Ecologia de hantavírus e de ectoparasitos em pequenos mamíferos

Transcrição

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Centro de Pesquisa em Virologia
Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada
Bioagentes Patogênicos
Ecologia de hantavírus e de ectoparasitos em pequenos
mamíferos selvagens
Gilberto Sabino-Santos Jr
Ribeirão Preto-SP
2015
GILBERTO SABINO-SANTOS JR
Ecologia de hantavírus e de ectoparasitos em pequenos
mamíferos selvagens
Tese
apresentada
Medicina
de
Universidade
à
Faculdade
Ribeirão
de
São
Preto
Paulo,
de
da
para
obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Área
de
concentração:
Imunologia
Básica e Aplicada. Opção: Bioagentes
Patogênicos
Orientador: Prof. Dr. Luiz Tadeu
Moraes Figueiredo.
Ribeirão Preto-SP
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO DE PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação
Serviço de Documentação
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Sabino-Santos Jr, Gilberto
Ecologia de hantavírus e de ectoparasitos em pequenos mamíferos selvagens.
Ribeirão Preto, 2015.
156 f.: il.; 30 cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Opção: Bioagentes
Patogênicos.
Orientador: Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes.
1. Hantavírus. 2. ecologia. 3. pequenos mamíferos selvagens. 4. ectoparasitos.
Folha de Aprovação
Gilberto Sabino-Santos Jr.
Ecologia de hantavírus e de ectoparasitos em pequenos mamíferos selvagens.
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade
de
Medicina
de
Ribeirão
Preto
da
Universidade de São Paulo, para obtenção do
título de Doutor em Ciências. Área de
concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Opção: Bioagentes Patogênicos.
Aprovado em: ___/___/____
Banca examinadora
Prof. Dr.:____________________________________________________________
Instituição:____________________________Assinatura:_____________________
Prof. Dr.:____________________________________________________________
Prof. Dr.:____________________________________________________________
Prof. Dr.:____________________________________________________________
Prof. Dr.:____________________________________________________________
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Dedicatória
Dedicatória
À minha amiga, companheira, minha linda mãe.
“O saber ensoberbece, mas o amor edifica. Se alguém julga saber alguma coisa, com
efeito não aprendeu ainda como convém saber.” (Ap. Paulo)
______________________________________________________________________
Agradecimentos
Agradecimentos
Ao professor Dr. Tadeu. Passamos uma longa caminhada juntos. Compartilhamos
alegrias e tristezas. Creio que posso dizer que és não somente meu orientador, mas um
amigo. Muito obrigado pela sua simplicidade, acessibilidade e disponibilidade. Por
aceitar as minhas imaturas idéias e sugestões, e com paciência me direcionar para o
amadurecimento das mesmas, ou então, por muitas vezes me fazer enxergar um
diferente caminho a seguir. Pelas valiosas correções, sugestões, e comentários na
primeira versão desta tese, e que ajudaram a amadurecer a versão final da mesma. E
agradeço enormemente por me aceitar como seu aluno e fazer parte de minha formação
como pessoa e futuro pesquisador.
Ao professor Dr. Eurico Arruda por aceitar o convite e solicitamente participar de
minha banca. Convivemos, embora, não diretamente como aluno e professor, mas fui
felicitado por absorver de seu vasto conhecimento e empolgação pela virologia e
ciência. Empolgação esta que sempre me motivou e serviu e serve de exemplo para
minha vida. Agradeço também por sempre estar disponível, por se portar acessível e
assim sanar algumas de minhas muitas dúvidas com toda simplicidade e humildade.
Pelas sugestões e comentários que me ajudaram a concluir a versão final desta tese. E
creio que pela amizade e convivência ao longo desses anos que me enriqueceram como
pessoa e futuro pesquisador.
Ao Dr. Luciano Luna por aceitar participar em minha banca de doutorado. Pelas
valiosas sugestões e comentários que me direcionaram em vários experimentos
realizados para obtenção dos resultados desta tese. Às suas valiosas e minuciosas
sugestões e comentários que ajudaram a concluir a versão final desta tese. Pela
convivência e grande amizade, que com seu jeito alegre de viver, me ensinou por
demais. Às discussões com fins científicos e filosóficos. E como é que pode...
Ao professor Dr. Ricardo Sousa por aceitar prontamente o convite para participar de
minha banca de doutorado. Às valiosas sugestões e comentários, que contribuíram
imensamente para o meu aprendizado, e foram de grande importância para a conclusão
da versão final desta tese.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo e a CAPES, pelo suporte
financeiro concedido.
Ao Dr. Miguel Rosalino, Dra. Carla Gheler-Costa, e Dr. Edson Martinez, pela
colaboração científica e ajuda nas análises que contribuíram para os resultados dos
capítulos 1 e 3.
Ao Dr. Patrício Hernaez pela ajuda nas análises dos resultados do capítulo 1 e na
redação do mesmo, e pela solicitude em sempre sanar minhas dúvidas, as quais me
ajudaram na discussão dos resultados do capítulo 2. Pela amizade, e sábios conselhos.
À Renata de Lara Muylaert pela colaboração científica e ajuda nas análises dos
resultados e redação que foram fundamentais para a conlusão do capítulo 2. Pela
amizade, e aprendizado no tocante a ecologia dos morcegos e identificação. E pela
participação em campanhas de campo.
Ao amigo Pedro Pedrosa pelas inúmeras discussões científicas e pela imensa
colaboração na redação da revisão bibliográfica desta tese.
Tese de Doutorado
Sabino-Santos Jr, 2015
Agradecimentos
À Dra. Talita Gagliardi pela colaboração científica e ajuda imprescindível nos
sequenciamentos que resultaram na conclusão desta tese. Pela amizade e convívio.
À Thallyta Vieira pela colaboração científica que resultou no capítulo 2 desta tese e no
artigo de um dos resultados deste capítulo. Pelas discussões científicas, filosóficas, e por
sua amizade.
À Thiago Neves por todo suporte dado na cidade de Montes Claros-MG. Por fazer o
ambiente, muitas vezes difícil, parecer fácil através sua alegria e otimismo sempre.
Ao amigo e colaborador científico Felipe GM Maia, “Big rider”, por me ajudar com as
campanhas de campo, e em todo desenho e logística deste projeto. Na triagem dos dados
e pelas infindáveis discussões que esclareceram exacerbadamente alguns dos resultados
aqui demonstrados.
À prof. Dra. Coleen Jonsson e Dr. Douglas Goodin pela colaboração científica e ajuda
na redação do capítulo 2, assim como do artigo.
Ao coordenador do programa em Imunologia Básica e Aplicada professor Dr. João
Santana. Pelo seu empenho à pesquisa e ao programa que sempre foram motivo de
exemplo para mim.
Ao colega William pela ajuda nas análises filogenéticas e pela convivência.
Ao serviço social da USP pela moradia universitária concedida durante 3 anos através
da assistente social Marília Equi que em muito me ajudou com seu tratamento humano e
distinto.
A todos do Centro de Pesquisa em Virologia-FMRP-USP, pelos aprendizados e
convívio ao longo desses anos.
E a todos que de alguma forma colaboraram para o meu aprendizado tanto pessoal como
científico.
Tese de Doutorado
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Resumo Geral
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Resumo Geral
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Gilberto Sabino-Santos Jr. Ecologia de hantavírus e de ectoparasitos em pequenos
mamíferos selvagens. Tese de Doutorado. Centro de Pesquisa em Virologia, Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 156 f., 2015.
Este trabalho envolve aspectos da virologia, ecologia, zoologia e entomologia.
Com o intuito de estudar a ecologia de hantavírus em pequenos mamíferos selvagens e
realizar um levantamento de espécies de ectoparasitos desses animais, capturas de
pequenos mamíferos selvagens foram realizadas na região sudeste do Brasil. Durante
fevereiro de 2012 até abril de 2014 foram capturados 154 pequenos mamíferos terrestres
(roedores e marsupiais), 275 morcegos e 3.225 ectoparasitos. Foi detectada presença de
anticorpos contra a nucleoproteína recombinante (Nr) do hantavírus Araraquara
(ARQV) em 9,7% dos representantes do grupo de mamíferos terrestres, incluindo
Necromys lasiurus, e em 17% dos morcegos amostrados. A infecção por hantavírus
estaria sendo influenciada diretamente pela degradação ambiental, concorrendo para a
pequena diversidade de roedores Sigmodontinae, os quais, contudo, apresentaram-se em
grande número na vegetação de capim braquiária. Ademais, a infecção por esse vírus
também estaria associada, ainda que indiretamente, à diversidade de espécies dos
mamíferos terrestres capturados, corroborando evidências anteriores. Sequências
parciais dos segmentos S e M do hantavírus ARQV também foram obtidas dos roedores
capturados. Ectoparasitos já descritos como possíveis vetores e reservatórios de
hantavírus foram encontrados tanto em roedores Sigmondotinae como em morcegos.
Entretanto, os resultados mais relevantes foram observados em morcegos. De forma
inédita nas Américas, infecção por hantavírus foi detectada em morcegos,
principalmente em áreas com alta fragmentação, pouca diversidade de espécies, e com
vegetação de mata ciliar. Nove morcegos apresentaram anticorpos, e o maior número de
infectados pertencia a espécie hematófaga Desmodus rotundus. Adicionalmente,
fragmento gênico do segmento S de hantavírus foi detectado em dois morcegos (D.
rotundus e Carollia perspicillata), sendo as respectivas sequências nucleotídicas
obtidas. No estudo filogenético, observou-se o agrupamento dessas sequências com a
equivalente do hantavírus ARQV. Este resultado é inédito para o mundo, pois trata-se
da primeira vez em que um hantavírus patogênico para o homem é detectado infectando
morcegos, abrindo perspectivas para maiores investigações sobre a manutenção e
dinâmica de transmissão deste vírus na natureza.
Palavras-chaves: Hantavírus, ecologia, pequenos mamíferos selvagens, ectoparasitos.
Tese de Doutorado
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General Abstract
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General abstract
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Gilberto Sabino-Santos Jr. Ecology of hantavirus and ectoparasites from wild small
mammals. PhD Thesis. Center for Virology Research, School of Medicine in Ribeirão
Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 156 f., 2015.
This work combines aspects of virology, ecology, zoology and entomology. In
order to study the ecology of hantavirus among wild small mammals and conduct a
survey of ectoparasites species from these animals captures were performed in
southeastern Brazil. During February 2012 to April 2014, 154 small terrestrial mammals
(rodents and marsupials), 275 bats and 3,225 ectoparasites were trapped. It has been
detected the presence of antibodies to the recombinant nucleoprotein (Nr) of hantavirus
Araraquara (ARQV) in 9.7% of terrestrial mammals, including Necromys lasiurus, and
in 17% of sampled bats. Hantavirus infection was found to be directly influenced by
environmental degradation, contributing to low diversity of Sigmodontinae rodents,
which, however, showed up in large numbers in brachiaria grass vegetation. In addition,
infection with this virus was also associated, even indirectly, to the diversity of species
of captured terrestrial mammals, confirming previous evidence. Partial sequences of
ARQV S and M segments were also obtained from captured rodents. Ectoparasites
previously reported as potential vectors and reservoirs of hantavirus have been found in
both Sigmondotinae rodents as in bats. However, the most relevant results were
observed in bats. In an unprecedented manner in the Americas, hantavirus infection was
detected in bats, especially in areas with high fragmentation, low diversity of species,
and with riparian vegetation. Nine bats had antibodies against the Nr of ARQV, and the
largest number of infected belonged to the hematophagous specie Desmodus rotundus.
Additionally, a gene fragment of hantavirus segment S was detected in two bats (D.
rotundus and Carollia perspicillata), and their nucleotide sequences were obtained. In
the phylogenetic study, there was a group of such sequences in the ARQV clade. Hence,
here for the first time we reported a pathogenic hantavirus to humans infecting bats.
These findings open perspectives for further investigations on the maintenance and
transmission dynamics of this virus in nature.
Key-words: Hantavirus, ecology, wild small mammals, ectoparasites.
Tese de Doutorado
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Sumário
Sumário
1. Introdução Geral ...................................................................................................... 17
2. Revisão Bibliográfica ................................................................................................ 21
2.1. Perspectiva histórica ...................................................................................................... 22
2.2. Hantavírus no Brasil ...................................................................................................... 23
2.3. Características morfológicas ......................................................................................... 25
2.4. Ciclo de vida.................................................................................................................... 27
2.4.1. Replicação dos hantavírus do Velho Mundo ............................................................ 27
2.4.2 Replicação dos hantavírus do Novo Mundo .............................................................. 29
2.5. Patogênese das infecções por hantavírus ..................................................................... 31
2.5.1. Infecção por hantavírus em roedores ........................................................................ 32
2.6. Reservatórios de hantavírus .......................................................................................... 34
2.6.1. Roedores Sigmondontinae ........................................................................................ 35
2.6.2. Morcegos .................................................................................................................. 40
3. Hipóteses .................................................................................................................... 47
4. Objetivos .................................................................................................................... 49
5. Capítulo 1: Ecologia de hantavírus em pequenos mamíferos terrestres ............. 51
5.1. Introdução ....................................................................................................................... 53
5.2. Material e Métodos ........................................................................................................ 54
5.3. Resultados ....................................................................................................................... 60
5.4. Discussão ......................................................................................................................... 67
6. Capítulo 2: Ecologia de hantavírus em morcegos Neotropicais ........................... 77
6.1. Introdução ....................................................................................................................... 79
6.2. Material e Métodos ........................................................................................................ 80
6.3. Resultados ....................................................................................................................... 85
6.4. Discussão ......................................................................................................................... 93
7. Capítulo 3: Ecologia de ectoparasitos de pequenos mamíferos selvagens
associados ou não a infecção por hantavírus............................................................ 102
7.1. Introdução ..................................................................................................................... 104
7.2. Material e Métodos ...................................................................................................... 105
7.3. Resultados ..................................................................................................................... 109
7.4. Discussão ....................................................................................................................... 113
8. Discussão Geral ....................................................................................................... 122
9. Conclusões Gerais ................................................................................................... 127
10. Referências Bibliográficas ................................................................................... 129
11. Anexo ..................................................................................................................... 153 Tese de Doutorado
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1. Introdução Geral
Introdução Geral
Uma mistura complexa de fatores predisponentes em nosso mundo moderno
criou novas oportunidades para o surgimento de doenças infecciosas em animais e
humanos. Isto está em grande parte relacionado com a globalização e mudanças
ambientais como a degradação, o que aumenta a natureza mutável dos contatos entre
animais e humanos (Ostfeld e Keesing, 2000, Smits e Osterhaus, 2013). Os vírus são as
entidades biológicas mais abundantes no planeta, e a maioria das doenças emergentes
em seres humanos é causada por vírus originários de animais. Pequenos mamíferos
selvagens, como pequenos roedores, marsupiais e, principalmente, morcegos são
importantes animais reservatórios de vírus. Esses vírus, adaptados a seus reservatórios
naturais, ocasionalmente se adaptam a novos hospedeiros, incluindo o ser humano,
podendo, se espalhar e causar epidemias ou, em casos extremos, pandemias (Woolhouse
e Gowtage-Sequeria, 2005).
Hantavírus é um gênero da família Bunyaviridae, que inclui vírus zoonóticos
emergentes encontrados principalmente em roedores, embora novos hantavírus
associados a insetívoros (Ordem: Soricomorpha) e morcegos tenham sido recentemente
descritos (Klempa et al., 2007, Araujo et al., 2012, Vaheri et al., 2013). Na América do
Sul, hantaviroses são zoonoses de roedores da família Cricetidae, subfamília
Sigmodontinae. No Brasil, existem 8 genótipos de hantavírus conhecidos até o
momento, sendo seis deles associados a doença humana: Anajatuba (ANAJV),
Araraquara (ARQV), Castelo dos Sonhos (CASV), Juquitiba (JUQV), Laguna Negra
virus-like (LNV) e Rio Mamoré (RIOMV). O ARQV ocorre nas regiões de Cerrado do
sudeste e do planalto central brasileiro e é considerado o mais virulento dos hantavírus
do Brasil e possivelmente do mundo, porque causa letalidade em 50% nos pacientes
com síndrome pulmonar e cardiovascular por hantavírus. (Rosa et al., 2005, 2010,
Figueiredo et al., 2009a, Raboni et al., 2009, Travasso da Rosa et al., 2012, Oliveira et
al., 2014a,b).
Acredita-se que a emergência da hantavirose no Brasil, observada nos últimos
22 anos, se deva principalmente à intensa degradação ambiental associada à atividade
agrícola (agricultura intensiva e crescimento urbano). Isso tem ocorrido, principalmente,
com o cultivo de monoculturas de vegetações exóticas, tais como o capim braquiária
(Brachiaria decumbens) e a cana de açúcar (Saccharum officinarum) (Sabino-Santos Jr,
2010). A degradação ambiental estaria afugentando animais de seu ambiente natural,
como ocorre com algumas espécies de roedores e morcegos, bem como com os seus
predadores. Por outro lado, a degradação ambiental estaria incentivando o aumento
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Introdução Geral
populacional de algumas espécies de pequenos mamíferos selvagens oportunistas
(Ostfeld e Keesing, 2000, Ostfled e LoGiudice, 2003, Suzán et al., 2009). Tais espécies,
buscando a sobrevivência, procuram alimento e abrigo em paióis, armazéns, silos, ou
em outros lugares criados pelo homem, transmitindo a este os seus vírus (Figueiredo et
al., 2003, Sabino-Santos Jr, 2010). Na região nordeste do estado de São Paulo, o ARQV
tem sido associado aos roedores Necromys lasiurus e também, possivelmente a Calomys
tener e Akodon spp., (Figueiredo et al., 2003, 2010).
Portanto, para conhecer a epidemiologia e criar algum mecanismo de controle
para a hantavirose, faz-se importante entender a ecologia de seus potenciais
reservatórios naturais (Suzuki et al., 2004, De Sousa et al., 2008). Nesse sentido,
pesquisas devem ser realizadas sobre as variações populacionais desses animais, seus
padrões ecológicos, bem como mudanças ambientais que estejam a afetar esses
mamíferos reservatórios (Lima et al., 1999, Armién et al., 2009).
Este trabalho dá continuidade à pesquisa desenvolvida por nós anteriormente, na
qual observamos observamos um pulo inter-espécie de hantavírus entre roedores
Sigmodontinae, assinalando que a perda da diversidade biológica influencia
indiretamente a ocorrência de infecção por hantavírus entre os roedores, e como
consequência, nos seres humanos. Portanto, o entendimento da ecologia desta zoonose
pode trazer mais informação sobre nossas observações prévias. Para tanto, pretendemos
conhecer sobre ambientes e habitats onde vivem os reservatórios naturais desses vírus e
também sobre como esses vírus são mantidos em reservatórios naturais.
Buscando trazer ao leitor uma visão geral sobre a hantavirose, fizemos uma
revisão bibliográfica focando aspectos históricos, morfológicos, do ciclo de vida do
hantavírus e de sua patogênese em roedores-reservatório. Também revisamos a ecologia
e a evolução dos principais reservatórios de hantavírus no Brasil (roedores
Sigmondontinae e morcegos, uma vez que no Brasil não são encontrados insetívoros da
Ordem: Soricomorpha) (Reis et al., 2011). Para apresentar nossas contribuições à
ecologia dos hantavírus e à dinâmica de hantaviroses na região sudeste do Brasil,
procuramos focar: (i) no capítulo um, sobre a ecologia de hantavírus em pequenos
mamíferos terrestres (roedores e marsupiais); (ii) no capítulo dois, sobre o a ecologia de
hantavírus em morcegos, ressaltando o potencial desses animais como reservatórios de
hantavírus; (iii) e no capítulo três, sobre os ectoparasitos dos pequenos mamíferos,
infectados ou não com hantavírus. Ressaltamos que com resultados do capítulo dois, um
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Introdução Geral
manuscrito já foi aceito para publicação relatando as evidências sorológicas de infecção
por hantavírus em morcegos no Brasil (ver anexo).
Tese de Doutorado
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2. Revisão Bibliográfica
Revisão Bibliográfica
2.1. Perspectiva histórica Segundo relatos históricos, a doença humana por hantavírus parece ser mais
antiga do que o reconhecimento relativamente recente de sua etiologia (Lee et al.,
1978). Segundo Vapalahti et al., (2003), em torno de 960 D.C., os chineses relatavam
uma doença que poderia ser a febre hemorrágica com síndrome renal (FHSR). Na I
Guerra Mundial, descreveu-se uma nefrite aguda, que foi denominada Nephropatia
Epidemica (NE) em 1934. De causa desconhecida, a doença por hantavírus produziu
surtos em tropas britânicas e em tropas japonesas que ocupavam a Manchúria durante a
II Guerra Mundial (Bradford, 1916, Myhrman, 1951, Johnson, 2001, Sundström, 2013).
Entre 1950 e 1953, durante a Guerra da Coréia, 3.000 soldados das Nações Unidas
foram acometidos por uma febre hemorrágica aguda com nefrite e choque. O agente
etiológico dessa doença, apesar de pesquisado exaustivamente com os recursos
disponíveis na época, não foi identificado, e foi apenas apontado como um provável
vírus. Apenas em 1975, o coreano Ho Wang Lee detectou em tecidos pulmonares de
roedor selvagem Apodemus agrarius, capturado próximo ao rio Han, antígenos
específicos de um vírus que foi posteriormente identificado e denominado Hantaan
(HTNV). Ho Wang Lee observou que antígenos de HTNV reagiam com soros de
pacientes com FHSR (Lee et al., 1978, Jonsson et al., 2010, Sundström, 2013). Portanto,
tratava-se de um novo patógeno e este acabou por originar um novo gênero, o
Hantavírus, na família Bunyaviridae. Entretanto, o primeiro hantavírus a ser isolado foi
o Thottapalayam (TPMV), em 1964,permanecendo sem classificação até 1989 (Zeller et
al., 1989, Sundström, 2013). TPMV é considerado um hantavírus diferente por não ser
associado a roedores, tendo sido isolado de um musaranho, pequeno mamífero
insetívoro. Atualmente, já são conhecidos 22 hantavírus de insetívoros (Guo et al.,
2013, Sundström, 2013). Na década de 1980, o agente causador da NE foi descrito e
denominado Puumala (PUUV). Em 1982, isolou-se um hantavírus de ratos urbanos
(Rattus rattus e R. norvegicus), e este foi associado a casos urbanos de FHSR na capital
da Coréia do Sul, o vírus Seoul (SEOV) (Lee et al., 1982, Hepojoki et al., 2012). Em
1992, durante a Guerra da Bósnia, 300 soldados foram acometidos por nefrite aguda e
destes foi isolado o hantavírus Dobrava-Belgrade (DOBV) (Avsic-Zupanc et al., 1992,
Sudström, 2013).
Nas Américas, em 1985 foi isolado do roedor selvagem Microtus
pennsylvanicus um hantavírus aparentemente não-patogênico para o homem, o Prospect
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Hill (PHV), (Tsai et al., 1985, Yanagihara et al., 1987). Entretanto, os hantavírus só
ganharam evidência no continente americano após 1993. Neste ano, ocorreu nos
Estados Unidos um surto de pneumonia grave, com alta letalidade, na região de Four
Corners, divisa entre os Estados do Arizona, Colorado e Novo Mexico. Nesta ocasião,
descobriram tratar-se de uma síndrome pulmonar e cardiovascular associada a
hantavírus (SPCVH). Esse patógeno foi identificado por biologia molecular e também
foi isolado. O vírus tem como reservatório o roedor silvestre Peromyscus maniculatus
(Nichol et al., 1993, Vapalahti et al., 2003, Jonsson et al., 2010). De fato, os avanços na
biologia molecular e o conhecimento prévio dos hantavírus causadores da FHSR,
contribuiram para que, em 1993, fosse reconhecido o vírus Sin Nombre (SNV),
causador da SPCVH nos Estados Unidos (Zeier et al., 2005, Jonsson et al., 2010).
Segundo o International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), quatro
critérios devem ser utilizados para a classificação das espécies de hantavírus: (i)
pertencer a um nicho ecológico específico, assim como possuir uma única espécie ou
subespécie de roedor como reservatório natural primário; (ii) diferir em pelo menos 7%
na sequência aminoacídica das glicoproteínas de superfície (Gn e Gc) ou da
nucleoproteína viral; (iii) induzir anticorpos em título 4 vezes mais elevado do que os
obtidos com outros hantavírus em teste de neutralização cruzada; e (iv) não formar
rearranjos naturais com outras espécies de hantavírus (King et al., 2012). Dos hantavírus
descritos em todo o mundo, com base em critério genômico, foram identificadas
somente 24 espécies incluindo 80 genótipos (Plyusnin 2002, Oliveira et al., 2014).
Entretanto, este número vem aumentando com a descrição de muitos novos vírus em
diferentes lugares e hospedeiros, tais como morcegos (Jonsson et al., 2010; Olsson et
al., 2010, Guo et al., 2013).
2.2. Hantavírus no Brasil No Brasil e em outros países da América do Sul, a busca por hantavírus
começou na década de 80. Capturas de roedores urbanos e peri-urbanos em cidades
portuárias permitiram isolar um hantavírus semelhante ao SEOV de um Rattus
norvegicus capturado na cidade de Belém (LeDuc et al., 1985). Este vírus não foi
associado a doença humana. Foram também detectados anticorpos contra HTNV em
roedores urbanos de Recife, Belém e São Paulo (LeDuc et al., 1985). Entre 1986 e 1990,
um estudo na região sul e sudeste do Brasil, analisando 1063 soros humanos, detectou
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23
32 positivos para os hantavírus HTNV, SEOV e PUUV (Iversson et al., 1994). Um
estudo de casos humanos suspeitos de leptospirose na cidade de Recife em 1993
detectou pacientes com anticorpos para hantavírus do Velho Mundo (Hindrichsen et al.,
1993).
Em 1993, após o surto de SPCVH nos Estados Unidos, 3 casos fatais da doença
foram diagnosticados no Brasil. Eram moradores de Juquitiba-SP e, por isso, o
hantavírus identificado recebeu este nome (JUQV) (Da Silva et al., 1997, Vasconcelos
et al., 1997). Em 1999, a partir de amostras clínicas enviadas para os EUA, dois outros
hantavírus foram identificados por amplificação parcial de seus genomas por RT-PCR
seguida por sequenciamento nucleotídico: em 1995 o Castelo dos Sonhos (CASV),
oriundo de um paciente da aldeia do mesmo nome no estado do Pará, e em 1996 o
Araraquara (ARQV), oriundo de dois pacientes das cidades de Araraquara e Franca-SP
(Johnson et al., 1999). Em seguida, em 1999, foram diagnosticados por ELISA e RTPCR dois casos fatais de SPCVH em agricultores da cidade de Guariba-SP, causados
pelo ARQV (Figueiredo et al., 2003). Em 2000, na cidade de Anajatuba, estado do
Maranhão, ocorreram 3 casos suspeitos de infecção por hantavirus e, com base em
estudo feito com o roedor local Oligoryzomys fornesi, identificou-se o hantavirus
Anajatuba (ANAJV), filogeneticamente relacionado ao vírus Rio Mamoré (RIOMV)
(Rosa et al., 2005, 2010). Em 2004, divulgou-se como reservatório natural do ARQV o
Necromys lasiurus, um roedor da família Cricetidae, subfamília Sigmodontinae (Suzuki
et al., 2004). Recentemente foi descrito no município de Careiro da Várzea, estado do
do Amazonas, um caso fatal de SPCVH causado por RIOMV (Oliveira et al., 2014b).
Atualmente, são conhecidos 8 genótipos de hantavírus no Brasil, 6 deles
associados a SPCVH: ANAJV, ARQV, CASV, JUQV, Laguna Negra-like (LNV) e
RIOMV (Figura 1). O ARQV ocorre nas regiões de Cerrado do sudeste e do planalto
central brasileiro e é considerado o mais virulento dos hantavírus conhecidos, porque,
nos pacientes com SPCVH, está associado a letalidade de 50% (Rosa et al., 2005, 2010,
Figueiredo et al., 2009a, Raboni et al., 2009, Travassos da Rosa et al., 2012, Oliveira et
al., 2014a,b).
Tese de Doutorado
24
Figura 1. Hantavírus descritos no Brasil e seus respectivos hospedeiros naturais. Na
legenda, à esquerda e no mapa, cada círculo refere-se a um genótipo de hantavírus e
representam 10 casos de SPCVH para hantavírus patogênicos e 10 roedores infectados
para hantavírus não patogênicos.
2.3. Características morfológicas O gênero Hantavírus pertence à família Bunyaviridae. Estes vírus são
envelopados, pleomórficos, com 80-160 nm de diâmetro. Os hantavírus do Velho
Mundo (HTNV) possuem genoma de 11,8 Kb e os do Novo Mundo (SNV), 12,3 kb.
Como todos os Bunyaviridae, seus genomas possuem fita simples de RNA trisegmentado e de polaridade negativa, compreendendo os segmentos L (grande), M
(médio), e S (pequeno). Nos hantavírus, esses segmentos variam de 1,8 a 2,1 Kb para a
região S, que codifica a proteína do nucleocapsídeo N. A proteína N forma, juntamente
com o RNA genômico e a polimerase de RNA dependente de RNA (RdRp), o complexo
ribonucleoproteico viral (RNP). Para PUUV, vírus Tula (TULV), vírus Andes (ANDV)
e outros, uma proteína não estrutural (NS) é codificada, em sobreposição, na mesma
ORF (sequência de leitura aberta) da proteína N (Mackow et al., 2009, Firth et al., 2012,
Hepojoki et al., 2012, Vera-Otarola et al., 2012). O segmento M, de 3,7 a 3,8 Kb,
codifica a poli-glicoproteína GPC que é posteriormente clivada, durante a maturação
viral, nas glicoproteínas Gn e Gc, outrora denominadas G1 e G2. O segmento L, com
6,5 a 6,6 Kb, codifica a RNA-polimerase dependente de RNA (RdRp) (Figura 2). Todos
Tese de Doutorado
25
os segmentos de RNA viral são flanqueados por regiões 3' e 5' não traduzidas (UTR) e
que formam uma estrutura secundária do tipo panhandle, que promove a transcrição do
mRNA e também a replicação do genoma viral (Hepojoki et al., 2012). A sequência
nucleotídica do segmento S é mais conservada que a do M, contendo apenas pequenas
variaçõe em sua ORF (Firth et al., 2012). Obeserva-se maior frequência de variações
nucleotídicas na ORF de GPC. Apesar de eventos de rearranjo terem sido detectados
recentemente, o padrão evolutivo dos genomas de hantavírus pode ser considerado
estável (Plyusnin et al., 1996, Rodriguez et al., 1998, Plyusnin, 2002, Klempa et al.,
2003, Khaboullina et al., 2005, Black et al., 2009, Razzauti et al., 2009, Elliot e
Schmaljohn, 2013, Bennet et al., 2014, Yanagihara et al., 2014).
Os rearranjos genômicos dos hantavírus merecem atenção devido a importância
deste na na evolução viral. Coinfecções in vitro por SNV e ANDV, hantavírus
filogeneticamente distintos, costumam produzir rearranjo com viabilidade viral mantida
em 8,9% dos casos para o parental ANDV. Isso pode proporcionar rearranjos genéticos,
mesmo entre hantavírus filogeneticamente distantes (Rizvanov et al., 2004). Portanto,
provavelmente, a diversidade das populações virais poderia elevar a probabilidade de
seleção positiva para certos hantavírus, bem como aumentar suas virulências. Em outro
estudo, uma recombinação em 8,5% dos virions foi observada em ensaios de coinfecção
com 2 cepas de SNV (Rodriguez et al., 1998). Também, rearranjo foi
experimentalmente produzido por coinfecções em cultura celular de SNV e Black Creek
Canal (BCCV), 2 espécies de hantavírus geneticamente distantes (Rodriguez et al.,
1998; Jonsson et al., 2010). Ainda, foi muito importante constatar que eventos de
recombinação genômica ocorrem na natureza, pois foram observados em 10% das
amostras de SNV oriundas de pequenos roedores selvagens capturados nos Estados
Unidos, entre 1995-2007 (Black et al., 2009). Evento similar foi observado em 32% dos
vírus resultantes de coinfecções naturais com 2 linhagens de PUUV. Neste caso, ocorreu
um padrão peculiar nos segmentos L e S, que eram derivados de um único ancestral, por
um processo evolutivo restrito que ocorre no norte da Finlândia (Razzauti et al., 2009).
Finalmente, outro exemplo do fenômeno de rearranjo genômico na natureza foi
observado entre 2 linhagens (genótipos) do hantavírus DOBV (DOBV-aa e DOBV-af)
(Klempa et al., 2003).
Tese de Doutorado
26
Figura 2. Morfologia dos vírus da família Bunyaviridae em A e esquematizada em B.
A. Eletromicrografia mostrando partículas de HTNV onde as glicoproteínas do
envelope formam padrão sugerindo vários trilhos juntos. As setas mostram sulcos
produzidos, provavelmente, pela conformação das ribonucleoproteínas virais. B. Os três
segmentos genômicos de RNA (S, M and L) mostram-se complexados com a
nucleoproteína N formando a ribonucleoproteína. O vírus apresenta envelope de
bicamada lipídica com espículas das glicoproteínas transmembrana Gn e Gc (Adaptado
de Elliot e Schmaljohn, 2013, Vaheri et al., 2013).
2.4. Ciclo de vida
2.4.1. Replicação dos hantavírus do Velho Mundo
Para a infecção celular, os hantavírus ligam-se a receptores β1 ou β3 integrina.
Contudo, estes receptores não seriam únicos, visto que células sem β3 integrina são
permissivas à entrada de alguns hantavírus. Evidências de outros possíveis receptores e
coreceptores têm sido divulgadas, sendo o principal dentre eles o fator acelerador do
decaimento (DAF/CD55) (Gavrilovskaya et al., 1998, Larson et al., 2005). A endocitose
viral é dependente de clatrina. Então, as partículas, após fusão de membranas do
envelope viral com as das vesículas, seguem pelo sistema endo-lisossômico em
exposição progressiva a acidez (pH 6,0-6,5) (Arikawa et al., 1985, McCaughey et al.,
1999, Garry e Garry 2004, Song et al., 2005, Tischler et al., 2005, Mou et al., 2006,
Krautkrämer e Zeir 2008, Hepojoki et al., 2010a, Huiskonen et al., 2010, Jonsson et al.,
Tese de Doutorado
27
2010, Strandin, 2011, Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013). Neste processo, o
complexo glicoprotéico se rearranja com a configuração tetramérica de Gn associada a
dois dímeros de Gc em uma conformação pós-adsorção. As proteínas Gc são
encontradas, supostamente, dissociadas da estrutura quaternária, expondo seus loops de
fusão e assim promovendo ligação irreversível à membrana endosomal. Em estágio
tardio, essa ligação permite que se formem complexos homo-triméricos de Gc
justapostos com o envelope viral e estes promovem a fusão da membrana (Tischler et
al., 2005, White et al., 2008, Strandin, 2011, Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013). A
liberação da RNP no citoplasma inicia a transcrição viral com o sequestro das
extremidades cap 5’ de mRNA celulares. Esse processo, denominado Cap-snatching, é
mediado pela proteína N. As extremidades sequestradas atuam como iniciadores da
transcrição viral e são marca fundamental dos hantavírus nesta etapa (Figura 3) (Mir et
al., 2008, Cheng et al., 2012, Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013).
A replicação genômica dos hantavírus ainda é pouco entendida, mas tem como
marcador a acumulação de formas livres da proteína N, que parece ter função de
chaperona ao longo da replicação viral (Jonsson e Schmaljohn, 2001, Walter et al.,
2011, Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013). A transcrição de mRNAs e a replicação
de RNAs virais ocorrem justapostas a membranas celulares e são dirigidas pela RdRp.
A replicação segue um processo denominado de prime and realign, onde a extremidade
5’-UTR é pareada com a extremidade 3'-UTR, por um pareamento de GTP (guanosina
trifosfato) com a terceira base da extremidade 3’, uma citosina (C). Desta forma, ocorre
replicação de até 3 nucleotídeos da extremidade 3’. Em seguida, a fita em síntese
realinha novamente os 3 nucleotídeos, colocando o par de bases em perfeito
alinhamento para a polimerização. Isso resulta em segmento genômico com
monofosfato na extremidade 5’ (Garcin et al., 1995, Plyusnin et al., 1996, Strandin,
2011, Sudström, 2013).
A transcrição dos mRNAs virais (justapostos a membrana celular) e a síntese das
proteínas N e RdRp ocorrem em agrupamentos poliribossomais livres do citoplasma
(Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013). A concentração de N no retículo
endoplasmático (RE) depende de seu transporte pelos microtúbulos (Ramanathan e
Jonsson, 2008). A produção e clivagem de GPC ocorrem em ribossomos associados ao
RE, gerando glicoproteínas que ancoram em seu lúmen. Em seguida, as glicoproteínas
são direcionadas para as cisternas do aparelho de Golgi após interação da cauda
transmembrana da porção C-terminal com a proteína N (Hepojoki et al., 2010b,
Tese de Doutorado
28
Strandin,
2011).
