melhora sintomática de pacientes submetidos a
revascularização direta por laser,7-12 que no entanto não foram confirmadas, em estudo randomizado e duplocego.56,57 É importante lembrar, no entanto, que ao contrário do observado com a terapia celular, a
revascularização direta com laser não foi capaz de demonstrar nenhuma melhora dos exames de perfusão
miocárdica por cintilografia. De forma diferente, nosso grupo, assim como outros, já relatou melhora do padrão
de perfusão miocárdica dos pacientes submetidos ao transplante de células tronco monucleares da medula
óssea.48-50
Resultados clínicos preliminares em pacientes com infarto agudo do miocárdio recente sugerem uma redução na
área de fibrose após terapia com células mononucleares de medula óssea30,31. No entanto, não há nenhum dado
clínico que sugira este tipo de efeito no modelo de pacientes, com grave disfunção ventricular, apresentado no
nosso estudo. Ao contrário, além do fato destes pacientes não terem apresentado melhora do defeito da
cintilografia em repouso, o que sugeriria um possível efeito miogênico, devemos observar que houve melhora do
VSF e não do VDF sugerindo um melhor desempenho contrátil das áreas viáveis e não o surgimento de novas
áreas viáveis. Uma vez que as células foram injetadas somente em áreas de miocárdio isquêmico, é razoável
imaginar que aquele meio (micro) ambiente oferecesse forte sinalização angiogênica para as células
transplantadas, como, por exemplo, pela presença do Fator de Hipóxia Tecidual (HIF-1, do inglês “hipoxia
inducible factor”) gerando Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF, do inglês “vascular endothelial
growth factor”). Se esta hipótese se confirmar, a precisão na técnica de liberação celular poderá ser de
importância para se atingir os objetivos terapêuticos de cada paciente.
Embora o pequeno número de pacientes e o desenho aberto do estudo possam justificar diferenças estatísticas
observadas na comparação de algumas variáveis (efeito hawthorne),58 os dados apresentados sugerem que os
resultados demonstrados podem ser secundários à melhora da perfusão miocárdica.
Conclusão
Neste estudo inicial prospectivo, não randomizado, em pacientes com doença arterial coronária com grave
disfunção ventricular e sem outra opção de tratamento, não observamos efeitos adversos graves relacionados ao
procedimento, seja na fase de internação, seja no seguimento de 6 meses. Neste período de acompanhamento
não observamos deterioração de parâmetros mecânicos e de perfusão nas áreas injetadas, assim como não
observamos qualquer sinal de disfunção do sistema de condução. Houve melhora dos sintomas, da função
cardíaca e da perfusão miocárdica no grupo tratado em relação ao grupo controle. Nós acreditamos que possa
existir um enorme potencial clínico para esta técnica. Investigações futuras conduzidas em estudos maiores e
randomizados são necessárias.
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ANEXO V
Trabalho publicado na Revista Circulation Julho 2005
- 110 Anexos
Circulation. 2005 Jul 26;112(4):521-6. Epub 2005 Jul 18.
Transendocardial autologous bone marrow mononuclear cell
injection in ischemic heart failure: postmortem
anatomicopathologic and immunohistochemical findings.
Dohmann HF, Perin EC, Takiya CM, Silva GV, Silva SA, Sousa AL, Mesquita CT, Rossi
MI, Pascarelli BM, Assis IM, Dutra HS, Assad JA, Castello-Branco RV, Drummond C,
Dohmann HJ, Willerson JT, Borojevic R.
