ada - SBBq

ISOFORMAS DA ADENOSINA DESAMINASE
(ADA) EM UM MODELO DE PERITONITE
INFECCIOSA EM RATOS
Núbia M.M. Luna1; Cid F. Cavalcante1; Yacy M. Almeida2; Marcus R. Vale1 *
1
LAB. FARMACOLOGIA-BIOQUÍMICA - DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA - DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
FACULDADE DE MEDICINA - UFC. * [email protected], Rua Cel. Nunes de Melo, 1127, CEP 60430-270 –
Rodolfo Teófilo - Fortaleza-Ceará
2
Adenosine deaminase (ADA) isoforms in a model of infectious peritonitis in rats
Infectious peritonitis induced by perforation of caecum was used to study adenosine deaminase (ADA) and its
isoenzymes in acute inflammatory process. Sham-operated rats (SO) did not present variation in ADA activity
both in blood and in the peritoneal wash, in spite of the increase in total and relative number of PMN at 12
and 24 hours. The experimental group (EG) presented leucopoenia up to 24 hours (due to migration of PMN
to peritoneum) and ADA increase in blood and in peritoneal wash. In liver and spleen the total activity of
ADA was augmented (peak at 12 hours). Peritoneal wash showed two isoforms: 91kD (human ADA2-like)
and 35kD (human free ADA1-like) with similar levels. In liver and spleen the increased levels of ADA were
due to 95kD isoform but at 12 and 24 hours (in liver) and 24 and 48 hours (in spleen) it was detected low
activity of 35kD isoform which could be explained by leakage from tissues during the process. Much should
be studied to find about the role of ADA in acute inflammation, which seems to vary from species to species.
Introdução
A adenosina (Ad) é um
nucleosídeo purínico que age como sinal
extracelular mediando uma grande
número de respostas via interação com
seus receptores de membrana (Rodwell,
1998). Sua ação antiinflamatória já está
bem estabelecida. Bloqueia a adesão de
neutrófilos (Cronstein et al, 1986),
maturação e quimiotaxia de monócitos
(Fischer et al, 1985), produção de íons
superóxido pelos neutrófilos (Cronstein
et al, 1985), citotoxicidade das células
“killers” e “natural killers” (Grever et al,
1982), liberação de citocinas (Bouma et
al, 1996), inibição da síntese de LTB4
(Krump et al, 1996) e a liberação de
histamina pelos basófilos (Marone et al,
1979).
A adenosina desaminase (ADA)
que catalisa a desaminação da adenosina
e 2’deoxi-adenosina tem um papel
reconhecidamente
crítico
no
desenvolvimento e funções do sistema
imunológico, como por exemplo na
maturação dos monócitos (Fischer, et al.,
1976). Já está muito bem estabelecido,
em número relevante de publicações,
que a ADA tem sua atividade aumentada
em inúmeras doenças infecciosas tais
como
hepatite
e
tuberculose
(Krawczynski et al., 1965; Raczynska et
al., 1966; Goldberg et al., 1966;
Nishikawa et al, 1986; Pushpakon, 1990)
e alguns tipos de câncer (Durak et al.,
1994a; Durak et al, 1994b; Namiot et al.,
1994).
No Homem, a ADA é encontrada sob
duas formas: uma tissular (ADA1) e
outra sérica (ADA2) (Gakis et al., 1989;
Van der Weyden & Kelley, 1976). Gakis
et al., (1989) formularam a hipótese de
que os altos níveis de ADA sérica
poderiam ser o reflexo de sua liberação
pelo sistema monocítico-macrofágico
nas
doenças
causadas
por
microorganismos intracelulares. Em
algumas patologias onde há aumento da
atividade da ADA, uma isoforma pode
ser mais representativa do que outra,
como na tuberculose onde a ADA2 é a
que contribui essencialmente para o
aumento da atividade da ADA total.
Nosso laboratório desenvolve
diversos estudos dentro desta linha de
pesquisa
(Rodrigues
et
al.1999,
Rodrigues et al. 2000, Vale et al. 1998).
Partindo destes dados, surgiu o
interesse de investigar o comportamento
da ADA e suas possíveis isoformas no
processo de peritonite infecciosa em
ratos. Sabe-se que esta desencadeia uma
extensa ativação das células de defesa a
nível focal e sistêmico (Vasconcelos,
1998). Resta saber se a proliferação
dessas células e seu afluxo para o foco
da infecção modificam os níveis de
atividade da adenosina desaminase
(ADA) nos fluidos e tecidos envolvidos
na infecção, como também caracterizar e
discriminar o papel de cada isoforma
neste processo .
