alexandra paiva araújo - Teses e Dissertações

Transcrição

ALEXANDRA PAIVA ARAÚJO
A INFLUÊNCIA DE FATORES NUTRICIONAIS NA
RESPOSTA AO TESTE DE MONTENEGRO, EM
INDIVÍDUOS VACINADOS ANTI LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR AMERICANA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
OURO PRETO
2007
A663i
Araújo, Alexandra Paiva.
A influência de fatores nutricionais na resposta ao teste de Montenegro,
em indivíduos vacinados anti leishmaniose tegumentar americana [manuscrito]
/ Alexandra Paiva Araújo. – 2007.
xxiii, 125 f.: il., color; graf., tabs.
Orientador: Prof. Dr. George Luiz Lins Machada Coelho.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.
1. Leishmaniose - Teses. 2. Vacinas - Teses. 3. Elementos traços - Teses.
I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 616.993.161
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
A INFLUÊNCIA DE FATORES NUTRICIONAIS NA RESPOSTA AO TESTE DE
MONTENEGRO, EM INDIVÍDUOS VACINADOS ANTI LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR AMERICANA
ALUNA: ALEXANDRA PAIVA ARAÚJO
ORIENTADOR: Prof. Dr. GEORGE LUIZ LINS MACHADO COELHO
Dissertação apresentada no Programa de PósGraduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, como parte integrante dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas,
área
de
concentração:
Imunobiologia de protozoários.
Ouro Preto
2007
ii
iii
Aos meus pais e meus heróis,
Stephenson e Leila,
Ao lindo Arthur
iv
“Tudo quanto te vier à mão para fazer,
Faze-o conforme as tuas forças.
Porque na sepultura, para onde vais,
Não há obra, nem indústria,
Nem ciência e nem sabedoria alguma.”
Eclesiastes 9. 10
v
AGRADECIMENTOS
vi
A Deus, fonte inesgotável de amor e sabedoria.
Ao Professor Doutor George Luiz Lins Machado Coelho, pela confiança em mim
depositada, pela oportunidade a mim concedida de desenvolvimento e crescimento
profissional, pelos ensinamentos, pela paciência, respeito e amizade desde a Iniciação
Científica, pelo valioso incentivo e cuidado na orientação deste trabalho. Muitíssimo
obrigada!
À Doutora Olguita Geralda Ferreira Rocha, pelos ensinamentos e colaboração
imprescindíveis ao desenvolvimento deste trabalho, pela confiança e paciência, pelo
carinho e atenção.
Ao Professor Doutor Wilson Mayrink, pela oportunidade a mim concedida de fazer parte de
sua equipe, desenvolvendo este trabalho na região de Caratinga. Além de tudo, agradeço o
enriquecimento intelectual e a confiança.
Ao Sr. Jair Cecílio de Paula, do Centro de Tratamento de Leishmanioses - Caratinga, pela
atenção e importantíssima colaboração nos trabalhos de campo realizados na região de
Caratinga.
À equipe da Unidade Descentralizada de Caratinga – Jane, Edna Cristina, Walter, José
Lúcio e Rogério, pela ajuda preciosa nos trabalhos de campo.
Aos funcionários do Laboratório de Traços Metálicos do CETEC, MG, pela atenção, apoio
e ótima convivência durante meu treinamento e análises laboratoriais das amostras. Em
especial ao Sr. Geraldo do Carmo, pela atenção e paciência nas análises realizadas no ICP
OES e a Susan Joyce por dividir comigo as tensões do FIAS MHS.
Ao Professor Roney pela disponibilização do LAPAC, para a realização dos hemogramas.
Ao aluno de Iniciação Científica, Daniel, pela valiosa ajuda e bom trabalho desenvolvido.
vii
Ao Alekson, um grande companheiro de mestrado e amigo. Obrigada pelo auxílio nas
coletas das amostras e realização dos hemogramas, pelas extensas horas de convívio no
LEPI ou estudando Bioestatística, as Protozoologias, Imuno e Epidemiologia.... E a todos
do LEPI pelo apoio constante, pela alegria, pelo bom trabalho em equipe, pelas risadas,
pelo companheirismo e amizade. Em especial à Ana Paula (Apcc), Gabriela Lanna, Liliane,
Paulinha, Josy e Cléia... grandes amigas... enfim, Deus coloca em nossa vida pessoas
capazes de tornar os caminhos menos árduos e nos fazer sorrir em meio às dificuldades.
Obrigada!!!
Aos voluntários participantes deste ensaio clínico, residentes nas áreas de Córrego do
Emboque, Fazenda Caetana e Patrocínio, região rural de Caratinga, MG, pela boa vontade
na vacinação, realização do TM e coletas de sangue.
Aos Professores do curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pela valiosa
contribuição na minha formação, em especial à Prof. Dra. Maria Terezinha Bahia; Prof. Dr.
Luiz Carlos Crocco Afonso; Prof. Dra. Marta de Lana e ao Prof. Dr. Alexandre Barbosa
Reis.
À Cida, nossa querida secretária do NUPEB.
À Universidade Federal de Ouro Preto, onde tive a oportunidade iniciar minha formação
profissional desde a graduação em Farmácia e onde hoje completo mais uma etapa desta
caminhada.
Aos meus amados pais Stephenson e Leila, pelo amor, incentivo em todos os momentos,
por me ensinarem o gosto pelas letras, pela confiança, por me acolherem nos momentos de
desespero e por vibrarem comigo frente às conquistas. Obrigada por não medirem esforços
para a realização deste nosso sonho.
Ao meu irmão Arthur, pelo carinho, amizade, paciência, e acolhimento em BH durante as
análises laboratóriais. Obrigada por estar ao meu lado incentivando sempre.
viii
Ao Olívio, meu amor, pela amizade, paciência, amor e pelo incentivo na etapa final deste
trabalho. Obrigada por estar ao meu lado, trazendo um novo colorido à minha caminhada.
A todos os amigos que estiveram ao meu lado, torcendo e apoiando. Muito obrigada!
À Ouro Preto, um lugar mágico, pela oportunidade de viver o passado e o futuro no
presente.
Muitíssimo obrigada!!!
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Organograma do estudo para avaliação da influência dos elementos traço e estado
nutricional na resposta induzida em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG),
2005.......................................................................................................................................43
Figura 2. Curva padrão de selênio para verificação da faixa de trabalho............................56
Figura 3. Curva padrão e curva da amostra acrescida de padrão para a verificação da
seletividade, segundo o INMETRO......................................................................................58
Figura 4. Distribuição de freqüência dos valores do diâmetro do TM entre os vacinados
com TM positivos 60 dias após vacinação (A) e do logarítmo dos valores do diâmetro do
TM (B) nos mesmos indivíduos, Caratinga (MG), 2005......................................................63
Figura 5. Distribuição da concentração de cobre sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de cobre sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
tegumentar americana, Caratinga (MG), 2005......................................................................65
Figura 6. Distribuição da concentração de ferro sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de ferro sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
Figura 7. Distribuição da concentração de selênio sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de selênio sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
tegumentar americana , Caratinga (MG), 2005.....................................................................66
Figura 8. Distribuição da concentração de zinco sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de zinco sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
Figura 9. Relação entre o logarítmo da concentração de cobre sérico (µg/L) e o diâmetro do
TM (mm), avaliado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005.................72
Figura 10. Relação entre o logarítmo da concentração de ferro sérico (µg/L) e o diâmetro
do TM (mm), avaliado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005............72
Figura 11. Relação entre o logarítmo da concentração de zinco sérico (µg/L) e o diâmetro
x
Figura 12. Relação entre o logarítmo da concentração de selênio sérico (µg/L) e o diâmetro
Figura 13. Relação entre o logarítmo do diâmetro do TM (mm) e os grupos (G0/I e GII) dos
elementos traço (cobre, ferro, selênio e zinco), nos indivíduos vacinados anti-LTA,
Caratinga (MG), 2005...........................................................................................................75
xi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Limites inferiores da normalidade para hemoglobina (g/dL), segundo idade e
sexo.......................................................................................................................................46
Tabela 2. Grupos dos elementos traço categorizados por seus níveis séricos, para cobre,
ferro, selênio e zinco de acordo com os valores de referência..............................................54
Tabela 3. Distribuição de variáveis para o cálculo da linearidade pelo teste F
(Snedecor).............................................................................................................................57
Tabela 4. Recuperação do selênio ao longo da curva contendo amostra em concentrações
conhecidas para avaliação da seletividade do método segundo o Guia Relacre...................58
Tabela 5. Distribuição das concentrações do branco da amostra para cálculo de LD e LQ.59
Tabela 6. Valores do padrão de selênio (10µg/L) para a avaliação da repetitividade..........60
Tabela 7. Valores do teste de recuperação para determinação de cobre sérico no ICP
OES.......................................................................................................................................61
Tabela 8. Valores do teste de recuperação para determinação do ferro sérico no ICP
OES.......................................................................................................................................62
Tabela 9. Valores do teste de recuperação para determinação do zinco sérico no ICP
OES.......................................................................................................................................62
Tabela 10. Concentração sérica média e desvio padrão de cobre, ferro, selênio e zinco
(µg/L) de acordo com gênero e idade, determinado em indivíduos vacinados anti-LTA,
Caratinga (MG), 2005...........................................................................................................67
Tabela 11. Distribuição da amostra por gênero (percentual), idade e IMC (média e desvio
padrão) de acordo com os grupos GI e GII dos elementos traço, entre os indivíduos
vacinados anti-LTA em Caratinga (MG), 2005....................................................................69
Tabela 12. Relação entre a contagem de hemácias e níveis de hemoglobina de acordo com
os grupos G0/I e GII de cobre, ferro, selênio e zinco dos individuos vacinados anti-LTA em
Caratinga (MG), 2005...........................................................................................................70
Tabela 13. Relação da contagem de leucócitos e do percentual de linfócitos e monócitos de
acordo com os grupos GI e GII de cobre, ferro, selênio e zinco dos indivíduos vacinados
anti-LTA em Caratinga (MG), 2005.....................................................................................71
xii
ÍNDICE DE TABELAS DOS ANEXOS
Tabela 14. Distribuição da concentração média e desvio padrão de cobre, ferro, selênio e
zinco de acordo com o diâmetro do TM, determinado em indivíduos vacinados anti-LTA,
Caratinga, MG.......................................................................................................................89
xiii
SUMÁRIO
Resumo..............................................................................................................................xviii
Abstract................................................................................................................................xxi
1. Introdução………………...........…………………………………………………………1
2. Revisão bibliográfica………............…………………………………..............................4
2.1. Leishmaniose Tegumentar Americana e sua epidemiologia................................5
2.1.1. Espécies do gênero Leishmania, vetores e reservatórios....................6
2.2.Formas clínicas ....................................................................................................8
2.3.Imunidade............................................................................................................10
2.3.1. Aspectos nutricionais e resposta imune............................................13
2.3.1.1. Cobre.....................................................................................14
2.3.1.2. Ferro……….…………………………………...……...…...16
2.3.1.3. Selênio..................................................................................19
2.3.1.4. Zinco.....................................................................................22
2.4. Diagnóstico da LTA...........................................................................................24
2.4.1. Diagnóstico clínico e epidemiológico.................................................24
2.4.2. Diagnóstico parasitológico……......................................…...…...…..25
2.4.3. Diagnóstico imunológico…................................................................26
2.4.4. Diagnóstico molecular…....................................................................27
2.5.Tratamento..........................................................................................................28
2.6.Controle da LTA.................................................................................................30
2.7.Vacina anti-leishmaniose tegumentar americana................................................31
3. Justificativas....................................................................................................................37
4. Objetivos.........................................................................................................................39
5. Materiais e Métodos........................................................................................................41
5.1. Desenho e população do estudo.........................................................................42
5.2. Cálculo do tamanho da amostra.........................................................................43
5.3. Vacina................................................................................................................44
5.4. Teste de Montenegro..........................................................................................44
5.5. Coleta de dados antropométricos.......................................................................44
xiv
5.6. Coleta de amostras e mascaramento..................................................................45
5.7. Realização dos Hemogramas…...……....................................................……..45
5.8. Determinação dos teores séricos de cobre, ferro, selênio e zinco......................46
5.8.1. Reagentes utilizados............................................................................47
5.8.2. Equipamentos......................................................................................48
5.8.3. Preparo das amostras...........................................................................48
5.8.4. Determinação de selênio sérico por espectrometria de absorção
atômica com geração de hidretos acoplado ao sistema de injeção de
fluxo..................................................................................................48
5.8.4.1. Princípio do método.............................................................48
5.8.4.2. Validação do método para determinação de selênio em soro
humano utilizando espectrometria de absorção atômica com
geração
de
hidretos
e
sistema
de
injeção
de
fluxos..................................................................................49
5.8.4.3. Linearidade da faixa de trabalho..........................................49
5.8.4.4. Teste de Seletividade…………...………............................50
5.8.4.5. Limites de detecção e quantificação....................................50
5.8.4.6. Estimativa da exatidão e repetitividade...............................51
5.8.5. Determinação de cobre, ferro e zinco séricos por espectrometria de
emissão
por
plasma
indutivamente
acoplado............................................................................................51
5.8.5.1. Princípio do método.............................................................51
5.8.5.2. Estimativa da exatidão do método.......................................52
5.9. Procedimento operacional..................................................................................52
5.10. Valores de referência para os níveis séricos de elementos traço.....................53
5.11. Processamento e análise de dados....................................................................53
6. Resultados.......................................................................................................................55
6.1. Validação da determinação de selênio em soro humano por espectrometria de
absorção atômica por gerador de hidretos acoplado ao sistema de injeção de
fluxos (FI-HGAAS).........................................................................................56
xv
6.1.1. Linearidade da faixa de trabalho.........................................................56
6.1.2. Seletividade e exatidão........................................................................57
6.1.3. Limite de detecção e limite de quantificação......................................59
6.1.4. Repetitividade.....................................................................................60
6.2. Estimativa da exatidão do método para a determinação de cobre, ferro e zinco
séricos
por
espectrometria
de
emissão
por
plasma
indutivamente
acoplado..............................................................................................................60
6.3. Análise descritiva dos indivíduos em relação ao TM.........................................63
6.4. Análise descritiva dos níveis séricos dos elementos traço.................................64
6.5. Análise descritiva dos níveis séricos dos elementos traço por gênero, idade e
IMC..................................................................................................................67
6.6. Relação da contagem de hemácias e os níveis séricos de hemoglobina com os
níveis séricos dos elementos traço. .................................................................69
6.7. Relação da contagem de leucócitos e do percentual de linfócitos e monócitos
com os níveis séricos de elementos traço.........................................................70
6.8. Relação entre o TM e os níveis séricos de cobre, ferro, selênio e zinco............71
7. Discussão...........................................................................................................................76
7.1. Limitações do estudo..........................................................................................83
8. Conclusões........................................................................................................................86
9. Anexos..............................................................................................................................88
10. Referências Bibliográficas..............................................................................................97
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ca
Cálcio
Cd
Cádmio
CMSP
Células mononucleares do sangue periférico
Cu
Cobre
DP
Desvio padrão
Fe
Ferro
FI-HGAAS
Espectrometria de absorção atômica por gerador de hidretos acoplado
ao sistema de injeção de fluxos
ICP OES
Espectrometria de emissão por plasma indutivamente acoplado
IgG
Imunoglobulina G
IL
Interleucina
INF-γ
Interferon gama
LTA
Leishamaniose tegumentar americana
LV
Leishmaniose visceral
Mg
Magnésio
Ni
Níquel
NO
Óxido nítrico
Se
Selênio
TM
Teste de Montenegro
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TLR
Toll like receptor
Zn
Zinco
WHO
World Health Organization
xvii
RESUMO
xviii
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença crônica causada por
espécies do gênero Leishmania e altamente prevalente em regiões tropicais e subtropicais
do mundo. No Brasil, é considerada altamente endêmica, com uma incidência de 40.000
casos em 2002 (Desjeux, 2004). Uma vacina composta por promastigotas mortas de
Leishmania (Leishmania) amazonensis foi desenvolvida por Mayrink e colaboradores e é,
atualmente, uma das possibilidades que se tem para a prevenção da LTA. No entanto esta
tem apresentado uma baixa imunogenicidade quando avaliada pelo Teste de Montenegro
(TM), com aproximadamente 20 a 30% de não conversão do TM em indivíduos após
vacinação.
Vários fatores poderiam estar relacionados a esta baixa conversão do TM. Dentre
estes, fatores nutricionais como os elementos traço (cobre, ferro, selênio e zinco)
apresentam uma relação com a resposta imunológica, tanto pela necessidade destes para a
proliferação e maturação das células do sistema imune, quanto da mudança de seus níveis
séricos em processos inflamatórios e infecciosos.
Diante destes dados e da não existência de estudos sobre a influência desses
elementos traço na resposta imunológica humana induzida pela vacina anti-LTA, o objetivo
deste estudo foi avaliar a relação entre fatores nutricionais e a resposta ao TM em
indivíduos vacinados anti-LTA.
O estudo foi realizado em uma subamostra (n = 172) de um ensaio comunitário para
avaliação da eficácia da vacina anti-LTA, na microrregião de Caratinga, Minas Gerais.
Dois grupos foram selecionados para participarem deste ensaio experimental mascarado, a
partir da resposta ao TM, definido por uma enduração maior ou igual a 5 mm, 48 horas
após sua aplicação. Um grupo foi composto por indivíduos que apresentaram TM negativo
(n = 97) e outro por indivíduos que apresentaram TM positivo (n = 75). De todos os
participantes foram obtidos dados antropométricos e amostras sanguínea.
A determinação dos níveis séricos de cobre, ferro e zinco foram realizadas por
espectrometria de emissão por plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) e o selênio por
espectrometria de absorção atômica com gerador de hidretos acoplado ao sistema de
injeção de fluxos (FI- HGAAS), as análises laboratoriais foram realizadas uma área limpa
xix
classe ISO 7 em capelas e módulos de fluxo laminar ISO 5, utilizando-se métodos
validados.
A partir dos dados laboratoriais os indivíduos foram divididos em grupos com
níveis séricos baixos (G0), normais (GI) e elevados (GII) de cobre, ferro, selênio e zinco de
acordo com seus valores de referência. Para fins de análise estatística o diâmetro do TM foi
categorizado em negativo e o grupo do TM positivo foi subdividido em 5 a 8 mm; 8,1 a 9
mm; 9,1 a 12 mm e > 12,0 mm.
O diâmetro do TM apresentou valores médios de 10,347 ± 4,64 mm (média ± DP)
entre os indivíduos TM positivos. Os níveis séricos médios e o desvio padrão observados
foram de 1.433,7 ± 665,7 µg/L para o cobre, 1.431,6 ± 791,5 µg/ L para o ferro, 88,6 ±
39,0 µg/ L para o selênio e 999,2 ± 366 µg/ L para o zinco.
O log do diâmetro do TM foi significativamente maior (p=0,021) no GII (0,66 ±
0,53) para o selênio quando comparado ao GI (0,38 ± 0,51) e significativamente menor
(p=0,033) para o GII do zinco (0,23 ± 0,43) em relação ao GI (0,48 ± 0,53). Já para o cobre
e o ferro não foi observada diferença significativa do diâmetro do TM entre GI e GII.
Quanto a avaliação dos níveis séricos dos elementos traços por quartis do diâmetro do TM
somente o selênio apresentou uma relação significativa (p=0,019), com um aumento dos
níveis séricos de selênio do terceiro ao quinto quartil.
Níveis séricos elevados de zinco estão relacionados a uma baixa resposta a vacina
anti-LTA, avaliada pelo Teste de Montenegro, ao contrário de cobre e ferro que não
apresentaram associação com a resposta ao TM entre os indivíduos vacinados anti-LTA.
Níveis séricos elevados de selênio estão associados a um maior diâmetro do TM,
evidenciando uma melhor resposta imune celular induzida pela vacina anti-LTA.
Este estudo indica a importância da suplementação com selênio em ensaios vacinais
para a avaliação da imunogenicidade da vacina, avaliada pelo TM, além da necessidade de
se ajustar análises de eficácia vacinal segundo os níveis séricos de selênio.
xx
ABSTRACT
xxi
American cutaneous leishmaniasis (ACL) is caused by several Leishmania species.
It is more prevalent in tropical and subtropical regions of the world. This disease is highly
endemic in Brazil, where it is considered an important health problem and where around
40,000 cases have been reported in 2002 alone (Desjeux, 2004). The development of a safe
and effective vaccine still remains the most promising approach to prevent ACL (Desjeux,
1996; Kedzierski et al., 2006).
Mayrink and collaborators developed and evaluated ACL vaccine candidates
composed by killed promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonensis (Marzochi et
al., 1998, De Luca et al., 2001; Mayrink et al., 2002; Armijos et al., 2004; Vélez et al.,
2005). The main problem observed in the most recent studies using the vaccine was its low
immunogenicity. Particularly, it was observed that after vaccination of volunteers, 30% of
subjects showed no sign of protection when using the Montenegro skin test (MST) as
immunological marker (i.e. their MST response was negative).
Trace elements, such as copper, iron, selenium and zinc, can influence the innate
and adaptive immunity; by modifying these immune cells activities (natural killer,
macrophages, neutrophils and lymphocytes) and cytokines production (Erickson et al.,
2000; Mocchegiani et al., 2000). Several studies have recently shown that the levels of
these trace elements can change with the different clinical presentations of ACL and the
others infectious process (Faryadi et al., 2003; Koçygit et al., 1998; Koçygit et al., 1999;
Van Weyenbergh et al., 2004). But there are no data on the influence of the trace elements
in the immune response induced by vaccination against ACL.
Thus, the aim of this study presented here was to investigate the association of those
trace elements and the immune response induced by vaccination against ACL, and whether
this could explain the varying degree of responsiveness observed in some of the ACL
vaccine trials.
This experimental double-blind study was performed on a sub sample (n= 172) of
the trial’s vaccinated subject group in Caratinga, Minas Gerais. Sixty days after
vaccination, a new MST was applied to subjects. They were divided in two groups, in
according with the MST response, those that had a negative (n=97) and positive (n=75)
MST. The MST was positive when the induration’s diameter was > 5mm. In both groups’
anthropometrics measures and blood samples were obtained.
xxii
The trace elements were determinate by inductively coupled plasma atomic
emission spectrometry (ICP-OES) (i.e. copper, iron and zinc) or by flux injection coupled
hydride generation atomic absorption spectrometry (FIAS MHS) (i.e. selenium). All assays
were performed in the metallic trace laboratory of CETEC, in two clean area ISO 7 and
laminar airflow ISO 5 class cabinets using validated methods.
The groups were composed by low (G0), normal (GI) and high (GII) serum levels of
each trace element according to reference values. For statistical analysis purposes the
subjects with a positive MST were classified into four groups, corresponding to the four
quartiles of the observed diameter size distribution of positive MST respondents (i.e. 5 to 8
mm; 8.1 to 9 mm; 9.1 to 12 mm; > 12 mm).
Among the subjects that had a positive MST response, the mean diameter was 10.35
± 4.64 mm (mean ± SD). For all tested subjects the mean serum levels of copper, iron,
selenium and zinc were 1433.7 ± 665.7 µg/L (mean ± SD; n = 171), 1431.6 ± 791.5 µg/ L
(mean ± SD; n = 144), 88.6 ± 39.0 µg/L (mean ± SD; n = 157) and 999.2 ± 365.7 µg/L
(mean ± SD; n = 171), respectively.
