1.3 Técnicas de análise em espectrometria de massas

1.3 Técnicas de análise em espectrometria de massas
I m ediat am ent e após a ionização da amostra, as moléculas ionizadas e no est ado gasoso ( ou plasm a) ent ram
no setor de análise do espect rômetro de massas.
Neste, os diferentes íons gerados na câmara de
ionização (íon molecular + fragmentos) serão
Separados de acordo com sua razão massa/carga
( m / z) . O set or de análise é que determina a acurância
do aparelho e em qual faixa de intervalo de massas
os compostos podem ser analisados. O setor de análise
pode ser de 4 tipos:
- de campo magnético e elét r ico ( em cojunto ou não)
- de quadrupolo
- de tempo de vôo (time of flight, TOF)
- de captura de íons (ion t rap)
- ressonância ciclotrônica de íons (FT- MS)
1
2
1.3.1 Analisadores de setor magnético e
setor magnético- elétrico ( dupla focalização)
Os primeiros espectrômetros de massas desenvolvidos
fizeram ( e ainda fazem ) uso da aplicação de um campo
magnét ico para a a separação dos íons. Na presença do
campo magnético, os íons são acelerados em um
trajeto semi- circular. O raio de trajetória dos íons irá
depender de sua razão m/z. O setor magnético irá
separar os íons também em função do raio de sua
trajetória (que por sua vez irá depender da razão m/z).
Os íons capazes de viajar ao longo de toda a trajetória
do setor de análise ir ão atingir a placa coletora de íons,
onde serão detectados.
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Em se utilizando somente um analisador magnético, os íons
serão separados de acordo com sua massa nominal (ou seja,
massa determinada por números inteiros), e por isso os
espectrômetros de massas compostos apenas de um setor de
análise m agnét ico são chamados de espectrômetros de
massas de baixa resolução. Já os espectrômetros de massas
que são constituídos por um setor de análise form ado por um
campo magnético acoplado a um setor elétrico pode separar
os íons de acordo com suas massas exatas, e por isso são
chamados de espectrômetros de massas de alta resolução.
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Quando os íons atravessam o setor magnético, atravessam
um campo magnético perpendicular ao seu movimento.
Como o campo magnét ico provoca a aceleração dos íons,
e a direção da aceleração é perpendicular ao seu movimento,
a velocidade dos íons permanecerá constante, mas estes
apresentarão uma trajetória circular. Consequentemente, a
geometria do setor magnético é semi- circular, para que os
íons possam atravessá- lo com uma velocidade constante.
Como os íons viajam à velocidade constante, será possível
separá- los de acordo com sua razão m/z.
B
V
r
Detector
1.3.1.1 Princípio da separação de íons nos analisadores
de setor magnético e setor magnético- elétrico
A energia cinética (Ek ) de um íon de massa m se
movendo a uma velocidade fixa v é dada por:
Ek = 1m.v2
2
Ep =
z.V
Ep = Ek
Por outro lado, a energia potencial (Ep)de um
íon de carga z sendo repelido de um campo
eletrostático de voltagem V é dada por:
Quando o íon é repelido, a sua energia
potencial (Ep) é convertida em energia cinética
(Ek). Logo,
z.V = 1 m.v2
2
v2 =
2.z.V
m
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Quando os íons são “ capturados” no campo magnético
do analisador, eles irão realizar uma trajetória circular.
Para que os íons atinjam a placa coletora de íons no
detector, os íons devem realizar uma trajetória de raio
r que resulta do equilíbrio entre a força centrífuga do íon
Fcf = m.v2
r
Fcp= z.B.v
z.B.v = m.v2
r
e a força centrípeta exercida pelo ím ã
que compõe o analisador magnético.
Logo, para que o íon possa percorrer a
trajetória do set or m agnético, F cf= F cp
Ou seja...
2
v = z.B.r
m
2.z.V = z.B.r
m
m
2
m
B.r 2
=
z
2.V
2
m
B.r 2
z = 2.V
Por esta equação fica claro:
1. Porque o espectrômetro de massas não distingue
sinais de íons m + e 2m 2+
2. Que os parâmetros B, r e V é que determinam o
trajeto dos íons no analisador.
Portanto, pode- se variar B ou V, de maneira a poder
“ varrer” t oda a faixa de m assas ( ou de razão m/z)
desejada para se detectar todos os íons ( M+ e fragm ent os) gerados na câmara de ionização. Usualmente
varia- se V muito mais rápido, e de maneira muito
mais precisa, do que B. Ou seja, varia- se a tensão (V)
aplicada no ím ã de int ensidade B fixa de maneira a
fazer com que os íons percorram uma trajetória de raio
r fixo ( 180 o , 90 o ou 60o ).