Experimental
Animais: ratas Wistar pesando entre 150
e 200g.
Indução da peritonite: os animais do
Grupo Peritonite (GP) foram submetidos
à laparotomia, tiveram o apêndice
exposto e o mesoceco seccionado. Após
a ordenha das fezes para o apêndice este
foi ligado e perfurado com agulha 21G.
Após sutura, os animais foram
hidratados e confinados, em jejum, mas
com água ad libitum. O Grupo Operado
(GO) teve o mesmo protocolo exceto a
ligadura e perfuração do apêndice. O
Grupo Controle (GC) não sofreu
qualquer intervenção cirúrgica.
Coleta de material: após 6, 12, 24, 48h
da indução da peritonite foi coletado
sangue do plexo retro-orbital e, após o
sacrifício, líquido ascítico diluído em
3ml de salina heparinizada. O material
foi usado para contagem total e
diferencial das células e, após a
centrifugação, os sobrenadantes foram
usados para o ensaio da enzima.
Ensaio da ADA: O ensaio da enzima está
baseado
na
determinação
da
concentração de amônia produzida na
desaminação da adenosina, pela
formação de azul de indofenol, que é
analisado
espectrofotometricamente
(628nm).
Filtração molecular: foi utilizada uma
coluna (Sephadex G200) de 30cm x
3cm, equilibrada em tampão de ensaio,
com fluxo 0,5ml/min. Frações de 2ml
eram coletadas e 100µl de cada fração
era utilizada para análise da ADA.
Resultados e Discussão
No
GP
observou-se
uma
leucopenia e aumento da celularidade na
cavidade peritoneal ( lavado peritoneal ),
com grande aumento no percentual de
polimorfonucleares (PMN) com pico às
12h (tabela 1), denunciando um processo
agudo de migração celular. A literatura
tem afirmado que a leucopenia é
conseqüência da remoção rápida dos
leucócitos do sangue circulante para um
tecido que sofreu intensa agressão. A
atividade
da
ADA
aumentou
acompanhando a elevação do percentual
de PMN no lavado peritoneal, atingindo
pico às 12h também. O GO não sofreu
alteração significante na contagem total
e diferencial de células nem na atividade
da ADA no plasma e lavado peritoneal
em relação ao GC.
Tabela 1 – Associação entre a atividade da ADA e o
percentual de PMN no lavado peritoneal
6h
12h
24h
48h
ADA
27.99± 3.5 48.76± 4.7 22.81± 2.3 12.38± 1.0
(U/L)
PMN
34.45± 2.1 71.36± 0.8 63.61± 0.7 28.42± 0.8
(%)
GC: 6.96± 0.5 U/L e 9.13± 0.9 %
O aumento significativo da
atividade da ADA (figura 1) é sugestivo
de que, durante o processo infeccioso
e/ou inflamatório focal grave, a ADA
apresenta intensa atividade e parece ser
uma enzima importante para manter a
imunidade mediada por células. Vários
trabalhos afirmam que a adenosina é
produzida em grande quantidade durante
isquemia e injúria tecidual e que, em
altas concentrações, passa a inibir a
resposta celular e humoral se os seus
níveis não forem modulados. A ADA é a
enzima chave desse processo. Nosso
trabalho mostra que a elevação dos
níveis de ADA no lavado peritoneal
acompanha temporalmente o aumento
percentual de PMN, sugerindo um
envolvimento dessas células com a
atividade da enzima.
(Figura 2C) as atividades de F1 e F2
foram equivalentes. É sabido que em
exsudatos peritoneais tuberculosos, entre
outros, ocorre alta atividade de ADA2 ao
passo que os níveis de ADA1 estão mais
baixos. Os presentes resultados mostram,
que neste caso, ambas as isoformas estão
envolvidas no processo. Não foi possível
coletar líquido peritoneal suficiente para
estudar o perfil de um animal normal
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
Frações
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
Frações
Controle
P-6h
P-12h
P-24h
P-48
***
U/L
50
***
***
25
η
p
75
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
Frações
***
0
Controle
P-6h
P-12h
P-24h
P-48
Figura 1 – Atividade da adenosina desaminase no lavado
peritoneal de ratos com peritonite
O exame do perfil cromatográfico do
exsudato peritoneal às 6 horas (Figura
2A) mostrou a presença de 2 isoformas:
F1 similar à ADA1 livre (35.000D) e F2
à ADA2 (91.000D) humanas, (pesos
moleculares aparentes padronizados pelo
nosso laboratório). A partir de 12h
(Figura 2B) a atividade apresentou um
pico com predominância de F1. Às 24h
Figura 2 – Perfil cromatográfico da atividade da ADA no
exsudato peritoneal de ratos após 6h (A), 12h (B) e 24h (C)
de indução da peritonite
As atividades específicas da ADA nos
homogenatos de fígado e baço no GP
também mostraram pico às 12h. (tabela
2). O GO não apresentou diferença
significante
O
estudo
do
perfil
cromatográfico do fígado às 12h de
indução da peritonite (Figura 3), onde
houve maior atividade, mostrou a
presença de F2 e traços de F1. Em todos
os períodos de indução da peritonite o
perfil comporta-se com o mesmo padrão:
predominância evidente da isoforma F2.