The logarithm (log) MST diameter was significantly higher for subjects in GII (0.66
± 0.53 mm) than G0/I (0.38 ± 0.51 mm) to selenium (p = 0.021). To zinc, the log MST
diameter was significantly lower for subjects in GII (0.23 ± 0.43 mm) than in G0/I (0.48 ±
0.53 mm) (p = 0.033). No significant difference in log MST diameter was observed in
copper and iron levels between GII and G0/I subject groups. The selenium levels also
differed with the quartiles of the MST diameters of individuals testing positive (p = 0.019),
with a tendency of increasing selenium serum levels associated with increasing MST
diameter.
Serum levels of zinc are associated to lower response induced by vaccine against
ACL, available by MST. But the serum levels of selenium was associated an improvement
of cellular response induced by vaccine against ACL.
Future immunological and biochemical studies of vaccinated subjects that would be
given selenium supplementation could improve our understanding about the relevance of
this trace element for vaccine immunogenicity. Analyses will have to be adjusted for these
levels, so that estimates of vaccine immunogenicity, evaluated by skin test, and protection
can be rigorously estimated as well as compared between different studies.
xxiii
1. Introdução
1
A Leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa causada por
protozoários do gênero Leishmania, apresenta evolução crônica e manifestações clínicas
multifacetadas o que a torna importante quanto à morbidade. Seu caráter zoonótico e sua
ampla distribuição no Novo mundo, com grande diversidade ecoepidemiológica, dificulta a
implementação de um conjunto de medidas comuns para seu controle, tornando-a um sério
problema de saúde pública. Além disso, o tratamento com antimoniais e outros
quimioterápicos apresenta vários efeitos colaterais, alto custo, longa duração, contraindicação a indivíduos com doenças cardíacas, renais e hepáticas, a idosos, gestantes e
ainda estão sendo relatados casos de resistência à estas drogas. Diante disso, uma vacina
segura, efetiva e barata seria a medida mais adequada para a prevenção da leishmaniose
tegumentar humana, representando um avanço significativo em saúde pública.
Salles Gomes (1939) e Pessoa & Pestana (1940) realizaram as primeiras avaliações
de uma vacina anti-LTA utilizando extrato de promastigotas mortas como antígenos
imunizantes. Posteriormente, Mayrink e colaboradores em uma série de ensaios
demonstraram a segurança, imunogenicidade e eficácia, de aproximadamente 50%, de uma
vacina anti-LTA, preparada com um pool de cinco cepas de promastigostas inativadas. Mas
segundo recomendações da OMS, uma nova composição de vacina foi proposta a partir de
uma única cepa (IFLA/BR/67/PH8) de Leishmania amazonensis, por ser a cepa que
apresentava maior resposta proliferativa de células mononucleares do sangue periférico
(CMSP), da produção de INF-γ e uma taxa de conversão em torno de 70 % do Teste de
Montenegro (TM) nos indivíduos vacinados, além de apresentar fácil cultivo em meio de
cultura.
Vários fatores inerentes ao parasita (imunogenicidade, poder de evasão, virulência)
e ao hospedeiro (marcadores genéticos, fatores nutricionais) podem influenciar no
desenvolvimento de uma resposta imune nos indivíduos após infecção por Leishmania sp.
Em modelos animais uma dicotomia Th1/Th2 foi estabelecida entre dois subsítios das
células T CD4+. Enquanto a resposta do tipo 1 caracteriza-se pela produção de citocinas
como INF-γ, IL-2, IL-12, capazes de ativar fagócitos levando à destruição do parasita, as
células Th2 produzem citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13 que tornam o hospedeiro mais
susceptivel à progressão da doença. Além disso, um novo subtipo de células T CD4+ vem
2
sendo definido com Th3 diante da produção de citocinas regulatórias, sendo a principal a
TGF-β (Mills, 2004).
A proteção conferida pela vacina anti-LTA, testada em animais, está associada ao
desenvolvimento da resposta protetora do tipo Th1, com aumento de proliferação CMSP e
produção de INF-γ, além da diminuição de IL-4. Segundo Nascimento et al. (1990) essa
resposta proliferativa CMSP apresenta uma correlação de 90% com a positividade do TM.
Isto faz deste teste imunológico o mais utilizado para auxílio no diagnóstico e para a
seleção de indivíduos aptos a receberem a vacina, além de marcador de imunogenicidade
pós-vacinação devido sua facilidade operacional.
Entre os fatores nutricionais, vários autores têm observado uma relação entre a
resposta imune e elementos traço (cobre, ferro, selênio e zinco) (Behar et al., 1999;
Koçyigit et al., 1999; Erickson et al., 2000; Mocchegiani et al., 2000). Estes elementos
atuam participando de diversas etapas da proliferação e maturação de fagócitos, bem como
na capacidade citotóxica dos mesmos e na indução da resposta imune do tipo Th1, a mesma
induzida pela vacina, capaz de promover proteção ao hospedeiro.
Uma vez que fatores nutricionais do indivíduo podem influenciar diretamente na
formação de uma resposta imunológica em presença de estímulo, como promastigotas
mortas de Leishmania amazonensis, no caso desta vacina, e na busca de se entender os 20 a
30% de não conversão do TM entre indivíduos vacinados, faz-se necessário e interessante
avaliar o papel dos elementos traço (cobre, ferro, selênio e zinco) na resposta imune
induzida pela vacina anti-LTA.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
4
2.1 Leishmaniose Tegumentar Americana e sua epidemiologia
As Leishmanioses são doenças infecciosas, causada por protozoários do gênero
Leishmania. Mais de 20 espécies de Leishmania capazes infectar o ser humano já foram
descritas e outras espécies estão emergindo, especialmente em associação com HIV/AIDS
(Desjeux, 1996). São prevalentes em quatro continentes, mais predominantes em regiões de
clima quente e úmido, como áreas tropicais e subtropicais do mundo, sendo considerada
endêmica em 88 países, dos quais 21 são do Novo Mundo e 66 do Velho Mundo. Destes
países, 16 são desenvolvidos, 72 estão em desenvolvimento e 13 estão entre os menos
desenvolvidos (Desjeux, 1996). A estimativa mundial da incidência anual das
leishmanioses é de 1,5 – 2,0 milhões de novos casos, com uma população de risco estimada
de aproximadamente 350 milhões de pessoas e uma prevalência de 12 milhões de casos.
Dentre as leishmanioses, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta
uma ampla distribuição nas Américas, onde é considerada uma zoonose em expansão
geográfica, ocorrendo em forma endêmico-epidêmica, podendo apresentar diferentes
padrões de transmissão. Ela constitui um dos cinco principais problemas de saúde pública
diante de sua magnitude e pouca vulnerabilidade às medidas de controle. No Brasil, sua
incidência foi estimada em aproximadamente 60.000 casos novos em 2003, sendo
caracterizada como altamente endêmica em muitas partes do país (Desjeux, 2004).
Essa expansão geográfica se deve a vários fatores, dentre eles a colonização que
levou ao aumento do desmatamento, da construção de rodovias, da atividade turística e
militar e do avanço de projetos agroindustriais, que trouxeram pessoas não imunes para
áreas endêmicas. Isto contribuiu para o aumento da transmissão da LTA, com mudança de
comportamento do ciclo e transmissão da doença, passando do ambiente selvático ao
peridomiciliar (Desjeux, 1996; Martins et al., 2004). A redução ou finalização de
campanhas com aplicação de inseticidas para o controle da malária é outro fator que tem
contribuído para o aumento da LTA e no caso da Leishmania (Viannia) guyanensis, onde se
mantém o ciclo selvático, o crescimento urbano não planejado com proximidade da floresta
leva a um aumento do risco de transmissão para os humanos (Desjeux, 1996; Desjeux,
2001). Além disso, o risco de co-infecção Leishmania/HIV vem aumentando como
resultado da modificação dos padrões das duas doenças, aumentando a gravidade da LTA e
da LV nos indivíduos co-infectados.
5
O gênero Leishmania compreende protozoários com um ciclo de vida digenético
(heteroxênico), com parte de sua vida em hospedeiro vertebrado e parte em hospedeiro
invertebrado (insetos vetores). Cerca de 30 espécies de insetos (vetores) já foram descritas
como responsáveis pela transmissão das leishmanioses aos mamíferos, que ocorre durante o
repasto sanguíneo das fêmeas infectadas de dípteros pertencentes ao gênero Lutzomya, no
Novo Mundo. Quando um flebotomíneo se infecta através da ingestão de macrófagos
contendo formas amastigotas (aflageladas), estas se diferenciam em formas promastigotas
(flageladas), em meio extracelular na luz do trato digestivo do inseto, e se multiplicam por
divisão binária, parte destas formas flageladas sofrem maturação gerando a forma
metacíclica, infectante aos vertebrados (Desjeux, 1996; Gontijo & Carvalho, 2003).
Dentre os hospedeiros vertebrados encontramos o homem, reservatórios domésticos
(cão e eqüinos) e selváticos (marsupiais, pequenos roedores e desdentados), nos quais os
parasitas são encontrados na forma amastigota, arredondada e imóvel, no interior de células
do sistema monocítico fagocitário, obrigatoriamente. Por meio de divisão binária as
amastigotas vão se multiplicando no vacúolo parasitóforo dos macrófagos, até que estas
células sejam rompidas liberando novos parasitas que são fagocitados por novos
macrófagos (Gontijo & Carvalho, 2003).
2.1.1 Espécies do gênero Leishmania, vetores e reservatórios
Cerca de 20 espécies de Leishmania foram descritas até o ano de 1993, no Novo
Mundo. De acordo com Lainson e Shaw (1987) o gênero Leishmania é subdividido em dois
subgêneros: Leishmania e Viannia. No Novo Mundo já foram encontradas 11 espécies do
subgênero Leishmania, mas apenas cinco foram observadas parasitando o homem. Parasitas
do subgênero Viannia ocorrem apenas no Novo Mundo e das nove espécies já descritas,
oito infectam o homem (Shaw, 1994).
No Brasil, as espécies do gênero Leishmania que provocam LTA mais
frequentemente, são Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, com menor
frequência de infecção existem Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi e
Leishmania (V.) shawi do subgênero Viannia e Leishmania (L.) amazonensis do subgênero
Leishmania (Marzochi & Marzochi, 1994; Gontijo & Carvalho, 2003).
6
A L. (V.) braziliensis é a espécie mais prevalente no homem, podendo causar lesões
cutâneas únicas ou múltiplas, além do acometimento mucoso. Apresenta uma ampla
distribuição no Brasil, sendo encontrada em todas as zonas endêmicas do país, tanto em
áreas de colonização antigas quanto recentes, sendo associada a ambientes rurais e peridomiciliares (Marzochi & Marzochi, 1994; Gontijo & Carvalho, 2003).
Seus principais vetores são Psychodopigus wellcomei, altamente antropofílico
(Marzochi & Marzochi, 1994), Lutzomyia whitmani, Lutzomyia wellcomei, Lutzomyia
migonei e Lutzomyia intermedia (Lainson & Shaw, 1987; Marzochi & Marzochi, 1994;
Domingos et al., 1998; Ferreira et al., 2001; Alexander et al., 2002; Dias et al., 2007).
Sendo este último abundante em áreas endêmicas, como a região Sudeste do Brasil e é
antropofílico com boa adaptação domiciliar e peridomiciliar (Aguiar et al., 1987; Rangel et
al., 1990; São Tiago & Guida, 1990; Falqueto et al 1991; Marzochi & Marzochi, 1994;
Domingos et al., 1998; Ferreira et al., 2001; Dias et al., 2007).
Como reservatórios têm sido descrito o cão (Falqueto et al., 1991; Hermeto et al.,
1994; Marzochi & Marzochi, 1994; Reithinger & Davies, 1999), equinos e mulas (Aguilar
et al., 1987; Falqueto et al., 1987; Rosa et al., 1988) e roedores domésticos ou sinantrópicos
(Vasconcelos et al., 1987), roedores (Akodon arviculoides e Proechimys dimidiatus) no vale
do Rio Doce (Dias et al., 1977; Magalhães-Rocha et al., 1987) e em preguiças (Bradypus
variegatus) (Pirmez et al., 1997).
A L. (V.) guyanensis encontrada principalmente em áreas de florestas de terra firme,
são conhecidas por causarem, sobretudo lesões cutâneas únicas ou múltiplas (resultados de
várias picadas silmultâneas por vários flebótomos). O comprometimento mucoso é raro e a
doença atinge principalmente jovens, do sexo masculino, em idade produtiva associados ao
desflorestamento, penetração em áreas de matas virgens, crescimento urbano desordenado
próximo a áreas de florestas e exercícios militares, principalmente na região norte do
Brasil, compreendendo o estado do Amazonas (Gontijo & Carvalho, 2003; Guerra et al.,
2006). O principal vetor é Lutzoymia umbratilis, acostumado a pousar durante o dia em
trocos de árvores e atacar o homem em grande quantidade quando perturbado. Animais
silvestres, como a preguiça (Choloepus didactylus), tamanduá (Tamandua tetradactyla),
marsupiais (Didelphis marsupialis) e roedores (Proechimys guyanensis) já foram
7
identificados como hospedeiros naturais da L. (V.) guyanensis. (Lainson, 1985; Barret &
Senra, 1989; Lainson & Shaw, 1998; Guerra et al., 2006).
A L. (L.) amazonensis é responsável por formas cutâneas, mucosa (raramente) e
difusa. É encontrada principalmente na região Amazônica, mas também já foi encontrada
nos estados da Bahia (Bittencourt et al., 1989; Barral et al 1991), Minas Gerais (Mayrink et
al., 1979), Paraná (Silveira et al., 1990), Santa Catarina (Steindel et al., 1997) e Mato
Grosso (Lainson & Shaw, 1970). Seus principais vetores são Lutzomya flaviscutellata,
Lutzomya reducta, Lutzomya olmeca, estes apresentam hábitos noturnos, vôo baixo e são
pouco antropofílicos. E seus hospedeiros naturais são marsupiais e principalmente o roedor
P. guyanensis, além de roedores do gênero Oryzomys que, às vezes, apresenta o parasita na
pele sem lesões cutâneas (Lainson, 1985).
2.2 Formas clínicas
Duas principais manifestações clínicas da leishmaniose tegumentar americana são
encontradas no ser humano - leishmaniose cutânea e leishmaniose mucosa. Estas formas
clínicas ocorrem na dependência da relação entre o parasita e o hospedeiro, a partir de
fatores inerentes ao parasita (características genéticas e virulência) e ao hospedeiro (fatores
nutricionais, estado imunológico, fatores genéticos), além de uma interação destes com o
ambiente.
A leishmaniose cutânea pode ser classificada como forma cutânea única ou
múltipla, forma cutânea disseminada (lesões muito numerosas em várias partes do corpo) e
forma cutânea difusa. A forma cutânea única é caracterizada pelo aparecimento de uma
lesão circunscrita com borda elevada, contendo poucas amastigotas, fundo granuloso com
ou sem exsudação, geralmente indolor, conhecida popularmente como “Úlcera de Bauru”.
É a forma clínica mais comum (90%), de menor gravidade da LTA e apresenta-se em
indivíduos com uma efetiva resposta imune celular. A presença mais comum é de lesão
única (74%), mas segundo o número de picadas infectantes do vetor é possível o
aparecimento de múltiplas lesões (26%) nas partes mais descobertas do corpo, como
cabeça, pés, braços e pernas, predominando nas duas últimas (Oliveira-Neto et al., 1988).
Observam-se também outros tipos de lesões como úlcero-crostosa, impetigóide,
ectimatóide, úlcero-vegetante, verrucosa, tuberosa, linquenóide dentre outras. Nestas
8
formas clínicas é frequente, na fase inicial, o aparecimento de linfangite e/ou adenopatia
satélite que poderia preceder as lesões de pele e no cordão linfático é possível sobressair
nódulos eritematosos que por vezes também se ulceram (Marzochi, 1992; Barral et al.,
1992; Barral et al., 1995). No Brasil, estas formas são causadas principalmente por L. (V.)
braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis. (Weigle & Saraiva, 1996).
Raramente por disseminação hematogênica ou linfática das amastigotas a doença
pode evoluir para uma variante cutânea com pequenas ulcerações múltiplas disseminadas
conhecidas como forma cutânea disseminada. Esta forma clínica se agrava em indivíduos
portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e infectados com L. (V.)
braziliensis. (Coura et al., 1987; Da-Cruz et al., 1992).
A forma cutânea difusa está associada à infecção por L. (L.) amazonensis, é rara e as
lesões podem se apresentar como eritematosas, múltiplas, sob a forma de pápulas,
tubérculos, nódulos e infiltrações difusas, e, menos freqüentemente, sob a forma tumoral,
não se ulceram e aparecem distante do sítio de inoculação se assemelhando a hanseníase
virchowiana (Marzochi & Marzochi, 1994). Além disso, esta forma é resistente ao
tratamento medicamentoso convencional, caracterizando uma forma grave da LTA.
A forma mucosa é também uma condição de difícil tratamento e de prognóstico
reservado quanto à possibilidade de cura. É caracterizada por uma progressiva destruição
do tecido mucoso e submucoso, principalmente das cavidades nasal e bucal, seguidas da
faringe e laringe, devido a uma exagerada reação de hipersensibilidade celular do tipo
tardia, causando lesões desfigurantes, mutilação de face com grande sofrimento à vida. No
Novo Mundo o principal agente etiológico é L. (V.) braziliensis, mas mais raramente a L.
(V.) panamensis, L. (V.) guyanensis e L. (L.) amazonensis também levam ao
desenvolvimento desta forma (Desjeux, 1996; Gontijo & Carvalho, 2003).
A apresentação mucosa da LTA geralmente é secundária a forma cutânea, podendo
surgir com a lesão cutânea ativa (apresentação mucocutânea) ou anos após sua cicatrização
(Weigle & Saraiva, 1996; Gontijo & Carvalho, 2003). Quando o acometimento mucoso é
distante da lesão na pele a apresentação mucocutânea é concomitante, e quando o
comprometimento mucoso ocorre por extensão da lesão de pele situada próximo à mucosa
é chamado de contíguo.
9
2.3 Imunidade
A resposta imunológica do indivíduo é um fator determinante no resultado da
infecção por Leishmania. Esta resposta pode ser dividida em resposta imune inata e
resposta imune adaptativa, sendo esta mais específica contra o patógeno. O resultado
clínico de uma infecção por Leishmania é variável e dependente da relação entre fatores do
parasito e do hospedeiro, o que pode ser observado pela manifestação de mais de uma
forma clínica causada pela mesma cepa de Leishmania (Rogers et al., 2002).
Quando o indivíduo entra em contato com o parasita, macrófagos/monócitos e
células dendríticas atuam fagocitando o parasita (formas promastigotas) e são as principais
células apresentadoras de antígeno, capazes de induzir eficientemente a diferenciação e
ativação de células T. Além disso, as células dendríticas são importantes na regulação da
resposta efetora e na manutenção do mecanismo de memória. Estas células são capazes de
distinguir diferentes tipos de patógenos e assim promover um sinal para as células T, via
MHC II, a fim de iniciar uma resposta imune apropriada. Campos et al. (2001) sugere que o
alvo de ativação das células dendríticas por protozoários, bem como para produtos
bacterianos, seja pelo reconhecimento de moléculas do patógeno através de membros da
família de receptores como toll-like receptor (TLR). Essa ativação concomitante a
produção de IL-12 e outras citocinas aumentam a expressão de moléculas co-estimulatórias
e de quimiocinas que promovem a migração de mais células dendríticas ao tecido periférico
e aos órgãos linfóides (Scott & Hunter, 2002).
A produção de IL-12 é crítica ao desenvolvimento de uma resposta imune protetora
(tipo 1), sendo sua principal fonte as células dendríticas. No entanto, a infecção dos
macrófagos por Leishmania prejudica o estímulo a produção de IL-12 por estas células,
mas este mecanismo ainda é desconhecido (Carrera et al., 1996; Belkaid et al., 1998; Scott
& Hunter, 2002). Outras citocinas como TNF-α e INF-α/β são produzidas pelas células
dendríticas ativadas, e assim como IL-12 induzem a produção INF-γ pelas células NK e
células T (Awasthi et al., 2004; Hamerman et al., 2005).
O INF-γ é a principal citocina produzida por células NK, T CD4+, T CD8+ e T γ/δ
de indivíduos infectados por Leishmania e é capaz de induzir a produção de óxido nítrico
(NO) dentro dos macrófagos levando a destruição do parasita. No entanto, citocinas como
10
TNF-α, IL-6, IL-18 e IL-12 e INF-α/β (INF do tipo 1) atuam sinergicamente com o INF- γ
no controle do parasita (Mattner et al., 1996; Rogers et al., 2002; Awasthi et al., 2004).
Estudos em modelos experimentais demonstraram que o controle da infecção por
Leishmania é dependente de células T, e que após a apresentação de antígeno a resistência
do organismo ao parasito ocorre diante de uma ativação e diferenciação seletiva das células
T CD4+ para o tipo 1. Esta resposta é caracterizada pela presença de citocinas, como INF-γ,
IL-2, IL-12, IL-18, TNF-α, que induzem a ativação de macrófagos e aumentam a produção
de óxido nítrico e intermediários reativos de oxigênio, no interior dos fagócitos,
promovendo destruição de parasitas intracelulares (Afonso & Scott, 1993; Ribeiro-de-Jesus
et al., 1998; Rogers et al 2002; Awasthi et al., 2004).
Entretanto, quando há uma diferenciação das células T CD4+ para o tipo 2, em
animais experimentais, com uma expressiva produção de citocinas como IL-4, IL-5 e IL-6,
estas atuam inibindo a ativação de macrógagos e permitindo a multiplicação e
desenvolvimento do parasita, além de promoverem produção de anticorpos específicos
contra o mesmo tornando estes hospedeirso susceptíveis ao desenvolvimento da
leishmaniose (Afonso & Scott, 1993; Riberio-de-Jesus et al., 1998; Rogers et al., 2002).
Citocinas como IL-10, IL-13 e TGF-β atuam na imunomodulação da resposta
imune, diminuindo a reposta tipo 1, sendo caracterizada por resposta tipo 3. O grupo celular
Th3 é gerado a partir de células T imaturas (Th0) e produzem citocinas que inibem a
produção de INF-γ, impedindo danos ao tecido e promovendo um equilíbrio entre as
respostas tipos 1 e 2 (Rogers et al., 2002; Mills, 2004).
Outro grupo de células que atuam na modulação da resposta imune são as células T
reguladoras naturais (T CD4+CD25+) produzidas no timo e capazes de inibir a proliferação
e produção de citocinas pelas células T CD4+ (Th1 e Th2), in vitro. O mecanismo de ação
destas células ainda não está bem estabelecido, mas existem evidências de que um contato
célula a célula é requerido com o envolvimento de uma molécula co-estimulatória de
inibição (CTLA 4). No entanto, existem evidências da capacidade de produção de citocinas
(IL-10 e TGF-β) por estas células, controlando a resposta imune excessiva ou mal
direcionada, incluindo resposta contra patógenos e antígenos próprios (Maloy & Powrie,
2001; Shevack, 2002; Mills, 2004; Lima, 2006).
11
Ji et al. (2005) avaliando a quantidade de células reguladoras naturais na infecção
por L. amazonensis, em camundongos, observaram um rápido acúmulo destas células no
sítio de infecção correlacionadas com o aumento da expressão de TGF- β e IL-10,
evidenciando o papel destas no controle da resposta tipo 1 e na progressão da doença.