A
glicosilação
completa
das
glicoproteínas
virais
ocorre,
principalmente, por manosilação. Esse processo permite que glicoproteínas agregadas,
pela forma trimérica da proteína N, interajam com o RNA viral e com a RdRp.
Acompanha este processo, uma oligomerização adicional, que é requerida para a
formação das RNPs ancoradas à porção C-terminal das glicoproteínas virais (Gn
principalmente). As RNPs não são perfeitamente eficientes e permitem formar
partículas virais diplóides (inclusão de ssRNA viral de cadeia positiva) (Hepojoki et al.,
2010b, Strandin, 2011, Strandin et al., 2011, Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013).
Acredita-se que a especificidade para cada segmento genômico é determinada por sinais
distintos na interação com as glicoproteínas virais justapostas às cisternas do Golgi. Os
sinais distintos das três RNPs (dos três segmentos do genoma) ajudam a promover o
brotamento viral das cisternas do Golgi (Mackow e Gavrilovskaya, 2009). Esse
processo poderia ser semi-randômico (Rodriguez et al., 1998, Strandin 2011, Cheng et
al., 2012, Hepojoki et al., 2012, Sudström, 2013). O virion, saído do Complexo de Golgi
(CG) ou do Complexo Intermediário do Retículo Endoplasmático-Golgi (ERGIC),
emerge da célula dentro de vesícula que é direcionada para a membrana plasmática
(Figura 3). Em hantavírus do Velho Mundo, evidências sugerem que a liberação viral
seja polarizada para a membrana apical (Jonsson et al., 2010, Hepojoki et al., 2012,
Krautkrämer et al., 2012, 2013, Sudström, 2013).
2.4.2 Replicação dos hantavírus do Novo Mundo
Os hantavírus do Novo Mundo exibem pequenas, mas importantes, direferenças
em seus processos replicativos. Na infecção com ANDV, a entrada na célula não é por
endocitose dependente de clatrina (Ramanathan e Jonsson, 2008, Hepojoki et al., 2012).
Também se observou que o egresso dos virions ocorre da membrana basolateral da
célula (Rowe e Pekosz 2006; Sudström 2013). As diferenças maiores na excreção viral
são relatadas para SNV e BCCV, que são montados diretamente da membrana
plasmática sem polaridade aparente (Figura 3) (Goldsmith et al., 1995, Ravkov et al.,
1997, Spiropoulou et al., 2003, Sudström, 2013).
Um estudo sobre utilização do citoesqueleto celular pelos hantavírus demonstrou
a utilização de microtúbulos para o transporte das proteínas N de SEOV, HTNV
(hantavírus do Velho Mundo) e ANDV e BCCV (do Novo Mundo). O uso de nocodozol
(despolimerizador de microtúbulos) e citocalasina D (despolimerizador de actina)
Tese de Doutorado
29
inibiram a infecção celular por ANDV e BCCV (Ramanathan et al., 2007, Ramanathan
e Jonsson, 2008, Hussein et al., 2012, McNulty et al., 2013).
Figura 3. Ciclo replicativo dos hantavírus. (1) Inicia-se o processo, com a ligação dos
receptores β integrinas e CD55/DAF às glicoproteínas Gc e Gn respectivamente; (2) a
entrada viral depende de clatrina para os hantavírus do Velho Mundo, formando-se o
endossoma primário que ao ser acidificado (pH ~ 6) como endossoma tardio permite a
fusão do envelope viral à membrana endossômica, com internalização e desnudamento
do genoma no citoplasma; (3) ocorre captura de sequências Cap dos RNAs mensageiros
celulares mediada pela proteína N, formando assim os RNAs mensageiros virais pela
RdRp; (4) a tradução dos transcritos dos segmentos S e L ocorre em agrupamentos
polirribossomais no citosol e a dos transcritos de segmento M, Gn e Gc, em ribossomos
associados ao RE; (5) a replicação do genoma viral é dependente da síntese de N, que
emite sinal para a RdRp mudar da síntese de RNAs mensageiros para a de RNAs
complentares necessários à síntese dos genomas da progênie; (6) a montagem das novas
partículas virais acontece no complexo de Golgi para hantavírus do Velho Mundo e na,
membrana plasmática contendo glicoproteínas previamente ancoradas, para os
hantavírus do Novo Mundo; (7) o egresso das novas partículas é mediado por
microfilamentos de actina e polarizado para a membrana basolateral em hantavírus do
Novo Mundo, e para a membrana apical em hantavírus do Velho Mundo (adaptado de
Jonsson et al., 2010).
Tese de Doutorado
30
2.5. Patogênese das infecções por hantavírus
Desde 1994, quando descreveu-se a SPCVH como uma nova doença (Duchin et
al., 1994), as infecções por hantavírus passaram a ser apresentadas em 2 formas
distintas: a FHSR no Velho Mundo e a SPCVH no Novo Mundo. A FHSR tem os rins
como órgão alvo, e a SPCVH, os pulmões. Porém, existem diferentes formas de FHSR.
Em 1934, descreveu-se uma forma branda e local da FHSR, apropriadamente
denominada de nephropathia epidemica (NE) pelo PUUV (Myhrman, 1951). A partir
de 1980, vem sendo descritos casos de NE, particularmente os fatais, com envolvimento
pulmonar predominando sobre o renal. Por isso, acredita-se hoje que exista
sobreposição clínica entre SPCVH e FHSR. Estudos sugerem mecanismos
patogenéticos comuns para as 2 síndromes, como a hiperpermeabilidade capilar. Desta
forma, nos últimos anos, alguns autores têm sugerido a denominação Doença por
Hantavírus em substituição ao nome destas 2 síndromes (Rasmuson et al., 2011,
Clement et al., 2014, Connolly-Andersen et al., 2013, Gizzi et al., 2013).
Geralmente, a infecção por hantavírus começa com a inalação de aerossóis
contendo partículas virais infecciosas e isso deve ocorrer, também, entre os roedores.
Chegando ao trato respiratório inferior, o vírus infecta, principalmente, macrófagos e
células dendríticas alveolares (CD), sendo drenado até linfonodos locais, onde ocorre
intensa replicação viral, o que permite uma viremia primária (Peebles e Graham, 2001,
Borges et al., 2006). Os hantavírus também infectam plaquetas utilizando, como
receptores, as integrinas αIIaβ3 de superfície, produzindo trombocitopenia. Ainda, os
hantavírus infectam células endoteliais, particularmente as do leito vascular pulmonar e
estas células passam a apresentar as glicoproteínas virais em suas membranas apicais.
Dessa forma, plaquetas circulantes são capturadas por estas glicoproteínas no lúmen
vascular, ampliando a trombocitopenia (Mackow e Gavrilovskaya 2009, Strandin,
2011). No entanto, o achado mais importante nas infecções por hantavírus é o aumento
da permeabilidade vascular nos órgãos afetados, que é comumente acompanhado de
plaquetopenia e leucocitose com células imaturas (bastonetes), incomum em outras
febres hemorrágicas virais. (Saggioro et al., 2007, Schönrich et al., 2008).
Tese de Doutorado
31
2.5.1. Infecção por hantavírus em roedores
Embora os roedores-reservatórios de hantavírus sofram infecção crônica
persistente, sem sinais patológicos aparentes, é bom salientar que sofrem infecção de
células
endoteliais,
mas
sem
aumento
da
permeabilidade
vascular,
nem
trombocitopenia. Entretanto, observou-se diminuição da sobrevida dos hospedeiros
Myodes glareolus quando infectados com PUUV comparativamente aos animais nãoinfectados, em períodos de inverno na Finlândia, (Kallio et al., 2007). O reservatório
natural do SNV, Peromyscus maniculatus, quando infectado, apresentava infiltrado de
células mononucleares no fígado e algum grau de edema pulmonar, com com base em
testes imuno-histoquímicos. Assim, a infecção por SNV parece produzir doença em seu
reservatório-natural (Netski et al., 1999). Em outro estudo, inoculando BCCV em seu
reservatório natural, roedor Sigmodon hispidus, todos juvenis, observou-se o
desenvolvimento de pneumonite aguda difusa nos animais inoculados com carga viral
mais elevada e por mais tempo (até 18 dias) (Billings et al., 2010). Em Montana,
Estados Unidos, um estudo de campo realizado por 15 anos, incluindo a captura e a
recaptura de P. maniculatus, reservatório de SNV, observou uma diminuição da
sobrevida e da taxa de reprodução destes roedores quando infectados com SNV (Luis et
al., 2012). Em suma, todos estes estudos demonstram o desenvolvimento de alguma
patologia e de um custo maior de fitness em roedores infectados com hantavírus.
Diferente do que comumente se supõe, roedores-reservatório apresentam uma
resposta imune celular à infeção por hantavírus com linfócitos T CD8. Camundongos
deficientes de células T inoculados com SEOV não exibiram a resposta imune adequada
para o controle inicial da infecção. Isso resultou em elevação dos títulos virais, com
amplo tropismo dos mesmos, e os animais morreram em até 10 semanas após a
inoculação. A fase persistente da infecção parece estar está associada à redução da
atividade das células T CD8, como observado com camundongos Balb/c infectados
cronicamente com HTNV (Mahmud-Al-Rafat e Taylor-Robinson, 2014). A resposta dos
linfócitos T CD4 à infecção parece ser importante no controle deste processo e, na
infecção crônica, observa-se uma alta expressão de GATA3 (fator de transcrição que é o
marcador do perfil da resposta Th2). Curiosamente, na fase aguda da infecção por
hantavírus em roedores ocorre elevação nos níveis de IFN-γ, IL-4, e IL-5, tendo-se um
padrão misto (Th1 e Th2), similar ao observado na SPCVH humana. Entretanto, esse
Tese de Doutorado
32
tipo de resposta imune não permanece durante a fase crônica da infecção nos roedores
(Easterbrook e Klein, 2008).
A ativação de células T reguladoras (Treg-marcado para FoxP3) ocorre em
roedores, com ação inibitória em sítios de replicação viral ativos, inibindo ou mesmo
suprimindo a produção de TNF-α, reduzindo a secreção de IL-10 e estimulando a
produção de TGF-β. Esta mediação da resposta imune celular é relevante para que os
roedores reservatório de SEOV e SNV tenham infecção crônica (Schountz et al., 2007,
Easterbrook e Klein, 2008, Li e Klein, 2012). As células T CD4 possuem importante
papel no desenvolvimento de populações de células Treg em roedores infectados, como
demonstrado na infecção in vitro por SEOV de células do endotélio pulmonar de
roedores cocultivadas com linfócitos T CD4. Neste caso, o fenótipo Treg foi altamente
induzido com uma expressão marcante de seu marcador FoxP3 (Li e Klein, 2012).
Enquanto existe infecção convencional e transmissão de um hantavírus entre
indivíduos de sua espécie hospedeira, há também transmissão não convencional entre o
seu reservatório e outra espécie de roedor (a princípio, relatado somente de roedor para
roedor). Essa transmissão pode gerar infecção produtiva que, por sua vez, pode permitir
novos eventos de contágio. Trata-se do fenômeno de spillover interespecífico, quando
um dado hantavírus infecta mais de uma espécie de animal-reservatório (Klingström et
al., 2002). Originalmente, spillover foi utilizado por Klingström et al., (2002) para
denominar o achado de PUUV infectando roedores silvestres Microtus agrestis e
Lemmus sibiricus, além de seu reconhecido roedor-reservatório, Myodes glareolus. Este
fenômeno pode ocorrer quando há sobreposição dos nichos ecológicos destes animais,
propiciando eventualmente a adaptação dos hantavírus a novos animais-reservatório
(Allen et al., 2009, Suzán et al., 2009, Dearing e Dizney, 2010). Tal fenômeno foi
reproduzido em laboratório por infecção de Peromyscus maniculatus (SNV
reservatório) com ANDV. Esta infecção evoluiu de forma crônica e provavelmente
assintomática. A distribuição de ANDV foi sistêmica (sangue, pulmões, coração e
baço), mas a resposta humoral eficaz foi detectada 21 dias p.i. (pós-infecção) e também,
uma forte resposta de linfócitos T CD4 foi demonstrada sem a expressão de citocinas
pró-inflamatórias do perfil Th17 (Spengler et al., 2013). Acredita-se que infecções tipo
spillover sigam um curso agudo ao invés de crônico e que a resposta via T CD4 pode
não ser eficaz devido a uma resposta humoral específica e efetiva.
O uso de roedores como modelos de infecção por hantavírus visa a reproduzir os
sinais patológicos humanos e estudar a patogênese, sendo uma área promissora de
Tese de Doutorado
33
investigação. Algum sucesso com modelo que simula SPCVH foi observado em
hamsters sírios. Nesse modelo, o desenvolvimento de doença SPCVH-símile após
infecção com ANDV manteve-se inalterado após o tratamento dos animais com
ciclofosfamida (supressor de linfócitos T) e depleção das células T (Hammerbeck et al.,
2011). Tal fato sugere outro mecanismo de patogênese que dispensaria a atuação das
células T CD8, permitindo-se especular se a infecção humana por hantavírus poderia ter
mecanismo fisiopatológico alternativo, sem papel preponderante das células T CD8.
2.6. Reservatórios de hantavírus
Os hantavírus tem sido considerados como roboviroses, vírus transmitidos por
roedores. As espécies de roedores-reservatório de hantavírus são incluídas em 2
famílias: a Muridae, subfamília Murinae (ratos e camundongos), que habita o Velho
Mundo e Novo Mundo; e a Cricetidae, dividida nas subfamílias Arvicolinae (ratazanas e
lêmingues, encontrados na Eurásia e América do Norte), Neotominae e Sigmodontinae
do Novo Mundo (Oliveira et al., 2014a). Entretanto, hantavírus também têm sido
descritos em hospedeiros não-roedores, como insetívoros e morcegos (Zeller et al.,
1989, Sumibcay et al., 2012, Sundström, 2013, Gu et al., 2014). Estudos recentes
mostram o potencial de morcegos como reservatórios de hantavírus. Inicialmente,
identificou-se em morcegos da espécie Nycteris hispida de Serra Leoa, na África, o
hantavírus Magboi (Weiss et al., 2012); posteriormente, também na África, foi
identificado o hantavírus Mouyassué em morcegos da espécie Neoromicia nanus
(Sumibcay et al., 2012). Mais recentemente, foram identificados três novos hantavírus
em morcegos: o Longquan em Rhinolophus das espécies R. affinis, R. sinicus e R.
monoceros, o Huangpi em Pipistrellus abramus na China, e o vírus Xuan Son em
Hipposideros pomona, no Vietnã (Gu et al., 2014).
Ectoparasitas poderiam ser potenciais transmissores de hantavírus entre os
animais silvestres (Houck et al., 2001). Os ecotoparasitas estariam influenciando na
sazonalidade do reservatório natural do hantavírus Bayou (BAYV), Oryzomys palustris
(Carmichael et al., 2007). Plyusnin et al., (2014) sugerem que um pré-bunyavírus,
provável ancestral dos hantavírus, tenha sido originado de hospedeiros artrópodes há
aproximadamente 150 milhões de anos (MA). Na América do Sul e no Brasil,
hantavírus são zoonoses de roedores da subfamília Sigmodontinae. Porém, existe um
único relato sobre encontro de anticorpos de hantavírus em morcegos (Sabino-Santos Jr
Tese de Doutorado
34
et al., 2015), e de detecção parcial do genoma viral em morcegos e marsupiais (Araujo
et al., 2012).
2.6.1. Roedores Sigmondontinae
Existe grande diversidade entre os Sigmodontinae, com aproximadamente 540
espécies e 84 gêneros distribuídos pelo Continente Americano (D’Elía et al., 2007,
2008, Jonsson et al., 2010,). Isso faz desta subfamília a mais diversa dentre os
mamíferos do Novo Mundo e a segunda em escala mundial, perdendo apenas para os
roedores do Velho Mundo, da subfamília Murinae (D’Elía et al., 2007). A diversidade
de espécies entre os gêneros de Sigmodontinae é irregular, sendo que Akodon e
Thamasomys apresentam mais de 40 espécies descritas (D’Elía, 2003a). Trata-se de um
desafio estudar a dinâmica destes roedores, quando novas espécies são constantemente
descritas, como uma do gênero Juliomys descrita na Floresta Atlântica do Paraguai (De
La Sancha et al., 2009). E também, porque estão ocorrendo constantes mudanças nos
ecossistemas causadas pelo homem. Tais mudanças favorecem a competição
interespecífica com uma das espécies competidoras sobressaindo. Portanto, para estudar
a dinâmica desses roedores selvagens é preciso estabelecer padrões definidos com
marcadores para captura e recaptura (Mills et al., 1997, Lima et al., 1999). Ainda,
flutuações na densidade populacional de roedores são dependentes do clima e habitat
dos animais (Lima et al., 1999, Ghizoni et al., 2005).
2.6.1.1. História evolutiva
Fósseis encontrados na América do Norte sugerem que os Sigmodontinae da
América do Norte e do Sul tenham se originado de um único ancestral comum, o
Copemys, gênero de roedores da América do Norte, há 25 MA (Baskin, 1989). Cinco
gêneros neotropicais de Sigmodontinae foram observados no Arizona-USA, embora três
deles ainda possam ser encontrados: Calomys, Sigmodon e Oryzomys (Baskin, 1989).
Quanto à América do Sul, os primeiros fósseis de Sigmodontinae (Auliscomys e
Necromys), datam aproximadamente de três MA (Reig, 1987, D’Elía, 2003b). Seguemse os gêneros Akodon, Graomys e Reithrodon, com 2,5 MA. Portanto, com base em
fósseis encontrados, não se sabe ao certo como formou-se a especiação da fauna
Sigmodontinae encontrada atualmente (Steppan, 1995). Quanto à história natural dos
Sigmodontinae, são apectos obscuros a região geográfica de origem e quando linhagens
destes roedores teriam invadido a América do Sul. Sabe-se que o ancestral dos
Tese de Doutorado
35
Sigmodontinae viveu na América do Norte e Central. Entretanto, estes roedores
poderiam ter migrado da América do Sul para a Central e a do Norte. Estima-se que os
Sigmodontinae estejam na América do Sul há aproximadamente 20 MA, porém este
também é um tema em debate (D’Elía, 2003a).
2.6.1.2. Distribuição geográfica
Os Sigmodontinae habitam desde a Tierra del Fuego (Chile e Argentina), na
América do Sul, até os Estados Unidos, na América do Norte. Eles estão também
presentes em algumas ilhas, adjacentes ao continente ou mesmo oceânicas, como as do
Arquipélago de Galápagos e as de Fernando de Noronha. A maioria dos Sigmodontinae
existentes, 61 dos 84 gêneros, encontra-se no continente Sul Americano. O Brasil, maior
país da América do Sul, abriga 46 dos 61 gêneros existentes no continente (D’Elía,
2003a, Bonvicino et al., 2008, Reis et al., 2011).
Três gêneros de Sigmodontinae habitam as 3 Américas: Oligoryzomys,
Sigmodon e Oryzomys, sendo este último, ausente do Brasil (Weksler et al., 2006).
Nesoryzomys
ocorre
nas
ilhas
Galápagos.
Também,
sabe-se
de
gêneros
presumivelmente extintos, como Megalomys, Megaoryzomys, e Noronhomys que
ocorriam nas Antilhas, Galápagos e Fernando de Noronha, respectivamente. Quanto ao
roedores do gênero Rhagomys, pensava-se que ocorressem apenas na costa do estado do
Rio de Janeiro, habitando fragmentos de Mata Atlântica; contudo, surgiram relatos
destes roedores nos Andes peruanos e, recentemente, na Bolívia (Luna e Patterson,
2003, Villalpando et al., 2006). O gênero Necromys possui nove espécies, dentre elas a
N. lasiurus, que é amplamente distribuído no Brasil, ocorrendo desde o leste do estado
do Pará até o norte do Rio Grande do Sul e sudoeste de Rondônia. No norte do Brasil há
indícios da ocorrência de N. urichi (Musser et al., 2005, Bonvicino et al., 2008).
2.6.1.3. Características físicas
Os Sigmodontinae divergem muito quanto a características físicas. São, em
geral, de tamanho pequeno, quando comparados aos de outras subfamílias de roedores,
variando de 12 a 400 gramas. O espécime de maior porte dentre os Sigmodontinae,
Kunsia tomentosus, não ultrapassa 300 mm de comprimento total. A orelha destes
roedores varia de ausente ou quase reduzida em Blarinomys breviceps (8 a 10 mm), a
moderada em N. lasiurus (Figura 5) e Akodon montensis (12 a 20 mm), e grande em K.
tomentosus e Scapteromys tumidus (21 a 32 mm) (Matson et al., 1977, Musser et al.,
Tese de Doutorado
36
2005, Bonvicino et al., 2008). A cauda destes roedores depende do tipo de
comportamento de cada espécie. Em geral, é anelada com terminações pontiagudas e
pouco pêlo. Em Rhipidomys, roedores de comportamento arborícola e escalador, a
cauda é maior que o corpo, assim como em Oligoryzomys. Em roedores terrestres como
os Necromys, Akodon e Calomys, a cauda é menor ou do tamanho do corpo (Bonvicino
et al., 2008). As patas também dependem do tipo de comportamento dos roedores.
Arborícolas possuem patas grandes e fortes. Semi-aquáticos possuem pata grande com
membranas interdigitais, e os terrestres e fossoriais (adaptados a cavar) geralmente,
possuem patas que não ultrapassam 37 mm na idade adulta, com garras salientes. Como
em toda ordem Rodentia, os incisivos são encontrados no maxilar superior e inferior,
sendo os caninos e pré-molares ausentes. O número total de dentes é dezesseis. Faz
exceção o Neusticomys oyapocki que possui dois molares no maxilar inferior e superior.
Observa-se grande variação quanto ao tamanho dos molares, morfologia e número de
raízes. Sigmodontinae que se alimentam de animais, sementes, frutas ou fungos
possuem coroa molar baixa e distinta daquela presente nos que se alimentam de
vegetação abrasiva como pastos e cana-de-açúcar (Reig 1987, D’Elía, 2003a, Luna e
Patterson, 2003).
2.6.1.4. Habitat, comportamento e dieta
Sigmodontinae habitam praticamente todos os ecossistemas do continente
Americano incluindo desertos, florestas equatoriais e tropicais, pântanos, cerrados,
campos de altitude, salinas e caatinga. Em sua maioria são terrestres como, por
exemplo, Akodon sp., Necromys sp., Calomys sp., Oligoryzomys sp., Juliomys sp.
(D’Elía, 2003b, D’Elía et al., 2008, De la Sancha et al., 2009). Porém, existem alguns
semifossiriais, como Blarinomys breviceps, Oxymicterus judex, O. dasytrhicus e
Juscelinomys sp. (Matson et al., 1977, Emmons 1999, Gonçalves et al., 2004),
arborícolas como Rhipidomys sp., Oecomys sp., Phaenomys sp. e Rhagomys sp. (Luna e
Patterson, 2003) e semi-aquáticos como Scapteromys tumidus, Nectomys squamipes,
Holochilus sciureus (Ernest et al., 1986). Algumas espécies semi-aquáticas habitam
florestas como Nectomys squamipes. Outros semi-aquáticos habitam vegetações
rasteiras e cerrados como Scapteromys tumidus. Alguns Sigmodontinae possuem mais
de um hábitat. Akodon azarae, A. montensis e Necromys lasiurus vivem em diferentes
tipos de ambientes abertos: pantanal úmido e seco, nos pampas, e sistemas agrícolas de
cana-de-açúcar e braquiária (D’Elía, 2003b, Bonvicino et al., 2008). Enquanto alguns
Tese de Doutorado
37
Sigmodontinae são altamente sensíveis à destruição de seus habitats, outros se adaptam
a esta situação. É o caso do A. azarae, A. montensis, N. lasiurus, Calomys tener e
algumas espécies de Oligoryzomys. Ainda, alguns Sigmodontinae vivem como
comensais dos seres humanos. Este é o caso do A. reigi, que tem sido coletado em casas
rurais no Uruguai (D’Elía, 2003a).
Os Sigmodontinae possuem comportamento noturno, contudo, algumas espécies
semi-aquáticas, como Holochilus sciureus têm também hábito diurno. Ainda, roedores
de espécies semi-aquáticas de Scapteromys sp., Nectomys sp., Oryzomys sp., Holochilus
sp., Amphinectomys sp. e Lundomys sp. são excelentes nadadores e mergulhadores,
podendo escapar de predadores e também explorar estes ambientes em busca de
alimento. Em geral, os Sigmodontinae fazem seus ninhos com 10 a 15 cm de largura e
profundidade de 30 cm, podendo ser mais profundos no caso dos fossoriais e
semifossoriais. Menos comum, são ninhos entre pedras e em raízes de árvores. Alguns,
de hábito semi-aquático, fazem seus ninhos próximos à água. Arborícolas, como
Thomasomys aureus e espécies de Oecomys e Rhipidomys, constroem seus ninhos em
árvores, podendo até utilizar ninhos de pássaros. Os Sigmodontinae machos têm hábito
de andar em torno de seus ninhos, podendo chegar a dois hectares (D’Elía, 2003a,
2003b). Contudo, estudos de ecologia mostraram que Sigmodontinae terrestres tem
sazonalidade e dispersão, principalmente no outono como é o caso de espécies de
Akodon (Ernest et al., 1986, Cook et al., 2001). Pouco se sabe sobre a comunicação
entre os Sigmodontinae. Porém, é conhecido que a dominância é comunicada por estes
roedores, principalmente pelo odor das excretas, fezes e urina, e que espécies semiaquáticas, particularmente Nectomys squamipes, emitem sons de alta freqüência (Ernest
et al., 1986, D’Elía, 2003a).
O conhecimento sobre a dieta dos Sigmodontinae baseia-se, principalmente, em
análises do conteúdo estomacal desses animais. Como esperado de roedores tão
diversos, os mesmos possuem, também, dietas variadas. Alguns são onívoros, podendo,
a depender da disponibilidade, se alimentar tanto de tecidos vegetais como de tecidos
animais. Espécies de hábito terrestre, em sua maioria, são granívoros. Arborícolas e
semi-fossoriais costumam ser frugívoros e carnívoros, respectivamente (D’Elía, 2003a).
A dieta mais estudada foi a do roedor semi-aquático Nectomys squamipes, que se
alimenta de insetos e pequenos animais com até 20 cm, além de pequenos peixes
(Ernest et al., 1986).
Tese de Doutorado
38
2.6.4.5. Ciclo reprodutivo
Os Sigmodontinae são, em geral, de vida curta. Atingem a maturidade na mesma
estação de nascimento. Vivem por nove meses e chegam à maturidade sexual em 45
dias. A média do número de embriões destes animais é de 4,5. Informações sobre a
reprodução dos Sigmodontinae vêm, principalmente, da análise de espécimes
capturados, onde são avaliadas as medidas externas, posição dos testículos, membrana
na vagina e número de embriões. Desta forma, inferências no tocante à sazonalidade da
atividade reprodutiva e tamanho da prole puderam ser realizadas (D’Elía, 2003a).
Espécies de Zygodontomys se reproduzem continuamente, mesmo em locais com
estações bem definidas (seca e chuvosa). Outras espécies respeitam a sazonalidade,
reproduzindo-se, principalmente, na primavera e verão. Em espécies do gênero
Calomys, os padrões de comportamento de cópula foram bem descritos. Tanto machos
como fêmeas têm comportamento agressivo no momento da cópula e os machos, em sua
maioria, não são monogâmicos (Laconi et al., 1998, Lassere et al., 2000). Na espécie A.
azarae ocorrem em fêmeas férteis, em 30 a 60%, os cromossomos sexuais XY. Nestes
casos, apesar de presentes, ocorre expressão deficiente do cromossomo Y, resultando no
desenvolvimento de ovários em vez de testículos (D’Elía, 2003a).
Um aspecto marcante na dinâmica populacional dos Sigmodontinae são os
freqüentes surtos que tornam suas populações abundantes em curto espaço de tempo.
Esse fenômeno é denominado “ratada”. As “ratadas” envolvem, geralmente, o
crescimento absurdo de quatro espécies, com sobreposição de seus nichos ecológicos. O
fenômeno ocorre por desequilíbrio ecológico causado pelo homem, ou também, é
decorrente de fenômenos climáticos naturais como o El niño. Sabe-se que a introdução
de animais e vegetações exóticas em uma determinada região leva à extinção de
espécies de roedores, como relatado por Mann (1945), ou ao fenômeno de “ratadas”
(Lima et al., 1999).
2.6.1.6. Importância dos Sigmodontinae para o homem
Sigmodontinae são roedores de grande importância para o homem. Sabe-se que
muitas espécies desta subfamília desempenham importante papel em seus ecossistemas
naturais. Algumas são importantes na dispersão de sementes, e ainda servem como fonte
alimentar para animais vertebrados carnívoros, como corujas e cobras. As espécies
terrestres Necromys sp., Akodon sp., e Calomys sp. são verdadeiras pragas em sistemas
Tese de Doutorado
39
agrícolas, pois roedores dessas espécies
quebram as sementes, inviabilizando a
germinação, podendo comer até 2 kg de comida por ano. N. lasiurus, Sigmodon hispidus
e Zygodontomys brevicauda são pragas da plantação de cana-de-açúcar (D’Elía, 2003a).
Também, vários destes animais são reservatórios naturais de agentes etiológicos de
várias doenças na América do Sul. Este é o caso dos Oligoryzomys sp., Necromys
lasiurus, Calomys sp., Akodon azarae e o rato de algodão Sigmodon alstoni,
reservatórios naturais de hantavírus (para o Brasil ver figura 1). De forma similar,
Calomys musculinus e o rato da cana Zygodontomys brevicauda são, respectivamente,
hospedeiros dos arenavírus Junin, na Argentina, e Guanarito na Venezuela. Os roedores
O. nigripes, A. montensis, Thaptomys nigrita, Euryoryzomys russatus (Weksler et al.,
2006) abrigam ectoparasitas que, por sua vez, são reservatórios do agente etiológico da
doença de Lyme: Borrelia burgdorferi (Chiappero, 2003, Suzuki et al., 2004,
Figueiredo et al., 2009a, Salked e Lane, 2010).
2.6.2. Morcegos
Taxonomicamente, os morcegos pertencem a ordem Chiroptera (palavra que
deriva do grego cheir, mão, e ptero, asa) (Moratelli e Calisher, 2015). Dobson (1875)
dividiu os Chiroptera nas subordens: Megachiroptera (também referida como morcegos
gigantes, morcegos frugívoros do Velho Mundo ou raposas-voadoras) e Microchiroptera
(micro morcegos). Os Megachiroptera incluem apenas os Pteropodidae e os
Microchiroptera incluem todas as outras famílias (Koopman, 1994). Os Pteropodidae
possuem 42 gêneros compreendendo 166 espécies e os Microchiroptera contém 17
famílias (aproximadamente 135 gêneros com 930 espécies) (Calisher et al., 2006, Reis
et al., 2007). Os Megachiroptera estão distribuídos na região tropical da África, Índia,
sudeste da Ásia e Austrália. (Fenton, 1983, Reis et al., 2007). No Brasil, são conhecidas
9 famílias de Microchiroptera com 64 gêneros e 167 espécies. Representam a segunda
ordem de maior riqueza de espécies no Brasil, perdendo apenas para a ordem Rodentia
com 235 espécies (Reis et al., 2007). Esta classificação foi amplamente utilizada, por
mais de um século, mas já não é aceita pelos sistematas de morcegos. Atualmente,
Yinpterochiroptera (Rhinolophoidea + Pteropodidae) e Yangochiroptera (todas as outras
famílias) são as subordens reconhecidas (Springer et al., 2001, Van Den Busshe e
Hoofer, 2004).
A palavra morcego é derivado do latim muris (rato) e coecus (cego). Também
vespertilio, do grego, e nycteris, do latim, são nomes relacionados ao hábito de vida
Tese de Doutorado
40
noturno (Reis et al., 2007). Popularmente, os morcegos são considerados cegos, ratos
alados, ou sugadores de sangue. Esse mito conduziu, em parte, à extinção de populações
de morcegos. Entretanto, esses animais, em sua grande maioria, são de grande utilidade
para os homens (Calisher et al., 2006, Reis et al., 2007).
2.6.2.1. História evolutiva
É difícil encontrar fósseis com informações sobre o período inicial da evolução
dos morcegos. Isso deve-se, em grande parte, ao seu delicado, pequeno e leve esqueleto
que não se preserva bem. O registro fóssil mais antigo, que remete a alguma
característica quiróptera, provém de meados do período Paleocênico (Reis et al., 2007,
Moratelli e Calisher, 2015). Esse registro apresentava tanto características de morcegos
como de insetívoros (Eulipotyphla, o grupo dos musaranhos). Estudos com dados
moleculares permitiram relacionar filogeneticamente esses dois grupos, onde os
Eulipotyphla se mantiveram como o grupo irmão do clado onde se encontram os
morcegos (Murphy et al., 2001). Mesmo assim, não é possível determinar se esses
animais primordiais já apresentavam estruturas alares. Especula-se que os morcegos
evoluíram com o início da diversificaçãoo das plantas com flores, o que trouxe,
consequentemente, a abundância de insetos. Nesta época, os mamíferos da ordem
Insetivora também se estabeleceram e exerceram uma forte pressão predadora contra os
ancestrais dos morcegos, pois havia mamíferos dessa ordem que predavam pequenos
mamíferos (Reis et al., 2007, Fenton e Simmons, 2015). Presume-se que os ancestrais
dos morcegos fossem noturnos, tendo evoluido de um mamífero pequeno e arborícola.
Após milhões de anos saltando, de árvore em árvore, atrás de insetos o processo de
seleção natural direcionou para o desenvolvimento de membranas que possibilitaram
esses ancestrais a planarem, assim como os colugos (ordem Dermoptera), e esquilos
voadores (ordem Rodentia). Deste ponto, os ancestrais dos morcegos se lançaram para o
vôo, onde menos energia é gasta, do que correr e saltar de árvore em árvore, além de
evitar contatos com predadores terrestres (Reis et al., 2007, Fenton e Simmons, 2015).
Sendo assim, o fóssil mais antigo completo de um verdadeiro morcego remete a
linhagem placentária do Eocênico a 60 MA, coincidindo com um grande aumento da
temperatura global (Calisher et al., 2006, Reis et al., 2007). Análises morfológicas desse
fóssil evidenciaram um Microchiroptera com hábitos insetívoros e habilidade para
ecolocalização. Outro relato de um fóssil encontrado, na Alemanha, também de um
Tese de Doutorado
41
morcego semelhante aos atuais, remete a 50 MA (Reis et al., 2007, Moratelli e Calisher,
2015).
2.6.2.2. Distribuição geográfica
Os morcegos estão distribuídos amplamente no mundo, ocorrendo em todos os
continentes, exceto na Antártida. Eles são a segunda ordem mais comum de mamíferos,
superada apenas pela Primates, devido à ampla distribuição dos seres humanos. Devido
à sua capacidade de voar, eles colonizaram muitas ilhas oceânicas e em algumas são os
únicos mamíferos nativos (Koopman, 1994). Entre as famílias reconhecidas atualmente,
Emballonuridae, Molossidae e Vespertilionidae ocorrem tanto no Novo como no Velho
Mundo. Cistugidae, Craseonycteridae, Hipposideridae, Megadermatidae, Miniopteridae,
Mystacinidae,
Myzopodidae,
Nycteridae,
Pteropodidae,
Rhinolophidae
e
Rhinopomatidae são endêmicas do Velho Mundo. Furipteridae, Mormoopidae,
Natalidae, Noctilionidae, Phyllostomidae e Thyropteridae ocorrem apenas no Novo
Mundo (Fenton e Simmons, 2015).
No Brasil, os morcegos, habitam todo o território nacional. As famílias
brasileiras com seus respetivos números de espécies são: Emballonuridae (17),
Phyllostomidae
(90),
Mormoopidae
(4),
Noctilionidae
(2),
Furipteridae
(1),
Thyropteridae (4), Natalidae (1), Molossidae (29) e Vespertillionidae (26) (Reis et al.,
2013).
2.6.2.3. Características físicas
Os morcegos variam muito em tamanho e forma. Suas massas corporais variam
de 2g no morcego-abelha, Craseonycteris thonglongyai (Craseonycteridae), o segundo
menor mamífero conhecido, para 1Kg em algumas raposas voadoras, Pteropus spp
(Pteropodidae), cuja envergadura pode chegar a 2m (Wilson, 1997, Moratelli e Calisher,
2015). No Brasil, o maior morcego é o filostomídeo Vampyrum spectrum, que pode
chegar a 190g, 15cm de corpo e 70cm de envergadura (Reis et al., 2007).
