molecular techniques for diagnostic and characterization of citrus
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molecular techniques for diagnostic and characterization of citrus
MELHORAMENTO E BIOTECNOLOGIA TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS DA TRISTEZA DOS CITROS ALESSANDRA A. DE SOUZA (1); MARIA LUISA P. N. TARGON (1); FRANCISCA A. DOS SANTOS (1); GERD W. MÜLLER (1) e MARCOS ANTÔNIO MACHADO (1) RESUMO O vírus da tristeza dos citros (CTV) é o patógeno viral de maior importância econômica na cultura. Infecta, praticamente, todas as espécies e variedades de citros. O CTV apresenta diferentes isolados relacionados imunologicamente, podendo ou não expressar sintomas, em função da combinação copa/porta-enxerto. O procedimento mais comum para caracterização de seus isolados é a indexação biológica. Todavia, esse processo, além de caro e demorado, nem sempre permite uma identificação correta das estirpes. Atualmente, várias técnicas moleculares estão sendo utilizadas para identificação das estirpes do CTV. Nesta revisão, serão abordadas as técnicas moleculares de RT-PCR, RFLP e SSCP do gene da capa protéica rotineiramente utilizadas no laboratório de Biotecnologia do Centro de Citricultura "Sylvio Moreira"-IAC no diagnóstico e caracterização de isolados do CTV. Termos de indexação: viroses, testes diagnósticos, CTV, RT-PCR, RFLP, SSCP. (1) Centro de Citricultura “Sylvio Moreira”-IAC, Caixa Postal 4, 13490-970 Cordeirópolis (SP). ARTIGO TÉCNICO 504 ALESSANDRA A. DE SOUZA et al. SUMMARY MOLECULAR TECHNIQUES FOR DIAGNOSTIC AND CHARACTERIZATION OF CITRUS TRISTEZA VIRUS Citrus tristeza virus (CTV) is economically the most important citrus virus in the world, which infects all citrus species and varieties. The CTV is present in citrus trees as a mixture of strains, expressing or not symptoms, according with the scion and rootstock variety. Usually, the properties of CTV isolates are determinate by biological indexing. However, this process is expensive and time consuming. Nowadays, several molecular techniques have been utilized to identify CTV strains. In this review, we describe techniques, such as RT-PCR, RFLP and SSCP, based on analysis of the coat protein gene and used for diagnostic and characterization of CTV isolates. Index terms: Viruses, diagnostic tests, CTV, RT-PCR, RFLP, SSCP. 1. INTRODUÇÃO O vírus da tristeza dos citros (CTV) é o patógeno viral de maior importância econômica na cultura. Infecta praticamente todas as espécies, cultivares e híbridos de citros (MÜLLER e COSTA, 1993). O CTV é limitado ao floema, pertence ao grupo dos closterovírus, com partículas longas e filamentosas de 10-12 nm de diâmetro por 2.000 nm de comprimento (BAR-JOSEPH et al., 1979). Suas partículas possuem capa protéica de 25 KDa e RNA fita simples (ssRNA) de, aproximadamente, 19.300 bases. Na forma replicativa do vírus, ocorre a formação de RNA dupla fita (dsRNA) e vários RNAs subgenômicos (LEE et al., 1988; VALVERDE et al., 1990). O vírus da tristeza apresenta diferentes isolados relacionados imunologicamente, podendo ou não expressar sintomas, em função da LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO... 505 combinação copa / porta-enxerto (POWELL, 1992). Em pomares comerciais, tem-se observado que, na presença do vírus, nem todas as variedades-copa desenvolvem-se satisfatoriamente, mesmo sobre porta-enxertos tolerantes. Isso tem sido associado à ocorrência de complexos severos do CTV. Para variedades mais suscetíveis, o problema tem sido parcialmente resolvido com a pré-imunização (MÜLLER e COSTA, 1993), na qual plantas sistematicamente infectadas com estirpes fracas do vírus impedem a manifestação de estirpes severas do mesmo vírus. Contudo, têm sido observados casos de plantas pré-imunizadas apresentando sintomas de CTV severo (SOUZA et al., 2000). Entre os complexos virais, o Capão Bonito é considerado um dos mais severos, afetando, com maior ou menor intensidade, todas as variedades de laranja-doce (Citrus sinensis L. Osbeck) enxertadas sobre limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbeck). O complexo viral utilizado em programas de pré-imunização também não tem tido êxito diante do complexo Capão Bonito (MÜLLER e COSTA, 1993). O procedimento mais comum para caracterização de isolados do CTV é a indexação biológica, na qual se utilizam plantas indicadoras sensíveis ao patógeno. Entretanto, esse processo, além de ser caro