A presença de uma maior proporção de células T já foi observada em pacientes
curados quando comparados com a proporção anterior à terapia (Da-Cruz et al., 1994). Nos
processos efetores o subsítio de células T CD4+ é crucial para a resistência do indivíduo à
infecção por Leishmania. Já as células T CD8+ têm sido encontradas participando dos
eventos de memória imunológica, independente da presença do antígeno (Müller, 1992;
Huber et al., 1998; Belkaid et al., 2002; Rhee et al., 2002) e isto pode ser uma alternativa
para explicar a maior proporção da linhagem destas células entre indivíduos vacinados
contra LTA (De Luca et al., 1999).
A forma cutânea da LTA apresenta uma forte resposta imune mediada por células T,
caracterizada por uma alta resposta linfoproliferativa e desenvolvimento de uma reação de
hipersensibilidade tardia frente aos antígenos de Leishmania, além da produção de INF-γ
(Ribeiro-de-Jesus et al., 1998). Entretanto, no início da infecção há uma menor produção de
INF-γ e uma maior produção de IL-10, o que permite a sobrevivência e multiplicação do
parasita (Almeida et al., 1995; Ribeiro-de-Jesus et al., 1998). Porém, 60 dias em média após
o início da infecção uma forte produção de INF-γ nos infectados é observada, com
predomínio de uma resposta tipo 1, em pacientes com forma cutânea da LTA (Ribeiro-deJesus et al, 1998).
Na forma mucosa uma alta resposta tipo 1 com produção exacerbada de INF-γ e
TNF-α estão associados à destruição tecidual, sendo assim responsáverl pela patogênese
desta forma de LTA (Ribeiro-de-Jesus et al, 1998).
Já na forma cutâneo-difusa ocorre uma anergia, onde há uma intensa multiplicação
do parasita e uma dificuldade no tratamento, evidenciando a influência das células
apresentadoras de antígeno, moléculas co-estimulatórias e o ambiente de citocinas
presentes no organismo na diferenciação das células T (Convit et al., 1993).
Muitos autores, estudando infecções experimentais em modelos animais, têm
demonstrado que a imunidade celular exerce um papel importante na cura da LTA
(Carvalho et al., 1985; Conceição- Silva et al., 1990; Rousseau et al., 2001; Scott & Hunter,
12
2002), estando diretamente relacionada a ativação de macrófagos, mediante a presença de
citocinas (INF-γ e TNF-α), com a produção de óxido nítrico, que leva a destruição dos
parasitas intracelulares (Ribeiro-de-Jesus et al, 1998).
Já o agravamento da infecção, ocorre pelo bloqueio da atividade fagocitária pela
ação de citocinas como IL-4 e IL-10 que atuam, permitindo a proliferação intracelular das
amastigotas (Afonso & Scott, 1993; Launois et al., 1997; Ribeiro-de-Jesus et al, 1998;
Kane & Mosser, 2001; Rogers et al., 2002).
2.3.1 Aspectos nutricionais e resposta imune
O conhecimento da relação entre aspectos nutricionais e a resposta imunológica
vêm sendo ampliada em diversos estudos e a desnutrição é um fator importante para a
morbi-mortalidade de doenças infecciosas e sistêmicas. As primeiras evidências de
desnutrição protéico-calórica e o desenvolvimento de LV foram descritas em camundongos
(Actor, 1960). Harrison et al. (1986) observaram uma maior freqüência de LV em crianças
com desnutrição protéico-calórica quando comparado as eutróficas. Cerf et al. (1987)
observaram uma associação entre a desnutrição e a gravidade do calazar, onde crianças com
desnutrição moderada a grave apresentavam um risco relativo de desenvolvimento da LV
de 8,7 quando comparado a crianças como o estado nutricional normal.
A relação entre a deficiência nutricional e a LTA tem sido pouco estudada. Perez et
al.(1979) observaram que camundongos alimentados com dieta pobre em proteínas e
vitaminas apresentaram uma maior suscetibilidade à infecção pela L. (L.) mexicana. Weigle
et al. (1995) observaram uma maior incidência de leishmaniose cutânea localizada entre
crianças equatorianas com anemia ferropriva ou com desnutrição protéico-calórica.
Dentre os fatores nutricionais, os elementos traço têm sido fatores chave para
designar uma melhor proteção em animais e humanos contra infecções, sendo os principais
relacionados a esta proteção o cobre, ferro, selênio e zinco (Munoz et al., 1995; Percival,
1998; Brock & Mulero, 2000; Erickson et al., 2000; Fraker et al., 2000; Rink & Haase,
2007).
Estes elementos traço apresentam uma relação importante no desenvolvimento da
imunidade inata e adaptativa, atuando na produção, maturação e função de células dos
mecanismos de defesa do organismo, como macrófagos, células “natural killer” (NK) e
13
neutrófilos, na imunidade inata e células B e T, na adaptativa. (Erickson et al., 2000; Ibs &
Rink, 2003). Estas células requerem uma suplementação adequada de alguns elementos
traço para expressão e preservação da estrutura e função de metaloproteínas, essenciais à
produção de energia (como ferro nos citocromos a, b e c, NADH e succinato
desidrogenase) e proteção das células contra espécies reativas de oxigênio altamente
tóxicas (como cobre e zinco na superóxido desmutase, ferro na catalase e o selênio na
glutationa peroxidase). Além disso, alguns elementos são componentes estruturais de
enzimas requeridas na replicação de DNA e divisão celular e atuam na manutenção de
inúmeras enzimas ligadas diretamente ao processo de defesa do organismo (Erickson et al.,
2000; Linder, 2001; Rink & Haase, 2007).
Características nutricionais do indivíduo, como níveis séricos de elementos traço,
têm um papel relevante no desenvolvimento da resposta imunológica específica ao antígeno
de Leishmania, apresentando diferentes perfis séricos nas diferentes formas clínicas da
LTA (Faryadi & Mohebali, 2003; Kocygit et al., 1998; Machado-Coelho et al., 2005) e a
resposta ao tratamento ou às vacinas (Kocygit et al., 1998).
2.3.1.1 Cobre
O cobre é o 29º elemento da tabela periódica e é distribuído nos sistemas biológicos
no estado cúprico (oxidação +2). Em indivíduo adulto saudável cerca de 50 a 120 mg de
cobre são distribuídos pelo corpo, apresentando uma concentração sanguínea aproximada
de 1000 µg/L. Em geral, ele se encontra no organismo complexado a proteínas, peptídeos,
aminoácidos e outras substâncias orgânicas, sendo necessário às atividades estruturais e
catalíticas das metaloenzimas que o contém (Linder et al., 2001; Alexandrova et al., 2003).
O cobre é um cofator essencial de muitas enzimas que participam nos processos de óxidoredução, como citocromo c oxidase, superóxido desmutase, catecol oxidase, dopamina-bmonoxigenase entre outras. (Tainer et al., 1983; Palumbo et al., 1990; Yoshikawa et al.,
1995).
A absorção do cobre ocorre desde o estômago até o duodeno, uma vez que o
ambiente ácido do estômago promove liberação do cobre dos complexos orgânicos
naturais. Cerca de 70% desse elemento encontra-se ligado a ceruloplasmina, enzima capaz
de ligar 6 a 7 átomos de cobre em 3 sítios quimicamente distintos (Linder et al., 2001). A
14
excreção de cobre endógeno ocorre através da bile no interior do trato gastrointestinal
(Turnlund et al., 1998). Alguns defeitos metabólicos como Síndrome de Menkes e Doença
de Wilson, gravidez e inflamação influenciam no metabolismo do cobre no organismo
(Beshgetoor & Hambidge, 1998).
A deficiência de cobre é freqüentemente resultado de uma dieta inadequada,
síndromes de má absorção, condições que predispõe uma grande perda do elemento ou que
aumentam a sua necessidade, como o crescimento rápido, prematuros com baixo peso e
crianças que se alimentam frequentemente com leite enriquecido com altas concentrações
de carboidratos refinados, pois a frutose e outros açúcares refinados levam a menor
absorção do cobre (Turnlund et al., 1998). Já o aumento das concentrações séricas deste
elemento é relatado em resposta ao estresse, inflamação e infecção, na Doença de
Parkinson, Diabetes mellitus e em condições envolvendo obstrução do fluxo da bile (Milne,
1994; Beshgetoor & Hambidge, 1998).
Em experimentos com animais deficientes de cobre foi observado um quadro de
anemia e diminuição do timo e baço. Em humanos, a neutropenia, sinal clínico da
deficiência deste elemento, associado a uma diminuição da capacidade do neutrófilo em
produzir ânions superóxido e destruir microorganismos fagocitados foi relatada por alguns
autores (Graham & Cordano, 1976; Williams et al., 1983; Kelley et al., 1995; Percival et
al., 1998). Mudanças similares são encontradas nos macrófagos (Babu & Failla, 1990).
Essa neutropenia se deve a uma menor produção de células pela medula óssea diante da
morte das células progenitoras da linhagem de polimorfonucleados, diminuição do tempo
de vida dos neutrófilos periféricos circulantes e uma alteração da distribuição de células
sanguíneas para os tecidos e órgãos ou alteração nos padrões de maturação da população de
leucócitos, como o aumento de mastócitos (Percival et al., 1995). Além disso, Higushi et al,
(1991) detectou anticorpos anti-neutrófilos no soro de indivíduos deficientes de cobre, o
que pode indicar um mecanismo de perda destas células.
Durante a deficiência de cobre a resposta imune adquirida também é afetada, sendo
observada a diminuição do timo e do baço, acompanhada de produção de anticorpos
significativamente reduzida, em experimentos animais. Além de um aumento de IL-1 e
diminuição da produção de IL-2 pelos linfócitos T, por inibição da transcrição do gene de
15
IL-2, alterando o padrão de citocinas da resposta imune. (Koller et al., 1987; Lukasewycz et
al., 1990; Hopkins & Failla, 1997).
Em um processo inflamatório uma alteração dos níveis séricos de cobre têm sido
relatada por vários autores (Klassing et al., 1987; El- Khoyl et al., 1990; Mastousek et al.,
1993; Beshgetoor & Hambidge, 1998; Kocyigit et al., 1998; Faryadi & Mohebali, 2003) e
uma relação entre estas mudanças e o aumento da síntese de proteínas de fase aguda (como
a ceruloplasmina) vem sendo bem estabelecida como parte de uma estratégia de defesa do
organismo induzidas por substâncias, liberadas por macrófagos ativados, como IL-1, TNFα e IL-6 (Barber & Cousins, 1988; Klassing et al., 1988). A IL-1 por sua vez induz ao
aumento de ceruloplasmina, importante na absorção do cobre, associado a seu aumento
sérico durante processos inflamatórios e infecciosos (Klassing et al., 1987, 1988), como
observado na leishmaniose cutânea causada por L. major (Faryadi & Mohebali, 2003;
Kocyigit et al., 1998). Este aumento de cobre sérico também foi observado na LTA (formas
cutânea e mucosa) e na leishmaniose visceral (LV) por Van Weyenbergh et al. (2004) ao
avaliarem indivíduos com LTA e LV, no Brasil. Porém após tratamento convencional os
níveis séricos de cobre voltaram a níveis semelhantes aos de indivíduos saudáveis (Kocyigit
et al., 1998; Van Weyenbergh et al., 2004).
2.3.1.2 Ferro
O ferro é o metal mais abundante no corpo humano, com uma concentração
aproximada de 30 a 40 mg/Kg em um adulto saudável, variando em função da idade e do
sexo (Bothwell et al., 1979). Cerca de 2/3 do ferro corporal está associada à hemoglobina
nos eritrócitos, o restante permanece em estoque na forma de ferritina e hemossiderina e
menos de 0,1% se encontra ligado a transferrina no plasma (Bricks et al., 1994). O fígado é
o principal órgão de estoque de ferro, contendo cerca de 60% de ferritina, que é diariamente
utilizada quando há necessidade de suprir demanda das células mediante uma ingestão
insuficiente deste elemento.
A deficiência de ferro é a causa mais freqüente de anemia em todo mundo, afetando
cerca de 2 bilhões de pessoas. Embora seja um problema presente em todos os grupos
etários, em países em desenvolvimento, os casos mais severos são encontrados entre os
16
lactentes, crianças e mulheres em idade fértil (Damsdaran et al., 1979; Dallman et al., 1986;
Bricks, 1994; Handler et al., 2002).
Os dados da literatura são conflitantes em relação à associação dos processos
infecciosos com as deficiências nutricionais de ferro. A carência de ferro aumenta a
susceptibilidade às infecções por prejudicar o sistema imunológico do hospedeiro. No
entanto, o excesso de ferro no organismo promove a formação intracelular de radicais
livres, gerando um dano oxidativo nas células (Cardier et al., 1995) e favorece o
crescimento intracelular e multiplicação de patógenos, por reduzir a produção de citocinas
importantes a ativação celular e inibir a ação de fagócitos, neste caso sua deficiência tem
até um valor protetor contra infecções (Bricks et al., 1994, Mencacci et al., 1997).
Como este elemento é essencial ao organismo e ao mesmo tempo apresenta uma
toxicidade potencial às células, faz-se necessário um esquema regulatório sofisticado e
complexo, a fim de suprir a demanda das células e impedir um acúmulo deletério. Um
suprimento adequado de ferro é necessário para muitos processos biológicos, como reações
de transferência de elétrons, regulação gênica, ligação e transporte de oxigênio, regulação
do crescimento e diferenciação celular. Sua homeostase envolve a regulação de absorção,
distribuição, estocagem em ferritina, incorporação em proteínas e regulação da liberação de
ferro dos transportadores para outras células ou órgãos (Beard, 2001).
O sistema imune requer o ferro para vários mecanismos de defesa, incluindo a
produção de intermediários reativos de oxigênio (IRO) e óxido nítrico, melhorando a
capacidade citotóxica dos fagócitos (Alford et al., 1991; Behar et al., 1999; CunninghamRundles et al., 2000; Collins et al., 2002). Além disso, ele está envolvido na regulação da
produção de citocinas e no mecanismo de ação através de segundo mensageiro (Hershko et
al., 1996). Sua deficiência leva a uma atrofia do timo, redução da reação de
hipersensibilidade tardia (Omara et al., 1994), diminuição da atividade das células NK,
baixa produção de IL-1, IL-2, INF-γ e TNF-α (Omara et al., 1994), diminuição no número
de linfócitos T e de sua blastogênese e mitogênese (Sussman, 1974; Kuvibidila et al.,
1999). Porém, não afeta a produção de neutrófilos, altera apenas sua atividade por reduzir a
atividade da mieloperoxidase, uma enzima contendo ferro responsável pela produção de
IRO levando morte intracelular de patógenos (Spear & Sherman, 1992; Beard, 2001). Estas
17
alterações são corrigidas com a reposição deste elemento (Spear & Sherman, 1992;
Kuvibidila et al., 1999; Cunningham-Rundles et al., 2000;).
Como a síntese de DNA requer uma enzima ferro dependente, ribonucleotídeo
redutase, a multiplicação de células pode ser limitada diante da deficiência deste elemento.
E o controle e diferenciação das células são influenciados pela biodisponibilidade do ferro e
seu transporte para o interior das mesmas, via receptor de transferrina, sendo este um
possível mecanismo que explica um dos efeitos da deficiência de ferro no sistema imune
(Beard et al., 2001).
Citocinas como IL-1, TNF-α e INF-γ influenciam o movimento do ferro no
organismo, reduzindo seu pool intracelular disponível por diminuir o receptor de
transferrina na superfície da célula, aumentando os estoques de ferritina e ativando os
sistemas de síntese de óxido nítrico levando a um diminuição sérica do ferro e um aumento
da resposta tipo 1 (Sussman et al., 1974; Murray et al., 1978; Damsdaran et al., 1979;
Kochanowski & Sherman, 1985; Ike et al., 1992; Hallquist et al., 1992; Fishbane et al.,
1999, Brock & Mulero, 2000).
A imunidade humoral parece ser menos afetada pela deficiência de ferro que a
imunidade celular. Em indivíduos com carência de ferro a produção de anticorpos em
resposta a imunização, com vários antígenos, é preservada. (Hallquist et al., 1992; Spear &
Sherman, 1992).
Durante os processos inflamatórios e infecciosos, como na LTA, os níveis séricos
de ferro encontram-se diminuídos quando comparados a um grupo de indivíduos saudáveis
(Kocyigit et al., 1998; Faryadi & Mohebali, 2003). Como muitos patógenos (fungos,
bactérias e protozoários) necessitam do ferro para replicação e desenvolvimento, proposto
por alguns autores uma estratégia de defesa do organismo seria uma redistribuição deste
elemento, tornando-o indisponível aos parasitas. Estas mudanças são induzidas por
citocinas como IL-1, TNF-α e IL-6 liberadas dose-dependente por macrófagos ativados
(Klassing et al., 1988; Brock & Mulero, 1994; Kocyigit et al., 1998).
A lactoferrina é uma proteína ligada ao ferro por alta afinidade, liberada por
neutrófilos, presente em fluidos do corpo como leite, saliva, lágrimas e soro, capaz de
retirar o ferro da circulação e dos tecidos. Consequentemente, durante a infecção por
microorganismos ela funciona como molécula de defesa seqüestrando o ferro circulante.
18
Este mecanismo foi evidenciado em pacientes com tuberculose (Schaible & Kaufmann,
2002), candidíase (Tanida et al., 2001; Ueta et al., 2001), cólera e infectados com algumas
enterobactérias (Yamaushi et al., 1993; Walker & Walker, 2000), sugerindo um provável
mecanismo para tornar o ferro indisponível à utilização de microorganismos invasores
podendo explicar assim os casos de anemia em infecções crônicas.
Em experimentos com camundongos, Bisti et al (2000) observou que o excesso de
ferro também modula a infecção por L. major, resultando em uma menor multiplicação do
parasita, com uma redução de IL-4, IL-6 e IL-10 e aumento de INF-γ e expressão de óxido
nítrico sintetase (iNOS). O contrário foi observado em pacientes com excesso de ferro,
medido pela saturação de transferrina, altos níveis de citocinas antiinflamatórias como IL-4,
IL-6 e IL-10, além de um bloqueio na expressão de iNOS (Weiss, 1999), sugerindo que a
susceptibilidade a infecções promovida pelo excesso dos níveis sérios deste elemento se
deve, não somente a sua disponibilidade aos patógenos favorecendo seu crescimento, como
também a uma alteração na imunidade inata e adquirida.
Pedrosa et al., (1990a) avaliando os efeitos da suplementação e deficiência de ferro
na evolução da Doença de Chagas em camundongos, observaram resultados discordantes
em relação as cepas de Trypanosoma cruzi. A deficiência de ferro foi correlacionada a
baixa parasitemia e baixa mortalidade de camundogos infectados com a cepa YuYu, mas
apresentou-se maléfica quando camundongos eram infectados com a cepa CL e Y. Os
autores sugerem que estas diferenças podem ser consideradas a variadas expressões
intraespecíficas entre as cepas. Porém a suplementação de ferro foi correlacionada a alta
parasitemia e mortalidade dos camundongos infectados pelas cepas Y, CL e YuYu.
2.3.1.3 Selênio
O selênio é um elemento traço que a partir da década de 50 vem sendo reconhecido
como essencial ao organismo humano com a avaliação de suas diversas funções. Cerca de
mais de 30 selenoproteínas estão sendo identificadas, mas apenas 12 foram parcialmente ou
completamente caracterizadas (Behne et al. 1997; Mckenzie et al. 1998). A primeira
selenoenzima identificada foi a glutationa peroxidase, responsável pela degradação do
peróxido de hidrogênio e neutralização dos radicais livres formados, sendo provavelmente a
principal enzima na proteção contra danos oxidativos (Thomson et al., 1977).
19
O nível de selênio nos produtos agrícolas varia proporcionalmente ao teor do
elemento no solo onde são cultivados e são refletidos nos níveis séricos deste elemento na
população, como demonstrado em alguns estudos nas regiões da Finlândia, Nova Zelândia,
costa leste dos EUA e China (Thomson et al., 1996; Burk et al., 1999). Um estudo
ecológico desenvolvido em quatro províncias do Iran, com baixos níveis de selênio no solo,
demonstrou a relação de maior ocorrência de câncer gástrico na província onde a população
apresentou menores valores de selênio sérico entre a população, com uma correlação de
76% (Nouraie et al., 2004).
Os alimentos contêm formas orgânicas de selênio como a selenometionina e a
selenocisteína, mas muitos experimentos que utilizam suplementação têm usado formas
inorgânicas como selenito, embora as orgânicas sejam melhor biodisponibilizadas no
organismo. Entretanto o selenito reage rapidamente com a glutationa peroxidase presente
nos eritrócitos para formar as selenoglutationas, ou seja, ativando a enzima que possui
atividades anticarcinogênicas e induz a apoptose de células tumorais humanas (Mckenzie et
al., 1998).
Estudos realizados em Linxian, China, onde os níveis de selênio são baixos no solo
e nos alimentos, observou-se uma correlação entre altos níveis de carcinomas no esôfago e
no estômago em indivíduos com baixa concentração sérica deste elemento (Blot et al.,
1985; Li et al., 1993), mas com o uso de suplementação de selênio foi observado uma
redução do risco de um desenvolvimento destes tipos de cânceres (Mark et al., 2000). Com
base em resultados de estudos animais e boas correlações encontradas em avaliações nas
populações humanas, o selênio tem demonstrado exercer um efeito anticarcinogênico,
através de alguns mecanismos (Fleming et al., 2001). Sua ação antioxidante é responsável
pela redução dos danos no DNA pelos radicais livres e modulação de enzimas que atuam na
degradação de xenobióticos envolvidos no metabolismo carcinogênico, reduzindo o
impacto de substâncias carcinógenas exógenas provenientes da dieta e prevenindo a
degeneração do tecido e a ocorrência de doenças cardiovasculares.
A glutationa peroxidase inibe enzimas inflamatórias, como a óxido nítrico sintetase
e a proteína C kinase, e atua na síntese de metabólitos do ácido araquidônico, na síntese de
lipoxinas, prostaglandinas e leucotrienos, reduzindo os lipoperóxidos, cujo acúmulo
20
prejudica a síntese de prostaciclina e promove um aumento de tromboxana, que leva a uma
maior agregação plaquetária nas doenças cardiovasculares (Mckenzie et al., 1998).
Um grande avanço no entendimento do papel do selênio no organismo humano
aconteceu com a descoberta de selenoenzimas responsáveis pela conversão periférica da
tiroxina (T4) para sua forma ativa 3,3’,5-triiodotironina (T3), a iodotironina deiodinase,
tipos I, II e III. Além disto, a glutationa peroxidase é altamente expressa nas células
foliculares da tireóide. Estas selenoenzimas são capazes de modular muitos aspectos do
metabolismo do hormônio da tireóide como iodinação da tireoglobulina na glândula
tireóide, síntese periférica de T3 a partir de T4, degradação de T4, inativação de T3 e
regulação da atividade da tireóide via eixo hipotálamo-pituitária (Hawkes & Keim, 2003).
Imunologicamente a habilidade das selenoproteínas, junto com a vitamina E, em
proteger o hospedeiro do estresse oxidativo, durante processos inflamatórios, é de vital
importância, sendo uma das formas do hospedeiro para minimizar os danos celulares que a
geração de radicais livres no interior de neutrófilos e macrófagos ativados pode causar. A
regulação da expressão de receptor IL-2 de alta afinidade nas células T, proliferação e
citotoxicidade destas células são algumas das funções do selênio no sistema imune, e como
estas células são componentes chave na ativação de células B para síntese de anticorpos,
isto pode explicar o efeito estimulatório deste elemento na produção de anticorpos (Roy et
al., 1994; Mackenzie et al., 1998). E de fato uma diminuição da imunidade celular relativa à
idade pode ser parcialmente revertida com suplementação de selênio aumentando a resposta
para IL-2 (Roy et al., 1994). Experimentos com suplementação de selênio demonstram um
aumento da atividade de células NK, macrófagos e células T citotóxicas, em camundongos
e humanos (Mckenzie et al., 1998).