Hospital Procardiaco, Rio de Janeiro, Brazil. [email protected]
BACKGROUND: Cell-based therapies for treatment of ischemic heart disease are currently
under investigation. We previously reported the results of a phase I trial of transendocardial
injection of autologous bone marrow mononuclear (ABMM) cells in patients with end-stage
ischemic heart disease. The current report focuses on postmortem cardiac findings from one of
the treated patients, who died 11 months after cell therapy. METHODS AND RESULTS:
Anatomicopathologic, morphometric, and immunocytochemical findings from the anterolateral
ventricular wall (with cell therapy) were compared with findings from the interventricular
septum (normal perfusion and no cell therapy) and from the inferoposterior ventricular wall
(extensive scar tissue and no cell therapy). No signs of adverse events were found in the cellinjected areas. Capillary density was significantly higher (P<0.001) in the anterolateral wall than
in the previously infarcted tissue in the posterior wall. The prominent vasculature of the
anterolateral wall was associated with hyperplasia of pericytes, mural cells, and adventitia. Some
of these cells had acquired cytoskeletal elements and contractile proteins (troponin, sarcomeric
alpha-actinin, actinin), as well as the morphology of cardiomyocytes, and appeared to have
migrated toward adjacent bundles of cardiomyocytes. CONCLUSIONS: Eleven months after
treatment, morphological and immunocytochemical analysis of the sites of ABMM cell injection
showed no abnormal cell growth or tissue lesions and suggested that an active process of
angiogenesis was present in both the fibrotic cicatricial tissue and the adjacent cardiac muscle.
Some of the pericytes had acquired the morphology of cardiomyocytes, suggesting long-term
sequential regeneration of the cardiac vascular tree and muscle.
Publication Types:
•
Case Reports
- 111 Anexos
Transendocardial Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Injection
in Ischemic Heart Failure: Postmortem Anatomicopathologic and
Immunohistochemical Findings
[Original Articles: Heart Failure]
Dohmann, Hans F.R. MD*; Perin, Emerson C. MD, PhD*; Takiya, Christina M. MD, PhD; Silva,
Guilherme V. MD; Silva, Suzana A. MD; Sousa, Andre L.S. MD; Mesquita, Claudio T. MD, PhD; Rossi,
Maria-Isabel D. PhD; Pascarelli, Bernardo M.O. MD; Assis, Isabella M. MD; Dutra, Helio S. PhD;
Assad, João A.R. MD; Castello-Branco, Rodrigo V. MD; Drummond, Cantidio MD; Dohmann, Hans J.F.
MD, PhD; Willerson, James T. MD; Borojevic, Radovan PhD
From the Hospital Procardiaco (H.F.R.D., S.A.S., A.L.S.S., C.T.M., J.A.R.A., R.V.C.B., C.D., H.J.F.D.),
Rio de Janeiro, Brazil; the Texas Heart Institute at St. Luke’s Episcopal Hospital (E.C.P., G.V.S., J.T.W.),
Houston, Tex; and the Institute of Biomedical Sciences and Clementino Fraga Filho Hospital, Federal
University (C.M.T., M.-I.D.R., B.M.O.P., I.M.A., H.S.D., R.B.), Rio de Janeiro, Brazil.
Received March 31, 2004; de novo received August 13, 2004; revision received January 28, 2005;
accepted February 23, 2005.
*Drs Dohmann and Perin are coprincipal investigators.
Correspondence to Hans F.R. Dohmann, MD, Rua General Polidoro 192, 22080-000 Rio de Janeiro,
Brazil (e-mail [email protected]), or Emerson C. Perin, MD, 6624 Fannin, Suite
2220, Houston TX 77030 (e-mail [email protected]).
Introduction
The role of cell-based therapy for the treatment of ischemic heart disease is currently under investigation.
In view of the myocardium’s limited capacity to regenerate spontaneously after an ischemic injury, the
therapeutic use of exogenous progenitor cells has recently gained increasing interest. In vitro
demonstration of functional cardiomyocyte differentiation from bone marrow–derived progenitor cells 1,2
has prompted in vivo studies in animal models, and promising results have been obtained in the repair and
regeneration of acute and chronic cardiac muscle lesions. Several types of progenitor cells have been used
in experimental models, including bone marrow–derived endothelial and blood cell progenitors, as well as
bone marrow mesenchymal progenitors.3–6
In humans, similar attempts have been made with surgical, intracoronary, or transendocardial introduction
of bone marrow–derived cells to improve cardiac lesions.7,8 Our group recently reported the results of
the first phase I human trial of transendocardial injection of autologous bone marrow mononuclear
(ABMM) cells in patients with end-stage ischemic heart disease.9 We observed a significant increase in
perfusion, contractility of ischemic myocardial segments, and functional capacity of the cell-injection
recipients. This report presents postmortem cardiac findings from one of these patients.