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De maneira a aumentar sua resolução, passaram a ser
construídos aparelhos de espectrometria de massas de
dupla focalização. Nestes, o setor de análise apresent a
um analisador de campo elét rico pós o analisador de
campo magnético. O analisador elétrico atua como um
filt ro de energia cinética, permitindo que apenas íons
com uma energia cinét ica específica possam
atravessá- lo, a despeit o de suas razões m/z. A
separação de íons no analisador eletrostático é explicada
pela combinação de duas equações: de força centrífuga ( 1)
e de energia potencial=cinética (2).
( 1)
Fcf = m.v2 = z.E
r
E = intensidade do campo
eletrostático
( 2)
z.V = 1 m.v2
2
r = 2V
E
Assim, o trajeto radial de íons possuindo a mesma
velocidade (energia cinética) é independent e de sua razão
m/z. Ou seja, o analisador eletrostático separa íons com
diferentes velocidades, ou energia cinéticas.
Consequentemente, a adição do setor eletrostático aumenta
a resolução de um fator de até 100.000. Este tipo de
aparelho é comumente utilizado com câmaras de ionização
do tipo impacto de elétrons (EI), bombardeamento rápido de
át om os ( FAB) ou ionização química (CI), mas não com
electrospray ou MALDI devido ao alto custo destes últ im os.
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Vantagens
- Espectros de massas “tradicionais”, ou seja pode operar em baixa
(1.000) ou alta resolução (até 60.000).
- Excelente reprodutibilidade
- Melhor desempenho quantitativo entre todos os aparelhos
- Alta resolução
- Alta sensibilidade
- Alta precisão nas medidas de massas (5 ppm em alta resolução).
Desvantagens
- Inadequadas para técnicas de ionização pulsada
- Aparelhos muito maiores e mais custosos
- Íons precisam ser acelerados com alta energia cinética para compensar
dispersão de energia na fonte (8 kV).
- Varreduras relativamente lentas (efeito de esteresse de campo).
Aplicações
- Para todos os compostos orgânicos
- Para determinação de massa exata
- Medidas de distribuição isotópica
BE ou EB
Análise Isotópica : detectores múltiplos Alta precisão.
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1.3.2 Analisadores de quadrupolo
Um analisador de quadrupolo consiste em quatro barras
paralelas, arranjadas em dois pares opostos. Um dos
pares apresenta um potencial elétrico aplicado de
( U+ Vcos( wt)) e o outro par apresenta um potencial
elétrico aplicado de - ( U+ Vcos( wt)), aonde U é uma
voltagem de corrente contínua e o termo Vcos( wt) é uma
voltagem de corrente alternada (ou de radiofrequência. A
aplicação destas duas voltagens afeta a trajetória centralizada
dos íons. Em se fazendo variar estas voltagens, somente íons
com uma razão m/z determinada irão atravessar no
centro do quadrupolo, enquanto que os outros íons
serão desviados da trajetória central. O espectro de
massas é obtido em se fazendo variar as voltagens do
quadrupolo, de maneira a se realizar uma varredura em
t oda a faixa de m / z desej ada. Pode- se ut ilizar 2 m étodos:
variando- se w e mantendo- se U e V constantes, ou
variando- se U e V (U/V) e mantendo- se w constante.
Quadrupolos Lineares : Q / q
Paul & Steinwedel 1953
Wolfgang Paul
Prêmio Nobel 1989
y
z
x
+
+
-
A varredura é feita variando simultaneamente U (DC) e V0 (AC) mas
mantendo constante a relação U/V0.
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Vantagens
- Espectros de massa “tradicionais”
- Boa reprodutibilidade
- Aparelhos relativamente pequenos (20 cm), robustos, simples e baratos.
- Podem ser utilizados para gerar espectros do tipo “dissociações induzidas
por colisões de baixa energia” (Low-energy collision-induced dissociation,
CID MS/MS) em sistemas com quadrupolos triplos e espectrômetros de
massa híbridos, nos quais se analisa as fragmentações dos fragmentos.
-Varreduras rápidas
- Íons acelerados com baixas energias cinéticas (15 eV).
Desvantagens
- Resolução limitada
- Altura dos picos variável em função da massa, mas não função da
abundância dos íons.
- Inadequada para técnicas de ionização pulsadas (MALDI e ESI).
- Baixa sensibilidade
Aplicações
- Na maioria dos equipamentos de LC/MS e GC/MS
- Sistemas de quadrupolo triplo MS/MS
- Em sistemas híbridos magnético/quadrupolo MS/MS.