Kocyigit et al. (1999) observou uma diminuição sérica de selênio associada a uma
menor atividade da glutationa peroxidase em indivíduos com leishmaniose cutânea, na
Turquia, quando comparados com indivíduos saudáveis residentes na mesma área. Com
base nestes resultados, estes autores sugerem que assim como demonstrado para outros
elementos (cobre, ferro e zinco) (Kocyigit et al., 1998; Faryadi & Mohebali, 2003; Van
Weyenbergh et al., 2004) o organismo, como estratégia de defesa, produz citocinas que
induzem uma redistribuição do elemento. Uma diminuição sérica do selênio e
consequentemente da glutationa peroxidase leva a uma menor capacidade de neutralização
21
dos intermediários reativos do oxigênio, produzidos na degradação do peróxido de
hidrogênio no interior dos fagócitos, durante o estresse oxidativo, aumentando o estresse
oxidativo e levando a morte de parasitas intracelulares. Além disso, sua deficiência “in
vitro” limita o crescimento de microorganismos como Salmonella typhimurium (Boyne et
al., 1984), P. bergueii e L. monocytogenes (Murray et al., 1985).
2.3.1.4 Zinco
O zinco é um elemento traço relevante ao funcionamento do organismo humano,
uma vez que ele é cofator de mais de 300 enzimas, atuando como componente catalítico ou
como constituinte estrutural, além de sua função antioxidante neutralizando os radicais
livres (Coleman et al., 1992; Rink & Gabriel, 2000). Todd et al. (1934) foi o primeiro a
apresentar a necessidade do zinco para o crescimento e desenvolvimento de camundongos.
Aproximadamente 30 anos depois, Prasad et al. (1963) descreveu a síndrome da deficiência
de zinco em crianças da Pérsia que praticavam geofagia e se caracterizava por anemia,
hipogonadismo, hepatoesplenomegalia, alterações na pele e no crescimento e retardo
mental.
O total de zinco em um organismo humano saudável varia entre 2 a 4 g; este é
predominantemente ligado a albumina (60%), α2-macroglobulina (30%) e transferrina
(10%) (Scott & Bradwell, 1983). Sua biodisponibilidade é dependente da composição da
dieta. Alimentos ricos em fitato e fosfatos quelam o zinco, diminuindo sua absorção, assim
como dietas ricas em cátions bivalentes, como Cu, Mg, Cd, Ca, Ni e Fe. Durante períodos
de gravidez, amamentação e crescimento há um maior requerimento deste elemento, uma
vez que ele é necessário à proliferação das células (Ziegler et al., 1989) sendo fundamental
ao desenvolvimento e manutenção dos sistemas com alta proliferação celular como a pele,
sistema imune e reprodutor (Chandra et al., 1984; Rink & Gabriel, 2000).
Fatores de interação com DNA e RNA, como fatores de transcrição e replicação,
são zinco dependentes, e a estabilidade do RNAm é influenciada pelo zinco, por isso a
hipozincemia influencia na diminuição da proliferação celular, alterando também as células
do sistema imune (Maret et al., 1999; Taylor & Blackshear, 1995). Outro efeito do zinco é a
regulação do processo de apoptose das células que é diminuído frente à presença deste
elemento traço (Jiang et al., 1995). Vários mecanismos são sugeridos para esta inibição da
22
apoptose, dentre eles a inibição da caspase-3 pelo zinco, indução da síntese de DNA e
antagonismo de cálcio inibindo a endonuclease Ca2+/Mg2+ (Maret et al., 1999; Rink &
Gabriel, 2000).
Na imunidade inata a quantidade dos neutrófilos, células NK e macrófagos
encontram-se diminuídos na deficiência de zinco, bem como o recrutamento, a capacidade
fagocítica e citotóxica destas células (Allen et al., 1983; Keen et al., 1990; Prasad et al.,
2000). As células NK ainda requerem o zinco para interação entre p58, um receptor
inibitório das células NK, e de moléculas do complexo de histocompatibilidade maior
classe I (MHC I) nas células T alvo, resultando na inibição da atividade de morte pelas
células NK (Rajagopalan et al., 1995). Aliado a esta alteração das funções das células NK e
células T, a capacidade fagocítica de células mononucleares é reduzida na infecção por
Trypanosoma cruzi, observado em indivíduos com estados deficientes de zinco (Wirth et
al., 1989; Cook-Mills et al., 1990).
As evidências iniciais relativas ao papel essencial do zinco na imunidade
relacionavam-o ao desenvolvimento de células T, visto que sua deficiência leva a uma
atrofia tímica, por ser cofator da timulina, hormônio secretado pelas células epiteliais do
timo que induz a diferenciação de células T imaturas. Este elemento também modula
secreção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico e induz proliferação
de células T CD8+ em combinação com IL-2 (Coto et al., 1992), anergia, redução da
resposta linfoproliferativa a mitógenos. Estas mudanças são reversíveis após suplementação
de zinco (Fraker et al., 1995; Mocchegiani et al., 1995). Na produção de citocinas este
elemento traço está relacionado à manutenção do equilíbrio entre as células T “helper”
(Th1 e Th2), induzindo a produção de IL -1, IL-6, TNF-α e INF-γ, além de aumentar a
expressão de receptores de alta afinidade para IL-2 nas células mononucleares do sangue
periférico (Salas & Kirchner, 1987; Rink & Gabriel, 2000).
A utilização do zinco como adjuvante em vacinas, quando administrado em
populações com deficiência deste elemento, com dose de suplementação padronizada
rigorosamente é uma interessante aplicação do zinco, melhorando a resposta imune a
vacinas (Fraker et al., 1986; Cakman et al., 1996). Entretanto, os resultados tem sido
contraditórios, pois o excesso de zinco, in vitro e in vivo, inibe a função das células T e
reduz a produção de INF- γ (Chandra et al., 1984). Em alguns estudos onde altas doses
23
(40.000µg/L) de suplemento de zinco foram administradas a pacientes foi observada uma
diminuição das funções imunológicas, como por exemplo, a redução da reação de
hipersensibilidade tardia (Chandra et al., 1984; Patterson et al., 1985; Provinciali et al.,
1998; Reinhold et al., 1999; Rink & Gabriel, 2000). Este efeito inibitório do excesso de
zinco tem se tornado uma nova ferramenta para o uso na terapia imunossupressora de baixa
toxicidade, onde uma supressão seletiva das funções linfocitárias é desejável, como no
tratamento da artrite reumatóide e transplante de órgãos (Rink & Gabriel, 2000).
Os níveis séricos de zinco avaliados entre indivíduos com leishmaniose cutânea
(LC) aguda e crônica, comparados aos de indivíduos saudáveis, estavam significativamente
diminuídos (Faryadi & Mohebali, 2003). Resultados semelhantes foram encontrados por
Van Weyenbergh et al., (2004) em um estudo realizado no Brasil, entre indivíduos com as
formas cutânea e mucosa da LTA. Estes autores também observaram níveis deficientes
deste elemento entre os indivíduos com LV. Entretanto, após três meses do tratamento com
antimonial houve um retorno dos níveis séricos de zinco a níveis semelhantes aos do grupo
controle. Semelhantemente a este estudo, Kocyigit et al. (1998) observaram uma
hipozincemia entre os indivíduos infectados com L. major, que também era revertida após o
tratamento convencional com antimonial.
Vários autores sugerem que esta hipozincemia encontrada entre indivíduos
infectados por Leishmania ou com qualquer outro processo inflamatório, seja resultado de
uma redistribuição sérica do elemento no organismo, assim como no caso do cobre e ferro,
induzido principalmente por citocinas como IL-1, IL-6 e glicocorticóides, ativando a
síntese hepática de metalotioneína, sob controle da proteína kinase C. Este aumento da
metalotioneína, capaz de se ligar ao zinco sérico retirando-o da circulação, é sugerido, por
alguns autores, como mecanismo responsável pela hipozincemia observada durante
processos infecciosos (Rofe et al., 1996; Mocchegiani et al., 1998).
2.4 Diagnóstico da LTA
2.4.1 Diagnóstico clínico e epidemiológico
O diagnóstico clínico da forma cutânea da LTA é baseado nas características de
lesões na pele, número, distribuição e sítio de localização destas lesões. Estas úlceras são
24
circunscritas com borda elevada, fundo granuloso com ou sem exsudação, geralmente
indolores. Podem se apresentar na forma localizada (única ou múltipla) ou numerosas
lesões em várias partes do corpo (forma disseminada) (Pearson & Souza, 1996; Gontijo &
Carvalho, 2003).
Em um exame clínico de forma cutânea crônica, a mucosa deve sempre ser avaliada
bem como a história pregressa da lesão cutânea, uma vez que a forma mucosa geralmente é
secundária a cutânea e pode aparecer meses ou anos após a resolução das lesões de pele. As
áreas mais atingidas são as cavidades nasais, seguidas da faringe, laringe e cavidade oral. É
possível observar no exame clínico das mucosas atingidas infiltração, ulceração, perfuração
do septo nasal, e lesões ulcero destrutivas na mucosa oronasal (Gontijo & Carvalho, 2003).
Na anamnese, devem ser considerados, ainda, os dados epidemiológicos, como a
existência de casos de LTA na região, procedência de área endêmica (viagem de lazer ou
trabalho, residência anterior), referência de cães ou eqüinos com lesões e residindo nas
proximidades ou inserção em áreas florestais (Rodriguez et al., 1988; Gontijo & Carvalho,
2003).
2.4.2 Diagnóstico parasitológico
O exame parasitológico consiste na utilização de exames diretos (escarificação,
punção aspirativa e biópsia com impressão por aposição ou histopatologia) ou indiretos
(cultivo e inoculação em animais de laboratório) que evidenciem a presença do parasita
(Marzochi & Marzochi, 1994; Gontijo & Carvalho, 2003).
Com o material obtido após escarificação, punção aspirativa ou biópsia é realizada
impressão por aposição do fragmento obtido em lâmina de vidro, seguida de fixação do
material em metanol e corado pelas técnicas de Giemsa ou Leishman. Após a avaliação no
microscópio óptico a presença de amastigotas de Leishmania indica um resultado positivo.
Este material obtido pode ser adicionado a meios de cultura para o isolamento do parasita
(Melo, 1982) e através de técnicas moleculares é possível determinar a espécie do mesmo.
Este material também pode ser inoculado em animais de laboratório, sendo este reservado à
pesquisas, principalmente pelo tempo de resultado e pelos custos de manutenção do animal,
sendo o hamster (Mesocricetus auratus) o animal de escolha (Gontijo & Carvalho, 2003).
25
Na histopatologia o material retirado por biópsia deve ser fixado em formol a 10%,
e os parasitas, quando presentes, são encontrados em vacúolos intracitoplasmáticos dos
macrófagos ou nos espaços intercelulares, geralmente isolados. O diagnóstico de certeza
pela histopatologia somente é dado quando se identifica o parasita nos tecidos (Medeiros et
al., 2002).
2.4.3 Diagnóstico imunológico
O Teste de Montenegro (TM) é baseado na reação de hipersensibilidade tardia, onde
há aplicação intradérmica do antígeno de Leishmania padronizado, na porção anterior do
antebraço. A formação de uma enduração no local da aplicação após 48 a 72 indica
produção de uma resposta celular contra o antígeno em questão (Melo et al., 1977; da Costa
et al., 1996).
O TM é um teste auxiliar no diagnóstico da LTA e possui uma sensibilidade
variando de 86 a 100% e uma especificidade de aproximadamente 100% em área endêmica,
o que a consagrou como uma das provas mais utilizadas na confimação da LTA ativa
(Furtado, 1980; Guedes et al., 1990; Silveira et al., 1999). Um resultado positivo evidencia
presença de LTA ou exposição prévia ao parasito com ou sem aquisição da doença,
mantendo-se positivo mesmo após cicatrização de lesão cutânea tratada ou curada
espontaneamente (Salman et al., 1999). Em caso de lesões mucosas a reação do TM é tão
intensa que pode levar até a ulceração e necrose local. Já na forma cutâneo-difusa,
leishmaniose visceral, pacientes imunodeprimidos ou indivíduos nos primeiros 30 dias após
início da lesão cutânea o TM pode apresentar-se negativo (Melo et al., 1977; da Costa et al.,
1996). A negatividade do TM tem sido utilizada como critério de inclusão de indivíduos em
estudos de caracterização da resposta imune e avaliação da eficácia da imunização após
utilização de vacinas contra leishmaniose (Antunes et al., 1986; Armijos et al., 1998;
Marzochi et al., 1998; Mayrink et al., 1979; Nascimento et al., 1990), principalmente por
possuir uma ótima correlação com a proliferação de células mononucleares do sangue
periférico (Nascimento et al., 1990).
Os testes de Imunofluorescência Indireta (IFI) e testes imunoenzimáticos (ELISA)
avaliam a presença de anticorpos específicos ao antígeno de Leishmania no soro do
indivíduo infectado. Estes testes não devem ser utilizados isoladamente para o diagnóstico
26
de LTA, no entanto é útil como critério adicional no diagnóstico quando há lesões extensas
e múltiplas e em casos de lesões mucosas. Além do diagnóstico diferencial com outras
doenças, especialmente quando não há demonstração do parasita.
2.4.4 Diagnóstico molecular
A Polymerase chain reaction (PCR) vem sendo desenvolvida e utilizada desde a
década de 90, A reação é baseada na detecção de DNA ou RNA de Leishmania em
amostras clínicas humanas e de outros animais suspeitos de apresentarem infecção
(Rodgers et al., 1990; Pirmez et al., 1999; Marques et al., 2001; Weigle et al., 2002). Mas
sua utilização deve considerar o contexto clínico e epidemiológico da doença (Harris et al.,
1998).
Belli et al. (1998) ao comparar PCR com o exame parasitológico direto observaram
100% de sensibilidade e especificidade da técnica molecular. Pirmez et al. (1999)
observaram uma positividade de 96.9% pela PCR em indivíduos com leishmaniose cutânea
frente a uma positividade de 67,4% observada para exame parasitológico nos mesmos
indivíduos. Marques et al. (2006) utilizando pacientes de uma área endêmica em Minas
Gerais comparou a positividade dos cinco testes diagnósticos (exame parasitológico direto,
TM, PCR, IFI e ELISA). Eles demonstraram que a positividade encontrada pela PCR foi
maior que as do exame parasitológico e TM quando utilizados isoladamente Também
demonstraram que pela PCR foi possível detectar pessoas infectadas que apresentaram
exame parasitológico e TM negativos. As positividades dos testes sorológicos (IFI e
ELISA) e da PCR foram semelhantes nos indivíduos avaliados. Assim a PCR apresenta-se
como um método laboratórial alternativo para o diagnóstico da LTA, sendo muito útil
particularmente nos casos onde o exame parasitológico e o TM não conseguem detectar a
doença. Com a PCR é possível detectar o DNA ou RNA do parasita, em poucas semanas,
antes mesmo de aparecerem alguns sintomas ou sinais clínicos (Weigle et al., 2002; Faber
et al., 2003; Singh & Sivakimar, 2003; Lawn et al., 2004; Marques et al., 2006). Entretanto
seu custo elevado e a necessidade laboratórios de alta complexidade ainda limitam a
utilização deste teste em áreas endêmicas (Oliveira et al., 2003).
27
2.5 Tratamento
Apesar do uso medicinal de compostos de antimônio já ser conhecido desde a
Antigüidade, séculos antes da era cristã, para diversos fins terapêuticos, somente em 1912,
Gaspar de Oliveira Vianna observou que o tártaro emético era eficaz na terapêutica da LTA
(Vianna, 1912). Porém diante da intolerância, toxicidade e graves efeitos colaterais
indesejáveis estes antimoniais trivalentes foram substituídos por antimoniais pentavalentes
(Rath et al., 2003).
Atualmente o arsenal terapêutico contra a LTA é restrito e possui severas limitações
diante dos efeitos colaterais. Mas o tratamento convencional preconizado pela OMS se
baseia na utilização de antimoniais pentavalentes, existentes sob duas formas: o antimonial
N-metil glucamina e o stibogluconato de sódio, não sendo o último distribuído no Brasil
(Gontijo & Carvalho, 2003).
O Ministério da Saúde preconiza o antimonial pentavalente como droga de primeira
escolha no tratamento da LTA, com variação de dose entre 10 a 20 mg Sb/Kg/dia via IM
tanto para adulto ou criança por 20 dias consecutivos para as formas cutânea localizada,
disseminada e difusa. Para a forma mucosa uma dose de 20 mg Sbv/Kg/dia via IM por 30
dias, com repetição do esquema terapeutico até completa cicatrização (Gontijo & Carvalho,
2003). Na ausência de resposta ao tratamento convencional a utilização de drogas de
segunda escolha é recomendada (Gontijo & Carvalho, 2003).
Os antimonais pentavalentes possuem mecanismo de ação ainda desconhecido e são
contra-indicados a gestantes e indivíduos portadores de doenças crônicas (cardiopatias,
nefropatias, hepatopatias, Doença de Chagas) e nos casos de indivíduos com tuberculose,
malária e alergias. Além disso apresentam vários efeitos colaterais graves (Berman, 1997) e
resistência a estes tem sido reportada (Olliario & Bryceson, 1993).
Em Caratinga, o tratamento com o antimonial pentavalente (N-metil glucamina)
consiste em um esquema seriado, com administração de 1mL/5Kg de peso corporal, sem
exceder a 10mL/dia, por 10 dias consecutivos. Após um intervalo de 10 dias, o tratamento é
novamente repetido. O período de 10 dias de tratamento associado ao intervalo de 10 dias é
denominado uma série do tratamento. Novas séries devem ser repetidas até completa cura
clínica dos pacientes. Este esquema terapeutico seriado diminui os efeitos colaterais sendo
vantajoso frente ao esquema preconizado pelo Ministério da Saúde (Mayrink et al., 2006).
28
As drogas de segunda escolha podem ser administradas quando não se obtém
resposta ao tratamento com antimonial ou na impossibilidade de seu uso. A Anfotericina B,
um antibiótico poliênico de reconhecida ação leishmanicida, deve ser administrada sob
vigilância, em serviços especializados, com paciente hospitalizado. Esta possui alto custo,
muitos efeitos colaterais e é contra indicada a gestantes, cardiopatas, nefropatas e
hepatopatas (Machado-Pinto et al., 2002). A anfotericina B pode ser incorporada em
lipossomas carregadores sendo absorvida pelo sistema reticuloendotelial onde o parasita da
leishmania reside, e é assim pouco absorvido pelos rins, o maior órgão alvo para a
toxicidade da anfotericina B, mas seu alto custo limita seu uso pelos pacientes (Rath et al.,
2003; Amato et al., 2004).
A Pentamidina é outro medicamento com o qual se tem bons resultados, com baixas
doses, na infecção por L. (V.) guyanensis, embora tenha as mesmas contra-indicações da
Anfotericina B e vários efeitos colaterais como hipoglicemia, hipotensão, alterações
cardiológicas e nefrotoxicidade, o que inviabiliza o amplo tratamento de todos os
indivíduos afetados pela LTA. Este fármaco também é eficaz para o tratamento e
cicatrização das lesões na forma mucosa onde houve falha terapêutica com antimoniais,
anfotericina B e cetoconazol (Amato, 1997).
O efeito terapêutico de outros fármacos vêm sendo testados em indivíduos com
LTA, como Miltefosina, um agente oral, utilizado no tratamento de câncer, que tem
demonstrado eficácia semelhante aos antimoniais frente a L. panamensis, na Colômbia. Na
Guatemala, este mesmo fármaco apresentou aproximadamente 50% de eficácia no
tratamento de indivíduos infectados por L. braziliensis e L. mexicana. Embora superior ao
placebo sua eficácia é muito inferior aos antimoniais (Soto & Berman, 2006).
Uma
importante
ferramente
terapêutica
tem
sido
a
utilização
da
imunoquimioterapia, uma associação da vacina anti-LTA com antimoniais pentavalentes.
Machado-Pinto et al. (2002) em um estudo duplo cego controlado por placebo
demonstraram 100% de cura no grupo que receber a associação de vacina anti-LTA e
antimonais, com isso foi utilizada metada da dose usual de antimonial reduzindo os efeitos
colaterais provocados pelo medicamento. Resultados concordantes foram encontrados por
Mayrink et al. (2006) que aos avaliarem o efeito
de vários esquemas terapêuticos,
incluindo a imunoterapia e a imunoquimioterapia, observaram que a imunoquimioterapia
29
apresentou um índice de cura de 100% em relação ao tratamento padrão com 17,9% da
redução do antimonial, redução do tempo de tratamento e dos efeitos colaterais, com
resultados satisfatórios.
2.6 Controle da LTA
A diversidade epidemiológica das diferentes formas da LTA dificulta seu controle,
diante da impossibilidade da implantação de um conjunto de medidas de controle único e
aplicável em qualquer região.
Uma complexidade de diferentes manifestações da LTA em todo o mundo foi
associada, e descrita em 11 entidades ecoepidemiológicas, durante um encontro do Comitê
de Experts no Controle da Leishmaniose em 1990 (WHO Technical Report Series), os
quais definiram métodos e estratégias de controle para cada entidade, sugerindo que uma
forma comum a todos os locais endêmicos de reduzir a incidência desta doença seria
integrar as atividades de controle específico a cada região e vigilância, nos níveis técnicos e
econômicos, evitando que ferramentas usadas no controle da LTA que já existem sejam
aplicadas incorretamente e inadequadamente avaliadas (Desjeux, 1996, 2004).
Medidas antivetoriais, aplicadas na LV, não são aplicáveis na LTA, em regiões do
Novo Mundo, principalmente na Amazônia, diante do caráter zoonótico da LTA,
apresentando vetores silvestres. A utilização de detetização utilizando piretróides intradomiciliar e peridomiciliar é eficiente em algumas regiões mas se torna inviável devido ao
seu alto custo, periodicidade e comportamento dos insetos vetores (Desjeux, 2004). Como
os reservatórios também são em sua maioria silvestres, o controle destes também se torna
inviável (Marzochi & Marzochi, 1994).
Medidas de proteção indivídual como o uso de mosquiteiros impregnados com
inseticidas e uso de repelentes aplicados sobre a pele, tem se mostrado útil onde a
transmissão ocorre intradomicílio (Marzochi & Marzochi, 1994). Em focos silvestres de L.
guyanensis, técnicas de mudanças ambientais como a criação de uma zona de 400 metros,
livre de mata ao redor de vilas tem sido utilizada com algum sucesso (Desjeux et al., 1996).
A educação da população com relação à saúde e a LTA pode contribuir para que a
comunidade permaneça em constante vigilância alertando o sistema de saúde diante do
aparecimento de casos, detecção e tratamento precoce dos casos e combate aos focos de
30
transmissão da doença (Marzochi & Marzochi, 1994; Moreira et al., 2002; Reis et al.,
2006).
Considerando a inviabilidade de medidas de controle para a LTA, principalmente
frente a sua complexidade e seu caráter zoonótico, o desenvolvimento e utilização de
vacinas seguras e eficazes para a imunização de indivíduos expostos, em áreas de alto risco
de infecção de LTA, representa um grande avanço em saúde pública na prevenção desta
doença (Marzochi & Marzochi, 1994; Kedzierski et al., 2006).