e demorado, nem sempre permite uma identificação correta das estirpes (BALLESTER-OLMOS et al., 1993). Atualmente, várias técnicas moleculares estão sendo usadas para identificação das estirpes do CTV, entre elas: análise do dsRNA de plantas infectadas (DODDS et al., 1987), hibridação com sondas de cDNA (ROSNER et al., 1986), comparação de seqüências de RNA do vírus (PAPPU et al., 1993), RT-PCR (transcrição reversa seguida de reação da polimerase em cadeia) (TARGON et al., 2000), análise do polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) do gene da capa protéica (GCP) do vírus (GILLINGS et al., 1993; VALLE et al., 2000), e análise do polimorfismo da conformação de fita simples (SSCP) do GCP (RUBIO et al., 1996). Entre as técnicas moleculares citadas, a comparação de seqüências do RNA é a mais precisa; entretanto, é a mais cara e consome muito tempo em trabalhos rotineiros. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 506 ALESSANDRA A. DE SOUZA et al. Nesta revisão, serão abordadas as técnicas moleculares de RT-PCR, RFLP e SSCP rotineiramente utilizadas no Laboratório de Biotecnologia do Centro de Citricultura "Sylvio Moreira"-IAC para o diagnóstico e caracterização de isolados do CTV. 2. APLICAÇÃO DOS TESTES Os procedimentos necessários à utilização das técnicas de RT-PCR, RFLP ou SSCP estão esquematizados na Figura 1. Coleta do material vegetal Ð Extração do dsRNA do vírus Ð Síntese da primeira fita de cDNA Ð RT-PCR Ó RFLP Ô SSCP Figura 1. Esquema representativo da seqüência de etapas na análise molecular do vírus da tristeza dos citros LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO... 507 2.1. Coleta do material vegetal Geralmente, o material a ser diagnosticado é coletado, em campo, de plantas apresentando ou não sintomas de CTV severo. Colocam-se os ramos coletados em sacos plásticos e acondicionam-nos no gelo. No laboratório, efetua-se a lavagem do material e a posterior separação das cascas dos ramos (local com maior concentração do vírus). Posteriormente, o material é seco e armazenado a -20ºC até processamento. 2.2. Extração do dsRNA e síntese do cDNA Como todas as análises se baseiam no gene que codifica a capa protéica, a primeira etapa dos procedimentos de laboratório consiste em extrair o material genético do vírus, ou seja, o RNA. Como mencionado na introdução, o CTV apresenta RNA fita simples (ssRNA); entretanto, na sua forma replicativa, também apresenta RNA dupla fita (dsRNA). O dsRNA é menos suscetível a degradações que o ssRNA e, por esse motivo, mais fácil de ser isolado por métodos laboratoriais. Os procedimentos mais utilizados para sua extração são os descritos por MORRIS et al. (1983) e VALVERDE et al. (1990). Após extração, a próxima etapa é a síntese do DNA complementar (cDNA) ao dsRNA, que vai servir de molde na etapa posterior, que é a amplificação do GCP por PCR. Para que tal ampli-ficação ocorra, é necessária a presença de uma enzima (Taq DNA polimerase) que reconhece apenas molde de DNA; por esse motivo, deve ser sintetizado o cDNA. Para sua síntese, o dsRNA é colocado em uma mistura de componentes contendo a enzima transcriptase reversa (RT), que tem a propriedade de sintetizar DNA a partir de RNA. 2.3. RT-PCR (Transcrição reversa seguida de reação da polimerase em cadeia) Após a sua síntese, o cDNA é usado como molde para amplificação do GCP utilizando "primers" específicos para o gene. Esses "primers" LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 508 ALESSANDRA A. DE SOUZA et al. são pequenas seqüências de nucleotídeos (~ 20 pares de bases - pb) que pareiam especificamente com as seqüências do GCP, sendo também chamados de iniciadores da reação. Após reação, observam-se fragmentos de, aproximadamente, 670 pb, tamanho correspondente ao GCP (Figura 2). Figura 2. Análise eletroforética em gel de agarose (1%) do gene da capa protéica do CTV amplificado por PCR de 12 amostras. M: Marcador molecular de 1Kb (Gibco). Depois dessa reação, já se pode concluir se a planta em questão está infectada ou não com o CTV. Emprega-se esse tipo de diagnóstico principalmente em mudas microenxertadas, pois, em plantas de campo, o CTV é endêmico em quase todas as espécies de citros. Recentemente, desenvolveram-se "primers" específicos para amplificar o GCP das estirpes presentes no complexo severo Capão Bonito (estirpe CB-22 e CB-104) (TARGON et al., 2000). Com esse desenvolvimento desses "primers", hoje é possível