Como animais noturnos, possuem poucos cones na retina, estrutura relacionada
com a percepção de cores. No entanto, não são cegos, e embora todas as famílias
brasileiras usem a ecolocalização para se orientar, alguns frugívoros maiores utilizam,
também, a visão para se localizarem. Por utilizarem primariamente o sistema de
ecolocalização para se orientarem, seus olhos são pequenos, as orelhas são grandes, o
“tragus” bem desenvolvido e as ornamentações nasais e faciais muitas vezes estão
Tese de Doutorado
42
presentes (Reis et al., 2007). Nos morcegos da família Phyllostomidae, a folha nasal é
uma marca reconhecida. Esta, por sua vez, toma parte importante no direcionamento
dos ultrassons que saem pelas narinas (Neuweiler, 2000). Durante o processo de
ecolocalização, os sons de alta frequência são transmitidos pela boca ou pelo nariz, e
são refletidos em superfícies do ambiente, indicando, assim, a direção e distância dos
objetos (Fenton e Simmons, 2015).
No tocante à coloração das pelagens, os morcegos, por serem animais noturnos,
apresentam poucas variações entre o preto e o pardo, com algumas poucas espécies
ruivas ou amaraledas. Mesmo assim, espécies como Diclidurus apresentam pelagem
branca, porém isso não parece ser um componente importante (Reis et al., 2007).
Durante a evolução, os morcegos desenvolveram finas e elásticas membranas,
denominada de patágio. O patágio vai de entre os dedos alongando-se até a parte distal
de suas pernas. Por isso, seus ossos são longos, finos, tubulares e leves, o que favoreceu
ainda mais a habilidade de voar para os morcegos (Fenton e Simmons, 2015). As
falanges da mão são extremamente longas, sustentadas pelo patágio. As vértebras
cervicais são torcidas possibilitando à cabeça permanecer levantada, o que permite,
quando pendurados de cabeça para baixo, ver o ambiente normalmente, sem que pareça
invertido. As vértebras tóraco-lombares são curvadas para ampliar a caixa torácica, e o
esterno apresenta uma crista para inserção de fortes músculos peitorais. As costelas são
ligadas parcialmente para tornar o tórax mais resistente, a clavícula é grossa e bem
fixada. A bacia sofreu torsão e o joelho é voltado para trás. Como seu patágio possui
grande superfície, sofrem muita desidratação e por isso, a necessidade de água é maior
em morcegos do que em outros mamíferos de mesmo porte físico (Neuweiler, 2000,
Reis et al., 2007).
A dentição varia com o modo de alimentação adotado. Os caninos são grandes e
os incisivos sempre rudimentares, com exceçãoo dos hematófagos, onde são bem
desenvolvidos. Os dentes permanentes variam de 20 nos hematófagos, até 38 nos
insetívoros. Nos hematófagos os incisivos são cortantes, os molares são achatados para
esmagar frutos nos frugívoros e pontiagudos nos insetívoros, para quebrar a quitina dos
insetos (Reis et al., 2007).
2.6.2.4. Habitat, comportamento e dieta
Os morcegos são únicos entre os mamíferos devido a sua capacidade de voar.
Em busca de comida, os morcegos podem voar até 80 Km por noite. Algumas espécies
Tese de Doutorado
43
durante períodos de migrações sazonais podem voar até 1290 Km. Isso permitiu aos
morcegos viverem em quase todo o tipo de ecossistema (Calisher et al., 2006). No
Brasil, os morcegos ocorrem na Amazônia, Cerrado, Mata Atlântica, Pantanal, no árido
nordeste e nos pampas gaúchos (Reis et al., 2007). Em áreas preservadas, seus abrigos
são as cavernas, tocas de pedras e ocos de árvores, mas também árvores com troncos de
coloração similar à sua, ou no meio de folhas de palmeiras, bananeiras, raízes na beira
de rios, árvores caídas, cupinzeiros e até nas áreas urbanas devido a intensa degradação
ambiental (Reis et al., 2007).
Embora os morcegos sejam superados pelos roedores em riqueza de espécies,
eles estão em primeiro lugar entre os mamíferos e, provavelmente, entre os vertebrados,
em diversidade alimentar (Fenton e Simmons, 2015). Estão adaptados para explorar
uma grande variedade de animais e vegetais como itens alimentares (Wilson 1973,
1997, Altringham 1996, 2011). Praticamente todos os grupos tróficos podem ser
observados entre os morcegos, com exceção dos saprófagos (Reis et al., 2007).
Portanto, o tipo de alimentação permite dividir estes animais em frugívoros, polinívoros
e nectarívoros, insetívoros aéreos (aqueles que capturam insetos em vôo, mas algumas
espécies capturam os insetos no chão), carnívoros (se alimentam de pequenos
vertebrados, incluindo pássaros, sapos e mamíferos), piscívoros (se alimentam de
pequenos peixes nas superfícies das águas), hematófagos (se alimentam exclusivamente
de sangue de mamíferos, Desmodus rotundus, e aves, Diaemus youngi e Diphylla
eucadata) e onívoros (Wilson, 1973, 1997).
Uma característica importante dos morcegos das famílias Vespertilionidae e
Rhinolophidae é a capacidade de entrar em torpor diário e hibernação sazonal. Isso
garante economia de energia nas noites frias e nos meses de inverno (Lyman, 1970).
2.6.2.5. Ciclo reprodutivo
A reprodução dos morcegos é semelhante a de outros mamíferos, mas o
acasalamento e duração da época de reprodução são fortemente influenciados pela
hibernação e migração. Geralmente, produzem 1 filhote por ano, mas podem ter 2 ou 3
e, raramente, 4. Noctilionidae e Phyllostomidae normalmente são poliestros (ciclo
contínuo), enquanto Vespertillionidae e Mollossidae são monoestros (ciclo único) (Reis
et al., 2007, Moratelli e Calisher, 2015). A gestação dura, em média, dois meses, porém
pode também levar até 11 meses. O nascimento dos filhotes se dá em época de maior
Tese de Doutorado
44
oferta de alimentos e geralmente cuidam de seus filhotes durante três meses (Reis et al.,
2007, Moratelli e Calisher, 2015).
Entre os mamíferos, a expectativa de vida geralmente aumenta conforme o
tamanho do corpo e portanto, animais de maior porte vivem mais tempo. Mas os
morcegos são exceção a essa regra. Enquanto um rato de 40g pode viver até dois anos,
um morcego de mesmo porte, pode viver até 20 anos na natureza (Wilkinson e South,
2002, Reis et al., 2007). Existem relatos de um morcego da Sibéria, Myotis brandtii, que
foi recapturado 41 anos depois de sua primeira captura (Podlutsky et al., 2005).
Contudo, registros de morcegos acima de 30 anos com vida livre são conhecidos apenas
para 5 espécies: Myotis lucifugus, M. blythii, Plecotus auritus, Rhinolophus
furremequinum e o megaquiróptero Pteropus giganteus (Wilkinson e South, 2002).
Análises do genoma e transcriptoma dos morcegos revelaram mudanças em genes que
aparentam contribuir para o tamanho pequeno do corpo e uma longa vida útil (Seim et
al., 2013).
2.6.2.6. Importância dos morcegos para o homem
O vôo, a característica mais peculiar dos morcegos e uma das mais importantes
para sua ampla distribuição, também teve efeitos sobre a evolução do sistema imune e
do metabolismo destes animais, o que lhes permitiu tornarem-se reservatórios naturais
de muitos vírus (O'Shea et al., 2014, Brook e Dobson, 2015). A habilidade de voar
também facilita a manutenção e o espalhamento desses patógenos. Vírus de várias
famílias como Bunyaviridae (hantavírus), Flaviviridae (vírus do Nilo Ocidental),
Filoviridae (vírus Ebola), Coronaviridae (coranavírus SARS e MERS) já foram
relatados em morcegos e tidos como seus reservatórios naturais (Moratelli e Calisher,
2015).
Entretanto, independente da percepção pública negativa, morcegos são
elementos críticos de todas as comunidades bióticas terrestres e particularmente para o
homem. Servem como material de pesquisa na medicina, em estudos epidemiológicos,
farmacológicos, mecanismos de resistência a doenças e no desenvolvimento de vacinas
(Calisher et al., 2006, Reis et al., 2007). Suas asas, que são constituídas dos tecidos
animais mais transparentes, permitem estudos sobre a circulação sanguínea, efeito de
inalação de fumaça e tempo de eliminação de drogas (Reis et al., 2007). Ainda, eles
possuem papéis importantes no controle de insetos (Boyles et al., 2011), dispersão de
sementes e polinização de plantas que servem como alimento humano e animal (Dirzo
Tese de Doutorado
45
et al., 2014). O guano é usado como fertilizante assim como para fabricação de
sabonetes e antibióticos. Além disso, a ecolocalização dos morcegos e a radiação
infravermelha dos hematófagos (Desmodus rotundus) forneceram modelos para
sistemas de sonar e infravermelho, respectivamente (Campbell et al., 2002, Moratelli e
Calisher, 2015).
Tese de Doutorado
46
_____________________________________________________________________
3. Hipóteses
Hipóteses
1- (H0) Os hantavírus, no Brasil, são vírus de pequenos roedores Sigmondotinae que: (i)
infectam somente esses roedores em ambientes degradados onde a diversidade de
espécies é baixa; (ii) na região nordeste do estado de São Paulo, somente o roedor
Necromys lasiurus é o reservatório natural do hantavírus ARQV. (capítulo 1).
2- (H0) A viremia entre os morcegos é muito baixa diminuindo a transmissão dos
hantavírus e fazendo com que esses animais não possuam papel relevante como
reservatórios de hantavírus no Brasil. (capítulo 2).
3- (H0) Existe uma diversidade muito grande de espécies de ectoparasitas em pequenos
mamíferos, mas: (i) não se conhece espécies de ectoparasitos nas áreas de estudo que
possam ser reservatórios de hantavírus; (ii) há relação entre o número de ectoparasitos
encontrado em um hospedeiro com maior risco de infecão por algum patógeno.
(capítulo 3).
Tese de Doutorado
48
_____________________________________________________________________
4. Objetivos
Objetivos
Realizar um levantamento das espécies de pequenos roedores e marsupiais selvagens,
com captura e recaptura, em cinco habitats distintos: Cerrado, Mata Semidecídua, Mata
Ciliar, e monoculturas de Capim Braquiária e Cana de Açúcar. (Capítulo 1).
Avaliar a diversidade das espécies de pequenos mamíferos terrestres nas estações seca
(abril a setembro) e chuvosa (outubro a março) e nos distintos habitats. (Capítulo 1).
Estimar o uso do habitat por roedores e marsupiais capturados. (Capítulo 1).
Determinar se os padrões ecológicos, incluindo aspectos alométricos (relação de
tamanho cabeça-corpo, massa corporal, índice de massa corporal, maturidade sexual),
diversidade de espécies, idade, tipo de habitat e sexo influenciam na infecção por
hantavírus em roedores e marsupiais selvagens. (Capítulo 1).
Caracterizar geneticamente hantavírus detectados em pequenos mamíferos selvagens.
(Capítulos 1 e 2).
Realizar levantamento das espécies de morcegos no nordeste do Estado de São Paulo e
norte do Estado de Minas Gerais, utilizando captura e recaptura, em distintos habitats:
Cerrado, Mata Ciliar, Mata Seca (Mata Estacional Decidual), Mata Semidecídua,
monoculturas de Capim Braquiária e Cana de Açúcar, e áreas de Cerrado degradado.
(Capítulo 2).
Avaliar a diversidade das espécies de morcegos nas áreas amostradas. (Capítulo 2).
Estimar o uso do habitat pelos morcegos capturados. (Capítulo 2).
Avaliar parâmetros ecológicos (diversidade de espécies por habitat, idade e estado
reprodutivo) que influenciariam a infecção por hantavírus em morcegos. (Capítulo 2).
Realizar um levantamento das espécies de ectoparasitos de pequenos roedores,
marsupiais e morcegos no nordeste do estado de São Paulo e norte de Minas Gerais.
(Capítulo 3).
Avaliar a especifidade ectoparasita-hospedeiro e procurar por relação entre quantidade
de ectoparasitos encontrados e infecção por hantavírus nos animais capturados.
(Capítulo 3).
Tese de Doutorado
50
___________________________________________________________________________
5. Capítulo 1: Ecologia de hantavírus em pequenos
mamíferos terrestres
Capítulo 1
Ecologia de hantavírus em pequenos mamíferos terrestres
Resumo: Na América do Sul, os hantavírus utilizam, como reservatório natural,
roedores da subfamília Sigmodontinae. Neste estudo, analisamos a prevalência de
infecções por hantavírus em pequenos mamíferos de diferentes habitats, na região
nordeste do estado de São Paulo, e a influência destes sobre os animais. Para tanto,
capturamos, no período de fevereiro 2012 a junho de 2013, 154 pequenos mamíferos
terrestres. Destes, Akodon montensis, Didelphis albiventris, Necromys lasiurus e
Oligoryzomys nigripes foram as espécies mais abundantes. N. lasiurus mostrou-se
endêmico no capim braquiária. Houve uma tendência sazonal quanto à maior
diversidade de espécies na estação chuvosa, porém, sem correlação com a infecção por
hantavírus nestes animais. Um total de 15 (9,7% de positividade) pequenos mamíferos
apresentaram anticorpos contra hantavírus. A prevalência foi maior entre os N. lasiurus,
e identificamos somente o ARAQV a infectar esses roedores. A frequência de roedores
infectados com hantavírus foi influenciada pela massa corporal e pelo habitat dos
animais. No habitat capim braquiária foi encontrado o maior percentual de pequenos
mamíferos infectados. Portanto, este estudo mostra efeitos da paisagem natural
influenciando a distribuição dos pequenos mamíferos e também a influência da
mudança da paisagem pelo uso humano, reduzindo a diversidade de espécies e alterando
a frequência das infecções por hantavírus em pequenos mamíferos terrestres. Estas
informações são importantes para o entendermos a dinâminca e transmissão da zoonose
por hantavírus na natureza.
Palavras-chaves: infecção por hantavírus, degradação ambiental, pequenos mamíferos
terrestres.
Abstract: In South America hantaviruses have as their natural hosts rodent species of
the subfamily Sigmodontinae. Our goal was to analyze the influence of hantavirus
prevalence, in different habitats, among wild small terrestrial mammals in northeastern
state of São Paulo, southeastern Brazil. One hundred and fifty-four small mammals
were captured from February 2012 to June 2013. From these, Akodon montensis,
Didelphis albiventris, Necromys lasiurus and Oligoryzomys nigripes were the most
common and abundant mammal species in our material. N. lasiurus is endemic in the
habitat with introduced grassland Brachiaria decumbens. There was a seasonal trend of
species diversity for the rainy season, but not correlated with hantavirus infection. A
Tese de Doutorado
52
Capítulo 1
total of 15 (9.7% positive) small mammals had antibodies to hantavirus. The prevalence
was higher in N. lasiurus, and we identified only Araraquara hantavirus infecting theses
rodents. The prevalence of hantavirus seems to be influenced by body mass and the
habitat type. The grassland was brachiaria found with the highest percentage of infected
small mammals. Therefore, this study shows effects of natural landscape influencing the
distribution of small mammals and also the influence of landscape changes by human
use, reducing species diversity and changing frequency of hantavirus infections among
small terrestrial mammals. These informations are important to understand hantavirus
dynamics and transmission in nature.
Key words: Hantavirus infection, environmental degradation, and wild small mammals.
5.1. Introdução
Hantavírus (Bunyaviridae) são comumente transmitidos por roedores, embora,
recentemente, novos hantavírus tenham sido associados a insetívoros e morcegos
(Klempa et al., 2007, Sumibcay et al., 2012). Por muito tempo, pensou-se que os
hantavírus não eram patogênicos para seus reservatórios naturais. Entretanto, evidências
mais recentes sugerem que essas infecções estejam associadas a um custo para seu
fitness ao hospedeiro (Kallio et al., 2007, Luis et al., 2012). Por outro lado, a infecção
humana por hantavírus pode produzir quadros graves (Clement et al., 2014). A principal
via de transmissão para os humanos é a inalação de partículas virais que atingem o trato
respiratório inferior, ou pelo contato direto com sangue ou saliva de animais infectados
(Schönrich et al., 2008, Jonsson et al., 2010).
Postula-se que ecossistemas da região Neotropical, degradados pelo uso humano,
estão associados a maior risco de infecção por hantavírus em roedores e em seres
humanos (Koch et al., 2007, Suzán et al., 2009). Um ecossistema mais complexo, que
abriga grande diversidade biológica, pode conter a disseminação de doenças humanas e
de animais selvagens (Derne et al., 2011). Além disso, uma comunidade altamente
diversificada pode reduzir os níveis de pequenos mamíferos, porque estes servem de
alimento a diversos predadores, como aves, cobras e jaguares. Da mesma forma, um
maior número de espécies em uma comunidade reduz crescimento e sobrevivência das
populações de reservatórios dos hantavírus (Ostfeld e Holt, 2004, Derne et al., 2011).
Diferentes linhagens de hantavírus circulam em todas as Américas. Roedoresreservatório de hantavírus sul-americanos pertencem à subfamília Sigmodontinae
Tese de Doutorado
53
Capítulo 1
(Rodentia: Cricetidae) (Jonsson et al., 2010). Seis linhagens de hantavírus foram
associadas a doença humana no Brasil: Castelo dos Sonhos (CASV), Anajatuba
(ANAV), Laguna Negra-like (LNLV), Rio Mamoré (RIOMV), Juquitiba (JUQV) and
Araraquara (ARQV) (Oliveira et al., 2014). Este último ocorre no Cerrado da região
sudeste e central do Brasil. Cerrado trata-se do habitat principal do roedor Necromys
lasiurus, o principal reservatório do ARQV, o mais virulento dentre os hantavírus,
porque causa doença humana com letalidade de 50% (Figueiredo et al., 2009a).
Acredita-se que a emergência da hantavirose na região nordeste do estado de São Paulo
se deva, principalmente, à degradação ambiental intensa pela monocultura da cana de
açúcar e do campim braquiária, ambas vegetações exóticas à região. Tal mudança na
estrutura e diversidade da paisagem é, provavelmente, responsável pela redução na
diversidade das espécies de roedores, bem como, pela redução de interações bióticas
devidas à extinção dos predadores destes animais. Os roedores das espécies
remanescentes procurariam alimento e abrigo em paióis, armazéns, silos ou outros
lugares edificados pelo homem, assim, facilitando a ocorrência de doença humana
transmitida por estes animais (Figueiredo et al., 2003, De Sousa et al., 2008).
Neste estudo, determinamos a prevalência de infecções por hantavírus (número de
animais infectados por espécie/número total de capturados por espécie) e sua influência
sobre pequenos mamíferos terrestres. Com base nos resultados obtidos: (i) buscamos
por padrões ecológicos relacionados à prevalência de hantavírus na área de estudo; (ii)
avaliamos a infecção por hantavírus nas populações de pequenos mamíferos terrestres;
(iii) e caracterizamos filogeneticamente os hantavírus detectados.
5.2. Material e Métodos
Área de estudo e metodologia de captura
Os pequenos mamíferos foram capturados na região nordeste do Estado de São
Paulo, em 4 campanhas de captura no campo, ocorridas entre fevereiro de 2012 e julho
de 2013. Duas ocorreram na estação seca (abril a setembro) e 2 no período chuvoso
(outubro a março), com atuação em cinco habitats distintos (Figura 1A). Os sítios de
captura escolhidos representam os principais tipos de vegetação e uso do solo na região.
- Sítio 1 (EEJ; Estação Ecológica de Jataí), localizada no município de Luis Antônio,
com uma altitude de 600 m, abrangendo cerca de 9000 ha. Trata-se da maior área
protegida no estado, possuindo vegetação contínua de Cerrado, além de pequenos
enclaves de mata semidecídua. O Cerrado, segundo maior bioma brasileiro (Ratter et al.,
Tese de Doutorado
54
Capítulo 1
1997), é altamente ameaçado pela invasão humana apesar de ser considerado um dos 25
biomas a serem conservados no mundo (Fonseca et al., 2000). Cercada por plantações
de cana-de-açúcar e intensa silvicultura, EEJ mantém alta diversidade de flora e fauna
(Talamoni et al., 2000). Foi selecionada como representante de um ecossistema
complexo e, também, como controle para outros locais.
- Sítio 2; no município de Cajuru, a uma altitude de 775 metros. Neste sítio a maior
parte da vegetação original (Cerrado) foi convertida em cultivares mono-específicos de
capim braquiária e cana-de-açúcar. O local escolhido foi uma área de cultivo de capim
braquiária (Brachiaria decumbens). Esta gramínea, originária da África, é amplamente
distribuída em toda a América tropical e utilizada para alimentar o gado (Miles et al.,
1996).
- Sítio 3; no município de Batatais, situado a uma altitude de 860 m, possuindo grandes
plantações de cana-de-açúcar, com pequenas manchas de outros tipos de vegetação
como o Cerrado nativo e vegetação secundária.
- Sítio 4; no campus da Universidade de São Paulo (USP), município de Ribeirão Preto,
situado a uma altitude de 546,8 metros. Os locais de captura na USP foram mata ciliar,
Cerrado e área cultivada com capim braquiária.
Para a amostragem, armamos armadilhas em uma grade permanente e em um
transecto espaçado, a 1000 m da grade (Fig. 1B), onde fizemos capturas por 6 noites
consecutivas, totalizando um esforço amostral de 600 armadilhas noite (esforço
amostral = número de noites x número de armadilhas por noite) (Mills et al., 1995).
Grade e transecto foram compostas por 100 armadilhas (Sherman e Tomahawk 'R' =
unidade amostral) dispostas no solo e quando possível, em árvores, para capturar
animais de hábito arborícola. Na grade, as armadilhas foram distribuídas em dez colunas
e 10 linhas espaçadas 10 m, com duas linhas de armadilhas do tipo Tomahawk, e as
outras do tipo Sherman. No transecto, armamos 100 armadilhas tipo Sherman ou
Tomahawk intercaladas a 10 m de distância. As iscas adicionadas às armadilhas
continham uma mistura de paçoca de amendoim, banana, essência de baunilha, sardinha
e aveia em flocos. Mamíferos capturados eram recolhidos das armadilhas e
cuidadosamente tratados, segundo as recomendações de Mills et al., (1995) e de acordo
com as leis de proteção da vida selvagem e dos regulamentos previamente aprovados
pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (Ministério do Meio
Ambiente), sob a licença nº 19838-1. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal da Universidade de São Paulo (nº 020/2011).
Tese de Doutorado
55
Capítulo 1
Figura 1. Área de estudo e desenho amostral. (A) Na região nordeste do Estado de São
Paulo evidenciamos os municípios dos sítios de captura. (B) Desenho amostral utilizado
no estudo incluindo uma grade e um transecto linear.
Os
animais
foram
identificados
segundo
caracteres
morfológicos
externos(Bonvicino et al., 2008, Reis et al., 2011). Quando necessário, a identificação
das espécies foi realizada utilizando métodos moleculares (com base num fragmento de
gene do citocromo-b) e seguindo protocolos previamente padronizados (Salazar-Bravo
et al., 2013). As espécies dos animais soropositivos para hantavírus foram confirmadas
por análise de sequências do gene citocromo-b. Animais soronegativos foram
identificados apenas morfologicamente. Os animais foram sexados pela morfologia da
genitália (masculino: presença de pênis; feminino: presença de vagina) e as suas idades
foram inferidas com base na massa corporal e em caracteres sexuais secundários
(presença de testículos no escroto, para machos; e membrana da vagina perfurada, para
fêmeas), o que permitu diferenciá-los em 3 classes (juvenis, subadultos e adultos) (ver
Tabela 1). Animais capturados nas grades foram marcados com brinco de orelha, para
evitar pseudoreplicação e liberados no local da captura. Por fim, uma razão sexual foi
estimada, para cada espécie, segundo o quociente entre número de machos por número
Tese de Doutorado
56
Capítulo 1
total de machos e fêmeas e os desvios da proporção sexual de 1:1 foram testados
utilizando teste binomial (Wilson e Hardy, 2002).
Tabela 1. Estágios de vida segundo a massa corporal e caracteres sexuais secundários
dos animais capturados (Bonvicino et al., 2008, Reis et al., 2011).
Estágios de Vida
Espécies
Juvenis (g)
Sub-Adultos (g)
Adultos (g)
Necromys lasiurus
≤ 19
20 a 39,9
≥ 40
Akodon montensis
≤ 15
16 a 29,9
≥ 30
Calomys tener
≤8
9 a 14,4
≥ 14,5
Oligoryzomys nigripes
≤8
9 a 15,9
≥ 16
Didelphis albiventris
≤ 100
101 a 350
≥ 351
Dasyprocta azarae
≤ 1700
1800 a 2500
≥ 3000
Marmosops paulensis
≤ 30
31 a 70
≥ 71
Rattus rattus
≤ 20
21 a 47,9
≥ 48
Euryoryzomys russatus
≤ 35
36 a 69,9
≥ 70
Determinação das caractéristicas ecológicas
Determinou-se o índice de diversidade que considera número de espécies e a
uniformidade com que os indivíduos estão distribuídos (Simpson, 1949). Trata-se de
uma relação entre número de espécies e número de indíviduos (Spellerberg e Fedor,
2003). Para analisarmos a diversidade de espécies em cada estação do ano (estação seca:
abril a setembro; estação chuvosa: outubro a março) e em cada habitat (cerrado, capim
braquiária, cana-de-açúcar, mata ciliar e semidecídua), utilizamos o índice de ShannonWiener (H) (Shannon, 1948). Diferenças na diversidade de espécies foram analisadas
usando teste-t, teste de Mann-Whitney, ANOVA e o de Kruskal-Wallis (Zar, 1999).
Utilizamos a frequência de captura para conhecer e comparar a preferência de
cada espécie por determinado habitat. Consideramos como variáveis ecológicas: mês
(altamente correlacionado à estação do ano), vegetação (habitat), sexo, maturidade
sexual, idade, local de captura e diversidade de espécies. Também, incluímos a massa
corporal, o comprimento cabeça-corpo e o índice de massa corporal (smi) dos animais
(Peig e Green, 2009).
Tese de Doutorado
57
Capítulo 1
Diagnóstico da infecção por hantavírus em pequenos mamíferos terrestres
Uma amostra de sangue foi coletada no seio retro-orbital de todos os mamíferos
capturados com capilar heparinizado. Amostras de fezes, suabes de saliva e urina
(quando presente) também foram coletados. As amostras foram colocadas em criotubos,
devidamente identificados, utilizando instrumentos limpos e esterilizados para cada
animal. As amostras foram armazenadas em nitrogênio líquido. Dos mamíferos
capturados no transecto, tecidos de coração, pulmões, baço, rins e fígado foram
colocados em criotubos contendo meio para congelamento viral e armazenados em
nitrogênio líquido, para detecção e isolamento de hantavírus. Para imunohistoquímica,
os intestinos dos animais foram guardados em solução com 4% de paraformaldeído e
livre de nucleases. Os animais foram avaliados quanto à presença de anticorpos
específicos, por ensaio imunoenzimático (ELISA) para hantavírus utilizando como
antígeno uma proteína recombinante do nucleocapsídeo de ARQV produzida em no
laboratório do Centro de Pesquisa em Virologia-FMRP-USP. As amostras de sangue
foram diluídas a 1:100. Como anticorpos secundários para roedores, utilizamos uma
mistura, na proporção 1:1, de conjugados de peroxidase com anticorpos anti-Rattus
rattus (roedores Murinae) e anti-Peromyscus leucopus (roedores Sigmodontinae) (KPL,
Maryland, EUA). Para marsupiais (Didelphidae), foram utilizados conjugados de
peroxidase com anticorpos anti-Opossum (Alpha Diagnostics Intl. Inc., San Antonio,
EUA). Este ELISA, previamente padronizado, mostrou sensibilidade de 97,2%,
especificidade de 100%, 100% de valor preditivo positivo e 98,1% de valor preditivo
negativo, quando comparado com o método padrão (Figueiredo et al., 2008, 2009b). A
prevalência de animais com anticorpos para hantavírus, segundo a espécie, foi calculada
dividindo o número de soropositivos pelo número total de analisados.
Os animais soropositivos tiveram RNA extraído do plasma com o QIAamp Viral
RNA Mini Kit (Qiagen, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. As
quantidades de RNA extraído foram quantificadas com o espectrofotômetro NanoDrop
ND1000 (EUA). Para a transcrição reversa utilizamos o High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Life Technologies, EUA), seguindo as instruções do fabricante. As
PCRs foram realizadas segundo Moreli et al., (2004). Os produtos de PCR foram
purificados com ExoSap-TI (Affimetrix, EUA) e, em seguida, utilizados para
sequenciamento nucleotídico. As sequências foram utilizadas para análise filogenética.
Tese de Doutorado
58
Capítulo 1
Análises filogenéticas dos hantavírus detectados
Para as análises filogenéticas, coletamos uma base de dados contendo todas as
sequências completas dos segmentos S e M de hantavírus disponíveis, até 23 de março
de 2015, no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI). As
sequências nucleotídicas dos segmentos S e M foram alinhadas individualmente com as
dos vírus encontradas neste estudo, com o programa MAFFT v7.158b (Katoh &
Standley, 2013). Posteriormente, com o programa Geneious v.8.0.1, selecionamos
apenas a região de amplificação dirigida pelos primers para o segmento S (na posição
nucleotídica: 213-477, sequência protótipo ARQV GenBank: EF571895) e para o
segmento M (na posição nucleotídica: 1301-1625, sequência protótipo ARQV
GenBank: AF307327) fazendo novos alinhamentos. Em seguida, estes dados foram
analisados no programa DAMBE 5.2.6, excluindo-se as sequências idênticas (Xia &
Xie, 2001).
As sequências foram submetidas ao programa jModelTest para identificar o
melhor modelo de substituição de nucleotídeo a ser utilizado na construção de árvores
filogenéticas (Posada, 2008). O critério utilizado foi o aLRT e o melhor modelo de
substituição de nucleotídeos, o GTR+G+I (General Time Reversible) com correção pela
taxa de distribuição gamma (γ) e invariante (I) (Rodríguez et al., 1990). As construções
filogenéticas
basearam-se
em
método
estatístico
probabilístico
de
máxima
verossimilhança (“Maximum Likelihood” - ML), que estima esta verossimilhança dos
dados segundo um processo evolutivo. Assim, utilizamos o modelo de substituição, que
considera taxas com base nos 3 possíveis tipos reversíveis de substituições entre os
nucleotídeos. Para tanto, utilizamos o programa PhyML 3.0, apoiado estatisticamente
por bootstrap (porcentagem de vezes em que o mesmo grupamento original foi
recuperado nas árvores-réplicas) (Guindon et al., 2010). Também, analisamos a
porcentagem de sítios idênticos nos vírus encontrados e nos selecionados, utilizando o
programa Geneious v.8.0.1.
Parâmetros ecológicos relacionados à infecção por hantavírus em pequenos mamíferos
A diversidade de espécies pode afetar, direta ou indiretamente, a presença do
vírus em certos ambientes por diluição do vírus (Randolph e Dobson, 2012). Mas o
risco da doença, provavelmente, seria fenômeno local, dependente da composição da
paisagem onde estão os hospedeiros reservatórios e sua ecologia, sendo pouco
influenciada por padrões de diversidade das espécies (Salkeld et al., 2013). Assim,
primeiramente, buscamos avaliar variáveis independentes que poderiam estar a
Tese de Doutorado
59
Capítulo 1
influenciar a infecção por hantavírus em pequenos mamíferos (a infeção por hantavírus
seria a variável dependente). Para sabermos se o padrão obtido dependia da distribuição
espacial dos animais amostrados, correlacionamos os dados pelo índice de Moran (I
Moran) (Paradis et al., 2004). Em seguida, verificamos se as variáveis independentes
eram significantemente correlacionadas entre si e com a infecção por hantavírus,
testando a multicolinearidade das variáveis contínuas por correlação de Spearman.
Desta forma, para analisar se os parâmetros ecológicos poderiam estar relacionados a
prevalência de hantavírus nos pequenos mamíferos terrestres, realizamos modelagem de
regressão logística adaptada a eventos raros, na qual obtivemos os 2 melhores modelos,
com menor valor pelo critério de informação de Akaike (“Akaike’s information
criterion” - AIC) (Burnham, 2002). Estas análises foram realizadas utilizando o
programa R versão 1.13.4. pacote “Multi-Model Inference” (Barton, 2015).
5.3. Resultados
Diversidade de espécies e uso de habitat
Um total de 154 pequenos mamíferos terrestres foram capturados durante o
período de estudo. Estes pequenos mamíferos foram classificados em 9 espécies
pertencentes a quatro famílias (Didelphimorphia: Didelphidae [duas espécies];
Rodentia: Cricetidae [quatro espécies], Muridae [uma espécie], e Dasyproctidae [uma
espécie]; Tabela 2). Akodon montensis, Didelphis albiventris, Necromys lasiurus e
Oligoryzomys nigripes foram as espécies mais freqüentes e abundantes, 34,41%,
22,72%, 16,23% e 14,28%, respectivamente (Tabela 2). As demais espécies não
ultrapassaram 12% do total de animais capturados (Tabela 2). No total, o número de
fêmeas superou o de machos, exceto em 2 espécies. Os desvios da razão sexual, a partir
da proporção 1:1 (teste binomial, p > 0,05), foram significantes para todos os animais da
ordem Rodentia, com exceção do Murinae Rattus rattus (Tabela 2). Para A. montensis e
O. nigripes, o número de fêmeas superou o de machos e para N. lasiurus e Calomys
tener ocorreu o inverso. O número de mamíferos capturados por armadilha variou entre
0 e 1, perfazendo um esforço amostral total de 3.600 armadilhas-noite, com um sucesso
de captura de 21%.
A diversidade de espécies pelo índice de Shannon-Wiener (H), variou de 1,678
(± 0,806) na estação chuvosa para 1,013 (± 0,565) na estação seca. A média da
diversidade das espécies de pequenos mamíferos diferiu entre as estações do ano (t 4,5 e
p < 0,001) mostrando uma tendência para a diversidade na estação chuvosa. O cerrado e
Tese de Doutorado
60
Capítulo 1
a mata semidecídua apresentaram maior diversidade de espécies 1,148 (± 0,713) e 0,881
(± 0,491), respectivamente. A diversidade de espécies foi menor nas áreas de braquiária
[0,174 (± 0,158)], cana de açúcar [0,529 (± 0,381), e mata ciliar [0,542 (± 0,782)].
Comparando habitats com média da diversidade de espécies na mata semidecídua e no
cerrado observamos diferenças significantes pelo teste t, 3,09 (p < 0,01) para
semidecídua e 3,5 (p < 0,001) para Cerrado, com variâncias homogêneas.
Tabela 2. Número de indivíduos capturados e razão sexual por espécie. O número em
negrito indica desvio da proporção sexual de 1:1 (ni = nenhuma informação).
Ordem
Família
Espécies
N
Machos Fêmeas Razão
Dideplphis albiventris
35
10
25
0,25
Marmosops paulensis
2
1
1
0,50
Akodon montensis
53
21
32
0,39
Calomys tener
6
4
2
0,66
Necromys lasiurus
25
15
10
0,60
22
8
14
0,36
Dasyproctidae Dasyprocta azarae
10
2
8
0.20
Muridae
1
1
0
n.i.
Didelphimorphia Didelphidae
Rodentia
Cricetidae
Rattus rattus
Total
154 62
92
Dos 5 habitats estudados, N. lasiurus e A. montensis estiveram presentes em 4.
Observamos que N. lasiurus parece ter uso de habitat com frequência de 50% para áreas
de braquiária. O A. montensis mostrou-se mais versátil variando entre o Cerrado e a
mata semidecídua (Figura 2). Marmosop paulensis foi endêmico na mata semidecídua, e
o Muridae Rattus rattus na braquiária. A cana de açúcar foi um ambiente utilizado por
todos os Sigmodontinae capturados, porém O. nigripes e C. tener tiveram o uso desse
habitat superior a 50%. O marsupial D. albiventris e o roedor Dasyprocta azarae foram
mais frequentes na mata ciliar (Figura 2).
Prevalência e análise filogenética de hantavírus em roedores e marsupiais
Um total de 15 mamíferos (9,7% positivos), apresentaram anticorpos IgG contra
a proteína N recombinante (Nr) de ARQV. A soropositividade foi maior em Necromys
lasiurus, Akodon montensis, Didelphis albiventris e Oligoryzomys nigripes, como
Tese de Doutorado
61
Capítulo 1
mostra a Tabela 3. Entretanto, destes, somente foi possível amplificar o genoma viral de
2 N. Lasiurus, identificados como gsj117 e gsj120 (Tabelas 3 e 4).
Figura 2. Estimativa do uso de habitat, das espécies de pequenos mamíferos terrestres
capturados, segundo a frequência de captura.