2.7 Vacina anti-leishmaniose tegumentar americana
Os primeiros estudos de uma vacina anti-LTA, no Brasil, foram realizados no
estado de São Paulo, por Salles Gomes (1939) ao inocular, por diferentes vias,
promastigotas mortas de Leishmania em pacientes com LTA ativa. O autor observou
regressão das lesões quando foi utilizada a via intravenosa. Os resultados levaram-no a
especular que promastigotas mortas de Leishmania poderiam agir como uma vacina
profilática efetiva contra as várias formas de LTA (Salles Gomes, 1939).
Em 1940, Pessoa & Pestana explorando as potencialidades da vacinação com
extratos de promastigotas mortas de Leishmania conduziu ensaios clínicos numa amostra
de 1.127 indivíduos, em seis áreas endêmicas para LTA no estado de São Paulo. A um
grupo de 527 indivíduos foi administrado a vacina e a outro grupo, composto por 600
indivíduos acompanhados ao longo do tempo sem vacinação. Os autores observaram uma
diferença significativa entre a incidência de infecção nos vacinados (3,2 %) e não vacinados
(18,0 %), com poucos casos de lesões no primeiro grupo (Pessoa et al., 1940; Pessoa,
1941). Entretanto, estes estudos foram abandonados, provavelmente devido ao declínio da
incidência da LTA em antigas áreas endêmicas (Marzochi et al., 1998).
Trinta anos depois, Mayrink e colaboradores, resgatando os ensaios de Salles
Gomes e de Pessoa & Pestana, desenvolveram uma vacina anti-LTA, preparada com um
pool de cinco cepas de Leishmania, isoladas em diferentes partes do Brasil. Os ensaios
realizados na região de Caratinga (MG), em uma amostra de 674 vacinados e 974 placebos
demonstraram uma taxa de 78,4 % de conversão do TM três meses após vacinação
(Mayrink et al., 1979).
31
Em 1985, esta vacina pentavalente foi testada em Viana, no estado do Espirito Santo
por Mayrink e cols., durante uma epidemia de LTA. Diferenças significativas foram
observadas nos níveis de infecção entre os grupos de vacinados e não vacinados, com 87,6
% de conversão do TM após vacinação (Mayrink et al., 1985).
Antunes et al. (1986) com o objetivo de avaliar a capacidade profilática desta vacina
pentavalente anti-LTA em área endêmica, realizaram um estudo em Manaus, com militares
ativos do Exército Brasileiro em treinamento na floresta Amazônica. Os autores
observaram taxa de conversão do TM entre os indivíduos vacinados de 70% e uma redução
anual dos níveis de incidência da LTA de 67,3% em 1981 e 85,7% em 1983 entre o grupo
vacinado quando comparado com o grupo placebo. O maior nível de incidência da LTA
entre o grupo vacinado de 1981, segundo os autores se deve a imunossupressão causada
pela imunização contra febre amarela pouco tempo antes da vacinação anti-LTA.
Nascimento et al. (1990) avaliando a indução de uma resposta imune por duas
vacinas diferentes, denominadas Leishvacin 5 (composta por 5 cepas de Leishmania) e
Leishvacin 6 (composta por seis cepas de Leishmania), observaram índices de estimulação
de linfócitos significativamente superiores nos grupos vacinados quando comparados ao
grupo placebo com uma correlação de 90% entre o índice de estimulação de linfócitos e o
TM.
Diante da capacidade imunogênica da vacina pentavalente anti-LTA demonstrada
nos estudos acima, Mendonça et al. (1995) realizaram um ensaio objetivando caracterizar a
produção de linfocinas e o fenótipo das células envolvidas na resposta imune induzida por
esta vacina, em 43 indivíduos saudáveis, sem qualquer evidência prévia de infecção por
Leishmania. Eles observaram 74% de conversão do TM entre os vacinados e uma resposta
imune mediada por células T com certo grau de espécie específicidade, uma vez que não
houve aumento da resposta linfoproliferativa frente aos antígenos de L. chagasi. Além
disso, uma produção de INF-γ e ausência de IL-4, indicando que a resposta induzida pela
vacina é potencialmente benéfica, foram encontradas aliado a um aumento da proporção de
células T CD8+ antígeno-específica, sugerindo que estas células e IFN-γ participam do
processo de proteção contra leishmaniose induzido por esta vacina.
Apesar dos efeitos extraordinários obtidos com a vacina multicepas, únicos no
mundo, algumas questões foram levantadas a respeito de sua composição e caracterização,
32
em duas reuniões realizadas em 1991. Estas foram patrocianadas pela Organização PanAmericana de Saúde e a UNDP/World Bank/WHO “Special Programe for Research and
Training in Tropical Diseases (TDR)”, com o titulo de “Consulta técnica sobre o
desenvolvimento de uma vacina no Brasil” em Washington, EUA, e a segunda realizada em
Belo Horizonte, Brasil, organizado pelo TDR/WHO, antiga BIOBRAS e UFMG. Uma das
questões discutidas foi o fato de não haver evidência de necessidade de uma vacina
multicepas, pois a proteção não é espécie específica. Além disso, havia dificuldades na
produção da vacina em grande escala, frente às diferenças nas características de
crescimento de cada cepa. Estas questões associadas à presença, na composição da vacina,
de cepas taxonomicamente não bem definidas poderiam causar problemas na padronização
para uso geral, diante da dificuldade de identificação de antígenos responsáveis pelo efeito
protetor na vacina polivalente, o que indicou a necessidade de avaliação de uma vacina
monocepa (Marzochi et al., 1998; Mayrink et al., 2002).
A fim de avaliar qual a melhor cepa constituinte da antiga vacina pentavalente antiLTA, de acordo com os parâmetros imunológicos, foram preparados extratos antigênicos de
cada uma destas cinco cepas e testados em camundongos C57BL/10. Uma resposta imune
celular protetora a cada antígeno testado foi observada seis meses após a infecção desafio
com L. (L.) amazonensis, indicando que cada cepa testada apresentava um potencial
imunogênico semelhante à resposta imune induzida pela vacina polivalente. No entanto, a
vacina monovalente produzida com a cepa PH8 de L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8),
induzia melhores níveis de INF-γ detectados no sobrenadante de células esplênicas dos
animais vacinados, sugerindo que esta deveria ser eleita para ensaios clínicos humanos
(Mayrink et al., 2002). A vacina produzida com L. (V.) braziliensis apesar de induzir uma
melhor resposta estimulativa foi preterida em função da suspeita de que as lesões
mucocutâneas sejam causadas por estímulos de auto-agressão por antígenos desta espécie.
Outro motivo da escolha de L. amazonensis foi sua caracterização e seu fácil crescimento
em meio de cultura (Marzochi et al., 1998; Mayrink et al., 2002).
Um estudo de fase I, duplo cego, foi realizado por Marzochi et al. (1998), no Brasil,
a fim de avaliar a presença de efeitos colaterais desta vacina anti-LTA monocepa aplicada
em voluntários normais, num esquema de duas doses intramuscular (IM) de 1,5 mL desta
vacina. Uma dor leve no local da aplicação foi observada, mas não se extendeu por mais de
33
24 horas, levando a conclusão de que esta vacina apresenta segurança para ser utilizada em
populações humanas, aplicadas num esquema de duas doses IM de vacina não autoclavada
na concentração de 1440 mg de nitrogênio por dose.
A imunogenicidade da vacina tem sido avaliada principalmente pela conversão do
TM, da proliferação de CMSP e da produção de INF-γ e IL-12, uma vez que a resposta
imune induzida pela vacina tem sido caracterizada como uma resposta mediada por células,
protetora do tipo Th1, com aumento da produção de INF-γ e IL-12 e ausência do aumento
da produção IL-4 por células mononucleares dos vacinados. Um predominante aumento na
proporção de células T CD8+ também vem sendo observado entre os vacinados, bem como
em indivíduos curados, sugerindo que estas células têm uma função protetora na LTA (De
Luca et al., 1999; De Luca et al., 2001).
A utilização do TM como método de seleção de indivíduos aptos a receberem a
vacina, bem como para a avaliação da imunogenicidade desta em ensaios vacinais é
utilizada por vários autores (Mayrink et al., 1979, 1985, 1986; Antunes et al., 1986;
Nascimento et al., 1990; Mendonça et al., 1995; Marzochi et al., 1998; De Luca et al.,
1999), justificada pela correlação de 90% encontrada entre o TM positivo e índices de
estimulação de linfócitos positivos (Nascimento et al., 1990). Por ser o TM um teste barato
e aplicável em áreas endêmicas com facilidade e confiabilidade, este teste pode ser muito
útil em ensaios vacinais.
A estabilidade e capacidade imunogênica das preparações da vacina monocepa antiLTA foram avaliadas por De Luca et al. (1999) em um estudo onde eles observaram taxas
de conversão do TM, 40 dias após vacinação, significativamente diferentes de 59% e 83%
para a vacina autoclavada e não autoclavada, respectivamente. Esta vacina foi capaz de
induzir uma resposta imune mediada por células T humanas contra Leishmania, uma maior
resposta proliferativa de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) e um
aumento da produção de INF-γ e IL-2, com predominância do subsítio CD8+ entre o grupo
dos vacinados, demonstrando-se imunogênica (De Luca et al., 1999). Porém, a vacina
autoclavada não apresentou suas propriedades imunológicas e bioquímicas preservadas (De
Luca et al., 1999).
Ensaio semelhante foi realizado por Mayrink et al. (1999) onde todos os voluntários
receberam duas doses (360 µg de nitrogênio por dose) em um intervalo de 21 dias de
34
vacina monocepa anti-LTA nas seguintes preparações: autoclavada, não autoclavada,
liofilizada, autoclavada estocada por 12 meses, não autoclavada estocada por 12 meses e
liofilizada estocada por 12 meses, com taxas de conversão do TM de 89,3 %, 89,3 %, 92,0
%, 26,7 %, 93,3 % e 80,0 %, respectivamente. Apenas o grupo que recebeu a vacina
autoclavada estocada por 12 meses apresentou menores taxas de conversão do TM e menor
produção de INF-γ. Evidenciando que os processos de liofilização e autoclavação não
prejudicavam a imunogenicidade de produtos recentes. Porém, após 12 meses preparações
autoclavadas estocadas a 4ºC apresentaram significante diminuição da imunogenicidade,
avaliada pela baixa conversão do TM e produção de INF-γ.
Ensaio mascarado controlado por placebo e randomizado, para a determinação da
melhor concentração da vacina, foi realizado por De Luca et al. (2001). Voluntários foram
divididos em grupos que receberam duas ou três doses de placebo ou 180, 360 ou 540 µg N
por dose de vacina. O esquema de duas doses de 360µg N/dose foi preconizado para
utilização em ensaios posteriores com esta vacina, pois foi capaz de induzir 100% de
conversão do TM e produziu maiores níveis de INF-γ.
Em um ensaio clínico realizado por Vélez et al. (2000), na Colômbia, a
imunogenicidade da vacina monocepa anti-LTA associada ao adjuvante BCG foi avaliada
pela conversão do TM, 60 dias após o término da vacinação. Sendo observado uma taxa de
86,4% de conversão do TM, após vacinação, no grupo que recebeu apenas a vacina e 67,9
% para o grupo que recebeu a associação de vacina com BCG, quando comparado aos 25,0
% placebo e 81,3 % do placebo associado ao BCG. Os grupos que receberam apenas vacina
e placebo foram reavalidos um ano após a vacinação e apresentaram uma taxa de conversão
do TM de 90,0% e 5,0 %, respectivamente. Um alto índice de linfoproliferação também foi
observado no grupo vacinado por até um ano após a vacinação, o mesmo não se observou
no grupo placebo. Esta vacina foi segura por não apresentar efeitos colaterais graves.
Aliado a imunogenicidade observada neste estudo de fase I/II, a vacina passou a ser
sugerida para estudo de fase III com avaliação da sua eficácia.
Paralelamente ensaios de fase III foram realizados por Armijos et al. (2004), no
Equador, e por Vélez et al. (2005), na Colômbia. No primeiro estudo uma população de
1995 indivíduos, dos quais 1.009 receberam vacina anti-LTA e 986 receberam placebo. A
ausência de efeitos colaterais graves indicou segurança desta vacina. A conversão do TM
35
60 dias após a vacinação foi de 74,4 % no grupo dos vacinados e 14,7 % no grupo que
recebeu placebo, confirmando sua imunogenicidade. Entretanto, não foi observada
diferença significativa entre a taxa de incidência de LTA entre o grupo vacinado (2,0%)
comparado ao grupo placebo (1,3%), durante 26 meses de acompanhamento. Os autores
sugerem que o processo de autoclavação pode ter sido um dos responsáveis por essa baixa
proteção (Armijos et al., 2004).
No segundo estudo, realizado por Vélez et al. (2005) com 1.302 vacinados e 1.295
placebos foi observado uma conversão do TM, um ano após a vacinação, de 84,3% no
grupo vacinados comparado a 16,8% no grupo placebo, indicando a imunogenicidade desta
vacina. A incidência de LTA no grupo dos vacinados foi de 7,7% comparada ao grupo
placebo que foi de 6,8%, durante um ano de acompanhamento. Os autores consideraram
que esta vacina é segura e imunogênica. Mas infelizmente, estes autores não realizaram o
TM 60 dias após vacinação como em outros estudos, sendo este realizado apenas um ano
depois, apresentando uma falha no protocolo do ensaio e tornando-o não válido a
comparação com demais estudos de fase III. Os autores concluem que sua proteção contra
L. panamensis, parasita presente no local do estudo, foi muito baixa.
Portanto, uma vacina ideal deve induzir a formação de uma resposta imune na
maioria dos vacinados e conferir uma proteção duradoura contra o antígeno em questão.
Muitos podem ser os fatores responsáveis pelos aproximados 30% de indivíduos vacinados
que não convertem o TM. Dentre eles, fatores característicos dos indivíduos como fatores
nutricionais que afetam diretamente o estado imunológico devem ser avaliados, uma vez
que vários autores têm demosntrado uma relação entre a resposta imune e a os fatores
nutricionais, principalmente elementos traço como cobre, ferro, selênio e zinco (Erickson et
al., 2000; Faryadi & Mohebali, 2003; Kocyigit et al., 1998; Van Weyenbergh et al., 2004).
36
3. Justificativas
37
Diante do percentual significativo de indivíduos que não convertem o TM 60 dias após a
vacinação contra LTA e da relação existente entre os elementos traço (cobre, ferro,
selênio e zinco) e resposta imune (Koçyigit et al., 1999; Erickson et al., 2000;
Mocchegiani et al., 2000; Arthur et al., 2002; Rink & Haase, 2007), este trabalho
envolve o estudo da associação entre os fatores nutricionais e a resposta ao TM em
indivíduos vacinados anti-LTA. A hipótese é que a carência de alguns elementos traço
promove uma diminuição significativa da atividade imunológica, explicando assim o
percentual de indivíduos que não respondem à vacina e com isso uma menor taxa de
proteção esperada pela vacina.
Uma vez que (i) a doença causa um estigma social por apresentar lesões
desfigurantes ou deformidades, (ii) seu tratamento é caro, doloroso com muitos efeitos
colaterais e contra indicado a certos grupos da população e (iii) o controle da
transmissão da LTA é complexo diante do seu vasto perfil epidemiológico, a obtenção
de uma vacina eficaz, com maior poder imunogênico, é de fundamental importância para
a proteção da população exposta a leishmaniose, doença endêmica em muitas áreas do
Brasil e que se encontra em franca expansão (Desjeux, 2004; Gontijo & Carvalho,2003).
Vários fatores ligados ao parasita estão envolvidos no grau de imunogenicidade de
uma vacina, tais como o tipo de cepa e a forma de apresentação. Também, fatores do
hospedeiro, genéticos e nutricionais, atuam sobre a resposta imunológica à vacina. Na
busca de uma vacina eficaz é fundamental a geração de conhecimentos, tanto sobre
fatores ligados ao parasito quanto aos fatores inerentes ao hospedeiro.
Não existem estudos sobre a associação de cobre, ferro, selênio e zinco com a
resposta imune induzida pela vacina monocepa, utilizando Leishmania amazonensis. Os
conhecimentos do possível papel destes elementos-traços sobre o padrão de resposta
imune induzida pela vacina anti-LTA podem trazer novas perspectivas para o
desenvolvimento de melhorias nas formulações da vacina, buscando uma maior
efetividade na prevenção de indivíduos expostos. Estes estudos poderão indicar a
necessidade de aplicação de medidas de prevenção primária visando uma melhoria do
estado nutricional dos indivíduos de áreas endêmicas, de forma a estimular a resposta
imunológica desta população.
38
4. Objetivo
39
4.1 Objetivo geral
Avaliar a relação entre os fatores nutricionais e a resposta ao Teste de Montenegro
em indivíduos submetidos à vacinação anti-leishmaniose tegumentar americana.
4.2 Objetivos específicos
1. Determinar a presença de associação entre os níveis séricos de elementos traço (cobre,
ferro, selênio e zinco) e a resposta ao TM em indivíduos submetidos à vacinação anti-LTA.
1ª Hipótese: Indivíduos vacinados que apresentarem baixos níveis de cobre, ferro,
selênio e zinco podem apresentar uma menor taxa de conversão ao TM do que indivíduos
com níveis mais elevados destes elementos.
2. Avaliar a presença de associação entre antropometria e resposta ao teste de Montenegro
(TM) em indivíduos submetidos à vacinação anti-LTA.
2ª Hipótese: Indivíduos com desnutrição protéica calórica apresentam menor
probabilidade de converter o teste de Montenegro do que indivíduos eutróficos.
3. Padronizar o método analítico para a determinação de cobre, ferro e zinco por ICP OES e
validar o método para a determinação de selênio por FI-HGAAS.
40
5. Materiais e Métodos
41
5.1 Desenho e população do estudo
Um ensaio comunitário denominado “Estudo do impacto da vacina anti-LTA sobre a
incidência da Leishmaniose Tegumentar Americana em Caratinga, Minas Gerais:
Ensaio Comunitário” – (Projeto: FAPEMIG/ nº 0262), foi realizado na microrregião de
Caratinga, Minas Gerais, área endêmica para LTA. Um total de 8.676 indivíduos com
idade entre 5 a 65 anos, história negativa para LTA e que apresentaram TM negativo
participaram deste estudo. Eles foram dividos em dois grupos: um que recebeu a vacina
(n = 4.767) e outro que recebeu placebo (n = 3.909). Indivíduos foram excluídos quando
apresentaram história prévia de leishmaniose (n = 583) ou TM positivo (n = 558), ou
quando eram portadores de doenças crônicas sérias (doenças autoimunes, diabetes,
doenças cardiovasculares) ou infecções, eram gestantes ou apresentaram uma
temperatura corporal maior que 37,5ºC no momento da vacinação. Todos os voluntários
receberam duas doses, intramuscular, de vacina anti-LTA ou placebo.
O presente estudo consiste em um ensaio experimental, mascarado realizado com uma
subamostra (n=172) selecionada aleatoriamente entre o grupo de vacinados do ensaio
comunitário descrito acima, residentes nas localidades de Patrocínio, Fazenda Caetana e
Córrego do Emboque da microrregião de Caratinga, Minas Gerais, Brasil. Após 60 dias
da vacinação um novo TM foi realizado e de acordo com os resultados os participantes
deste ensaio foram divididos em dois grupos: um composto pelos indivíduos TM
negativos (n=97) e outros pelos TM positivos (n=75).
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Ouro
Preto (CEP/UFOP 2005/52) e todos os indivíduos selecionados e/ou seu responsável legal
receberam informações sobre a importância deste estudo e destes foi obtida a assinatura do
Consentimento livre e esclarecido.
42
“Estudo do impacto da vacina anti-LTA sobre a incidência da Leishmaniose
Tegumentar Americana em Caratinga, MG: Ensaio Comunitário”
Vacina (n = 4.767)
Placebo (n = 3.909)
Ensaio experimental (n = 172)
TERMO DE CONSENTIMENTO
TM positivo
(n = 75)
TM negativo
(n = 97)
PAREADO
Estado nutricional
(Antropometria)
Elementos traço
(Cu, Fe, Se e Zn)
Figura 1. Organograma do estudo para avaliação da influência dos elementos traço e estado
nutricional na resposta induzida em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005.
5.2 Cálculo do tamanho da amostra
O tamanho mínimo da amostra para o estudo foi calculado no programa EPI INFO
versão 3.3.2, baseado nas seguintes premissas:
1. Razão de 1/1 entre o grupo teste e o grupo controle;
2. Desvio padrão da concentração de zinco sérico no grupo controle igual a 191,9
mg/L (Faryadi et al., 1998);
3. Variação de 5% em torno da média da concentração de zinco sérico que é igual a 1.161,7
mg/L no grupo controle (Faryadi & Mohebali, 1998);
4. Diferença de 30% entre os grupos teste e controle.
A amostra mínima necessária para detectar uma diferença de 50% foi de 90
indivíduos divididos em dois grupos. Grupo de casos: 45 indivíduos que não converteram o
43
TM 60 dias após a vacinação anti-LTA. Grupo controle: 45 indivíduos que converteram o
TM, também 60 dias após vacinação anti-LTA.
5.3 Vacina
A vacina utilizada neste ensaio foi composta por promastigotas mortas de L. (L.)
amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) conservadas em uma solução de tampão fosfato
mertiolatada (100µg/mL de mertiolate) à temperatura de 2 a 8 ºC, de acordo com as
recomendações da Organização Mundial de Saúde e produzida de acordo com a
metodologia descrita por Mayrink e colaboradores (1979).
O esquema de vacinação consistiu em aplicação intramuscular de duas doses de 1
mL de vacina (360µg de nitrogênio total) com um intervalo de 21 dias entre as doses,
utilizando seringas plásticas descartáveis de 1 mL.
5.4 Teste de Montenegro
A reação de hipersensibilidade tardia (Teste de Montenegro) foi realizada mediante
a aplicação de 0,1 mL de uma suspensão de promastigotas mortas de L. (L.) amazonensis
(IFLA/BR/67/PH8) (40 µg.mL-1 nitrogênio total) diluídas em uma solução salina contendo
timerosal (100 µg/mL), de acordo com a metodologia padrão (Mello et al., 1977; da Costa
et al., 1996). Quarenta e oito horas após aplicação do TM foram medidos os diâmetros
maior e menor da enduração no local da aplicação utilizando um paquímetro (da Costa et
al., 1996; Salman et al.,1999).
A seleção dos indivíduos aptos a receberem a vacina foi realizada pela apresentação
de um TM negativo e a avaliação da resposta imune induzida pela vacina anti-LTA dos
participantes deste ensaio foi realizada através do TM, aplicado 60 dias após a vacinação.
5.5 Coleta de dados antropométricos
Os dados antropométricos (altura e peso) foram obtidos no momento da coleta de
sangue, 48 horas após a aplicação do TM. A aferição da altura foi realizada utilizando o
antropômetro de campo, com escala em centímetros (cm). O peso foi determinado
utilizando a balança Tanita BF escala 542, com graduação de gordura corporal de 0,5%
44
(Tanita Corporation of America, Inc. Arlington Heights, IL, USA). Para a aferição o
indivíduo permaneceu em pé e com bexiga vazia.