Case Report
The patient was a 55-year-old man with ischemic cardiomyopathy and 2 previous myocardial infarctions
(in 1985 and 2000). He began to have symptoms of congestive heart failure 2 years before study
enrollment. One year before enrollment, the patient had an ischemic stroke with mild residual right
hemiparesis and resultant episodes of chronic tonic-clonic seizures. His risk factors for coronary artery
disease included diabetes mellitus type II, hypertension, and hypercholesterolemia.
The patient’s functional capacity was evaluated at baseline by means of a ramp treadmill protocol 10 with
a peak maximal oxygen consumption ([latin capital V with dot above]o2max) of 15.9 mL · kg-1 · min -1 and
a workload of 4.51 metabolic equivalents (METs). A baseline single-photon-emission computed
tomography (SPECT) perfusion study showed a partially reversible perfusion defect in the anterolateral
wall, a fixed perfusion defect (scar) in the inferior and posterior walls, and normal perfusion in the septal
wall.
Cardiac catheterization revealed a left ventricular ejection fraction of 11%, a 70% ostial and an 85%
middle stenosis of the left anterior descending (LAD) coronary artery, an 80% proximal lesion of the left
circumflex (LCx) coronary artery, and total occlusion of the first obtuse marginal artery and right
coronary artery. The distal segments of the LAD and LCx were diffusely diseased. Owing to the severity
and extent of the patient’s coronary disease, he was not considered a candidate for surgical or
interventional procedures. At enrollment in our study, he was in New York Heart Association (NYHA)
- 112 Anexos
functional class III and Canadian Cardiovascular Society (CCS) angina class III. His serum C-reactive
protein level, complete blood count, creatine kinase level, and troponin level were normal at baseline.
The patient received a total of 3×107 ABMM cells (the Table) that had been harvested 2 hours before the
procedure. With the guidance of electromechanical mapping,11,12 the cells were injected
transendocardially into the anterolateral wall of the left ventricle. No periprocedural complications were
observed.
Table. Phenotype and Functional Characterization of
3×107 Cells Injected via a Transendocardial Route
Noninvasive follow-up evaluation was performed 2 and 6 months after cell therapy. Invasive follow-up
evaluation, with cardiac catheterization, was performed at 4 months and revealed no change in coronary
anatomy. Symptomatic and functional improvements were noted because the patient returned to NYHA
and CCS class I. Holter monitoring showed no malignant ventricular arrhythmias, and signal-averaged
ECG parameters remained stable. There was no change in the patient’s medications after cell therapy.
There was no change in the global ejection fraction or left ventricular volume on echocardiography. The
wall-motion index score (on 2-dimensional echocardiography) improved from 1.94 to 1.65 as contractility
increased in 5 segments adjacent to the injected area. Myocardial perfusion, as assessed by SPECT,
improved in the anterolateral wall. Mechanical data derived from SPECT showed improvements in
regional ejection fraction, wall motion, and thickening. In addition, during ramp treadmill testing, the
[latin capital V with dot above]o2max increased from 15.8 to 25.2 mL · kg-1 · min -1, and the METs
increased from 4.51 to 7.21 at 2 months. At 6-month follow-up testing, the [latin capital V with dot
above]o2max reached 31.6 mL · kg-1 · min-1, and the METs was 9.03.
From 6 to 11 months after the cell injection procedure, the patient’s cardiovascular condition remained
stable. At 11 months, however, he had a tonic-clonic seizure at home and was found in cardiopulmonary
arrest by family members.
Methods
After signed, informed consent was given by the family, an autopsy was performed, including
morphological and immunocytochemical analysis of the heart. This report presents the
anatomicopathologic findings about the infarcted areas of the anterolateral ventricular wall, which were
the areas that had received bone marrow cell injections. The histological findings from this region were
compared with findings from within the interventricular septum (which had normal perfusion in the
central region and no cell therapy) and findings from the previously infarcted inferoposterior ventricular
wall (which had extensive scarring and no cell therapy).