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Extrel Pentaquadrupole QqQqQ Mass Spectrometer (MS3)
Eberlin, M. N. Mass Spectrom. Reviews 1997, 16, 113
Extrel Pentaquadrupole QqQqQ Mass Spectrometer (MS3)
M1
Fonte
Q1
q2
M2
Q3
q4
Q5
Det.
Eberlin, M. N. Mass Spectrom. Reviews 1997, 16, 113
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1.3.3 Analisadores de captura de íons (ion trap)
tridimensionais
Existem dois tipos de espectrômetros de massas de captura
de íons: captura de íons por quadrupolos tridimensionais
( t am bém chamada de captura dinâmica), e de ressonância
em cíclotron (captura estática). Ambas funcionam acumulando íons no seu interior, em se manipulando correntes
alternada e de radiofrequência simultaneamente. A captura
permite a liberação controlada de íons, o que permite
analisar sua separação controlada e com uma resolução
muito grande. Além disso, é utilizada para experimentos
m últi- acoplados (MSn ), que permitem estudar mecanismo de
fragm ent ação de moléculas relativamente complexas, além
de fornecerem espectros com alta sensibilidade. A possibilidade de capturar íons por períodos que variam de
milissegundos a dias permite a análise de reações de
fragm ent ação extremamente incomuns, dando origem a
espectros de massas que não podem ser obtidos através
de nenhuma outra técnica.
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•"Bath gas": adiciona-se hélio a uma pressão típica de 10-3 Torr para
aumentar sensibilidade e resolução. A repulsão entre íons de mesma carga
confinados no centro do trap tende a desestabilizar suas trajetórias por
dispersão (efeito "space-charge"). Colisões com o "bath gas" resfriam os íons
(energia cinética), mantendo-os aprisionados com refocalização para o centro
do trap.
•Aprisionamento seletivo de íons: seqüência de eventos. Após o
aprisionamento de vários íons, um íon de m/z específico (ex: 100) pode ser
mantido no trap, e os demais eliminados. Uma voltagem rf adicional é
aplicada nos eletrodos end-cap com amplitude e freqüência ajustadas para
eliminar os íons mais pesados (m/z > 100). A amplitude da voltagem rf (V)
aplicada no ring electrode é então aumentada até um valor limite
(imediatamente inferior aquele necessário para a eliminação do íon de
m/z 100), e durante a varredura de V tanto os íons pesados como os leves
são sucessivamente eliminados.
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QIT - Quadrupolos "Ion Traps Lineares”
Vantagens: ~50 vezes mais sensíveis; maior capacidade de
armazenamento. Reduzem os problemas de “charge space” : repulsão
íon-íon e assim minimizam “mass-shifts”. Sem problemas de self-CI e
perda de 1/3 m/z em MS/MS !
Vantagens
- Alta sensibilidade: íons são pré-concentrados e sucessivamente analisados.
- Permite a realização de EM em multi-etapas
- Baixo custo, simples, robusto e pequeno: ~ 5 x 5 x 5cm.
- Permite experimentos MSn seqüenciais no tempo (ex: MS13).
Desantagens
- Ineficiente para se medir abundância relativa dos íons
- Baixa dinâmica
- Sujeito à interferência por espécies carregadas e reações inter-moleculares
- Energia de colisão entre partículas mal definida
- Deve-se otimizar vários parâmetros simultaneamente para a obtenção de
dados de boa qualidade
- Baixa resolução: resolução "unitária". Pode trabalhar em alta resolução em
varreduras lentas.
- Devido a possibilidade de ocorrer reações íon-molécula durante
aprisionamento, espectros de EI podem ser "contaminados" por CI.
Applicações
- Sistemas GC/MS, LC/MS e MS/MS
- Análise de íons específicos
- Estudo da química de íons
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1.3.4 Analisadores de tempo- de- vôo (time- of- flight)
O espectrômetro de massas com analisador de tempo de vôo
faz uso da propriedade do tempo em que íons de diferentes
m/z levam para cruzar o sistema de separação de íons.
Opera em modo pulsado, de tal forma que os íons devem ser
gerados repetidamente (em pulsos). Um campo elétrico
acelera todos os íons formados (íon molecular e fragmentos)
para uma região livre de efeitos externos (campo magnético,
diferença de potencial, etc). Os íons são levados com uma
energia cinética zV, na qual z = carga do íon e V é uma
voltagem aplicada para que possam ser “ carregados” . Como
a energia cinétiva é dada pelo termo 1/2mv2 , íons mais leves
viajarão mais rápido do que os pesados, e alcançarão o
detector no fim da região livre de efeitos externos. Logo, o
t em po de vôo de um íon dependerá de sua massa, carga e
energia cinética.