O Índice de Massa Corporal (IMC) foi calculado dividindo o peso corporal (Kg)
pelo quadrado da altura (m2). O IMC foi classificado de acordo com o critério da
Organização Mundial de Saúde em baixo peso ( < 18.5 Kg/m2), eutróficos (18.5 – 24,9
Kg/m2), sobrepeso ( 25,0 – 29,9 Kg/m2)e obesos ( > 30,0 Kg/m2) para indivíduos acima de
18 anos (WHO, 1997).
5.6 Coleta de amostras e mascaramento
Todas as amostras de sangue foram coletadas, 48 horas após a aplicação do TM, em
sistema a vácuo. Para a determinação de cobre, ferro, selênio e zinco foram coletados cerca
de 10 mL de sangue, em tubo sem anticoagulantes. As amostras foram centrifugadas a 3000
g/min durante 5 minutos, para separação do soro, que foi armazenado em microtubos de
polietileno à temperatura de – 20 ºC, devidamente identificados.
Para a realização dos hemogramas utilizou-se EDTA como anticoagulante. Foi
necessário a utilização de luvas sem talco, tanto para a coleta quanto para o processamento
das amostras, a fim de evitar contaminação das amostras com minerais.
A codificação das amostras foi realizada, pelo coordenador do estudo, a partir de
uma tabela de números aleatórios, logo após a coleta e estes códigos foram revelados
somente após a realização das análises laboratoriais, a fim de se proceder às análises
estatísticas.
5.7 Realização dos Hemogramas
O hemograma completo foi realizado no Laboratório Piloto de Análises Clínicas da
UFOP (LAPAC/UFOP), a partir do sangue coletado em sistema à vácuo, contendo EDTA
como anticoagulante, em um contador automático de células ABX micros 60, que fornece
contagem de hemácias, global de leucócitos, linfócitos e plaquetas, hematócrito, dosagem
de hemoglobina e índices hemantimétricos. O esfregaço sanguíneo foi realizado em lâmina
de vidro para a diferencial de leucócitos e avaliação das características das hemácias em
microscopia óptica pelo analista clínico.
45
A presença de anemia carencial foi determinada pelos níveis de hemoglobina de
acordo com Dallman & Simes. (1979) (Tabela 1).
Tabela 1. Limites inferiores da normalidade para hemoglobina (g/dL), segundo
idade e sexo.
Idade (anos)
Sexo
Hemoglobina (g/dL)
≥ 0,5 – 5,0
11,0
5,1 – 9,0
11,5
9,1 – 12
12,0
12,1 – 14,0
14,1 – 18
> 18
Feminino
12,0
Masculino
12,5
Feminino
12,0
Masculino
13,0
Feminino
12,0
Masculino
13,5
Fonte: Dallman & Simes, 1979.
5.8. Determinação dos teores séricos de cobre, ferro, selênio e zinco
Todos os ensaios para a determinação dos teores séricos de cobre, ferro, selênio e
zinco, foram realizados no laboratório de Traços Metálicos da Fundação Centro
Tecnológico de Minas Gerais – LTM/CETEC, composto de um sistema de controle de
contaminação tipo “Sala Limpa” classe ISO – 7 a e de módulos de fluxo laminar classe ISO
– 5 b.
a Classe ISO-7:0,5µm( 352 000 partículas/m3),5µm (293 partículas/m3)(ISO14644:1999).
b Classe ISO-5:0,5µm( 3 520 partículas/m3),5µm (29 partículas/m3)(ISO14644:1999).
46
Para utilização do laboratório LTM/CETEC foi necessário treinamento quanto aos
procedimentos específicos para trabalhos em uma área limpa.
Os métodos foram validados utilizando-se figuras de mérito para verificação do
desempenho analítico, recomendadas por organismos oficiais a exemplo do Instituto
Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO); A Focus for
Analytical Chemistry in Europe (EURACHEM); Associação de Laboratórios Acreditados
de Portugal (RELACRE) e International Organization for Standardization (ISO).
Para os ensaios de selênio foram feitas validações completas, uma vez que as
metodologias estavam sendo implantadas no laboratório durante a execução do trabalho,
partindo-se de métodos publicados na literatura, visto não terem sido encontradas
indicações de métodos oficiais (Batarióvá et al., 2005).
Para os ensaios de cobre, ferro e zinco já implantados no LTM/CETEC foram
feitos, testes de acompanhamento do método dando continuidade à operação e avaliação
das cartas de controle para médias, já implantadas no laboratório, análise de material de
referência, em água e testes de recuperação da adição do padrão às amostras de soro. Os
testes de recuperação foram efetuados visando certificar se não existia interferência de
matriz e se não havia perda dos analitos durante o processo de preparo das amostras.
5.8.1 Reagentes utilizados
Para a realização das análises químicas foram utilizados os seguintes reagentes:
a) solução de referência de Se contendo 1 g/L (Titrisol - Merck);
b) solução de referência certificada – OC 486692 ICP Multi Elemento Standard IV
1g/L (Merck);
c) ácido nítrico p.a. 65% Merck;
d) ácido clorídrico p.a. 37% Merck;
e) peróxido de hidrogênio 37% Merck;
f) água purificada tipo II com resistividade de aproximadamente 10 megaohms/cm
obtida por osmose reversa;
g) água ultrapura tipo 1 – obtida através do sistema de ultrapurificação Milli-Q da
Millipore- resistividade 18,2 megaohms/cm, alimentado com água tipo II;
47
h) Nitrogênio - pureza mínima 99,99%;
i) Argônio – pureza mínima 99,99%;
j) Padrão de referência - NIST- SRM 1643c-Trace Metal in Water;
5.8.2 Equipamentos
a) Espectrômetro de emissão ótica, com fonte de plasma indutivamente acoplado - ICP
OES – Perkin Elmer© modelo Optima 3000 com tocha radial;
b) Espectrômetro de absorção atômica Perkin Elmer© modelo Analyst 100 com
Gerador de Hidretos MHS 20 e sistema de injeção de fluxo FIAS 400;
c) Sistema de purificação de água por osmose reversa e sistema de ultrapurificação de
água - Milli-Q da Millipore©;
5.8.3 Preparo das amostras
A dois mililitros de soro, adicionou-se ácido nítrico 65% e peróxido de hidrogênio
37% v/v, aquecendo em chapa à temperatura de aproximadamente 90ºC, até que a solução
se apresentasse límpida, evidenciando a destruição da matéria orgânica.
Após a digestão e resfriamento a solução foi tratada com ácido clorídrico 37%
visando a redução de todo selênio presente, para o estado de oxidação +4. Essa etapa foi
realizada em banho-maria a temperatura de aproximadamente 60ºC.
A solução final foi transferida quantitativamente para balão volumétrico de 10 mL e
filtrada, procedendo-se aos ensaios de cobre, ferro, selênio e zinco utilizando-se métodos
validados.
5.8.4 Determinação de selênio sérico por espectrometria de absorção atômica com
geração de hidretos acoplado ao sistema de injeção de fluxo
5.8.4.1 Princípio do método
Elementos metálicos capazes de formar hidretos como o arsênio e selênio podem ser
determinados por espectrômetria de absorção atômica com geracão de hidretos.
A técnica consiste de reação do elemento com borohidreto de sódio, na qual a
solução contendo o elemento a ser determinado é introduzida em uma célula de reação com
48
um agente redutor (NaBH4 0,1% em NaOH 0,025%), onde é formado o hidreto volátil do
analito de interesse, conforme apresentado na equação:
NaBH4 + 3 H2O + HCl Î H3BO3 + NaCl + 8H.
E m+ + H.(excesso) Î EHn +H2 (excesso)
Onde E: elemento de interesse (ex.: selênio, arsênio, etc)
O hidreto formado é carreado, por um gás inerte (argônio ou nitrogênio) até uma
célula de quartzo aquecida a 900ºC, onde ocorre a decomposição do hidreto com liberação
de hidrogênio e de átomos do elemento de interesse, que absorvem luz de uma lâmpada do
elemento sendo o sinal gerado medido pela quantidade de luz absorvida.
No presente trabalho, foi utilizada uma lâmpada de selênio, cátodo oco,
comprimento de onda 196,0 nm e 500 µL de solução da amostra.
Inicialmente preparou-se uma curva de calibração de absorvância em função da
concentração do analito, utilizando-se padrões de concentração conhecida e o teor de
selênio contido na amostra foi calculado na curva de calibração.
5.8.4.2 Validação do método para determinação de selênio em soro humano utilizando
espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos e sistema de injeção de
fluxos
As figuras de mérito utilizadas para validação do método foram: linearidade da
faixa de trabalho, seletividade, determinação dos limites de detecção e quantificação,
repetitividade e estimativa da exatidão, assumindo um nível de significância de 0,05.
5.8.4.3 Linearidade da faixa de trabalho
A Linearidade definida pela habilidade de um método analítico em produzir
resultados diretamente proporcionais às concentrações do analito nas amostras (INMETRO,
2003) foi realizada de acordo com a Norma ISO 8466-1 (1990). Esta foi adotada como base
para o estabelecimento da faixa de trabalho para a determinação de selênio em soro humano
e estabelece uma metodologia completa para o desenvolvimento experimental e a validação
estatística do intervalo entre a menor e a maior concentração de calibração do método. No
presente trabalho foi verificada a faixa de trabalho de 2 a 20 µg/L. Segundo recomendação
da norma ISO 8466-1 (1990) foram preparadas soluções contendo selênio nas
49
concentrações de (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 µg/L) em ácido clorídrico 10% v/v, feita a
leitura em, absorvância, de todas as soluções com número total de replicatas para o
primeiro e último padrão igual a dez. A seguir procedeu-se a comparação das variâncias
dos extremos da faixa de trabalho por meio do teste F (Snedecor). Segundo a norma
aplicada, considera-se a faixa linear quando F calculado for menor que F tabelado.
5.8.4.4 Teste de Seletividade
A determinação da seletividade de um método é importante para avaliar se os
componentes da matriz de interesse interferem no desempenho da medição, ocasionando
resultados errôneos.
A Seletividade do método foi testada segundo o que recomenda o DOQ-CGCRE008(2003) do INMETRO, é um método mais robusto e avalia o paralelismo entre as curvas
do padrão e da amostra acrescida de padrão. Duas séries de soluções foram preparadas,
contendo selênio nas concentrações de 0; 4; 8; 10; 16 e 20 µg/L, sendo uma em HCl 10% e
outra em amostra de soro humano digerido. As curvas não apresentaram paralelismo
indicando que o método não se apresentou seletivo (INMETRO, 2003). No sentido de
confirmar o teste, foi adotado, também o procedimento do Guia RELACRE 13 (2000) que
recomenda adições de padrão às amostras, ao longo da faixa de trabalho, considerando o
método seletivo se as recuperações obtidas situarem-se próximo de 100%.
5.8.4.5 Limites de detecção e quantificação
O Limite de detecção (LD) corresponde a concentração mínima de uma substância
medida com 95 ou 99 % de confiança de que a concentração do analito é maior que zero e,
o Limite de quantificação (LQ), a menor concentração do analito que pode ser determinada
com um nível aceitável de precisão e veracidade.
Os LD e LQ foram calculados utilizando "0 + 3,143 s" (LD), onde s é desvio
padrão, considerando a análise de sete ou mais amostras de brancos com adição, sendo LQ
calculado como o valor médio da amostra-branco mais a concentração do analito
correspondente a 5, 6 ou 10 desvio-padrão (onde a recuperação for aceitável).
50
5.8.4.6 Estimativa da exatidão e repetitividade
A exatidão pode ser definida como a concordância entre o resultado de um ensaio e
o valor de referência aceitável como verdadeiro e foi avaliada utilizando cálculos de
recuperação em amostras adicionadas de padrões, devendo os valores situar entre 80 a
120% (Green, 1996). A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras
adicionadas com quantidades conhecidas de padrão (10 µg/L) e é calculada segundo a
equação de recuperação:
Recuperação (%) = [(C1 - C2) / C3] x 100
Onde C1 é a concentração determinada na amostra adicionada, C2 é a concentração
determinada na amostra não adicionada e C3 a concentração adicionada.
A repetitividade consiste no grau de concordância entre os resultados de medidas
sucessivas de um mesmo mensurado, realizado sob as mesmas condições de medição, e foi
calculada pelo coeficiente de variação (CV) da análise de pelo menos 10 análises de um
padrão de 10 µg/L (AOAC, 2002).
5.8.5 Determinação de cobre, ferro e zinco séricos por espectrometria de emissão por
plasma indutivamente acoplado.
5.8.5.1 Princípio do método
A Espectrometria de emissão atômica por plasma indutivamente acoplado é um
método de quantificação de elementos presentes em uma solução, baseado na emissão
atômica de elementos em comprimentos de onda característicos.
Um fluxo de argônio ao passar por um tubo ou tocha de quartzo, cujo topo é
envolvido por uma bobina de indução eletromagnética, é ionizado inicialmente por uma
descarga de elétrons, formando o plasma que é utilizado como fonte de emissão atômica, e
é mantido neste estado enquanto interage com as linhas de força do campo magnético.
A amostra é aspirada para o nebulizador por um capilar por meio de uma bomba
peristáltica, gerando o aerossol que é levado ao plasma por um tubo injetor localizado
dentro da tocha, submetendo os constituintes atômicos à temperatura cerca de 6000 a
8000K. Isto leva uma redução significativa das interferências químicas, devido à completa
51
dissociação das moléculas. Essa amostra aerossol passa pelo centro do plasma, no sentido
ascendente, descrevendo um trajeto cilíndrico em região de temperatura relativamente
estável. Em um determinado trecho deste percurso onde há maior densidade de espécie
radiante e menor background, situam-se as emissões atômicas de valor analítico que são
lançadas na fenda de entrada do sistema óptico.
5.8.5.2 Estimativa da exatidão do método.
Foi efetuada por meio do teste de recuperação da adição de padrões às amostras de
soro. Este teste foi necessário para certificar se não havia interferência de matriz e se os
analitos não seriam perdidos durante o processo de preparo das amostras.
A preparação das amostras de soro humano foi realizada de acordo com o item 5.8.3
e para os testes de recuperação utilizou-se o padrão contendo cobre, ferro e zinco
OC486692 ICP- Multi Element Standard IV 1 g/L, da marca Merck, rastreável ao NIST
(National Institute Standard Technology), para a adição do padrão a solução original foi
diluída para se obter 1000 µg/L.
A faixa linear de trabalho utilizada foi até 500 µg/L e para a preparação da curva
utilizou-se padrão ICP Multi elementos, contendo os elementos de interesse. As amostras
foram ensaiadas, diluídas 5 vezes, e o cálculo da recuperação realizado de acordo com a
fórmula:
Recuperação (%) = [(C1 - C2) / C3] x 100
Onde, C1 é a concentração determinada na amostra adicionada, C2 é a concentração
determinada na amostra não adicionada e C3 a concentração adicionada. O percentual de
recuperação aceitável é de 80-120 % (Green, 1996).
5.9 Procedimento operacional
As amostras codificadas foram retiradas do freezer e deixadas a temperatura
ambiente até o total descongelamento, logo em seguida foram homogeneizadas e com uma
pipeta volumétrica de dois mL transferidas para um béquer, previamente identificado, onde
foi realizada a digestão da amostra, seguida da redução do selênio na presença de ácido
52
clorídrico. A solução foi transferida quantitativamente para balão de 10 mL e depois
filtrada.
A solução obtida foi utilizada para a determinação de selênio no FI-HGAAS, no
mesmo dia da análise, e o restante da solução foi utilizado para a determinação de cobre,
ferro e zinco realizado no ICP OES. Os resultados obtidos foram multiplicados pelo fator
de diluição (Fd: 5).
5.10 Valores de referência para os níveis séricos de elementos traço
Após análise laboratorial os resultados dos níveis séricos dos elementos traço foram
classificados de acordo com a faixa aceitável obtida pelos valores de referência
padronizados pela literatura científica, para cada elemento.
Para o cobre a faixa aceitável varia de 800 à 1550 µg/L para indivíduos do sexo
feminino e 700 à 1400 µg/L para o sexo masculino (Iyengar et al, 1988), para o ferro esta
faixa varia de 600 à 1800 µg/L (Iyengar et al, 1988), já para o selênio a variação vai de 80 a
120 µg/L (Alfthan et al., 1996) e para o zinco de 700 à 1200 µg/L (Iyengar et al, 1988).
5.11 Processamento e análise de dados
A partir de todas as informações coletados dos participantes deste estudo foram
montados bancos de dados nos programas Microsoft Excel 2000® (Microsoft Corporation,
Seattle, WA, USA) e SPSS versão 12.0, 2003 (SPSS, Chicago, IL, USA) nos quais foram
realizadas as análises estatísticas.
Para os testes performance do método foi estabelecida uma rotina no programa
Microsoft Excel 2000® (Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA), para o cálculo dos
testes F (Snedecor) e teste t (Student), utilizando o nível de significância de 0,05.
Os métodos estatísticos utilizados para descrever os dados foram média, desvio
padrão e distribuição de freqüência. A homogeneidade de variância foi testada pelo teste de
Levene.
O diâmetro do TM foi categorizado em negativo e quartis da resposta positiva,
constituindo cinco grupos (negativo; 5 a 8 mm; 8,1 a 9 mm; 9,1 a 12 mm; > 12 mm).
53
Os elementos traço foram categorizados em três grupos: níveis séricos baixos (G0),
normais (GI) e elevados (GII) para cada elemento (Tabela 2).
Tabela 2. Grupos dos elementos traço categorizados pelos níveis
séricos, para cobre, ferro, selênio e zinco, de acordo com os
valores de referência.
Grupos de elementos traço (µg/L)
G0
GI
GII
feminino < 800
800 - 1550
> 1550
Cobre
masculino < 700
700 - 1400
> 1400
< 600
600 - 1200
> 1200
Ferro
< 80
80 - 120
> 120
Selênio
< 700
700 - 1200
> 1200
Zinco
G0: níveis séricos inferiores aos valores de referências; GI: níveis
Elementos traço
séricos dentro da faixa aceitável de acordo com os valores de
referência; GII: níveis séricos acima dos níveis aceitáveis pelos valores
de referências.
As diferenças entre as médias dos níveis séricos de cobre, ferro, selênio e zinco,
segundo gênero, idade e diâmetro do TM foram testadas pela análise de variância simples,
utilizando o teste POS-HOC para comparação intragrupos.
As diferenças entre as médias de idade, IMC, hemácias, hemoglobina, leucócitos,
linfócitos e monócitos observadas em cada categoria dos elementos traço (G0, GI, GII)
foram comparadas pela ANOVA.
As diferenças entre as proporções da distribuição do gênero segundo as categorias
de elementos traço foram testadas pelo teste de Qui-quadrado (χ2), com diferença
significativa quando p < 0,05.
54
6. RESULTADOS
55
6.1. Validação da determinação de selênio em soro humano por espectrometria de
absorção atômica por gerador de hidretos acoplado ao sistema de injeção de fluxos
(FI-HGAAS).
6.1.1. Linearidade da faixa de trabalho
A figura 2 apresenta a relação entre a absorvância e as concentrações (µg/L) dos
padrões de selênio variando de 2 a 20 µg/L, com um fator de correlação (R2) maior que
0,90.
Absorvância
0,50
0,40
0,30
0,20
y = 0,0176x + 0,0305
0,10
R = 0,9637
2
0,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
Concentração (µg/L)
Figura 2. Curva padrão de selênio para verificação da faixa de trabalho.
Os resultados para o cálculo estatístico da faixa de trabalho estão descritos na tabela
3 onde a média e o desvio padrão foram obtidos a partir do resultado de dez leituras do
menor (2 µg/L) e maior (20 µg/L) padrão da curva de selênio, que foram avaliadas pelo
teste F (Snedecor). A faixa testada foi considerada linear até 20 µg/L, uma vez que o valor
de F calculado (2,57) foi menor que o de F 9,9,0,01(5,35).
56
Tabela 3. Distribuição de variáveis para o cálculo da linearidade
pelo Teste F (Snedecor).
Cálculo da linearidade (Teste F)
2 µg/L
20 µg/L
Média
0,06
0,35
Variância
0,0003
0,0001
Observações
10
10
gl
9
9
F
2,57
P(F<=f) uni-caudal
0,09
F crítico uni-caudal
3,18
F tabelado
5,35
6.1.2. Seletividade e exatidão
Na figura 3 está apresentada a variação da absorvância em função da concentração
do padrão e da amostra acrescida de padrão (µg/L). Não foi observado paralelismo entre as
curvas, indicando poder existir uma interferência da matriz nos ensaios.
A fim de se confirmar esta hipótese, foi realizado o teste de seletividade do método
segundo recomenda o Guia Relacre, avaliando o percentual de recuperação ao longo da
curva de calibração, como demonstrado na tabela 4, que apresenta o percentual de
recuperação ao longo da curva contendo amostra, para concentrações adicionadas
conhecidas, segundo a concentração da amostra e do adicionado. Entretanto o percentual de
recuperação não ficou tão próximo de 100% em todos os pontos como recomendado,
evidenciando o efeito de matriz e a não seletividade do método.
Para minimizar este efeito de matriz uma curva de calibração contendo amostra foi
adotada para curva padrão em todos os ensaios.
57
0,4
y = 0,0149x + 0,0653
R2 = 0,9927
Absorvância
0,3
0,2
y = 0,0176x + 0,0129
R2 = 0,9938
0,1
0
0
5
10
15
20
25
Concentração (µg/L)
Abs do padrão
Linear (Abs amostra+padrão)
Abs amostra+padrão
Linear (Abs do padrão)
Figura 3. Curva padrão e curva da amostra acrescida de padrão para a verificação da
seletividade, segundo o INMETRO.
Tabela 4. Recuperação do selênio ao longo da curva contendo amostra em
concentrações conhecidas para avaliação da seletividade do método segundo o
Guia Relacre.
Concentração
Padrão
Adicionado Recuperado
(µg/L)
Recuperação
total (µg/L)
(µg/L)
(%)
1
2,88
0
2
4,72
2
1,83
91,73
3
6,43
4
3,55
88,65
4
8,61
6
5,73
95,54
5
12,02
10
9,14
91,37
6
16,13
14
13,24
94,60
7
18,00
16
15,12
94,48
8
20,63
20
17,75
88,73
Para a avaliação da exatidão em que o percentual de recuperação necessário deve
estar situado entre 80 a 120% (Green, 1996) houve recuperação aceitável ao longo da curva
58
de calibração, apresentando um valor médio de 92% de recuperação e desvio padrão de 2,6
demonstrando a exatidão do método.
6.1.3. Limite de detecção e limite de quantificação
O Limite de detecção (LD) do método encontrado foi aproximadamente 2 µg/L e o
Limite de Quantificação (LQ) 7 µg/L, de acordo com o apresentado na tabela 5, onde estão
apresentados os resultados, em concentração, de dez leituras do branco da amostra. A partir
do qual foi possível obter a média e o desvio padrão, valores necessários ao cálculo do LD
(0 + 3,143 x DP) e LQ [média + (5 x DP)], onde foi utilizado 5 desvios-padrão pois neste
ponto obteve-se uma recuperação de aproximadamente 100%, concordante com o que
recomenda o INMETRO.
Tabela 5. Distribuição das
concentrações do branco da
amostra para cálculo de LD e LQ.
Branco da
Concentração
amostra
(µg/L)
B1
2,52
B2
2,45
B3
3,58
B4
3,55
B5
3,70
B6
3,80
B7
4,03
B8
4,44
Média
3,51
DP
0,69
LD
2,18
LQ
6,97
DP: desvio padrão; LD: limite de
detecção; LQ: limite de quantificação.