Immunocytochemical analysis of paraffin sections was performed with antibodies against factor VIII–
related antigen (A0082, Dako), vimentin (M0725, Dako), smooth muscle [alpha]-actin (M0851, Dako),
and CD34 and Ki-67 (NCL-l-End and NCL-Ki67MM1 respectively, Novocastra). Antibodies were
reacted with Dako’s EnVision+ System/HRP, with diaminobenzidine as a chromogen. Frozen sections
were fixed, permeated with acetone, and incubated with antibodies for troponin T (T6277, Sigma),
smooth muscle [alpha]-actin, sarcomeric actinin (A7811, Sigma), and desmin (D1033, Sigma).
Antibodies were revealed with anti-mouse or anti-rabbit IgG, F(ab)2 fragment, conjugated to fluorescein
- 113 Anexos
isothiocyanate (1814192 and 1238833, respectively, Boehringer-Mannheim), and counterstained with a
0.1‰ solution of Evans blue dye (Merck).
Capillary density was monitored by using computerized image analysis (Image-Pro Plus,
MediaCybernetics) of randomly selected fields in sections stained with hematoxylin and reacted with
antibody for factor VIII–related antigen (n=108) and randomly selected fields in sections reacted with
antibodies for smooth muscle [alpha]-actin (n=96). Transverse sections of capillaries identified by
staining for factor VIII and pericyte-containing capillaries identified by staining for smooth muscle
[alpha]-actin were quantified separately. Results were expressed as the mean number of capillaries per
square millimeter in the case of factor VIII–stained slides or the number of capillaries containing
pericytes in [alpha]-smooth-muscle-actin–stained slides. Larger vessels identified by a continuous wall of
smooth muscle actin–positive mural cells were excluded. Differences between the anterolateral, septal,
and posterior walls were assessed with Kruskal-Wallis ANOVA and the Student-Newman-Keuls method
for pairwise multiple comparison. Results were considered significant if P was <0.05.
Evaluation of the capillary density inside the fibrotic areas within the cell-treated anterolateral wall versus
the nontreated posterior wall was performed in 40 selected fields inside the fibrotic scars, excluding the
regions containing cardiomyocytes. Microscope fields (at ×100) of factor VIII–stained slides were
digitized, and the number of transverse sections of capillaries per square millimeter of fibrotic zones was
assessed. Differences between the treated infarcted zones and the nontreated fibrotic wall were assessed
by the Mann-Whitney rank-sum test. Results were considered significant if P was <0.05.
Results
Anatomopathologic Findings
The heart weighed 765 g. There was severe arteriosclerosis with subocclusive calcified atheromata in all
coronary arteries, calcification of the pulmonary artery, and moderate atheromatosis of the aorta. The
heart cavities were dilated, with hypertrophic walls. There was no evidence of any acute injury or of
lesions that could be related to cell injections. A generalized, homogeneous endocardial opacification,
affecting all the cardiac internal surfaces, was identified on histological examination as diffuse
fibroelastic hyperplasia of the endocardium. Minute focal and punctate scars were observed, mainly in the
posterior and anterolateral walls.
The apical zone was thinned and fibrotic. The posterior and apical regions had dense, fibrotic, wellcircumscribed scars that separated cardiomyocyte bundles. The septal wall exhibited focal scars
interspersed with cardiac fibers in the regions adjacent to the anterior and posterior ventricular walls, but
it was devoid of fibrosis in the central region.
The anterolateral ventricular wall that received cell injections had elongated, irregular, and parallel
reddish areas throughout. In the same wall, in adjacent regions that did not receive injections, the density
and morphology of the fibrotic scars were similar to those of the posterior wall, suggesting that no overt
differences were present among the different infarcted areas before cell injections.
Morphometric Analysis
The capillary density was significantly higher in the areas of the anterolateral ventricular walls that
received cell injections than in the previously infarcted posterior wall (P<0.0001) (Figure 1A). The
median capillary density in the anterolateral wall was apparently similar to that in the septal wall.
However, the broad dispersion of the septal wall data, which may have been due to fibrotic areas in
regions close or adjacent to the ventricular walls, generated a statistically significant difference between
these 2 groups.