Tabela 3. Espécies de pequenos mamíferos terrestres com anticorpos para hantavírus e
que tiveram o genoma viral paracialmente amplificado.
Espécies
No.
Animais
testados
No.
Animais
infectados
Positividade
(%)
Genoma parcial
amplificado
Necromys
lasiurus
25
5
20,00
2
Akondon
montensis
53
6
11,32
0
Didelphis
albiventris
35
3
8,57
0
Oligoryzomys
nigripes
22
1
4,54
0
Tese de Doutorado
62
Capítulo 1
Tabela 4. Percentuais de identidade em genomas parciais dos segmentos S e M de
hantavírus das 2 amostras de Necromys lasiurus (gsj117, gsj120), com os mesmos
sítios, encontrados em alguns dos principais hantavírus.
Amostras
gsj117S
gsj120S
gsj117M
gsj120M
Araraquara
85,9%
90,9%
90,6%
89,0%
Andes
71,5%
74,4%
70,8%
70,1%
Rio Mamoré
69,5%
72,0%
71,4%
70,1%
Sin Nombre
66,0%
69,7%
66,0%
65,7%
Puumala
68,0%
70,5%
66,7%
66,4%
Hantaan
60,9%
61,4%
57,2%
56,8%
Logquan
54,7%
58,3%
52,8%
54,7%
Thottapalayam
53,9%
57,9%
53,8%
53,1%
Vírus*
* Número de acesso no GenBank das sequências dos vírus utilizados: Araraquara (EF571895), Andes (
AF325966), Rio Mamoré (FJ532244), Sin Nombre (JQ690276), Puumala (GQ339483), Hantaan
(AB620031), Logquan (JX465417), Thottapalayam (JF784172).
Para as análises filogenéticas, utilizamos dados de 86 sequências com 259
nucleotídeos do segmento S (Figura 3), e 69 com 328 nucleotídeos do segmento M
(Figura 4). Excluimos desta análise sequências idênticas ou clones obtidos de hantavírus
oriundos de todos os continentes, de 1985 a 2012. Quando comparadas com a sequência
de ARQV, a distribuição de nucleotídeos idênticos em nossas 2 amostras variaram de
aproximadamente 85% para o segmento S a 90% para o segmento M (Tabela 4). As
relações filogenéticas analisadas pelos 2 segmentos demonstraram que gsj117 e gsj120
se agrupam em um mesmo ramo no clado do ARQV. Porém, o segmento S de gsj120
aparenta distância menor com um suposto ancestral comum no ramo da árvore (Figura
3). Quanto ao segmento M, o inverso foi observado (Figura 4).
Não houve correlação entre o padrão das amostras e a distribuição espacial dos
animais capturados (I Moran = 0,02; p = 0,07). Portanto, a localização das amostras não
influenciou a infecção por hantavírus. Também, avaliamos se as variáveis
independentes eram siginificativamente correlacionadas entre si. Como seria de esperar
a massa corporal e o comprimento cabeça-corpo estão correlacionadas de forma
significante e ainda, a massa corporal (r = 0,113; p = 0,53) mostrou-se mais
correlacionada com a infecção por hantavírus que o comprimento cabeça-corpo (r =
0,067; p = 0,69).
Tese de Doutorado
63
Capítulo 1
Figura 3. Relações filogenéticas entre hantavírus detectados neste estudo com base em
Máxima Verosimilhança de sequências de fragmento do gene da nucleproteína (259 nt)
e do segmento S de 86 outros hantavírus. A barra de escala indica uma divergência de
sequência de 3,0. As análises foram suportadas utilizando o teste estatístico de
bootstrap de 1000 réplicas e os valores estão indicados nos principias ramos.
Ramificações internas foram coloridas de acordo com a subfamília ou ordem de
hospedeiro. A seta vermelha indica as sequências referentes ao presente estudo. Os
rótulos dos ramos incluem o número de acesso ao GenBank e as espécies ou linhagens
virais.
Tese de Doutorado
64
Capítulo 1
Figura 4. Relações filogenéticas por Máxima Verosimilhança entre os 2 vírus
detectados neste estudo com sequências do gene Gn (328 nt) do segmento M de 69
outros hantavírus. A barra de escala indica divergência de sequência de 2,0. As análises
foram suportadas por bootstrap de 1000 réplicas e os valores estão indicados nos
principais ramos. Ramificações internas foram coloridas de acordo com a subfamília ou
ordem de hospedeiro. A seta vermelha indica as sequências referentes ao presente
estudo. Os rótulos dos ramos incluem o número de acesso ao GenBank, e as espécies ou
linhagens virais.
Parâmetros ecológicos relacionados à infecção por hantavírus em pequenos mamíferos
Para avaliar a influência da infecção por hantavírus com habitats, idade, sexo,
época de coleta (sazonalidade) e maturidade sexual dos animais utilizamos um modelo
de regressão logística para eventos raros, no pacote de modelos lineares generelizados
mistos (GLMM). Não houve diferença significativa para a idade (0,55 < p < 0,8), sexo
(p = 0,33), maturidade sexual (p = 0,62) e diversidade de espécies (0,20 < p < 0,8).
Quanto a sazonalidade, verificamos pequena correlação, os coeficientes variaram de
0,05 < p < 0,1 [mês de março (p = 0,09); mês de junho (p = 0,07)]. Porém, isso não
significou tendência sazonal para a infecção por hantavírus, uma vez que o mês de
março se encontra na estação chuvososa e o de junho, na seca. Portanto, os resultados
sugerem que estas variáveis não estariam influenciado significativamente a infecção por
hantavírus nos pequenos mamíferos terrestres.
Tese de Doutorado
65
Capítulo 1
Analisando a média dos modelos e a dos intervalos de confiança (IC),
observamos que para apenas 2 categorias de vegetação os IC não cruzam o zero,
Cerrado (p < 0,05; IC 95% -5.3043640 a -0.4840745) e mata ciliar (p < 0,01; IC 95% 6.5173561 a -1.0341294). Assim, podemos afirmar que os animais capturados nestes
locais têm probabilidade significantemente menor de se infectarem com hantavírus que
os capturados na área de braquiária (Figura 5).
Figura 5. Frequência relativa da detecção de hantavírus por ELISA nos distintos
ambientes estudados: capim braquiária (Brachiaria), mata ciliar (Ciliar), mata
semidecídua (Semidecidua), cerrado (Cerrado) e Cana de açúcar.
Por outro lado, as áreas com cana e as de mata semidecídua apresentaram
coeficientes (0,05 < p < 0,1), cujo limite superior dos IC é próximo a zero (sendo o
inferior muito negativo, bem como a média dos coeficientes). Estes dados parecem
indicar, também, que os animais capturados nestas áreas têm baixas probabilidades de
Tese de Doutorado
66
Capítulo 1
se infectarem por hantavírus (Figura 5). Resumindo, os resultados sugerem que a massa
corporal e as áreas com braquiária influenciam positivamente a infecção por hantavírus
em pequenos mamíferos terrestres.
5.4. Discussão
Necromys lasiurus, o reservatório natural do ARQV (Suzuki et al., 2004), foi o
pequeno mamífero com maior preferência pelo capim braquiária (50%) (Figura 2). N.
lasiurus habita ambientes de vegetação abertos, em sua maioria, e usa uma grande
variedade de alimentos, dependendo da época: na estação seca 72,6% de sua dieta é
composta de material vegetal, e na estação chuvosa, por um alto nível de alimento de
origem animal (Talamoni et al., 2008). Este hábito alimentar onívoro explicaria o
sucesso desta espécie em habitats modificados para a agricultura. De fato, em outros
lugares do Brasil, devido a efeitos antrópicos, a distribuição e abundância de N. lasiurus
são melhor explicadas pela disponibilidade de alimentos que pelo tipo de vegetação, ou
grau de perturbação do ecossistema (Layme et al., 2004).
Nossos dados mostram que em vegetação de Cerrado e em mata semidecídua, N.
lasiurus foi menos abundante do que Akodon montensis. A. montensis mostrou-se ser
uma espécie comum em áreas abertas de Cerrado e em ambientes antrópicos. Portanto,
esse roedor parece ser o mais versátil dos Sigmondontinae capturados em nosso estudo,
habitando 4 dos 5 habitats estudados. Por outro lado, na área de cana de açúcar houve
predominância de Oligoryzomys nigripes e Calomys tener, porém sem associação com
infecção por hantavírus.
Gheler-Costa et al., (2013) observaram que N. lasiurus e C. tener predominaram
na cana de açúcar, e que C. tener seria o mais adaptado a este ambiente. O marsupial
Marmosops paulensis mostrou-se endêmico na mata semidecídua, sugerindo um alto
grau de preservação desse habitat, pois segundo Reis et al., (2011) esse marsupial
somente habita áreas de florestas primárias ou secundárias. Nosso estudo, pioneiro no
sudeste brasileiro, evidenciou que a vegetação de Cerrado abriga a mais alta diversidade
de roedores, seguida da mata semidecídua. A diversidade de espécies apresentou
tendência sazonal, aumentando na estação chuvosa. Esse achado difere de outros
estudos analisando a influência da sazonalidade sobre diversidade dos roedores e de
outros pequenos mamíferos terrestres, que referiam aumento na estação seca (D’Andrea
et al., 2007, Luis et al., 2010).
Tese de Doutorado
67
Capítulo 1
N. lasiurus apresentou alta prevalência de soropositivos para hantavírus e
análises filogenéticas dos fragmentos genômicos virais detectados em 2 animais
mostraram tratar-se, provavelmente, do ARQV. Estes dados reforçam que N. lasiurus
seja o reservatório deste vírus (Suzuki et al., 2004). Análises filogenéticas dos ARQVs
encontrados nos 2 animais permitem especular sobre a existência de rearranjo genômico
nesta espécie viral. As análises do fragmento do segmento S mostraram uma diferença
de aproximadamente 5% para ARQV previamente conhecidos. Processos de rearranjos
naturais ocorrem preferencialmente entre vírus estreitamente relacionados, no mesmo
habitat e que sejam capazes de infectar o mesmo animal hospedeiro (Kirsanovs et al.,
2010, Plyusnina et al., 2012). Em cultura celular, rearranjo genético tem sido mostrado
para hantavírus americanos da mesma ou de diferentes espécies (McElroy et al., 2004).
Tais rearranjos podem diminuir ou aumentar a patogenicidade do vírus (Kirsanovs et
al., 2010). É evidente que mais estudos sejam necessários para verificar tal fato em
nosso trabalho.
Em nosso estudo, várias espécies apresentaram anticorpos para hantavírus, como
A. montensis, O. nigripes e o marsupial Didelphis albiventris; estes animais teriam se
infectado com hantavírus e desenvolveram resposta imune humoral. Portanto, o achado
de anticorpos não os define como reservatórios de hantavírus, nem como eventos de
spillover (Allen et al., 2009, Holsomback et al., 2009, 2013).
Em estudos anteriores, verificou-se que os roedores machos eram mais
propensos a serem soropositivos para hantavírus do que as fêmeas, o que não foi
observado em nosso estudo (Armién et al., 2009, Suzán et al., 2009). Talvez tenhamos
aqui um artefato devido ao número relativamente baixo de espécimes capturados, 154
contra 3.450 no estudo de Armién et al., (2009). Mas também, pode indicar que essa
observação prévia não seja a realidade para os nossos pequenos mamíferos terrestres,
particularmente os roedores Sigmondontinae (Armién et al., 2009). Portanto, mais
estudos detalhados no nordeste do estado de São Paulo são necessários para dissecar a
natureza complexa desses padrões de infecção, principalmente os do ARQV em N.
lasiurus.
A perda acelerada da biodiversidade diminui a viabilidade de um ecossistema
natural, com grande dano para a sociedade humana (Chan et al., 2006, Dearing et al.,
2010). Uma alta diversidade biológica pode proteger os seres humanos de doenças
zoonóticas, reduzindo o risco de doenças por patógenos oriundos de reservatórios
selvagens (Ostfeld e LoGiudice, 2003, Mills et al., 2006). Suzán et al., (2009)
Tese de Doutorado
68
Capítulo 1
observaram que, quanto menor for a diversidade de espécies de um ambiente, maior
será a taxa de transmissão de hantavírus entre animais selvagens e o risco de doença
humana. Da mesma forma, Swaddle et al., (2008) relataram que a alta diversidade de
espécies de aves selvagens diminuiu a taxa de transmissão do vírus do Nilo Ocidental
para os seres humanos.
No presente estudo, observamos que a baixa diversidade de espécies foi
associada a uma maior taxa de prevalência de hantavírus, confirmada por
soroprevalência, em roedores selvagens. Também, maior taxa de prevalência foi
relacionada com a vegetação composta por Brachiaria decumbens. Estudos anteriores,
no Panamá, mostraram que a degradação ambiental para agricultura intensiva, aumenta
a soroprevalência para hantavírus em roedores. Assim, em nosso estudo, ambientes com
capim braquiária parecem estar influenciando positivamente as infecções por hantavírus
em roedores e isso poderia representar risco de infecção humana. A prevalência de
hantavírus, em nosso estudo, mostrou-se correlacionada à massa corporal dos pequenos
mamíferos terrestres. Outros estudos demonstram que a sazonalidade influi na
prevalência de hantavírus (Luis et al., 2010, Bagamian et al., 2012). Mas não houve
indício disso em nosso estudo, embora tenha ocorrido discreta relação para os meses de
março e junho, sugerindo sazonalidade na prevalência de hantavírus em pequenos
mamíferos selvagens. Os resultados do presente estudo parecem indicar que a
combinação de degradação ambiental com fator relacionado à ecologia dos pequenos
mamíferos, possa afetar a dinâmica da infecção por hantavírus. Isto, pelo menos em
parte, pode estar sendo impulsionado indiretamente pela redução da diversidade de
espécies de pequenos mamíferos terrestres. Para finalizar, ressaltamos que, neste
trabalho, evidenciamos fatores de risco para infecção por hantavírus em espécies
oportunistas de roedores Sigmodontinae (Necromys lasiurus, Akodon montensis e
Oligoryzomys nigripes). Acreditamos que nossos resultados forneçam subsídios
relevantes para a compreensão do ciclo e da manutenção da infecção por hantavírus na
natureza. Esses resultados devem ter implicações em saúde pública e na conservação
ambiental, que é perturbada por degradação resultante da intensa atividade
agropecuária.
Tese de Doutorado
69
Capítulo 1
Referências
Allen LJS, Wesley CL, Owen RD, Goodin DG, Koch D, Jonsson CB, Chu YK,
Hutchinson JMS, Paige RL, (2009). A habitat-based model for the spread of hantavirus
between reservoir and spillover species. J Theor Biol. 260(4):510-522.
Armién AG, Armién B, Koster F, Pascale JM, Avila M, Gonzalez P et al., (2009).
Hantavirus infection and habitat associations among rodent populations in
agroecosystems of Panama: implications for human disease risk. Am J Trop Med Hyg.
81(1): 59-66.
Bagamian KH, Douglass RJ, Alvarado A, Kuenzi AJ, Amman BR, Waller LA, Mills
JN, (2012). Population Density and Seasonality Effects on Sin Nombre Virus
Transmission in North American Deermice (Peromyscus maniculatus) in Outdoor
Enclosures. PLoS One. 7(6) e37254.
Barton K (2015). MuMIn: Multi-Model Inference. R package version 1.13.4.
[http://CRAN.R-project.org/package=MuMIn].
Bonvicino CR, Oliveira JA, D’Andrea OS, (2008). Guia dos Roedores do Brasil com
Chaves para Gêneros Baseadas em Caracteres Externos.. Rio de Janeiro (RJ): Centro
Pan-Americano de Febre Aftosa – OPAS. 120p.
Burnham KP and Anderson DR, (2002). Model selection and multimodel inference: a
practical information-theoretic approach. Springer-Verlag, New York.
Chan KMA, Shaw MR, Cameron DR, Underwood EC, Daily GC, et al., (2006).
Conservation planning for ecosystem services. PLoS Biol. 4:2138-52.
Clement J, Maes P, Ranst MV, (2014). Hemorrhagic fever with renal syndrome in the
new, and hantavirus pulmonary syndrome in the old world: paradi(se)gm lost or
regained? Vir Res.187:55-8.
Tese de Doutorado
70
Capítulo 1
D’Andrea PS, Gentile R, Maroja LS, Fernandes FA, Coura R, Cerqueira R, (2007).
Small mammal populations of an agroecosystem in the Atlantic Forest domain,
southeastern Brazil. J Biol. 67(1):179-86.
Dearing DM e Dizney E, (2010). Ecology of hantavirus in a changing world. Ann NY
Acad Sci. 1195: 99-112.
Derne BT, Fearnley EJ, Lau CL, Paynter S, Weinstein P, (2011). Biodiversity and
leptospirosis risk: a case of pathogen regulation? Med Hypoth. 77(3):339-44.
De Sousa RLM, Moreli ML, Borges AA, et al., (2008). Natural host relationship and
genetic diversity of rodent associated hantaviruses in southeastern Brazil. Intervirol.
51(4):299-310.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Campos GM, Sousa RLM, (2003). Hantaviruses in São
Paulo State, Brazil. Emerg Infect Dis. 9(7):891-2.
Figueiredo LT, Moreli ML, Borges AA, Figueiredo GG, Souza RL, Aquino VH, (2008).
Expression of a hantavirus N protein and its efficacy as antigen in immune assays. Braz
J Med Biol Res. 41(7):596-9.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Sousa RLM, et al., (2009a). Distinct hantaviruses causing
pulmonary syndrome in central plateau, southeastern and southern brazil. Emerg Infect
Dis. 15(4):561-7.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Borges AA, et al., (2009b). Evaluation of an enzymelinked immunosorbent assay based on Araraquara virus recombinant nucleocapsid
protein. Am J Trop Med Hyg. 81(2):273-6.
Fonseca GAB, Mittermeier RA, Cavalcanti RB, Mittermeier CG, (2000). Brazilian
Cerrado. In: Hotspots, Earth's biologically richest and most endangered terrestrial
ecoregions. Chicago (IL): Conservation International. 159p.
Tese de Doutorado
71
Capítulo 1
Gheler-Costa C, Sabino-Santos Jr G, Amorim LS, Rosalino LM, Figueiredo LTM,
Verdade LM, (2013). The effect of pre-harvest fire on the small mammal assemblage in
sugarcane fields. Agric Eco Env. 171:85-9.
Guindon S, Dufayard JF, Lefort V, Anisimova M, Hordijk W, Gascuel O, (2010). New
algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the
performance of PhyML 3.0. Syst Biol. 59(3):307-21.
Holsomback TS, McIntyre NE, Nisbett RA, Strauss RE, Chu YK, et al., (2009). Bayou
virus detected in non-oryzomyine rodent hosts: an assessment of habitat composition,
reservoir community structure, and marsh rice rat social dynamics. J Vector Ecol. 34:921.
Holsomback TS, Van Nice C, Clark R, McIntyre NE, Abuzeineh A, Salazar-Bravo J,
(2013). Socioecology of the marsh rice rat (Oryzomys palustris) and the spatiotemporal
distribution of Bayou virus (BAYV) in Coastal Texas. Geospat Health. 7(2):289-98.
Jonsson CB, Figueiredo LT, Vapalahti O, (2010). A global perspective on hantavirus
ecology, epidemiology, and disease. Clin Microbiol Rev. 23(2):412-41.
Kallio ER, Voutilainen L, Vapalahti O et al., (2007). Endemic hantavirus infection
impairs the winter survival of its rodent host. Ecology. 88(8):1911-6.
Katoh K, Standley DM, (2013). MAFFT multiple sequence alignment software version
7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 30(4):772-80.
Kirsanovs S, Klempa B, Franke R, Lee MH, Schönrich G, Rang A, Kruger DH, (2010).
Genetic reassortment between high-virulent and low-virulent Dobrava-Belgrade virus
strains. Vir Gen. 41(3):319-28.
Klempa B, Fichet-Calvet E, Lecompte E et al., (2007). Novel hantavirus sequences in
shrew, Guinea. Emerg Infect Dis. 13(3):520-2.
Tese de Doutorado
72
Capítulo 1
Koch DE, Mohler RL, Goodin DG, (2007). Stratifying land use/land cover for spatial
analysis of disease ecology and risk: an example using object-based classification
techniques. Geospat Health. 2(1):15-28.
Layme VMG, Lima APIMA, Magnusson WE, (2004). Effects of fire, food availability
and vegetation on the distribution of the rodent Bolomys lasiurus in an Amazonian
savanna. J Trop Ecol. 20:183-7.
Luis AD, Douglass RJ, Mills JN, Bjørnstad ON, (2010). The effect of seasonality,
density and climate on the population dynamics of Montana deer mice, important
reservoir hosts for Sin Nombre hantavirus. J Ani Ecol. 79:462-70.
Luis AD, Douglass RJ, Hudson PJ, Mills JN, Bjørnstad ON, (2012). Sin Nombre
hantavirus decreases survival of male deer mice. Oecologia. 169(2):431-9.
McElroy AK1, Smith JM, Hooper JW, Schmaljohn CS, (2004). Andes virus M genome
segment is not sufficient to confer the virulence associated with Andes virus in Syrian
hamsters. Virol. 15;326(1):130-9.
Miles JW, Maass BL, do Valle CB, (1996). Brachiaria: biology, agronomy and
improvement. Campo Grande (MS):Joint publication by CIAT, Cali, Colombia and
Embrapa/CNPGC.
Mills JN, Yates TL, Childs JE et al., (1995). Guidelines for working with rodents
potentialy infected with hantavirus. J Mammal. 76(3):716-22.
Mills JN, (2006). Biodiversity loss and emerging infectious disease: An example from
the rodent-borne hemorrhagic fevers. Biodiversity. 7(1):9-17.
Moreli ML, De Sousa RLM, Figueiredo LTM, (2004). Detection of Brazilian hantavirus
by RT-PCR amplification of N gene with patients with hantavirus cardiopulmonary
syndrome. Mem Inst Oswaldo Cruz. 99(6):633-8.
Tese de Doutorado
73
Capítulo 1
Oliveira RC, Cordeiro-Santos M, Guterres A, Fernandes J, Melo AX, Guilherme A.P.
João GAP et al., (2014). Rio Mamoré Virus and Hantavirus Pulmonary Syndrome,
Brazil. Emerg Infect Dis. 20(9):1568-70.
Ostfeld RS and LoGiudice K, (2003). Community disassembly, biodiversity loss, and
the erosion of an ecosystem service. Ecology. 84:1421-27.
Ostfeld RS and Holt RD, (2004). Are predators good for your health? Evaluating
evidence for top-down regulation of zoonotic disease reservoirs. Front Ecol Environ.
2(1):13-20.
Paradis E, Claude J & Strimmer K, (2004). APE: analyses of phylogenetics and
evolution in R language. Bioinfo. 20:289-90.
Peig J and Green AJ, (2009). New perspectives for estimating body condition from
mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos 118:1883-91.
Plyusnina A, Heyman P, Baert K, Stuyck J, Cochez C, Plyusnin A, (2012). Genetic
characterization of seoul hantavirus originated from norway rats (Rattus norvegicus)
captured in Belgium. J Med Virol. 84(8):1298-303.
Posada D, (2008). jModelTest: phylogenetic model averaging. Mol Biol Evol.
25(7):1253-6.
Ratter JA, Ribeiro JF, Bridgewater S, (1997). The Brazilian cerrado vegetation and
threats to its biodiversity. Ann Bot Lond. 80:223-30.
Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA, Lima IP, (2011). Mamíferos do Brasil. UEL Bibliot
Cent. Londrina. 2 ed. 439p.
Randolph SE and Dobson DM, (2012). Pangloss revisited: a critique of the dilution
effect and the biodiversity-buffers-disease paradigm. Parasitol. 139:847-63.
Rodríguez F, Oliver JL, Marín A, Medina JR, (1990). The general stochastic model of
Tese de Doutorado
74
Capítulo 1
nucleotide substitution. J Theor Biol. 22;142(4):485-501.
Salazar-Bravo J, Pardiñas U, and D’Elía G, (2013). A phylogenetic appraisal of
Sigmodontinae (Rodentia, Cricetidae) with emphasis on phyllotine genera: systematics
and biogeography. Zool Scripta. 42(3):250-61.
Salkeld DJ, Padgett KA and Jones JH, (2013). A meta-analysis suggesting that the
relationship between biodiversity and risk of zoonotic pathogen transmission is
idiosyncratic. Ecol Let. 16:679-86.
Schönrich G, Rang A, Lütteke N, Raftery MJ, Charbonnel N, Ulrich RG, (2008).
Hantavirus-induced immunity in rodent reservoirs and humans. Immunol Rev. 225:16389.
Shannon CE, (1948). A mathematical theory of communication. T Bell System Tech J.
27:623-56.
Simpson EH, (1949). Measurement of diversity. Nature. 163:688.
Sokal RR, Robli FI, (1981). Biomeiry: the principles and practice of statistics in
biological research. San Francisco: W.H. Freeman. 859p.
Spellerberg IF and Fedor PJ, (2003). A tribute to Claude Shannon (1916–2001) and a
plea for more rigorous use of species richness, species diversity and the ‘Shannon–
Wiener’ Index. Global Ecol Biog 12:177-79.
Sumibcay L, Kadjo B, Gu SH, et al., (2012). Divergent lineage of a novel hantavirus in
the banana pipistrelle (Neoromicia nanus) in Côte d’Ivoire. Virol J. 9:34.
Suzán G, Marce E, Giermakowski T, et al., (2009). Experimental evidence for reduced
rodent diversity causing increased hantavirus prevalence. PLoS One. 4(5): e5461.
Suzuki A, Bisordi I, Levis S, Garcia J, Pereira LE, Souza RP et al., (2004). Identifying
rodent hantavirus reservoirs, Brazil. Emerg Infect Dis. 10(12): 2127-34.
Tese de Doutorado
75
Capítulo 1
Swaddle JP, and Calos SE, (2008). Increased avian diversity is associated with lower
incidence of human West Nile infection: observation of the dilution effect. PLoS One.
3(6): e2488.
Talamoni SA, Motta-Junior CJ, Dias MM, (2000). Fauna de mamíferos da Estação
Ecológica de Jataí e da Estação Experimental de Luiz Antônio. In: Santos JE, Pires JSR.
Est Eco Jat. v1 São Carlos: Rima Editora. 345p. Portuguese.
Talamoni SA, Couto D, Cordeiro DA, Diniz FM, (2008). Diet of some species of
Neotropical small mammals, Mammal Biol. 73:337-41.
Wilson K and Hardy ICW (2002). Statistical analysis of sex ratios: an introduction. In:
Hardy ICW, Sex ratios: concepts and research methods. Cambridge: Cambridge
University Press. 92p.
Xia X and Xie Z (2001). DAMBE: software package for data analysis in molecular
biology and evolution. J Hered. 92(4):371-3.
Zar JH (1999). Biostatistical analysis. New Jersey: Prentice Hall. 663p.
Tese de Doutorado
76
_________________________________________________________________________
6. Capítulo 2: Ecologia de hantavírus em morcegos
Neotropicais
Capítulo 2
Ecologia de hantavírus em morcegos Neotropicais
Resumo: Os hantavírus são vírus zoonóticos de roedores-reservatórios que podem
causar graves doenças em humanos. Novas espécies de hantavírus foram recentemente
identificadas em morcegos e musaranhos, ampliando, assim, o potencial de
reservatórios e variedade desses vírus. Visando elucidar se os morcegos no sudeste do
Brasil podem ser reservatórios de hantavírus, foram capturados 275 morcegos, entre
fevereiro de 2012 a abril de 2014, em distintos habitats, e avaliadas características
ecológicas procurando asssociá-las à infecção por hantavírus. Dos morcegos capturados,
houve predominância da família Phyllostomidae. Morcegos desta família apresentaram
anticorpos IgG contra a proteína N do hantavírus Araraquara (ARQV), com uma
soroprevalência de 17%. Foi possível amplificar parcialmente o genoma do segmento S
de um espécime de cada uma das seguintes espécies: Carollia perspicillata e Desmodus
rotundus. As sequências nucleotídicas obtidas mostraram alta similaridade com o
hantavírus ARQV. Foi observado que áreas com baixa diversidade de espécies e alta
dominância de espécies (sobreposição de abundância de espécies de morcegos) parecem
estar influenciando a infecção por hantavírus em morcegos. A mata ciliar apresentou
maior taxa de infecção quando comparado com áreas de Cerrado e Mata semidecídua,
onde a diversidade de espécies foi maior. Diante disso, relatamos aqui, pela primeira
vez, nas Americas, fatores de risco para infecção de hantavírus em morcegos e
fornecemos fortes evidências que eles podem estar desenvolvendo um papel como
reservatórios de vírus letais aos seres humanos.
Palavras-chaves: Infecção por hantavírus, morcegos, diversidade de espécies.
Abstract: Hantaviruses are zoonotic viruses harbored by rodents that can cause severe
diseases in humans. New species of hantaviruses have been recently identified in bats
and shrews expanding the potential reservoirs and range of these viruses. To elucidate if
bats in southeastern Brazil harbor hantaviruses, 275 bats were captured from February
2012 to April 2014, in distinct habitats. From the captured bats there was a
predominance of Phyllostomidae family. Bats from this family had IgG antibodies
against the N protein of Araraquara hantavirus (ARQV) with an overall seroprevalence
of 17%. It was possible to amplify partial genome from segment S of the following
species: Carollia perspicillata and Desmodus rotundus. The nucleotide sequences
Tese de Doutorado
78
Capítulo 2
obtained showed high similarity with ARQV. There was observed some ecological
patterns regarded to hantavirus infection among bats. Areas with low species diversity
and high dominance of species (overlapping of bats species abundance) seem to be
influencing infection among bats. Riparian vegetation has shown a high infection ratio
when compared to Cerrado and Semideciduous forest, where diversity of species was
higher. Therefore, here we report for the first time in the Americas, some risk factors for
hantavirus infection among bats, and we provide strong evidences that bats may be
playing a role of hantavirus reservoir and harboring lethal hantaviruses to humans.
Key-words: Hantavirus infection, bats, species diversity.
6.1. Introdução
Hantavírus (família Bunyaviridae) são transmitidos a partir de roedores-reservatório
para os seres humanos, causando doenças fatais (Weiss et al., 2012). Os morcegos
(ordem Chiroptera) são conhecidos por abrigarem uma grande diversidade de patógenos
emergentes. A sua capacidade de voar e comportamento social favorecem a
manutenção, evolução e disseminação desses patógenos (Sumibcay et al., 2012, Weiss
et al., 2012). Kim et al. (1994) descreveram um isolamento de hantavírus em tecidos
pulmonares de morcegos. Entretanto, os hantavírus detectados e caracterizados, até
2006, parecem estar relacionados a pequenos roedores e, por isso, acreditava-se que os
hantavírus teriam evoluído juntamente com seus roedores-reservatório, ao longo de
milhões de anos (Bennett et al., 2014, Plyusnin e Morzunov, 2001). No entanto,
recentemente, novas espécies de hantavírus foram identificadas em morcegos na África
e Ásia (Gu et al., 2014, Sumibcay et al., 2012, Weiss et al., 2012). Guo et al. (2013)
sugeriram que os hantavírus tenham se originado principalmente em morcegos e então
dispersos entre outros mamíferos reservatórios. Porém, devido à história evolutiva dos
morcegos, é mais provável que insetívoros (musaranhos e toupeiras) tenham sido os
reservatórios originais e, a partir destes, o vírus tenha se espalhado para morcegos e
roedores (Bennett et al., 2014, Plyusnin e Sironnen, 2014, Yanagihara et al., 2014,
Sabino-Santos Jr et al., 2015). Portanto, a presença de novos hantavírus em pequenos
mamíferos não roedores desafia o paradigma de que os hantavírus evoluíram com seus
roedores e sugere que possam ter um amplo espectro de reservatórios naturais.
Quanto à infecção por hantavírus em pequenos roedores selvagens, a diversidade de
espécies parece influenciar na infeção desses animais. Dados obtidos no Paraguai e
Tese de Doutorado
79
Capítulo 2
Panamá sugerem que, para a região Neotropical, a degradação nos ecossistemas esteja
associada a um risco aumentado de infecção por hantavírus em roedores e seres
humanos (Koch et al., 2007, Suzán et al., 2009). Porém, a participação dos morcegos na
manutenção dos hantavírus também precisa ser considerada com base em evidências de
que estes poderiam ser novos reservatórios de hantavírus (Yanagihara et al., 2014).
Neste sentido, pouco ou quase nada se conhece da ecologia de hantavírus nesses
animais.
Diante disso, visando elucidar se morcegos realmente podem estar infectados por
hantavírus no Brasil e consequentemente terem papel como potenciais reservatórios,
realizamos este trabalho buscando: (i) testar sorologicamente os morcegos para
hantavírus utilizando como antígeno a proteína recombinante (Nr) do hantavírus
Araraquara (ARQV), (ii) identificar e caracterizar por sequenciamento nucleotídico as
espécies de hantavírus circulantes nos morcegos e (ii) determinar padrões ecológicos
que influenciariam a infecção por hantavírus entre os morcegos Neotropicais.
Área de estudo e metodologia de captura
Os morcegos foram capturados em cinco locais ecologicamente distintos na
região nordeste do estado de São Paulo (sítios 1 a 3) e na região norte do estado de
Minas Gerais (sítios 4 e 5), sudeste do Brasil (Figura 1). Sítio 1, Estação Ecológica de
Jataí (EEJ): está localizado na cidade de Luis Antônio-SP e abrange uma área de
9.010,70 ha, sendo atualmente a maior área contínua protegida de Cerrado (um bioma
tipicamente brasileiro) no estado de São Paulo. A Estação de Jataí também contém
pequenos enclaves de mata semidecidual. Sítio 2: localizado na cidade de Cajuru-SP,
com a maior parte da vegetação original (Cerrado) convertida em monoculturas e
também apresentando manchas de matas ciliares. Sítio 3: localizado na cidade de
Batatais-SP, caracterizado por grandes plantações de cana-de-açúcar rodeando pequenas
manchas de Cerrado, matas ciliares e florestas secundárias. Sítio 4: localizado no Parque
Ecológico de Sapucaia (PES) que, com 37,66 ha de área, possui topografia cárstica.
Sítio 5: localizado no Parque Ecológico Lapa Grande (PELG) que com 9.600 ha de área,
possui uma alta concentração de cavernas e abrigos. Os sítios 4 e 5 estão localizados no
município de Montes Claros-MG e abrigam uma vegetação predominante de Cerrado,
com manchas de floresta estacional decidual (mata seca) e trechos de transição para
Tese de Doutorado
80
Capítulo 2
Caatinga (um bioma desértico brasileiro). As campanhas de campo foram conduzidas de
fevereiro de 2012 a abril de 2014. Os locais foram visitados duas vezes: uma na estação
seca (abril a setembro) e outra no período chuvoso (outubro a março).
Utilizaram-se 12 redes de neblina (modelo 716 / 12P, 12 x 2,5 m; denier 75/2,
malha de 16 x 16 mm; Ecotone Inc., Polonia) nos sítios 1, 2 e 3, e 6 redes de neblina
nos sítios 4 e 5. Em geral, as redes eram abertas a no mínimo três metros de altura em
trilhas, logo após o pôr do sol (por volta das 18 horas) e fechadas por volta da meia
noite, nas áreas amostradas. Isto ocorria por 3 noites consecutivas nos sítios 1 a 3, e por
1 noite nos sítios 5 e 6 (Esberard et al., 2005, Martins et al., 2006). Este projeto de
pesquisa, incluindo procedimentos e protocolos, está de acordo com as leis de proteção
da vida selvagem e foi previamente aprovado pelo Instituto Chico Mendes de
Conservação da Biodiversidade (Ministério do Meio Ambiente), conforme os
protocolos 19838-1 e 41709-3. O projeto foi aprovado pelos Comitês de Ética em
Pesquisa Animal da Universidade de São Paulo e da Universidade Federal de Minas
Gerais (protocolos 020/2011 e 333/2013).
Figura 1. Áreas de estudo nos estados de São Paulo e Minas Gerais, sudeste do Brasil.
O mapa mostra os municípios onde os morcegos foram capturados.
Tese de Doutorado
81
Capítulo 2
Os morcegos capturados foram identificados segundo Gardner (2007) e Reis et
al. (2013). Quando necessário, a identificação de espécie foi realizada segundo dados
moleculares (com base em fragmento de gene do citocromo-b), conforme protocolos
padronizados por Salazar-Bravo et al. (2013). A espécie de cada um dos espécimes
soropositivos para hantavírus foi confirmada por análise de sequência do gene
citocromo-b. Os animais soronegativos foram identificados apenas morfologicamente.
Todos os morcegos foram manipulados e amostrados de acordo com Sikes et al. (2011).