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Aumento da Resolução em TOF
TOF's lineares apresentam baixa resolução devido a duração do pulso de
ionização e dispersão de energia cinética dos íons na fonte. Solução paliativa:
Aumento de L ou técnicas de aceleração "pós-ionização".
Reflectors (Espelhos Eletrostáticos): Uma série de grades ou eletrodos onde
se aplica um potencial repulsivo crescente. Os íons penetram angularmente no
reflector, são desacelerados por repulsão eletrostática, fazem uma curva, e
assim retornam para o tubo de vôo. Considere dois íons de mesma m/z mas
com diferentes velocidades, dispersos no tempo. O íon de maior energia
cinética, a frente em tempo de vôo, penetra mais profundamente no reflector
e ali permanece por mais tempo. O outro penetra menos profundamente,
e ali permanece por um tempo menor. A dispersão é corrigida, e os íons
são refocalizados em tempo de vôo, com conseqüente aumento da resolução
(largura do pico) ou poder de separação.
Aceleração ortogonal. o-TOF: Íons são produzidos de forma contínua na
fonte de ionização, e acelerados. O feixe de íons é focalizado com o auxílio
de lentes e quadrupolos/octapolos "rf-only". Uma aceleração pulsada e
ortogonal ao movimento do feixe de íons é aplicada. Íons então adquirem
velocidades "ortogonais" que não são influenciadas pelas suas velocidades
divergentes adquiridas pela aceleração na fonte.
Combinação MALDI - TOF
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Vantagens
- É o espectrômetro de massas mais rápido
- Desenhado para técnicas de ionização pulsada (MALDI)
- Alta transmissão de íons
- Informação sobre MS/MS após fragmentação
- Permite a detecção de íons com a maior faixa (de pequena a altíssima).
- Alta sensibilidade
- Baixo custo, fácil manutenção.
- Varreduras extremamente rápidas.
- Ampla faixa de varredura > 106 u. Único analisador acoplável a MALDI de
macromoléculas.
- Hoje, uma das melhores relações custo/benefício.
Desantagens
- Requer técnica de ionização pulsada
- Requer detecção muito rápida, e digitalização dos sinais.
- Baixa seletividade na geração de precursores iônicos em MS/MS
- TOF's lineares: baixa resolução. TOF's com reflector: média resolução.
o-TOF's com reflector: alta resolução e alta precisão ( 5 ppm).
Applicações
- Todos os sistemas MALDI
- Sistemas de GC/MS muito rápidos
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1.3.5 Espectrometria de Massas com Ressonância
Ciclotrônica de Í ons (ICR) e Transformada de Fourier
( FT- MS)
Uma cela cúbica é posicionada no centro de um íma supercondutor
(~ 3-7 Tesla). Os íons formados dentro da cela (ou ali injetados) se movem
em uma trajetória circular perpendicular ao eixo do campo magnético, de
frequência angular (frequência de ressonância ciclotrônica) wc proporcional
ao campo magnético B e as suas m/z's:
wc = zeB/m
Para evitar que íons escapem da cela, uma baixa voltagem dc é aplicada aos
eletrodos de aprisionamento gerando um campo elétrico E perpendicular ao
campo magnético B.
Uma voltagem rf é aplicada aos eletrodos transmissores (laterais). Varre-se
então rapidamente a frequência da voltagem rf (pulso) mantendo-se B
constante. Quando a frequência de rf (wrf) se iguala a frequência angular
de oscilação de algum íon: wc, este absorve energia com aumento de
velocidade e do raio de sua orbita mas sem alterar a frequência de sua
oscilação. Após poucas rotações, os íons que absorveram energia estarão
se movendo sincronizadamente. Esta oscilação ciclotrônica é sentida pelos
eletrodos receptores (superior e inferior), produzindo uma corrente com
frequência iqual a wc. Rápida variação de wrf pode ser realizada, sendo o
espectro de massas obtido pela aplicação de FT.
Princípio básico: Aprisionamento de íons em uma campo magnético/elétrico,
seguido da medida de suas frequências de ressonância ciclotrônica.
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FTMS
Princípios de operacão do ICR (FTMS)
Partículas carregadas irão apresentar um
movimento circular em um campo magnético
com uma frequência ciclotrônica relacionada
ao seu valor de m/z !