Figure 1. Number of capillaries per mm2 in anterolateral, posterior,
and septal walls of studied heart. A, Anti-factor VIII–associated
antigen counterstained with hematoxylin. B, Anti-smooth muscle
[alpha]-actin antigen counterstained with hematoxylin. C,
Capillaries reacted with anti-factor VIII–associated antigen inside
fibrotic areas only in anterolateral and posterior walls. (n=108
microscope fields for A; 96 microscope fields for B; and 40
microscopic fields for C.) Differences were statistically significant
- 114 Anexos
among all groups in pairwise comparisons (P<0.05, Newman-Keuls
method) for A and B. Differences were significantly different
(P<0.05) between anterolateral and posterior walls in MannWhitney rank-sum test for C.
The density of capillaries that contained smooth muscle [alpha]-actin–positive cells within their walls was
also assessed (Figure 1B). The number of such vessels was higher in the anterolateral wall than in the
septal and posterior walls (P<0.0001). Larger vessels identified by a continuous wall of smooth muscle
[alpha]-actin–positive mural cells were not included in these analyses. The capillary density was
significantly higher within fibrotic areas of the anterolateral wall than within fibrotic areas of the posterior
wall (P<0.0001) (Figure 1C).
Histological Findings
The anterolateral wall showed irregular, pale regions of fibrotic tissue intercalated with dark regions of
cardiac muscle arranged in roughly parallel, interspersed bands, perpendicular to the ventricular wall
plane (Figure 2A). No abnormal cell organization, growth, or differentiation or signs of previous focal
necrosis, inflammatory reactions, or tissue repair were found in the region that had received cell
injections. Inside the fibrotic tissue, trichrome and picrosirius collagen staining disclosed regions with
decreased collagen density, in which a rich vascular tree was present. The anterolateral wall also showed
larger central vessels that ramified into smaller ones, parallel to the cardiomyocyte bundles (Figure 2B).
In the anterolateral wall, the peripheral zone of fibrotic areas merged into the cardiomyocyte layer and
lacked well-defined limits, unlike the fibrotic areas observed in the posterior wall (Figure 2C). No fibrotic
tissue was seen in the central area of the septal wall (Figure 2D).
Figure 2. Gomori trichrome stain of anterolateral (A, B), posterior
(C), and septal (D) walls. Increased vascular tree is present in B.
Original magnification is ×40 in A, B, and D; ×100 in C.
Inflammatory cells were rare in the perivascular region: There were occasional isolated small groups of
lymphocytes and, very rarely, granulocytes. At the interface between fibrotic tissue and cardiomyocyte
bundles, 2 gradients merged: the decreasing blood vessel diameter and the increasing cardiomyocyte size.
Very small cardiomyocytes were seen isolated in the fibrotic matrix adjacent to capillaries in the
anterolateral wall, together with a progressively increasing number of fibroblastoid cells that were
isolated or interspersed in small groups among the cardiomyocyte bundles.
Immunocytochemistry Findings
Immunocytochemical labeling of factor VIII–associated antigen identified a thin endothelial layer of
blood vessels in the posterior, septal (Figure 3A), and anterolateral (Figure 3B) ventricular walls. In the
anterolateral wall, neither factor VIII nor CD34 was found in the fibroblastoid cell population inside the
fibrotic matrix. In the posterior ventricular wall and septum, smooth muscle [alpha]-actin was readily
identified in blood vessel wall cells. This protein was present both in pericytes and in the smooth muscle
- 115 Anexos
cells of the thin vessel wall layer (Figure 3C) in the anterolateral wall. The vascular tree of the
anterolateral wall showed intense labeling in the blood vessel walls, which had a marked hypertrophy of
smooth muscle cells (Figure 3D). The same staining pattern was present in isolated cells located in the
perivascular position and in the adjacent region among cardiomyocytes and fibrotic matrix (Figure 3E).
Vimentin was present in the endothelial layer of the anterolateral wall, in the perivascular cells, and in
cells adjacent to or in close contact with the cardiomyocytes (Figure 4A). These cells frequently formed
an extensive network that permeated the fibrotic matrix and the interstitial space among cardiomyocytes
(Figure 4B).
Figure 3. Immunocytochemical identification of factor VIII–
associated antigen (A, B) and smooth muscle [alpha]-actin (C–E) in
blood vessel walls of septal (A) and anterolateral (B–E) regions of
studied heart, depicting increased vascular density (B) and
hyperplasia of perivascular and mural cells (C–E). Ki67 reactivity
was rarely present in perivascular cells of anterolateral wall (F).