Os animais tiveram o sexo identificado de acordo com a morfologia da genitália e as
idades, estimadas pelo estado de ossificação das epífises, o que permitiu dividí-los em
três classes de desenvolvimento (juvenis, sub-adultos e adultos) (Figura 2) (Hutson e
Pacey, 2004).
Figura 2. Ilustração mostrando a aparência do antebraço de um morcego, sendo: A.
juvenil, B. sub-adulto, e C. adulto (modificado de Hutson e Pacey, 2004).
Determinação das características ecológicas
O índice de diversidade é uma medida quantitativa que reflete quantos tipos
diferentes (tais como as espécies) existem em um conjunto de dados e,
simultaneamente, leva em conta a forma como as entidades básicas (como os
indivíduos) são distribuídas entre os tipos (Simpson, 1949). Desta forma, os índices de
diversidade foram gerados para as áreas amostradas, para podermos compará-las entre
sí. Para tanto, utilizamos os índices de: Shannon-Wiener (H), Abundância, Dominância
de Simpson, Equitabilidade de Gibson e o estimador de Riqueza total Chao 1
(Magurran, 2004). Shannon-Wiener é uma relação entre o número de espécies (riqueza)
e o número de indivíduos (abundância) (Spellerberg e Fedor, 2003). A Equitabilidade
Tese de Doutorado
82
Capítulo 2
leva em consideração o quão bem distribuídas estão as abundâncias para cada amostra.
Uma equitabilidade alta significa que todas as espécies têm abundâncias parecidas em
uma determinada área. A dominância indica o quanto uma ou poucas espécies estariam
sobrepujando as outras, em abundância, em uma dada área. Chao 1 estima a quantidade
total de espécies estimadas para uma área, baseada em quantas espécies foram
amostradas somente uma vez (“singletons”) (Mangurran, 2004). Por fim, a razão sexual
foi estimada como o quociente entre o número de machos pelo número total de machos
e fêmeas para cada espécie, sendo que os desvios da proporção sexual de 1:1 foram
testados utilizando o teste binomial (Wilson e Hardy, 2002). As variáveis ecológicas
independentes foram: estação (seca e chuvosa), área, tipo de vegetação (habitat),
maturidade sexual, idade, município e diversidade de espécies.
Diagnóstico da infecção por hantavírus
Nos morcegos anestesiados, o sangue foi coletado por punção cardíaca. Em
seguida os animais foram sacrificados por aprofundamento da anestesia e tiveram seus
órgãos (coração, pulmões, baço, rins, fígado, e duodeno) coletados em meio de
congelamento viral visando o posterior isolamento viral. Amostras de fezes e suabe de
saliva foram coletados de todos os morcegos capturados. Amostras de urina foram
coletadas sempre que presentes. Todas as amostras foram imediatamente colocadas em
criotubos, devidademente identificados e armazenadas em nitrogênio líquido. Amostras
de intestinos (exceto duodeno) foram colocadas em tubos contendo paraformaldeído a
4% e livre de nucleases para posterior análise por imunohistoquímica.
Para a detecção dos morcegos infectados com hantavírus, fez-se triagem por
ensaio imunoenzimático (ELISA). As amostras de sangue foram diluídas a 1:100. Como
antígeno do ELISA, utilizou-se uma proteína recombinante do nucleocapsídeo de
ARQV produzida em nosso laboratório (Centro de Pesquisa em Virologia-FMRP-USP).
Como anticorpo secundário, utilizou-se o anti-Bat (Bethyl Laboratories, Inc., EUA),
específico para porção Fc de anticorpo IgG de morcegos da ordem Microchiroptera
conjugado a peroxidase. Este ELISA quando aplicado para detectação de anticorpos de
roedores mostrou sensibilidade de 97,2%, especificidade de 100%, valor preditivo
positivo de 100% e valor preditivo negativo de 98,1%, quando comparado ao método
padrão (Figueiredo et al., 2008, 2009). A prevalência de positivos para hantavírus foi
calculada dividindo o número de animais soropositivos ao número total de animais
analisados, por espécie.
Tese de Doutorado
83
Capítulo 2
Os animais soropositivos tiveram RNA extraído do plasma com o QIAamp Viral
RNA Mini Kit (Qiagen, Inc., Alemanha), segundo instruções do fabricante. Após
quantificação do RNA nos extratos com o espectrofotômetro NanoDrop ND1000
(EUA), estes foram submetidos a RT-PCR. A transcrição reversa (RT) foi realizada
utilizando o High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Inc.,
EUA), segundo instruções do fabricante. A PCR foi feita de acordo com Moreli et al.
(2004). Os produtos da PCR foram purificados com o kit ExoSap-IT (Affimetrix, Inc.,
EUA), e, em seguida, utilizados para sequenciamento nucleotídico e análise
filogenética.
Análises filogenéticas dos hantavírus detectados
Nestas análises, utilizou-se uma base de dados contendo todas as sequências
nucleotídicas completas dos segmentos S e M de hantavírus disponíveis no “GenBank
do National Center for Biotechnology Information” (NCBI) até 23 de Março de 2015.
As sequências nucleotídicas dos segmentos S e M foram alinhadas individualmente com
as dos vírus detectados nos morcegos com o programa MAFFT v7.158b (Katoh &
Standley, 2013). Posteriormente, selecionou-se com o programa Geneious v.8.0.1 a
região amplificada pelos primers do segmento S (nucleotídios de 213 a 477, sequência
protótipo ARQV GenBank: EF571895) e com estes fragmentos fizeram-se novos
alinhamentos, que foram analisados com o programa DAMBE 5.2.6, excluindo-se as
sequências idênticas (Xia & Xie, 2001). Em continuação, as sequências alinhadas foram
submetidas ao programa jModelTest para identificar o melhor modelo de substituição
de nucleotídeos para a construção de árvores filogenéticas (Posada, 2008). O critério
utilizado para nossas análises filogenéticas foi o aLRT e o melhor modelo de
substituição de nucleotídeos foi o GTR+G +I (General Time Reversible), com correção
pela taxa de distribuição gamma (γ) mais invariante (I) (Rodríguez et al., 1990). As
construções filogenéticas utilizadas basearam-se em método probabilístico de máxima
verossimilhança (maximum likelihood). Este método estima a verossimilhança de um
conjunto de dados representando um processo evolutivo supostamente ocorrido. Assim,
utilizou-se modelo que considera taxas baseadas nos 3 possíveis tipos de substituições
entre os nucleotídeos, utilizando o programa PhyML 3.0, apoiado por “bootstrap”
(percentual de vezes em que o grupamento original foi recuperado nas árvores-réplicas)
(Guindon et al., 2010). Analisaram-se percentuais de sítios idênticos nos conjuntos de
dados utilizando o programa Geneious v.8.0.1.
Tese de Doutorado
84
Capítulo 2
Influência da prevalência de hantavírus
Utilizaram-se índices de diversidade de espécies infectadas por hantavírus nos
habitats (variável tipo dummy) e pesquisou-se uma associação entre infecção por
hantavírus e idade, bem como o estado reprodutivo dos indivíduos testados. As análises
foram realizadas por seleção de modelos com múltiplas hipóteses concorrentes, baseada
na Teoria da Informação de Akaike (AICc) (Burnham e Anderson, 2002), e estimativas
de máxima verossimilhança restrita para o limitado número de amostras. Utilizou-se
peso de evidência (wAIC) para avaliar a plausibilidade de cada modelo e para testar o
poder de inferência das análises, concorrendo com um modelo nulo incluindo uma
variável preditora aleatória. O peso de evidência varia de zero a um, que corresponde ao
modelo mais plausível. Utilizaram-se nestas análises o programa R (R Development
Core team 2014) e os pacotes bbmle (Bolker, 2014) e vegan. Os modelos utilizados
foram lineares generalizados (GLM), com distribuição de probabilidade binomial do
tipo logit. As informações sobre tipos de vegetação e área de fragmentos foram retiradas
dos planos de manejo dos parques amostrados e de Muylaert et al. (2015).
6.3. Resultados
Diversidade e distribuição de espécies
Um total de 275 morcegos foram capturados, durante o período de estudo, a
partir de um esforço amostral de 56.160 m2h. Estes morcegos foram identificados em 23
espécies pertencentes a três famílias (Molossidae [2 espécies], Phyllostomidae [19
espécies], Vespertiollionidae [2 espécies]; Tabela 1). A espécie de morcego mais
capturada foi a Carollia perspicillata, seguida por Artibeus lituratus e A. planirostris
(ver Tabela 1). Das 23 espécies capturadas, 10 foram capturadas apenas uma vez
(singletons). Observou-se que o número total de machos sobrepôs o de fêmeas, embora
sem significado estatístico. Os desvios da razão sexual analisados por teste binomial (p
> 0,05), não mostraram-se significativos para nenhuma das espécies capturadas (Tabela
1). Os animais capturados eram, na maioria, adultos (Tabela 2). A área amostrada com
maior riqueza de espécies, na estação seca, foi a de Montes Claros, seguida por Cajuru,
Luis Antônio e Batatais. Na estação chuvosa, o padrão foi similar, tendo sido
amostradas mais espécies em Montes Claros. Luis Antônio e Batatais exibiram maior
dominância e menor diversidade de espécies (Tabela 3).
Tese de Doutorado
85
Capítulo 2
Tabela 1. Número e razão sexual por espécie de morcegos capturados.
Família
Espécie
N
Machos
Fêmeas
Razão sexual
Molossidae
Molossops neglectus
1
1
0
--
M. temminckii
2
1
1
0,5
Anoura caudifer
2
1
1
0,5
A. geoffroyi
4
3
1
0,75
Artibeus fimbriatus
2
1
1
0,5
A. obscuros
2
2
0
--
A. lituratus
43
22
21
0,51
A. planirostris
43
17
26
0,40
Carollia benkeithi
1
1
0
--
C. perspicillata
57
31
26
0,54
Chrotopterus auritus
1
0
1
--
Chiroderma villosum
1
0
1
--
Desmodus rotundus
11
10
1
0,9
Glossophaga soricina
25
11
14
0,44
Lasiurus blossevillii
1
0
1
--
L. ega
1
1
0
--
Loncophylla spp
1
0
1
--
Micronycteris minuta
1
0
1
--
Phyllostomus hastatus
1
1
0
--
Platyrrhinus lineatus
25
11
14
0,44
Sturnira lilium
33
17
16
0,52
Myotis albescens
1
0
1
--
M. nigricans
16
7
9
0,44
275
138
137
0,50
Phyllostomidae
Vespertillionidae
Total
Tese de Doutorado
86
Capítulo 2
Tabela 2. Distribuição da idade em morcegos por sítio e por condição (totais e
infectados).
Idade/Cidade
Luis Antônio
Batatais
Cajuru
Montes
Condição
Adulto
56
14
32
99
Total
Sub-adulto
7
1
1
43
Juvenil
3
0
1
17
Adulto
1
2
0
3
Sub-adulto
1
1
0
1
Juvenil
0
0
0
0
Infectados
Tabela 3. Índices da diversidade de espécies de morcegos por cidade em diferentes
estações do ano.
Cidade
Luis Antônio
Batatais
Cajuru
Montes
Índice
Chuvosa
Seca
Chuvosa
Seca
Chuvosa
Seca
Chuvosa
Seca
Riqueza
5
6
6
0
9
5
10
14
Abundância
39
27
15
0
28
6
39
121
Dominância
0,3675
0,3635 0,2356
0
0,148
0,2222 0,2018
0,1675
Diversidade de Simpson
0,6325
0,6365 0,7644
0
0,852
0,7778 0,7982
0,8325
Shannon-Wiener (H)
1,213
1,32
0
2,032
1,561
2,056
1,582
1,855
Equitabilidade de Gibson 0,6726
0,6238 0,8109
0
0,8476
0,9524 0,6392
0,558
Chao-1
6,5
0
9,333
8
15,5
5
9
15
Considerando a abundância de morcegos em cada habitat comparado ao
tamanho dos fragmentos amostrados, identificaram-se 2 eixos principais que explicam a
variação na presença e quantidade das espécies de morcegos (Figura 3). Como as áreas
de Cerrado e Mata semidecídua apresentaram os maiores valores de vegetação,
consideramos no eixo 1 da PCA (análises de componentes principais) (eixo x) como a
quantidade de vegetação e, no eixo 2, a estrutura da vegetação (que influenciou menos
na distribuição das espécies menos abundantes).
Tese de Doutorado
87
Capítulo 2
Figura 3. Distribuição das espécies de morcegos em diferentes tipos de habitats através
da análise de componentes principais. Os números nos eixos são resultados das análises
de variânica-covariância. O eixo x representa a variação em quantidade florestal nas
diferentes áreas, enquanto o eixo y a variação na estrutura florestal. A linha verde indica
a contribuição do tipo de vegetação dos diferentes habitats na variação da presença e
abundância das espécies de morcego. Nota-se a diferença na composição de espécies
influenciadas por Floresta Semidecídua e áreas degradadas.
Prevalência e análise filogenética dos hantavírus detectados
Dos 275 morcegos capturados, 53 foram eutanasiados e tiveram o sangue
coletado. Destes 53, 9 (17% de positividade) apresentaram anticorpos IgG contra a
proteína N recombinante (Nr) de ARQV. Os morcegos soropositivos pertenciam a 7
espécies da família Phyllostomidae, sendo que o maior número de positivos ocorreu no
morcego vampiro Desmodus rotundus. Porém, o carnívoro Chrotopterus auritus, e o
frugívoro Chiroderma villosum tiveram somente 1 espécime testado e este, em ambas as
espécies, mostrou-se soropositivo (Tabela 4). Entretanto, foi possível amplificar
genoma de hantavírus em somente 2 espécimes, um da espécie Carollia perspicillata
(gsj 169) e outro da espécie Desmodus rotundus (gsj 174) (Tabelas 4 e 5), ambos
Tese de Doutorado
88
Capítulo 2
capturados na zona rural do município de Batatais e em vegetação de mata ciliar
margeando monoculturas de capim braquiária.
Tabela 4. Espécies que apresentaram anticorpos IgG contra a proteína Nr ARQV e
tiveram genoma viral parcialmente amplificado. Distribuídos pelo sexo e sua principal
dieta.
Espécies
Testados/Positivos
Machos Fêmeas Dieta
RNA viral
Artibeus lituratus
6/1
1
0
Frugívoro
0
Artibeus obscurus
2/1
1
0
Frugívoro
0
Artibeus planirostris
3/1
1
0
Frugívoro
0
Carollia perspicillata
10/1
1
0
Frugívoro
1
Chiroderma villosum
1/1
0
1
Frugívoro
0
1/1
0
1
Carnívoro
0
Desmodus rotundus
5/3
3
0
Sanguinívoro 1
Tabela 5. Variação dos sítios nucleotídicos idênticos em sequência parcial do segmento
S nos vírus obtidos de Carollia perspicillata, comparado com as dos principais
hantavírus.
Amostra
Vírus*
gsj169S
Araraquara
90,7%
Andes
74,7%
Rio Mamoré
72,0%
Sin Nombre
70,0%
Puumala
69,6%
Hantaan
60,3%
Logquan
58,4%
Thottapalayam
56,4%
* Número de acesso no “GenBank” das sequências dos vírus utilizados: Araraquara (EF571895), Andes (
AF325966), Rio Mamoré (FJ532244), Sin Nombre (JQ690276), Puumala (GQ339483), Hantaan
(AB620031), Logquan (JX465417), Thottapalayam (JF784172).
Tese de Doutorado
89
Capítulo 2
Para as análises filogenéticas, utilizaram-se 86 sequências com 259 nucleotídeos
para o segmento S oriundas de hantavírus descritos de 1985 a 2012, excluídas
sequências idênticas ou clones (Figura 4). Quando as amostras de morcegos foram
comparadas ao ARQV observou-se aproximadamente 91% de identidade de
nucleotídeos (Tabela 5). Na árvore filogenética, gsj 169 agrupou-se no clado do ARQV,
curiosamente, com sequências oriundas de Sigmondontinae (Figura 4). Quanto a gsj
174, sua sequência foi agrupada às do GeneBank, mostrando uma identidade superior a
90% com a do ARQV.
Figura 4. Árvore filogenética por Máxima Verosimilhança, gerada a partir de
comparações das sequências do gene da nucleproteína (259 nt) incluindo 84 sequências
do segmento S de hantavírus e 1 dos vírus detectados nos morcegos. A escala indica
divergências de sequências nucleotídicas em 2,0. As análises foram suportadas por
bootstrap de 1000 réplicas e seus valores estão indicados nos principias ramos.
Ramificações internas foram coloridas segundo a subfamília ou ordem do hospedeiro. A
seta vermelha indica a sequência referente ao presente estudo. Os rótulos contêm
número de acesso ao GenBank, e as espécies ou linhagens virais.
Tese de Doutorado
90
Capítulo 2
Influência da prevalência de hantavírus em morcegos
Dentre os morcegos infectados por hantavírus, nenhum era juvenil (Tabela 2). O
número de machos infectados foi maior que o de fêmeas, porém sem significância
(Tabela 4). A distribuição de infectados por habitat (Tabela 6) mostrou que o maior
número de testados foi o de animais capturados no Cerrado e o menor número na mata
ciliar. Entretanto, o local que apresentou proporcionalmente mais indivíduos infectados
foi a mata ciliar (33% do total de indivíduos infectados). Em áreas de mata secundária
degradada nenhum morcego, dentre 8 testados, mostrou-se infectado.
A distribuição de morcegos infectados se mostra homogênea entre os habitats,
com exceção da área degradada (Tabela 6).
Tabela 6. Percentual de morcegos capturados e infectados por hantavírus (entre
parênteses) nos diferentes habitats amostrados.
Tipo de Vegetação Cerrado
Mata Ciliar Decídua*
Degradado** Semidecídua†
Não-infectados
32,26 (10)
9,68 (3)
9,68 (3)
25,81 (8)
22,58 (7)
Infectados
22,22 (2)
33,33 (3)
22,22 (2)
0 (0)
22,22 (2)
Total
30 (12)
15 (6)
12,50 (5)
20 (8)
22,50 (9)
*Mata Seca; **Cerrado degradado, antropizado; †Mata semidecídua
Com relação aos modelos concorrentes, observou-se que quanto maior a
dominância, encontraram-se mais indivíduos positivos para hantavírus, embora
variando com o tipo de vegetação. Dentre os locais de captura, matas ciliares obtiveram
maior número de morcegos positivos, sendo que áreas com riqueza e diversidade baixas
também tenderam a apresentar maior número de infectados (Tabela 7). Entretanto, os
modelos pouco explicaram, como pode-se observar pelo peso de evidência (0,18 para
diversidade e 0,14 para dominância), corroborando maior incidência de infecção em
áreas de maior dominância (Figura 5).
Tese de Doutorado
91
Capítulo 2
Tabela 7. Lista de modelos explicando a variação nos resultados de positividade para
hantavirus. Modelos plausíveis em itálico e, em negrito, os melhores modelos.
Modelo Linear Generalizado
Infecção~Shannon
dAI
Cc
Graus de
liberdade
Peso de
evidência (waic)
0
2
0,1837
Infecção~Dominância
Infecção~Área de vegetação+Tipo de
vegetação
0,5
2
0,1427
0,8
6
0,122
Infecção~Área de vegetação
0,8
2
0,1209
Infecção~Equitabilidade
0,9
2
0,1168
1
2
0,1123
Infecção~Tipo de Vegetação
1,2
5
0,1002
Infecção~Idade
Infecção~Dominância e Área de
vegetação
2,5
3
0,0525
2,8
3
0,0455
9
6
0,0021
11
11
<0,001
12
12
<0,001
26,3
16
<0,001
Modelo Nulo
Infecção~Condição Reprodutiva
Infecção~Condição Reprodutiva e
Tipo de Vegetação
Infecção~Espécie
Infecção~Condição Reprodutiva e
Riqueza
Distrib.*
Diagnóstico
Plausível
Binomial
(logit)
Não
plausível
*Distribuição
Figura 5. Positividade para hantavirus nos morcegos em função das variáveis mais
plausíveis. (A) Diversidade de espécies por Shannon-Wiener, (B) Dominância, (C)
Percentagem de floresta.
Tese de Doutorado
92
Capítulo 2
6.4. Discussão
Os indícios aqui obtidos nos permitiram reconhecer, nas áreas amostradas, que
hantavírus estão a infectar e provavelmente, a utilizar os morcegos como possíveis
reservatórios naturais. Observamos, também, que a diversidade de espécies, a
dominância e o tipo de habitat estão influenciando essa infecção nos morcegos
neotropicais.
Alterações antrópicas no uso da terra ameaçam a biodiversidade e o
funcionamento dos ecossistemas (Meyer et al., 2008). A conversão de habitats naturais
em áreas modificadas pelo homem, por agricultura intensiva ou moderna, conduzem à
fragmentação do habitat criando paisagens em mosaico que, muitas vezes, levam a
consequências drásticas para a fauna associada (Ripperger et al., 2015). Pudemos
verificar que a diversidade e distribuição das espécies de morcegos capturadas foram
maiores em habitats com vegetações nativas de Cerrado e mata semidecídua (Figura 3).
Dos locais amostrados, Montes Claros, com maior área de vegetação nativa
(Cerrado e machas de mata decídua), mostrou maior diversidade de espécies tanto na
estação seca como na chuvosa. Medellin et al. (2000) demonstraram que a diversidade
de morcegos phillostomideos é drasticamente reduzida em ambientes onde a vegetação
nativa de Floresta Tropical Úmida foi convertida em plantações de algodão. Foi visto
que esses morcegos, embora sejam grandes dispersores de sementes em habitats
antropizados para agricultura, dependem fortemente de fragmentos naturais para
sobreviverem (Ripperger et al., 2015). Em nosso estudo, observamos que em áreas onde
a vegetação nativa de Cerrado foi degradada, a diversidade e distribuição de espécies
mostrou-se polarizada negativamente, corroborando o estudo prévio. Isto foi observado
por Hale et al. (2012), que verificou a urbanização como fator de impacto negativo para
a atividade dos morcegos. Os morcegos da família Phyllostomidae foram os mais
abundantes em nosso estudo. Destes, Carollia perspicillata foi o mais abundante. Tratase de morcego com hábito frugívoro, mas que pode se alimentar de pequenos insetos
(Reis et al., 2007) e possui pico de atividade cerca de 2 horas após o por do sol (Aguiar
e Marinho-Filho, 2004). Em estudo realizado no sudeste do Brasil, C. perspicillata foi
também a espécie mais abundante (Aguiar e Marinho-Filho, 2004). Em nosso estudo,
não observamos diferença entre número de machos e fêmeas, embora, o número total de
machos tenha sido maior. Porém, quando comparamos 5 espécies de phillostomideos
mais abundantes encontramos padrão distinto pois Artibeus lituratus, A. planirostris,
Tese de Doutorado
93
Capítulo 2
Platyrrhinus lineatus, e Sturnira lilium, frugívoros da subfamília Sternodermatinae,
tiveram número de fêmeas capturadas maior, embora sem significância. Portanto, entre
as espécies capturadas, a razão sexual tendeu a zero. Isso, somado à distribuição (Figura
3), pode indicar que as espécies menos abundantes, talvez, tenham sido capturadas no
limite de seu nicho ecológico. Por isso, na Figura 3, não foi possível determinar a
distribuição exata dos morcegos nos diferentes habitats. Trata-se de uma diferença com
relação às espécies mais abundantes, que podem ter sido capturadas no centro de seu
nicho ecológico, como verificado para Carollia perspicillata e Sturnira lilium, em
Cerrado e mata semidecídua, respectivamente (Brown, 1984, Parmesan et al., 2005). No
tocante à idade dos morcegos, observamos número maior de adultos e sub-adultos que
de juvenis, o que já era esperado, uma vez que muitos morcegos juvenis são
dependentes maternalmente e não possuem completa autonomia (Reis et al., 2007).
Vírus originários de morcegos podem tornar-se zoonoses emergentes
transmitidas destes para animais domésticos e para seres humanos (Plowright et al.,
2014, Brook e Dobson, 2015). Os morcegos são a segunda ordem de mamíferos
considerados reservatórios de viroses zoonóticas, perdendo apenas para os roedores.
Entretanto, os morcegos podem hospedar mais vírus zoonóticos por espécie do que os
roedores (Luis et al, 2013, Brook e Dobson, 2015). Entender como esses patógenos e
suas infecções ocorrem nos sistemas ecológicos até causarem doenças em seres
humanos é de grande importância em saúde pública. Em nosso estudo, estabelecemos
alguns padrões ecológicos da infecção de hantavírus em morcegos neotropicais
(phillostomideos). Encontramos 9 morcegos com anticorpos para ARQV, todos
pertencentes à família Phyllostomidae. O morcego vampiro, Desmodus rotundus, foi
aquele com maior número de infectados (Tabela 4). A análise filogenética de sequências
parciais do segmento S mostrou que as sequências nucleotídicas virais derivadas dos
espécimes de Desmodus rotundus e Carollia perspicillata se agruparam com o ARQV.
Anteriormente, Araujo et al. (2012) observaram que um ARQV-like estava infectando
morcegos phillostomideos Diphylla eucadata e Anoura caudifer. Porém, no estudo de
Araujo et al. (2012), não houve detectecção de anticorpos para hantavírus, e se baseou
apenas em uma sequencia parcial do genoma. Como não existem sequências de
hantavírus oriundos de morcegos Neotropicais, a sequência nucleotídica do vírus obtido
em nosso estudo se agrupou às de hantavírus oriundos de roedores Sigmodontinae, até
por se tratar de um provável ARQV. Evolutivamente, os morcegos formam um clado
irmão com os insetívoros (musaranhos e toupeiras) (Yanagihara et al., 2014) e presumeTese de Doutorado
94
Capítulo 2
se que estes animais tenham uma história evolutiva comum. Porém, Guo et al. (2013)
sugeriram que hantavírus teriam sua origem em morcegos e depois teriam passado aos
insetívoros e roedores. Contudo, é mais provável que os hantavírus tenham se originado
em musaranhos e posteriormente se dispersado para os morcegos e roedores (Bennet et
al., 2014, Yanagihara et al., 2014). Nosso achado abre margem para futuros estudos
focando a evolução dos hantavírus em morcegos Neotropicais, pois, até o momento,
pouco se conhece a esse respeito, e existem várias questões em aberto.
Dentre os morcegos capturados, a infecção por hantavírus não foi detectada em
nenhum juvenil. Isto deve ter ocorrido porque tais infecções têm efeito cumulativo com
a idade, assim como observado com os hantavírus em roedores (Sabino-Santos Jr, 2010,
Piudo et al., 2012). O número de machos infectados foi maior do que o de fêmeas,
porém sem significância (Tabela 4). Em roedores, o sexo parece influenciar a
prevalência de infecções por hantavírus, onde mais machos são encontrados infectados,
e isso reduziria a taxa de reprodução nesses animais (Luis et al., 2012). Os nossos dados
revelam que, em morcegos, o sexo parece não influenciar, porém, mais estudos são
necessários para confirmar este achado. A degradação ambiental e a fragmentação
continuam, atualmente, em um ritmo acelerado e alarmante (Meyer et al., 2008). Isso
põe em risco a vida selvagem, diminuindo a biodiversidade e aumentando o risco de
doenças, que podem ser transmitidas de pequenos mamíferos para os seres humanos
(Mills et al., 2006, Dirzo et al., 2014). Sabe-se que a diminuição da diversidade de
roedores pode aumentar o risco de infecção entre estes animais e consequentemente no
ser humano (Suzán et al., 2009). Portanto, a fragmentação pode ser um fator de risco
para infecção em roedores selvagens (Armién et al., 2009). Com relação aos morcegos,
verificamos que áreas com riqueza e diversidade baixa destes animais também
apresentam um maior risco de infecção por hantavírus. A mata ciliar apresentou uma
proporção maior de animais infectados, enquanto que no Cerrado degradado, onde
esperava-se maior frequência, não observamos infectados dentre 8 morcegos testados.
Esses resultados mostram que hantavírus poderiam ter morcegos como
reservatórios naturais. Entretanto, a alta variabilidade nos dados de nossos modelos
permitiu um baixo poder de inferência. Esse trabalho é pioneiro na detecteção e na
ecologia de hantavírus em morcegos, mostrando indícios que podem direcionar estudos
futuros. Ainda, fato muito importante, nossos resultados sugerem que ARQV, um
hantavírus patogênico para o homem e produtor de grave doença, encontra-se
infectando morcegos no Brasil.
Tese de Doutorado
95
Capítulo 2
Referências
Aguiar LMS e Marinho-Filho J, (2004). Activity patterns of nine phyllostomid bats
species in a fragment of the Altantic Forest in southeastern Brazil. Rev Bras Zoo.
21(2):385-90.
Araujo J, Thomazelli LM, Henriques DA, et al., (2012). Detection of hantavirus in bats
from remaining rain forest in São Paulo, Brazil. BMC Res Notes. 5:690.
Armién AG, Armién B, Koster F, et al., (2009). Hantavirus infection and habitat
associations among rodent populations in agroecosystems of Panama: implications for
human disease risk. Am J Trop Med Hyg. 81(1): 59-66.
Bennet SN, Gu SH, Arai S, Yanagihara R, (2014). Reconstructing the evolutionary
origins and phylogeography of hantaviruses. Trends Microbiol. 22(8):473-82.
Bolker B e R Development Core Team, (2014). bbmle: Tools for
likelihood
estimation.
R
package
version
1.0.16.
general maximum
[http://CRAN.R–
project.org/package=bbmle].
Brook CE e Dobson AP, (2015). Bats as ‘special’ reservoirs for emerging zoonotic
pathogens. Trends Microbiol 23(3): 172-80.
Brown JH, (1984). On the relationship between abundance and distribution of species. T
Amer Nat. 124(2):255-79.
Burnham KP, e Anderson DR, (2002). Model Selection and Multimodel Inference, 2nd
edn. Springer-Verlag, New York, NY. 488 p.
Dirzo R, Young HS, Galetti M, et al., (2014). Defaunation in the Anthropocene.
Science. 345, 401-6.
Esberard CEL e Bergallo H, (2005). Coletar morcegos por seis ou doze horas a cada
noite? Rev Bras Zoo. 22(4):1095-98.
Tese de Doutorado
96
Capítulo 2
J Med Biol Res. 41(7):596-9.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Borges AA, et al., (2009). Evaluation of an enzymelinked immunosorbent assay based on Araraquara virus recombinant nucleocapsid
Hale JD, Fairbrass AJ, Matthews TJ, Sadler JP, (2012). Habitat composition and
connectivity predicts Bat presence and activity at foraging sites in a large UK
conurbation. PLoS one. 7(3):e33300.
Hutson AM e Pacey PA, (2004). In: Bat Workers Manual. 3rd edition. Joint Nature
Conservation Committee. JNCC, Monkstone House, City Road, Peterborough, UK.
178p.
Gardner AL, (2007). Mammals of South America, vol 1. Marsupials, xenarthrans,
shrews, and bats. Chicago (IL): University of Chicago Press; 669 p.
Gu SH, Lim BK, Kadjo B, et al., (2014). Molecular Phylogeny of Hantaviruses
Harbored by Insectivorous Bats in Côte d’Ivoire and Vietnam. Viruses. 6(5):1897-910.
Guindon S, Dufayard JF, Lefort V, Anisimova M, Hordijk W, Gascuel O, (2010). New
algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the
performance of PhyML 3.0. Syst Biol. 59(3):307-21.
Guo WP, Lin XD, Wang W, et al., (2013). Phylogeny and origins of hantaviruses
harbored by bats, insectivores, and rodents. PLoS Pathog. 9(2):e1003159.
Katoh K e Standley DM, (2013). MAFFT multiple sequence alignment software version
7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 30(4):772-80.
Kim GR, Lee YT, Park CH, (1994). A new natural reservoir of hantavirus: isolation of
hantaviruses from lung tissues of bats. Arch Virol. 134(1-2):85-95.
Tese de Doutorado
97
Capítulo 2
Koch DE, Mohler RL, Goodin DG, (2007). Stratifying land use/land cover for spatial
analysis of disease ecology and risk: an example using object-based classification
techniques. Geospat Health. 2(1):15-28.
Luis AD, Douglass RJ, Hudson PJ, Mills JN, Bjørnstad ON, (2012). Sin Nombre
hantavirus decreases survival of male deer mice. Oecologia. 169(2):431-9.
Luis AD, Hayman DTS, O’Shea TJ, et al., (2013). A comparison of bats and rodents as
reservoirs of zoonotic viruses: are bats special? Proc R Soc B. 280:20122753.
Magurran AE, (2004). Ecological Diversity and its measurement. New Jersey, Princeton
University Press. 179 p.
Muylaert RL, Stevens RD, Tevens MCR, (2015). Threshold effect of habitat loss on bat
richness in savanna-forest landscapes. Ecological Appl. (submetido).
Martins ACM, Bernard E, Gregorin R, (2006). Inventários biológicos rápidos de
morcegos (Mammalia, Chiroptera) em três unidades de conservação do Amapá, Brasil.
Rev Bras Zoo. 23(4):1175-84.
Meyer CFJ, Fründ J, Lizano WP, Kalko EKV, (2008). Ecological correlates of
vulnerability to fragmentation in Neotropical bats. J App Ecol. 45:381-91.
Medellin RA, Equihua M, Amin MA, (2000). Bat diversity and abundance as indicators
of disturbance in Neotropical Rainforests. Cons Biol. 14(6):1666-75.
Mills JN, (2006). Biodiversity loss and emerging infectious disease: An example from
the rodent-borne hemorrhagic fevers. Biodiversity. 7(1):9-17.
Tese de Doutorado
98
Capítulo 2
Parmesan C, Gaines S, Gonzalez L, et al., (2005). Empirical perspectives on species
borders: from traditional biogeography to global change. Oikos. 108:58-75.
Piudo L, Monteverde MJ, Walker RS, Douglass RJ, (2012). Características de
Oligoryzomys longicaudatus asociadas a la presencia del virus Andes (Hantavirus). Rev
Chil Infect. 29(2):200-6.
Plowright RK, Eby P, Hudson PJ, et al., (2014). Ecological dynamics of emerging bat
virus spillover. Proc R Soc B. 282:20142124.
Posada D, (2008). jModelTest: phylogenetic model averaging. Mol Biol Evol.
25(7):1253-6.
Plyusnin A, Morzunov SP, (2001). Virus evolution and genetic diversity of hantaviruses
and their rodent hosts. Curr Top Microbiol Immunol. 256:47-75.
Plyusnin A e Sironen T, (2014). Evolution of hantaviruses: Co-speciation with reservoir
hosts for more than 100 MYR. Vir Res. 17(187):22-6.
R Development Core Team, (2014). R: A language and environment for statistical
computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. [URL
http://www.R–project.org/].
Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA, Lima IP, (2007). Morcegos do Brasil. UEL Bibliot
Reis NR, Fregonezi MN, Peracchi AL, Shibatta OA, (2013). Morcegos do Brasil, guia
de campo. Technical Books. Rio de Janeiro. 1 ed. 252p.
Ripperger SP, Kalko EKV, Rodríguez-Herrera, et al., (2015). Frugivorous bats maintain
functional habitat connectivity in agricultural landscapes but rely strongly on natural
forest fragments. PloS One. DOI:10.1371.
Rodríguez F, Oliver JL, Marín A, Medina JR, (1990). The general stochastic model of
nucleotide substitution. J Theor Biol. 22;142(4):485-501.
Tese de Doutorado
99
Capítulo 2
Sabino-Santos Jr G, (2010). Detecção de hantavírus em roedores silvestres e estudo de
sua dinâmica populacional na região nordeste do estado de São Paulo. [Dissertação de
Mestrado]. São Paulo: Univ. de São Paulo.
Sabino-Santos Jr G, Motta FGM, Vieira TM, et al., (2015). Evidence of Hantavirus
Infection Among Bats In Brazil. Am J Trop Med Hyg. (aceito para publicação).
Salazar-Bravo J, Pardiñas U, and D’Elía G, (2013). A phylogenetic appraisal of
Sigmodontinae (Rodentia, Cricetidae) with emphasis on phyllotine genera: systematics
and biogeography. Zool Scripta. 42(3):250-61.
Salkeld DJ, Padgett KA, Jones JH, (2013). A meta-analysis suggesting that the
relationship between biodiversity and risk of zoonotic pathogen transmission is
idiosyncratic. Ecol Let. 16:679-86.
Sikes RS, Gannon WL and the Animal Care and Use Committee of the American
Society of Mammalogists, (2011). Guidelines of the American Society of
Mammalogists for the use of wild mammals in research. J Mammal. 92(1):231-53.
Spellerberg IF e Fedor PJ, (2003). A tribute to Claude Shannon (1916–2001) and a plea
for more rigorous use of species richness, species diversity and the ‘Shannon–Wiener’
Index. Global Ecol Biog 12:177-79.
rodent diversity causing increased hantavirus prevalence. PLoS One. 4(5): e5461.