59
6.1.4. Repetitividade
Na tabela 6 estão apresentados os dados obtidos para a leitura de dez replicatas de
um padrão de concentração de 10 µg/L de selênio, utilizadas para o cálculo do CV de
acordo com a equação: CV = desvio padrão/média x 100.
O coeficiente de variação (CV) encontrado na avaliação da repetitividade foi de
0,56%, quando testado a partir de dez replicatas de padrões (10 µg/L), evidenciando uma
baixa variação nas leituras, obtendo valores adequados de repetitividade, conforme o
recomendado pela AOAC 2002, em que o CV máximo é de 30 % para faixa de
concentração de µg/L.
Tabela 6. Valores do padrão de selênio (10 µg/L)
para a avaliação da repetitividade.
Padrão (10µg/L)
Concentração
(µg/L)
P10
10,82
P10
10,79
P10
10,82
P10
10,83
P10
10,76
P10
10,80
P10
10,76
P10
10,80
P10
10,95
P10
10,90
Média
10,82
Desvio padrão (DP)
0,06
Coeficiente de variação (CV)
0,56
6.2. Estimativa da exatidão do método para a determinação de cobre, ferro e zinco
séricos por espectrometria de emissão por plasma indutivamente acoplado.
A estimativa da exatidão deste método foi avaliada pelo teste de recuperação da
adição de 1000 µg/L do padrão OC486692 ICP- Multi Element Standard IV 1 g/L, da
60
marca Merck, contendo os elementos de interesse, às amostras de soro, obtendo um
percentual de recuperação aceitável na faixa de 80 -120% (Green, 1996).
Os resultados do teste de recuperação para o cobre estão apresentados na tabela 7,
onde 1000 µg/L de padrão multi elementos contendo cobre foi adicionado a amostra a
partir do qual foram calculados os percentuais de recuperação. Estes percentuais
observados variaram de 84,55% a 90,32%, se encontrando na faixa aceitável de
recuperação.
Tabela 7. Valores do teste de recuperação para determinação de cobre sérico no ICP OES.
CONCENTRAÇÃO
AMOSTRA
Branco
(média)
Amostra
(µg/L)
RECUPERADO ADICIONADO RECUPERAÇÃO
Am - Br Am X 5(Fd)
(µg/L)
(µg/L)
(%)
62,65
239,68
177,03
885,15
AP1
412,60
349,96
1.749,79
864,63
1.000,00
86,46
AP2
419,04
356,40
1.781,98
896,82
1.000,00
89,68
AP3
408,78
346,13
1.730,66
845,50
1.000,00
84,55
AP4
420,31
357,66
1.788,31
903,16
1.000,00
90,32
AP5
412,37
349,73
1.748,63
863,48
1.000,00
86,35
(média)
Am: Amostra; Br: Branco. Fd: Fator de diluição; Am-Br: valor da amostra diminuído do valor do
branco; Am x 5 (Fd): valor da amostra multiplicado pelo fator de diluição (5); AP: amostra
acrescida de padrão.
A tabela 8 apresenta o teste de recuperação para o ferro onde 1000 µg/L de padrão
multi elementos contendo ferro foi adicionado à amostra, a partir do qual foram calculados
os percentuais de recuperação. Estes percentuais observados variaram de 83,66 % a
106,47%, se encontrando na faixa aceitável de recuperação.
A tabela 9 apresenta o teste de recuperação para o zinco, onde 1000 µg/L de padrão
multi elementos contendo zinco foi adicionado à amostra, a partir do qual foram calculados
os percentuais de recuperação. Estes percentuais observados variaram de 83,57 % a
101,78%, se encontrando na faixa aceitável de recuperação.
61
Tabela 8. Valores do teste de recuperação para determinação do ferro sérico no ICP OES.
CONCENTRAÇÃO
AMOSTRA
Branco
(média)
Amostra
(µg/L)
Am X
Am - Br
5(Fd)
RECUPERADO ADICIONADO RECUPERAÇÃO
(µg/L)
(µg/L)
(%)
244,31
477,78
233,47 1.167,37
AP1
690,72
446,41 2.232,06
1.064,69
1.000,00
106,47
AP2
645,14
400,83 2.004,17
836,80
1.000,00
83,68
AP3
645,10
400,79 2.003,94
836,57
1.000,00
83,66
AP4
674,88
430,57 2.152,86
985,49
1.000,00
98,55
AP5
664,13
419,82 2.099,09
931,72
1.000,00
93,17
(média)
branco; Am X 5 (Fd): valor da amostra multiplicado pelo fator de diluíção(5).
Tabela 9. Valores do teste de recuperação para determinação do zinco sérico no ICP OES.
CONCENTRAÇÃO
Am - Br
5(Fd)
(µg/L)
(µg/L)
(%)
187,65
149,80
748,98
AP1
391,22
353,36 1.766,81
1.017,83
1.000,00
101,78
AP2
373,15
335,29 1.676,45
927,47
1.000,00
92,75
AP3
377,62
339,76 1.698,79
949,82
1.000,00
94,98
AP4
354,79
316,93 1.584,65
835,68
1.000,00
83,57
AP5
383,68
345,82 1.729,12
980,14
1.000,00
98,01
AMOSTRA
Branco
(média)
Amostra
(média)
(µg/L)
Am X RECUPERADO ADICIONADO RECUPERAÇÃO
37,86
branco; Am x 5(Fd): valor da amostra multiplicado pelo fator de diluíção(5).
62
Na medida em que os valores da recuperação encontraram-se dentro da faixa de 80
a 120%, foi possível estimar a exatidão do teste, diante da evidência da não interferência da
matriz nas determinações de cobre, ferro e zinco por espectrometria de emissão atômica
indutivamente acoplada ao plasma, além de demonstrar não haver perda destes elementos
durante o preparo da amostra. Diante disso, este método foi considerado útil na
determinação desses elementos em amostra de soro humano.
6.3. Análise descritiva dos indivíduos em relação ao TM
O diâmetro médio do TM nos 75 indivíduos TM positivos 60 dias após a vacinação
foi 10,35 ± 4,64 mm (média ± DP), variando de 5,0 a 27,0 mm.
Como a freqüência dos valores do diâmetro do TM representada na figura 4A
apresentou uma distribuição assimétrica, estes foram transformados em seus respectivos
logaritmos [log (X+1)], como representado na figura 4B.
25
20
Freqüência
Frequência
20
15
10
A
5
0
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
10
5
0
B
0,70 0,80 0,90 1,00 1,10 1,20 1,30 1,40 1,50
Diâmetro maior do TM
Log do diâmetro do TM
Figura 4. Distribuição de freqüência dos valores do diâmetro do TM entre os vacinados
com TM positivos 60 dias após vacinação (A) e do logarítmo dos valores do diâmetro do
TM (B) nos mesmos indivíduos, Caratinga (MG), 2005.
63
6.4. Análise descritiva dos níveis séricos dos elementos traço
Os níveis séricos de cobre, avaliados em 171 indivíduos, apresentaram um valor
médio de 1.433,7 ± 665,7 µg/L (média ± DP), variando entre 318,9 e 4.789,7 µg/L. Os
níveis séricos de ferro, avaliados em 144 indivíduos, apresentaram um valor médio de
1.431,6 ± 791,5 µg/L (média ± DP), variando entre 339,5 a 4.811,3 µg/L. Os níveis séricos
médios de selênio encontrados na avaliação de 157 indivíduos foram de 88,6 ± 39,0 µg/L
(média ± DP), variando de 35,9 a 311,4 µg/L e o valor médio de zinco sérico observado em
171 indivíduos foi 999,2 ± 365,7 µg/L (média ± DP), variando de 584,7 a 4.267,9 µg/L. A
amostra para determinação de selênio e ferro foi menor devido à quantidade insuficiente de
sangue de alguns voluntários para as análises laboratoriais.
Para normalizar a distribuição dos valores séricos dos elementos traço avaliados foi
utilizada a transformação logarítmica [log (X+1)]. As figuras 5A, 6A, 7A e 8A apresentam
a distribuição das concentrações séricas de cobre, ferro, selênio e zinco respectivamente,
observados na amostra. Enquanto as figuras 5B, 6B, 7B e 8B apresentam distribuição
normal após transformação logarítmica das concentrações séricas de cobre, ferro, selênio e
zinco, respectivamente.
64
40
30
30
Frequência
Frequência
40
20
20
10
10
B
A
0
0,00
1000,0
2000,0
3000,0
4000,0
0
2,50
5000,0
2,75
3,00
3,25
3,50
3,75
Log da concentração de cobre sérico
(µg/L)
Concentração de cobre sérico (µg/L)
Figura 5. Distribuição da concentração de cobre sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de cobre sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
tegumentar americana, Caratinga (MG), 2005.
40
Frequência
Frequência
30
20
10
30
20
10
A
0
0,0
1000,0
2000,0
3000,0
4000,0
5000,0
Concentração de ferro sérico (µg/L)
B
0
2,50
2,75
3,00
3,25
3,50
3,75
Log da concentração de ferro sérico
(µg/L)
Figura 6. Distribuição da concentração de ferro sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de ferro sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
65
50
30
25
Frequência
30
20
y
Frequência
40
10
20
15
10
5
B
A
0
0,0
100,0
200,0
0
300,0
1,40
1,60
1,80
2,00
2,20
2,40
2,60
Log_da concentração de selênio sérico
(µg/L)
Figura 7. Distribuição da concentração de selênio sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de selênio sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
100
40
Frequência
Frequência
80
60
40
30
20
10
20
A
0
500,0
1500,0
2500,0
3500,0
4500,0
Concentração de zinco sérico (µg/L)
B
0
2,80
3,00
3,20
3,40
3,60
3,80
Log da concentração de zinco sérico
(µg/L)
Figura 8. Distribuição da concentração de zinco sérico (A) e distribuição do logarítmo da
concentração de zinco sérico (B) em µg/L, nos indivíduos vacinados anti-leishmaniose
66
6.5. Análise descritiva dos níveis séricos dos elementos traço por gênero, idade e IMC
A tabela 10 apresenta a distribuição dos valores séricos médios dos elementos traço
avaliados por gênero e idade. Quanto ao gênero, apesar de não significativo, foram
observados maiores níveis séricos de cobre (1.544,8 ± 676,7 µg/L), selênio (92,8 ± 46,5
µg/L) e zinco (999,4 ± 863,2 µg/L) entre indivíduos do sexo feminino. Ao contrário, o
nível sérico médio de ferro que apresentou maior valor entre os indivíduos do sexo
masculino (1.495,8 ± 863,2 µg/L) quando comparado aos indivíduos do sexo feminino
(1.336,5 ± 667,2 µg/L).
Também apesar de não significativo, quanto à idade, os maiores valores séricos
médios de ferro (1.552,5 ± 911,3 µg/L), selênio (95,6 ± 44,7 µg/L) e zinco (1.033,8 ± 450,2
µg/L) foram observados na faixa etária de 21 a 59 anos. Diferença significativa foi
observada apenas para o cobre, que apresentou maior valor sérico médio (1.757,9 ± 839,8
µg/L) na faixa etária de 5 a 10 anos de idade.
Tabela 10. Concentração sérica média e desvio padrão de cobre, ferro, selênio e zinco
(µg/L) de acordo com gênero e idade, determinado em indivíduos vacinados antiLTA, Caratinga (MG), 2005.
Variável
Cobre (µg/L)
n
Média
DP
Ferro (µg/L)
n Média DP
Selênio (µg/L)
n Média DP
Zinco (µg/L)
n Média DP
Gênero
F
M
65 1.544,8 676,7 58 1.336,5 667,2 59
106 1.365,6 652,7 86 1.495,8 863,2 98
92,8
85,9
46,5 65
33,8 106
999,4
998,9
283,5
409,4
Idade
1.757,9 a
1.425,2 b
1.351,5 b
1.280,1 b
5-10
11-20
21-59
60+
30
34
98
9
839,8 24 1.178,4 517,1 26
727,2 28 1.332,8 559,5 33
578,2 84 1.552,0 911,3 89
348,5 8 1.273,5 635,0 9
74,2
81,5
95,6
86,5
21,8 30 963,7 183,8
31,9 35 938,6 227,8
44,7 97 1.033,8 450,2
26,5 9
979,1 178,3
Total
171 1.433,7 665,7 144 1.414,0 791,5 157
88,6
39,0 171
999,2
365,7
n: número de indivíduos avaliados; DP: desvio padrão; a: diferença significativa da
faixa etária de 5 – 10 com as de 11 – 20 e 21 – 59 anos (P< 0,05); b: não há diferença
significativa (P> 0,05) entre as faixas etárias.
67
A distribuição da amostra por gênero (percentual), idade (média ± DP) e IMC
(média ± DP) de acordo com os grupos de elementos traço séricos está apresentada na
tabela 11. Os grupos 0 e I (G0 e GI), classificados por níveis baixos e níveis dentro da faixa
recomendada de referência para os elementos traço em soro humano, respectivamente,
foram agrupados diante do pequeno número de indivíduos do grupo 0, formando o grupo
G0/I.
Quanto ao gênero, não foi observada diferença significativa do percentual de
indivíduos do sexo masculino e feminino segundo o grupo de elementos traço. O percentual
de indivíduos do sexo masculino foi maior em ambos os grupos (G0/I e GII) para cobre
(65,7% e 56,1%), ferro (59,5% e 60,6%) e zinco (63,1% e 54,5%). A excessão do selênio
que apresentou um percentual superior de indivíduos do sexo feminino no grupo GII, com
excesso de selênio (54,5%).
Também não foi observada diferença significativa em relação à idade. Para o grupo
G0/I de cobre e zinco foram encontrados idades superiores ao grupo GII, no entanto para
ferro e selênio uma idade ligeiramente maior foi encontrada entre os indivíduos com
excesso destes elementos (GII).
Quanto ao IMC, não foi observada diferença significativa nos seus valores médios
entre os grupos G0/I e GII para todos os elementos traço avaliados, os quais foram muito
semelhantes.
68
Tabela 11. Distribuição da amostra por gênero (percentual), idade e IMC (média e
desvio padrão) de acordo com os grupos G0/I e GII dos elementos traço, entre os
indivíduos vacinados anti-LTA em Caratinga (MG), 2005.
Gênero (%)
Feminino Masculino
36 (34.3) 69 (65.7)
29 (43.9) 37 (56.1)
0,135
Idade (anos)
Média
DP
30,5
17,3
26,8
17,4
0,176
IMC (Kg/m2)
Média
DP
21,8
4,2
21,2
5,3
0,451
111
33
45 (40,5) 66 (59,5)
13 (39,4) 20 (60,6)
0,536
29,4
17,5
31,5
18
0,550
21,8
4,7
21,2
4,5
0,563
SELÊNIO G0/I
GII
p
135
22
47 (34.8) 88 (65.2)
12 (54.5) 10 (45.5)
0,064
28,6
17,7
35,4
16
0,092
21,5
4,7
22,3
3,6
0,481
G0/I
GII
149
22
55 (36.9) 94 (63.1)
10 (45.5) 12 (54.5)
0,293
29,4
17,6
27
16,2
0,541
21,6
4,7
20,7
4,6
0,384
Elementos traço
(µg/L)
COBRE G0/I
GII
p
n
105
66
G0/I
GII
FERRO
p
ZINCO
p
n: número de individuos avaliados; DP: desvio padrão; G0/I: níveis séricos
agrupados valores baixo a níveis aceitáveis de acordo com valores de referências;
GII: níveis séricos elevados, acima dos níveis aceitáveis pelos valores de
referências.
De acordo com os valores de referência, 61,4 %, 77,1 %, 86,0 % e 87,1 % dos
indivíduos avaliados se encontram no grupo G0/I e 38,6 %, 22,9 %, 14,0 % e 12,9 %
apresentaram valores elevados (GII) para cobre, ferro, selênio e zinco, respectivamente.
6.6. Relação da contagem de hemácias e os níveis séricos de hemoglobina com os níveis
séricos dos elementos traço.
O valor médio da contagem de hemácias (106/mm3) e dos níveis séricos de
hemoglobina para os indivíduos vacinados anti-LTA dos grupos G0/I e GII de cada
elemento estão demonstrados na tabela 12. Uma maior quantidade de hemácias foi
69
observada em G0/I para cobre (5,03 ± 0,45), selênio (5,05 ± 0,50) e zinco (5,00 ± 0,52),
mas para o ferro o maior número de hemácias observado foi em GII (5,14 ± 0,49), embora
não tenha sido observada nenhuma diferença significativa entre estes valores.
Os níveis séricos de hemoglobina, observados nos indivíduos avaliados,
apresentaram valores significativamente maiores em G0/I de cobre (13,76 ± 1,64; p =
0,034) e selênio (13,71 ± 1,79; p = 0,013) quando comparados com GII de cobre (13,15 ±
2,01) e selênio (12,68 ± 1,37). Enquanto nenhuma diferença significativa foi observada
para os níveis de hemoglobina entre G0/I e GII de ferro e zinco.
Tabela 12. Relação entre a contagem de hemácias e níveis de hemoglobina de
acordo com os grupos G0/I e GII de cobre, ferro, selênio e zinco dos individuos
vacinados anti-LTA em Caratinga (MG), 2005.
Elementos traço (µg/L)
n
Hemácias (106/mm3)
Média
DP
5,03
0,45
4,95
0,60
Hemoglobina (g/dL)
Média
DP
13,76 *
1,64
13,15 *
2,01
COBRE
G0/I
GII
105
66
FERRO
G0/I
GII
111
33
4,98
5,14
0,54
0,49
13,46
14,08
1,81
1,48
SELÊNIO
G0/I
GII
135
22
5,05
4,81
0,50
0,57
13,71 *
12,68 *
1,79
1,37
ZINCO
G0/I
GII
149
22
5,00
4,97
0,52
0,52
13,50
13,61
1,82
1,86
agrupados valores baixo a níveis aceitáveis de acordo com valores de
referências; GII: níveis séricos elevados, acima dos níveis aceitáveis pelos
valores de referências; * Diferença significativa p ≤ 0,05.
6.7. Relação da contagem de leucócitos e do percentual de linfócitos e monócitos com
os níveis séricos de elementos traço.
A tabela 13 apresenta a contagem de leucócitos e o percentual de linfócitos e
monócitos de acordo com os grupos G0/I e GII para cobre, ferro, selênio e zinco.
70
Na distribuição do número de leucócitos entre G0/I e GII para todos os elementos
não foi observada diferença significativa, entretanto o percentual de linfócitos foi
significativamente maior (p = 0,031) em GII apenas para o selênio (37,43 ± 9,77) quando
comparado a G0/I (32,70 ± 9,16). O percentual de monócitos foi significativamente maior
em G0/I para o cobre (7,79 ± 3,62; p = 0,013) e para o selênio (7,53 ± 3,41; p = 0,030),
porém nenhuma diferença significativa foi observada entre G0/I e GII de ferro e zinco.
Tabela 13: Relação da contagem de leucócitos e do percentual de linfócitos e
monócitos de acordo com os grupos G0/I e GII de cobre, ferro, selênio e zinco dos
indivíduos vacinados anti-LTA em Caratinga (MG), 2005.
Leucócitos (106/mm3)
Média
DP
G0/I 101
6,27
1,67
GII 65
6,62
2,68
Linfócitos (%)
Média
DP
33,29
8,45
33,61
10,75
G0/I 108
GII 32
6,46
6,28
2,27
1,83
33,51
32,58
9,30
9,50
7,43
6,71
3,34
1,97
SELÊNIO G0/I 131
GII 21
6,50
5,57
2,17
1,54
32,70 *
37,43 *
9,16
9,77
7,53 *
5,86 *
3,41
1,85
G0/I 143
GII 22
6,43
6,36
2,10
2,38
33,30
33,86
9,20
10,76
7,43
6,45
3,28
3,14
Elementos traço
(µg/L)
COBRE
FERRO
ZINCO
n
Monócitos (%)
Média
DP
7,79 *
3,62
6,50 *
2,48
agrupados valores baixo a níveis aceitáveis de acordo com valores de referências;
GII: níveis séricos elevados, acima dos níveis aceitáveis pelos valores de
referências. * p ≤ 0,05 diferença estatisticamente significativa.
6.8. Relação entre o TM e os níveis séricos de cobre, ferro, selênio e zinco.
As figuras 9, 10, 11 e 12 apresentam o logaritmo da concentração dos níveis séricos
de cobre, ferro, zinco e selênio, respectivamente, de acordo com faixas do diâmetro do TM
(0, 5-8, 8,1 - 9, 9,1 - 12, >12 mm). A concentração sérica média de cobre, ferro, selênio e
zinco de acordo com as faixa do diâmetro do TM estão apresentadas na tabela 14 (em
71
anexo). Não houve diferença significativa entre os valores do logaritmo da concentração
dos níveis séricos de cobre (Figura 9), ferro (Figura 10) e zinco (Figura 11) com as faixas
Log da concentração
sérica de cobre (µg/L)
do diâmetro do TM.
3,5
3,4
3,3
3,2
3,1
3,0
2,9
2,8
2,7
2,6
0
5,0 - 8,0
8,1 - 9,0
9,1 - 12,0
> 12,0
Diâmetro do TM (mm)
Figura 9. Relação entre o logarítmo da concentração de cobre sérico (µg/L) e o diâmetro do
TM (mm), avaliado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005.
sérica de ferro (µg/L)
3,4
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
0
5,0 - 8,0
8,1 - 9,0
9,1 - 12,0
> 12,0
Figura 10 Relação entre o logarítmo da concentração de ferro sérico (µg/L) e o diâmetro do
TM (mm), avaliado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005.
72
sérica de zinco (µg/L)
3,3
3,2
3,1
3,0
2,9
2,8
2,7
2,6
2,5
0
5,0 - 8,0
8,1 - 9,0
9,1 - 12,0
> 12,0
Figura 11. Relação entre o logarítmo da concentração de zinco sérico (µg/L) e o diâmetro
do TM (mm), avaliado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005.
Na figura 12 está apresentado a média e o desvio padrão do logaritmo da
concentração sérica de selênio segundo o diâmetro do TM. Foi observada uma diferença
significativa (p < 0.05) entre o valor apresentado no grupo de diâmetro de 5-8 mm com os
grupos de diâmetro igual a 0, 8,1 – 9 mm e 9,1 – 12 mm, apresentando um aumento
progressivo do diâmetro do TM com um aumento dos níveis séricos de selênio, sendo esta
tendência a partir do grupo de diâmetro do TM de 8,1 – 9 mm. Isto demonstra uma relação
benéfica do selênio com a resposta imune, avaliada pelo TM, em indivíduos vacinados antiLTA.
73
sérica de selênio (µg/L)
2,4
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0
5,0 - 8,0
8,1 - 9,0
9,1 - 12,0
> 12,0
Figura 12. Relação entre o logarítmo da concentração de selênio sérico (µg/L) e o diâmetro
do TM (mm), avaliado em indivíduos vacinados anti-LTA, Caratinga (MG), 2005.
A figura 13 apresenta a relação entre o logarítmo do diâmetro médio do TM para
cada elemento traço avaliado, levando em consideração os grupos G0/I e GII, onde para o
selênio o diâmetro do TM foi significativamente (p = 0,021) maior em GII (0,66 ± 0,53
mm) em relação à G0/I (0,38 ± 0,51 mm), ou seja, indivíduos vacinados com excesso de
selênio apresentaram um maior diâmetro do TM.