F = z (v x B)
F = mv2
r
F = massa . aceleração
zvB = mv2
r
c=
c =
2
zB
m
2
c=
v = zB
r m
m= B
z 2
c
Espectrômetro de massas FT-ICR ( 9.4 Tesla )
FTMS
Detector
plate
Trapping
plate
Excitation
plate
Detection on
frequency spectrum
Magnetic
field, B
Excitation on, one frequency (RF)
excites one m/z
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I llustration of how the image current is
obtained. As the ion(s) in a circular orbit
approach the top plate, electrons are
attracted to this plate from ground. Then
as the ion(s) circulate towards the bottom
plate, the electrons travel back dow n to
the bottom plate. This motion of electrons
moving back and forth between the two
plates produces a detectable current.
Características principais FT- MS
• Altíssima resolução (função de B como em RMN) que diminui
com o aumento de m/z.
• Análise não-discriminatória ( e não destrutiva) . Alta
sensibilidade. 10- 100 íons precisam normalmente oscilar para
serem sentidos pelos eletrodos receptores.
• Alto custo (supercondutores), difícil manutenção.
• MSn. Operação semelhante aos “ion- traps”.
• Trabalham sob altíssimo vácuo (< 10-8 Torr) enquanto a
quantidade de íons aprisionados na cela é pequena ("chargespacing").
• Muito utilizados em estudos de reações íon- molécula
( estudos cinéticos) e em análise de altíssima resoluçãoprecisão.
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1.3.6 Espectrometria de massas em sequência (MS/MS,
ou Tandem Mass Spectrometry)
Nesta técnica, também chamada de Tandem mass spectrometry permite a indução de fragmentação e a análise da
fragm ent ação de fragmentos. Em geral, se induz a colisão
de determinados íons com um gás (em geral He), em
seguida analisando- se o espectro de massas dos
fragm ent os form ados. A fragm ent ação é induzida at ravés
de um processo denominado “ dissociação induzida por
colisão [collision- induced dissociat ion (CID)], na qual um
íon é int roduzido em um a célula de colisão. O íon selecionado colide com um gás (He ou Ar), o que resulta em
fragm ent ação Os fragmentos gerados são separados em
um setor de análise, gerando um “ espectro de fragmento” .
Assim, pode- se gerar um espectro de fragmento de fragmento de fragmento (MS/MS/MS), quantas vezes se quiser
( MSn ). Esta técnica é utilizada para se estudar a fragm ent ação de moléculas grandes (peptídeos)..
MS/MS em determinação estrutural
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MS/MS em determinação estrutural
1.4 Detectores de íons
Uma vez que os íons são separados no setor de análise e
separação, devem ser detectados. O detector permite gerar
uma corrente elétrica gerada pelo choque dos íons no seu
int erior. Est e sinal é amplificado, e transformado em um
sinal que será registrado ou acumulado em computador.
1.4.1 “Copo” de Faraday
O copo de Faraday opera no princípio de que uma mudança
da carga em uma placa de metal resulta em um fluxo de
elétrons, e, consequentemente, é gerada uma corrente
elétrica. Um íon que atinja a superfície da placa, formada
por BeO, GaP, ou CsSb, induz a ej eção de vários elétrons.
Esta emissão temporária de elétrons induz uma corrente
no copo e cria uma pequena amplificação da corrente gerada
pela colisão do íon no copo. Este detector é de baixa
sensibilidade, mas é robusta e de desenho simples.
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1.4.1 Multiplicadora de elétrons
Uma multiplicadora de elétrons é um dos meios mais simples
para se detectar íons, apresentando grande sensibilidade
fazendo uso do princípio do copo de Paraday. Na multiplicadora
se utiliza uma série de placas coletoras de íons em série,
mantidos em potencial crescente. Os íons atingem a súperfície
da primeira placa, resultando na transmissão de elétrons.
Estes elét rons são atraídos pela segunda placa aonde são
gerados novos elétrons, resultando em uma cascata de
elétrons. O ganho típico da amplificação da corrente gerada
pela cascata de elétrons é da ordem de 1.000.000 de vezes.
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1.4.1 Placa de conversão fotomultiplicadora
A placa de conversão fotomultiplicadora é similar a uma
multiplicadora de elétrona aonde inicialmente os íons atingem
uma placa, resultando na emissão de elétrons. Todavia, os
elétrons gerados atingem uma tela de fósforo. A tela de
fósforo, como uma tela de televisão, ejeta fótons uma vez
atingida por elétrons. Estes fót ons são detectados por uma
fotomultiplicadora, que opera em cascada como uma
multiplicadora de elétrons. A vantagem é que os fótons
gerados estã dentro de um sistema isolado do resto do
equipamento, o que evita a presença de outras partículas
int erferindo na det ecção dos elétrons gerados pelo choque
de íons na placa coletora. Consequentemente, o tempo de
vida da placa coletora é muito maior, apresentando uma
grande sensibilidade.
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