Original magnification ×40 in A and B, ×400 in C and D, and
×1000 in E and F.
Figure 4. Anterolateral wall that received cell injection therapy. A
and B, Immunostaining for vimentin depicted positive reaction in
vascular wall and in fibroblastoid interstitial cells. C and D,
Immunostaining for desmin showed small groups of intensely
reactive cells between blood vessels and cardiomyocytes (C) and
small cells inside cardiomyocyte bundles with typical striated
cytoskeleton (D). E and F, Immunostaining for troponin showed
positive reaction in all mural cells of medium-sized blood vessel.
Original magnification is ×1000 in A and F; ×400 in B–E.
Desmin was identified in the same cell population. Desmin labeling was less intense in the vascular wall
cells and isolated perivascular cells and was more intense in the cells adjacent to cardiomyocytes. On
sections perpendicular to the main cardiomyocyte axis, thin desmin-positive fibrils were observed mainly
in the submembrane region; on longitudinal sections, a typical transverse banded pattern of desmin was
observed (Figure 4C and 4D). Among cardiomyocytes, some of the small cells had strong, peripheral
desmin-stained areas (Figure 4D).
In vascular and perivascular cells in the posterior wall and septum, troponin labeling was negative. In the
anterolateral wall, troponin labeling was negative in capillary walls but was positive in the adjacent
- 116 Anexos
pericapillary pericytes and in cells migrating into the pericapillary matrix (Figure 4E). In larger vessels,
troponin-positive cells were observed in the outer cell layers and adventitia, occasionally forming a
continuous troponin-positive cell layer around the vessel (Figure 4F). Isolated cells or small groups of
troponin-positive cells were found in the area between the fibrotic tissue and cardiomyocytes and inside
the adjacent cardiomyocyte bundles. The intensity of labeling increased in the proximity of
cardiomyocytes, where some small fibroblastoid cells disclosed a bright cytoplasm homogeneously
labeled for troponin (Figure 5A). Occasionally, such cells had an increased volume, with troponin
labeling restricted to the periphery; the central area was filled by a troponin-negative cytoskeleton similar
to the desmin-stained areas in small cardiomyocytes. In mature cardiomyocytes, troponin-specific
antibody labeled the peripheral filamentous and sarcomeric cytoskeleton.
Figure 5. Anterolateral wall that received cell injection therapy. A,
Immunostaining for troponin depicted small cardiomyocyte-like
cells with intense reaction in peripheral cell area. B–F,
Immunostaining for sarcomeric actinin depicted reactivity in mural
cells of blood vessel (B–E) and isolated cells among
cardiomyocytes with actinin organization similar to that of
sarcomeres (E, F). Original magnification is ×400 in A and F;
×1000 in B–E.
Labeling of sarcomeric actinin was similar to that of troponin. However, both pericapillary pericytes and
mural blood vessel cells in the anterolateral region were negative for sarcomeric actinin in blood vessels
that were deeply embedded in the fibrotic scar matrix and that remained distant from cardiomyocyte
bundles. The same cells located in vessels adjacent to or embedded between the cardiomyocyte bundles
were positive for sarcomeric actinin, as were the isolated cells or small groups of fibroblastoid cells
(Figures 5B and 5C). Some of these cells had increased in size and, in their central region, disclosed
sarcomeric actinin that was already organized in the typical banded pattern of sarcomeres (Figures 5D and
5E). In this central region, isolated cells barely larger than pericytes could be observed; only a few
sarcomeres were present, suggesting that those isolated cells had acquired some cardiomyocyte
characteristics (Figure 5F).
The Ki67 antibody, which identifies cells actively engaged in replication, reacted only rarely with
endothelial cells in the posterior wall. In the anterolateral region, the Ki67 antibody also reacted with
pericapillary pericytes and with isolated fibroblastoid cells in the surrounding fibrotic matrix (Figure 3F).
The overall cell reactivity with Ki67 antibody was relatively low.
Discussion
Accumulating evidence from both experimental animal studies 4–6 and human trials 7–9 indicates that
ABMM cell therapy improves myocardial perfusion in patients with ischemic heart disease. At the same
time, clinical stem cell therapy research is focusing more on safety than on efficacy. The present report
describes the postmortem study of one patient who underwent transendocardial injection of ABMM cells.