Sabe-se que em humanos a ADA2 é
sintetizada pelo sistema monocíticomacrofágico.
O
fígado
possui
representante celular desse sistema, que
são as células de Kupffer. Contudo fica o
questionamento se atividade tão
significantemente alta é devida somente
a esta população celular. Mais
interessante ainda é a presença de
pequena atividade de ADA na região
correspondente à F1 (ADA1 livre
humana símile), principalmente após 12
horas de indução da peritonite.
Esperava-se obter alta atividade dessa
isoforma em relação a F2.
200
Atividade da ADA
η moles de NH3
175
150
125
100
75
50
25
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
Frações
Figura 3 - Perfil cromatográfico da atividade da ADA no
homogenato de fígado de ratos após 12h de indução da
peritonite
O
estudo
do
perfil
cromatográfico do baço mostrou a
presença apenas da isoforma F2 que foi
responsável pelo pico às 12h de
indução.(figura 6). Os outros períodos
mostraram mesmo perfil.
200
η moles de NH3
Tabela 2- Atividade específica da ADA em homogenatos de
fígado e baço em nmoles\mg prot.\min
6h
12h
24h
48h
Fígado 17.32±0.6 22.52±1.3
14.26± 0.8 12.02± 0.6
Baço
21.57± 1.4 101.20±3.8
77.86± 3.3 21.56± 1.4
GC: 11.07±0.4 (Fígado), 15.05±0.4(Baço)
Atividade da ADA
175
150
125
100
75
50
25
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100
Frações
Figura 6 - Perfil cromatográfico da atividade da ADA no
homogenato de baço de ratos após 12h de indução da
peritonite
Conclusões
• O modelo de infecção utilizado no
nosso trabalho está bem estabelecido e
caracterizado;
• O aumento da atividade da ADA no
lavado peritoneal na peritonite induzida
acompanha a elevação de PMN;
• Na peritonite experimental em ratos
Wistar a ADA parece exercer importante
papel;
• Os perfis cromatográficos dos
exsudatos peritoneais revelaram a
presença de duas isoformas de pesos
moleculares compatíveis com a ADA1
livre e ADA2 humanas;
• O perfil cromatográfico do fígado
mostrou forte presença de uma isoforma
com peso molecular compatível com
ADA2 humana, o que levanta o
questionamento se em rato essa
isoenzima
seja
exclusivamente
sintetizada pelo sistema monocíticomacrofágico.
• O perfil cromatográfico do fígado
também é sugestivo da presença de ADA
com peso molecular correspondente à
ADA1
livre
humana,
contudo
apresentando atividade muito abaixo do
esperado.
• O perfil cromatográfico do baço
mostrou a presença de apenas uma
isoforma
com
peso
molecular
compatível com ADA2 humana.
• As duas isoformas parecem participar
do processo infeccioso em contradição
com as observações em humanos, onde a
ADA2 apresenta-se mais elevada em
líquidos infectados.
Agradecimentos
CNPq
Referencias Bibliográficas
Bouma, M. G.; Van den Wildenberg; F. A. J. M.;
Buurman, W. A. - Adenosine inhibits cytokine
release and expression of adhesion molecules by
activated human endothelial cells. J. Physiol.,
270: c522-c529, 1996.
Cronstein, N. B., Levin, R. I., Belanoff, J.,
Weissmann, G.; Hirschhorn, R. - Adenosine: An
endogenous inhibitor of neutrophil-mediated
injury to endothelial cells. J. Clin. Invest., 78:
760-770, 1986.
Cronstein, N. B., Rosenstein, E. D., Kramer, B.,
Weissman, G.; Hirschhorn, R. - Adenosine
physiological modulator of superoxide anion
generation by human neutrophils. Adenosine acts
via an a2 receptor on human neutrophils. J.
Immunol., 135: 1366-1371, 1985.
Durak I, Cetin R, Cambolat O et al
(1994a) - Adenosine deaminase,
5’nucleotidase, guanase and citidine
deaminase activities in gastric tissues
from patients with gastric cancer.