diagnosticar por RT-PCR a presença de tais estirpes nas plantas. O diagnóstico é feito da seguinte forma: primeiramente, o GCP do CTV presente nas plantas a avaliar é amplificado com um par de "primers" que amplificam qualquer estirpe do CTV (Figura 2). Após constatação que o cDNA utilizado está amplifi- LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO... 509 cando o GCP, este é utilizado para amplificação com "primers" específicos para um dos componentes do complexo Capão Bonito (estirpe CB22), que gera um fragmento de 285 pb (Figura 3A), e específicos para outro componente (estirpe CB-104), gerando um fragmento de 295 pb (Figura 3B). A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M A Î - 1018pb - ~ 285pb Figura 3. Análise eletroforética em gel de agarose (1% ) do gene da capa protéica do CTV amplificado por PCR, utilizando "primers" específicos para o complexo Capão Bonito. As setas indicam as bandas relacionadas às estirpes CB-22 (A) e CB 104 (B). M: Marcador molecular de 1Kb (Gibco). B Î - 1018pb ~ 295pb Como a presença do complexo Capão Bonito está relacionada à presença dos dois fragmentos na mesma planta, na Figura 3 são consideradas positivas, para o complexo Capão Bonito, as plantas 5, 6, 11 e 12. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 510 ALESSANDRA A. DE SOUZA et al. 2.4. RFLP (Polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição) A técnica de RFLP é mais utilizada em avaliações de campo, quando há suspeita de CTV severo em algumas plantas, ou, ainda, para avaliar a estabilidade do isolado protetivo em plantas pré-imunizadas. A técnica de RFLP, utilizada para caracterização dos isolados do CTV, consiste em cortar o GCP das estirpes a serem avaliadas com enzimas de restrição. Essas enzimas têm a propriedade de clivar o DNA quando encontram seqüências específicas de nucleotídeos. Dessa forma, se houver alguma diferença no conteúdo de nucleotídeos do sítio de reconhecimento da enzima, não haverá clivagem do DNA naquela região. Quando o DNA é então submetido à corrida eletroforética, aquele que apresenta o sítio de restrição revelará um fragmento a mais que o que não apresenta o sítio, e assim se constata a diferença entre ambos (Figura 4). Um exemplo prático do uso dessa técnica é mostrado no trabalho de SOUZA et al. (2000), em que o objetivo foi determinar se houve mudança no isolado protetivo em plantas pré-imunizadas há mais de vinte anos. Pôde-se verificar que, entre dez plantas avaliadas, apenas uma apresentava o padrão similar ao do complexo protetivo original, enquanto as demais continham alterações significativas do vírus. Isso sugere que outras estirpes se estabeleceram nas plantas ao longo do tempo. 2.5. SSCP (Polimorfismo da conformação da fita simples) O emprego da técnica de SSCP é o mesmo que o de RFLP. Entretanto, o SSCP é, atualmente, um dos mais utilizados na detecção e caracterização de vírus (KOENIG et al., 1995; SHI et al., 1996; PALACIO e DURAN-VILA, 1999). A técnica baseia-se no fato de que o DNA dupla fita (forma em que se encontra o GCP após PCR), quando parcialmente desnaturado, migra como dois fragmentos de DNA fita simples em eletroforese com gel de poliacrilamida. A migração das duas fitas depende da seqüência de nucleotídeos e da conformação adquirida nas condições de eletroforese. Pequenas mudanças na seqüência podem alterar a conformação das fitas e, conseqüentemente, o padrão eletroforético. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO... 300pb 511 200pb 170pb Amostra 1 500pb 170pb Amostra 2 Eletroforese Amostra 1 300pb Ö 200pb Ö 170pb Ö Amostra 2 Õ 500pb Õ 170pb Figura 4. Esquema da técnica de RFLP. Amostra 1 apresenta dois sítios de restrição, gerando três fragmentos que, somados, equivalem ao tamanho do GCP. Amostra 2 difere da 1 pela ausência de um sítio de restrição, originando, dessa forma, dois fragmentos. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 512 ALESSANDRA A. DE SOUZA et al. Dessa forma, a técnica de SSCP é mais precisa que a de RFLP, pois neste são detectadas somente diferenças se houver mutação no sítio de restrição da enzima utilizada, enquanto no SSCP a variação de apenas um nucleotídeo em qualquer parte do gene é suficiente para mudar a conformação da fita simples e, conseqüentemente, sua migração em gel de eletroforese (Figura 5). A T DNA G C Desnaturação A Fita simples Simples GG G A Diferentes conformações Eletroforese Î Diferença na Mobilidade mobilidade Í Figura 5. Esquema da técnica de SSCP. A fita de DNA, que contém uma adenina (A), apresenta conformação linear e, por isso, migra mais lentamente no gel. A fita de DNA que contém uma guanina (G) revela conformação mais compacta, migrando mais rápido no gel. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO... 513 A técnica de SSCP é também utilizada para diagnosticar a presença do complexo Capão Bonito. Na Figura 6, encontra-se um gel de SSCP contendo, separadamente, o padrão do CB-22, CB-104 e a mistura de ambos. Se as plantas diagnosticadas apresentarem padrão igual à mistura, infere-se que, provavelmente, estejam hospedando as estirpes do comple-xo Capão Bonito. CB-22 CB-104 CB22 +104 Figura 6. Polimorfismo de conformação de fita simples do gene da capa protéica das estirpes presentes no complexo Capão Bonito. Outro exemplo prático da técnica de SSCP é a caracterização de isolados fracos e severos em campo, pois, como já constatado em alguns trabalhos (CORAZZA-NUNES et al., 2001), a diferença de sintoma, geralmente, está associada à diferença do padrão do GCP. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 514 ALESSANDRA A. DE SOUZA et al. 3. COMENTÁRIOS FINAIS O gene da capa protéica representa apenas 3,5% do genoma do CTV. Dessa forma, pesquisas que visem estudar a variabilidade entre os isolados devem avaliar também outros genes do vírus. Contudo, as técnicas apresentadas neste trabalho, utilizando o GCP, mostram-se satisfatórias para detecção do complexo Capão Bonito, para o monitoramento do isolado protetivo em plantas pré-imunizadas e para a caracterização dos padrões moleculares presentes em isolados fracos e severos do vírus. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BALLESTER-OLMOS, J.F.; PINA, J.A.; CARBONELL, E.; MORENO, P.; MENDOZA, A.H.; CAMBRA, M.; NAVARRO, L. Biological diversity of citrus tristeza virus (CTV) isolates in Spain. Plant Pathology, Palo Alto, v.42, 219229, 1993. BAR-JOSEPH, M.; GARNSEY, S.M.; GONÇALVES, D. The closteroviruses: a distinct group of elongated plant viruses. Advances in Virus Research, v. 25, p.93-168, 1979. CORAZZA-NUNES, J.M.; MACHADO, M.A.; MÜLLER, G.W.; STACH-MACHADO, D.R.; SOUZA, A.A.; NUNES, W.M. Evaluation of citrus tristeza virus (CTV) complexes in pre-immunized Marsh seedless grapefruits. Summa Phytopathologica, Jaboticabal, v.27, 2001. (No prelo) DODDS, J.A.; JARUPATT, T.; LEE, J.G.; ROISTACHER, C.N. Effects of strain, host, time of harvest, and virus concentration on double-stranded RNA analysis of citrus tristeza virus. Phytopathology, St. Paul, v.76, p.820-824, 1987. GILLINGS, M.; BROADBENT, P.; INOSTO, J.;LEE, R.F. Characterisation of isolates and strain of citrus tristeza closterovirus using restriction analysis of the coat protein gene amplified by polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods, Amsterdam, v.44, p.305-317, 1993. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001 TÉCNICAS MOLECULARES PARA DIAGNÓSTICO... 515 KOENIG, R.; LÜDDECKE, P.; HAEBERLÉ, A.M. Detection of beet necrotic yellow vein virus strains, variants and mixed infections by examining singlestrand conformation polymorphism of immunocapture RT-PCR products. Journal of General Virology, Reading, v.76, p.2051-2055, 1995. LEE, R.F.; CALVERT, L.A.; NAGEL, J.; HUBBARD, J.D. Citrus tristeza virus: Characterization of coat proteins. 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SOUZA, A.A.; MÜLLER, G.W.; TARGON, M.L.P.N.; MACHADO, M.A. Evaluation of changes occurred in a mild protective CTV isolates in Pera sweet orange trees using RFLP and SSCP of the coat protein gene. In: INTERNATIONAL ORGANIZATION OF CITRUS VIROLOGISTS, 14., Lake: Alfred, v.28, p.136-140, 2000. TARGON, M.L.P.N.; MACHADO, M.A.; SOUZA, A.A.; MÜLLER, G.W. Detection of severe isolates of citrus tristeza virus by bidirectional RT-PCR (BDRT-PCR). Virus Reviews and Research, v.1, n.5, p.37-44, 2000. VALLE, V.G.R.; MACHADO, M.A.; MÜLLER, G.W.; TARGON, M.L.P.N.; TEÓFILO SOBRINHO. J.; LEE, R.F. Characterization of citrus tristeza closterovirus isolates by RFLP of the coat protein gene. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.25, n.2, p.175-181, 2000 VALVERDE, R.A.; NAMETH, S.T.; JORDAN, R.L. Analysis of double strand RNA for plant virus diagnosis. Plant Disease, St. Paul, v.71, p.255-258, 1990. LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001
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