Yanagihara R, Gu SH, Arai S, Kang HJ, Song JW, (2014). Hantaviruses: rediscovery
and new beginnings. Virus Res. 187:6-14.
Tese de Doutorado
100
Capítulo 2
Wilson K e Hardy ICW, (2002). Statistical analysis of sex ratios: an introduction. In:
Hardy ICW, Sex ratios: concepts and research methods. Cambridge: Cambridge
University Press. 92p.
Weiss S, Witkowski PT, Auste B, et al., (2012). Hantavirus in Bat, Sierra Leone. Emerg
Infect Dis. 18(1):159-61.
Xia X e Xie Z, (2001). DAMBE: software package for data analysis in molecular
biology and evolution. J Hered. 92(4):371-3.
Tese de Doutorado
101
___________________________________________________________________________
7. Capítulo 3: Ecologia de ectoparasitos de pequenos
mamíferos selvagens associados ou não a infecção por
hantavírus
Capítulo 3
Ecologia de ectoparasitos de pequenos mamíferos selvagens associados ou não a
infecção por hantavírus
Resumo: Doenças transmitidas por ectoparasitos desempenham um papel importante na
saúde humana e/ou veterinária. Ectoparasitos já foram encontrados naturalmente
infectados com hantavírus, podendo transmitir o vírus de forma transovariana e
transestadial. Nosso objetivo aqui foi realizar um levantamento ecológico de espécies da
ectoparasitofauna de pequenos mamíferos selvagens associando à (i) especificidade
ectoparasito-hospedeiro, (ii) diversidade de espécies dos ectoparasitos, e a (iii) relação
da abundância (quantidade) de ectoparasitos com a infecção por hantavírus nas espécies
de pequenos mamíferos selvagens. Foram coletados 3.225 ectoparasitos de 154
pequenos mamíferos terrestres e de 181 morcegos, durante fevereiro de 2012 até abril
de 2014, nos estados de São Paulo e Minas Gerais, Brasil. Observamos que a
diversidade de ectoparasitos foi maior no roedor Necromys lasiurus. A especificidade
ectoparasito-hospedeiro foi notada quase em todos os pequenos mamíferos onde o
índice de similaridade de Jaccard não excedeu a 0,2. As exceções foram percebidas para
os ectoparasitos Amblyomma sculptum, Androlaelaps rotundus, Hoplopleura sp.,
Laelaps paulistanensis, e Trichobius joblingi, que foram distribuídos em duas ou mais
espécies de hospedeiros. Geralmente, quanto a maior abundância de ectoparasitos,
maior o risco de infecção e doença nos hospedeiros. Mas em nosso estudo, não houve
relação da infecção por hantavírus nem com a quantidade e com a diversidade de
ectoparasitos. Espécimens adultos de Akodon montensis parecem ser mais
ectoparasitados, enquanto N. lasiurus capturados no capim braquiária tiveram um
número de ectoparasitos maior do que em outros ambientes.
Palavras-chaves: Ectoparasitos, infecção por hantavírus, mamíferos-hospedeiros.
Abstract: Diseases transmitted by arthropods, play an important role in human and/or
animal health. Ectoparasites have been found naturally infected with hantavirus, and can
transmit the virus by transovarian and transstadial pathways. Our goal here was to
conduct a ecological survey of ectoparasites species from wild small mammals by
combining (i) ectoparasite-host specificity, (ii) diversity of species of ectoparasites, and
(iii) abundance of ectoparasites with the hantavirus infection among small mammals.
During Februaray 2012 to April 2014 we collected 3,225 ectoparasites from 154
terretrial small mammals, and 181 bats, in the states of São Paulo and Minas Gerais,
Tese de Doutorado
103
Capítulo 3
Brazil. We found that the diversity of ectoparasites was higher in the rodent Necromys
lasiurus. The ectoparasite-host specificity was noted in almost all small mammals
where the Jaccard index of similiarity did not exceed 2.0. The noted exceptions belong
to ectoparasites such as: Amblyomma sculptum, Androlaelaps rotundus, Hoplopleura
sp., Laelaps paulistanensis, and Trichobius joblingi, that were distributed into two or
more host species. Usually, the greater abundance of ectoparasites, the greater is the risk
of infection and disease in the host. However, there was no relationship of hantavirus
infection with the amount, nor the diversity of ectoparasites. Adults specimens of
Akodon montensis seem to have more ectoparasites, while N. lasiurus captured in
grassland had a number of ectoparasites higher than in other environments.
Key-words: Ectoparasites, hantavirus infection, mammals-hosts.
7.1. Introdução
Os artrópodes constituem o maior filo animal. Porém um número relativamente
pequeno de espécies encontra-se direta ou indiretamente relacionado com à saúde
pública (Fritsche, 2003). Essas espécies podem ser de importância médica por serem
vetores biológicos de organismos causadores de doenças (malária, filariose, febre
amarela, dengue, peste bubônica, babebiose, tifo, doença de Lyme, doença de Chagas,
leishmanioses, e muitas outras) (Mathison e Pritt, 2014). Podem produzir fenômenos
inflamatórios, alérgicos ou até espoliação, causando danos aos seus hospedeiros.
Acredita-se que quanto maior a abundância de ectoparasitos maior é o risco de danos ao
hospedeiro (Wall, 2007). Como vetores biológicos destacam-se os ácaros, carrapatos,
pulgas e algumas espécies de moscas. Muitos desses artrópodes não são de vida livre e
vivem associados a pequenos mamíferos selvagens, sendo algumas espécies específicas
de seus hospedeiros. Esta especificidade pode, inclusive, auxiliar na identificação
taxonômica de espécies hospedeiras (Linardi, 1977, Valiente-Moro et al., 2005).
Chumakov et al. (1990) sugeriram que ectoparasitos podem manter a infecção
por hantavírus apenas entre roedores. Houck et al. (2001) detectaram em ectoparasitos,
por métodos moleculares, o hantavírus Bayou, sugerindo que este não tenha sido
adquirido originalmente pelos roedores, mas que tenha replicado previamente em
ectoparasitos. O vírus Haantan foi detectado em lotes com 3 espécies de ácaros da
família Laelapide, gamasideos (Eulaelaps stabularis, Haemolaelaps glasgowi, e
Laelaps cynognathus). Estes artrópodes foram coletados em ninhos de roedores
Tese de Doutorado
104
Capítulo 3
selvagens Apodemus agrarius. Estes estudos indicaram que ácaros gamasideos possam
ser naturalmente infectados com vírus Hantaan, e que poderiam transmitir o vírus de
forma transovariana e transestadial (Yu e Tesh 2014). Sabe-se que a transmissão de
hantavírus para os seres humanos ocorre por inalação de partículas virais em aerossóis
contendo excrementos de pequenos roedores Cricetidae infectados (Jonsson et al.,
2010). Guo et al. (2013) sugeriram que os hantavírus tenham se originado
principalmente em morcegos e posteriormente dispersos entre outros mamíferos
reservatórios. Entretanto, com base na história evolutiva dos morcegos seria possível
que os insetívoros (musaranhos e toupeiras) tenham sido os reservatórios originais
destes vírus e a partir destes teriam acometido morcegos e roedores (Bennett et al.,
2014, Yanagihara et al., 2014). Estas evidências, contestam que Bunyaviridae do gênero
Hantavirus, diferentemente dos outros gêneros da família, não seriam transmitidos por
artrópodes.
Diante disso, realizamos um levantamento ecológico de espécies da fauna de
ectoparasitas de pequenos mamíferos selvagens, associando estes resultados a: (i)
especificidade ectoparasito-hospedeiro, (ii) diversidade de espécies dos ectoparasitos e
(iii) relação da abundância (quantidade) de ectoparasitos com a infecção por hantavírus
nos animais.
Área de estudo e metodologia de captura de pequenos mamíferos selvagens
Os ectoparasitas foram coletados de pequenos mamíferos selvagens em cinco
sítios ecologicamente distintos da região nordeste do estado de São Paulo e do norte do
estado de Minas Gerais (Figura 1). Sítio 1: Estação Ecológica de Jataí (EEJ), município
de Luis Antônio, que abrange uma área de 9.010,70 ha, a maior área contínua protegida
de Cerrado (um bioma tipicamente brasileiro) no estado de São Paulo. Ali, observam-se
também, pequenos enclaves de mata semidecidual. Sítio 2: no município de Cajuru-SP,
local com vegetação original (Cerrado) convertida em monoculturas, mas apresentando
manchas de matas ciliares. Sítio 3: no município de Batatais-SP, local com plantações
de cana-de-açúcar rodeando pequenas manchas de Cerrado, matas ciliares e florestas
secundárias. Sítio 4: Parque Ecológico de Sapucaia (PES), com área de 37,66 ha e
topografia cárstica. Sítio 5: Parque Ecológico Lapa Grande (PELG), com 9.600 ha e alta
concentração de cavernas e abrigos. Os sítios 4 e 5 estão localizados no município de
Montes Claros-MG e abrigam uma vegetação predominante de Cerrado, com manchas
Tese de Doutorado
105
Capítulo 3
de floresta estacional decidual (mata seca) e trechos de transição para Caatinga (um
bioma desértico brasileiro).
Figura 1. Área de estudo nos estados de São Paulo e Minas Gerais, sudeste do Brasil. O
mapa mostra os municípios onde ectoparasitos foram coletados dos pequenos
mamíferos selvagens.
Para a captura de pequenos mamíferos selvagens terrestres (roedores e
marsupiais), nos sítios 1 a 3, utilizou-se uma grade permanente e um transecto (ambos
compostos de 100 armadilhas do tipo Sherman e Tomahawk) distante 1000 m da grade.
Grade e transecto foram mantidos por 6 noites consecutivas, totalizando esforço
amostral de 600 armadilhas-noite (Mills et al., 1995). Para a captura de morcegos
utilizaram-se 12 redes de neblina (modelo 716/ 12P, 12 x 2,5 m; denier 75/2, malha de
16 x 16 mm; Ecotone Inc., Polônia) nos sítios 1, 2 e 3; e 6 redes de neblina nos sítios 4 e
5. As redes foram abertas em trilhas, com 3 ou mais metros de altura e mantidas por 3
noites consecutivas nos sítios 1 a 4 e por 1 noite, nos sítios 5 e 6. A abertura das redes
ocorria por volta das 18 horas e o fechamento, por volta de meia noite (Esberard e
Bergallo 2005, Martins et al., 2006). Os pequenos mamíferos terrestres capturados
foram marcados com um brinco e os morcegos com um colar, evitando, assim, novas
amostragens num mesmo indivíduo.
Tese de Doutorado
106
Capítulo 3
Os ectoparasitos foram coletados de pequenos mamíferos capturados entre
fevereiro de 2012 a abril de 2014. Os procedimentos e protocolos utilizados estão de
acordo com as leis de proteção da vida selvagem e dos regulamentos, e foram
previamente aprovados pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
(Ministério do Meio Ambiente), protocolos nos. 19838-1 e 41709-3. O projeto de
trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de
São Paulo e da Universidade Federal de Minas Gerais (nos. 020/2011. e 333/2013,
respectivamente).
Coleta e identificação de ecotoparasitos
Para evitar contaminação por ectoparasitas entre os diferentes mamíferoshospedeiros, estes foram anestesiados dentro de um saco de plástico individual
comhalotano contido em um pedaço de algodão. Os mamíferos anestesiados foram
depositados sobre um saco plástico estéril de cor branca (saco de coleta de
ectoparasitos, individual para cada mamífero-hospedeiro) e cuidadosamente escovados,
da base da cauda a cabeça, mas, principalmente, no dorso (Bittencourt e Rocha, 2003).
Em seguida, pinças estéreis foram utilizadas para coletar todos os ectoparasitos e
armazená-los no saco de coleta. Em seguida, estes foram transferidos para criotubos
devidamente identificados e contendo 70% de etanol, incluindo os ectoparasitas
coletados de cada mamífero. Os criotubos foram armazenados a 4ºC e depois, no
laboratório, a -80ºC (Houck et al., 2001, Carmichael et al., 2007, Wójcik-Fatla et al.,
2013). A fauna de ectoparasitos foi identificada com base em descrições originais e
comparações com exemplares depositados na coleção do Instituto Butantan de São
Paulo (IBSP). Porém os laelapideos foram identificados segundo Fonseca (1935/36,
1939, 1957/58), Furman (1972a, b), Gettinger (1992), e Gettinger et al. (2005). Os
ácaros da família Macronyssidae foram identificados segundo os critérios de NieriBastos et al. (2011).
Diversidade e abundância de ectoparasitos
O índice de diversidade é uma medida quantitativa que reflete quantos tipos
diferentes (tais como espécies) existem em um conjunto de dados e considera a forma
como entidades básicas (como os indivíduos) são distribuídas entre os tipos (Simpson,
1949). Utilizamos, no trabalho, o índice de diversidade de Shannon-Wiener (H), que
relaciona número de espécies (riqueza) com número de indíviduos (abundância)
(Spellerberg e Fedor, 2003). A abundância foi estimada como o número total de
ectoparasitos para cada espécie. Realizou-se o teste de normalidade Shapiro-Wilk para
Tese de Doutorado
107
Capítulo 3
verificar se a quantidade de ectoparasitos seguia uma distribuição normal em cada
mamífero-hospedeiro, assim como para o sexo (macho e fêmea), idade (adulto, subadulto, e juvenil) e tipo de habitat (Cerrado, Mata Ciliar, Mata Semidecídua, Mata Seca,
Cerrado degradado, capim braquiária, e cana de açúcar). Diferenças na quantidade de
ectoparasitos foram comparadas, quando possível, para cada mamífero-hospedeiro,
segundo sexo, idade e tipo de habitat. Para tanto, utilizou-se o teste de Wilcoxon com
correção de continuidade (para o sexo) e o teste de Kruskal-Wallis (para idade e
habitat).
Especificidade ectoparasito-hospedeiro
Para analisar a similaridade dos ectoparasitos associados a diferentes espécies de
mamíferos-hospedeiros, utilizou-se o índice de Jaccard (Magurran, 1988, Bittencourt &
Rocha, 2003). Os coeficientes de similaridade Jaccard foram calculados nos diversos
hospedeiros, tendo por base a comunidade de ectoparasitas em cada um. A fórmula
utilizada para calcular o índice Jaccard foi: J=a/(b+c-a), onde J é o índice de
similaridade, a é o número de espécies de ectoparasitos comuns em ambas espécies de
mamíferos-hospedeiros, b é o número de espécies de ectoparasitos encontradas somente
no primeiro hospedeiro, c é o número de espécies de ectoparasitos encontrados somente
no segundo hospedeiro a ser comparado.
Diagnóstico da infecção por hantavírus em pequenos mamíferos-hospedeiros
Anestesiados os pequenos mamíferos, amostras de sangue foram coletadas pela
via retro-orbital nos roedores e por punção cardíaca nos morcegos e marsupiais. As
amostras de sangue foram imediatamente colocadas em criotubos, devidademente
identificadas e armazenadas em nitrogênio líquido.
Para pesquisar sobre a infecção por hantavírus nos pequenos mamíferos,
utilizou-se um ensaio imunoenzimático (ELISA). As amostras de sangue foram diluídas
1:100. Como antígeno, utilizou-se proteína recombinante do nucleocapsídeo de ARQV
produzida em nosso laboratório. Como anticorpos secundários, para morcegos utilizouse um anti-Bat específico para porção Fc de anticorpos IgG de morcegos da ordem
Microchiroptera (Bethyl Laboratories, Inc., EUA); para roedores, utilizamos uma
mistura na proporção 1:1 de anti-Rattus rattus (roedores Murinae) e anti-Peromyscus
leucopus (roedores Sigmodontinae) (KPL, Maryland, EUA). E para marsupiais
(Didelphidae) um anti-Opossum (Alpha Diagnostics Intl. Inc., San Antonio, EUA),
todos conjugados à peroxidase. Este ELISA quando aplicado para detectação de
anticorpos de roedores mostrou sensibilidade de 97,2%, especificidade de 100%, valor
Tese de Doutorado
108
Capítulo 3
preditivo positivo de 100% e valor preditivo negativo de 98,1%, quando comparado ao
método padrão (Figueiredo et al., 2008, 2009b).
Relação abundância de ectoparasitos e infecção por hantavírus
Na análise dos resultados, pesquisou-se pela correlação entre quantidade de
ectoparasitos e infecção por hantavírus. Para tanto, utilizou-se o índice de Spearman.
Realizou-se uma regressão logística com modelos lineares generalizados (GLM) e
mistos (GLMM) utilizando a espécie de pequenos mamíferos-hospedeiros como fator
randômico para controlar o efeito na infecção por hantavírus e na quantidade de
ectoparasitas. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa R versão 1.13.4.
pacote “Multi-Model Inference” (Barton, 2015).
7.3. Resultados
Diversidade e abundância de ectoparasitos
Um total de 3.225 ectoparasitas foram coletados de 335 pequenos mamíferoshospedeiros, sendo 154 pequenos mamíferos terrestres (roedores e marsupiais) e 181
morcegos. A abundância de ectoparasitos foi maior no roedor Dasyprocta azarae
(n=2.273) e no marsupial Didelphis albiventris (n=339). Os roedores Sigmondontinae,
Oligoryzomys nigripes (n=252), Necromys lasiurus (n=163) e Akodon montensis
(n=142) foram os que apresentaram maior abundância de ectoparasitos (Tabela 1). Dos
morcegos, Sturnira lilium (n=18) foi o que apresentou maior número de ectoparasitos.
Dentre os ectoparasitos, 2.589 foram da espécie Amblyomma sculptum, principalmente
em D. azarae e D. albiventris (Tabela 1). Foram encontradas 7 espécies de ectoparasitos
da subfamília Laelapinae (Acari: Laelapidae), também conhecidos como ácaros
gamasideos, sendo duas mais abundantes: 190 Laelaps paulistanensis e 141
Androlaelaps rotundus (Tabela 1). Dos ectoparasitos da ordem Diptera, os mais
abundantes foram Trichobius joblingi e T. angulatus (Tabela 1).
Tese de Doutorado
109
Capítulo 3
Tabela 1. Distribuição da ectoparasitofauna segundo a espécie de pequeno mamíferohospedeiro.
Família
Mamífero
Phyllostomidae
Espécie
Mamífero
Anoura geoffroyi
Artibeus lituratus
Ordem
Ecto
Diptera
Diptera
Família
Ecto
Streblidae
Streblidae
A. planirostris
Acari
Acari
Diptera
Spinturnicidae
Macronyssidae
Spinturnicidae
Streblidae
Diptera
Streblidae
Sturnira lilium
Acari
Diptera
Spinturnicidae
Streblidae
Vespertillionidae
Myotis nigricans
Acari
Macronyssidae
Didelphidae
Ixodida
Ixodidae
Cricetidae
Marmosops paulensis
Akodon montensis
Phthiraptera
Acari
Hoplopleuridae
Laelapidae
Phthiraptera
Calomys tener
Acari
Gyropidae
Hoplopleuridae
Laelapidae
Necromys lasiurus
Acari
Laelapidae
Dasyproctidae
Dasyprocta azarae
Tese de Doutorado
Phthiraptera
Sarcoptiformes
Siphonaptera
Acari
Ixodida
Macronyssidae
Hoplopleuridae
Listrophoridae
Rhopanopsyllidae
Laelapidae
Ixodidae
110
Espécie
Ecto
Trichobius uniformis
Megistopoda aranea
Trichobius angulatus
Periglischrus sp
Ornithonyssus sp
Periglischrus sp
Speiseria ambigua
Strebla wiedemannii
Trichobius joblingi
Trichobius angulatus
T. joblingi
T. tiptoni
Periglischrus sp
n.d.
Aspidoptera falcata
Megistopoda proxima
Ornithonyssus sp
O. wernecki
Amblyomma sculptum
Amlblyoma dubitatum
Hoplopleura sp
Androlaelaps rotundus
Androlaelaps sp
Laelaps sp
Gyropus sp
Hoplopleura sp
Laelaps paulistanensis
Laelaps sp
Androlaelaps
fahrenholzi
Androlaelaps rotundus
Laelaps sp
Ornithonyssus sp
Hoplopleura sp
n.d.
Polygenis sp
Laelaps sp
Laelaps paulistanensis
Gigantolaeps
wolffsohni
Mysolaelaps
parvipinosus
A. sculptum
Amblyomma dubitatum
No.
Ectos
1
1
1
1
1
1
1
1
6
5
1
1
2
4
2
10
6
2
317
22
1
84
10
1
3
44
6
2
70
57
1
2
5
1
23
44
184
14
10
2272
1
Capítulo 3
No tocante à diversidade de ectoparasitos, foi possível observar que, dentre
todos os pequenos mamíferos-hospedeiros, a diversidade de espécies foi maior em N.
lasiurus (H=1,3), Sturnira lilium (H=1,1), Carollia perspicillata (H=1,0) e Akodon
montensis (H=0.9) (Figura 2).
Figura 2. Diversidade da ectoparasitofauna nos pequenos mamíferos-hospedeiros
capturados. Eixo x mostra os valores do índice de Shannon-Wiener comparado às
diferentes espécies no eixo y.
Quando se comparou diversidade de ectoparasitos com o sexo e a idade dos
pequenos mamíferos, não houve relação significante. Porém, aparentemente, quanto
maior a idade dos roedores da espécie A. montensis maior é a probabilidade de portarem
ectoparasitos (Tabela 2). Em morcegos C. perspicillata e S. Lilium, somente espécimes
adultos portavam ectoparasitos. Quanto ao habitat, verificou-se que em N. lasiurus,
capturados no capim braquiária, o número de ectoparasitos foi maior, embora sem
significância (Tabela 2).
Tese de Doutorado
111
Capítulo 3
Tabela 2. Análise da significância do número de ectoparasitos segundo sexo, idade e o
habitat de cada espécie (n.c. = não foi possível calcular, todos indíviduos adultos).
Sexo
Idade
Tipo de habitat
Akodon montensis
0,37
0,06
0,20
Dasyprocta azarae
0,38
0,80
0,12
0,38
0,67
0,28
Necromys lasiurus
0,93
0,57
0,07
0,56
0,89
0,17
0,62
n.c.
0,32
Sturnira lilium
0,70
n.c.
0,24
Ordem:Espécies
Variáveis
Rodentia
Didelphimorphia
Chiroptera
Tabela 3. Valores do índice quantitativo de similaridade Jaccard para espécie de
pequeno mamífero-hospedeiro capturado (- = sem estimativa).
Espécies
4
13
8
6
7
9
10
11
12
1
0,16
0,20
0,33
0,12
-
2
0,25
0,20
3
4
0,20
0,33
0,13
-
0,13
0,50
-
5
6
1,00
-
0,14
-
7
0,13
-
10
0,10
-
12
0,14
-
1-Akodon montensis; 2-Artibeus lituratus; 3-A. planirostris; 4-Calomys tener; 5-Dasyprocta azarae; 6Marmosops paulensis; 7-Myotis nigricans; 8-Didelphis albiventris; 9-Necromys lasiurus; 10Oligozryzomys nigripes; 11-Platyrrhinus lineatus; 12-Sturnira lilium; 13-Carollia perspicillata.
Tese de Doutorado
112
Capítulo 3
Especificidade ectoparasito-hospedeiro
Quanto ao coeficiente de similaridade Jaccard, este variou de 0 a 1 (Tabela 3). O
valor 0 indica não existir semelhança e 1 indica máxima similaridade. Os valores
observados em toda a comunidade de ectoparasitas foram relativamente baixos, com
poucas exceções. A Tabela 3 resume similaridades nas diferentes espécies de
hospedeiros.
Relação entre abundância de ectoparasitos e infecção por hantavírus
Dos 154 pequenos mamíferos terrestres, 15 pertencentes a 4 espécies,
apresentavam anticorpos para hantavírus [Necromys lasiurus (20%), Akodon montensis
(11%), Didelphis albiventris (8%) e Oligoryzomys nigripes (4%)]. Entre os morcegos, 9
pertencentes a 8 espécies apresentaram estes anticorpos [Artibeus lituratus (1 positivo /6
testados), A. obscuros (1/2), A. planirostris (1/3), Carollia perspicillata (1/10),
Chiroderma villosum (1/1), Chrotopterus auritus (1/1) e Desmodus rotundus (3/5)].
Avaliando se a quantidade de ectoparasitos possuía relação com a variável
dependente (infecção por hantavírus) obteve-se r = 0,01 (p = 0,74) e, portanto, não
houve tal correlação. Utilizou-se espécie do mamífero-hospedeiro como fator
randômico visando a controlar que mamíferos-hospedeiros de uma mesma espécie
pudessem ter quantidades similares de ectoparasitas e serem infectados por hantavírus
igualmente. Com esse critério, avaliou-se, por GLM e GLMM, a relação entre
quantidade de ectoparasitos e animais infectados. Neste caso, os intervalos de confiança
cruzaram 0, e a quantidade de ectoparasitos não foi significante (IC 95% -0,004 a
0,0112; p = 0,71).
7.4. Discussão
Este levantamento das espécies de ectoparasitos em pequenos mamíferos
selvagens (terrestres e morcegos), associados ou não a infecção por hantavírus, é um
dos pioneiros e incluiu um número de ectoparasitos considerado elevado, já que estudos
similares não analisaram tal montante de artrópodos (Carmichael et al., 2007, WójcikFatla et al., 2013). Os ectoparasitos coletados tiveram seus gêneros determinados, com
exceção de alguns espécimes das famílias Listrophoridae e Streblidae, sendo, na última,
em decorrência de danos aos exemplares.
Necromys lasiurus, reservatório do hantavírus Araraquara (ARQV) (Suziki et
al., 2004), foi o que apresentou maior diversidade de ectoparasitos, seguido pelos
morcegos Sturnira lilium, Carollia perspicillata, e pelo roedor Akodon montensis. O
Tese de Doutorado
113
Capítulo 3
carrapato Amblyomma sculptum foi o ectoparasita mais abundantemente coletado,
porém, foi encontrado somente em 2 hospedeiros (Didelphis albiventris, Dasyprocta
azarae). A. sculptum infecta-se com a bactéria Rickettsia rickettsii e possui importância
reconhecida como seu transmissor (Guedes et al., 2011). Ácaros Laelapidae também
foram abundantes, porém, somente nos roedores Sigmondotinae. Estes ácaros já foram
citados como vetores e reservatórios de hantavírus (Yu e Tesh 2014). Quanto a
morcegos, o percentual de parasitados mostrou-se baixo (35%), resultado semelhante ao
observado por Graciolli et al. (2006).
Em geral, a ectoparasitofauna de morcegos consiste de artrópodes pertencentes a
espécies exclusivas. Entre estas estão dípteros das famílias Streblidae, Nycteribiidae e
também ácaros das ordens Mesostigmata, Sarcoptiformes e Trombidiformes. Neste
estudo, dípteros da família Streblidae foram encontrados, corroborando o que foi dito
acima (Prevedello et al., 2005, Silva e Filho, 2011). Nos morcegos Myotis nigricans,
Artibeus planirostris, Carollia perspicillata e Sturnira lilium foram encontrados ácaros
da família Macronyssidae e Spinturnicidae, o que acredita-se ser pouco comum
(Graciolli et al., 2008, Moras et al., 2013). A análise dos resultados mostrou ausência de
relação entre diversidade de espécies com o sexo, idade, ou habitat dos pequenos
mamíferos. Porém, entre os roedores Akodon montensis, observou-se, em adultos, maior
quantidade de ectoparasitos quando comparados a juvenis e sub-adultos, porém sem
significado estatístico. N. lasiurus capturados em capim braquiária apresentaram maior
número de ectoparasitos em comparação com os de outros habitats.
Foi sugerido que as interações ectoparasito-hospedeiro, tão específicas,
poderiam ser utilizadas como ferramenta adicional na identificação taxonômica de
hospedeiros (Linardi, 1977) e, ainda, indicarem suas histórias evolutivas comuns
(Barker, 1994). Tais interações podem ser obrigatórias ou facultativas, permanentes ou
intermitentes, superficiais ou subcutâneas (Bittencourt e Rocha, 2003, Wall, 2007). Os
dados aqui mostrados sugerem que várias estratégias de associação estavam sendo
utilizados pelos ectoparasitas coletados nas áreas amostradas. Por um lado, há as
espécies de ácaros e moscas que ocorreram com alta frequência, mas restritos a apenas
uma espécie de hospedeiro. Por outro lado, 5 taxa de ectoparasitos (Amblyomma
sculptum, Androlaelaps rotundus, Hoplopleura sp., Laelaps paulistanensis, Trichobius
joblingi) foram frequentes em 2 ou mais espécies hospedeiras. O índice de Jaccard
mostrou baixa similaridade para toda a comunidade de ectoparasitos. Isso sugere que
algumas espécies devam ser hospedeiros-específicas, mas há exceções. Por exemplo,
Tese de Doutorado
114
Capítulo 3
Amblyomma sculptum parasitou Didelphis albiventris e Dasyprocta azarae, o que
mostra seu conhecido ecletismo. Sabe-se que, mesmo na fase adulta, este carrapato tem
baixa especificidade por hospedeiros e nesta fase, ocorre a maioria dos relatos de
parasitismo humano (Labruna et al., 2004). Androlaelaps rotundus possui mais de um
mamífero-hospedeiro o que inclui vários roedores da tribo akondontine, entre eles:
Akodon cursor, A. azarae, A. toba, Necromys lasiurus (Gettinger e Owen, 2000).
Gettinger e Owen (2000) sugerem que Androlaelaps rotundus possa mostrar-se
morfologicamente distinto em hospedeiros que vivem simpatricamente (espécies que
ocorrem em uma mesma região geográfica), dificultando a sua identificação
taxonômica. Em Akodon montensis, observamos 10 espécimes do gênero Androlaelaps,
sobre os quais não logramos distinguir a espécie.
Parasitos artrópodes são, em geral, pequenos em relação ao tamanho de seu
hospedeiro. Cada ectoparasita consome quantidades relativamente pequenas de
alimento, produzindo pouco dano (Poulin, 1996). Entretanto, mesmo em baixas
densidades, os ectoparasitos produzem lesões. A maioria das espécies de ectoparasitos
têm tempos de geração curtos e produzem grandes quantidades de crias com taxas
elevadas de crescimento populacional. Estes artrópodos são capazes de explorar
situações em que há superabundância de alimentos (Rehbein et al., 2003, Colebrook e
Wall, 2004). O hospedeiro, quando acometido por grande quantidade de ectoparasitos,
tem efeitos que passam de subclínicos para clínicos, os quais produzem maior dano.
Assim, para a maioria dos ectoparasitos, seu significado clínico seria diretamente
associado à sua abundância (Wall, 2007). Neste estudo, não observamos relação entre a
quantidade de ectoparasitos e a infecção por hantavírus. Talvez, esta infecção esteja
mais relacionada à ecologia do hospedeiro, ou espécie do ectoparasito (Zhang et al.,
2001, Yu e Tesh 2014).
Portanto, este trabalho mostrou aspectos importantes relacionados à ecologia dos
ectoparasitos de pequenos mamíferos selvagens. As espécies de pequenos mamíferos,
que se mostraram infectadas por hantavírus, portavam ectoparasitofaunas distintas, com
exceção dos roedores Sigmodontinae. Este estudo pioneiro, apesar da baixa associação
entre as variáveis analisadas, deve estimular futuras investigações que busquem por
ectoparasitos vetores de hantavírus e por suas associações com animais-reservatório.
Tese de Doutorado
115
Capítulo 3
Referências
Barker SC, (1994). Phylogeny and classification, origens, and evolution of host
associations of lice. Int J Parasitol 24:1285-1291.
Barton K, (2015). MuMIn: Multi-Model Inference. R package version 1.13.4.
[http://CRAN.R-project.org/package=MuMIn].
Bennet SN, Gu SH, Arai S, Yanagihara R, (2014). Reconstructing the evolutionary
Bittencourt EB e Rocha CFD, (2003). Host-ectoparasite specificity in a small mammal
community in an area of Atlantic Rain Forest (Ilha Grande, State of Rio de Janeiro),
Southeastern Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 98(6):793-98.
Carmichael JA, Strauss RE, McIntyre NE. Seasonal variation of North American form
of Gigantolaelaps mattogrossensis (Acari: Laelapidae) on marsh rice rat in southern
coastal Texas. J Med Entomol. 2007 Jan;44(1):80-4.
Chumakov MP, Gavrilovskaya IN, Myasnikov YA, (1990). Reservoirs and models of
spread of hemorrhagic fever with renal syndrome, a zoonotic nontransmissible human
disease. Arch Virol. 1:49-56.
Colebrook E e Wall R, (2004). Ectoparasites of livestock in Europe and the
Mediterranean region. Vet. Parasitol. 120, 251-74.
Esberard CEL e Bergallo H, (2005). Coletar morcegos por seis ou doze horas a cada
noite? Rev Bras Zoo. 22(4):1095-98.
Figueiredo LT, Moreli ML, Borges AA, et al., (2008). Expression of a hantavirus N
protein and its efficacy as antigen in immune assays. Braz J Med Biol Res. 41(7):596-9.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Borges AA, et al., (2009). Evaluation of an enzymelinked immunosorbent assay based on Araraquara virus recombinant nucleocapsid
Tese de Doutorado
116
Capítulo 3
Fonseca F, (1935/36). Notas de Acarologia XX. Espécies novas de acarianos do gênero
Laelaps, parasitas de ratos do Brasil (Acari: Laelaptidae). Mem Inst Butantan. 10:33-37.
Fonseca F, (1939). Novos estudos sobre o gênero Laelaps Kock, 1836 (Acari:
Laelapidae). Mem Inst Butantan. 12:103-23.
Fonseca F, (1957/58). Notas de Acarologia XLIV. Inquérito sobre a fauna acarológica
de parasitas no nordeste do Brasil. Mem Inst Butantan. 28:99-186.
Furman DP, (1972a). Laelapid mites (Laelapidae: Laelapinae) of Venezuela. Brigh
Young Univ Scie. Bull Biol Ser. 27:1-58.
Furman DP (1972b) New species of Laelaps (Acarina: Laelapidae) from Venezuela. J
Med Entomol. 9:36-46.
Fritsche TR, (2003). Arthropods of medical importance, p 2061–2078. In Baron EJ,
Pfaller MA, Jorgensen JH, Yolken MA (ed), Manual of clinical microbiology, 8th ed,
vol 2. ASM Press, Washington, DC.
Gettinger D, (1992). Three new species of Laelaps (Acari: Laelapidae) associated with
small mammals in central Brazil. J Med Entomol. 29:66-70.
Gettinger D e Owen RD, (2000). Androlaelaps rotundus Fonseca (Acari:Laelapidae)
associated with akodontine rodents in Paraguay: a morphometric examination of a
pleioxenous ectoparasite. Rev Brasil Biol. 60(3): 425-34.
Gettinger D, Martins-Hatano F, Lareschi M, Malcolm JR, (2005). Laelapine mites
(Acari: Laelapidae) associated with small mammals from Amazonas, Brazil, including a
new species from marsupials. J Parasitol. 91:45-48.
Graciolli G, Passos FC, Pedro WA, et al., (2006). Moscas ectoparasitas (Diptera,
Streblidae) de morcegos filostomídeos (Mammalia, Chiroptera) na Estação Ecológica
dos Caeteus, São Paulo, Brasil. Rev Bras Zoo. 23(1):298-299.
Tese de Doutorado
117
Capítulo 3
Graciolli G, Azevedo AA, Árzua M, Barros-Battesti DM, & Linardi PM, (2008).
Artrópodos ectoparasitos de morcegos no Brasil. In: Pacheco S, Marques RV &
Esverard CEL, org., Morcegos do Brasil: Biologia, Sistemática, Ecologia e
Conservação. Porto Alegre, Armazém Digital. p. 123-38.
Guedes E, Leite RC, Pacheco RC, Silveira I, Labruna MB, (2011). Rickettsia species
infecting Amblyomma ticks from an area endemic for Brazilian spotted fever. Rev Bras
Paras Vet. 20(4):308-11.
Guo WP, Lin XD, Wang W, et al., (2013). Phylogeny and origins of hantaviruses
Houck MA, Qin H, Roberts HR, (2001). Hantavirus transmission: potential role of
ectoparasites. Vector Borne Zoonotic Dis. 1(1):75-9.
Labruna MB, Amaku M, Metzner JA, Nascimento EMM, Colombo S, (2004). Larval
behavioral diapause regulates life cycle of Amblyomma cajennense (Acari:Ioxididae) in
Southeast Brazil. J Med Ent. 40(2):170-78.
Linardi PM, 1977. Relações pulgas/roedores observados nos municípios de Salesópolis
e Itapetininga, SP. Bol Mus Hist Nat 23: 1-23.
Magurran AE, 1988. Ecological Diversity and its Measurement, Croom Helm Ltd,
London, 179 pp.