Accordingly, the major findings in this report pertain to the procedure’s safety: No abnormal or
disorganized tissue growth, no abnormal vascular growth, and no enhanced inflammatory reactions were
observed. In addition, some intriguing histological and immunohistochemical findings were documented:
(1) There was a higher capillary density in the cell-treated area than in nontreated areas of the heart. (2) A
proliferation of smooth muscle [alpha]-actin–positive pericytes and mural cells was noted. (3) The
aforementioned cells expressed specific cardiomyocyte proteins.
In the postnatal period, new blood vessels form through either vasculogenesis or angiogenesis, in which
proliferation of endothelial cells is followed by remodeling of the extracellular matrix and proliferation of
- 117 Anexos
blood wall cells.13–15 Endothelial cells can result from bone marrow–derived progenitors (postnatal
vasculogenesis) or from the migration and proliferation of endothelial cells from existing vessels
(angiogenesis).16 Mural cells such as pericytes and smooth muscle cells can be derived from bone
marrow mesenchymal cells (stroma), myofibroblasts, and/or fibroblasts.17 In the neoangiogenic process,
pericytes are derived either from cells of adjacent tissues (mobilized by growth factors produced by
endothelial cells) or from proliferation of adventitial and pericapillary pericytes and their distal gliding on
the abluminal side of the growing blood vessel’s basement membranes.13 The alternative origination of
pericytes from mesenchymal stem cells has been proposed and preliminarily confirmed in experimental
models.18 Pericytes may be essential to achieve a physiological angiogenic process with resultant durable
blood vessels. In the present case, when compared with the noninjected regions, the cell-injected wall had
marked hyperplasia of pericytes and mural cells. The observed hypertrophic pericytes displayed 2
characteristics: First, although still located in the vascular wall, they expressed specific myocardial
proteins and second, they were found in locations that suggested detachment, having migrated into the
adjacent tissue and reached proximal cardiomyocytes that were either isolated or in small cell clumps.
Closer to cardiomyocytes, the expression of myocardial proteins was enhanced, yielding brighter
immunostaining throughout the whole cytoplasm. The significance of these findings remains to be
established. However, within the posterior wall, none of the findings was seen, and small blood vessels
could only rarely be found.
Notwithstanding the aforedescribed data, the present report has limitations that severely restrict our
ability to make conclusions about the role of ABMM cells in myocardial regeneration. The findings could
have occurred by chance. It is impossible to exclude the influence of a natural recovery process as the
cause for the difference in vascular density between cell-treated and nontreated areas. Comparisons of
capillary density among different sections of wall were based on specimens from a single patient.
Moreover, this is an isolated, uncontrolled case involving late events after injection of unlabeled cells; it
precluded the use of any imaging technique that could have helped to colocalize and identify the presence
of stem cell direct descendants within the vessel wall or myocardium. Therefore, the significant
difference in vascular density between cell-treated and nontreated areas cannot be extrapolated to a larger
population of similar patients. However, the increased vascular density within the cell-injected
anterolateral wall accompanied that wall’s improvement in perfusion as assessed by SPECT, whereas all
other walls remained unchanged.
Conclusion
At 11-month follow-up evaluation, stem cell therapy was not associated with any adverse histological
findings. Morphological and immunohistochemical analysis of the area that underwent ABMM cell
implantation suggested that that area had more capillaries than nontreated areas and that ABMM cell
therapy was associated with hyperplasia of pericytes, mural cells, and adventitia. Some of these cells had
acquired cytoskeletal elements and contractile proteins (desmin, troponin, and sarcomeric actinin).
Acknowledgments
The authors thank L. Maximilian Buja, MD, and Silvio Litovsky, MD, for reviewing the pathological
findings; Marianne Mallia-Hughes, ELS, and Virginia Fairchild of the Section of Scientific Publications
of the Texas Heart Institute, for editorial assistance; and William K. Vaughn, PhD, for assistance with
statistical questions.
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Key Words: angiogenesis; stem cells; heart failure; revascularization; ischemia
- 120 Anexos

Suzana Alves da Silva - ICES

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