No entanto, para o zinco em GII (0,23 ± 0,43 mm) foi observado um diâmetro
médio do TM significativamente (p = 0,033) menor quando comparado a G0/I (0,48 ± 0,53
mm). Para o ferro foi observado um menor valor do diâmetro médio do TM em GII (0,35 ±
0,52 mm) quando comparado ao grupo G0/I (0,43 ± 0,52 mm), porém sem diferença
significativa (p=0,441). Para o cobre, ao contrário, foi observado um aumento não
significativo (p=0,127) do diâmetro médio do TM em GII (0,52 ± 0,54 mm) em relação à
G0/I (0,40 ± 0,51 mm).
74
Log do diâmetro do TM (mm)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Cu
Fe
Se *
Elementos traço
níveis séricos baixos a normais (G0/I)
Zn *
níveis séricos elevados (GII)
Figura 13. Relação entre o logarítmo do diâmetro do TM (mm) e os grupos (G0/I e GII) dos
elementos traço (cobre, ferro, selênio e zinco), nos indivíduos vacinados anti-LTA,
Caratinga (MG), 2005. * p < 0,05
75
7. DISCUSSÃO
76
O ensaio vacinal foi realizado na região de Caratinga, área endêmica para LTA,
onde o grupo de pesquisa do Dr. Wilson Mayrink vêm desenvolvendo trabalhos por mais
de quarenta anos, o que permitiu a consolidação de uma vigilância epidemiológica sediada
no “Ambulatório Dr. Paulo Araújo Magalhães”, centro de referência na região do Vale do
Rio Doce para diagnóstico, tratamento e controle das leishmanioses. De acordo com
Machado-Coelho et al. (1999) 1.712 novos casos de LTA foram relatados em Caratinga, no
período de 1966 a 1996, com um nível médio de incidência de 48 casos por 100.000
habitantes e com um aumento da morbidade neste período. Estes autores também
observaram uma variação cíclica, durante três décadas, na incidência anual da LTA na
região de Caratinga, com um pico epidêmico em cada década. Segundo estes autores, estas
alças epidêmicas se devem, principalmente, ao nascimento de uma coorte de indivíduos
susceptíveis com consequente acúmulo destes, suficientes para o início de um novo surto
epidêmico. Porém diante da diminuição dos susceptíveis há um declínio da epidemia, até
que uma nova coorte de susceptíveis seja formada novamente. Associado a isto, o aumento
da população de vetores no domicílio e peridomicílio, devido a baixas condições sanitárias
e acúmulo de lixo, contribui para a criação de uma biocenose susceptível responsável pelos
picos de incidência ocasionais de LTA.
Com o início da avaliação de uma vacina anti-LTA por Mayrink et al. (1979)
realizado nesta mesma área, inúmeros avanços no desenvolvimento desta vacina,
confirmados a partir de ensaios de fase I, II e III, foram realizados em diferentes locais do
Brasil e da América do Sul. Em estudo de fase I, Mazochi et al. (1998) observaram que a
vacina é segura, na medida que não apresenta efeitos colaterais graves, que se restringem a
apenas a dor local. Os ensaios de fase II realizados confirmaram a segurança e
demonstraram uma capacidade imunogênica da vacina (Vélez et al., 2000; De Luca et al.,
2001). Os ensaios de fase III realizados por Armijos et al. (2004) e Vélez et al. (2005)
confirmaram novamente a segurança e imunogenicidade desta vacina. Estes estudos, no
entanto, demonstraram baixa eficácia vacinal.
Mas em todos os ensaios realizados fica definido que cerca de 30% dos indivíduos
vacinados não convertem o TM após vacinação. Vários fatores podem estar relacionados a
este percentual da população que não converte o TM, observado em diferentes ensaios
77
vacinais em diferentes localidades, dentre eles fatores inerentes ao parasita e outros ao
hospedeiro.
Existem fatores específicos do hospedeiro, como fatores genéticos e nutricionais
que podem afetar a resposta humana contra LTA (Murray et al., 2005). Entre os fatores
nutricionais, os elementos traço como cobre, ferro, selênio e zinco são componentes
essenciais de muitas enzimas que tem funções importantes na resposta imune humana
(Erickson et al., 2000; Mocchegiani et al., 2000; Rink & Gabriel, 2000).
Até o momento não existem estudos publicados que investigaram a influência destes
elementos traço na resposta imune induzida por uma vacina anti-leishmaniose.
De acordo com a literatura um aumento de cobre sérico leva a um maior número de
macrófagos e neutrófilos no sangue e suas atividades fagocíticas são melhoradas (Erickson
et al., 2000; Percival, 1995). No entanto, a deficiência de cobre promove a diminuição da
produção de IL-2, uma citocina envolvida na resposta imune do tipo Th1 (Hopkins &
Failla, 1997). Além disso é observado neutropenia e redução da produção e atividade de
células fagocíticas na deficiência deste elemento (Percival, 1998). Alguns estudos
demonstraram que durante processos inflamatórios o organismo produz interleucina-1 (IL1) que está associada à síntese de proteínas de fase aguda, como ceruloplasmina,
aumentando a captação e biodisponibilidade do cobre, sendo assim a responsável pelo
aumento de cobre sérico (Klassing et al., 1987).
Nossos resultados não demonstraram um aumento significativo do diâmetro do TM
em função do aumento dos níveis séricos de cobre entre os vacinados. Entretanto, Faryadi
& Mohebali (2003) observaram concentrações séricas de cobre significativamente maiores
em indivíduos com leishmaniose aguda e crônica, quando comparado a indivíduos
saudáveis. O mesmo foi observado por Koçygit et al. (1998), entretanto, neste estudo após
o tratamento convencional os níveis sericos de cobre foram semelhante aos valores
observados em indivíduos saudáveis. Em ambos os estudos, os autores sugerem uma
associação deste aumento sérico de cobre durante a infecção ao aumento da ceruloplasmina
induzida por IL-1.
Van Weyenbergh et al. (2004) ao comparar diferentes formas clínicas da
leishmaniose mostrou um aumento expressivo deste elemento na forma cutânea da LTA e
na leishmaniose visceral. Na LV foi observada uma correlação positiva entre cobre
78
plasmático e anticorpos IgG anti-Leishmania. Esta resposta é caracterizada como não
protetora, tipo Th2, sugerindo a interferência de cobre também na resposta humoral. Estes
autores não consideraram o aumento de cobre como marcador de infecção, pois não foi
observado aumento significativo na forma mucosa da LTA, caracterizada por alta produção
de citocinas pró-inflamatórias como INF-γ e TNF-α.
Em nosso estudo observamos uma relação significativa entre elevados níveis de
cobre e um menor nível de hemoglobina. Isto pode ser explicado pela capacidade inibitória
da absorção de ferro em meio a elevadas concentrações de cobre, observada por Arredondo
et al. (2006) em experimentos in vitro. Estes autores sugerem que essa interação ocorre
devido à competição da ligação na proteína transportadora DMT1, que participa do
transporte de metais bivalentes (Fe, Cu, Zn, Mn e Pb). A DMT1 é a principal proteína
transportadora de Fe2+ e participa ativamente no transporte de Cu+1 (Gunshin, 1997;
Arrendondo, 2003).
Um menor percentual de monócitos foi observado no grupo GII para o cobre (p <
0,05), onde os indivíduos apresentam elevados níveis séricos deste elemento. De acordo
com Percival (1998) o cobre é essencial à produção e maturação de monócitos, porém seu
excesso pode interferir na absorção de outros elementos importantes para produção desta
linhagem de células, como zinco e ferro (Whittaker, 1998; Arredondo et al., 2006).
A deficiência de zinco afeta primariamente as células T, resultando na diminuição
destas e em um desequilíbrio de resposta das células T helper, promovendo predominância
de uma resposta Th2 (Ibs & Rink, 2003; Rink and Haase, 2007). Essa deficiência leva
também a diminuição da produção e maturação de monócitos, bem como de neutrófilos e
células “natural killer” (NK), diminuindo também o estresse oxidativo no interior dos
fagócitos, além da diminuição da produção de citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α e INF-γ)
(Erickson et al., 2000; Mocchegiani et al., 2000; Ibs & Rink, 2003). Porém, durante a
resposta inflamatória a produção de IL-1 induz a produção de IL-6 e glicocorticóides,
substâncias capazes de ativar a síntese de metalotioneína no fígado e em outros tecidos,
resultando em uma diminuição dos níveis de zinco sérico, explicando a hipozincemia em
estados inflamatórios e infecciosos (Svenson et al., 1985; Klassing et al., 1987; Rofe et al.,
1996; King et al., 2000).
79
Nossos resultados demonstraram uma baixa resposta ao TM entre os vacinados com
altos níveis de zinco sérico. Estes resultados parecem concordar com outros estudos que
observaram uma redução da reação de hipersensibilidade tardia associada a um excesso dos
níveis séricos de zinco. Isto provavelmente é devido à supressão da atividade dos linfócitos
e da diminuição de INF-γ, demonstrado em estudos in vitro (Chandra, 1984; Provinciali et
al., 1998; Rink & Gabriel, 2000), reduzindo a resposta imune Th1 (Mendonça et al., 1995;
Nascimento et al., 1990). É importante ressaltar que em nosso estudo, ao contrário do
demonstrado por estes autores, nossos resultados não foram consistentes, pois comparando
os níveis séricos de zinco com os quartis do diâmetro positivo do TM essa diferença não foi
significativa.
No trabalho de Faryadi & Mohebali (2003) uma hipozincemia associada a níveis
séricos elevados de cobre foi observada entre os pacientes com LTA aguda e crônica.
Resultado semelhante foi encontrado por Koçygit et al. (1998), na Turquia, e por Van
Weyenbergh et al. (2004), no Brasil, antes do tratamento convencional com antimoniais.
Entretanto, em ambos os estudos, após o tratamento da leishmaniose os níveis séricos de
zinco e cobre se normalizaram, demonstrando uma correlação fundamental entre estes
elementos e uma resposta inflamatória produzida pela infecção por Leishmania (Koçyigit et
al., 1998; Van Weyenbergh et al., 2004). Uma possível explicação para a ausência de
mudanças expressivas nos níveis séricos de cobre e zinco entre os vacinados é que a
resposta imune, neste caso, foi induzida pelo contato com parasitas mortos. O estímulo
produzido pela vacina é menos expressivo que o induzido pela presença de parasitas vivos
no sítio de infecção, já que estes se replicam. Sendo, portanto este último estímulo contínuo
e mais expressivo, refletindo em uma significativa modificação dos níveis séricos de cobre
e zinco.
Em relação ao ferro, a literatura tem indicado que a proliferação e ativação de linfócitos,
neutrófilos e células NK requerem a presença de ferro, uma vez que este elemento é
essencial para o funcionamento de enzimas como a ribonucleotídeo redutase, envolvida
na síntese de DNA (Leberman et al., 1984; Brock & Mulero, 2000; Erickson et al.,
2000). Além disso, já foi observada em indivíduos deficientes de ferro uma redução da
reação de hipersensibilidade tardia e função de células T reduzidas (Brock, 1993).
Entretanto, entre os indivíduos da amostra desse estudo, em Caratinga, o percentual de
80
indivíduos com baixos níveis de ferro foi pequeno. Portanto, não foi observada diferença
significativa entre os níveis séricos de ferro e a resposta ao TM entre os indivíduos
vacinados anti-LTA.
Ao contrário dos resultados observados em Caratinga, entre os indivíduos
vacinados, outros autores observaram um menor nível de ferro entre os indivíduos
infectados por Leishmania, quando comparado aos controles (Koçyigit et al., 1998; Faryadi
& Mohebali, 2003). Koçyigit et al. (1998) observaram que após tratamento os níveis de
ferro sérico aumentaram, encontrando-se na faixa aceitável como normal pelos valores de
referência. O mecanismo da diminuição dos níveis séricos de ferro sugerido foi devido à
presença de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e TNF-α pela via de regulação da
ferritina (Brock & Mulero, 2000) e pela liberação de apolactoferrina pelos granulócitos
(Adamik & Wlaszczyk, 1996). Este sequestro do ferro durante estágios da infecção é
importante para diminuir a biodisponibilidade deste elemento aos microorganismos
impedindo seu crescimento e patogenicidade. Entretanto, essa diminuição é controlada pelo
hospedeiro a fim de permitir o desenvolvimento de uma resposta imune adapatativa (Brock
& Mulero, 2000).
Este efeito da biodisponibilidade do ferro favorável ao patógeno foi avaliado por
Laionde & Holbein. (1984) que observaram um aumento da mortalidade em camundongos
infectados com Trypanosoma cruzi quando recebiam suplementação de ferro, mas uma
depleção deste elemento se mostrava como fator protetor aos camundongos quanto ao
desenvolvimento da infecção. Resultados semelhantes foram encontrados por Pedrosa et al.
(1990b) ao avaliar os efeitos de depleção e suplementação de ferro, no curso da infecção
em camundongos infectados com a cepa Y de T. cruzi.
Ao contrário do cobre, zinco e ferro, os níveis séricos de selênio são
significativamente maiores com o aumento do TM, resultados que se mantiveram
consistentes mesmo após a inversão da análise. Observamos um aumento progressivo do
diâmetro do TM com o aumento dos níveis séricos de selênio. Mas neste caso, foi
observado apenas a partir do grupo de diâmetro do TM de 8,1 – 9 mm, demonstrando uma
relação benéfica do selênio com a resposta imune. Estes resultados parecem confirmar
estudos onde a suplementação de selênio, em animais experimentais, está associada ao
aumento da produção e atividade de células NK, neutrofilos, macrófagos e células T
81
citotóxicas, produção de citocinas, aumento da resposta de hipersensibilidade tardia e
resposta induzida por vacinas (Urban & Jarstrand, 1986; Kiremidjian-Schumacher & Roy,
1998; McKenzie et al., 1998; Erickson et al., 2000; Arthur et al., 2003). Este aumento da
reação de hipersensibilidade tardia com aumento do selênio é concordante com os
resultados observados neste estudo, uma vez que o TM é baseado neste tipo de reação.
Nossos resultados apresentaram uma menor concentração de hemoglobina em GII
para o selênio, onde os indivíduos apresentaram elevados níveis séricos deste elemento.
Porém, como sua biodisponibilidade ainda não é totalmente elucidada, não sabemos se há
alguma interação na absorção e biodisponinilidade de selênio e ferro. Interações entre
elementos como cobre, ferro, zinco e outros elementos já são conhecidas (Pedrosa et al.,
1993; Arredondo, 2006), por isso não se pode descartar a hipótese de uma interação entre
ferro e selênio.
Um menor percentual de monócitos foi observado em GII, ou seja, entre os
indivíduos com excesso de selênio. Este resultado parece contraditório aos dados da
literatura que relatam a necessidade deste elemento para a produção e maturação de
monócitos, mas pouco se sabe sobre a toxicidade do mesmo e sua interferência na
manutenção das células.
Estudos em animais experimentais demonstraram que uma baixa ingestão de selênio
e conseqüente deficiência deste elemento estão relacionadas ao desenvolvimento de várias
doenças e geralmente é concomitante a deficiência de vitamina E. Esta associação da
deficiência de selênio e vitamina E leva a hipótese de um processo antioxidante (Turner &
Finch, 1991; Wichtel, 1998). O efeito antioxidante do selênio na resposta imune está
relacionado à atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px). Esta selenoenzima é importante
na proteção celular, pois cataliza a oxidação da glutationa reduzida pelo peróxido de
hidrogênio e outros hidroperóxidos, diminuindo assim o dano oxidativo a célula hospedeira
(Ursini & Bindoli, 1987). A atividade diminuída da glutationa peroxidase leva a uma
remoção incompleta de peróxido de hidrogênio das células, aumentando a morte de
parasitas intracelulares (Haidaris & Bonventre, 1982; Koçyigit et al., 1999; Urban &
Jarstrand, 1986).
82
Koçyigit et al. (1999) avaliaram os níveis séricos de selênio e de glutationa
peroxidase em indivíduos com leishmaniose cutânea, os quais apresentaram menores níveis
séricos de selênio correlacionados a uma diminuição significativa de glutationa peroxidase
quando comparado a indivíduos saudáveis. Estes resultados sugerem que durante a infecção
por Leishmania a diminuição de selênio promove uma baixa capacidade antioxidante da
glutationa peroxidase, aumentando a citotoxidade dos fagócitos. Isto pode ser considerado
uma estratégia de defesa do hospedeiro contra os patógenos invasores. Resultados
semelhantes foram encontrados em pessoas infectadas por Leishmania donovani (Biwas et
al., 1997). No entanto, apesar deste achado o mecanismo exato da redistribuição do selênio
ainda é desconhecido.
A essencialidade do selênio ao funcionamento eficiente do sistema imune em
animais e humanos e sua bioquímica celular descrita como um sistema complexo, além da
expressão de proteínas contendo selênio é relatado por vários autores (Turner & Finch,
1991; Wichtel, 1998; Lescure et al., 2002; Arthur et al., 2003). Este elemento é encontrado
em quantidades variadas em solos de diferentes regiões do mundo, o que é refletido na sua
concentração sérica em indivíduos que consomem alimentos produzidos localmente.
Combs (2001) avaliando a expressão de selenoenzimas de acordo com a dieta observou que
indivíduos que apresentam dieta pobre em selênio possuem uma menor expressão destas
selenoenzimas. Diante disso, seria interessante uma avaliação dos níveis de selênio no solo
da região de Caratinga, para correlacionar aos níveis séricos observados em nossa amostra.
7.1 Limitações do estudo
Idealmente, a avaliação da resposta proliferativa de células mononucleares do
sangue perifério (CMSP) e a determinação de citocinas séricas deveriam ser utilizadas para
avaliação de vacinas candidatas. Entretanto devido aos recursos escassos e dificuldade
destas avaliações nos campos de trabalho, isto se torna inviável para o desenvolvimento
destes ensaios em grande escala.
Diante da alta correlação do TM com a resposta proliferativa de CMSP e com os
níveis séricos de INF-γ e IL-12 (Nascimento et al., 1990) além de ser um teste barato e de
fácil realização, este método tem sido utilizado tanto na seleção de indivíduos aptos a
receberem a vacina como sendo marcador imunogênico pós-vacinal (Mayrink et al., 1979;
83
Mayrink et al., 1985; Antunes et al., 1986; Nascimento et al., 1990; Mendonça et al., 1995;
Armijos et al., 1998; Marzochi et al., 1998; De Luca et al., 1999; Vélez et al., 2000;
Armijos et al., 2004).
Alguns autores tem questionado a capacidade do TM em induzir um significativo
aumento da proliferação de CMSP e produção de INF-γ in vitro e in vivo (José et al., 2001;
De Luca et al., 2003), o que limitaria seu uso em ensaios vacinais. Entretanto, as diferenças
na dose entre a vacina e o TM (40 µg de nitrogênio proteico por mL para o TM e 180, 360
ou 540 µg de nitrogênio proteico/mL para a vacina) e na via de administração (via
intradérmica para o TM e intramuscular para a vacina) sugerem que uma única dose do TM
não seja capaz de induzir positividade de um segundo TM por no mínimo 60 dias da
primeira aplicação.
José et al. (2001) avaliando o poder sensibilizante do TM em indivíduos sem
contato prévio com Leishmania e residentes em área não endêmica, observaram semelhança
entre a positividade do segundo TM aplicado 30 e 90 dias após o primeiro, entre os grupos
placebo e o que recebeu o TM. Esses autores ao avaliarem os níveis séricos de INF-γ 30 e
360 dias após a primeira aplicação do TM observaram um alto nível desta citocina no 30º
dia. No entanto, 360 dias após o primeiro TM esta citocina foi detectada em poucos
indivíduos e com níveis muito baixos (José et al., 2001). Diante disso, acreditamos que o
TM é capaz de sensibilizar indivíduos saudáveis, porém em menor intensidade e com uma
sensibilização não duradoura, assim sua utilização como teste para seleção de indivíduos
aptos a receberem vacina anti-LTA e na avaliação da imunogenicidade da mesma é
aceitável.
Um fator limitante deste estudo é a presença de subgrupos populacionais compostos
por diferentes níveis séricos de elementos traço. Apesar de ser ideal uma avaliação prévia
destes elementos à vacinação, os custos seriam proibitivos, uma vez que suas deficiências
são pouco freqüentes. Em Caratinga observamos um percentual de deficiência de apenas
6,2% de cobre e zinco e 5,8 para ferro. Entretanto, para o selênio o percentual de indivíduos
deficientes foi bem maior (49,5%).
Outra limitação observada foi a variação da concentração de cobre em função da
idade, com uma maior concentração sérica média deste elemento na faixa etária de 5 a 10
anos. Os níveis séricos de cobre podem ser correlacionados à concentração do mesmo no
84
solo e nos alimentos. Dentre estes alimentos, leites e derivados contém baixo teor de cobre
e normalmente muito consumidos nesta faixa etária. No entanto, como as localidades deste
estudo são áreas de cultivo de café, um consumo de leite é provavelmente menos freqüente
para algumas famílias. Porém, quanto aos grupos G0/I e GII, estes foram homogêneos na
medida em que não houve diferença significativa entre os níveis de elementos traço
relacionados ao sexo, idade e IMC.
85
8. CONCLUSÕES
86
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem as seguintes conclusões:
1. Níveis séricos elevados de cobre e ferro não apresentaram associação com a
resposta imune induzida pela vacina anti-LTA composta por L. amazonensis
(IFLA/BR/67/PH8), avaliada pelo Teste de Montenegro.
2. A imunogenicidade da vacina anti-LTA composta por L. amazonensis
(IFLA/BR/67/PH8), avaliada pelo Teste de Montenegro aumenta em função dos
níveis séricos de selênio.
3. A imunogenicidade da vacina anti-LTA composta por L. amazonensis
(IFLA/BR/67/PH8), avaliada pelo Teste de Montenegro é menor no grupo com
excesso de zinco sérico. No entanto, estes resultados não são consistentes na medida
em que estes não se repetem com a inversão da definição de dependência das
variáveis.
4. Não foi encontrada relação entre a antropometria e a resposta imune induzida pela
vacina anti-LTA, avaliada pelo Teste de Montenegro.
87
9. ANEXOS
88
Tabela 14. Distribuição da concentração média e desvio padrão de cobre, ferro,
selênio e zinco de acordo com o diâmetro do TM, determinado em indivíduos
vacinados anti-LTA, Caratinga, MG.
Diâmetro
do TM
0
5,0 – 8,0
8,1 – 9,0
9,1 – 12,0
> 12,0
Total
p
Cobre (µg/L)
n Média DP
97
33
10
16
15
171
1.354,1
1.599,8
1.614,8
1.341,7
1.560,9
1.433,7
0,285
657,4
696,4
881,6
462,3
648,6
665,7
Ferro (µg/L)
n Média DP
86
27
8
12
11
144
1.536,2
1.408,2
1.094,2
1.152,6
1.221,3
1.431,6
0,264
848,9
824,9
475,4
458,4
588,4
791,5
Selênio (µg/L)
n Média DP
Zinco (µg/L)
n Média DP
83,6 a
111,1a
68,4 a
76,5a
103,3b
88,57
0,002*
97 1.009,0 323,1
33 938,6 151,1
10 1.237,0 1071
16 950,6 184,1
15 962,2 168,7
171 999,2 365,7
0,228
93
28
10
13
13
157
20,1
66,0
16,7
19,5
35,5
39,0
n: número de indivíduos avaliados; DP: desvio padrão; a: diferença significativa
(p<0,05) do diâmetro 5,0 – 8,0 com os grupos de diâmetro 0; 8,1 – 9,0; 9,1 – 12,0. b:
diferença significativa (p<0,05) do diâmetro 8,1 – 9,0 com o grupo de diâmetro > 12,0.
89
90
91
92
93
94
95
96
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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