Martins ACM, Bernard E, Gregorin R, (2006). Inventários biológicos rápidos de
morcegos (Mammalia, Chiroptera) em três unidades de conservação do Amapá, Brasil.
Rev Bras Zoo. 23(4):1175-84.
Mathison BA and Pritt BS, (2014). Laboratory Identification of Arthropod Ectoparasites
Clin. Microbiol. Rev. 27(1):48-67.
Tese de Doutorado
118
Capítulo 3
Moras LM, Bernardi LFO, Graciolli G, and Gregorin R, (2013). Bat flies (Diptera:
Streblidae, Nycteribiidae) and mites (Acari) associated with bats (Mammalia:
Chiroptera) in a high-altitude region in southern Minas Gerais, Brazil. Acta Parasitol.
58(4), 556-63.
Nieri-Bastos FA, Labruna MB, Marcili A, et al., (2011). Morphological and molecular
analysis of Ornithonyssus spp. (Acari: Macronyssidae) from small terrestrial mammals
in Brazil. Exp Appl Acarol. 55:305-27.
Poulin R, (1996). The evolution of life history strategies in parasitic animals. Adv.
Parasitol. 37:107-34.
Prevedello JA, Graciolli G, Carvalho CJB, et al., (2005). A fauna de dípteros (Streblidae
e Nycteribiidae) ectoparasitos de morcegos (Chiroptera) do Estado do Paraná, Brasil:
composição, distribuição e áreas prioritárias para novos estudos. Bioc. 13(1):193-209.
Rehbein S, Visser M, Winter et al., (2003). Productivity effects of bovine mange and
control with ivermectin. Vet. Parasitol. 114:267-84.
Silva JRR & Filho HO, (2011). Dípteros ectoparasitas (Insecta, Diptera) em morcegos
(Chiroptera, Mammalia) na Reserva Biológica das Perobas Paraná, Brasil. Iher Ser Zoo.
101(3): 220-4.
Spellerberg IF e Fedor PJ, (2003). A tribute to Claude Shannon (1916–2001) and a plea
for more rigorous use of species richness, species diversity and the ‘Shannon–Wiener’
Index. Global Ecol Biog 12:177-79.
Suzuki A, Bisordi I, Levis S, Garcia J, Pereira LE, Souza RP et al., (2004). Identifying
rodent hantavirus reservoirs, Brazil. Emerg Infect Dis. 10(12): 2127-34.
Valiente-Moro C, Chauve C, Zenner L, (2005). Vectorial role of some dermanyssoid
mites (Acari, Mesostigmata, Dermanyssoidea). Parasite. 12:99-109.
Tese de Doutorado
119
Capítulo 3
Yu XJ e Tesh RB, (2014). The Role of Mites in the Transmission and Maintenance of
Hantaan Virus (Hantavirus: Bunyaviridae). J Inf Dis. 210(11):1693-9.
Wall R, (2007). Ectoparasites: Future challenges in a changing world. Vet Paras.
148:62-74.
Wójcik-Fatla A, Zając V, Knap JP, Dutkiewicz J, (2013). Hantavirus RNA was not
detected in Dermacentor reticulatus ticks. Ann Agric Environ Med. 20(3):452-4.
Zhang Y, Zhu J, Deng XZ, Wu GH, Zhang JJ, Zhou YP, (2001). Experimental study on
the roles of gasmid mite and chigger mite in the transmission of hemorrhagic fever with
renal syndrome virus. Chinese J Epidemiol. 22:352-4.
Zhang Y, Zhu J, Deng XZ, Wu GH, Zhang J, Zhou YP, (2002). Distribution of
hemorrhagic fever with renal syndrome virus in gamasid mites and chigger mites.
Chinese J Preventive Med. 36: 232–4.
Tese de Doutorado
120
“Simplicidade é o caminho para se chegar a humildade, e com isso possuir a paz: para
ser menos arrogante e prepotente, combatendo e se livrando da inveja, orgulho e ciúmes.
Não seja apenas moral. Esteja acima da moralidade. Não seja apenas bom, seja bom
com um propósito.” (Adpatado de Henry David Thoreau)
___________________________________________________________________________
8. Discussão Geral
Discussão Geral
Os seres humanos, na história da civilização, vêm gerando profundas mudanças
nos ambientes e ecossistemas, o que tem implicações de nível local a mundial (Burney e
Flannery, 2005). Alterações ambientais incluem o desmatamento, agricultura e
agropecuária intensiva (com fins comerciais e de grande escala), urbanização,
suburbanização, desenvolvimento de infra-estruturas (estrada de ferro, estradas, linhas
de energia), alteração hidrológica (barragens, irrigação, construção de canal) e extração
com exaustão de recursos naturais (mineração, extração de madeira, caça) (Foley et al.,
2005). Tais mudanças ambientais podem impactar negativamente a integridade
ecológica e biodiversidade, interrompendo a estrutura e função da cadeia alimentar
(Foley et al., 2005). Desta forma, ciclos biogeoquímicos terrestres e aquáticos são
alterados, desestruturando propriedades dos ecossistemas, favorencendo a introdução de
espécies não nativas, excluindo ou extinguindo espécies nativas e incluindo patógenos
(Gottdenker et al., 2014). Essas mudanças podem, ainda, alterar a dinâmica de interação
entre os patógenos e seus reservatórios naturais levando ao surgimento de doenças
infecciosas em humanos, animais domésticos e mesmo nos animais selvagens (Foley et
al., 2005, Gottdenker et al., 2014).
No presente estudo, foi possível verificar que mudanças de natureza semelhante
às citadas acima vêm, provavelmente, alterando a dinâmica do hantavírus Araraquara
(ARQV) na região sudeste do Brasil. Verificou-se que a degradação ambiental, no caso
pelo capim braquiária, uma vegetação introduzida, está a influenciar positivamente a
infecção por hantavírus em roedores Necromys lasiurus. Nestes animais, o aspecto
alométrico massa corporal parece ter influído no número de infectados por hantavírus e
portanto, maior positividade foi encontrada entre os adultos. No campim braquiária,
onde a diversidade de espécies foi baixa, observou-se um maior número de roedores
infectados. Além disso, um achado muito importante de nosso estudo foi a infecção de
morcegos por hantavírus. Áreas com alta fragmentação e paisagens mosaico,
comumente, inflingem consequências drásticas para as faunas locais e isto traz
consequências, como a observada em nosso estudo, ali constatou-se que eram as de
maior risco para a infecção por hantavírus em morcegos (Ripperger et al., 2015).
O primeiro hantavírus conhecido, o Thottapalayam virus (TPMV), foi isolado
em 1964, na Índia, de um musaranho da ordem Soricomorpha, família Soricidae
(Suncus murinus) (Carey et al., 1971), porém, só foi classificado como um
Bunyaviridae em 1989 (Zeller et al., 1989). Desde então, todos os hantavírus
conhecidos, até 2006, estariam relacionados com pequenos roedores, e por isso,
Tese de Doutorado
123
Discussão Geral
acreditava-se que estes vírus teriam evoluído com seus roedores-reservatórios ao longo
de milhões de anos (Morzunov et al., 1998, Hughes et al., 2000, Plyusnin et al., 2014,
Yanagihara et al., 2014). Entretanto, a partir de 2006, cerca de 22 espécies de hantavírus
foram identificadas em mamíferos insetívoros (Kang et al., 2012). Os hantavírus de
insetívoros divergem filogeneticamente dos de roedores, formando um grupo
monofilético distante. Ainda, nos últimos 3 anos, novas espécies de hantavírus foram
identificadas em morcegos africanos e vietnamitas (Sumibcay et al., 2012, Arai et al.,
2013). A presença de hantavírus em insetívoros da ordem Soricomorpha (musaranhos e
toupeiras) e em morcegos tem mudado a teoria coevolutiva dos roedores-reservatório
com seus hantavírus. Também, o conhecimento de que os hantavírus, vírus de RNA fita
simples, teriam, talvez, uma evolução 10000 vezes mais rápida que a dos roedores,
prejudica seriamente a idéia coevolutiva (Ramsden et al., 2008, 2009). Esse achados
parecem indicar que passagem de vírus entre espécies de hospedeiros possam ter
acontecido ao longo da história evolutiva dos hantavírus (Guo et al., 2013) e que a
dinâmica da transmissão destes entre os reservatórios-naturais, ainda, é pouco
conhecida. Diferente dos outros Bunyaviridae, os do gênero hantavírus não são
transmitidos por artrópodes. Entretanto, Houck et al., (2001) detectaram RNA do vírus
Bayou em ectoparasitos de roedores negativos tanto na sorologia como no RT-PCR,
sugerindo que o vírus detectado nesses artrópodos não tenha sido adquirido dos
roedores. Guo et al. (2013) sugeriram que os hantavírus tenham se originado em
morcegos e então dispersos entre outros mamíferos reservatórios. Entretanto, devido a
história evolutiva aparentemente em comum dos morcegos com os insetívoros, é mais
provável que os insetívoros (musaranhos e toupeiras) tenham sido os reservatórios
originais, e, a partir destes, o vírus tenha se espalhado para morcegos e roedores
(Bennett et al., 2014, Plyusnin e Sironnen, 2014, Yanagihara et al., 2014, Sabino-Santos
et al., 2015). No entanto, nenhuma sequência de hantavírus em ectoparasitas foi
analisada até o presente momento. E por isso, ainda várias questões a esse respeito ainda
permanecem desconhecidas.
Em nosso estudo, encontramos sequências de alta similaridade com ARQV, um
hantavírus causador de grave doença humana, infectando morcegos. Até o momento, os
hantavírus descritos em morcegos não haviam sido relacionados com doença humana e,
com base na filogenia, são consideravelmente diferentes dos patogênicos para o homem
(Gu et al., 2014). O achado de um provável ARQV infectando morcegos é muito
importante porque abre especulações sobre como seria a dinâmica de transmissão e
Tese de Doutorado
124
Discussão Geral
manutenção deste vírus na natureza. É importante para o conhecimento da
epidemiologia da hantavirose, ou seja, a origem dos hantavírus transmitidos para o
homem. Participariam os morcegos como fonte de transmissão? Os fragmentos de mata
ciliar onde os morcegos foram encontrados infectados com hantavírus, no município de
Batatais, SP, acompanham o achado de roedores infectados pelo vírus no mesmo local e
a ocorrência de casos da doença humana por hantavírus no município (capítulo 2).
Diante dos resultados encontrados em nosso trabalho, propomos aqui um modelo de
dinâmica da transmissão e manutenção do ARQV na natureza (Figura 1).
Os roedores Sigmodontinae, como mostrado no capítulo 1, utilizam as
plantações de cana de açúcar ou braquiária na alimentação, mas não necessariamente
vivem nestas áreas. É mais provável que estes roedores vivam nos fragmentos onde a
vegetação está mais preservada, compartilhando assim o mesmo ambiente dos
morcegos, que dependem de paisagens naturais para sobreviverem à degradação
ambiental (Ripperger et al., 2015). Desta forma, os morcegos infectados poderiam
transmitir hantavírus para os roedores através de suas excretas. Entretanto, acredita-se
que a viremia em morcegos deva ser baixa (Moratelli e Calisher, 2015). Por outro lado,
é possível que os hantavírus, ainda, estejam em fase de adaptação nos roedores, que
teriam se infectado a partir de morcegos. Sendo assim, os roedores atuariam como
vetores, onde os vírus se replicariam, aumentariam sua carga e então, dos roedores,
seriam transmitidos para os seres humanos através de partículas virais em aerossóis de
suas excretas, como mostrado na Figura 1. Por fim, apesar da baixa viremia, não se
pode afastar completamente que infecções por hantavírus possam ocorrer diretamente
dos morcegos já que estes, como os roedores, estão em constante contato com o homem
(Moratelli e Calisher, 2015).
Nosso trabalho, ainda, suscita especulações relativas ao papel dos ectoparasitas
na transmissão de hantavírus. No capítulo três, observamos morcegos compartilhando
ectoparasitos da mesma família (Macronyssidae:Ornithonyssus sp.) com os roedores.
Apesar de não termos encontrado artrópodos infectados (pois ainda não foram testados)
estes poderiam contribuir na manutenção do ARQV na natureza, levando o vírus dos
morcegos para o roedor ou menos provável, do roedor para o morcego (Figura 1).
Porém, esses ectoparasitos não poderiam transmitir hantavírus para os seres humanos,
por serem hospedados especificamente por esses pequenos mamíferos, não parasitarem
o homem e não serem de vida livre. Finalizando, poderíamos especular que o hantavírus
ARQV possa ter sua origem em morcegos, e estes, por seus ectoparasitos ou, por
Tese de Doutorado
125
Discussão Geral
aerossóis de suas excretas, estariam transmitindo o vírus para os roedores e os roedores
para os seres humanos.
Figura 1. Potenciais reservatórios naturais, dinâmica da transmissão e manutenção do
hantavírus Araraquara na natureza.
Tese de Doutorado
126
___________________________________________________________________________
9. Conclusões Gerais
Conclusões Gerais
• A soroprevalência para hantavírus em pequenos mamíferos terrestres foi de
9,7%, e em morcegos, de 17% (capítulo 1 e 2).
• O hantavírus Araraquara foi encontrado infectando o roedor Necromys lasiurus e
os morcegos Desmodus rotundus e Carollia perspicillata (capítulo 1 e 2).
• A degradação ambiental está a influenciar a infecção por hantavírus tanto em
morcegos como em pequenos mamíferos terrestres (capítulo 1 e 2).
• O capim braquiária, vegetação introduzida, está aumentando as infecções por
hantavírus em pequenos mamíferos terrestres (capítulo 1).
• A baixa diversidade de espécies e a alta dominância associada à fragmentação
ambiental, principalmente em áreas de mata ciliar, influenciaram a infecção por
hantavírus em morcegos (capítulo 2).
• A massa corporal está a influenciar positivamente a infecção por hantavírus em
pequenos mamíferos terrestres (capítulo 1).
• Os morcegos e pequenos mamíferos terrestres compartilham ectoparasitos da
mesma família Macronyssidae, gênero Ornythonyssus sp. (capítulo 3).
• O roedor Necromys lasiurus apresentou a maior diversidade de ectoparasitos
dentre os pequenos mamíferos capturados (capítulo 3).
• Ectoparasitos Laelapidae, possíveis vetores e reservatórios de hantavírus, foram
encontrados em roedores Sigmodontinae (capítulo 3).
Tese de Doutorado
128
___________________________________________________________________________
10. Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
Alexeyev OA, (1992). Respiratory burst of neutrophils enhances in hemorrhagic fever
with renal syndrome (HFRS). Scand J Infect Dis. 24(6): 697-9.
Altringham J, (1996). Bats, biology and behavior, Oxford University Press, Oxford, 262
pp.
Altringham J, (2011). Bats, from evolution to conservation, 2nd ed., Ox- ford
University Press, Oxford, xv 342 pp.
Araujo J, Thomazelli LM, Henriques DA et al., (2012). Detection of hantavirus in bats
from remaining rain forest in São Paulo, Brazil. BMC Res Notes. 5:690.
Arikawa J, Takashima I, Hashimoto N, (1985). Cell fusion by haemorrhagic fever with
renal syndrome (HFRS) viruses and its application for titration of virus infectivity and
neutralizing antibody. ArchVirol. 86(3-4):303-13.
Arai S, Nguyen ST, Boldgiv B, et al., (2013). Novel bat-borne hantavirus, Vietnam.
Emerg Infect Dis. 19(7):1159-61.
Armién AG, Armién B, Koster F, et al., (2009). Hantavirus infection and habitat
associations among rodent populations in agroecosystems of Panama: implications for
human disease risk. Am J Trop Med Hyg. 81(1): 59-66.
Avsic-Zupanc T, Xiao SY, Stojanovic R, Gligic A, Van der Groen G, LeDuc JW,
(1992). Characterization of Dobrava virus: a hantavirus from slovenia, Yugoslavia. J
Med Virol. 38(2):132-7.
Baskin JA, (1989). The initial origin and diversification of the Neotropical
Sigmodontinae (Rodentia: Muridae) a perspective from the North American fossil
record. In: Abstracts of papers and posters. Fifth International Theriological Congress,
Rome. Pp. 263-64.
Bennet SN, Gu SH, Arai S, Yanagihara R (2014). Reconstructing the evolutionary
Tese de Doutorado
130
Bergoć MM, Lindić J, Kovać D et al., (2013). Successful treatment of severe hantavirus
nephritis with corticosteroids: a case report and literature review. Ther Apher Dyal.
17(4):402-6.
Black WC 4th, Doty JB, Hughes MT et al., (2009). Temporal and geographic evidence
for evolution of Sin Nombre virus using molecular analyses of viral RNA from
Colorado, New Mexico and Montana. Virol J. 6:102-17.
Björkstrom NK, Lindgren T, Stoltz M et al., (2010). Rapid expansion and long-term
persistence of elevated NK cell numbers in humans infected with hantavirus. J Exp
Med. 208(1):13–21.
Billings AN, Rollin PE, Milazzo ML et al. (2010). Pathology of black creek canal virus
infection in juvenile hispid cotton rats (Sigmodon hispidus). Vector-Borne Zoon Dis.
10(6):621-8.
Bonvicino CR, Oliveira JA, D’Andrea OS (2008). Guia dos Roedores do Brasil com
Chaves para Gêneros Baseadas em Caracteres Externos.. Rio de Janeiro (RJ): Centro
Pan-Americano de Febre Aftosa – OPAS. 120p.
Borges AA, Campos GM, Moreli ML et al., (2006). Hantavirus cardiopulmonary
syndrome: immune response and pathogenesis. Microbes Infect. 8(8): 2324-30.
Borges AA, Campos GM, Moreli ML et al. (2008). Role of mixed Th1 and Th2 serum
cytokines on pathogenesis and prognosis of hantavirus pulmonary syndrome. Microbes
Infect. 10(10-11):1150-7.
Boyles JG, Cryan PM, Mccracken GF, Kunz TH, (2011). Economic importance of bats
in agriculture. Science. 332:41-2.
Bradford JR (1916). Nephritis in the British troops in Flanders. QJM. 34:125-37.
Brook CE, Dobson AP, (2015). Bats as ‘special’ reservoirs for emerging zoonotic
pathogens. Trends Microbiol doi: 10.1016/j. tim.2014.12.004.
Tese de Doutorado
131
Burney DA, Flannery TF, (2005). Fifty millennia of catastrophic extinctions after
human contact. Trends Ecol Evol. 20(7):395-401.
Calisher CH, Childs JE, Field HE, Holmes KV, Schountz T, (2006). Bats: important
reservoir hosts of emerging viruses. Clin Microbiol Rev. 19:531-45.
Campbell AL, Naik RR, Sowards L & Stone MO, (2002). Biological infrared imaging
and sensing. Micron. 33, 211-25.
Carey DE, Reuben R, Panicker KN, Shope RE, Myers RM, (1971) Thottapalayam
virus: A presumptive arbovirus isolated from a shrew in India. Indian J Med Res.
59:1758-60.
Carmichael JA, Strauss RE, McIntyre NE, (2007). Seasonal variation of North
American form of Gigantolaelaps mattogrossensis (Acari: Laelapidae) on marsh rice rat
in southern coastal Texas. J Med Entomol. 44(1):80-4.
Clement J, Maes P, Ranst MV(2014). Hemorrhagic fever with renal syndrome in the
new, and hantavirus pulmonary syndrome in the old world: paradi(se)gm lost or
regained? Vir Res. 187:55-8.
Chen JP, Cosgriff TM, (2000). Hemorrhagic fever virus-induced changes in hemostasis
and vascular biology. Blood Coagul Fibrinol. 11(5):461-83.
Chen H, Liu H, Wang Y et al., (2014). Elevated serum IL-21 levels in hantavirusinfected patients correlate with the severity of the disease. Inflammation. 37(4):1078-83.
Cheng E, Mir MA, (2012). Signatures of host mRNA 5' terminus for efficient
hantavirus cap snatching. J Virol. 86(18):10173-85.
Chiappero MB, Gardenal CN, (2003). Restricted gene flow in Calomys musculinus
(Rodentia, Muridae), the natural reservoir of Junin virus. J Hered. 94(6):490-5.
Tese de Doutorado
132
Christofferson DE, Yuan J, (2010). Necroptosis as an alternative form of programmed
cell death. Curr Op Cell Biol. 22(2):263-8.
Connolly-Andersen AM, Ahlm K, Ahlm C, Klingströn J, (2013). Puumala virus
infections associated with cardiovascular causes of death. Emerg Infect Dis. 19(1):1268.
Cook WM, Timm RM, and Hyman DE, (2001). Ability in three Costan Rican Dry
Forest rodents. Rev Biol Trop. 49:1177-81.
Da Silva MV, Vasconcelos MJ, Hidalgo NT, Veiga AP, Canzian M, Marotto PC,
(1997). Hantavirus pulmonary syndrome. Report of the first three cases in São Paulo,
Brazil. Rev Inst Med Trop. Sao Paulo. 39(4):231-4.
D’Elía G, (2003a). In: Grzimek’s animal life encyclopedia, 2nd edition. Hutchins M,
Kleiman DG, Geist V, and McDade MC (Eds). Volumes 12 – 16, mammals I – V.
Farmington Hills, MI: Gale Group.
D’Elía G, (2003b). Phylogenetics of Sigmodontinae (Rodentia, Muroidea, Cricetidae),
with special reference to the akodont group, and with additional comments on historical
biogeography. Cladistics. 19:307–323.
D’Elía G and Pardiñas UFJ, (2007). Putting names to the phylogenetic diversity of
neotropical sigmodontine rodents: new genera for known species. Mammal. 2007;
71:146-49.
D’Elía G, Pardiñas UFJ, Jayat JP, Salazar-Bravo J, (2008). Systematics of Necromys
(Rodentia, Cricetidae, Sigmodontinae): species limits and groups, with comments on
historical biogeography. Jour Mammal. 89(3):778-90.
De la Sancha N, D’Elía, Netto F, Pérez P and Salazar-Bravo J, (2009). Discovery of
Juliomys (Rodentia, Sigmodontinae) in Paraguay, a new genus of Sigmodontinae for the
country’s Atlantic Forest. Mammal. 73:162-67.
Tese de Doutorado
133
De Sousa RLM, Moreli ML, Borges AA, et al., (2008). Natural host relationship and
genetic diversity of rodent associated hantaviruses in southeastern Brazil. Intervirol.
51(4):299-310.
Dearing DM e Dizney E, (2010). Ecology of hantavirus in a changing world. Ann NY
Acad Sci. 1195: 99-112.
Dirzo R, Young HS, Galetti, M, Ceballos, G, Isaac, NJ & Collen B, (2014). Defaunation
in the Anthropocene. Science. 345, 401-406.
Dobson GE 1875. Conspectus of the suborders, families and genera of Chiroptera
arranged according to their natural affinities. T Annals Mag Nat Hist 4(16): 345-57.
Duchin JS, Koster FT, Peters CJ et al., (1994). Hantavirus pulmonary syndrome: a
clinical description of 17 patients with a newly recognized disease. The Hantavirus
Study Group. N Engl J Med. 330(14):949-55.
Easterbrook JD, Klein SL, (2008). Immunological mechanisms mediating hantavirus
persistence in rodent reservoirs. PloS Pathog. 4(11):e1000172.
Elliot RM, Schmaljohn CS. Bunyaviridae, (2013). In: Knipe DM, Howley PM, Griffin
DE, Lamb RA, Martin MA, Roizman B, Straus SE (ed.), Fields Virology, 6th ed., vol.
1. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA; 1282p.
Emmons LH, (1999). Two new species of Juscelinomys (Rodentia: Muridae) from
Bolivia. Am Mus Nov. 3280:1-15.
Ernest KA, and Mares MA, (1986). Ecology of Nectomys squamipes, the neotropical
water rat, in central Brazil: home range, habitat selection, reproduction and behaviour. J
Zool Lond. 210:599-612.
Fan W, Liu X, Yue J (2012). Determination of urine tumor necrosis factor, IL-6, IL-8,
and serum IL-6 in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. Braz J Infect
Dis. 16(6)527-30.
Tese de Doutorado
134
Fenton MB, (1983). Just bats, University of Toronto Press, Toronto, 165 pp.
Fenton MB e Simmons NB, (2015). Bats, a world of science and mystery, The
University of Chicago Press, Chicago, 303 pp.
Figueiredo LTM, Campos GM, Rodrigues FB, (2001). Hantavirus pulmonary and
cardiovascular syndrome: epidemiology, clinical presentation, laboratory diagnosis and
treatment. Rev Soc Bras Med Trop. 34(1):13-23. Portuguese.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Campos GM, Sousa RLM, (2003). Hantaviruses in Sao
Paulo State, Brazil. Emer Infec Dis. 9(7):891-2.
Figueiredo LTM, (2004). Hantaviroses. In: Cinerman S, Cinerman B. Condutas em
infectologia. São Paulo: Editora Atheneu; p.123-132. Portuguese.
Figueiredo LTM, (2006). Viral hemorrhagic fevers in Brazil. Rev Soc Bra Med Trop.
39(2):203-10. Portuguese.
J Med Biol Res. 41(7):596-9.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Sousa RLM et al., (2009a), Distinct hantaviruses causing
pulmonary syndrome in central plateau, southeastern and southern brazil. Emerg Infect
Dis. 15(4): 561-7.
Figueiredo LTM, Moreli ML, Borges AA, et al., (2009b). Evaluation of an enzymelinked immunosorbent assay based on Araraquara virus recombinant nucleocapsid
Firth C, Tokarz R, Simith DB et al., (2012). Diversity and distribution of hantaviruses in
south america. J Virol. 86(24)13756-66.
Tese de Doutorado
135
Foley JA, Defries R, Asner GP, et al., (2005). Global consequences of land use.
Science. 309(5734):570-4.
Garcin D, Lezzi M, Dobbs M et al., (1995). The 5' ends of Hantaan virus
(Bunyaviridae) RNAs suggest a prime-and-realign mechanism for the initiation of RNA
synthesis. J Virol. 69(9)5754-62.
Garry CE, Garry RF, (2004). Proteomics computational analyses suggest that the
carboxyl terminal glycoproteins of Bunyaviruses are class II viral fusion protein (betapenetrenes). Theor Biol Med Model. 1:10.
Gavrilovskaya IN, Shepley M, Shaw R, Ginsberg MH, Mackow ER, (1998). Beta3
integrins mediate the cellular entry of hantaviruses that cause respiratory failure. Proc
Natl Acad Sci USA. 95:7074-79.
Gavrilovskaya IN, Gorbunova EE, Mackow NA, (2008). Hantaviruses direct endothelial
cell permeability by sensitizing cells to the vascular permeability factor VEGF, while
angiopoietin 1 and sphingosine 1-phosphate inhibit hantavirus-directed permeability. J
Virol. 82(12):5797-806.
Gavrilovskaya I., Gorbunova E., Matthys V et al., (2012). The role of the endothelium
in hps pathogenesis and potential therapeutic approaches. Adv Virol. 2012:467059.
Gavrilovskaya IN, Gorbunova EE, Mackow ER, (2013). Hypoxia induces permeability
and giant cell responses of andes virus-infected pulmonary endothelial cells by
activating the mTOR-S6K signaling pathway. J Virol. 87(23) 12999-3008.
Ghizoni IRJ, Layme VMG, Lima AP, and Magnusson WE, (2005). Spatially explicit
population dynamics in a declining population of the tropical rodent, Bolomys lasiurus.
J Mammal. 86(4):677-82.
Gizzi M, Delaere B, Weynand B et al., (2013). Another case of “European hantavirus
pulmonary syndrome” with severe lung, prior to kidney, involvement, and diagnosed by
viral inclu- sions in lung macrophages. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 32(10)1341-5.
Tese de Doutorado
136
Goldsmith CS, Elliott LH, Peters CJ, Zaki SR, (1995). Ultrastructural characteristics of
sin nombre virus, causative agent of hantavirus pulmonary syndrome. Arch Virol.
140(12):2107-22.
Gonçalves PR, Oliveira JA (2004). Morphological and genetic variation between two
sympatric forms of Oxymycterus (Rodentia: Sigmodontinae): an evaluation of
hypotheses of differentiation within genus. J Mammal. 85(1):148-61.
Gottdenker NL, Streicker DG, Faust CL, Carroll CR, (2014). Anthropogenic Land Use
Change and Infectious Diseases: A Review of the Evidence. EcoHealth.
doi:10.1007/s10393-014-0941-z.
Gu SH, Lim BK, Kadjo B et al., (2014). Molecular Phylogeny of Hantaviruses
Harbored by Insectivorous Bats in Côte d’Ivoire and Vietnam. Viruses. 6(5):1897-910.
Guo WP, Lin XD, Wang W et al., (2013). Phylogeny and origins of hantaviruses
Gupta S, Braun M, Tischler ND et al., (2013). Hantavirus-infection confers resistance to
cytotoxic lymphocyte-mediated apoptosis. PloS Pathog. 9(3):e1003272.
Hammerbeck CD, Hooper JW, (2011). T cells are not required for pathogenesis in the
syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. J Virol. 85(19)9929-44.
Hardestam J, Simon M, Hedlund KO et al., (2007). Ex vivo stability of the rodent-borne
hantaan virus in comparison to that of arthropod-borne members of the bunyaviridae
family. Appl Env Microbiol. 73(8)2547-51.
Hardestam J, (2008). Hantaviruses – shedding, stability and induction of apoptosis.
[Doctoral thesis]. Hillarpssalen: Karolinska Institutet.
Hepojoki J, Strandin T, Vaheri A, Lankinen H, (2010a). Interactions and
oligomerization of hantavirus glycoproteins. J Virol. 84(1):227-42.
Tese de Doutorado
137
Hepojoki J, Strandin T, Wang H et al., (2010b). Cytoplasmic tails of hantavirus
glycoproteins interact with the nucleocapsid protein. J Gen Virol. 91(Pt 9):2341-50.
Hepojoki J, Strandin T, Lankinen H, Vaheri A, (2012), Hantavirus structure - molecular
interactions behind the scene. J Gen Virol. 93(Pt 8):1631-44.
Hindrichsen S, Medeiros de Andrade A, Clement J et al., (1993). Hantavirus infection
in Brazilian patients from Recife with suspected leptospirosis. Lancet. 341(8836):50.
Houck MA, Qin H, Roberts HR, (2001). Hantavirus transmission: potential role of
ectoparasites. Vector Borne Zoonotic Dis. 1(1):75-9.
Huiskonen JT, Hepojoki J, Laurinmäki P et al., (2010). Electron cryotomography of tula
hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. J Virol.
(10)4889-97.
Hussein ITM, Cheng E, Ganaie SS et al., (2012). Autophagic clearance of sin nombre
hantavirus glycoprotein gn promotes virus replication in cells. J Virol. 86(14):7520-9.
Iversson LB, Da Rosa AP, Rosa MD, Lomar AV, Sasaki MG, Leduc JW, (1994).
Human infection by hantavirus in southern and southeastern Brazil. Rev Assoc Med
Bras. 40(2):85-92. Portuguese.
Johnson AM, de Souza LT, Ferreira IB et al., (1999). Genetic investigation of novel
hantaviruses causing fatal HPS in Brazil. J Med Virol. 59(4):527-35.
Johnson KM, (2001). Hantaviruses: history and overview. Curr Top Microbiol
Immunol. 256:1-14.
Jones KE, Patel NG, Levy MA et al., (2008). Global trends in emerging infectious
diseases. Nature. 451(7181):990-3.
Jonsson CB, Schmaljohn CS, (2001). Replication of hantaviruses. Curr Top Microbiol
Immunol. 256:15-32.
Tese de Doutorado
138
Kallio E.R., Voutilainen L., Vapalahti O et al., (2007). Endemic hantavirus infection
impairs the winter survival of its rodent host. Ecology. 88(8):1911-6.
Kang HJ, Bennett SN, Hope AG, Cook JA and Yanagihara R, (2011). Shared ancestry
between a newfound mole-borne hantavirus and hantaviruses harbored by Cricetid
rodents J Virol. 85(15):7496.
Khaiboullina SF, St Jeor SC, (2002). Hantavirus immunology. Viral Immunol.
15(4):609-25.
Khaboullina SF, Moruzov SP, St Jeor SC, (2005). Hantaviruses: molecular biology,
evolution and pathogenesis. Curr Mol Med. 5(8):773-90.
Khaiboullina S.F., Martynova E.V., Khamidullina Z.L et al., (2014). Upregulation of
IFN-γ and IL-12 is associated with a milder form of hantavirus hemorrhagic fever with
renal syndrome. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33(12):2149-56.
Kim S, Sung HS, An HR et al., (2010) A case report of crescentic glomerulonephritis
associated with Hantaan virus infection. Nephrol Dial Transplant. 25(8)2790-2.
King AMQ, Lefkowitz E, Adams MJ e Carstens EB. Bunyaviridae, (2012). In: Virus
Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.
International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Inc. 725-41 Pg.
Klempa B, Schmidt HA, Ulrich R et al., (2003). Genetic interaction between distinct
Dobrava hantavirus subtypes in Apodemus agrarius and A. flavicollis in nature. J Virol.
77(1):804-9.
Klempa B, Fichet-Calvet E, Lecompte E et al., (2007). Novel hantavirus sequences in
shrew, Guinea. Emerg Infect Dis. 13(3):520-2.
Tese de Doutorado
139
Klingström J, Heyman P, Escutenaire S, et al., (2002). Rodent host specificity of
European hantaviruses: evidence of Puumala virus interspecific spillover. J Med Virol.
68(4):581-8.
Klingström J, Hardestam J, Stoltz M et al., (2006). Loss of cell membrane integrity in
puumala hantavirus-infected patients correlates with levels of epithelial cell apoptosis
and perforin. J.Virol. 80(16)8279-82.
Koivula TT, Tuulasvara A, Hetemäki L et al., (2014). Regulatory T cell response
correlates with the severity of human hantavirus infection. J Infect. 68(4)387-94.
Koopman KF, (1994). In: Chiroptera: systematics. Handbuch der zoologie Vol. 8, part
60, Mammalia, Walter de Gruyter, Berlin, 217 pp.
Korva M, Duh D, Saksida A, Trilar T, Avsic-Zupanc T, (2009). The hantaviral load in
tissues of naturally infected rodents. Microb Infect. 11(3):344-51.
Krautkrämer E, Zeier M, (2008). Hantavirus causing hemorrhagic fever with renal
syndrome enters from the apical surface and requires decay-accelerating factor
(DAF/CD55). J Virol. 82(9):4257-64.
Krautkrämer E, Lehmann MJ, Bollinger V, Zeier M, (2012). Polar release of pathogenic
Old World hantaviruses from renal tubular epithelial cells. Virol J. 9:299.
Krautkrämer E., Zeier M., Plyusnin A, (2013). Hantavirus infection: an emerging
infectious disease causing acute renal failure. Kidney Int. 83(1):23-7.
Laconi MR, and Castro-Vásquez A, (1998). Precopulatory fighting and other agressive
interactions during mating encounter in the corn mouse, Calomys musculinus (Muridae:
Sigmodontinae). Mast Neot. 5:21-8.
Lasserre A, Cebral E, and Vitullo AD, (2000). Successful capacitation and homologous
fertilization in vitro in Calomys musculinus and Calomys laucha (Rodentia:
Sigmodontinae). J Rep Fert. 120:41-7.
Tese de Doutorado
140
LeDuc JW, Smith GA, Pinheiro FP, Vasconcelos PF, Rosa ES, Maiztegui JI, (1985).
Isolation of a Hantaan-related virus from Brazilian rats and serologic evidence of its
widespread distribution in South America. Am J Trop Med Hyg. 34(4):810-5.
Larson RS, Brown DC, Ye C, Hjelle B, (2005). Peptide antagonists that inhibit Sin
Nombre virus and Hantaan virus entry through the beta3- integrin receptor. J Virol.
79:7319-26.
Lee HW, Lee PW, Johnson KM, (1978). Isolation of the etiologic agent of Korean
hemorrhagic fever. J Infect Dis. 137(3):298-308.
Lee HW, Baek LJ, Johnson KM, et al., (1982). Isolation of Hantaan virus, the etiologic
agent of Korean hemorrhagic fever from wild urban rats. J Infect Dis. 146(5):638-44.
Le Negrate G, (2012). Viral interference with innate immunity by preventing NF-κB
activity. Cell Microbiol. 14(2):168-81.
Li W e Klein S, (2012). Seoul virus-infected rat lung endothelial cells and alveolar
macrophages differ in their ability to support virus replication and induce regulatory T
cell phenotypes. J Virol. 86(21):11845-55.
Lima M, Keymer JE, and Jaksic MF, (1999). El Niño–Southern Oscillation–driven
rainfall variability and delayed density dependence cause rodent outbreaks in western
South America: linking demography and population dynamics. Am Nat Vol. 153:47691.