Cancer Lett. 84:199-202.
Durak I, Perk H, Kavutcu M. et al
(1994b) - Adenosine deaminase, 5’
nucleotidadse,
xanthine
oxidase
superoxide dismutase and catalase
activities in cancerous and noncancerous human bladder tissues. Free
Radical Biology and Medicine, 16:825831.
Fischer D, Van der Weyden MB,
Snyderman R et al. (1976) - A role for
adenosine deaminase in monocyte
maturation. J. Clin. Invest. 58:399-407.
Giusti, G. (1974) Adenosine deaminase.
In: Methods of Enzymatic Analysis,
Ed. Hans Ulrich Bergmeyer, Academic
Press, Inc., New York.
Goldberg DM, Fletcher MJ & Watts C
(1966) - Serum adenosine deaminase
activity in hepatic disease: A
comparative enzymological evaluation.
Clin. Chim. Acta, 14:720-728.
Grever, M. R., Siaw, M. F. E., Coleman, M. S.,
Whisler, R. L.; Barcerzac, S. P. - Inhibition of k
and nk limphocyte cytotoxicity by an inhibitor of
adenosine deaminase and deoxi-adenosine. J.
Immunol., 129:365-369, 1982.
Krawczynski J, Raczynska J. Jonas S et
al. (1965) - The activity of adenosine
deaminase in the blood serum of viral
hepatitis patients. Clin. Chim. Acta,
11:227-232.
Krump, E., Lemay, G.; Borgeat, P. Adenosine
a2
receptor-induced
inhibition of leukotriene b4 synthesis in
whole blood ex-vivo. J. Pharmacol.,
117:1639-1644, 1996.
Lowry, OH, Rosenborough, NJ, Farr,
AL & Randal, RJ (1951) - Protein
measurement with the Folin phenol
reagent. J. Biol. Chem., 193:265-275.
Marone, G., Findley, S. R.; Lichtenstein,
L. M. - Adenosine receptor of human
basophils: modulation of histamine
release. J. Immunol., 123:1473, 1979.
Namiot Z, Kemona A. Stasiewicz J et al
(1994) – Adenosine deaminase activity
in gastric cancer. Cancer Lett. 82:9598.
Nishikawa Y, Fukumoto K, Watanabe F
(1986) - Liver disease diagnosis based
on serum adenosine deaminase activity.
Jpn. J. Clin. Chem. 15:259-263.
Pushpakom R, Ong-Ajyooth S and
Bovornkitti S (1990) - The association of
adenosine deaminase activity with Tlymphocytes and subsets in pulmonary
tuberculosis
and
bronchogenic
carcinoma. J. Med. Assoc. Thai,
73:244-248.
Raczynska S, Jonas S & Krawczynski
(1966) - Diagnostic value of adenosine
deaminase in some liver disease. Clin.
Chim. Acta, 13:151-154.
humana. In: XIII Reunião Anual da
Federação das Sociedades de Biologia
Experimental, 1998 - Caxambu-MG –
Resumo P.122.
Rodrigues, L.F.S., Freire, G.H. e Vale,
M.R. (1999) – Caracterização da
adenosina desaminase em tecidos
caprinos
In:
Congresso
Latinoamericano de Especialistas em
Pequenos Ruminantes y Camélidos,
Montevideu, Uruguai.
Van der Weyden, MB & Kelley, WN
(1976) - Human adenosine deaminase
(Distribution and properties). J. Biol.
Chem., 251:5448-5456.
Rodrigues, L.F.S., Freire, G.H. e Vale,
M.R. (2000) – Multiple isoforms of
caprine adenosine deaminase. Israel J.
Vet. Med. 55:135-138.
Rodwell, V. W. Estrutura, função e replicação
das macromoléculas informacinais. In: Murray,
R. K.; Granner, D.K.; Mayes, P. A.; Rodwell, V.
W. – Harper: Bioquímica. 8a ed. Atheneu, .,
São Paulo, 1998.
Vale, M.R. e Almeida, Y.M. (1998) –
Discriminação das atividades das
isoenzimas da adenosina desaminase
Vasconcelos, R.P., Lima, L.F.A.,
Nascimento, C.S.R., Mattos, J.P.V., e
Vale, M.R. - Expressão da adenosina
desaminase na peritonite experimental
em ratos XIII Reunião Anual da
Federação das Sociedades de Biologia
Experimental, 1998 - Caxambu-MG Resumo 14.024, pp122.
Wichterman, KA, Baue, AE & Chaudry,
IH (1980) - Sepsis and septic shock - A
review of laboratory models and a
proposal. J. Surg. Res., 29:189-201.