Luna L e Patterson BD, (2003). A remarkable new mouse (Muridae: Sigmodontinae)
from Southeastern Peru: with comments on the affinities of Rhagomys rufescens
(Thomas, 1886). Fieldiana Zoo. N.S. 101:1-24.
Lütteke N, Raftery MJ, Lalwani P et al., (2010). Switch to high-level virus replication
and HLA class I upregulation in differentiating megakaryocytic cells after infection
with pathogenic hantavirus. Virology. 405(1)70-80.
Tese de Doutorado
141
Lyman CP, (1970). Thermoregulation and metabolism in bats. In: W. A. Wimsatt (ed.),
Biology of bats. Academic Press, New York, N.Y. p. 301-30.
Machado AM, Figueiredo GG, Sabino dos Santos Jr G, Figueiredo LTM, (2009).
Laboratory diagnosis of human hantavirus infection: novel insights and future potential.
Fut Virol. 4(4):383-89.
Mahmud-Al-Rafat A, Taylor-Robinson AW, (2014). Emergence and persistence of
hantavirus in rodent reservoirs: role of glucocorticoid hormone. Imm Dis. 2:a9.
Mackow ER e Gavrilovskaya IN, (2009). Hantavirus regulation of endothelial cell
functions. Thromb Haemost. 102(6):1030-41.
Mackow ER, Dalrymple N, Cimica V, Matthys V, Gorbunova E, Gavrilovskaya I,
(2014). Hantavirus interferon regulation and virulence determinants. Virus Res. 187:6571.
Maes P, Clement J, Gavrilovskaya I, Van Ranst M, (2004). Hantaviruses: immunology,
treatment, and prevention. Viral Immunol. 17(4):481-97.
Mann G (1945). Mamíferos de Tarapacá. Biológica. 2:23-98.
Matson JO, Abravaya JP, (1977). Blarinomys breviceps. Mammal Spec. 74:1-3.
McCaughey C, Shi X, Elliot RM, Wyatt DE, O’Neill HJ, Coyle PV, (1999). Low pHinduced cytopathic effect--a survey of seven hantavirus strains. J Virol Methods. 81(12):193-7.
McNulty S, Flint M, Nichol ST, Spiropolou C, (2013). Host mTORC1 signaling
regulates andes virus replication. J Virol. 87(2)912-22.
Mendes WS, Aragao NJL, Santos HJ et al., (2001). Hantavirus pulmonary syndrome in
Anajatuba, Maranhão, Brazil Case Reports. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2001;
43:237-40.
Tese de Doutorado
142
Mills JN, Ksiazek TG, Ellis BA, Rollin PE, Nichol ST, Yates TL et al., (1997). Patterns
of association with host and habitat: antibody reactive with Sin Nombre vírus in small
mammals in the major biotic communities of the Southeastern United States. Am J Trop
Med Hyg. 56(3):273-84.
Mir MA, Duran WA, Hjelle BL, Ye C, Panganiban AT, (2008). Storage of cellular 5’
mRNA caps in P bodies for viral cap-snatching. Proc Natl Acad Sci U S A.
105(49):19294-9.
Moratelli R e Calisher CH, (2015). Bats and zoonotic viruses: can we confidently link
bats with emerging deadly viruses? Mem Inst Oswaldo Cruz 110(1):1-22.
Morens DM, Folkers GK, Fauci AS, (2004). The challenge of emerging and reemerging infectious diseases. Nature. 430(6996):242-9.
Morzunov SP, Rowe JE, Ksiazek TG, et al., (1998). Genetic analysis of the diversity
and origin of hantaviruses in Peromyscus leucopus mice in North America. J Virol 72:
57-64.
Mou DL, Wang YP, Huang CX et al., (2006). Cellular entry of Hantaan virus A9 strain:
specific interactions with beta3 integrins and a novel 70kDa protein. Biochem Biophys
Res Commun. 339(2):611-7.
Murphy WJ, Eizirik E, O’Brien SJ, et al., (2001). Resolution of the early placental
mammal radiation using Bayesian phylogenetics. Science. 294(5550):2348-51.
Musser GG, Carleton MD, (2005). Superfamily Muroidea. In Mammal Species of the
World: A Taxonomic and Geographic Reference; Wilson, D.E., Reeder, D.M., Eds.;
Johns Hopkins University Press: Baltimore, MD, USA, 849-1531pp.
Tese de Doutorado
143
Myhrman G, (1951). Nephropathia Epidemica, a new infectious disease in Northern
Scandinavia. Acta Med Scand. 140(1):52-6.
Netski D, Thran BH, St Jeor SC, (1999). Sin Nombre Virus Pathogenesis in Peromyscus
maniculatus. J Virol. 73(1)585-91.
Neuweiler G, (2000). The biology of bats. New York: Oxfor University Press. 310p.
Nichol ST, Spiropoulou CF, Morzunov S et al., (1993). Genetic identification of a
hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness. Science.
262(5135):914-7.
Oliveira RC, Guterres A, Fernandes J, D’Andrea PS, Bonvicino CR, Lemos ERS,
(2014a). Hantavirus reservoirs: current status with an emphasis on data from Brazil.
Viruses. 6:1929-73.
Oliveira RC, Cordeiro-Santos M, Guterres A, et al., (2014b). Rio Mamoré Virus and
Hantavirus Pulmonary Syndrome, Brazil. Emerg Infect Dis. 20(9):1568-70.
Olsson GE, Leirs H, Henttonen H, (2010). Hantaviruses and their hosts in Europe:
reservoirs here and there, but not everywhere? Vector Borne Zoonotic Dis. 10:(6)54961.
O’Shea TJ, Cryan PM, Cunningham AA, Fooks AR, Hayman DTS, Luis AD, Peel AJ,
Plowright RK, Wood JLN, (2014). Bat flight and zoonotic viruses. Emerg Infect Dis.
20:741-45.
Ostfeld R e Keesing F, (2000). The function of biodiversity in the ecology of
vectorborne zoonotic diseases. Can J Zool. 78:2061-78.
Ostfeld RS e LoGiudice K, (2003). Community disassembly, biodiversity loss, and the
erosion of an ecosystem service. Ecology. 84:1421-27.
Tese de Doutorado
144
Passaro DJ, Shieh WJ, Hacker JK et al., (2001). Predominant kidney involvement in a
fatal case of hantavirus pulmonary syndrome caused by Sin Nombre virus. Clin Infect
Dis. 33(2):263-4.
Peebles RS Jr, Graham BS, (2001). Viruses, dendritic cells and the lung. Respir Res.
2(4):245-9.
Pepini T, Gorbunova EG, Gavrilovskaya IN, Mackow JE, Mackow ER, (2010). Andes
virus regulation of cellular microRNAs contributes to hantavirus-induced endothelial
cell permeability. J Virol. 84(22)11929-36.
Pettersson L, Thunberg T, Rocklov J et al., (2014). Viral load and humoral immune
response in association with disease severity in Puumala hantavirus-infected patients implications for treatment. Clin Microbiol Infect. 20(3):235-41.
Plyusnin A, Vapalahti O, Vaheri A, (1996). Hantaviruses: genome structure, expression
and evolution. J Gen Virol. 77(Pt 11):2677-87.
Plyusnin A, (2002). Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy. Arch Virol.
147(4):665-82.
Plyusnin A e Sironen T, (2014). Evolution of hantaviruses: Co-speciation with reservoir
hosts for more than 100 MYR. Vir Res. 17(187):22-6.
Podlutsky AJ, Khritankov AM, Ovodov ND, Austad SN, (2005). A new field record for
bat longevity. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 60:1366-68.
Popugaeva E, Witkowski PT, Schlegel M et al., (2012). Dobrava-Belgrade hantavirus
from Germany shows receptor usage and innate immunity induction consistent with the
pathogenicity of the virus in humans. PLoS One. 7(4):e35587.
Raboni SM, Hoffmann FG, Oliveira RC et al., (2009). Phylogenetic characterization of
hantaviruses from wild rodents and HPS cases in the state of Paraná (Southern Brazil). J
Gen Virol. 90(Pt 9):2166-71.
Tese de Doutorado
145
Ramanathan HN, Jonsson CB, (2008). New and Old World hantaviruses differentially
utilize host cytoskeletal components during their life cycles. Virology. 374(1):138-50.
Ramanathan HN, Chung DH, Plane SJ et al., (2007). Dynein-dependent transport of the
hantaan virus nucleocapsid protein to the endoplasmic reticulum-Golgi intermediate
compartment. J Virol. 81(16):8634-47.
Ramsden C, Melo FL, Figueiredo LTM, et al., (2008). High rates of molecular
evolution in hantaviruses. Mol Biol Evol. 25(7): 1488-92.
Ramsden C, Holmes EC, Chalerston MA, (2009). Hantavirus Evolution in Relation to
Its Rodent and Insectivore Hosts: No Evidence for Codivergence. Mol Biol Evol. 26(1):
143-53.
Rasmuson J, Andersson C, Norrman E, Haney M, Evander M, Ahlm C, (2011). Time to
revise the paradigm of hantavirus syndromes? Hantavirus pulmonary syndrome caused
by European hantavirus. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30(5):685-90.
Ravkov EV, Nichol ST, Compans RW, (1997). Polarized entry and release in epithelial
cells of Black Creek Canal virus, a New World hantavirus. J Virol. 71(2):1147-54.
Razzauti M, Plyusnina A, Sironen T, Henttonen H, Plyusnin A, (2009). Analysis of
Puumala hantavirus in a bank vole population in northern Finland: evidence for cocirculation of two genetic lineages and frequent reassortment between strains. J Gen
Virol. 90(Pt 8):1923-31.
Reig AO, (1987). An assessment of the systematics and evolution of the Akodontini,
with the description of new fossil species of Akodon (Cricetidae: Sigmodontinae).
Fieldiana Zool. N.S. 39:347-99.
Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA, Lima IP, (2011). Mamíferos do Brasil. UEL Bibliot
Tese de Doutorado
146
Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA, Lima IP, (2007). Morcegos do Brasil. UEL Bibliot
Reis NR, Fregonezi MN, Peracchi AL, Shibatta OA, (2013). Morcegos do Brasil, guia
de campo. Technical Books. Rio de Janeiro. 1 ed. 252p.
Rizvanov AA, Khaiboullina SF, St Jeor S, (2004). Development of reassortant viruses
between pathogenic hantavirus strains. Virology. 327(2):225-32.
Rodriguez LL, Owens JH, Peters CJ et al., (1998). Genetic reassortment among viruses
causing hantavirus pulmonary syndrome. Virology. 242(1):99-106.
Rosa ES, Mills JM, Padula PJ, et al., (2005). Newly recognized hantaviruses associated
with hantavirus pulmonary syndrome in northern Brazil: partial genetic characterization
of viruses and serologic implication of likely reservoirs. Vec Bor Zoon Dis. 5:11-9.
Rosa EST, Lemos ERS, Medeiros DBA, et al., (2010). Hantaviruses and hantavirus
pulmonary syndrome, Maranhão, Brazil. Emerg Infect Dis. 16(12):1952-55.
Rowe RK, Pekosz A, (2006). Bidirectional virus secretion and nonciliated cell tropism
following Andes virus infection of primary airway epithelial cell cultures. J Virol.
80(3):1087-97.
Sabino-Santos Jr G, (2010). Detecção de hantavírus em roedores silvestres e estudo de
sua dinâmica populacional na região nordeste do estado de São Paulo. [Dissertação de
Mestrado]. São Paulo: Univ. de São Paulo.
Sabino-Santos Jr G, Maia FGM, Vieira TM, et al., (2015). Evidence of Hantavirus
Infection Among Bats In Brazil. Am J Trop Med Hyg. (in press).
Saggioro FP, Rossi MA, Duarte MIS et al., (2007). Hantavirus induces a typical
myocarditis that may be responsible for myocardial depression and shock in hantavirus
pulmonary syndrome. J Infect Dis. 195(10):1541-9.
Tese de Doutorado
147
Salkeld DJ, Lane RS, (2010). Community ecology and disease risk: lizards, squirrels,
and the Lyme disease spirochete in California, USA. Ecol. 91(1):293-8.
Schmidt-Chanasit J, Essbauer S, Petraytite R et al., (2010). Extensive host sharing of
central European Tula virus. J Virol. 84(1)459-74.
Schountz T, Prescott J, Cogswell AC et al., (2007). Regulatory T cell-like responses in
deer mice persistently infected with Sin Nombre virus. Proc Natl Acad Sci U S A.
104(39):15496-501.
Schönrich G, Rang A, Lütteke N, Raftery MJ, Charbonnel N, Ulrich RG, (2008).
Hantavirus-induced immunity in rodent reservoirs and humans. Immunol Rev. 225:16389.
Seim I, Fang X, Xiong Z, Lobanov AV, Huang Z, Ma S, Feng Y, Tura-nov AA et al.,
(2013). Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s
bat Myotis brandtii. Nat Commun. 4:1-8.
Shin OS, Song GS, Kumar M, Yanagihara R, Lee HW, Song JW, (2014). Hantaviruses
induce antiviral and pro-inflammatory innate immune responses in astrocytic cells and
the brain. Viral Immunol. 27(6):256-66.
Smits SL and Osterhaus ADME, (2013). Virus discovery: one step beyond. Curr Opin
Virol. 3:1-6.
Sironen T, Klingstrom J, Vaheri A, Andersson LC, Lundkvist A, Plyusnin A, (2008).
Pathology of puumala hantavirus infection in macaques. PLoS One. 3(8):e3035.
Song JW, Song KJ, Baek LJ, Frost B, Poncz M, Park K, (2005). In vivo characterization
of the integrin beta3 as a receptor for Hantaan virus cellular entry. Exp Mol Med.
37(2):121-7.
Tese de Doutorado
148
Spengler JR1, Haddock E, Gardner D, Hjelle B, Feldmann H, Prescott J, (2013).
Experimental Andes virus infection in deer mice: characteristics of infection and
clearance in a heterologous rodent host. PLoS One. 8(1):e55310.
Spiropoulou CF, Goldsmith CS, Shoemaker TR, Peters CJ, Compans RW, (2003). Sin
Nombre virus glycoprotein trafficking. Virology. 308(1):48-63.
Springer MS, Teeling EC, Madsen O, Stanhope MJ, Jong WW, (2001). Integrating
fossil and molecular data reconstruct bat echolocation. Proc Natl Acad Sci USA. 98:
6241-46.
Steppan SJ, (1995). Revision of the tribe Phyllotini (Rodentia: Sigmodontinae), with a
phylogenetic hypothesis for the Sigmodontinae. Fieldiana Zool. N.S. 80:1-112.
Stoltz M, Ahlm C, Lundkvist A, Klingström J, (2007). Lambda interferon (IFN-l) in
serum is decreased in hantavirus-infected patients, and in vitro-established infection is
insensitive to treatment with all IFNs and inhibits IFN-gamma-induced nitric oxide
production. J Virol. 81(16):8685-91.
Strandin T, (2011). Hantavirus infection: insights into entry, assembly and
pathogenesis. [Doctoral thesis]. Helsinki: Univ.Helsinki.
Strandin T1, Hepojoki J, Wang H, Vaheri A, Lankinen H, (2011). The cytoplasmic tail
of hantavirus Gn interacts with RNA. Virology. 418(1):12-20.
Sundström K, (2013). Of voles and men: novel hantavirus in vitro models. [Doctoral
thesis]. Hillarpssalen: Karolinska Institutet.
rodent diversity causing increased hantavirus prevalence. PLoS One. 4(5):e5461.
Tese de Doutorado
149
Suzuki A, Bisordi I, Levis S, et al., 2004. Identifying rodent hantavirus reservoirs,
Brazil, Emerg Infect Dis. 10(12):2127-34.
Temonen M1, Mustonen J, Helin H, Pasternack A, Vaheri A, Holthöfer H, (1996).
Cytokines, adhesion molecules, and cellular infiltration in nephropathia epidemica
kidneys: an immunohistochemical study. Clin Immunol Immunopathol. 78(1):47-55.
Terajima M, Ennis FA, (2011). T cells and pathogenesis of hantavirus cardiopulmonary
syndrome and hemorrhagic fever with renal syndrome. Viruses. 3(7):1059-73.
Tischler ND, Gonzalez A, Perez-Acle T, Rosemblatt M, Valenzuela PD, (2005).
Hantavirus Gc glycoprotein: evidence for a class II fusion protein. J Gen Virol. 86(Pt
11):2937-47.
Travassos da Rosa ES, Medeiros DBA, et al., (2012). Molecular epidemiology of
Laguna Negra virus, Mato Grosso State, Brazil. Emerg. Infect. Dis. 18:982-85.
Tsai TF, Bauer SP, Sasso DR et al., (1985). Serological and virological evidence of a
Hantaan virus-related enzootic in the United States. J Infect Dis. 152(1):126-36.
Vaheri A, Strandin T, Hepojoki J et al. (2013). Uncovering the mysteries of hantavirus
infections. Nat Rev Microbiol. 11(8):539-50.
Van Den Bussche RA, Hoofer SR, (2004). Phylogenetic relationships among recent
chiropteran families and the importance of choos- ing appropriate out-group taxa. J
Mammal. 85:321-30.
Vapalahti O, Mustonen J, Lundkvist A, Henttonen H, Plyusnin A, Vaheri A, (2003).
Hantavirus infections in Europe. Lancet Infect Dis. 3(10):653-61.
Vasconcelos MI, Lima VP, Iversson LB, et al., (1997). Hantavirus pulmonary syndrome
in the rural area of Juquitiba, São Paulo metropolitan area, Brazil. Rev Inst Med Trop.
São Paulo. 39(4):237-8.
Tese de Doutorado
150
Vera-Otarola J, Solis L, Soto-Rifo R et al., (2012) The Andes hantavirus NSs protein is
expressed from the viral small mRNA by a leaky scanning mechanism. J Virol.
86(4)2176-87.
Villalpando G, Vargas J, and Salazar-Bravo J, (2006). First Record of Rhagomys
(Mammalia: Sigmodontinae) in Bolivia. Mast Neot. 13(1):143-49.
Yanagihara R, Daum CA, Lee PW et al., (1987). Serological survey of Prospect Hill
virus infection in indigenous wild rodents in the USA. Trans R Soc Trop Med Hyg.
81(1):42-5.
Walter CT e Barr JN, (2011). Recent advances in the molecular and cellular biology of
bunyaviruses. J Gen Virol. 92(Pt 11):2467-84.
Weiss S, Witkowski PT, Auste B et al., (2012). Hantavirus in Bat, Sierra Leone. Emerg
Infect Dis. 18(1):159-61.
Weksler M, Percequillo AR, and Voss RS, (2006). Ten New Genera of Oryzomyine
Rodents (Cricetidae: Sigmodontinae). Am Mus Nat His. 3537:29p.
White JM, Delos SE, Brecher M, Schornberg K, (2008). Structures and mechanisms of
viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Crit Rev
Biochem Mol Biol. 43(3):189-219.
Wilkinson GS e South JM, (2002). Life history, ecology and longevity in bats. Aging
Cell. 1:124-31.
Wilson DE, (1973). Bat faunas: a trophic comparison. Syst Zool. 22:14-29.
Wilson DE, (1997). Bats in question: the Smithsonian answer book, Smithsonian
Institution Press, Washington DC, 168 pp.
Tese de Doutorado
151
Zeier M, Handermann M, Bahr U et al., (2005). New ecological aspects of hantavirus
infection: a change of a paradigm and a challenge of prevention--a review. Virus Gen.
30(2)157-80.
Zeller HG, Karabatsos N, Calisher CH et al., (1989). Electron microscopic and
antigenic studies of uncharacterized viruses. II. Evidence suggesting the placement of
viruses in the family Bunyaviridae. Arch Virol. 108(3-4)211-27.
Tese de Doutorado
152
___________________________________________________________________________
11. Anexo
Am. J. Trop. Med. Hyg., 00(0), 2015, pp. 000–000
doi:10.4269/ajtmh.15-0032
Copyright © 2015 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene
Evidence of Hantavirus Infection among Bats in Brazil
Gilberto Sabino-Santos Jr.,* Felipe Gonçalves Motta Maia, Thallyta Maria Vieira, Renata de Lara Muylaert,
Sabrina Miranda Lima, Cristieli Barros Gonçalves, Patricia Doerl Barroso, Maria Norma Melo, Colleen B. Jonsson,
Douglas Goodin, Jorge Salazar-Bravo, and Luiz Tadeu Moraes Figueiredo
AU1 Center for Virology Research, School of Medicine in Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil; Department of Microbiology,
Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, Brazil; Department of Parasitology, Institute of Biological Sciences,
Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil; Department of Ecology, São Paulo State University, Rio Claro, Brazil;
Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville Center for Predictive Medicine for Biodefense and
Emerging Infectious Diseases, Louisville, Kentucky; Department of Microbiology, National Institute for Mathematical and
Biological Synthesis, Knoxville, Tennessee; Department of Geography, Kansas State University, Manhattan, Kansas;
Department of Biological Sciences, Texas Tech University, Lubbock, Texas
Abstract. Hantaviruses are zoonotic viruses harbored by rodents, bats, and shrews. At present, only rodent-borne
hantaviruses are associated with severe illness in humans. New species of hantaviruses have been recently identified
in bats and shrews greatly expanding the potential reservoirs and ranges of these viruses. Brazil has one of the highest
incidences of hantavirus cardiopulmonary syndrome in South America, hence it is critical to know what is the prevalence
of hantaviruses in Brazil. Although much is known about rodent reservoirs, little is known regarding bats. We captured
270 bats from February 2012 to April 2014. Serum was screened for the presence of antibodies against a recombinant
nucleoprotein (rN) of Araraquara virus (ARAQV). The prevalence of antibody to hantavirus was 9/53 with an overall
seroprevalence of 17%. Previous studies have shown only insectivorous bats to harbor hantavirus; however, in our study,
of the nine seropositive bats, five were frugivorous, one was carnivorous, and three were sanguivorous phyllostomid bats.
AU2
T1 ; F1
AU3
cryovials and flash-frozen in liquid nitrogen. At sites 4 and 5,
five specimens per trap-night were randomly selected for blood
collection. All bats were handled and sampled according to
Sikes and others10 guidelines. This research project, along with
its procedures and protocols, is in accordance with Brazilian
environment and wildlife protection laws and regulations, and
have been approved by the Chico Mendes Institute of Biodiversity Conservation (Ministry of Environment), protocols
nos. 19838-1 and 41709-3. It has also been approved by the
Ethics Committee for Animal Research of University of São
Paulo and Federal University of Minas Gerais (nos. 020/2011
and 333/2013, respectively). From 270 captured bats, 53 were
bled for detection of immunoglobulin G (IgG) antibodies to
rN-ARAQV by indirect enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) using anti-bat (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery,
TX) secondary antibody. This ELISA, as previously described,
showed 97.2% sensitivity, 100% specificity, 100% positive predictive value, and 98.1% negative predictive value when compared
with an IgG-ELISA using rN antigen of Andes virus, which is the
serological test for hantavirus most used in South America.11,12
Nine bats had IgG antibodies to ARAQV, which represents
an overall seroprevalence of 17%. Five of these bats were from
São Paulo state and four were from Minas Gerais state. Of
these, five were frugivorous, one was carnivorous, and three
were sanguivorous (Table 2). From these infected bats, seven
were males and two were females. We found more infected
bats in the rainy season (N = 6) than in the dry season (N = 3).
Bats evolution is dated around 50 million years ago, and
they are distributed widely in the world, on all continents,
except Antarctica.2,13 Perhaps, because of their ancient origin
certain viruses seem to be coevolved with them. Thus, maintenance and transmission of these viruses crossed species barriers
to infect wild and domestic mammals and also humans.2,13,14
Antibodies to viruses such as Hendra, Ebola, and severe acute
respiratory syndrome (SARS)-like coronavirus (CoV) have
been detected in wild bats, demonstrating that these animals
are able to mount an antibody response, including IgM, IgE, IgA,
and multiple IgG classes.14 Although bats may be persistently
Hantaviruses (family Bunyaviridae) are present throughout
the globe in rodents, bats, and shrews.1 Humans exposed to
rodent excreta from hantaviral reservoirs may develop lifethreatening diseases. However, none of the other reservoirs
are associated with human illness presently.1,2 Bats (order
Chiroptera) are known to harbor a broad diversity of emerging
zoonotic pathogens.2 Their ability to fly and social behavior
favors maintenance, evolution, and spread of pathogens.1,2
The prevailing hypothesis has been that hantaviruses have
coevolved with their rodent reservoirs over millions of years.1,3
With the recognition of new species of hantavirus in bats in
Africa and Asia,4 Guo and others5 hypothesized that hantaviruses originated primarily in bats and then spilled over into
rodents and shrews, but it seems that shrews are the original
hosts from which the viruses jumped into both rodents and
bats.3 To determine if New World bats in Brazil may harbor
hantaviruses, we screened bat sera for antibodies that react
against the recombinant nucleoprotein (rN) of Araraquara
hantavirus (ARAQV).
Bats were collected at five ecologically distinct sites in the
northeast region of São Paulo state (sites 1–3) and north
region of Minas Gerais state (sites 4 and 5), southeastern
Brazil (Figure 1 and Table 1). Field collections were conducted
from February 2012 to April 2014. Trap sites were visited
twice: one in the dry season (April–September) and once in
the rainy season (October–March). We used 12 mist nets
(model 716/12P, 12 × 2.5 m; denier 75/2, mesh 16 × 16 mm;
Ecotone Inc., Gdynia, Poland) in sites 1, 2 and 3; and six mist
nets in sites 4 and 5 with a total sampling effort of 56,160 m2h.
Captured bats were identified following Gardner,9 and one
specimen per species by trap-night was anesthetized to collect
blood by cardiac puncture; blood samples were stored in
*Address correspondence to Gilberto Sabino-Santos Jr., Center for
Virology Research, School of Medicine in Ribeirão Preto, University of
São Paulo, Avenida Bandeirantes no. 3900, Monte Alegre, 14049900,
Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. E-mail: [email protected]
1
AU4
T2
2
SABINO-SANTOS JR AND OTHERS
FIGURE 1. Study areas, highlighting the states of São Paulo and Minas Gerais in southeastern Brazil. The map shows cities where bats have
been captured.
infected with many viruses, evidence from experimental and naturally infected bats has shown that they rarely produce an antibody response, probably because they are able to control viral
replication via the innate immune antiviral response, and therefore, show a low viremia.13,14 However, here we were capable to
show bats with IgG antibodies against the rN-ARAQV. The
ELISA essays using rN-ARAQV as antigen have been previously used in hantavirus serologic surveys in rodents.15,16 Previous studies with bats of the Old World showed that only
insectivorous bats are infected with hantavirus.5 Our study
emphasizes that hantaviruses are infecting bats of several species
and of different trophic groups in Brazil (Table 2). We also
observed that the hantavirus prevalence in infected bats was
higher when compared with that observed in rodent reservoirs
from the same region.15,16 Despite, we have found antibodies
against hantavirus, our results only support the idea that these
bats become infected in some moment of their lifetime. Further
studies in bats are necessary to detect the species and genotype of
the infecting hantavirus and then determine the viral load in distinct organ tissues of these animals. Therefore, virus isolation
followed by infection experiments could provide additional information if bats actually play a role as reservoirs of hantaviruses.
Regardless of the negative public impression of bats, they possess
important roles on insect control,17 reseeding forests, and pollinate plants that provide human and animal food.18 Bat guano is
used as a fertilizer and for manufacturing soaps, gasohol, and
antibiotics. Besides, bat echolocation and the infrared radiation
of vampire bats (Desmodus rotundus) have provided models for
sonar and infrared systems, respectively.13,19
Our study gives insights into ecology, conservational biology,
and public health. These data may be useful to understand patterns of hantavirus evolution, in bats and other reservoirs, and
to understand the virus dynamics and their potential public
health importance. It is also important to preserve the native
environment of these animals. Hence, this is the first report of
the presence of hantavirus antibodies in phyllostomid bats in
southeastern Brazil and also the first report of hantavirus antibodies among bats in the Americas.
Received January 14, 2015. Accepted for publication April 26, 2015.
Acknowledgments: We thank specially Thiago Neves for all the
support in Montes Claros city and field guidance at Sapucaia and Lapa
Grande Ecological Parks. We are also grateful to Vinicius Kavagutti,
Márcio Schafer, Milene Eigenher, Ariane and Gustavo Crepaldi de AU5
Morais for their help in field collections. We appreciate all the support
from the Jatai Ecological Station Manager Edison Montilha, Armando
Nascimento who supported us on his farm Santa Gabriela (Batatais
city), and José Teotônio (Zezinho) and the Secretary of Health from AU6
Cajuru city through Toninho. We also thank Patricio Hernaez for the
help in the map construction and Luciano Luna for the comments in
the final version of the manuscript.
Financial support: This work was supported by the São Paulo State
Research Foundation (FAPESP) grants 2011/06810-9 to Gilberto
Sabino-Santos Jr. and 2008/50617-6 to Luiz Tadeu Moraes Figueiredo.
TABLE 1
Trap sites general features6
1
2
3
4
5
Trap sites/altitude (m)
City/state
Main vegetation
Secondary vegetation
Features
JES/600
NEF/775
SGF/860
SEP/872
LGEP/1,009
Luis Antonio/SP
Cajuru/SP
Batatais/SP
Montes Claros/MG
Montes Claros/MG
Cerrado*
Grassland
Sugarcane
Dry forest†7
Cerrado8
Semideciduous forest
Cerrado
Cerrado
Cerrado
Gallery forest
Continuous Cerrado
Monocultures
Monocultures
Karst topography
Caves and shelters
JES = Jatai Ecological Station; LGEP = Lapa Grande Ecological Park; MG = Minas Gerais state; NEF = Nova Esperança Farm; SEP = Sapucai Ecological Park; SGF = Santa Gabriela Farm;
SP = Sao Paulo state.
*Cerrado = Brazilian savanna-like biome.
†Dry forest = deciduous seasonal forest.
3
HANTAVIRUS INFECTION AMONG BATS
TABLE 2
Infected and tested bats for antibodies against rN-ARAQV
Family
Species
Captured
Infected/tested
Main feeding items
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Molossidae
Molossidae
Vespertilionidae
Vespertilionidae
Phyllostomidae
Phyllostomidae
Artibeus lituratus
A. obscurus
A. planirostris
Chiroderma villosum
Desmodus rotundus
Glossophaga soricina
Lonchophylla spp.
Micronycteris minuta
Molossops neglectus
Molossops temminckii
Myotis nigricans
Myotis albescens
Sturnira lilium
41
2
41
43
1
1
11
22
1
1
1
2
13
4
23
38
1/6
1/2
1/3
1/10
1/1
1/1
3/5
0/5
0/1
0/1
0/1
0/1
0/5
0/1
0/4
0/6
Fruits
Fruits
Fruits
Fruits and insects
Fruits
Small vertebrates
Mammals blood
Nectar and pollen
Nectar and pollen
Insects
Insects
Insects
Insects
Insects
Fruits
Fruits
rN-ARAQV = recombinant nucleoprotein of Araraquara virus.
Main feeding items are shown according to Gardner.9
Authors’ addresses: Gilberto Sabino-Santos Jr. and Luiz Tadeu
Moraes Figueiredo, Center for Virology Research, School of Medicine in Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, São
Paulo, Brazil, E-mails: [email protected] and [email protected].
Felipe Gonçalves Motta Maia, Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo,
Brazil, E-mail: [email protected]. Thallyta Maria Vieira,
Sabrina Miranda Lima, Cristieli Barros Gonçalves, Patricia Doerl
Barroso, and Maria Norma Melo, Department of Parasitology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais, Belo
Horizonte, Brazil, E-mails: [email protected], sabrina_mlima@
hotmail.com, [email protected], [email protected], and
[email protected]. Renata de Lara Muylaert, Department of
Ecology, São Paulo State University, Rio Claro, São Paulo, Brazil,
E-mail: [email protected]. Colleen B. Jonsson, Department of
Microbiology and Immunology, University of Louisville, Louisville,
KY, E-mail: [email protected]. Douglas Goodin, Department
of Geography, Kansas State University, Manhattan, KS, E-mail:
[email protected]. Jorge Salazar-Bravo, Department of Biological
Sciences, Texas Tech University, Lubbock, TX, E-mail: [email protected].
REFERENCES
AU7
AU8
1. Holmes EC, Zhang YZ, 2015. The evolution and emergence of
hantaviruses. Curr Opi Virol 10: 27–33.
2. Brook CE, Dobson AP, 2015. Bats as ‘special’ reservoirs for
emerging zoonotic pathogens. Trends Microbiol 23: 172–180.
3. Bennett SN, Gu SH, Kang HJ, Arai S, Yanagihara R, 2014.
Reconstructing the evolutionary origins and phylogeography
of hantaviruses. Trends Microbiol 22: 473–482.
4. Gu SH, Lim BK, Kadjo B, Arai S, Kim JA, Nicolas V, Lalis A,
Denys C, Cook JA, Dominguez SR, Holmes KV, Urushadze
L, Sidamonidze K, Putkaradze D, Kuzmin IV, Kosoy MY,
Song J-W, Yanagihara R, 2014. Molecular phylogeny of hantaviruses harbored by insectivorous bats in Côte d’Ivoire and
Vietnam. Viruses 6: 1897–1910.
5. Guo W-P, Lin X-D, Wang W, Tian J-H, Cong M-L, Zhang H-L,
Wang M-R, Zhou R-H, Wang J-B, Li M-H, Xu J, Holmes EC,
Zhang Y-Z, 2013. Phylogeny and origins of hantaviruses harbored
by bats, insectivores, and rodents. PLoS Pathog 9: e1003159.
6. Ribeiro JF, Walter BMT, 2008. As principais fitofisionomias do
Bioma Cerrado. Sano SM, Almeida SP, Ribeiro JF, eds. Cerrado:
Ecologia e Flora. Planaltina, Brazil: Embrapa Cerrados, 152–212
(In Portuguese).
7. Santos RM, Vieira FA, Gusmão E, Nunes F, Roberta Y, 2007.
Florística e estrutura de uma floresta estacional decidual, no
Parque Municipal da Sapucaia, Montes Claros (MG). Cerne
13: 248–256 (In Portuguese).
8. Oliveira GL, Moreira DL, Mendes ADR, Guimarães EF,
Figueiredo LS, Kaplane MAC, Martins ER, 2013. Growth
study and essential oil analysis of Piper aduncum from two
sites of Cerrado biome of Minas Gerais State, Brazil. Rev
Bras Farmacog 23: 743–753.
9. Gardner AL, 2007. Mammals of South America: Marsupials,
Xenarthrans, Shrews, and Bats, Volume 1. Chicago, IL: University of Chicago Press, 669.
10. Sikes RS, Gannon WL; the Animal Care and Use Committee of
the American Society of Mammalogists, 2011. Guidelines of
the American Society of Mammalogists for the use of wild
mammals in research. J Mammal 92: 231–253.
11. Figueiredo LTM, Moreli ML, Borges AA, de Figueiredo GG,
Badra SJ, Bisordi I, Suzuki A, Capria S, Padula P, 2009. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay based on
Araraquara virus recombinant nucleocapsid protein. Am J
Trop Med Hyg 81: 273–276.
12. Figueiredo LT, Moreli ML, Borges AA, Figueiredo GG, Souza
RL, Aquino VH, 2008. Expression of a hantavirus N protein
and its efficacy as antigen in immune assays. Braz J Med Biol
Res 41: 596–599.
13. Moratelli R, Calisher CH, 2015. Bats and zoonotic viruses: can
we confidently link bats with emerging deadly viruses? Mem
Inst Oswaldo Cruz 110: 1–22.
14. Baker ML, Schountz T, Wang LF, 2013. Antiviral immune
responses of bats: a review. Zoo Pub Health 60: 104–116.
15. De Sousa RLM, Moreli ML, Borges AA, Campos GM, Livonesi
MC, Figueiredo LTM, Pinto A, 2008. Natural host relationship and genetic diversity of rodent associated hantaviruses in
southeastern Brazil. Intervirol 51: 299–310.
16. Figueiredo GG, Borges AA, Campos GM, Machado AM,
Saggioro FP, Sabino Júnior Gdos S, Badra SJ, Ortiz AA,
Figueiredo LT, 2010. Diagnosis of hantavirus infection in
humans and rodents in Ribeirão Preto, State of São Paulo,
Brazil. Rev Soc Bras Med Trop (Impresso) 43: 348–354.
17. Boyles JG, Cryan PM, Mccracken GF, Kunz TH, 2011. Economic importance of bats in agriculture. Science 332: 41–42.
18. Dirzo R, Young HS, Galetti M, Ceballos G, Isaac NJ, Collen B,
2014. Defaunation in the Anthropocene. Science 345: 401–406.
19. Campbell AL, Naik RR, Sowards L, Stone MO, 2002. Biological
infrared imaging and sensing. Micron 33: 211–225.

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